Upload
trananh
View
215
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Hochschule für Angewandte Wissenschaften Hamburg
Fakultät Life Siences
Entwicklung einer Kultivierungsstrategie unter
Serumentzug zur Effizienzsteigerung der Expression
von rekombinantem Grün Fluoreszierenden Protein
bei transgenen CHO-Zellen
Bachelorarbeit
im Studiengang Biotechnologie
vorgelegt von
Lisa Schindler
Hamburg-Bergedorf
am 18.05.2012
1. Gutachter: Herr Prof. Dr. phil. nat. Oliver Ullrich (HAW Hamburg)
2. Gutachter: Frau Prof. Dr Gesine Cornelissen (HAW Hamburg)
Das Bachelorarbeit wurde betreut und erstellt im Labor für Molekularbiologie und
Zellkulturtechnik der Hochschule für Angewandte Wissenschaften Hamburg.
2
Danksagung
Mit der vorliegenden Bachelorarbeit geht der erste Abschnitt meines Studiums zu
Ende. Ich möchte mir deshalb an dieser Stelle die Zeit für ein paar Worte des Dankes
nehmen.
Ganz besonders möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Oliver Ullrich bedanken, der mir
die Möglichkeit gegeben hat diese Arbeit in seinem Labor für Molekularbiologie und
Zellkulturtechnik an der HAW Hamburg zu verwirklichen. Ebenso möchte ich ihm für
die gute Betreuung und Unterstützung bei allen Fragen und Problemen während
meiner Arbeit danken.
Ein liebes Dankeschön gilt Frau Elisabeth Schäfer, die mir bei allen Aufgaben im Labor
immer mit Rat und Tat zur Seite stand.
Frau Prof. Dr. Gesine Cornelissen möchte ich für die Übernahme der Zweitkorrektur
danken.
Herrn Prof. Dr. Birger Anspach danke ich für die Bereitstellung des
Spektrofluorometers.
Ein großes Dankeschön geht auch an meine Familie und Freunde, die mir immer Kraft
und Mut gegeben haben diesen Abschnitt meines Lebens zu meistern. Ohne sie wäre
die tolle Zeit in Hamburg nicht möglich gewesen.
3
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung...................................................................................................................... 5
1.1 Bedeutung von Serum in der Zellkultur.......................................................................... 5 1.2 Kultivierung von Zellen ohne Serum in der Industrie und medizinischen
Forschung.................................................................................................................................... 6 1.3 Alternativen zum Serum ....................................................................................................... 7 1.4 Rolle von CHO-Zellen in der Forschung und Industrie.............................................. 8 1.5 Markerproteine für die Expression in eukaryotischen Zellen................................ 9 1.6 Grün Fluoreszierendes Protein (GFP).............................................................................. 9 1.7 Methode der Fluoreszenzspektometrie ........................................................................11 1.8 Aufgabenstellung ...................................................................................................................15
2 Material und Methoden............................................................................................. 16
2.1 Zellkultur...................................................................................................................................16 2.1.1 Verwendete Zelllinien ...............................................................................................16
2.1.1.1 Erste verwendete CHO-Zelllinie: stabile His6-GFP-CHO-Zellinie ........16 2.1.1.2 Zweite verwendete CHO-Zelllinie: stabile His6-GFP-Rab11-CHO-
Zelllinie .......................................................................................................................17 2.1.2 Kultivierung der Zellen .............................................................................................17
2.1.3.1 Material und Lösungen.........................................................................................18 2.1.3.2 Auftauen der tiefgefrorenen Zellkulturen und Aussaat der Zellen .....19 2.1.3.3 Optische Kontrolle der Zellkultur ....................................................................20 2.1.3.4 Passagieren der Zellen / Medienwechsel......................................................20 2.1.3.5 Aussaat der CHO-Zellen in 24-Well-Platten .................................................22 2.1.3.6 Kryokonservierung................................................................................................24
2.2 Zellzahlbestimmung..............................................................................................................24 2.2.1 Beladen der Zählkammer/ Messung durch Countess™ Automated Cell
Counter ............................................................................................................................25 2.3 Fluoreszenzmessung ............................................................................................................26
2.3.1 Spektrofluorometer....................................................................................................26 2.3.2 Vorbereiten der Zellen von einer 24-Well-Platte zur anschließenden
Vermessung im Spektrofluorometer....................................................................27 2.3.3 Messung der Probe mit Hilfe der Software Panorama .................................28 2.3.4 Peakflächenberechnung mit Hilfe der Software Panorama........................30
2.4 Fluoreszenzmikroskopie.....................................................................................................32
3 Ergebnisse................................................................................................................... 35
3.1 Einfluss von FCS auf Proliferation und Expression der beiden Zelllinien CHO-GFP und CHO-GFP-Rab11 in Abhängigkeit von der Aussaatdichte ....................35
3.1.1 Einfluss von FCS auf Proliferation und Expression bei niedriger Aussaatdichte (1x105)................................................................................................35
3.1.2 Einfluss von FCS auf Proliferation und Expression bei hoher Aussaatdichte (1x106)................................................................................................38
3.1.3 Einfluss von FCS auf Proliferation und Expression bei mittlerer Aussaatdichte (3x105, 5x105)..................................................................................41
4
3.2 Versuche zur Entwicklung einer Kultivierungsstrategie zur optimalen Ausbeute an GFP unter Serumentzug ............................................................................47
3.2.1 Proliferation und Expression bei einer niedrigen Aussaatdichte ................ (1x105).............................................................................................................................48 3.2.2 Proliferation und Expression bei einer mittleren Aussaatdichte ................. (5x105).............................................................................................................................51
3.3 Fluoreszenzmikroskopie.....................................................................................................54 3.3.1 Fluoreszenzmikroskopische Analyse der CHO-GFP-Rab11-Zellen..........54 3.3.2 Fluoreszenzmikroskopische Analyse der CHO-GFP-Zellen ........................55
4 Diskussion ................................................................................................................... 58
4.1 Einfluss von FCS auf Proliferation und Expression bei verschiedenen Aussaatdichten........................................................................................................................58
4.2 Kultivierungsstrategie zur optimalen Produktion von GFP/ GFP-Rab11 unter Serumentzug................................................................................................................60
4.3 Fluoreszenzmikroskopie.....................................................................................................61 4.4 Fazit .............................................................................................................................................62
5 Zusammenfassung...................................................................................................... 63
6 Literaturverzeichnis .................................................................................................. 64
7 Anhang........................................................................................................................ 67
7.1 Abbildungsverzeichnis.........................................................................................................67 7.2 Tabellenverzeichnis ..............................................................................................................69 7.3 Material und Geräte ..............................................................................................................70 7.4 Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................................72
Einleitung
5
1 Einleitung
Die Zellkultur, Kultivierung von aus lebenden Geweben isolierten Zellen in vitro (lat.
‚im Glas’), ist ein anerkanntes, wertvolles Werkzeug der biomedizinischen Forschung
zur Gewinnung reproduzierbarer Daten und zur Produktion diagnostischer und
therapeutischer Proteine [Gstraunthaler, 2003]. In heutiger Zeit werden mit Hilfe von
Zellkulturen immer mehr hochwertige Produkte im großen Maßstab für Medizin und
Forschung hergestellt, wie zum Beispiel Insulin, Wachstumsfaktoren, Impfstoffe und
vielen weiteren Proteinen. Ebenso stellt die Zellkultur eine hervorragende Alternative
zu Tierversuchen dar und ist aus diesem Grund ein wichtiger Teil in Industrie und
Forschung.
1.1 Bedeutung von Serum in der Zellkultur
In vitro kultivierte Zellen benötigen zum Wachstum sogenannte Nährlösungen
(Medien), die eine möglichst exakte Nachahmung der physiologischen Situation
in vivo (d.h. im lebenden Körper) darstellen. Dabei spielt das Vorhandensein von
Blutserum eine enorme Rolle und ist aufgrund der vielseitigen Zusammensetzung der
am häufigsten verwendete Medienzusatz. Es kann artübergreifend verwendet
werden. Ebenso ist wissenschaftlich nachgewiesen, dass einige Zelllinien ohne das
Vorhandensein von Serum nicht in der Lage sind, zu proliferieren. Durch in der
Vergangenheit durchgeführte Experimente und zahlreiche Versuche erwies sich, dass
das Serum von ungeborenen Föten als besonders hochwertig gilt, da sich im fötalen
Entwicklungsstadium eine enorme Zellaktivität entfaltet [Boxberger, 2007].
Bei dem am häufigsten verwendeten Serum handelt es sich um das Fötale
Kälberserum (FKS), auch bekannt unter den Bezeichnungen „Fetal Bovine Serum“
(FBS) oder „Fetal Calf Serum“ (FCS). Die genaue Zusammensetzung sowie alle
wirksamen Faktoren und Wirkstoffkombinationen des Serums sind bis heute noch
nicht entschlüsselt. Schätzungen zu folge ist die komplexe Flüssigkeit aus mehr als
5000 verschiedenen Komponenten zusammengesetzt, wobei diese Zahl von Charge zu
Charge stark schwanken kann [Schrödel, 2007]. Die in dem Serum vorhandenen
Einleitung
6
Proteine, Aminosäuren, Spurenelemente, Hormone, Wachstumsfaktoren etc. sind ein
wichtiger Faktor für die langfristige Kultivierung. Ebenso ist bewiesen, dass Serum
hilfreich bei der Anheftung der Zellen am Kulturboden ist (bei adhärent wachsenden
Zellen), oder als natürliches Puffermittel zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes im
Kulturmedium dient [Uppangala, 2010]. Zudem erhöht Serum die Viskosität des
Mediums und kann somit zum Schutz der Zellen vor mechanischer Beschädigung, wie
zum Beispiel beim Pipettieren, beitragen. Mit dem heuten Wissen, der modernen
Zellbiologie und Biochemie lässt sich ebenso zeigen, dass die Rolle des fötalen
Kälberserums auch einen entscheidenden Einfluss auf die Differenzierung von Zellen
einnimmt [Gstraunthaler, 2003]. Allerdings bringt die Kultivierung mit
serumhaltigem Medium auch ungewollte Nachteile, die im nächsten Absatz 1.2
verdeutlicht werden.
1.2 Kultivierung von Zellen ohne Serum in der Industrie und
medizinischen Forschung
Einer der wichtigsten Gründe für die Etablierung einer Kultivierungsmethode von
eukaryotischen Zellen ohne FCS besteht in der Betrachtung der ethischen Seite zur
Gewinnung des Serums [Shailer und Corrin, 1999; van der Valk et al., 2003]. Der
Gewinnung für FKS geht die Entnahme der Gebärmutter des Muttertieres mitsamt des
etwa drei bis sieben Monate alten, ungeborenen Fetus voraus. Anschließend wird das
Herz des Fetus punktiert (kardiale Interpunktion) und Blut entnommen, welches im
Folgenden für die Serumgewinnung verwendet wird. Diese Methode ist ethisch
äußerst fragwürdig und muss unter einem kritischen Aspekt betrachtet werden
[taz.de, 2005].
Ein weiterer wichtiger negativer Faktor ist die mögliche Kontamination mit Bakterien,
Mycoplasmen, Pilzen oder Rinderviren, die trotz zahlreicher Filtrationsschritte,
Hitzeinaktivierung und/oder Behandlung mit UV-Strahlung nicht entfernt bzw.
inaktiviert werden können. Dies könnte in der medizinischen Forschung und
Entwicklung von Medikamenten fatale Folgen haben, da sich darunter unter anderem
die viralen Erreger der Maul- und Klauenseuche (Bovine Rhinotracheitis) oder die
Erreger der Bovinen Spongiformen Enzephalophatie (Prionen) befinden, wobei
letztere beim Menschen zu der sogenannten Creutzfeld-Jakob-Krankheit führen
können [Boxberger, 2007].
Einleitung
7
Aus diesen Gründen ist die Kultivierung von Zellen, die bei der Herstellung von
Arzneimitteln eingesetzt werden, nur unter ganz bestimmten Aspekten möglich.
Darunter zählt unter anderem die Verwendung von serumfreien Medien, bei deren
Verwendung somit keine Gefahr für den menschlichen Organismus ausgeht. Ebenso
würde auf diese Weise die von der FDA (Food and Drug Administration),
Pharmacopoe Europeae bzw. ISO (Internationale Organisation für Normung) zu
überprüfende Virus-Sicherheit garantiert werden. Hier ist der Nachweis zu erbringen,
dass keine schädlichen Viren im Endprodukt enthalten sind [http://www.zwisler-
laboratorium.com/sites/news/virus_news.html].
1.3 Alternativen zum Serum
Seit mehr als 25 Jahren versucht man, aufgrund der oben genannten Nachteile, einen
optimalen Ersatz mit besten Kultivierungsbedingungen, zum Beispiel in Bezug auf die
Aussaatdichte und Kultivierungstemperatur, für das Fötale Kälberserum zu finden.
Die größte Herausforderung liegt darin, einen angemessenen Ersatz für die
zahlreichen wachstumsfördernden Serumkomponenten zu finden [Boxberger, 2007].
Das Angebot an serumfreien Zellkulturmedien ist in den letzten Jahren stark
gestiegen. Allerdings bedarf es durch die selektive Einsetzbarkeit der Medien eines
gründlichen und zeitaufwendigen Rechercheaufwandes, um ein ideales Medium für
eine bestimmte Zelllinie zu finden. Die serumfreie Kultivierung stellt eine moderne,
wissenschaftlich akzeptierte Alternative zur Verwendung von FCS in der Zellkultur
dar [Gstraunthaler, 2003]. Deshalb ist es von großer Bedeutung, die Forschung an
serumfreien Medien und die Optimierung der Kultivierungsbedingungen weiterhin
voran zu treiben.
Einer der größten Nachteile der Kultivierung mit serumfreien Medien ist jedoch die
noch sehr langsame Zellproliferation im Gegensatz zur Kultivierung mit
serumhaltigem Medium, die durch einzelne Kultivierungsbedingungen und Strategien
verbessert werden kann. Dabei spielt auch die Wahl der Zelllinie eine wichtige Rolle,
da einige Zelllinien serumunabhängiger und anpassungsfähiger sind als andere.
Einleitung
8
1.4 Rolle von CHO-Zellen in der Forschung und Industrie
Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO, engl. Chinese Hamster Ovary) sind die
am häufigsten verwendeten Säugetierzellen zur Transfektion, Expression und
Produktion rekombinanter Proteine. Es handelt sich hierbei um eine immortalisierte,
adhärent wachsende Zelllinie. Im Jahre 1957 hat Theodore T. Puck diese
„unsterbliche“ Zelllinie aus den Eierstockzellen eines chinesischen Hamsters isoliert
[Puck et al., 1958]. Der Vorteil der CHO-Zellen ist, dass sie den menschlichen Zellen
sehr ähnlich sind, da es sich auch hier um Säugertierzellen handelt, weshalb man mit
ihnen komplexe therapeutische menschliche Proteine produzieren kann. Nahezu
70 % aller rekombinant hergestellten Proteine, mit Bestimmung zur therapeutischen
Verwendung, werden heutzutage in CHO-Zellen exprimiert [Voedisch et al., 2005]. Im
Vergleich zu anderen Zelllinien haben sie große Vorteile. Einer davon ist, dass die
Gefahr, dass sie mit gefährlichen Viren infiziert sind, sehr gering ist, was für die
Produktion von therapeutischen Proteinen wichtig ist. Vor allem sind die CHO-Zellen
seit langem etabliert und man hat es geschafft, viel Erfahrung im Umgang mit ihnen zu
sammeln. Mittlerweile stehen zahlreiche Varianten mit unterschiedlichen genetischen
Veränderungen zur Verfügung.
Abbildung 1.1: Chinese Hamster Ovary Cells. Morphologie der CHO-Zelllinie in niedriger (links) und hoher Zelldichte (rechts)
Quelle: http://www.lgcstandards-atcc.org/Attachments/1768.jpg
Einleitung
9
1.5 Markerproteine für die Expression in eukaryotischen Zellen
Um nicht nur die äußerlich sichtbaren Veränderungen von Zellen in der Wahl der
Kultivierungsmethode beurteilen zu können, wie zum Beispiel Wachstum und
Morphologie der Zellen, ist es wichtig sich auch den Gesichtpunkt der Expression von
zellspezifischen Proteinen zu betrachten. Dabei bezieht sich die Wissenschaft auf
sogenannte Markerproteine, wofür bekannte Proteine mit gegebenen Eigenschaften
(Größe, relative Molekülmasse, chemische Eigenschaften) eingesetzt werden.
1.6 Grün Fluoreszierendes Protein (GFP)
Ein in der Zellkultur häufig verwendetes Markerprotein ist das Grün Fluoreszierende
Protein (GFP; engl.= green fluorescent protein), welches ebenso ein wichtiges
Instrument der Molekularbiologie darstellt [Chalfie, 1994]. Erstmals wurde das
Protein 1961 von Osamu Shimomura beschrieben. Dabei erfolgte die Entdeckung
dieses Proteins eher zufällig durch eine Gruppe von Wissenschaftlern. Sie
untersuchten Extrakte aus Quetschpräparaten der pazifischen Qualle Aequoria
victoria und isolierten daraus die Ca2+- aktivierbare Oxoluciferase Aequorin, sowie
das daran assoziierte und nach UV-Bestrahlung Grün Fluoreszierende Protein, woher
dieses auch seinen Namen bekam (GFP) [Shimomura et al., 1962].
Einleitung
10
Abbildung 1.2: Grün Fluoreszierendes Protein: Dreidimensionale Struktur des GFP. Die Aminosäuren bilden eine zylinderförmige Struktur aus, in deren Mitte sich die Licht-emittierende Gruppe befindet (links); Pazifikqualle Aequoria victoria, in dieser Qualle wurde das Grün Fluoreszierende Protein entdeckt (rechts).
Quelle: links: http://www.fsbio-hannover.de/oftheweek/293.htm rechts: http://mabryonline.org
Der Vergleich zwischen Emissions- und Anregungsmaxima von Aequorin und GFP
zeigte, dass sich das Emissionsmaximum von Aequorin mit dem Anregungsmaximum
von GFP übereinstimmt. Diese Erkenntnis deutet auf eine Anregung des GFPs durch
Aequorin hin. Das Absorptionsspektrum und die Fluoreszenzquantenausbeuten des
GFP, sowie der strahlungslose Energietransfer zwischen Aequorin und GFP wurde
erstmals 1974 beschrieben [Morise et al., 1974].
Die Primärsequenz von GFP, sowie die Klonierung des GFP- Gens wurde 1992 zum
ersten Mal veröffentlicht, was einen enormen wissenschaftlichen Durchbruch
bedeutete [Prasher et al., 1992]. GFP besteht aus 238 Aminosäuren, besitzt eine
Molekülmasse von 26,9 kDa und eine ungewöhnliche Struktur, die in 11 beta-
Faltblattstrukturen angeordnet ist (siehe Abbildung 1.2). Diese sind in einer Art
Zylinder geordnet, in dessen Mitte sich das Fluorophor befindet. Es besitzt die
Aminosäuren Serin, Tyrosin und Glycin, deren Seitenketten miteinander reagieren
können und so die typische Fluoreszenz bewirken. Diese wurde 1996 durch zwei
Gruppen unabhängig voneinander bestimmt [Ormö et al., 1996; Yang et al., 1996].
Einleitung
11
Eine weitere äußerst außergewöhnliche Eigenschaft des natürlich vorkommenden
GFP (wtGFP, engl. = wild type GFP) ist, dass es zwei Absorptionsmaxima besitzt, jedoch
nur ein Emissionsmaximum. Im Protein kann das Tyrosin66 in seiner Hydroxy-Form,
bei einem Anregungsmaximum von 395nm oder der deprotonierten Enolat-Form, bei
einem Anregungsmaximum von 475nm (blauer bzw. ultravioletter Strahlungsbreich),
vorliegen. Der einzige fluoreszierende Zustand ist jedoch die angeregte Phenolat-
Form, die Licht bei 508nm (grüner Strahlungsbreich) emittiert. Durch die Anregung
wird der Säure-Charakter des Tyrosin66 erhöht, wodurch es zu einem Übergang in die
Phenolat-Form unter Abspaltung eines Protons kommt. Unter Lichtemission kehrt
diese in den Grundzustand zurück [Ormö et al., 1996].
Beim GFP handelt es sich um ein besonders stabiles Protein, was wahrscheinlich auf
die kompakte Struktur zurückzuführen ist. Durch das in der Struktur gut geschützte
innenliegende Fluorophor, ist es über einen sehr großen pH-Bereich (pH 5-12) stabil
und denaturiert erst bei Temperaturen über 65°C [Tsien, 1998]. Außerdem ist es
nahezu resistent gegenüber den meisten Proteasen (u.a. Trypsin, Chymotrypsin,
Elastase, Papain) und zeigt auch eine sehr hohe Stabilität in Lösungen, die zum
Beispiel Detergentien, wie SDS, Triton X-100, Tween 80 oder CHAPS enthalten.
Da zur Erzeugung der Fluoreszenz keinerlei Co-Faktoren benötigt werden, konnte
GFP inzwischen in einer Vielzahl von Organismen erfolgreich funktional exprimiert
werden. GFP ist in einer Zelle durch die vorhandene Lumineszenz und nach Anregung
mit UV- oder blauem Licht leicht detektierbar.
1.7 Methode der Fluoreszenzspektometrie
Als Fluoreszenz wird im Allgemeinen die Absorption von Licht einer bestimmten
Wellenlänge (=Anregungslicht) mit der gleichzeitigen Emission von Licht mit
größerer Wellenlänge bezeichnet [Gey, 2008]. Dieses Verhalten (Absorption von
kurzwelligem Licht, Emission von längerwelligem Licht) ist auch beim GFP zu
beobachten. Um sich einen Eindruck von der Menge und Intensität an vorhandenen
GFP in Zellen zu machen, kann die sogenannte Fluoreszenzspektroskopie
herangezogen werden.
Die Fluoreszenz einer Substanz hängt in ganz starkem Maße von den umgebenden
Bedingungen ab. Daher erfolgt die Fluoreszenzmessung im Gegensatz zur
Einleitung
12
Absorptionsspektroskopie "relativ zur Dunkelheit". Somit ist die
Fluoreszenzspektroskopie einerseits als Sensor für die Umgebung und andererseits
aufgrund der noch nachweisbaren Konzentration, bis zu einzelnen Molekülen, eine
sehr empfindliche Untersuchungsmethode der Molekül- und Bioanalytik [Gey, 2008].
Die einzelnen Prozesse, die von der Absorption von Anregungslicht zur Emission von
Fluoreszenzlicht führen, können mit Hilfe eines bestimmten Energiediagramms
dargestellt werden. Diese Diagramme sind nach dem polnischen Physiker Alexander
Jablonski benannt, der damit als Begründer der modernen Fluoreszenzspektroskopie
gilt. Ein Jablonski-Diagramm zeigt die Energien der Elektronenübergänge, die bei
Absorption und Emission von Photonen auftreten [Böcker. 1997]. Viele Fluorochrome
haben aromatische Ringstrukturen, wie Quinine, Fluorescein, Rhodamin B, POPOP,
Acrdinorange und Umbelliferone. Solche Moleküle besitzen delokalisierte Elektronen
in sogenannten bindenden p-Orbitalen. Die Elektronen dieser Orbitale treten leicht in
Wechselwirkung mit der Umgebung und erreichen bei Absorption eines
Anregungsphotons ein höheres Orbital (p*). In bindenden Orbitalen liegen Elektronen
normalerweise mit antiparallelem Spin vor, eine Anordnung, die die sogenannten
Singulett-Zustände charakterisiert (S0, S1, S2) (siehe Abbildung 1.3). Die Absorption
eines Anregungsphotons (hnA) hebt ein Elektron aus dem Grundzustand S0 in einen
der angeregten Zustände S1 oder S2. Dieser Vorgang ist extrem schnell, er vollzieht
sich innerhalb etwa 10-15 Sekunden. Aus dem oberen angeregten Zustand ist ein
Übergang nach S1 möglich, ohne das eine Photon emittiert wird ("innere
Umwandlung"), aber beim Übergang in den Grundzustand wird die freiwerdende
Energie als Fluoreszenzphoton (hnF) emittiert. Die Energie des emittierten Photons ist
immer geringer als die des absorbierten Photons, damit ist die Wellenlänge des
Fluoreszenzlichts größer als die des Anregungslichts (Stokessche Regel). Die mittlere
Verweilzeit im angeregten Zustand (Fluoreszenz-Lebenszeit) ist bei vielen
Fluorochromen im Bereich von 10 Nanosekunden. Bei manchen Verbindungen kann
es zu einem Übergang aus einem angeregten Singulettzustand in einen Triplett-
Zustand (T1) kommen. Bei diesem Vorgang ("Interkombination") kommt es zu einer
Spinumkehr des angeregten Elektrons und auch der Sprung in den Grundzustand
erfordert eine Spinumkehr. Solche Vorgänge sind jedoch sehr unwahrscheinlich und
die Emissionsraten sind sehr gering (1-1000 pro s). Diese geringe Übergangsrate ist
Einleitung
13
der Grund für das langsame Abklingen der Phosphoreszenz bei Leuchtziffern und
Spielzeug, das im Dunkeln leuchtet.
Abbildung 1.3: Jablonski Diagramm. Energiezustände bei der Lichtabsorption und Fluoreszenz-Emission; S0 = Singulett-Grundzustand; S1/ S2 =angeregte Singulettzustände. Die Absorption eines Anregungsphotons hebt ein Elektron aus dem Grundzustand S0 in einen der angeregten Zustände S1 oder S2. Die dicken waagerechten Linien verdeutlichen die niedersten Schwingungsniveaus des Elektronenzustandes. Die schmalen Linien darüber bezeichnen das Schwingungsniveaus, die als Unterniveaus des einzelnen angeregten Zustandes aufzufassen sind. Es kann zu einem Übergang aus einem angeregten Singulettzustand in einen Triplett-Zustand (T1) kommen
Quelle: Lakowicz, J. R., 1999
Eine Lichtquelle sendet über ein optisches System mit Anregungsfilter eine
vorgegebene Extinktionswellenlänge (λex) direkt durch die Mikrodurchflussküvette,
in der sich die zu analysierende Probe befindet. Diese elektromagnetische Strahlung
wird von den darin enthaltenen Molekülen absorbiert und senkrecht zur
Strahlungsebene über einen Emissionsfilter in Form einer Emissionswellenlänge
(λem) auf den Photodioden detektiert [Gey, 2008]. Die Messung der Emission ist der
wesentliche Unterschied zu anderen spektroskopischen Methoden, bei denen die
Absorption der Strahlung gemessen wird. Dieser Vorgang wird im Folgenden
schematisch dargestellt (vgl. Abbildung 1.4)
Einleitung
14
Abbildung 1.4: Fluoreszenzmessung mit Hilfe eines Spektrofluorometers. Die Lichtquelle emittiert im UV-Bereich. Die Monochromatoren dienen der Selektion der Anregungswellenlänge (1) bzw. der Analyse des Fluoreszenzlichtes (2). Die Probe wird in einer Küvette in den Proberaum gegeben. Der Detektor empfängt das emittierte Signal und leitet es an eine weitere elektronische Einheit weiter. Der Monochromator 2 steht senkrecht zur Anregungswellenlänge, so dass diese das Extinktionssignal nicht stört.
Quelle: Gey, 2008
Einleitung
15
1.8 Aufgabenstellung
Die Kultivierung von Zellen ohne Serum spielt in der medizinischen Forschung und
Herstellung von Arzneimitteln eine wichtige Rolle, da hier ein geringes
Infektionsrisiko für den Menschen von enormer Bedeutung ist. Allerdings ist die
Kultivierung ohne die im Serum enthaltenen Proteine, Aminosäuren, Spurenelemente,
Hormone und Wachstumsfaktoren sehr schwierig.
Das Ziel dieser Arbeit ist den Einfluss von Serum auf die Proteinexpression in
CHO-Zellen zu untersuchen und dabei die Bedeutung von Parametern, wie Zelldichte,
Kultivierungsdauer und Zellproliferation zu erfassen. Dies sollte anhand zweier
rekominanter, leicht quantifizierbarer Markerproteine (GFP und GFP-Rab11), die
diese verwendeten Zelllinien exprimieren, untersucht werden. Um detailliertere
Aussagen treffen zu können, sollten zwei verschiedene Zelllinien (His6-GFP-CHO und
His6-GFP-Rab11-CHO) miteinander verglichen werden. Aus diesen Ergebnissen sollte,
wenn möglich, eine Kultivierungsempfehlung für die optimale Expression von
Proteinen in CHO- Zellen aufgestellt werden, wobei auf die Verwendung von fetalem
Kälberserum möglichst verzichtet werden sollte.
Material und Methoden
16
2 Material und Methoden
2.1 Zellkultur
Alle zellbiologischen Arbeiten und die damit verbundene Kultivierung der Zellen in
Kulturmedium wurden unter sterilen Bedingungen an einer Sterilwerkbank mit
laminarem Luftstrom durchgeführt. Wichtige Voraussetzung für das sterile Arbeiten
war die Befreiung der verwendeten Arbeitsmaterialien (Kulturmedien,
Medienzusätze, Zellkulturgefäße etc.) von lebenden Mikroorganismen einschließlich
ihrer Ruhestadien. Das sterile Arbeiten ist insbesondere sehr wichtig, um die Zellen
vor Kontaminationen zu schützen.
Um eine optimale Kultivierung zu gewährleisten, wurde ein für die verwendeten CHO-
Zelllinien (Chinese Hamster Ovary) etabliertes Medium (Ham`s F12) unter Zusatz von
Antibiotika (Penicillin/ Streptomycin), L-Glutamin und FCS eingesetzt und weitere
Kultivierungsbedingungen an diese Zelllinie angepasst. Dabei wurden die Zellen in
einem Brutschrank mit einer Temperatur von 37°C und kontinuierlicher
Kohlenstoffdioxidzufuhr (5% CO2) sowie bei einer konstant hohen Luftfeuchtigkeit
(etwa 70%) kultiviert.
Die Hauptkultur der verwendeten Zelllinien wurde in Zellkulturflaschen (T25, T75)
aus Kunststoff (Polystyrol) herangezüchtet, wobei allerdings als Anzuchtgefäß der
Zellen für die einzelnen Experimente eine 24-Well-Platte, ebenfalls aus einem
Kunststoff (Polystyrol), eingesetzt wurde.
2.1.1 Verwendete Zelllinien
2.1.1.1 Erste verwendete CHO-Zelllinie: stabile His6-GFP-CHO-Zellinie
Die verwendete His6-GFP-exprimierende transgene CHO-Zelllinie wurde im Rahmen
der Diplomarbeit von Laura Gonda im Jahr 2006 an der Hochschule für Angewandte
Wissenschaften Hamburg hergestellt (siehe Abbildung 2.1). Die benötigte
CHO- Zelllinie für diesen Versuch wurde von Prof. M. Zerial (Max-Planck-Institut für
Molekulare Zellbiologie und Genetik, Dresden) zur Verfügung gestellt. Dabei handelt
es sich um einen Subklon der adhärent wachsenden CHO-Zelllinie, die von T. T. Puck
Material und Methoden
17
bei einer Biopsie von Ovarien eines erwachsenen Chinesischen Hamsters 1957
isoliert wurde, den CHO-K1-Zellen [Puck et al., 1958].
Das GFP ist ein cytosolisches Protein und somit gleichmäßig in der Zelle verteilt ist.
Abbildung 2.1: Aufnahme der stabilen CHO-GFP-His₆-Zellinie mit Hilfe eines Lichtmikroskopes mit Phasenkontrast Die Zellen wurden in einer T75-Zellkuturflasche bei 37°C und 5%CO₂ im Brutschrank kultiviert. Die Aufnahme würde mit einer 200-fachen Vergrößerung aufgenommen, nachdem die Zellen 3 Tage inkubiert wurden.
2.1.1.2 Zweite verwendete CHO-Zelllinie: stabile His6-GFP-Rab11-CHO-Zelllinie
Bei der in den folgenden Experimenten ebenso verwendeten Zelllinie handelt es sich
um eine stabile His6-GFP-Rab11-exprimierende CHO-Zelllinie, die von Mareen Glausch
im Rahmen ihrer Diplomarbeit im Jahre 2006 an der Hochschule für Angewandte
Wissenschaften Hamburg hergestellt wurde. Die Zelllinie ist von der Morphologie
sehr ähnlich den CHO-GFP-His₆-Zellen.
Im Gegensatz zum GPF ist das Rab11 ein membrangebundenes Protein, was somit
vorwiegend in der perinuklearen Region der Zelle vorkommt [Ullrich et al., 1996].
2.1.2 Kultivierung der Zellen
Die Kultivierung beider stabiler Zelllinien (His6-GFP-CHO; His6-GFP-Rab11-CHO) wird
nach den jeweils gleichen Arbeitsabläufen durchgeführt, die in den folgenden
Abschnitten beschrieben werden.
CHO-Zellen wachsen auf geeigneter Unterlage als Monolayer, da aufgrund von
Kontaktinhibition ein Übereinanderwachsen verhindert wird.
Material und Methoden
18
2.1.3.1 Material und Lösungen
Für die Kultivierung der in Abschnitt 2.1.1 und 2.1.2 vorgestellten CHO-Zelllinien
werden folgende Lösungen und Kulturgefäße angesetzt bzw. verwendet und
anschließend zur Kultivierung genutzt. Diese werden in den nachfolgenden Tabellen
dargestellt.
Tabelle 2.1: Für die Kutlivierung der CHO-Zellen verwendete Lösungen und ihre Zusammensetzung
Kulturmedium
500 ml Ham´s F12 50 ml fetales Kälberserum (FCS) 5 ml 200mM L-Glutamine 5 ml Penicillin/Streptomycin (10.000 Units/ml; 10.000 μg/ml)
PBS 0,8 g/l NaCl 0,2 g/l KCl 1,1 g/l Na₂HPO₄ 0,2 g/l KH₂PO₄, pH 7,4
Trypsin/ EDTA- Lösung 0,05 % / 0,02 % (w/v) in PBS- G418 50 mg/ml (Endkonzentration: 200 μg/ml) Einfriermedium Für 10ml Ansatz:
9ml Kulturmedium 1ml Dimethylsulfoxyd
Tabelle 2.2: Benötigte Volumina der verwendeten Lösungen zum Ablösen der ahärenten Zellen in dem jeweils verwendeten Kulturgefäß
Zellkulturgefäße/-platten Volumina PBS [ml]
Volumina Trypsin/EDTA [ml]
Volumina Medium [ml]
25 cm² - Kulturflasche 5 2 6 75 cm² - Kulturflasche 10 5 15 24-Well-Platte (1,862cm²) 0,5 0,2 0,8
Material und Methoden
19
Tabelle 2.3: Für die Kultivierung der CHO-Zellen verwendete Kulturgefäße und die benötigten Volumina der zur Aussaat verwendeten Lösungen/ Zellsuspension bei einer Konfluenz der Zellen von etwa 80% in der zu passagierenden Kulturflasche (T25/T75)
Zellkulturflaschen-/ platten
Volumina Zellsuspension [ml]
Volumina Medium [ml]
Volumina G418 [µl]
25 cm² - Kulturflasche 1 7 28 75 cm² - Kulturflasche 4 11 60
2.1.3.2 Auftauen der tiefgefrorenen Zellkulturen und Aussaat der Zellen
Um eine langfristige Lagerung der Zellen ohne Qualitätsverlust zu gewährleisten,
werden diese in flüssigem Stickstoff (-196°C) in sogenannten Kryoröhrchen
aufbewahrt.
Die tiefgefrorenen Zellkulturen sind sehr empfindlich und müssen möglichst
schonend behandelt werden, damit sie in ihrer Struktur nicht zerstört oder
beschädigt werden. Die meisten Zellen, so auch die verwendeten CHO-Zelllinien, sind
empfindlich gegenüber dem im Einfiermedium enthaltenen Dimethylsulfoxyd
(DMSO), daher wurden die folgenden Schritte möglichst schnell und
kontaminationsfrei durchgeführt. Dimethylsulfoxyd verhindert beim Einfrieren der
Zellen die Bildung von schädlichen Wasserkristallen und die parielle Dehydration des
Cytoplasmas [Boxberger, 2007]. Allerdings besitzt DMSO eine zytotoxische Wirkung
und ist somit ein Zellgift, das zur Zerstörung von Zellwand bzw. Zellmembran und
somit zum Zelltod führen kann.
Die tiefgefrorenen Zellen wurden zum Anfang in einer 25cm²-Zellkulturflasche
kultiviert, die noch vor direktem Auftauen der Zellen in den Kryoröhrchen mit
frischem Medium befüllt wurde. Die Temperatur des Kulturmediums sollte bereits
eine Temperatur von 37°C besitzen. Das Füllvolumen betrug 7ml. Anschließend
wurde ein Kryoröhrchen der entsprechenden Zelllinie aus dem Stickstoffbehälter
entnommen. Dabei mussten schützende Maßnahmen, wie das Tragen von
Schutzbrille, Gesichtschutz und Kälteschutzhandschuhe, getroffen werden, da Gesicht
und Hände durch die niedrigen Temperaturen des Stickstoffs gefährdet wären. Die
Zellen wurden nun möglichst schnell unter gelegentlichen Schwänken in einem auf
37°C vorgeheiztem Wasserbad aufgetaut. Bevor das Röhrchen unter die
Sterilwerkbank gestellt werden konnte, wurde es mit 70%iger alkoholischer
Desinfektionslösung abgesprüht und somit keimfrei gehalten. Beide Zelllinien waren
Material und Methoden
20
in einem Volumen von 1ml Suspension weggefroren, die nun mit einer 1000µl-Pipette
mit abgeschnittener blauer Spitze unter vorsichtigem Mischen entnommen und in die
bereitgestellte Kulturflasche mit dem frischen Medium überführt wurde. Dabei ist
eine vorsichtige Handhabung wichtig, damit keine schädlichen Luftblasen, die die
Zellen schädigen könnten, beim Pipettieren entstehen. Die Zellsuspension wird durch
kurzes und langsames Schwenken der Kulturflasche auf dem Boden verteilt und
anschließend bei 37°C im Inkubator unter optimalen Bedingungen (siehe Abschnitt
2.1) kultiviert. Um den Gehalt an noch vorhandenem DMSO in der nun ausgesäten
Zellsuspension weitgehend zu entfernen, wurde nach einer Zeit von 4h das alte
Medium durch ein neues Medium ausgetauscht. Da es sich um adhärente Zellen
handelt, wurden beim Medienwechsel, der im Abschnitt 2.1.3.4 noch genauer
beschrieben wird, keine lebenden Zellen entnommen oder beschädigt.
2.1.3.3 Optische Kontrolle der Zellkultur
Die frisch aufgetauten Zellen beginnen nicht sofort mit der Zellteilung, sondern
verbleiben noch einige Zeit in der sogenannten lag-Phase. Das Wort „lag“ kommt aus
dem Englischen und bedeutet „Verzögerung“. Für eine optimale Zellkultur ist es
wichtig, dass man die Gesamtheit der Zellen und das Kulturmedium stetig kontrolliert,
da so eine mögliche Kontamination, die falsche CO₂- Konzentration oder verbrauchtes
Medium schnell erkannt werden. Durch die optische Kontrolle können auch konkrete
Aussagen über Zelltod oder Zellproliferation gegeben werden.
Die visuelle Prüfung erfolgte mit Hilfe eines Mehrlinsenlichtmikroskops unter
Verwendung des 10er Objektivs. Dabei konnte eine gute Einschätzung über Zelldichte,
sowie Belastung des Mediums durch tote Zellen und Debris (Zelltrümmer) gegeben
werden. Durch diese Informationen konnte eine gute Prognose erstellt werden, ob
bzw. wann die noch freien Stellen des Kultivierungsbodens konfluent sind, d.h. wann
ein Splitten (engl. = teilen) der Zellen notwendig ist.
2.1.3.4 Passagieren der Zellen / Medienwechsel
Nach vier Tagen exponentiellen Wachstums haben die Zellen meist einen
Konfluenzgrad von etwa 80% erreicht und bieten damit die optimale Dichte pro
Flächeneinheit für eine Subkultivierung. Dabei ist eine makroskopische und
mikroskopische Beurteilung der Zellkultur notwendig. Zum einen wurde die Farbe
Material und Methoden
21
des Mediums und zum anderen die Wachstumsdichte der Zellen bewertet. Sobald das
Medium eine leichte Orangefärbung annimmt und der Zellrasen ausreichend
konfluent ist, wurden die Zellen passagiert, wie im Folgenden beschrieben wird. Das
Passagieren ist notwendig, da sich nach Erreichen der maximalen Ausbreitungsdichte
ein Stillstand der Teilungsaktivität, was auch als Kontaktinhibition bezeichnet wird,
einstellt und somit eine maximale Ausbeute nicht möglich ist. Eine Ausdünnung durch
Passagieren ermöglicht ein weiteres Zellwachstum.
Im ersten Schritt des Passagiervorgangs wird das alte Kulturmedium mit Hilfe einer
10ml-Pipette abgenommen und verworfen. Anschließend wurden die Zellen einmal
mit PBS- gewaschen und mit leicht erwärmten Trypsin/EDTA (37°C) durch
Schwenken benetzt. Die verwendeten Volumina sind der in Kapitel 2.1.3 aufgeführten
Tabelle (Tabelle 2.2) zu entnehmen. Zum effektiveren Ablösen wurden die benetzten
Zellen für 3-5min im Brutschrank inkubiert und anschließend leicht angeklopft, damit
sich die Zellen effektiver vom Boden ablösen. EDTA ist ein Chelatbildner, der eine
enorme Affinität für zweifach geladene Kationen, wie zum Bespiel Ca²+ besitzt. Durch
den somit entstandenen Calziumentzug kommt es zu einer Aufweichung der
Zellanheftungs- und Zellstrukturen und damit zu einer Auflösung des Zellrasens in
Einzelzellen [Boxberger, 2007]. Durch das ebenso vorhandene Trypsin wird die
Ablösung der Zellen von der Unterlage gleichfalls unterstützt, da es sich hier um ein
Verdauungsenzym mit proteolytischer Aktivität handelt. Nachdem sich alle Zellen
abgerundet und vom Boden abgelöst haben, wurde der Vorgang des „Trypsinierens“
durch die Zugabe von warmem FCS-haltigen Mediums (ca. 37°C) abgestoppt und
somit eine weitere Schädigung der Zellen verhindert. Im Weiteren wurden die Zellen
durch mehrmaliges Auf- und Abziehen mit einer 10ml-Pipette vereinzelt und somit
eine optimale Grundlage für das Subkultivieren und weitere Experimente geschaffen.
Im letzten Schritt wurden die Zellen verdünnt und in einer neuen Zellkulturflasche
ausgesät. Abhängig von der Menge der Zellen, die für die dementsprechenden
Experimente benötigt wurden, wurden neue Flaschen angesetzt. Die einzelnen
Volumina sind wieder der Tabelle 2.3 zu entnehmen. Durch das eingesetzte
Antibiotikum G418 sollen mögliche Kontaminationen verhindert werden. Alle neu
angesetzten Kulturflaschen wurden beschriftet (Name der Zelllinie, Passagenzahl,
Datum) und in den Brutschrank gestellt.
Material und Methoden
22
2.1.3.5 Aussaat der CHO-Zellen in 24-Well-Platten
Die Aussaat der Zellen in 24-Well-Platten bildet die Grundlage für alle durchgeführten
Experimente. Je nach unterschiedlichen Ansätzen, welche im Kapitel Ergebnisse noch
weiter beschrieben werden, wurden verschiedene Zelldichten/Zellzahlen ausgesät.
Beim anschließenden Medienwechsel wurde mit verschiedenen Konzentrationen an
fötalem Rinderserum (FCS) gearbeitet. Durch die untereinander abgetrennten
Plattenvertiefungen war es möglich, eine Vielzahl von Versuchsreihen auf einer Platte
durchzuführen. Ebenso haben die gewählten Zellkulturplatten optimale optische
Eigenschaften und garantieren einen kontrollierten Gasaustausch bei geringer
Verdunstung, was eine mögliche Fehlerquote sehr gering hält.
Die Aussaat der Zellen knüpft an das schon in Abschnitt 2.1.3.4 beschriebene Ablösen
der Zellen an. Dazu wurden die Zellen in den vorher kultivierten
T75-Zellkulturflaschen mit PBS- gewaschen, mit Trypsin/EDTA abgelöst und die
Reaktion mit Medium abgestoppt. Für eine definierte Zellzahl der einzelnen
Experimente, wurde die vorhandene Anzahl an Zellen mit Hilfe eines Zellzählgerätes
bestimmt. Dieser Arbeitsschritt wird in Abschnitt 2.2 „Zellzahlbestimmung“
ausführlicher beschrieben. Je nach gewünschter Zelldichte wurde die Zellsuspension
in einem dafür vorbereitetem 15 ml- oder 50 ml-Zentrifugengefäß verdünnt. Dabei
wurde zuerst das berechnete Medium mit dem Antibiotikum G418 (200 μg/ ml → 4 μl
der konzentrierten Stammlösung auf 1 ml Medium) vorgelegt und folgend das
Volumen an Zellsuspension hinzugegeben. Anschließend wurde durch mehrmaliges,
vorsichtiges Schwenken des Zentrifugengefäßes die Suspension vermischt. Von dieser
Suspension wurde mit Hilfe einer 1000µl Pipette mit abgeschnittener blauer Spitze
jeweils 1 ml in ein Well pipettiert. Um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu
gewährleisten, wurde nach dem Verteilen auf 4 Wells die Zellsuspension erneut
vorsichtig durch Schwenken resuspendiert. Nach 24h wurde das alte Medium entfernt
und durch das in den einzelnen Experimenten relevante Medium mit gewähltem FCS-
Anteil ersetzt, was in der folgenden Tabelle dargestellt ist. Dabei wurde jeweils 1ml
neues Medium pro Well verwendet.
Material und Methoden
23
Tabelle 2.4 Medienansatz mit unterschiedlichen FCS- Konzentrationen für ein Standardansatzvolumen von 10ml Mediengemisch
FCS- Anteil [%] Medium Ham´s F12 [ml] (inkl. Pen/Strep, L-Glu) FCS [ml] G418 [µl]
0 10 - 40 2 9,8 0,2 40 4 9,6 0,4 40 6 9,4 0,6 40 8 9,2 0,8 40 10 9 1 40
Es wurden pro Experiment jeweils zwei identisch befüllte 24-Well-Platten verwendet,
wobei für jeden Test (definierte Zellzahl mit definierter FCS- Konzentration im
Medium) ein Doppelansatz vorbereitet wurde. Dabei wurde eine Platte für die
Zellzahlbestimmung und die zweite Platte für die Bestimmung des GFP-Gehalts am
Spektrofluorometer genutzt, was in Kapitel 2.3 beschrieben wird.
Die Verteilung der Zellsuspension ist in Abbildung 2.2 dargestellt.
Abbildung 2.2: Pipettierschema zur Aussaat der CHO-Zellen in einer 24-Well-Platte. Pro Analysengang wurden jeweils zwei indentisch befüllte Platten ausgesät, um zum einen die Zellzählung und zum anderen die Fluoreszenzmessung durchzuführen. Dabei wurden jeweils die ersten vier Wells mit je 1ml Zellsuspension befüllt (1-4). Nach Resuspendieren der Suspension durch Schwenken wurden die nächsten vier Wells der anderen Platte befüllt (5-8). Je nach Vorgabe des Experiments wurde die entsprechende Menge an Wells nach diesem Schema befüllt.
Quelle: eigene Zeichnung; Lisa Schindler; 2012
Material und Methoden
24
2.1.3.6 Kryokonservierung
Um eine Zelllinie möglichst dauerhaft zu erhalten, ist es von großer Wichtigkeit,
Zellen in niedrieger Passagenzahl in einem oder mehreren Kryoröhrchen
einzufrieren. Voraussetzung dafür ist, eine gesunde, unkontaminierte und möglichst
junge und vitale Zellkultur zu verwenden. Dazu werden die ausgewählten Zellen in
den Kulturflaschen mit PBS- gewaschen, mit Trypsin/EDTA abgelöst und
anschließend mit Medium versetzt. Dieser Arbeitsablauf wurde im oberen Abschnitt
2.1.3.4 (Passagieren von Zellen/ Medienwechsel) genauer beschrieben. Nachdem die
Zellsuspension vorsichtig resuspendiert wurde, konnte diese in ein 50ml-
Zentrifugenröhrchen überführt werden. Im Anschluss wurden die Zellen 3 min bei
300Xg (g= Erdbeschleunigung ≈9,81m/s²) bei Raumtemperatur zentrifugiert und der
Überstand verworfen. Je nach Suspensionsvolumen wurde das entstandene Pellet in
Einfriermedium resuspendiert. Dabei wurde pro 10ml Zellsuspension je 1ml
Einfriermedium verwendet. Die so entstandene Suspension wurde nun auf
Tiefkühlröhrchen aliquotiert (pro Röhrchen jeweils 1ml Einfriersuspension) und
zuerst für zwei Stunden in einem Styroporbehälter bei 4°C gekühlt, anschließend über
Nacht bei -20°C und danach über Nacht bei -80°C eingefroren. Hier sind die Zellen nun
mehrere Monate haltbar. Um eine Langzeitaufbewahrung zu gewährleisten, wurden
die Zellen nach Einfrieren bei -80°C in flüssigen Stickstoff eingelagert. Das
schrittweise Abkühlen der Zellen ist notwendig, um die Zellen möglichst schonend
tiefzugefrieren und keine Schäden an der Zellstruktur zu hinterlassen.
2.2 Zellzahlbestimmung
Die Zellzahlmessung war für die exakte Auswertung der Ergebnisse der einzelnen
Experimente notwendig, um einen genauen Verlauf des Zellwachstums bzw.
Zellsterbens zu erkennen. Ebenso war diese Messung notwendig, um das gemessene
Fluoreszenzsignal auf die Anzahl an CHO-Zellen zu beziehen und somit eine Aussage
über die Expression der Zellen von rekominantem grün fluoreszierendem Protein
treffen zu können.
Bei dem verwendeten Zellzählgerät handelt es sich um den „Countess™ Automated
Cell Counter“ von Invitrogen.
Material und Methoden
25
Die Herstellung der zu messenden Zellsuspension knüpft an das schon in Kapitel
2.1.3.4 beschriebene Ablösen der Zellen an. Abhängig davon, ob es sich um das
Ablösen von einer Zellkulturflasche, oder einer 24-Well-Platte handelt, werden die
entsprechenden Volumina, die der Tabelle 2.2 zu entnehmen sind, verwendet.
2.2.1 Beladen der Zählkammer/ Messung durch Countess™ Automated Cell Counter
Hierzu wurden vorbereitend die Probe im Verhältnis 1:1 mit einer 0,4%igen
Trypanblau- Lösung gemischt. Anschließend wurden aus diesem Gemisch 10µl in eine
der beiden halbmondförmigen Zellzählkammeröffnungen pipettiert (gekennzeichnet
mit A oder B). Anschließend wurde die Seite mit der Probe nach vorn in die passende
Öffnung im Zellzählgerät geschoben, bis ein leises „Klick“ ertönt. Um ein scharfes Bild
der Zellen zu bekommen, und somit eine präzise Messung zu gewährleisten, wurde als
erstes die Zoomtaste betätigt, sodass die einzelnen Zellen gut sichtbar waren. Mit
Hilfe des Fokusrädchens an der Seite des Gerätes konnte man das Bild so einstellen,
dass eine optimale Messung möglich war. Dazu sollen die lebenden Zellen ein klares
Zentrum und eine dunkle Umrandung besitzen, wobei die toten Zellen einen
gleichförmigen dunklen Farbraum ohne ein helles Zentrum aufweisen (siehe
vergleichend Abb. 2.3).
Abbildung 2.3: Lebende und tote Zellen mit der richtigen/optimalen Einstellung am Countess™ Automated Cell Counter von Invitrogen. Die als lebend gekennzeichneten Zellen (Live) besitzen ein klares Zentrum und eine dunkle Umrandung. Die als tot gekennzeichneten Zellen (Dead) haben einen gleichförmigen dunklen Farbraum ohne ein helles Zentrum. Mit Hilfe der Software des Gerätes können diese beiden Signaltypen unterschieden werden.
Quelle::invitrogen.com
Material und Methoden
26
Um die Messung durchzuführen musste die „Count cells – Taste“ betätigt werden.
Nach circa 30sec erscheint das Ergebnis der Messung auf dem Display und kann von
dort auf einen USB-Stick gespeichert werden. Mit Hilfe des Countess™ Automated Cell
Counter von Invitrogen kann nicht nur die Gesamtzellzahl, sondern auch die jeweils
lebenden und toten Zellen genau bestimmt werden. In Abbildung 2.4 werden die
einzelnen Schritte noch einmal mit Hilfe von Bildern dargestellt.
Abbildung 2.4: Schrittweise durchgeführte Zellzahlmessung mit Hilfe des Countess™ Automated Cell Counter von Invitrogen. Pipettieren der vorbereiteten Zelllösung in die Zählkammer (A); die befüllte Zellzählkammer wir in das Gerät eingeführt (B); nach Einstellung der gewünschten Parameter muss der Knopf „Count cells“ betätigt werden (C); nach cirka 30sec erscheint das Ergebnis auf dem Display des Zählgerätes.
Quelle: invitrogen.com
2.3 Fluoreszenzmessung
2.3.1 Spektrofluorometer
Bei einem Spektrofluorometer handelt es sich um ein wissenschaftlich genutztes
Instrument, das die fluoreszierenden Eigenschaften von Verbindungen nutzt, um eine
Aussage über Konzentration einer Probe zu liefern. Speziell für die Vermessung von
GFP nutzt man die Fluoreszenzspektroskopie, auch bekannt als Fluorometrie oder
Material und Methoden
27
Spektrofluorometrie, die eine spezielle Art der elektromagnetischen Spektroskopie
darstellt und die Fluoreszenz einer Probe analysiert.
Für die Messung der Probe wurde ein Spektrofluorometer der Firma Shimadzu
(Modell: RF-5301PC) verwendet. Als Probengefäß wurde eine Quarzküvette
eingesetzt, da diese das zur Messung verwendete UV-Licht nicht absorbiert und somit
die Ergebnisse nicht verfälscht.
Mit Hilfe der speziell entwickelten Software „Panorama“ die auf einem an das
Spektrofluorometer angeschlossenen Computer installiert ist, können die Messungen
gesteuert und ausgewertet werden.
Bevor die einzelnen Ansätze vermessen werden konnten, musste das
Spektrofluorometer bereits etwa 30min vor Messbeginn eingeschaltet werden, damit
der Verschleiß der Lampe möglichst gering gehalten wird und somit die
Nutzungsdauer erhöht werden kann.
Abbildung 2.5: Spektrofluorometer der Firma Shimadzu (Modell: RF-5301PC) Gerät mit angeschlossenem Computer (Bild links); Probenraum zur Messung der GFP-Proben (Bild rechts)
Quelle: eigene Fotos; Lisa Schindler; 2012
2.3.2 Vorbereiten der Zellen von einer 24-Well-Platte zur anschließenden Vermessung im Spektrofluorometer
Um die Zellen für die Messung im Spektrofluorometer vorzubereiten, müssen diese
mit Hilfe eines Lysatpuffers permeabilisiert werden, da es sich beim GFP um ein
intrazelluläres Protein handelt. Dabei muss besonders darauf geachtet werden, dass
Material und Methoden
28
das GFP durch das Einwirken des Lysatpuffers nicht denaturiert und somit verloren
geht. Ebenso ist es von enormer Wichtigkeit, dass der Puffer keinen Einfluss auf die
Messung ausübt und somit beispielsweise keine Streuung dieser bewirkt. Aus der
Projektarbeit von Aasif und Schröder konnte entnommen werden, dass sich für diesen
Versuch ein Gemisch aus PBS- mit 0,5% Triton X-100 am besten eignet [Aasif und
Schröder, 2010].
Beim Vorbereiten der Zellen für die anschließende Vermessung am
Spektrofluorometer waren keine sterilen Arbeitsbedingungen nötig. Im ersten Schritt
wurde das alte Medium verworfen und jedes mit Zellen bewachsene Well einmal
vorsichtig mit 1ml PBS- gewaschen. Im Folgenden wurde in jedes Well jeweils 2ml des
vorbereiteten Lysatpuffer pipettiert. Anschließend wurde die 24-Well-Platte in einem
mit Eis gefüllten Gefäß auf einem Kippschüttler positioniert und für 30min bei
ständiger Bewegung inkubiert. Eine Kühlung war notwendig, um das Protein zu
schonen und somit eine genauere Messung zu ermöglichen [Aasif und Schröder,
2010]. Nach Abschluss der Inkubationszeit wurde das Zelllysat mit Hilfe einer 1000µl
Pipette mehrmals resuspendiert, um noch eventuell intakte Zellen mechanisch
aufzubrechen.
Zur Messung des GFP-Signals der Probe wurde das Lysat in eine Quarzküvette
überführt, in den Probenmessraum des Gerätes platziert (siehe Abbildung 2.5) und
sofort vermessen.
2.3.3 Messung der Probe mit Hilfe der Software Panorama
Mit Hilfe der Ausarbeitungen von Stephanie Westphal zum Thema „Einfluss von
Serum und Serumersatzstoffen auf die Expression von rekombinantem Grün
Fluoreszierenden Protein in CHO-Zellen“ konnten alle Parameter, wie zum Beispiel
Wellenlänge, Emissionsstart, Emissionsstop oder die Messgeschwindigkeit
übernommen werden. Die einzelnen Werte werden in der folgenden Tabelle 2.5
aufgeführt.
Material und Methoden
29
Tabelle 2.5 Einzelne, am Gerät einzustellende Parameter für die Messung der GFP-Probe
2D Emissionsmessung
Anregungswellenlänge Emissions-Start Emissions-Stop
434 nm 300 nm 600 nm
Instrumentenparameter
Anregungs- Schlitzbreite Emissions- Schlitzbreite Empfindlichkeit
10 nm 10 nm Hoch
Messparameter
Messgeschwindigkeit Antwortzeit Abtastzeit
Super Automatisch 1 nm
Um im vollen Umfang eine Messung durchführen und anschließend speichern zu
können, muss zuerst einmalig ein Überordner erstellt werden, der für diese Arbeit mit
„LS“ gekennzeichnet wurde. Dies ist unter dem Menüpunkt <Projekt><Neu> möglich.
Ebenso war es im Anschluss möglich für jedes durchgeführte Experiment einen
Unterordner zu erstellen, der mit dem jeweiligen Datum und der Nummer des
Experimentes benannt wurde.
Abbildung 2.6: Software Panorama; Ausschnitt des Ordners <Projekt> Unter dem in der Menüleiste angeführten Ordner „Projekt“ kann ein neuer/ eigener Projektordner erstellt werden.
Quelle: Westphal, 2011
Anschließend wurde im Menüpunkt <RF-5301> die Messmethode
2D-Emissionsmessung für die Vermessung der GFP-Proben eingestellt.
Material und Methoden
30
Abbildung 2.7: Software Panorama; Ausschnitt des Ordners <RF-5301> Unter dem in der Menüleiste angeführten Ordner „RF-5301“ ist die Methode der 2D Emissionsmessung auszuwählen.
Quelle: Westphal, 2011
Für die nun folgende Probenmessung wurde die gesamte vorbereitete Probe (siehe
Kapitel 2.3.2) in eine Quarzküvette pipettiert. Hier muss besonders darauf geachtet
werden, dass die Seitenwände der Küvette möglichst sauber und klar sind, damit die
Messung nicht verfälscht wird. Ebenso kann es durch die gekühlte Probe zu einer
Kondenswasserbildung an den Seitenwänden kommen. Diese müssen vor der
Messung mit Hilfe eines Papiertuches getrocknet werden.
Nachdem die Eingabe der Messdaten erfolgt ist (Tabelle 2.5), wurde die Küvette samt
Probeninhalt in den vorgesehenen Halter im Probenmessraum positioniert und die
Messung gestartet. Nach Abschluss der Messung konnte durch das automatische
Öffnen eines Fensters auf dem Display der Name und das Datum der Einzelmessung
gespeichert werden, um eine Übersicht der Messergebnisse zu gewährleisten.
2.3.4 Peakflächenberechnung mit Hilfe der Software Panorama
Zum Berechnen der Peakflächen wurde unter dem Menüpunkt <Mathematik> das
Programm <Peaksuche> ausgewählt.
Material und Methoden
31
Abbildung 2.8: Peakflächenberechnung a) Menüpunkt <Mathematik> mit der Auswahl <Peaksuche> in der Sofware Panorama, b) Ausschnitt des Fenster nach Auswahl des Programmpunktes <Peaksuche>
Quelle: Westphal, 2011
Nach Auswahl des Menüpunkes <Peaksuche> erscheint eine rote Gerade über der
Messkurve (siehe Abbildung 2.9). Diese Gerade wurde mit Hilfe einer Pfeiltaste nach
unten bewegt bis sich die Fläche unter der Kurve grau eingefärbt hat. Anschließend
wurde die Schaltfläche <Berechnen> ausgewählt. Die vom Programm automatisch
festgelegten Anfangs- und Endwerte zur Berechnung der Peakfläche wurden in der
Peaktflächentabelle (Abbildung 2.10) angezeigt und konnten nach Belieben verändert
werden. Nach einer möglichen Änderung wurde der Wert für die Peakfläche von der
Software automatisch angepasst bzw. berechnet.
Abbildung 2.9: Darstellung der Grenzen der Peakflächenberechnung Die dargestellten Zahlen im oberen Bereich zeigen die Emissionswellenlänge der vom Programm ermittelten Maxima. Die obere Gerade stellt dabei den Anfangszustand dar. Die untere Gerade stellt Soll-Endzustand für Berechnung dar. Die geraden dürfen nur so verschoben werden, dass der Peak in einem grauen Farbton erscheint. Die ist der Berechnungsbereich für das Fluoreszenzsignal.
Quelle: Westphal, 2011
Material und Methoden
32
Abbildung 2.10: Peakflächentabelle Türkis hinterlegtes Feld stellt Messdaten der GFP-Expression dar. Anfangs- und Endwert der Peakflächenberechnung können verändert werden. Peakflächenwerte werden der Spalte "Peakfläche" entnommen.
Quelle: Westphal, 2011
2.4 Fluoreszenzmikroskopie
In der Fluoreszenzmikroskopie können Strukturen oder Proteine spezifisch durch
Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen sichtbar gemacht werden. Fluoreszierende
Farbstoffmoleküle absorbieren Licht bei bestimmten Wellenlängen und emittieren
längerwelliges, charakteristisches Fluoreszenzlicht.
Abbildung 2.11: Verwendetes Fluoreszenzmikroskop der Firma Olympus (Modell: BX41)
Quelle: eigenes Foto; Lisa Schindler; 2012
Um eine Immunfluoreszenzanalyse durchführen zu können, mussten die
entsprechenden CHO-Zelllinien auf sterilen Deckgläschen in einer 24-Well-Platte
ausgesät werden. Die Deckgläschen wurden dazu vorher autoklaviert und
anschließend mit einer spitzen Pinzette möglichst vorsichtig unter sterilen
Bedingungen in die 24-Well-Kulturplatte überführt. Im Folgenden wurden die aus
Material und Methoden
33
einer konfluenten T75-Flasche abgelösten Zellen (Arbeitsanweisungen siehe
Kap. 2.1.2) mit einer Zelldichte von 1x105 und 1x106 Zellen pro Well ausgesät. Die
Zellkulturplatten werden nun im Inkubator bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert.
Nach 24 h wurde das alte Medium entfernt und durch neues Medium mit
unterschiedlichen FCS-Anteilen ersetzt, was in der oben bereits eingefügten Tabelle
2.3 dargestellt ist. Dabei wurde jeweils 1ml neues Medium pro Well verwendet.
Nach einer Inkubationszeit von 96h wurden die Zellen für die
Fluoreszenzmikroskopie vorbereitet. Dazu wurde das alte Medium verworfen und die
Zellen im ersten Schritt jeweils zweimal kurz mit PBS- gewaschen. Anschließend
wurden 500µl einer 3%ige Paraformaldehydlösung in die Wells pipettiert und für
30min inkubiert, was die Zellen fixierte. Sodann wurden die Zellen jeweils drei Mal für
5min mit PBS- gewaschen und mit 1000µl einer 50mM Ammoniumchlorid-Lösung (in
PBS gelöst) überschichtet und für 30min inkubiert. Dieser Schritt dient dem
Quenchen der Aldehydgruppen (Schlagartiges Abbrechen der Reaktion).
Anschließend wurden die Zellen dreimal für 5min mit PBS- gewaschen. Im letzten
Schritt wird auf einen Objektträger je 5µl Mowiol vorgelegt und das Deckgläschen
kurz in autoklaviertes Wasser getaucht, wobei der Überschuss an Wasser wieder
vorsichtig mit einem Papiertuch entfernt wird. Mowiol wird verwendet, da es die
Fluoreszenz der Zellen nicht verändert. Die Deckgläschen werden mit den Zellen nach
unten auf den Mowiol-Tropfen gelegt, über Nacht in einer lichtundurchlässigen Box
getrocknet und können dann für die Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden.
Tabelle 2.6: Lösungen für die Fluoreszenzmikroskopie
Paraformaldehydlösung
- 1600ml PBS auf 80°C erhitzen - 60g Paraformaldehyd zufügen und
mischen, bis klare Lösung entsteht - 200µl 1M CaCl2 zufügen und mit 200µl 1M
MgCl2 versetzt, während die Lösung noch warm ist
- abkühlen lassen und mit PBS- auf 2000ml auffüllen
- auf pH 7.4 einstellen - Lagerung: bei -20°C in 10ml Aliquots
Material und Methoden
34
Ammoniumchlorid - 2,675g NH4Cl in PBS lösen - auf 1l mit PBS auffüllen
Mowiol - 6g Glycerol in einem 50ml Falkon abwiegen
- 2,49g Mowiol zufügen und gut mischen - 6ml ddH2O hinzu und etwa 2h bei RT gut
mischen - 12ml 0,2M Tris-HCL-Lösung (pH8.5)
hinzufügen und bei 53°C mischen, bis Mowiol gut gelöst ist
- um Lösung zu klären bei 4.000rpm 20min zentrifugieren; den Überstand aliquotieren und bei -20°C lagern
Ergebnisse
35
3 Ergebnisse
3.1 Einfluss von FCS auf Proliferation und Expression der beiden Zelllinien CHO-GFP und CHO-GFP-Rab11 in Abhängigkeit von der Aussaatdichte
Beide CHO-Zelllinien wurden nach Ablösen von einer T75-Zellkuturflasche mit Hilfe
des Zellzählgerätes gezählt und somit die genaue Zellzahl bestimmt. Die für das
Experiment benötigten Zellzahlen (1x105, 3x105, 5x105, 1x106 Zellen pro Well)
wurden anschließend in einem 50ml-Zentrifugenröhrchen mit der dementsprechend
ausgerechneten Menge an Ham´s F12 Medium verdünnt. Ebenso wurde diese
Zellsuspension mit Antibiotikum (G418) versetzt. Die einzelnen Ansätze wurden auf
24-Well-Platten verteilt und für 24h in den Brutschrank gestellt. Nach dieser
Inkubationszeit wurde ein Medienwechsel mit den verschiedenen Konzentrationen an
FCS (0% FCS – 10% FCS) durchgeführt, wobei für jeden Medienansatz
Doppelbestimmungen vorlagen.
3.1.1 Einfluss von FCS auf Proliferation und Expression bei niedriger Aussaatdichte (1x105)
Für die genaue Betrachtung der Proteinexpression in adhärenten Zellen ist die
Aussaatdichte ein sehr wichtiger Faktor. Ebenso ist die Untersuchung der
Unterschiede zwischen den im Medium enthaltenen Konzentrationen an FCS ein
wichtiger Aspekt [Boxberger, 2007].
Ergebnisse
36
0
100000
200000
300000
400000
0%FCS 2%FCS 4%FCS 6%FCS 8%FCS 10%FCS
FCS-Konzentration
Ze
llza
hl
pro
cm
²
CHO-GFP-Rab11
CHO-GFP
Zellaussat pro cm²
Abbildung 3.1: Einfluss von FCS auf die Proliferation bei niedriger Aussaatdichte (1x105) Dargestellt ist der Verlauf des Wachstums der Zellen pro cm² in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium. Die Zellen wurden 24h nach Anheftung in das entsprechende Medium überführt und weitere 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert. Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Die dargestellte Linie stellt die Zelldichte (hier: 1x105) dar, mit der die Zellen ausgesät wurden. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) miteinander verglichen, die mit unterschiedlich farbigen Balken gekennzeichnet sind.
In Abbildung 3.1 wird das Zellwachstum in Abhängigkeit der vorhandenen
Konzentration an fetalem Kälberserum im Kulturmedium dargestellt. Dabei wurden
zwei unterschiedliche Zelllinien miteinander verglichen, um die Allgemeingültigkeit
der Ergebnisse und den daraus erzielten Aussagen zu untersuchen. Um die einzelnen
Zelllinien voneinander unterscheiden zu können, wurden unterschiedlich farbige
Diagrammbalken (rosa, blau) verwendet.
Es ist deutlich zu erkennen, dass das Zellwachstum anfänglich linear ansteigt, je mehr
FKS im Medium enthalten ist. Betrachtet man dabei die einzelnen Zelllinien
untereinander ist ihre Wachstumkurve in etwa gleich. Dabei zeigt sich, dass diese
Entwicklung bei einer FCS-Konzentration von 4% abflacht und erreicht ein Plateau.
Durch die im Diagramm eingezeichnete Aussaat-Linie ist zu erkennen, dass die Zellen
in jedem Ansatz proliferieren. Dabei wird allerdings ein enormer Unterschied
zwischen dem Zellwachstum bei 0% FCS und 10% FCS im Medium deutlich. Bei einer
FCS- Konzentration von 0% hat sich die Zellzahl um etwa das Doppelte gesteigert.
Vergleichend dazu sind die Zellendichten bei einer FCS- Konzentration von 10% um
etwa das vier bis fünf fache gestiegen.
Im Weiteren wurde nicht nur das Zellwachstum, sondern auch die im
Spektrofluorometer gemessene Expression von GFP pro Zelle in Bezug gestellt.
Ergebnisse
37
0
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
0,014
0,016
0,018
0%FCS 2%FCS 4%FCS 6%FCS 8%FCS 10%FCS
FCS-Konzentration
GF
P (
Pe
ak
flä
che
) p
ro Z
ell
e
CHO-GFP-Rab11
CHO-GFP
Abbildung 3.2: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle bei niedriger Aussaatdichte (1x105) Dargestellt ist der Verlauf der GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle in Abhängigkeit von der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium. Die relativen Werte an GFP/ GFP-Rab11 wurden mit Hilfe eines Spektrofluorometer und der Software Panorama als Peakfläche dargestellt und berechnet. Die Zellen wurden 24h nach Anheftung in das entsprechende Medium überführt und weitere 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert. Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) miteinander verglichen, die mit unterschiedlich farbigen Balken gekennzeichnet sind.
Betrachtet man nun die Expression an GFP/ GFP-Rab11, ist zu erkennen, dass bei
Zugebe von FCS im Medium die beobachtbare Proteinexpression zurückgeht
(Abbildung 3.2). Die größte Expressionsabnahme ist von 0% auf 2% FCS festzustellen,
danach schwanken die Werte auf ähnlichem Niveau. Dabei ist in beiden Zelllinien zu
sehen, dass das größte Signal des fluoreszierenden Proteins bei einer Konzentration
von 0% FCS im Medium gemessen wurde. Unterschiedlich sind die einzelnen Werte
der Zelllinien untereinander. Dabei ergeben die Signale der CHO-GFP-Zelllinie erhöhte
Werte im Bezug auf die andere Zelllinie (CHO-GPF-Rab11).
Ergebnisse
38
0
1000
2000
3000
0%FCS 2%FCS 4%FCS 6%FCS 8%FCS 10%FCS
FCS-Konzentration
GF
P (
Pe
ak
flä
che
) p
ro c
m²
CHO-GFP-Rab11
CHO-GFP
Abbildung 3.3: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro cm² bei niedriger Aussaatdichte (1x105) Dargestellt ist der Verlauf der GFP-/ GFP-Rab11-Expression bezogen auf die Wachstumsfläche pro cm² in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium. Die relativen Werte an GFP wurden mit Hilfe eines Spektrofluorometer und der Software Panorama als Peakfläche dargestellt und berechnet. Die Zellen wurden 24h nach Anheftung in das entsprechende Medium überführt und weitere 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert. Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) miteinander verglichen, die mit unterschiedlich farbigen Balken gekennzeichnet sind.
Die Messung des gesamten Zelllysates gab Aufschluss über den Anteil an GFP pro cm²
bewachsener Kulturfläche und spiegelt somit die Summe beider Parameter Zelldichte
und Expression der Zellen wider. Dabei ist zu erkennen, dass die Menge an GFP pro
cm² mit steigender FCS- Konzentration stetig zunimmt, wobei ab 4% FCS die
Zunahme stark abflacht (Abbildung 3.3). Dabei wurde feststellt, dass trotz der hohen
Werte in der GFP-Expression pro Zelle bei einer Kultivierung ohne Serum, die Signale
der Gesamtprobe relativ gering im Vergleich zur Kultivierung mit Serum sind. Das
liegt daran, dass die Zellen ohne serumhaltiges Medium eine viel geringe Proliferation
aufweisen.
3.1.2 Einfluss von FCS auf Proliferation und Expression bei hoher Aussaatdichte (1x106)
Um die Bedeutung der Aussaatdichte der Zellen auf das Wachstum und die
entsprechende GFP-Expression zu untersuchen, wurden die Zellen in einem zweiten
Experiment sehr dicht ausgesät. Dabei sollte untersucht werden, ob sich beide
Zelllinien bei einer Aussaatdichte von 1x106 pro Well ähnlich verhalten wie in dem
vorherigen Experiment, bei einer Zelldichte von 1x105 pro Well.
Ergebnisse
39
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
0%FCS 2%FCS 4%FCS 6%FCS 8%FCS 10%FCS
FCS-Konzentration
Ze
llza
hl
pro
cm
²CHO-GFP-Rab11
CHO-GFP
Zellaussat pro cm²
Abbildung 3.4: Einfluss von FCS auf die Proliferation bei hoher Aussaatdichte (1x106) Dargestellt ist der Verlauf des Wachstums der Zellen pro cm² in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium. Die Zellen wurden 24h nach Anheftung in das entsprechende Medium überführt und weitere 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert. Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Die dargestellte Linie stellt die Zelldichte (hier: 1x106) dar, mit der die Zellen ausgesät wurden. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) miteinander verglichen, die mit unterschiedlich farbigen Balken gekennzeichnet sind.
Bei einer Aussaatdichte von 1x106 ist deutlich zu sehen, dass es kein weiteres
Zellwachstum in den einzelnen Ansätzen gab. Vielmehr ist durch die Reduzierung
oder das Weglassen von FCS ein deutlicher Abfall der Zelldichte zu beobachten, was
besonders in den Ansätzen mit 0%-4% FCS zu sehen ist. Dies deutet auf das Sterben
von Zellen hin. Das Fehlen der wichtigen Faktoren, die im FCS enthalten sind
(Wachstumsfaktoren, Spurenelemente, Hormone), hat offensichtlich bei einer hohen
Aussaatdichte einen besonders großen Einfluss auf das Überleben der Zellen. Für die
Kultivierung mit 6%-10% FCS ist zu erkennen, dass die Zellen trotz Serum nicht
weiter proliferieren können. Dies lässt darauf schließen, dass mit einer Zelldichte von
1E6 pro Well die maximale Wachstumsfläche ausgeschöpft ist.
Ergebnisse
40
0
0,002
0,004
0,006
0%FCS 2%FCS 4%FCS 6%FCS 8%FCS 10%FCS
FCS-Konzentration
GF
P (
Pe
ak
flä
che
) p
ro Z
ell
e
CHO-GFP-Rab11
CHO-GFP
Abbildung 3.5: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle bei hoher Aussaatdichte (1x106) Dargestellt ist der Verlauf der GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle in Abhängigkeit von der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium. Die relativen Werte an GFP/ GFP-Rab11 wurden mit Hilfe eines Spektrofluorometer und der Software Panorama als Peakfläche dargestellt und berechnet. Die Zellen wurden 24h nach Anheftung in das entsprechende Medium überführt und weitere 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert. Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) miteinander verglichen, die mit unterschiedlich farbigen Balken gekennzeichnet sind.
Auch bei einer hohen Aussaatdichte ist zu sehen, dass die Produktion an GFP/
GFP-Rab11 pro Zelle bei serumfreier Kultur bzw. niedriger FCS- Konzentration am
deutlichsten ausgeprägt ist und somit die Präsenz von Serum die Expression von GFP
reduziert. Allerdings ist dieser Effekt nicht mehr so stark ausgeprägt, wie bei der in
Abbildung 3.2 dargestellten geringern Aussaatdichte.
Zusätzlich ist noch der Unterschied zwischen den einzelnen Zelllinien bzw.
expremierten Proteinen zu berücksichtigen. Die rosa hinterlegten Balken, die auf die
Werte der CHO-GFP-Zelllinie hinweisen, zeigen einen Abfall der Werte an
vorhandenem GFP, je weniger Serum sich im Medium befindet. Hingegen verhält sich
die CHO-GFP-Rab11-Zelllinie, die durch blau hinterlegte Balken gekennzeichnet ist,
eher leicht ansteigend, bzw. auf einer gleichen Konzentrationsebene an GFP, je mehr
Serum im Medium enthalten ist.
Weiterführend wurden auch hier die Werte für Zelldichte und GFP-Expression
verknüpft, um die Ausbeute an rekombinantem Protein pro cm² Kulturflasche
wiederzugeben.
Ergebnisse
41
0
1000
2000
3000
0%FCS 2%FCS 4%FCS 6%FCS 8%FCS 10%FCS
FCS-Konzentration
GF
P (
Pe
ak
flä
che
) p
ro c
m²
CHO-GFP-Rab11
CHO-GFP
Abbildung 3.6: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro cm² bei hoher Aussaatdichte (1x106) Dargestellt ist der Verlauf der GFP-/ GFP-Rab11-Expression bezogen auf die Wachstumsfläche pro cm² in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium. Die relativen Werte an GFP wurden mit Hilfe eines Spektrofluorometer und der Software Panorama als Peakfläche dargestellt und berechnet. Die Zellen wurden 24h nach Anheftung in das entsprechende Medium überführt und weitere 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert. Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) miteinander verglichen, die mit unterschiedlich farbigen Balken gekennzeichnet sind.
Die Ausbeute pro cm² Wachstumsfläche folgt für das Membranprotein GFP-Rab11
einem ähnlichen Verlauf, wie dies bereits bei niedriger Aussaatdichte zu beobachten
war (Abbildung 3.3), mit zunehmender FCS- Konzentration steigt die
Proteinausbeute. Für das cytosolische GFP ist das nicht der Fall, hier hat CS keinen
förderlichen Einfluss auf die Produktausbeute.
3.1.3 Einfluss von FCS auf Proliferation und Expression bei mittlerer Aussaatdichte (3x105, 5x105)
Um zu untersuchen, wie die Zellen sich bei mittleren Aussaatdichten verhalten
wurden diese in Konzentrationen von 3x105 und 5x105 Zellen pro Well ausgesät und
vermessen. Dabei sollte festgestellt werden, wie sich die Zellen im Vergleich zu den
vorher vermessenen extremen Aussaatdichten von 1x105 und 1x106 verhalten.
Ergebnisse
42
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
0%FCS 2%FCS 4%FCS 6%FCS 8%FCS 10%FCS
FCS-Konzentration
Ze
llza
hl
pro
cm
²
CHO-GFP-Rab11
CHO-GFP
Zellaussat pro cm²
Abbildung 3.7: Einfluss von FCS auf die Proliferation bei mittlerer Aussaatdichte (3x105) Dargestellt ist der Verlauf des Wachstums der Zellen pro cm² in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium. Die Zellen wurden 24h nach Anheftung in das entsprechende Medium überführt und weitere 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert. Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Die dargestellte Linie stellt die Zelldichte (hier: 3x105) dar, mit der die Zellen ausgesät wurden. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) miteinander verglichen, die mit unterschiedlich farbigen Balken gekennzeichnet sind.
Auch bei einer mittleren Aussaatdichte von 3x105 pro Well ist zu beobachten, dass
sich das Zellwachstum mit zunehmender FCS- Konzentration deutlich steigert. Ab
einer FCS- Konzentration von 4% (GFP) bzw. 6% (GFP-Rab11) flacht die Steigung ab.
Dabei wachsen die CHO-GFP-Rab11-Zellen etwas langsam, besonders in serumfreier
Kultur. Im Gegensatz dazu haben sich die CHO-GFP-Zellen in serumfreien Medium
sehr gut vermehrt und können eine fast 100%ig höhere Zellzahl nach 72h aufweisen.
Bei einer Kultivierung mit serumhaltigem Medium ist allerdings eine bis zu dreimal
höhere Zellzahl als ohne Serum zu erkennen. Das Wachstum der Zellen wird somit
auch bei einer mittleren Aussaatdichte stark vom Vorhandensein von Serum
beeinflusst.
Ergebnisse
43
0
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
0%FCS 2%FCS 4%FCS 6%FCS 8%FCS 10%FCS
FCS-Konzentration
GF
P (
Pe
ak
flä
che
)pro
Ze
lle
CHO-GFP-Rab11
CHO-GFP
Abbildung 3.8: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle bei mittlerer Aussaatdichte (3x105 ) Dargestellt ist der Verlauf der GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle in Abhängigkeit von der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium. Die relativen Werte an GFP/ GFP-Rab11 wurden mit Hilfe eines Spektrofluorometer und der Software Panorama als Peakfläche dargestellt und berechnet. Die Zellen wurden 24h nach Anheftung in das entsprechende Medium überführt und weitere 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert. Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) miteinander verglichen, die mit unterschiedlich farbigen Balken gekennzeichnet sind.
Beider Betrachtung der GFP/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle ist wieder deutlich
erkennbar, dass bei beiden Zelllinien der Expression an Protein bei einer
Konzentration von 0%FCS deutlich erhöht ist. Mit steigendem Serumanteil im
Medium sinken die relativen Werte an GFP pro Zelle, wobei sich der Trend bei etwa
6% FCS- Anteil stabilisiert. Beide Zelllinien verhalten sich in ihrem Verlauf auch hier
sehr ähnlich.
Ergebnisse
44
0
1000
2000
3000
0%FCS 2%FCS 4%FCS 6%FCS 8%FCS 10%FCS
FCS-Konzentration
GF
P (
Pe
ak
flä
che
) p
ro c
m²
CHO-GFP-Rab11
CHO-GFP
Abbildung 3.9: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro cm² bei mittlerer Aussaatdichte (3x105) Dargestellt ist der Verlauf der GFP-/ GFP-Rab11-Expression bezogen auf die Wachstumsfläche pro cm² in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium. Die relativen Werte an GFP wurden mit Hilfe eines Spektrofluorometer und der Software Panorama als Peakfläche dargestellt und berechnet. Die Zellen wurden 24h nach Anheftung in das entsprechende Medium überführt und weitere 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert. Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) miteinander verglichen, die mit unterschiedlich farbigen Balken gekennzeichnet sind.
In Bezug auf die Ausbeute pro Wachstumsfläche kann wieder festgestellt werden,
dass die Werte mit steigender FCS- Konzentration sich schrittweise deutlich erhöhen.
Dabei ist zu erkennen, dass sich für die GFP- Expression die Werte im Bereich von
4%-10% FCS angleichen und ein Plateau erreichen. Die Expression von GFP-Rab11
steigt hingegen kontinuierlich an und flacht er bei 10% FCS- Anteil ab, ähnlich der
Beobachtung bei hoher Aussaatdichte (Abbildung 3.6).
Um einen weiteren Bereich in der mittleren Aussaatdichte abdecken zu können,
wurden im Folgenden die Zellen in einer Konzentration von 5x105 Zellen pro Well
ausgesät.
Ergebnisse
45
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
0%FCS 2%FCS 4%FCS 6%FCS 8%FCS 10%FCS
FCS-Konzentration
Ze
llza
hl
pro
cm
²
CHO-GFP-Rab11
CHO-GFP
Zellaussat pro cm²
Abbildung 3.10: Einfluss von FCS auf die Proliferation bei mittlerer Aussaatdichte (5x105) Dargestellt ist der Verlauf des Wachstums der Zellen pro cm² in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium. Die Zellen wurden 24h nach Anheftung in das entsprechende Medium überführt und weitere 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert. Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Die dargestellte Linie stellt die Zelldichte (hier: 5x105) dar, mit der die Zellen ausgesät wurden. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) miteinander verglichen, die mit unterschiedlich farbigen Balken gekennzeichnet sind.
Auch bei dieser Aussaatdichte ist ein stetiger Anstieg des Zellwachstums mit
steigender FCS- Konzentration im Medium zu sehen. Bei 6% FCS- Anteil wird ein
Plateau erreicht. Hierbei sind die Werte und der allgemeiner Verlauf für beide
Zelllinien sehr ähnlich. Werden die Zellen ohne Serum kultiviert, zeigt sich nur eine
Zellezunahme von circa 20%. Hingeben ist bei einer Kultivierung mit serumhaltigem
Medium (10% FCS) eine um 100% gestiegene Zellzahl zu beobachten.
Ergebnisse
46
0
0,002
0,004
0,006
0,008
0%FCS 2%FCS 4%FCS 6%FCS 8%FCS 10%FCS
FCS-Konzentration
GF
P (
Pe
ak
flä
che
) p
ro Z
ell
e
CHO-GFP-Rab11
CHO-GFP
Abbildung 3.11: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle bei mittlerer Aussaatdichte (5x105) Dargestellt ist der Verlauf der GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle in Abhängigkeit von der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium. Die relativen Werte an GFP/ GFP-Rab11 wurden mit Hilfe eines Spektrofluorometer und der Software Panorama als Peakfläche dargestellt und berechnet. Die Zellen wurden 24h nach Anheftung in das entsprechende Medium überführt und weitere 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert. Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) miteinander verglichen, die mit unterschiedlich farbigen Balken gekennzeichnet sind.
Im Hinblick auf die GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle wird auch hier deutlich,
dass sich mit einer Kultivierung ohne Serum das größte Fluoreszenzsignal ergibt.
Dabei zeigt sich, dass ab einer Reduzierung des Serums auf 4% FCS sich die
Expression stabilisiert. Vergleich man die einzelnen Zelllinien untereinander, so ist zu
erkennen, dass die CHO-GFP-Zellen in allen FCS- Konzentrationen erhöhte werde
aufweisen. Dabei ist allerdings der Unterschied bei einer Kultivierung ohne Serum am
geringsten.
Ergebnisse
47
0
1000
2000
3000
0%FCS 2%FCS 4%FCS 6%FCS 8%FCS 10%FCS
FCS-Konzentration
GF
P (
Pe
ak
flä
che
) p
ro c
m²
CHO-GFP-Rab11
CHO-GFP
Abbildung 3.12: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro cm² bei mittlerer Aussaatdichte (5x105) Dargestellt ist der Verlauf der GFP-/ GFP-Rab11-Expression bezogen auf die Wachstumsfläche pro cm² in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium. Die relativen Werte an GFP wurden mit Hilfe eines Spektrofluorometer und der Software Panorama als Peakfläche dargestellt und berechnet. Die Zellen wurden 24h nach Anheftung in das entsprechende Medium überführt und weitere 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert. Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) miteinander verglichen, die mit unterschiedlich farbigen Balken gekennzeichnet sind.
Betrachtet man wieder die GFP- bzw. GFP-Rab11-Ausbeute pro cm² Wachstumsfläche
ist deutlich zu erkennen, dass sich die Werte bis etwa 6% FCS- Anteil leicht erhöhen
(um ca. 20%), um darüber ein Plateau ohne weitere Steigung zu erreichen.
3.2 Versuche zur Entwicklung einer Kultivierungsstrategie zur optimalen Ausbeute an GFP unter Serumentzug
Mit Hilfe dieser Experimente sollte eine Kultivierungsstrategie entwickelt werden, die
es möglich macht eine möglichst hohe Ausbeute an Protein zu erhalten. Dabei wurde
eine längere Kultivierung der Zellen mit zusätzlichen Medienwechseln ausgetestet.
In diesem Experiment wurde nur die CHO-GFP-exprimierende Zelllinie verwendet.
Dabei wurden die Zellen nach Ablösen von einer T75-Zellkuturflasche mit Hilfe eines
Zellzählgerätes gezählt und somit die genaue Zellzahl bestimmt. Die für das
Experiment benötigten Zellzahlen (1x105 oder 5x105) wurden anschließend in einem
50ml-Zentrifugenröhrchen mit der entsprechenden Menge an FCS-haltigem (x%)
Ham´s F12 Medium verdünnt und mit dem Antibiotikum G418 versetzt. Die einzelnen
Ansätze wurden auf 24-Well-Platten verteilt und für 24h im CO2- Inkubator kultiviert.
Nach dieser Inkubationszeit wurde ein Medienwechsel mit den verschiedenen
Konzentrationen an FCS (0% FCS – 10% FCS) durchgeführt, wobei für jeden Ansatz
Ergebnisse
48
Doppelbestimmungen vorgenommen wurden. Nach einer Kultivierung der Zellen für
72h wurde ein zweiter Medienwechsel durchgeführt, wobei das gesamte alte Medium
durch neues Ham´s F12 (+G418, 0-10% FCS) ersetzt wurde. Die ersten Messungen
(Zellzahl und GFP-Expression) wurden nach weiteren 72h Inkubationszeit
durchgeführt. Anschließend wurde ein weiter Medienwechsel durchgeführt, wobei
die Zusammensetzung des neuen Mediums unterschiedlich war. In einem Versuchsteil
bestand das neue Medium aus frischem Ham´s F12 (+G418, 0-10% FCS), in einem
anderen wurde eine 50:50 Medienmischung aus neuem und alten konditionierte
Medium eingesetzt. Die Messung dieser beiden Versuche wurde nach weiteren 96h
Inkubationszeit durchgeführt.
3.2.1 Proliferation und Expression bei einer niedrigen Aussaatdichte (1x105)
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
0%FCS 2%FCS 4%FCS 6%FCS 8%FCS 10%FCS
FCS-Konzentration
Ze
llza
hl
pro
cm
² nach 6 Tagennach 10 Tagen (1)nach 10 Tagen (2)Zellaussat pro cm²
Abbildung 3.13: Einfluss von FCS auf die Proliferation bei niedriger Aussaatdichte (1x105) und 6 bzw. 10 Tagen Kultivierungszeit Dargestellt ist der Verlauf des Wachstums der Zellen pro cm² in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium nach einer geringen Aussaatdichte von 1x105. Für 12h inkubierte Zellen wurden nach dem ersten Medienwechsel für weitere 72h und nach zweitem Medienwechsel nochmals 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert (blaue Balken). Beim zweiten Ansatz wurde ein dritter Medienwechsel mit neuem Medium durchgeführt und die Zellen weitere 96h inkubiert (rosa Balken). Im dritten Ansatz wurde ebenfalls ein dritter Medienwechsel durchgeführt, hier aber mit einer Gemisch aus neuem und altem Medium im Verhältnis 50:50 (gelbe Balken). Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Die dargestellte Aussaat-Linie stellt die Zelldichte (hier: 1x105) dar, mit der die Zellen vor Medienwechsel ausgesät wurden.
Die Zellen wurden hier mit einer Zelldichte von 1x105 pro Well ausgesät und das
Experiment wie im oberen Abschnitt 3.2 beschrieben durchgeführt. Die
Ergebnisse
49
Kultivierungsverfahren des Versuches wurden mit unterschiedlich farbigen Balken
gekennzeichnet. Dabei stellen die blauen Balken die Messung nach 6 Tagen und zwei
Medienwechseln dar. Die rosa farbigen Balken stellen die Messung nach 10 Tagen und
drei Medienwechseln mit neuem Ham´s F12 dar. Die gelben Balken repräsentieren die
Messung der Zellen nach 10 Tagen mit drei Medienwechseln, wobei beim dritten
Medienaustausch eine Mischung aus 50:50 neuem und altem konditionierten Medium
verwendet wurde.
Es ist zu sehen, dass die Zellen sowohl nach 6 Tagen, als auch nach 10 Tagen in
Abhängigkeit von der Serumkonzentration, je mehr Serum im Medium enthalten ist,
umso besser in das Wachstum. Dabei spielt es für das Wachstum der Zellen aber keine
Rolle, ob beim dritten Medienwechsel komplett neues Medium, oder die Mischung aus
neuem und altem Medium verwendet wurde. Die Dauer der Kultivierung hat auf die
erreichte Zellmenge einen größeren Einfluss als die Höhe des verwendeten
FCS- Anteils im Medium.
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0%FCS 2%FCS 4%FCS 6%FCS 8%FCS 10%FCS
FCS-Konzentration
GF
P (
Pe
ak
flä
che
) p
ro Z
ell
e
nach 6 Tagennach 10 Tagen (1)nach 10 Tagen (2)
Abbildung 3.14: Einfluss von FCS auf Expression von GFP pro Zelle bei niedriger Aussaatdichte (1x105) und 6 bzw. 10 Tagen Kultivierungszeit Dargestellt ist der Verlauf der GFP-Expression pro Zellen in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium nach einer geringen Aussaatdichte von 1x105. Für 12h inkubierte Zellen wurden nach dem ersten Medienwechsel für weitere 72h und nach zweitem Medienwechsel nochmals 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert (blaue Balken). Beim zweiten Ansatz wurde ein dritter Medienwechsel mit neuem Medium durchgeführt und die Zellen weitere 96h inkubiert (rosa Balken). Im dritten Ansatz wurde ebenfalls ein dritter Medienwechsel durchgeführt, hier aber mit einer Gemisch aus neuem und altem Medium im Verhältnis 50:50 (gelbe Balken). Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Die dargestellte Aussaat-Linie stellt die Zelldichte (hier: 1x105) dar, mit der die Zellen vor Medienwechsel ausgesät wurden.
Ergebnisse
50
Betrachtet man nun die zelluläre GFP- Expression ist wieder deutlich zu sehen, dass
die Werte der Kultivierung ohne Serum im Vergleich zur Kultivierung mit Serum
deutlich erhöht sind. Diese Tendenz tritt sowohl bei der Messung nach 6 Tagen, als
auch bei der Messung nach 10 Tagen auf. Interessanterweise ist allerdings zu sehen,
dass bei der Messung nach 10 Tagen generell die Balken mit der Medienmischung aus
50:50 neuem und altem Medium deutlich erhöht sind, obwohl die Zellen genauso gut
gewachsen sind, wie beim Medienwechsel mit komplett frischem Medium
(Abbildung 3.13).
-1000
1000
3000
5000
0%FCS 2%FCS 4%FCS 6%FCS 8%FCS 10%FCS
FCS-Konzentration
GF
P (
Pe
ak
flä
che
) p
ro c
m²
nach 6 Tagennach 10 Tagen (1)nach 10 Tagen (2)
Abbildung 3.15: Einfluss von FCS auf Expression von GFP pro cm² bei niedrigen Aussaatdichte (1x105) und 6 bzw. 10 Tagen Kultivierungszeit Dargestellt ist der Verlauf der GFP-Expression pro cm² in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium nach einer geringen Aussaatdichte von 1x105. Für 12h inkubierte Zellen wurden nach dem ersten Medienwechsel für weitere 72h und nach zweitem Medienwechsel nochmals 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert (blaue Balken). Beim zweiten Ansatz wurde ein dritter Medienwechsel mit neuem Medium durchgeführt und die Zellen weitere 96h inkubiert (rosa Balken). Im dritten Ansatz wurde ebenfalls ein dritter Medienwechsel durchgeführt, hier aber mit einer Gemisch aus neuem und altem Medium im Verhältnis 50:50 (gelbe Balken). Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Die dargestellte Aussaat-Linie stellt die Zelldichte (hier: 1x105) dar, mit der die Zellen vor Medienwechsel ausgesät wurden.
In Bezug auf die GFP- Expression pro cm² wird deutlich, dass die Werte der GFP-
Signale bei der Messung nach 6 Tagen einen leichten Anstieg aufweisen, je mehr
Serum im Medium vorhanden ist. Bei der Messung nach 10 Tagen ist zu erkennen,
dass die Signale des fluoreszierenden Proteins bei einem Wert von 0%FKS im Medium
deutlich erhöht sind und sich klar von allen anderen, serumhaltigen Medien absetzen.
Aus dem Diagramm ist ebenso ersichtlich, dass nach dem dritten Medienwechsel mit
Ergebnisse
51
dem Gemisch aus neuem und altem konditionierten Medium die mit Abstand höchste
GFP- Expression erreicht wird.
3.2.2 Proliferation und Expression bei einer mittleren Aussaatdichte (5x105)
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
0%FCS 2%FCS 4%FCS 6%FCS 8%FCS 10%FCS
FCS-Konzentration
Ze
llza
hl
pro
cm
² nach 6 Tagennach 10 Tagen (1)nach 10 Tagen (2)Zellaussat pro cm²
Abbildung 3.16: Einfluss von FCS auf Proliferation bei mittlerer Aussaatdichte (5x105) und 6 bzw. 10 Tagen Kultivierungszeit Dargestellt ist der Verlauf des Wachstums der Zellen pro cm² in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium nach einer mittleren Aussaatdichte von 5E5. Für 12h inkubierte Zellen wurden nach dem ersten Medienwechsel für weitere 72h und nach zweitem Medienwechsel nochmals 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert (blaue Balken). Beim zweiten Ansatz wurde ein dritter Medienwechsel mit neuem Medium durchgeführt und die Zellen weitere 96h inkubiert (rosa Balken). Im dritten Ansatz wurde ebenfalls ein dritter Medienwechsel durchgeführt, hier aber mit einer Gemisch aus neuem und altem Medium im Verhältnis 50:50 (gelbe Balken). Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Die dargestellte Aussaat-Linie stellt die Zelldichte (hier: 5x105) dar, mit der die Zellen vor Medienwechsel ausgesät wurden.
Die Zellen wurden hier mit einer Zelldichte von 5x105 pro Well ausgesät und das
Experiment wie im oberen Abschnitt 3.2 beschrieben durchgeführt. Ziel war es hier zu
überprüfen, ob es vorteilhaft ist die Zellen etwas dichter auszusäen, damit sie
schneller einen dichten Konfluenzgrad erreichen und somit mehr Ausbeute an Zellen
und rekombinantem Protein zu gewinnen ist.
Im Diagramm zur Proliferation der Zellen bei einer Aussaat von 5x105 pro Well ist zu
erkennen, dass unter serumfreien Bedingungen die Zellen weder nach 6 Tagen, noch
nach 10 Tagen über die Aussaatdichte hinaus wachsen. Erst ab einem FCS-Gehalt von
Ergebnisse
52
2% im Medium zeigen die Zellen signifikantes Wachstum, das bei 10 Tagen
Kultivierungsdauer deutlich höher ausfällt, als nach 6 Tagen. Diese Erhöhung der
Zellzahl zeigt sich umso ausgeprägter, je mehr Serum im Medium vorhanden ist.
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0%FCS 2%FCS 4%FCS 6%FCS 8%FCS 10%FCS
FCS-Konzentration
GF
P (
Pe
ak
flä
che
) p
ro Z
ell
e
nach 6 Tagennach 10 Tagen (1)nach 10 Tagen (2)
Abbildung 3.17: Einfluss von FCS auf Expression von GFP pro Zelle bei mittlerer Aussaatdichte (5x105) und 6 bzw. 10 Tagen Kultivierungszeit Dargestellt ist der Verlauf der GFP-Expression pro Zellen in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium nach einer mittlerer Aussaatdichte von 5x105. Für 12h inkubierte Zellen wurden nach dem ersten Medienwechsel für weitere 72h und nach zweitem Medienwechsel nochmals 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert (blaue Balken). Beim zweiten Ansatz wurde ein dritter Medienwechsel mit neuem Medium durchgeführt und die Zellen weitere 96h inkubiert (rosa Balken). Im dritten Ansatz wurde ebenfalls ein dritter Medienwechsel durchgeführt, hier aber mit einer Gemisch aus neuem und altem Medium im Verhältnis 50:50 (gelbe Balken). Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Die dargestellte Aussaat-Linie stellt die Zelldichte (hier: 5x105) dar, mit der die Zellen vor Medienwechsel ausgesät wurden.
Betrachtet man die Expression an GFP pro Zelle zeichnet sich die Tendenz ab, dass die
Biildung des rekombinanten Proteins in serumfreiem Medium erhöht ist, unabhängig
von der Kultivierungsdauer. Bei einem Zusatz von Serum im Medium wird lauf
Diagramm deutlich, dass es keinen signifikanten Unterschied in Bezug auf die
GFP-Expression pro Zelle macht, ob die Kultur mit 2%, 4%, 6%, 8% oder 10% FCS
versetzt wurde.
Ergebnisse
53
-1000
1000
3000
5000
0%FCS 2%FCS 4%FCS 6%FCS 8%FCS 10%FCS
FCS-Konzentration
GF
P (
Pe
ak
flä
che
) p
ro c
m²
nach 6 Tagennach 10 Tagen (1)nach 10 Tagen (2)
Abbildung 3.18: Einfluss von FCS auf Expression von GFP pro cm² bei mittlerer Aussaatdichte (5x105) und 6 bzw. 10 Tagen Kultivierungszeit Dargestellt ist der Verlauf der GFP-Expression pro cm² in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium nach einer mittleren Aussaatdichte von 5x105. Für 12h inkubierte Zellen wurden nach dem ersten Medienwechsel für weitere 72h und nach zweitem Medienwechsel nochmals 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert (blaue Balken). Beim zweiten Ansatz wurde ein dritter Medienwechsel mit neuem Medium durchgeführt und die Zellen weitere 96h inkubiert (rosa Balken). Im dritten Ansatz wurde ebenfalls ein dritter Medienwechsel durchgeführt, hier aber mit einer Gemisch aus neuem und altem Medium im Verhältnis 50:50 (gelbe Balken). Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Die dargestellte Aussaat-Linie stellt die Zelldichte (hier: 5x105) dar, mit der die Zellen vor Medienwechsel ausgesät wurden.
Die GFP-Expression pro cm² zeigt, dass die Werte im Bereich von 0%FKS im Medium
am höchsten sind. Dabei ist offensichtlich, dass die Messungen nach 6 Tagen die
geringsten Signale bei allen FCS- Konzentrationen ergeben. Die Ansätze bei denen
auch ein dritter Medienwechsel durchgeführt wurde, ergeben die höchsten Werte,
wobei sie sich untereinander in ihren Werten nicht bedeutend unterscheiden.
Ergebnisse
54
3.3 Fluoreszenzmikroskopie
3.3.1 Fluoreszenzmikroskopische Analyse der CHO-GFP-Rab11-Zellen
Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie sollte die Intensität und Lokalisation des
GFP-Rab11 in der verwendeten Zelllinie dargestellt werden. Dabei wurden die Zellen
mit Medien, die von 0%-10% FCS enthalten, kultiviert.
Abbildung 3.19: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Zelllinie CHO-GFP-Rab11 bei einer Zelldichte von 1x105 pro Well und unterschiedlichen FCS- Konzentrationen im Medium. Dargestellt sind fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen, die die Lokalisation und Intensität des grün fluoreszierenden Fusionsproteins zeigen. Die Zellen wurden in einer 24-Well-Platte kultiviert. Nach 24h wurde ein Medienwechsel mit den entsprechenden FCS- Konzentrationen durchgeführt. Nach weiteren 96h Inkubationszeit wurden die Zellen für die Fluoreszenzmikroskopie vorbereitet. Die Aufnahmen entstanden mit einer 200fachen Vergrößerung.
Die Aufnahmen der CHO-GFP-Rab11-Zelllinie bei einer Aussaat von 1x105 pro Well
zeigen, dass mit der Zunahme an Serum im Medium die fluoreszierenden Zellen eine
höher Konfluenz aufweisen. Die Intensität an produziertem GFP-Rab11 pro Zelle
verändert sich kaum zwischen den einzelnen FCS- Konzentrationen. Das
membrangebundene rekombinante Protein, ist deutlich in der perinuklearen Region
in der Zelle sichtbar.
Ergebnisse
55
Abbildung 3.20: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Zelllinie CHO-GFP-Rab11 bei einer Zelldichte von 1x106 pro Well und unterschiedlichen FCS- Konzentrationen im Medium
Dargestellt sind fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen, die die Lokalisation und Intensität des grün fluoreszierenden Fusionsproteins zeigen. Die Zellen wurden in einer 24-Well-Platte kultiviert. Nach 24h wurde ein Medienwechsel mit den entsprechenden FCS- Konzentrationen durchgeführt. Nach weiteren 96h Inkubationszeit wurden die Zellen für die Fluoreszenzmikroskopie vorbereitet. Die Aufnahmen entstanden mit einer 200fachen Vergrößerung.
Bei einer Aussaat von 1x106 pro Well zeigen die Zellen eine deutlich verminderte
Fluoreszenz. Die Kulturen, die mit 2%-10% FCS im Medium kultiviert wurden zeigen
eine sehr schwache Produktion an GFP-Rab11 pro Zelle. Ein verschwindend geringes
Signal wird bei der Kultivierung ohne Serum sichtbar. Hier ist fast gar keine
Fluoreszenz zu erkennen.
3.3.2 Fluoreszenzmikroskopische Analyse der CHO-GFP-Zellen
Vergleichend zu ersten Zelllinie wurden auch fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen
von der verwendeten zweiten Zelllinie mit dem rekombinantem GFP erstellt. Dies
sollte u.a. die unterschiedliche Lokalisation von GFP in den Zellen verdeutlichen.
Ergebnisse
56
Abbildung 3.21: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Zelllinie CHO-GFP bei einer Zelldichte von 1x105 pro Well und unterschiedlichen FCS- Konzentrationen im Medium
Dargestellt sind fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen, die die Lokalisation und Intensität des Grün Fluoreszierenden Proteins zeigen. Die Zellen wurden in einer 24-Well-Platte kultiviert. Nach 24h wurde ein Medienwechsel mit den entsprechenden FCS- Konzentrationen durchgeführt. Nach weiteren 96h Inkubationszeit wurden die Zellen für die Fluoreszenzmikroskopie vorbereitet. Die Aufnahmen entstanden mit einer 200fachen Vergrößerung.
Die Aufnahmen zeigen ein deutliches GFP- Signal in allen FCS- Konzentrationen. Das
GFP ist gleichmäßig in der Zelle verteilt, was die Lokalisation des GFP als ein
cytosolisches Protein unterstreicht. Darüber hinaus findet sich auch GFP im Zellkern
wieder, eine für GFP bekannte Lokalisation.
57
Abbildung 3.22: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Zelllinie CHO-GFP bei einer Zelldichte von 1x106 pro Well und unterschiedlichen FCS- Konzentrationen im Medium
Dargestellt sind fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen, die die Lokalisation und Intensität des grün fluoreszierenden Proteins zeigen. Die Zellen wurden in einer 24-Well-Platte kultiviert. Nach 24h wurde ein Medienwechsel mit den entsprechenden FCS- Konzentrationen durchgeführt. Nach weiteren 96h Inkubationszeit wurden die Zellen für die Fluoreszenzmikroskopie vorbereitet. Die Aufnahmen entstanden mit einer 200fachen Vergrößerung.
Bei einer Aussaat von 1x106 pro Well ist auch hier deutlich zu erkennen, dass das
Signal an GFP sehr gering ist. Dabei weisen lediglich die Zellen bei einer Kultivierung
mit 10%FCS- Anteil im Medium eine leichte Fluoreszenz auf.
Diskussion
58
4 Diskussion
Das Ziel der Arbeit war es anhand zweier rekominanter, leicht quantifizierbarer
Markerproteine (GFP und GFP-Rab11) zu untersuchen, wie die Parameter
Serumkonzentration, Aussaatdichte und Kultivierungsdauer die Proliferation und
Proteinexpression beeinflussen. Aus diesen Ergebnissen sollte, wenn möglich, eine
Kultivierungsempfehlung für die optimale Expression von Proteinen in CHO- Zellen
aufgestellt werden. Dabei sollte auf die Verwendung von fetalem Kälberserum
möglichst verzichtet werden. Dies ist besonders in der medizinischen Forschung und
Arzneimittelherstellung sehr wichtig, da das Serum viele Nachteile mit sich bringt
[Boxberger, 2007].
4.1 Einfluss von FCS auf Proliferation und Expression bei verschiedenen Aussaatdichten
Bei jeder der ausgesäten Zelldichten wird deutlich, dass die Proliferation mit
steigendem FCS-Gehalt im Serum zunimmt. Das heißt, je mehr Serum im
Kulturmedium enthalten ist, desto besser wachsen die Zellen. Das lässt auf die im
Serum enthaltenen Wachstumsfaktoren, Adhäsionsproteine und viele andere
Faktoren schließen, die positiv auf die Zellvermehrung wirken [Boxberger, 2007].
Allerdings spielt auch die Aussaatdichte eine wichtige Rolle. Werden die Zellen in
einer sehr niedrigen bis mittleren Dichte (1x105, 3x105, 5x105 pro Well) ausgesät, so
wird deutlich, dass die Zelldichte im Vergleich zur Aussaatdichte immer zunimmt
(Abb. 3.1, 3.7, 3.10). Allgemein ist zu sagen, dass die CHO-GFP-Rab11-Zelllinie ein
weniger starkes Wachstum aufweist, als die CHO-GFP-Zellen. Dies kann an den
unterschiedlichen Expressionssystemen (GFP/ GFP-Rab11) der Zellen liegen [Gonda,
2006; Glausch, 2007]. Betrachtet man nun aber die Wachstumswerte bei einer hohen
Aussaatdichte von 1x106 Zellen pro Well (Abb. 3.4), zeigt sich bis zu einem FCS-
Gehalt von 4% ein massives Zellsterben, was auf das Fehlen von Nährstoffen und
Sauerstoff zurück zu führen ist. Die Zellen sind in diesem Medium (FCS-Gehalt von
0%-4%) nicht mehr in der Lage die ausgesäte hohe Zelldichte zu erhalten, da ihnen
zum Überleben wichtige Faktoren fehlen, die im Serum enthalten sind bzw. durch den
Entzug des konditionierten Mediums verloren gegangen sind. Da mit einer
Aussaatdichte von 1x106 pro Well die maximale Kapazität der Kultivierungsfläche
erreicht ist, die bei einer 24-Well-Platte etwa 1,862cm² pro Well beträgt, zeigt sich
Diskussion
59
auch im Bereich von 6%-10% FCS kein zusätzliches Wachstum mehr. Allerdings sind
die Zellen hier in der Lage ihre Zellzahl zu halten oder durch Wachstum eventuelle
Verluste zu kompensieren. Auch in diesem Versuch verhalten sich die beiden
verwendeten Zelllinien sehr ähnlich (siehe Abb. 3.4).
Betrachtet man nun neben dem Wachstum der Zellen auch die Expression des
rekombinanten Grün Fluoreszierenden Proteins (GFP) und des Fusionsproteins GFP-
Rab11, so lässt sich feststellen, dass die Kultivierung in serumfreien Medium einen
äußerst positiven Effekt auf die zelluläre Produktion der Proteine ausübt. Allerdings
zeigt sich beim Vergleich der Diagramme deutlich, dass die Unterschiede zu den
Signalstärken der anderen serumhaltigen Ansätze (2%-10% FCS) geringer werden, je
höher die Aussaatdichte ist (siehe Abb. 3.5). Ebenso werden die Signale, je mehr
Zellen im Well wachsen, generell immer geringer. Daraus lässt sich schließen, dass bei
einer hohen Aussaatdichte weniger GFP/ GFP-Rab11 pro Zelle, als bei einer niedrigen
bis mittleren Aussaatdichte (vgl. Abb. 3.3, 3.5 und 3.8, 3.11) exprimiert wird.
Auch die Arbeitsgruppe um Dana R. Broussard hat herausgefunden, dass eine
Konzentration von 10% FCS im Kulturmedium für ein logarithmisches Wachstum
notwendig ist. Dabei zeichnet sich auch in dieser Arbeit ab, dass eine erhöhte
FCS-Konzentration im Medium einen negativen Effekt auf die Proteinexpression
ausübt. Hierbei wurden allerdings alle Versuche in den Zellen des S. frugiperda
durchgeführt [Broussard, 1988]. Trotzdem lassen sich Zusammenhänge zwischen
dieser Zelllinie und den verwendeten CHO-Zelllinien bezüglich der Expression und
Proliferation in Abhängigkeit der Serumkonzentration finden.
Einer der wichtigsten Aspekte für Industrie und Forschung ist allerdings die
Proteinausbeute pro Kulturfläche, die sich aus der Kombination von Proliferation und
Expression pro Zelle zusammensetzt. Dabei zeigt sich, dass trotz der geringen
Proteinexpression bei einer hohen Aussaatdichte (1x106 Zellen pro Well), bezogen auf
die Produktion pro Fläche, ein positiver Trend abzeichnet. Daraus wird deutlich, dass
es für diese Form der Kultivierung nicht mehr so relevant ist, ob mit serumfreien oder
serumhaltigen Medium kultiviert wird (Abbildung 3.6). Die Werte liegen ungefähr auf
einer Höhe. Diese Tendenz ist auch noch bei einer Aussaatdichte von 5x105 Zellen pro
Well zu sehen (Abbildung 3.12). Bei einer geringeren Aussaatdichte zeigt sich noch
Diskussion
60
ein leichter Anstieg bei der Kultivierung mit serumhaltigem Medium (Abbildung 3.3,
3.9).
4.2 Kultivierungsstrategie zur optimalen Produktion von GFP/ GFP-Rab11 unter Serumentzug
Durch die gesammelten Ergebnisse in den ersten Experimenten konnte nun eine
Strategie entwickelt werden, die sowohl die optimale Aussaatdichte, als auch eine
bestmögliche Kultivierungsdauer kombiniert. Dabei wurde nicht nur ein
Medienwechsel durchgeführt, sondern über die lange Kultivierungsdauer (6 bis 10
Tage) bis zu dreimal das Kulturmedium gewechselt. Die Zellen sollten sich somit
besser an das serumfreie oder serumreduzierte Medium adaptieren können.
Es wurden zwei Aussaatdichten gewählt, die einen guten Vergleich untereinander
möglich machen. Zum einen waren das 1x105 Zellen pro Well und zum anderen 5x105
Zellen pro Well.
Bei einer niedrigen Aussaatdichte (1x105 Zellen pro Well) war sowohl nach 6 Tagen
(mit zwei Medienwechseln), als auch nach 10 Tagen (mit 3 Medienwechseln) ein
starkes Wachstum zu sehen, je mehr Serum im Kultivierungsmedium vorhanden war
(Abbildung 3.13). Vergleichend dazu ist zu sagen, dass bei einer etwas höheren
Aussaatdichte (5x105 Zellen pro Well) auch ein verbessertes Wachstum bei
serumhaltigen Medien zu sehen ist (Abbildung 3.16). Allerdings ist hier das
Wachstum relativ verlangsamt, da die Zellen offensichtlich weniger Platz haben um zu
proliferieren. Auch das Wachstum in serumfreien Medium ist deutlich ausgeprägter
bei einer geringen Aussaatdichte (vgl. Abb. 2.13 und 2.16).
Geht man näher auf die Expression von GFP pro Zelle ein, so zeigt sich bei beiden
ausgesäten Zelldichten, dass eine Kultivierung in serumfreien Medium sich positiv auf
die Produktion der Proteine auswirkt. Dies wird sowohl nach 6 Tagen, als auch nach
10 Tagen Inkubationszeit sichtbar. Betrachtet man nun allein die Kultivierung in
serumfreien Medium, so ist zu erkennen, dass bei einer geringen Aussaatdichte, die
Zellen, die bei einem dritten Medienwechsel mit einem Gemisch aus neuem und
konditionierten altem Medium kultiviert wurden, einen deutlich erhöhten Wert
anzeigen (Abb. 3.14). Dies kann daran liegen, dass die Zellen während ihrer
Wachstumsphase an das Medium bestimmte Stoffe abgeben, die positiv auf die
Diskussion
61
Proteinexpression zurück wirken. Allerdings ist dieser Effekt bei einer mittleren
Aussaatdichte von 5x105 Zellen pro Well nicht mehr zu beobachten. Hier scheinen die
Werte zwischen komplettem dritten Medienwechsel und dem Mediengemisch
annähernd gleich zu sein. Dies lässt darauf schließen, dass die Zellen in einer deutlich
subkonfluenten Konzentration weniger förderliche Stoffe ins Medium abgeben bzw.
von der Präsenz weniger abhängig sein [Plattner, Hentschel, 1977].
Der förderliche Einfluss von FCS auf die Expression von GFP/ GFP-Rab11 in Bezug auf
die Wachstumsfläche in der gesamten Probe ist nach einer Kultivierungsdauer von 10
Tagen verschwindend gering. Es zeigt sich, dass die Zellen sich schon nach einem
zweiten Medienwechsel an ihre neue serumfreie bzw. serumreduzierte Umgebung
gewöhnt haben. Sowohl nach 6 Tagen, als auch nach 10 Tagen zeigen die Ergebnisse
deutlich, dass eine Kultivierung ohne Serum einen offensichtlich positiven Einfluss auf
die Proteinausbeute pro Wachstumsfläche hat. Weiterhin erhöht sich die Menge an
exprimiertem Protein nochmals um etwa 30%, wenn die Zellen 10 Tage und mit drei
Medienwechseln kultiviert werden, im Gegensatz zu einer Kultivierungszeit von 6
Tagen und 2 Medienwechseln.
4.3 Fluoreszenzmikroskopie
Durch die Fluoreszenzaufnahmen zeichnet sich ab, dass die Zellen bei einer geringen
Aussaatdichte mehr GFP pro Zelle exprimieren. Dabei zeigte sich allerdings kein
gravierender Unterschied zwischen den in serumfreien und serumhaltigen Medium
kultivierten Zellen (vgl. Abb. 3.19, 3.20, 3.21 und 3.22). Diese Beobachtung ist durch
zukünftige Quantifizierungen zu untermauern, für die im Rahmen dieser
Bachelorarbeit die Zeit fehlte.
Die Lokalisation von GFP und GFP-Rab11 in den beiden Zelllinien konnte durch die
Analysen mit dem Fluoreszenzmikroskop verdeutlicht werden. Dabei zeigt das
membrangebundene GFP-Rab11 ein deutliches Signal in der Nähe des Zellkernes auf.
Dies entspricht der Lokalisation des endogenen Rab11, das sich im perinuklearen
Recycling- Kompartiment befindet [Ullrich et al., 1995]. Im Gegensatz dazu leuchtete
das cytosolisches Protein GFP im gesamten Zellraum und war im Zellkern
angereichert [Barka et al., 2004; Savina et al., 2020].
Diskussion
62
4.4 Fazit
Diese Versuche zeigen, dass es durchaus möglich ist mit der Kultivierung ohne Serum
hohe Proteinausbeuten zu erhalten. Dabei spielt es in dieser Untersuchung keine
Rolle, welche Zelllinie (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) man verwendet und welches
Protein betrachtet wird (cytosolisch/ membrangebunden), da sie in ihrer
Proliferation und Expression sehr ähnlich auf die Kulturbedingungen reagieren.
Wichtig ist offenbar die Aussaatdichte und Kultivierungsdauer. Man muss den Zellen
die Möglichkeit geben sich bei einer Kultivierung ohne Serum an das Medium zu
gewöhnen. Durch diesen Zeitraum der Anpassung können die Zellen den Mangel und
Stress, den sie durch den Medienwechsel zum serumfreien Medium erfahren haben,
kompensieren und sich an die neuen Bedingungen anpassen. Es scheint, dass durch
das Fehlen der im Serum enthaltenen Wachstumsfaktoren die zelluläre
Stoffwechselaktivität primär die Produktion der rekombinanten Proteine steigert und
nicht das Zellwachstum. Daraus lässt sich eine Kultivierungsstrategie für die
serumfreie Produktion von rekombinanten Proteinen ableiten, wobei die Zellen in
einer mittleren Zelldichte ausgesät werden (5x105 Zellen pro Well) und dann über
einen längeren Zeitraum von 10 Tagen kultiviert werden.
Zusammenfassung
63
5 Zusammenfassung
Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer optimalen Kultivierungsstrategie für
die Expression rekombinanter Proteine in CHO-Zellen unter Berücksichtigung von
Parametern wie Aussaatdichte, Serumkonzentration und Kultivierungsdauer. Dabei
sollte möglichst auf die Verwendung von Serum im Medium verzichtet werden. Die
Analyse erfolgte an zwei transgenen CHO-Zelllinien die das cytosolische Grün
Fluoreszierende Protein (GFP) und das membrangebundene Fusionsprotein GFP-
Rab11 als leicht messbare Modellproteine exprimieren.
Es zeigte sich, dass durch die Zugabe von Serum im Medium das Zellwachstum der
einzelnen Kulturen ernorm gesteigert wird und somit einen positiven Einfluss auf die
schnelle Produktion von Zellmasse ausübt. Die mit serumhaltigem Medium
kultivierten Zellen weisen ein bis zu doppelt so hohes Wachstum auf, wie die in
serumfreiem Medium kultivierten Zellen. Im Gegensatz dazu hemmt das Serum
überraschenderweise die Expression von rekombinantem GFP und GFP-Rab11.
Sowohl in Bezug auf die Expression pro Zelle, als auch pro Kulturfläche wurde für die
serumfreie Kultivierung eine bis zu doppelt so hohe Ausbeute an rekombinantem
Protein gemessen, wie in einer serumhaltigen Kultur. Der Vergleich der beiden
verwendeten Zelllinien untereinander zeigte dabei sehr ähnliche Tendenzen für
Proliferation und Expression. Bei weiteren Untersuchungen wurde deutlich, dass es
von entscheidendem Vorteil ist eine relativ lange serumfreie Kultivierungsdauer von
10 Tagen durchzuführen. Im Vergleich zu einer 6-tägigen Kultivierung konnte die
Produktion an rekombinantem Protein nochmals um 30% gesteigert werden. Die
Aussaat einer mittleren Zelldichte (2,7x105 Zellen pro cm²) stellte sich als beste
Ausgangskonzentration für eine produktorientierte serumfreie Kultivierung von CHO-
Zellen heraus.
Literaturverzeichnis
64
6 Literaturverzeichnis
Aasif, Mostafa und Schröder, Constantin. 2010. Die Expression von GFP in
rekombinanten CHO Zellen in Abhängigkeit der Medienzusammensetzung. Studienprojekt, HAW- Hamburg
Böcker, Jürgen. 1997. Spektroskopie. Würzburg : Vogel-Verlag
Boxberger, Hans Jürgen. 2007. Leitfaden für die Zell- und Gewebekultur: Einführung
in Grundlagen und Techniken. Weinheim: Wiley-VCH
Broussard, Dana R. and Summers, Max D..1988. Effects of Serum Concentration and
Media Composition on the Level of Polyhedrin and Foreign Gene Expression by
Baculovirus Vectors. Journal of Invertebrate Pathology 54, 144-150
Ganten, Detlev. 2008. Grundlagen der Molekularen Medizin. Berlin, Heidelberg: Springer Verlag
Gey, Manfred H. 2008. Instrumentelle Analytik und Bioanalytik. Berlin, Heidelberg : Springer Verlag
Glausch, Mareen. 2007. Herstellung stabiler GFP-CHO-Zellen und Analyse von
GFP-Rab11-CHO-Zellen. Diplomarbeit, HAW- Hamburg
Gonda, Laura 2006. Etablierung einer stabilen GFP-Rab11 exprimierenden
CHO-Zelllinie. Diplomarbeit, HAW- Hamburg
Gstraunthaler, Gerhard. 2003. Alternatives to the Use of Fetal Bovine Serum: Serum-
free Cell Culture. Altex 20, 4/03
Kück, Ulrich. 2005. Praktikum der Molekulargenetik. Berlin, Heidelberg: Springer Verlag
Krug, Laura. 2008. Etablierung eines Affinitätsreinigungsverfahrens zur Isolierung und
Analyse von Recycling Endosomen aus His6-GFP-Rab11-exprimierenden CHO-Zellen. Diplomarbeit, HAW Hamburg
Lakowicz, J. R.. 1999. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Berlin, Heidelberg: Springer Verlag
Lindl, Toni. 2002. Zell- und Gewebekultur: Einführung in die Grundlagen sowie
ausgewählte Methoden und Anwendungen. Heidelberg: Spektrum Akademischer Verlag, 2002. Lodish, Harvey. A., Berk, Anold, Zipursky, S. Lawrence, Baltimore, David und Darnell, James E.. 2001. Molekulare Zellbiologie. Berlin, Heidelberg: Spektrum Akademischer Verlag,
Literaturverzeichnis
65
Minuth, Will W., Strehl, Raimund und Schumacher, Karl. 2003. Zukunftstechnologie Tissue Engineering: von der Zellbiologie zum künstlichen Gewebe.
Weinheim: Wiley-VCH
Morgan, S. J. und Darling, D. C. 1994. Kultur tierischer Zellen. Berlin, Heidelberg: Spektrum Akademischer Verlag,
Ormö, Mats, Cubitt, Andrew B., Kallio, Karen, Gross, Larry A., Tsien, Roger Y. und Remington, S. James. 1996. Crystal Structure of the Aquorea Victoria Green
Fluorescent Protein. .Science: Vol. 273 no. 5280 pp. 1392-1395
Plattner, Helmut und Hentschel, Joachim. 1977. Zellbiologie. Thieme: 2. Auflage
Pörtner, Ralf. 1996. Reaktionstechnik der Kultur tierischer Zellen. Hamburg : Shaker Verlag
Prasher, Douglas C, Eckenrobe, Virginia, Ward, William W., Prendergast, Frank G. und Cormier, Milton J.. 1991. Primary structure of the Aequorea Victoria green-
fluorescent protein. Elyevier Science Publisher B.V.
Prasher, Douglas, Chalfie, Martin, Tu, Yuan, Euskirchen Ghia und Ward, William W. 1994. Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression. Sience: Vol. 263
Puck, Theodore T. Cieciura, Steven J und Robinson, Arthur. 1958. Long Term
Cultivation of euploid cells from hunan and animal subjects. J Exp Med. 1958, Bd. 108, 945-953.
Schmitz, Sabine. 2007. Der Experimentator: Zellkultur. München : Elsevier GmbH
Schrödel, Andrea. 2007. Die Rolle des fetalen Kälberserums in Zellkulturmedien. Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.
Shailer, C. and Corrin, K. (1999). Serum supply: policies and controls operating in
New Zealand. Dev. Biol. Stand. 99, 71-77
Shimomura, Osamu. 2005. The discovery of awquorin and green fluorescent protein. Journal of Microscokpie 2005, Bd. 217, 3-15
Stemmer, Willem P.C., Crameri, Andreas, Whitehorn, Erik A. und Tate, Emily. 1995. Improved Green Fluorescent Protein by Molecular Evolution Using DNA Shuffling. Nature Biotechnologie: Volume 14
Tsien, Roger Y. 1998. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem, 1998, 67: 509-544
Ullrich, O., S. Reinsch, S. Urbe, M. Zerial, and R. G. Parton. 1996. Rab11 Regulates
Recycling through the pericentriolar Recycling Endosome. J. Cell Biol., 135:913-924
Uppangala, Nidhi. 2010. Animal Cell Culture Media: Natural and Artificial. Biotech Professionals
Literaturverzeichnis
66
van der Valk, J., Mellor, D., Brands, R. et al. (2003). The humane collection of fetal
bovine serum and possibilities for serum-free cell and tissue culture. Toxicol. in Vitro 17, in press.
Voedisch, Bernd, Menzel, Christian, Jordan, Eva, El-Ghezal, Aymen, Schirmann, Thomas, Hust, Michael und Jostock, Thomas. 2005. Expression rekombinanter
Proteinpharmazeutika. Intraskript: Nr. 7
Widengren, Jerker, Terr, Bob und Rigler, Rudolf. 1999. Protonation kinetics of GFP
an FITC investigated by FCS – aspects of the use of fluorescent indicators for measunring
pH. Elsevier Science B.V.
Wink, M. 2004. Molekulare Biotechnologie. Wiley-VCH Verlag, Weinheim
Taz.de. 2005. Ein grausamer Nebeneffekt. [Online] 18.02.2005 [Zitata vom: 19. 04.2012] http://www.taz.de/1/archiv/?dig=2005/02/18/a0259
Anhang
67
7 Anhang
7.1 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1.1: Chinese Hamster Ovary Cell ……………………..…………………………... 8 Abbildung 1.2: Grün Fluoreszierendes Protein..…..…………………………………………10 Abbildung 1.3: Jablonski Diagramm ………………………………………………………….…..13 Abbildung 1.4: Fluoreszenzmessung mit Hilfe eines Spektrofluorometers …..…14 Abbildung 2.1: Aufnahme der stabilen CHO-GFP-His₆-Zellinie mit Hilfe eines
Lichtmikroskopes mit Phasenkontrast………...…………………………17 Abbildung 2.2: Pipettierschema zur Aussaat der CHO-Zellen in einer 24-Well-
Platte ………………………………………………………………………………..… 23 Abbildung 2.3: Lebende und tote Zellen mit der richtigen/optimalen
Einstellung am Countess™ Automated Cell Counter von Invitrogen …...…………………………………………………………………..……25
Abbildung 2.4: Schrittweise durchgeführte Zellzahlmessung mit Hilfe des Countess™ Automated Cell Counter von Invitrogen ……………..…26
Abbildung 2.5: Spektrofluorometer der Firma Shimadzu (Modell: RF-5301PC) ……………………………………………………….….. 27
Abbildung 2.6: Software Panorama; Ausschnitt des Ordners <Projekt> ……..…. 29 Abbildung 2.7: Software Panorama; Ausschnitt des Ordners <RF-5301> …...…. 30 Abbildung 2.8: Peakflächenberechnung …………………………………………………….….31 Abbildung 2.9: Darstellung der Grenzen der Peakflächenberechnung………….….31
Abbildung 2.10: Peakflächentabelle …………………………………………………………….….32 Abbildung 2.11: Fluoreszenzmikroskop der Firma Olympus (Modell: BX41)..….. 32 Abbildung 3.1: Einfluss von FCS auf die Proliferation bei niedriger
Aussaatdichte (1x105).…………………………………………………………. 36 Abbildung 3.2: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle
bei niedriger Aussaatdichte (1x105)………………….……………………37 Abbildung 3.3: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro cm²
bei niedriger Aussaatdichte (1x105)……………….……………………....38 Abbildung 3.4: Einfluss von FCS auf die Proliferation bei hoher Aussaatdichte
(1x106)………………………………………………………………………………….39
Abbildung 3.5: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle bei hoher Aussaatdichte (1x106)…………………….………………………40
Abbildung 3.6: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro cm² bei hoher Aussaatdichte (1x106)……………………….……………………41
Abbildung 3.7: Einfluss von FCS auf die Proliferation bei mittlerer Aussaatdichte (3x105)………………………………………………………...….42
Abbildung 3.8: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle bei mittlerer Aussaatdichte (3x105 )…………………...…………………....43
Abbildung 3.9: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro cm² bei mittlerer Aussaatdichte (3x105)…………………………...…..………44
Abbildung 3.10: Einfluss von FCS auf die Proliferation bei mittlerer Aussaatdichte (5x105)………………......……………………………………….45
Anhang
68
Abbildung 3.11: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle bei mittlerer Aussaatdichte (5x105)………………………………......……46
Abbildung 3.12: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro cm² bei mittlerer Aussaatdichte (5x105)………………………..…...…………47
Abbildung 3.13: Einfluss von FCS auf die Proliferation bei niedriger Aussaatdichte (1x105) und 6 bzw. 10 Tagen Kultivierungszeit ..48
Abbildung 3.14: Einfluss von FCS auf Expression von GFP pro Zelle bei niedriger Aussaatdichte (1x105) und 6 bzw. 10 Tagen Kultivierungszeit ………………………………………………………..…………49
Abbildung 3.15: Einfluss von FCS auf Expression von GFP pro cm² bei niedrigen Aussaatdichte (1x105) und 6 bzw. 10 Tagen Kultivierungszeit ..............................................................................................50
Abbildung 3.16: Einfluss von FCS auf Proliferation bei mittlerer Aussaatdichte (5x105) und 6 bzw. 10 Tagen Kultivierungszeit ……………….……..51
Abbildung 3.17: Einfluss von FCS auf Expression von GFP pro Zelle bei mittlerer Aussaatdichte (5x105) und 6 bzw. 10 Tagen Kultivierungszeit ……………………………………………………….………….52
Abbildung 3.18: Einfluss von FCS auf Expression von GFP pro cm² bei mittlerer Aussaatdichte (5x105) und 6 bzw. 10 Tagen Kultivierungszeit …………………………………………………………………. 53
Abbildung 3.19: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Zelllinie CHO-GFP-Rab11 bei einer Zelldichte von 1x105 pro Well und unterschiedlichen FCS- Konzentrationen im Medium ……………..54
Abbildung 3.20: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Zelllinie CHO-GFP-Rab11 bei einer Zelldichte von 1x106 pro Well und unterschiedlichen FCS- Konzentrationen im Medium ……………..55
Abbildung 3.21: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Zelllinie CHO-GFP bei einer Zelldichte von 1x105 pro Well und unterschiedlichen FCS- Konzentrationen im Medium …………..…56
Abbildung 3.22: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Zelllinie CHO-GFP bei einer Zelldichte von 1x106 pro Well und unterschiedlichen FCS- Konzentrationen im Medium…......……….57
Anhang
69
7.2 Tabellenverzeichnis
Tabelle 2.1: Für die Kultivierung der CHO-Zellen verwendete Lösungen und ihre Zusammensetzung ……………………………………...………... 18
Tabelle 2.2: Benötigte Volumina der verwendeten Lösungen zum Ablösen der ahärenten Zellen in dem jeweils verwendeten Kulturgefäß .……………………………………………………………………. 18
Tabelle 2.3: Für die Kultivierung der CHO-Zellen verwendete Kulturgefäße und die benötigten Volumina der zur Aussaat verwendeten Lösungen/ Zellsuspension bei einer Konfluenz der Zellen von etwa 80% in der zu passagierenden Kulturflasche (T25/T75).…………………………………………………………..………………. 19
Tabelle 2.4 Medienansatz mit unterschiedlichen FCS- Konzentrationen für ein Standardansatzvolumen von 10ml Mediengemisch…….. 23
Tabelle 2.5 Einzelne Parameter für die Messung der GFP-Probe ...……...……. 29 Tabelle 2.6 : Ansatz für die Lösungen für die
Fluoreszenzmikroskopie……………………………………….……………… 33
Anhang
70
7.3 Material und Geräte
Tabelle 7-1: Verwendete chemische Substanzen Hersteller/ Bezugsquelle Cat-No
Ammoniumchlorid Sigma-Aldrich 235-186-4 Ethanol vergällt > 98% Carl Roth K928.4 FKS BIOCHROM AG S0115 G418 Solution GIBCO 1003772 Ham´s F12 BIOCHROM AG F0815 L-Glutamin BIOCHROM AG K0282 Mowiol CALBIOCHEM B23468 PBS BIOCHROM AG L182-50 Penicillin/Streptomycin BIOCHROM AG A2212 Triton-X 100 Roche 10789704001 Trypan Blue Stain 0.4% GIBCO 15250 Trypson EDTA BIOCHROM AG L2143 Paraformaldehyd Sigma-Aldrich P6148 Tabelle 7-1: Verwendete Materialien
Hersteller/ Bezugsquelle Cat-No /
Modelnummer
Cell counting chamber slides Invitrogen 2CO5221 Pipettenspitzen (2-200µl) Eppendorf AG Z142260 Pipettenspitzen (50-1000µl) Eppendorf AG A144744N Pipettierhilfe Brand Accu-jet 26300 Pipetten (10-100µl) Eppendorf AG Pipetten (100-1000µl) Eppendorf AG Serologische Pipetten (2ml) FALCON 357507 Serologische Pipetten (5ml) FALCON 94005 Serologische Pipetten (10ml)
FALCON 94010
Serologische Pipetten (25ml)
FALCON 94525
UV-Küvette Hellma 980-04187 Zellkulturflaschen (25cm²) BIOCHROM AG 90026 Zellkulturflaschen (75 cm²) BIOCHROM AG 90076 Zentrifugenröhrchen (15ml) Falcon N461.1 Zentrifugenröhrchen (50ml) Falcon N465.1 Eppendorf -Reaktionsgefäße VWR 211-2130
Anhang
71
Tabelle 7-3: Verwendete Geräte Hersteller/
Bezugsquelle Modell(-nummer)
Autoklav Systec V150 Automated Cell Counter Invitrogen Countess CO2 – Inkubator Binder CB150 #05-74745 Digitalkamera Canon PowerShot A95 Eismaschine Scotsman AF80 Fluoreszenzmikroskop Olympus BX41 Kippschüttler EMBL Heidelberg 22708 Kühlschrank (4°C) Liebherr Kühltruhe (-20°C) Liebherr Kühltruhe (-80°C) Liebherr Magnetrührer Heidolph MR3001 Mehrlinsenmikroskop (invers) Zeiss Axiovert 40 Reinstwasseranlage Millipore Synergy Stickstofftank (-196°C) AIR Liquide TR11 Spectroflurometer Shimadzu Spülmaschine Miele Professional G7883 Sterilwerkbank Kendro Laboratory KS18, HERA safe Thermocycler Biometra 2807122 VE-Anlage Sterling Berkfeld miniRO Vortexer Heidolph Reaxtop Waage Satorius TE 1502s (max 1500g;
d.=0.01g) Wasserbad GFL Tabelle 7-4: Verwendete Software Hersteller Verwendungszweck
Adobe Photoshop Adobe Bildbearbeitung Microsoft Exel 2010 Microsoft Statistische Auswertung PanoramaRF Shimadzu Messung und
Auswertung der Fluoreszenz
Countess Software Invitrogen Zellzählung
Anhang
72
7.4 Abkürzungsverzeichnis
°C Grad Celsius
CHO Chinese Hamster Ovary
CO2 Kohlenstoffdioxid
DMSO Dimethylsulfoxid
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
FCS Fetal Calf Serum
FDA Food and Drug Administration
G418 Geneticin 418
GFP Grün Fluoreszierendes Protein
h Stunde(n)
ISO International Organisation für Normung
KCl Kalumclorid
KH2PO4 Kaliumhydrogenphosphat
L-Glu L-Glutamin
min Minute(n)
ml Milliliter
µl Mikroliter
µg Mikrogramm
nm Nanometer
NaCl Natriumchlorid
Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat
PBS Phosphate Buffered Saline
Pen Penicillin
s Sekunde(n)
Strep Streptomycin
USB Universal Serial Bus
UV ultaviolett
Anhang
73
Eidesstattliche Erklärung
Ich versichere, dass ich die vorliegende Bachelorarbeit ohne fremde Hilfe verfasst und
nur die angegebenen Hilfsmittel verwendet habe. Wörtlich oder dem Sinn nach aus
anderen Werken entnommene Stellen sind unter Angabe der Quellen kenntlich
gemacht.
Lisa Schindler
Hamburg, den 18.05.2012