ENTWICKLUNG EINESNACHWEISVERFAHRENS FÜR

GENTECHNISCHEVERÄNDERUNGEN IM GENOM VONMIKROORGANISMEN AUS STARTER-

UND SCHUTZKULTUREN

Dissertation zur Erlangung des Grades Dr. rer. nat.

am Fachbereich Biologie/Chemie der Universität Bremen

vorgelegt von Mario Käse aus Alfeld/Leine

Bremen 2000

2

1. Gutachter : Prof. Dr. Armin Hildebrandt

2. Gutachter : Prof. Dr. Detmar Beyersmann

Tag des Promotions-Kolloquiums : 08. März 2000

3

An der Verbraucherakzeptanz von biotechnologisch

verbesserten Produkten wird letztlich der Erfolg der

Wissenschaft gemessen. (...) Untersuchungen in den

USA haben gezeigt, daß dort eine große Mehrheit diese

Technologie unterstützt. In Europa sind die

Einstellungen der Verbraucher von Land zu Land

verschieden. Durch die immer umfangreicheren

Informationen über Biotechnologie (...) ist zu erwarten,

daß Verständnis und Akzeptanz der Verbraucher

weiter zunehmen werden.

Aus „Biotechnologie – Chance für die Zukunft“,

Broschüre der Monsanto Europe S.A., 1998

Großbritannien

Gen-Firma garantiert Arbeitern genfreies Essen

LONDON, 22. Dezember (ap). Der Monsanto-

Konzern gehört zu den Vorreitern bei der

Entwicklung von gentechnisch veränderten

Nahrungsmitteln. Aber selbst die Kantine der

Monsanto-Niederlassung bei London garantiert jetzt

den Mitarbeitern, daß ihnen keine Gerichte unter

Verwendung von Gen-Mais oder -Soja vorgesetzt

werden. Kantinen-Lieferant Granada Food Services

teilte mit, diese Entscheidung sei auf Grund der Sorge

von Verbrauchern getroffen worden.

© Frankfurter Rundschau vom 23.12.1999

4

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungen 7

Zusammenfassung 9

1. Einleitung 101.1 Einsatz der Gentechnologie zur Herstellung von Lebensmitteln 10

1.1.1 Gentechnisch veränderte Nahrungsmittel – ein Wachstumsmarkt? 10

1.1.2 Gentechnisch veränderte Starter- und Schutzkulturen 11

1.1.3 Kennzeichnungsregelungen für gentechnisch veränderte Lebensmittel 13

1.2 Nachweisverfahren für gentechnisch veränderte Organismen in Lebensmitteln 14

1.2.1 Untersuchung von Lebensmitteln mit Nachweisverfahren auf Basis der PCR 14

1.2.2 Sonstige Verfahren zum gezielten Nachweis bestimmter Fremdgene

oder ihrer Genprodukte in Lebensmitteln 15

1.2.3 Screening-Verfahren zum universellen Nachweis von Fremdgenen in

Lebensmitteln 16

1.3 Bausteine zur Entwicklung einer universellen Nachweismethode für GVMO 17

1.3.1 Methoden zur Darstellung geringfügiger Unterschiede im Genom nah

verwandter Organismen 17

1.3.2 Die Representational Difference Analysis (RDA): Eine Kombination aus

Subtraktiver Hybridisierung und Suppression-PCR 18

1.3.3 Vorversuche zum Nachweis von GVMO durch genomische Subtraktion 20

1.3.4 Anpassung der RDA an die Erfordernisse zum Nachweis von GVMO 20

1.4 Charakterisierung der Modell-Organismen Lactobacillus sake und Penicillium nalgiovense 21

1.4.1 Taxonomische und physiologische Einordnung 21

1.4.1.1 Lactobacillus sake 21

1.4.1.2 Penicillium nalgiovense 22

1.4.2 Einsatz der Modell-Organismen in der Lebensmittel-Biotechnologie 23

1.4.2.1 Lactobacillus sake 23

1.4.2.2 Penicillium nalgiovense 23

5

2. Material und Methoden 242.1 Organismen 24

2.1.1 Herkunft und Eigenschaften der Lactobacillus sake Stämme 24

2.1.2 Herkunft und Eigenschaften der Penicillium nalgiovense Stämme 25

2.2 Kultivierung der Mikroorganismen 25

2.2.1 Kultivierung von Lactobacillus sake 25

2.2.2 Kultivierung von Penicillium nalgiovense 26

2.3 DNA-Isolierung 26

2.3.1 DNA-Isolierung aus Lactobacillus sake 26

2.3.2 DNA-Isolierung aus Penicillium nalgiovense 27

2.4 Standard-Methoden der Molekularbiologie 27

2.4.1 Agarose-Gelelektrophorese 27

2.4.2 Southern Blot 28

2.4.3 Herstellung von DNA-Sonden 28

2.4.4 Hybridisierung auf festphasengebundene DNA und DIG-Nachweis 29

2.4.5 Polymerase Kettenreaktion (PCR) 29

2.4.6 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegel 30

2.4.7 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Polyacrylamid-Gel 30

2.4.8 Klonierung von PCR-Fragmenten 31

2.4.8.1 Ligation und Transformation mit dem Vektor pZErO 31

2.4.8.2 Ligation und Transformation mit dem Vektor pGEM-T 31

2.4.9 Mini-Präparation von Plasmid-DNA 32

2.4.10 Präparation von Plasmid-DNA 32

2.4.11 DNA-Sequenzierung und Sequenzanalyse 33

2.5 Representational Difference Analysis (RDA) 33

2.5.1 DNA Restriktion 34

2.5.2 Adapter Ligation 34

2.5.3 Subtraktive Hybridisierung 34

2.5.4 Suppression-PCR 35

2.6 Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-PAGE) 36

2.6.1 Diskontinuierliche PAGE 36

2.6.2 PAGE mit Bisbenzimid-PEG im Horizontalverfahren 37

2.6.2.1 Herstellung des Trenngels 37

2.6.2.2 Durchführung der 2D-PAGE im Horizontalverfahren 37

2.6.2.3 Silberfärbung von 2D-PA-Gelen 38

6

3. Ergebnisse 393.1 Nachweis von Fremdgenen bei drei gentechnisch veränderten Stämmen der Art

Lactobacillus sake 39

3.1.1 Anreicherung von DNA-Fragmenten, die nicht im Genom des Wildtyps

L. sake 23K enthalten sind 39

3.1.2 Klonierung und Sequenzierung der für die gentechnisch veränderten Stämme

spezifischen DNA-Fragmente 41

3.1.3 Anreicherung von DNA-Fragmenten bei einem gentechnisch veränderten

Stamm von L. sake durch Subtraktion mit der DNA verwandter Stämme 43

3.2 Nachweis von Fremdgenen bei zwei gentechnisch veränderten Stämmen der Art

Penicillium nalgiovense 44

3.2.1 Anreicherung von DNA-Fragmenten, die nicht im Genom des Wildtyps

P. nalgiovense BFE 66 vorhanden sind 44

3.2.2 Isolierung, Klonierung und Sequenzierung der für die gentechnisch

veränderten Stämme spezifischen DNA-Fragmente 45

3.2.3 Anreicherung von DNA-Fragmenten bei den gentechnisch

veränderten Stämmen von P. nalgiovense durch Subtraktion mit der DNA eines

verwandten Stamms 49

4. Diskussion 504.1 Ableitung eines generellen Vorgehens zum Nachweis gentechnisch veränderter

Starter- und Schutzkulturen in Lebensmitteln 50

4.2 Bewertung der Leistungsfähigkeit und Praktikabilität des vorgestellten

Nachweisverfahrens 52

4.2.1 Reproduzierbarkeit und Aufwand 52

4.2.2 Zuverlässigkeit der Ergebnisse 53

4.2.3 Empfindlichkeit und Spezifität 56

4.2.4 Vergleich mit alternativen Nachweisverfahren 58

4.3 Weiterentwicklung des Verfahrens und Ausblick 59

5. Literaturverzeichnis 62Anhang 69

Danksagung 76

7

Abkürzungen

A AdeninamdS Acetamidase-Gen (von Aspergillus nidulans)ampr Ampicillin-Resistenzgen (Vektor pKW 100)Anti-Dig-AP Anti-Digoxigenin-Antikörper gekoppelt mit Alkalischer PhosphataseargB Ornithin-Carbamoyltransferase-Gen (von Aspergillus nidulans)atp Adenosintriphosphat-Synthtetase-Genbar Phosphinotricin-Acetyltransferase-Gen (von Strepromyces hygroscopicus)BgVV Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und

VeterinärmedizinBFE Bundesforschungsanstalt für ErnährungBLAST Basic Local Alignment Search Toolbp BasenpaareC CytosincDNA copy-DNAclp ATP-abhängige-Protease-GenCTAB Cetyltrimethylammoniumbromiddemin. entmineralisiertDIG Digoxigenin-DNA-Markierungs-System (Boehringer)DMIF-GEN Development of methods to identify foods produced by means of genetic

engineeringDNA DesoxyribonucleinsäuredNTP DesoxyribonucleosidphosphatDSM Deutsche Sammlung für MikroorganismenEDTA Ethylendiamin-TetraessigsäureEMBL European Molecular Biology LaboratoryELISA Enzyme linked Immuno Sorbent Assayemr Erythromycin-Resistenzgen (von Streptococcus faecalis)FPLC First Performance Liquid ChromatographyG GuaninGenTG GentechnikgesetzGVMO Gentechnisch veränderter MikroorganismmusGVO Gentechnisch veränderter OrganismusHepes N-Hydroxyethylpiperazin-N´-2-EthansulfonsäureIfLTH Institut für Lebensmitteltechnologie der Universität HohenheimINRA Institut National de la Recherche AgronomiqueIPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosidlacZ β-Galactosidase-Gen (von Escherichia coli)

8

LCR Ligase Chain ReactionLMBG Lebensmittel- und BedarfsgegenständegesetzLSLB low saline Luria-Bertani (Medium)LUA (Staatliches) Lebensmittel-Untersuchungsamt (Braunschweig)mRNA messenger RNAMRS Medium zur Kultivierung von MilchsäurebakterienNBT Nitroblau-TetrazoliumNCBI National Center for Biotechnology Informationnos-3´ Terminator des Nopalin-Synthetase-Gens (von Agrobacterium tumefaciens)npt II Neomycin-Phosphotransferase-Gen (von TN5)ocs-3´ Terminator des Octopin-Synthetase-Gens (von Agrobacterium tumefaciens)PA PolyacrylamidPAGE Polyacrylamid-GelelektrophoresepBSK Vektor pBluescript SKPCR Polymerase Chain ReactionPCI-Mix Phenol/Chloroform/Isoamyl-AlkoholPEG PolyethylenglycolP n1/n2R nested Primer 1 und 2R (Clontech)P-nos Promotor des Nopalin-Synthetase-Gens (von Agrobacterium tumefaciens)P-35S Promotor 35S des Cauliflower Mosaic Viruspts Phosphoenolpyruvat:carbohydrat-Phosphotransferase-GenRAPD Random amplified polymorphic DNARDA Representational Difference AnalysisRNA Ribonucleinsäurerpm rounds per minuteRT RaumtemperaturSDS Natrium-Dodecyl-SulfatSMT Standards, Measurement and TestingSOC Medium zur Kultivierung von transformationsgestreßten E. coliSSC saline Sodium-CitrateSTE saline Tris/EDTASTET saline Tris/EDTA/Triton X-100T ThyminTanneal Annealing-TemperaturTm SchmelztemperaturTAE Tris/Acetat/EDTA-PufferTB Terriffic BrothTE Tris/EDTA-PufferTEMED N,N,N´,N´-TetramethylethylendiaminTris 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandioltrpC Tryptophan-Synthetase-Gen (von Aspergillus nidulans), Untereinheit CTSE Tris/Sodiumchloride/EDTA-PufferTSES Tris/Sodiumchloride/EDTA/Sucrose-PufferU Unit, Enzym-EinheitX-Gal 5-Chlor-4-Brom-3-Indolyl-β-D-GalactopyranosidX-Phosphat 5-Chlor-4-Brom-3-Indolyl-Phosphat2D zweidimensional

9

Zusammenfassung

Die Entwicklung von gentechnisch veränderten Mikroorganismen (GVMO) als Starter- und

Schutzkulturen in der Lebensmittelproduktion ist mittlerweile so weit fortgeschritten, daß mit

einer baldigen Markteinführung derartiger Produkte zu rechnen ist. Die Kennzeichnung dieser

Produkte ist u.a. durch die EU Novel Food Verordnung vorgeschrieben. Es fehlen aber bisher

noch Nachweisverfahren, die eine umfassende Überprüfung der Kennzeichnungspflicht

ermöglichen würden. Alle gängigen Verfahren, einschließlich der PCR-Screening-Verfahren

beruhen auf dem spezifischen Nachweis bekannter gentechnischer Veränderungen. Der

Nachweis von unbekannten gentechnischen Veränderungen mit einem universellen Verfahren

war bisher nicht möglich. In dieser Arbeit wird ein Verfahren zum Nachweis von GVMO

vorgestellt, das die Basis für einen universellen und produkt-unspezifischen Nachweis von

gentechnisch veränderten Starter- und Schutzkulturen in Lebensmitteln darstellt.

Dieses Verfahren beruht auf dem Abgleich des Genoms eines zu untersuchenden Stamms mit

dem Genom eines sehr nah verwandten, nicht gentechnisch veränderten Referenzstamms mit

Hilfe der Representational Difference Analysis, einer Kombination aus Subtraktiver

Hybridisierung und Suppression-PCR. Die damit generierten stammspezifischen DNA-

Fragmente werden mit einer zweidimensionalen Polyacrylamid-Gelelektrophorese isoliert,

sequenziert und die DNA-Sequenzen mit Datenbank-Beständen verglichen. Das Verfahren

wurde an zwei Modellsystemen Lactobacillus sake und Penicillium nalgiovense jeweils anhand mehrerer

gentechnisch veränderter Stämme entwickelt und erprobt. Bei allen untersuchten Stämmen

konnten artfremde genetische Elemente zuverlässig und reproduzierbar detektiert werden.

Das Verfahren eignet sich prinzipiell zur Untersuchung aller Mikroorganismen, die zur

Veredelung oder Konservierung von Lebensmitteln Verwendung finden und ermöglicht einen

Nachweis von GVMO, sobald diese zwei bis drei artfremde genetische Elemente besitzen. Es ist

durch die Notwendigkeit limitiert, einen geeigneten Referenzstamm zu finden und mit dem

Verfahren können nur Starter- und Schutzkulturen aus nicht sterilisierten Lebensmitteln

untersucht werden. Der wesentliche Vorteil des Verfahrens liegt in der Universalität: Im

Gegensatz zu PCR-Screening-Verfahren zum Nachweis von GVMO ist es ohne Kenntnis von

DNA-Sequenzen potentiell vorhandener artfremder genetischer Elemente anwendbar.

10

1. Einleitung

1.1 Einsatz der Gentechnologie zur Herstellung von Lebensmitteln

1.1.1 Gentechnisch veränderte Nahrungsmittel – ein Wachstumsmarkt?

Während in den USA bereits in großem Maßstab gentechnisch veränderte Pflanzen angebaut

werden, steckt in Europa die Gentechnik im Nahrungsmittelsektor noch in den Kinderschuhen.

Von den knapp 28 Millionen Hektar Ackerland, auf denen 1998 weltweit transgenes Saatgut1

eingesetzt wurde, entfielen allein 20,5 Millionen auf die USA. Andere bedeutende Anbauländer

sind China, Kanada und Argentinien, der europäische Weltmarktanteil lag unter 1%. Dem noch

geringen Grad der kommerziellen Nutzung der Gentechnik steht aber in der EU mit rund 1000

Freisetzungsversuchen und zahlreichen gentechnischen Produkten, die nur im Labormaßstab

produziert wurden, ein hohes Maß an Forschungsaktivitäten gegenüber (Klärner, 1998; DER

SPIEGEL 41/1998; http://www.ucsusa.org, 1999; http://www.rki.de, 1999)2. Doch anhand der

bisherigen Forschungsziele offenbart sich, warum sich Novel Food bei den Verbrauchern in

Europa bisher so schwer durchsetzen ließ: Nur ca. 10% der bisher bei Freisetzungsversuchen

getesteten transgenen Pflanzen weisen veränderte Eigenschaften auf, die man als

Qualitätsverbesserung im Sinne des Konsumenten bezeichnen kann. Rund 75% der

Forschungsaktivität geht in die Übertragung von Resistenzen gegen Schadinsekten,

Krankheitserreger oder Herbizide, allesamt Eigenschaften, die nur den Saatgutkonzernen oder

bestenfalls dem Landwirt direkt nutzen (Jany und Greiner, 1998). Verständlicherweise lehnen

viele Verbraucher eine „grüne“ Gentechnik ab, die für sie und die Umwelt keine Vorteile,

sondern schlimmstenfalls unkalkulierbare Risiken bringt. Solange gentechnisch veränderte

Produkte nicht besser schmecken, länger haltbar, oder ernährungsphysiologisch wertvoller sind

als ihre unveränderten Pendants, werden sie – zumindest in Europa – weiterhin Ladenhüter

bleiben (Sievers, 1999a). Diese sog. 1. Generation gentechnisch veränderter Nahrungsmittel

1 Hierin enthalten sind auch transgene Nutzpflanzen wie z.B. Baumwolle.2 Laufend aktualisierte Informationen über die Marktzulassung transgener Organismen oder deren Freisetzung zuForschungszwecken finden sich auf den Internet-Seiten des Robert-Koch-Instituts (für die EU) und der Zeitschrift„Gene Exchange“ (für die USA).

11

brachte den in dieser Sparte führenden Agro-Konzernen Monsanto, Novartis und Agrevo daher

bisher nur massive ökonomische Verluste ein (Sievers, 1999b).

Derartige Probleme bei der Markteinführung innovativer Produkte sollen in Zukunft dadurch

vermieden werden, daß die 2. Generation gentechnisch veränderter Lebensmittel stärker auf die

Wünsche der Konsumenten zugeschnitten sein wird. In der Entwicklung sind z.B. Produkte mit

einem erhöhten Gehalt an Vitaminen, komplexen Kohlehydraten oder Ballaststoffen und mit

einer ernährungsphysiologisch günstigeren Fettsäuren-Zusammensetzung (Brabeck-Letmathe,

1998; Greiner und Jany, 1998; Wandtner, 1998).

Als Vorbild dient der Boom der probiotischen Lebensmittel. Mit Probiotika wurden allein in

Deutschland 1997, zwei Jahre nach der Markteinführung, Umsätze in Höhe von 300 Mio. DM

erzielt (Kutter, 1998), obwohl die postulierte generelle gesundheitsfördernde Wirkung dieser

Produkte nach wie nach nicht bewiesen werden konnte. Die Marktgängigkeit von Lebensmitteln

hängt eben in hohem Maße von ihrem Image ab. Es ist demnach davon auszugehen, daß für

gentechnisch veränderte Lebensmittel gute Absatzchancen bestehen, sobald glaubhaft vermittelt

werden kann, daß sie nicht nur gesundheitlich unbedenklich, sondern sogar noch „gesünder“ sind

als herkömmliche Nahrungsmittel. Für die weltweite Vermarktung dieser sog. Nutrazeutika

prognostizieren Fachleute Potentiale in der Größenordnung von mehreren Hundert Mrd. US-

Dollar (Sprenger, 1998).

1.1.2 Gentechnisch veränderte Starter- und Schutzkulturen

In nahezu allen menschlichen Kulturen dienen Mikroorganismen traditionell der Herstellung,

Veredelung und Konservierung von Lebensmitteln. Sie werden als Starterkulturen eingesetzt, um

chemische und sensorische Eigenschaften von fermentierten Lebensmitteln zu verändern und als

Schutzkulturen zur Hemmung des Wachstums pathogener und anderer unerwünschter Keime. In

vielen Milchprodukten , z.B. Joghurt, Sauermilch, Quark, Kefir oder Labkäse sind tote und/oder

lebende Milchsäurebakterien ein wesentlicher Bestandteil des Lebensmittels, in probiotischen

Joghurts auch in qualitativer Hinsicht. Außer in den genannten Milchprodukten finden sich in

Rohwurst (z.B. Salami), sauer fermentiertem Gemüse, Schimmelkäse und einigen fernöstlichen

Sojaprodukten noch tote und/oder lebende Mikroorganismen in beträchtlicher Anzahl.

Gegenwärtig sind in der EU noch keine Lebensmittel, die gentechnisch modifizierte

Milchsäurebakterien, Hefen oder Schimmelpilze enthalten auf dem Markt. In Großbritannien ist

aber bereits ein mit gentechnisch veränderter Brauhefe produziertes kalorienreduziertes Bier

zugelassen worden und im Direktvertrieb erhältlich (Jany und Greiner, 1998). Dieses Produkt

enthält aber keine lebenden GVO-Hefen.

12

In den letzten Jahren wurden die Forschungen zur gentechnischen Optimierung von Starter- und

Schutzkulturen stärker anwendungsorientiert durchgeführt. Die Ziele dieser Forschungen waren

neben der Verbesserung der Produktqualität, z.B. durch Steigerung des

ernährungsphysiologischen Werts aber auch die Erhöhung der Prozeß- und Produktsicherheit,

die Reduzierung hygienischer Risiken und die Steigerung der Prozeßeffizienz, also weiterhin rein

wirtschaftlicher Natur (Heller, 1997; Schauzu et al., 1998).

Im Labormaßstab wurden z.B. mit Erfolg gentechnisch modifizierte Brauhefen zur Herstellung

alkoholreduzierten Bieres (Stahl, 1997) und Weinhefen zur Produktion besonders fruchtig

schmeckenden Weins (Perez-Gonzalez, 1993) oder von harnstoffreiem Reiswein (Sake)

eingesetzt3 (Kitamoto, 1991).

Viele Arbeiten beschäftigten sich mit der Optimierung von Milchsäurebakterien und

Schimmelpilzen. Doch da diese in Endprodukten wie Joghurt und Käse – im Gegensatz zum

Bier oder Wein – noch lebensfähig enthalten sind, muß sichergestellt sein, daß die

Mikroorganismen keine Gene für Antibiotika-Resistenzen besitzen und sie keine genetischen

Elemente enthalten, die sie zur Übertragung der neu erworbenen Eigenschaften auf Bakterien der

menschlichen Darmflora befähigen (Geisen und Holzapfel, 1995). Derartige konjugative

Plasmide werden aber momentan noch regelmäßig in der Gentechnik eingesetzt.

Durch die Konstruktion von lebensmitteltauglichen Vektoren für Milchsäurebakterien, die sich

samt ihrer Fracht stabil in das Genom integrieren, scheint jetzt aber der Weg frei zu sein für den

Einsatz der Gentechnik in Molkereiprodukten (Kuipers et al., 1997; Leenhouts et al., 1998). Bei

der Bundesanstalt für Milchforschung in Kiel haben solche Bakterien bereits ihren Praxistest in

der Käseherstellung bestanden (Bockelmann und Heller, 1998). Mit Hilfe der Gentechnik kann

nun auf Aroma und Textur von Joghurt und Käse Einfluß genommen werden, ohne Additive

verwenden zu müssen, die als Verursacher des „chemischen Beigeschmacks“ von vielen

Verbrauchern abgelehnt werden. Außerdem können die Eigenschaften von Milchsäurebakterien,

die für ihre Klassifizierung als probiotische Bakterien relevant sind, verstärkt werden.

Auch bei der Entwicklung lebensmitteltauglicher Vektoren für Schimmelpilze wurden einige

Fortschritte erzielt, wenn auch noch nicht bis zur Marktreife der Organismen. Inzwischen

existieren für alle lebensmitteltechnologisch relevanten Schimmelpilze Vektoren, die sich stabil in

das Genom integrieren und deren Markergene für den menschlichen Verzehr geeignet scheinen

(Geisen, 1993). Diese Vektoren enthalten aber stets noch größere Abschnitte bakterieller DNA,

da sie i.d.R. als shuttle-Vektoren konzipiert wurden. In Kombination mit der Technik

ortsspezifischer Rekombination bei filamentösen Pilzen lassen sich aber diese bakteriellen

3 Harnstoff ist eine Vorstufe des Carcinogens Ethylcarbamat, der Harnstoffgehalt sollte daher in Reiswein möglichstgering sein.

13

Sequenzen nachträglich wieder entfernen. Als Alternative zu dieser aufwendigen Methode bieten

sich Vektoren an, die frei von bakterieller DNA sind. Diese wurden bereits zur Transformation

filamentöser Pilze eingesetzt, allerdings noch nicht bei solchen, die in der Lebensmittel-

Biotechnologie Verwendung finden (Nowak et al., 1995).

Dem Einsatz gentechnisch veränderter Starter- und Schutzkulturen steht aus technologischer

Sicht nichts mehr im Weg. Die Markteinführung von Lebensmitteln, die lebende GVMO

enthalten, wird somit zu einer Frage der Akzeptanz seitens der Verbraucher4 und zu einer Frage

der politischen Regulierung5.

1.1.3 Kennzeichnungsregelungen für gentechnisch veränderte Lebensmittel

In der Bundesrepublik Deutschland6 sind das Inverkehrbringen und die Kennzeichnung von

gentechnisch veränderten Lebensmitteln durch das Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetz

(LMBG) und das Gentechnikgesetz (GenTG) geregelt. Darüberhinaus gelten im Rahmen der EU

die Freisetzungsrichtlinie 90/220/EWG, die Novel Food Verordnung 258/97/EG und die

Etikettierungsrichtlinie 79/112/EWG samt Ergänzungsverordnungen. Für die Vermarktung von

Lebensmitteln, die lebende GVMO enthalten, ergibt sich daraus ein aufwendiges, mehrstufiges

Genehmigungsverfahren und eine unbedingte Pflicht zur entsprechenden Kennzeichnung des

Produkts. Diese Kennzeichnungspflicht greift generell nur, wenn es auch technisch nachweisbar

4 Bereits einige Jahre vor der Markteinführung von Produkten, die in irgendeiner Form mit Gentechnik in Berührungstehen, wurde die Akzeptanz durch die Konsumenten in repräsentativen Umfragen erforscht. BundesdeutscheKonsumenten erwiesen sich dabei als überaus kritisch gegenüber Novel Food und die ablehnende Haltung hat sichmit der Intensivierung der Debatte um Gentechnik und Lebensmittel in den Medien eher noch verstärkt. Nach einereuropaweit durchgeführten Delphi-Studie über die Zukunftserwartungen an die moderne Biotechnologieversprechen sich lediglich 36% der Deutschen von ihr einen positiven Beitrag zur Verbesserung derLebensbedingungen. Schlußlichter bei diesem europäischen Orakel sind die Österreicher mit 28%, während in Italienknapp 60% der Menschen der Biotechnologie erwartungsvoll gegenüberstehen (Menrad, 1998). Nichtsdestotrotzrechnet jeder zweite Deutsche damit, daß innerhalb der nächsten zehn Jahre das meiste Bier in der Bundesrepublikmit gentechnisch veränderter Hefe gebraut werden wird. Es scheint also ein gewisser Fatalismus gegenüber derMacht der Konsumenten(wünsche) bezüglich der Produktentwicklung in der Marktwirtschaft zu herrschen. DieseZukunftserwartung erscheint plausibel, wenn man bedenkt, daß die Akzeptanz gentechnisch veränderterNahrungsmittel in manchen Ländern Europas wesentlich höher ist als in der Bundesrepublik und daß diese Ländereine Vorreiterrolle einnehmen werden, wenn es darum geht, den Konsumenten die Bedenken gegen Novel Food zunehmen. So bevorzugten in einem Produkt-Vergleichstest (Bredahl und Grunert, 1998) zwischen Joghurt ausVollmilch, Magermilch-Joghurt, fettfreiem Joghurt mit Additiven zur Geschmacksabrundung und (nur laut Etikett)gentechnisch hergestelltem fettfreiem Joghurt, der aber wie Vollmilch-Joghurt schmeckt, in Deutschland fast 60%der Tester den Vollmilch-Joghurt und nur 5% das gentechnische Produkt, in Großbritannien hingegen nur 26% denVollmilch-Joghurt und 19% die gentechnisch hergestellte Alternative.5 Diesbezüglich hat sich innerhalb der EU im Jahre 1999 eine bemerkenswerte Trendwende vollzogen. So wurdezum Jahresanfang ein Antrag der Firma Zeneca auf Vermarktung einer „Anti-Matsch-Tomate“, die ein Resistenzgengegen das Antibiotikum Kanamycin enthält, vom zuständigen EU-Ausschuß aufgrund von Sicherheitsbedenkenabgelehnt (Emmrich, 1999). Mitte des Jahres verständigten sich die EU-Umweltminister als Reaktion auf neuereErkenntnisse, nach denen gentechnisch veränderter Mais unkalkulierbare ökologische Risiken berge, auf dieErarbeitung einer strengeren Zulassungsrichtlinie, was nach Worten der EU-Umweltkommissarin Bjerregard einemDe-Facto-Moratorium bis zum Jahr 2002 gleichkomme (dpa, 1999).6 Auf die – angesichts weltweit operierender Lebensmittel-Konzerne durchaus relevanten – Regelungen in anderenStaaten kann hier leider nicht näher eingegangen werden.

14

ist, daß ein Produkt durch gentechnische Veränderungen nicht mehr gleichwertig mit seinem

unveränderten Pendant ist. Diesen Nachweis zu führen, ist unter gewissen Voraussetzungen (s.

Kap. 1.2.1) im Falle z.B. eines Joghurts, der transgene Milchsäurebakterien enthält, technisch

einfach. Weit schwieriger gestaltet sich eine Überprüfung der Kennzeichnungspflicht. Zur

Untersuchung, ob ein nicht gekennzeichneter Joghurt auch wirklich frei ist von GVMO, ist man

bislang auf die Kooperation des Herstellers angewiesen und selbst dann sind die technischen

Möglichkeiten zur Überprüfung der Kennzeichnung noch unzureichend. Eine gesetzliche

Regelung zur (stichprobenartigen) Überprüfung der Kennzeichnung von Lebensmitteln existiert

bisher weder in der Bundesrepublik, noch auf EU-Ebene (Jany und Greiner, 1998).

In der Präambel der Novel Food Verordnung wurde ausdrücklich darauf hingewiesen, daß

Lebensmittel auch derart gekennzeichnet werden können, daß sie „Gentechnikfrei“ seien. In der

Bundesrepublik wurde daraufhin eine entsprechende nationale Verordnung erlassen. Demnach

dürfen nur dann Lebensmittel als „Gentechnikfrei“ gekennzeichnet werden, wenn sie keine GVO

oder deren Bestandteile enthalten und sogar im gesamten Herstellungsprozeß (incl. Tierfutter

und Arzneimittel) kein gentechnisches Verfahren oder Produkt angewendet wurde. Für die

Produktwahrheit sind die Hersteller verantwortlich, sie müssen gegenüber den

Lebensmittelüberwachungsbehörden entsprechende Garantie-Erklärungen abgeben (Haas, 1998).

Doch weder die Novel Food Verordnung, noch die nationale Kennzeichnungs-Verordnung

schreiben bestimmte technische Verfahren zur Überprüfung dieser Garantie-Erklärungen vor.

Auch hier gilt: Ohne wirkungsvolle Überprüfungsverfahren ist der Nutzen einer Etikettierung

„Gentechnikfrei“ höchst fragwürdig.

1.2 Nachweisverfahren für gentechnisch veränderte Organismen in Lebensmitteln

1.2.1 Untersuchung von Lebensmitteln mit Nachweisverfahren auf Basis der PCR

Die meisten in der Routine eingesetzten Verfahren zum Nachweis von gentechnisch veränderten

Organismen bzw. Nahrungsmitteln basieren auf einem Nachweis der modifizierten DNA.

Methode der Wahl ist die PCR in Verbindung mit einer geeigneten Verifizierungs-Methode

(Schulze, 1997). Dieses Vorgehen wurde von Meyer (1995) für die „Flavr-Savr-Tomate“

eingeführt und seitdem für zahlreiche neue gentechnisch veränderte Lebensmittel etabliert

(Hemmer, 1997). Die bundesdeutsche Sammlung von Lebensmittel-Untersuchungsmethoden

nach § 35 LMBG umfaßt mittlerweile fünf in Ringversuchen validierte Verfahren, die allesamt

auf einer Kombination aus PCR und einer Überprüfung des PCR-Produkts mit einer spezifischen

DNA-Sonde beruhen (Zagon et al., 1998). Darunter befinden sich auch zwei Methoden zum

15

Nachweis gentechnisch veränderter Mikroorganismen, nämlich von Lactobacillus curvatus als

Starterkultur in Rohwurst (Nr. L 08.00.44) und von Streptococcus thermophilus als Starterkultur in

Joghurt (Nr. L 02.02.4).

Mit der PCR lassen sich auch in hochgradig verarbeiteten Lebensmitteln noch geringe Spuren der

modifizierten DNA nachweisen. Das macht diese Methode zwar unschlagbar in puncto

Sensitivität, hat aber den Nachteil der möglichen Verwechselung unbeabsichtigter

Kontaminationen mit „echter“ Gen-Manipiulation. Dieses Problem kann allerdings durch die

Festlegung eines Grenzwertes und die Einführung einer quantitativen PCR gelöst werden

(Greiner und Jany, 1998). Die Methode versagt lediglich bei gentechnisch erzeugten

Lebensmitteln, bei denen es durch Filterung der transgenen Mikroorganismen (z.B. bei Bier) oder

durch sehr starkes Erhitzen und Ansäuern (z.B. in Soja-Öl oder Tomaten-Ketchup) zur

vollständigen Degradierung oder Entfernung der DNA kommt (Greiner et al., 1997).

Die PCR ist eine Methode hoher Spezifität, vorausgesetzt, es werden Primer einer Länge von ca.

20 Basen, hoch stringente Bedingungen für das Annealing der Primer und Primer-

Bindungsstellen, die in ihrer Kombination ausschließlich in einem gentechnisch veränderten

Organismus vorkommen, gewählt. Daraus ergibt sich zwangsläufig, daß sich mit der PCR nur

solche gentechnisch veränderten Nucleinsäuren nachweisen lassen, deren Sequenzen publiziert

wurden und nach denen gezielt gesucht werden kann. Ein universeller Nachweis „Enthält

gentechnisch veränderte DNA“ oder gar „Gentechnikfrei“ ist mit einem einzelnen PCR-

Verfahren nicht möglich.

1.2.2 Sonstige Verfahren zum gezielten Nachweis bestimmter Fremdgene oder ihrerGenprodukte in Lebensmitteln

Andere Verfahren als die PCR kommen zum Nachweis gentechnisch veränderter Lebensmittel

i.d.R. nur als Methoden zu deren Verifizierung zum Einsatz, oder wenn das Produkt

erwartungsgemäß keine amplifizierbare manipulierte DNA enthält. Zur Verifizierung besteht

neben der Hybridisierung mit einer DNA-Sonde auch die Möglichkeit einer Restriktions-

Fragmentlängen-Analyse oder einer Sequenzierung des PCR-Produkts. Alternativ zur PCR

kommt gelegentlich eine Ligase-Kettenreaktion (LCR) als Methode der Wahl in Frage (Hemmer,

1997).

Gentechnische Veränderungen lassen sich in einigen Fällen auch gezielt auf der Protein-Ebene

nachweisen. Als Verfahren kommen die Flüssigchromatographie (FPLC) oder immunologische

Methoden wie der Enzyme linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) in Frage. Die Methoden sind

aber wesentlich aufwendiger und weniger sensitiv als die Verfahren auf Nucleinsäure-Ebene und

16

ermöglichen ebenfalls nur die gezielte Suche nach publizierten gentechnischen Manipulationen

(Jany und Greiner, 1998).

1.2.3 Screening-Verfahren zum universellen Nachweis von Fremdgenen in Lebensmitteln

Alle bisher publizierten Ansätze zur Etablierung eines universellen Nachweises von Fremdgenen

basieren auf der PCR. Durch die Verwendung von Primer-Paaren, mit Hilfe derer sich genetische

Elemente nachweisen lassen, die sehr häufig bei der gentechnischen Veränderung von

Lebensmitteln Verwendung finden, können diese PCR-Verfahren zum Screening benutzt

werden. In diesem Sinne bezeichnen Greiner et al. (1998) die Primer-Paare 35S-1/35S-2 und NOS-

1/NOS-2 als geeignet zum Screening nach transgenen Pflanzen. Eine auf ähnlichen Primern

beruhende Methode ist 1998 unter dem Titel „Screeningverfahren zum Nachweis gentechnisch

veränderter DNA-Sequenzen in Lebensmitteln“ in die Amtliche Sammlung nach § 35 LMBG

aufgenommen worden (Nr. L 00.00.31), sie erfaßt aber ebenfalls „nur“ alle bisher vermarkteten

transgenen Pflanzen. Neben den bereits erwähnten Zielsequenzen P-35S-Promoter und nos-3´-

Terminator eigenen sich noch der P-nos-Promoter, der ocs-Terminator und die Markergene npt

II und bar gut für einen universellen Nachweis von Fremdgenen, da sie vielfach bei der

Transformation von pflanzlichen Lebensmitteln eingesetzt wurden. Durch eine Kombination der

entsprechenden Primer-Paare ließe sich nach Hemmer (1997) der Großteil der bis dato

vermarkteten transgenen Pflanzen erfassen. Der Autor merkt allerdings selbst an, daß diese Gene

auch sehr häufig in der belebten Natur vorkommen und damit eine beträchtliche Anzahl falsch

positiver Testergebnisse zu erwarten sei.

Zur Identifikation gentechnisch modifizierter Mikroorganismen schlagen MacCormick et al.

(1998) ein ähnliches Vorgehen vor. Ausgehend von den Sequenzen sechs häufig benutzter

Markergene bakterieller Herkunft (davon vier Antibiotika-Resistenzgene) und der

übereinstimmenden Abschnitte der gebräuchlichsten Polylinker haben sie Primer abgeleitet und

einen Cocktail von DNA-Sonden entwickelt, mit deren Hilfe sich gentechnisch veränderte

Milchsäurebakterien mit einer hohen Wahrscheinlichkeit identifizieren lassen sollten. Für GVO-

Hefen wurden insgesamt sieben Markergene aufgeführt, die sich als Zielgene zum Nachweis einer

gentechnischen Manipulation eignen sollten, da sie in Hefen von Natur aus nicht vorkommen.

Leider wurde bisher keine entsprechende Liste für gentechnisch veränderte Schimmelpilze

erarbeitet. Den empirischen Beweis, daß diese Strategie in der Laborpraxis auch umsetzbar ist,

liefern MacCormick et al. nicht, die entsprechenden Experimente stehen noch aus. Zweifellos ist

hiermit ein Ansatz für den Nachweis nicht deklarierter gentechnisch veränderter

Mikroorganismen bzw. Lebensmittel gegeben. Die Autoren betonen aber auch, daß jedes

17

Screening mit solch einem System zwangsläufig den Neu-Entwicklungen der gentechnologischen

Lebensmittelproduktion hinterhinken muß und stets auf die Preisgabe der Methoden und DNA-

Sequenzen durch Forschungsinstitute und Unternehmen angewiesen sein wird.

1.3 Bausteine zur Entwicklung einer universellen Nachweismethode für GVMO

Um in einem Organismus Fremdgene nachzuweisen, muß man mit den bisher zur Verfügung

stehenden Methoden entweder gezielt oder im PCR-Screening nach ganz bestimmten, bekannten

Zielsequenzen suchen. Als Alternative zu diesem Vorgehen wurde in dieser Arbeit ein Verfahren

auf Grundlage der Subtraktiven Hybridisierung entwickelt, das einen Abgleich des Genoms des

potentiell gentechnisch veränderten Untersuchungs-Organismus mit einem gentechnisch nicht

veränderten Referenz-Organismus ermöglichen sollte. Anhand der Differenzen sollte

rückverfolgt werden können, ob der Untersuchungs-Organismus genmanipuliert worden ist oder

nicht.

1.3.1 Methoden zur Darstellung geringfügiger Unterschiede im Genom nah verwandterOrganismen

Das Grundprinzip der Subtraktiven Hybridisierung besteht in der Entfernung aller Nukleinsäure-

Sequenzen eines Zelltyps oder Stamms, die homolog zu einem Referenz-Zelltyp oder Referenz-

Stamm sind. Dadurch ergibt sich eine Anreicherung und die Möglichkeit zur genaueren Analyse

derjenigen Sequenzen, die in der Referenz nicht vorkommen. Das Verfahren kann mit cDNA

(seitens der Referenz auch cDNA oder RNA) und Gesamt-DNA durchgeführt werden. Die

Subtraktive Hybridisierung wurde ursprünglich zur Analyse zelltypspezifischer Genexpression

entwickelt (Davis et al., 1984; Hedrick et al., 1984) und seitdem eingesetzt zur Identifikation

einzigartiger Sequenzen im Genom pathogener Bakterienstämme oder zur Isolierung

merkmalsgebundener polymorpher Marker. Die methodische Weiterentwicklung betraf im

wesentlichen die Technik zur Entfernung der homologen Hybride nach der Hybridisierung der

Genome. Die DNA/RNA-Hybride, die bei der Untersuchung von Genexpressionsmustern

anfallen, lassen sich durch eine Hydroxyl-Apatit-Chromatographie entfernen. Bei Subtraktiven

Hybridisierungen auf DNA-Ebene werden die Hybride abgetrennt, indem die DNA der Referenz

biotinyliert wird und die somit biotinylierten Hybride durch eine Reaktion mit Streptavidin und

eine Phenol/Chloroform-Extraktion entfernt werden können (Sive und St. John, 1988). Eine

Vereinfachung dieser Methode ergibt sich durch den Einsatz streptavidinbeschichteter

magnetischer Partikel. Die Anreicherung der nach einer Subtraktiven Hybridisierung isolierten

18

cDNA oder DNA-Fragmente erfolgt, falls sie nicht markiert und als Sonde eingesetzt werden

sollen, entweder durch Klonierung oder durch PCR nach der Ligation von Adaptern (Straus und

Ausubel, 1990). In jedem Fall müssen für eine Anreicherung einzelner einzigartiger Sequenzen

die Arbeitsschritte Hybridisierung und anschließende Entfernung der Hybride mehrfach

hintereinander durchgeführt und dabei eine große Menge an Referenz-Nucleinsäure eingesetzt

werden. Das macht die Methode zu einem zeitaufwendigen und in manchen Fällen (z.B. bei

wenig Probenmaterial) auch nicht praktikablen Verfahren.

1.3.2 Die Representational Difference Analysis (RDA): Eine Kombination ausSubtraktiver Hybridisierung und Suppression-PCR

Eine wesentliche Vereinfachung und qualitative Verbesserung zur Untersuchung der

Unterschiede nah verwandter Genome oder cDNA-Banken stellt die RDA dar. Während durch

eine fünfstufige Subtraktive Hybridisierung eine Anreicherung einzigartiger Sequenzen gegenüber

dem Ausgangszustand etwa um den Faktor 1000 erreicht werden kann, was zur Isolierung von

single-copy Genen aus komplexen eukaryotischen Genomen nicht ausreicht, liefert die RDA in

einem zweistufigen Verfahren bereits eine Anreicherung um den Faktor 105 (Lisitsyn et al., 1993).

Erreicht wird dies durch eine adaptergestützte exponentielle Amplifikation aller Nicht-Hybride

nach jeder einzelnen Subtraktion, während Hybrid-DNA nur linear oder gar nicht amplifiziert

wird. Damit eröffneten sich zunehmend Möglichkeiten zur Arbeit mit hoch komplexen

Genomen wie dem menschlichen, z.B. zur Analyse molekulargenetischer Unterschiede zwischen

Krebszellen und gesunden Zellen (Lisitsyn, 1995).

Eine weitere methodische Vereinfachung der RDA führten Gurskaya et al. (1996) und

Diatchenko et al. (1996) ein, indem sie das Prinzip der Suppression PCR (US Patent # 5.565.340)

integrierten. Dadurch, daß beide Adapter A und B eine selbst-komplementäre Sequenz haben,

bilden DNA-Fragmente, die an ihren Enden den gleichen Adapter tragen Sekundärstrukturen

aus, die zu einer Verminderung ihrer Amplifikation in einer PCR führen, obwohl Primer

eingesetzt werden, die auf die Sequenzen der Adapter abgestimmt sind. Zur exponentiellen

Amplifikation gelangen lediglich DNA-Fragmente, die an einem Ende den Adapter A und am

anderen Ende den Adapter B tragen. Sie werden somit selektiv angereichert.

Darauf aufbauend hat die Firma Clontech ihr PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit mit den

Adaptern 1 und 2R und einem Primer P1 für eine erste und einem Primer-Paar Pn1 und Pn2R

für eine nested PCR entwickelt. Das Prinzip der Methode ist in Abb. 1.1 dargestellt (s. auch Kap.

2.5). Die zweistufige Amplifikation gewährleistet eine maximale Anreicherung der gesuchten

einzigartigen Sequenzen gegenüber dem Rest des Genoms (Clontech Laboratories Inc., 1995).

19

Abbildung 1.1: Schematische Darstellung der Representational Difference Analysis mit dem Clontech PCR-SelectcDNA Subtraction Kit (Clontech Laboratories Inc., 1995). Schritte 1A und 1B: Erste Subtraktive Hybridisierung ingetrennten Ansätzen, Schritt 2: Zweite Subtraktive Hybridisierung unter Vereinigung der Ansätze sowie Zugabefrisch denaturierter Driver-DNA, Schritt 3: Auffüllen der überstehenden Adapter, Schritt 4: Erste PCR undanschließende nested PCR.

Representational Difference Analysis mit dem Clontech-Kit

1A 1B

2

3

4

Fragmentierte Driver-DNA(im Überschuß)

Fragmentierte Tester-DNA mitAdapter 1

Fragmentierte Tester-DNA mitAdapter 2R

a

b

c

d

a

b

c

d

a,b,c,d + e

a

b

c

d

e

b = Suppression-PCR, geringe Amplifikation

e = exponentielle Amplifikation a,d = keine Amplifikationc = lineare Amplifikation

20

1.3.3 Vorversuche zum Nachweis von GVMO durch genomische Subtraktion

Im Rahmen einer Diplomarbeit in der AG von Prof. Hildebrandt wurde anhand eines

Modellsystems bestehend aus λ-Phagen-DNA, der als Fremdgen ein bakterieller

Transformationsvektor zugefügt wurde, überprüft, inwieweit durch genomic blocking

hybridization ein Nachweis dieses „GVO“ möglich wäre. Der Nachweis beruhte darauf, daß

enzymatisch geschnittene, einzelsträngige GVO-DNA an eine Membran gebunden und mit

DIG-markierter, identischer DNA hybridisiert wurde. Der Hybridisierungslösung wurde als

Driver-DNA in hohem Überschuß nicht markierte, fragmentierte DNA des nicht gentechnisch

veränderten Referenz-Organismus, in diesem Falle λ-DNA zugefügt. Dadurch sollte die DNA-

Sonde für das Fremdgen relativ zur restlichen Sonden-DNA angereichert werden und damit nach

der Hybridisierung auf einen Southern Blot ein deutliches Signal auf der Bahn mit dem „GVO“

liefern. Diese Methode erwies sich nur innerhalb des beschriebenen, sehr einfachen

Modellsystems als praktikabel und auch nur dann, wenn der „GVO“ Fremdgene in einem

Ausmaß enthielt, das in der Realität nicht zu erwarten wäre (Foth, 1997). Die Anwendung der

Methode scheiterte bereits im prokaryontischen Modellsystem L. sake (s. Kap. 2.1.1).

Auch die bereits in Kap. 1.3.1 beschriebene Methode von Straus und Ausubel (1990) lieferte mit

dem prokaryontischen Modellsystem L. sake keinen Nachweis der GVMO. Als Tester-DNA

diente enzymatisch geschnittene DNA des Stamms L. sake ATP, als Driver DNA gleichartig

geschnittene und biotinylierte DNA des Wildtyp-Stamms L. sake 23K. Es wurden fünf Zyklen der

Subtraktiven Hybridisierung jeweils mit einem hohen Überschuß an Driver-DNA durchgeführt,

wobei die biotinylierten Hybride mit streptavidin-beschichteten Magnetpartikeln (Merck Bio-

Beads) aus der Hybridisierungslösung entfernt wurden. Die verbliebenen, nicht-biotinylierten

Hybride wurden mit Adaptern versehen und in einer PCR amplifiziert. Die Amplifikate

entsprachen aber nicht den nachzuweisenden Fremdgenen.

1.3.4 Anpassung der RDA an die Erfordernisse zum Nachweis von GVMO

Die RDA verspricht verglichen mit anderen Methoden der genomischen Subtraktion eine

außerordentlich starke Anreicherung speziesspezifischer oder gewebespezifischer Gene. Ob diese

Leistungsfähigkeit auch ausreichen würde, in einem realitätsnahen Modellsystem Fremdgene und

damit die GVMO nachzuweisen, sollte in dieser Arbeit geklärt werden. Dafür wurde jeweils ein

prokaryontischer und ein eukaryontischer Modell-Organismus ausgewählt, der sowohl in der Art

und dem Umfang der gentechnischen Veränderung den Anforderungen entsprach, als auch

hinsichtlich seiner Relevanz für die Lebensmittel-Biotechnologie. Außerdem wurde auf das

21

kommerziell erhältliche PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit der Firma Clontech

zurückgegriffen, da damit auch ein späterer Einsatz des Nachweisverfahrens im Routinebetrieb

einfach zu bewerkstelligen wäre. Die Arbeitsvorschriften aus dem Kit sollten für die Arbeit mit

Gesamt-DNA modifiziert werden. Im wesentlichen galt es, die Bedingungen für eine

Anreicherung weniger single-copy Fremdgene einschließlich ihrer Steuerungselemente aus einem

hoch komplexen Genom heraus zu ermitteln. In Bezug auf das eukaryontische Modellsystem

wurde hier Neuland betreten, da genomische Subtraktion bisher stets von bakterieller DNA

ausging und auf eukaryontischer Ebene von der cDNA des zu untersuchenden Organismus bzw.

Gewebes. Darüber hinaus sollte eine Methodik etabliert werden, die angereicherten Gen-

Fragmente zu isolieren und ihre Herkunft zu bestimmen, um damit den Nachweis von GVMO

zu führen.

1.4 Charakterisierung der Modell-Organismen Lactobacillus sake und Penicilliumnalgiovense

1.4.1 Taxonomische und physiologische Einordnung

1.4.1.1 Lactobacillus sake

Die Milchsäurebakterien werden in der Familie der Lactobacteriaceae zusammengefaßt, wobei die

Gattung Lactobacillus mehr als 50 Arten umfaßt (Miteva et al., 1992). Obwohl die Gruppe

morphologisch uneinheitlich erscheint und Lang- und Kurzstäbchen sowie Kokken einschließt,

ist sie physiologisch relativ gut zu charakterisieren. Alle Angehörigen sind gram-positiv, bilden

keine Sporen und sind mit Ausnahmen unbeweglich. Zur Energiegewinnung sind sie durchweg

auf Kohlehydrate angewiesen und scheiden Milchsäure (Lactat) aus. Im Gegensatz zu den

ebenfalls Lactat produzierenden Enterobacteriaceae sind sie obligate Gärer. Sie enthalten keine

Hämine (Cytochrome, Katalase). Trotz dieses Mangels sind die Lactobacteriaceae in der Lage, in

Gegenwart von Luftsauerstoff zu wachsen, sie sind anaerob aber aerotolerant (Schlegel, 1985).

Lactobacteriaceae haben die Fähigkeit zur Synthese vieler Metabolite verloren. Sie haben einen

hohen Bedarf an Aminosäuren, Peptiden, Nucleotiden, Vitaminen, Salzen und fermentierbaren

Kohlehydraten. Nach ihrer Eigenart, Glucose entweder nur zu Lactat oder daneben auch zu

anderen Gärprodukten und CO2 zu vergären, teilt man die Milchsäurebakterien in

homofermentative und heterofermentative ein. Homofermentative Lactobacillen bilden reines

Lactat. Bei den heterofermentativen Milchsäurebakterien entsteht neben Lactat auch Ethanol

(Schlegel, 1985).

22

Mit den hohen Nährstoffansprüchen und der Art der Energiegewinnung hängt die Verbreitung

der Lactobacteriaceae in der Natur zusammen. Sie sind Teil der Normalflora vieler Tiere,

einschließlich des Menschen. Obwohl vereinzelt über eine Beteiligung der Lactobacteriaceae bei

schweren Infektionen berichtet wird, gelten die Lactobacteriaceae als nicht pathogen. Aufgetretene

Infektionen mit Lactobacillus stellten sich in der Vergangenheit als Kontaminationen, als

Sekundärbesiedlung oder aber als falsch identifizierte Streptokokken-Infektion heraus (Aguirre und

Collins, 1993).

Roussel et al. (1993) bestimmten für Milchsäurebakterien eine Genomgröße von ca. 2 x 106 bp,

damit zählen sie zu den Prokaryoten mit einem eher kleinen Genom. Der GC-Gehalt der DNA

beträgt 32-53% (L. sake: 42-44%). Innerhalb der Art L. sake beträgt die DNA-Homologie

lediglich 76-100%. Anhand dieser Ergebnisse wurde inzwischen vorgeschlagen, die Art in die

Subspezies L. sake subsp. sake und L. sake supsp. carnosus zu unterteilen. (Torriani et al., 1996).

1.4.1.2 Penicillium nalgiovense

Die Gattung Penicillium gehört zu den Deuteromycetes oder Fungi imperfecti, sie umfaßt mehr als

hundert Arten. Der Name leitet sich von der charakteristischen Form der Konidiophoren ab, die

in einem Büschel von verzweigten Ästen (lat. Penicillus) enden. Penicillium Arten sind vorwiegend

in den gemäßigten klimatischen Regionen anzutreffen, dort aber in Boden, Wasser, Luft und

Innenräumen sehr häufig vertreten. Penicillien sind Saprobionten, gewinnen also ihre Energie aus

dem Abbau toter organischer Substanz. Sie pflanzen sich überwiegend vegetativ fort und sind in

der Lage, Sporen zu bilden.

Wie die meisten Schimmelpilze sind auch die Arten der Gattung Penicillium i.d.R. sehr

anspruchslos und wachsen daher auf den unterschiedlichsten Substraten und in einem weiten

Temperaturbereich. Daher spielen sie auch eine bedeutende Rolle als Lebensmittelverderber und

Materialzersetzer. Die Art P. nalgiovense ist beispielsweise häufig am Verschimmeln von Weichkäse

beteiligt.

Einige Penicillien besiedeln die menschliche Haut, gedeihen dort als Opportunisten und können

auch an Haut-Mykosen beteiligt sein. Im engeren Sinne pathogen ist aber keine Penicillium Art.

Zur Gattung Penicillium gehört auch eine Reihe von Mycotoxinbildnern, darunter auch die

lebensmitteltechnologisch relevante Spezies P. roqueforti. P. nalgiovense ist demgegenüber nicht fähig

zur Synthese bekannter Mycotoxine (Reiß, 1997).

Penicillien haben ein Genom einer Größe von ca. 5 x 107 bp und sind im Gegensatz zu Hefen im

molekulargenetischen Sinne echte Eukaryonten (Alberts et al., 1995).

23

1.4.2 Einsatz der Modell-Organismen in der Lebensmittel-Biotechnologie

1.4.2.1 Lactobacillus sake

Der auf der Ansäuerung ihrer Umgebung durch die Ausscheidung von Lactat beruhenden

sterilisierenden und konservierenden Wirkung verdanken die Milchsäurebakterien ihre breite

Verwendung in der Landwirtschaft, in der milchverarbeitenden Industrie und in der

Lebensmittelherstellung (Ruiz-Barba et al., 1991). Man verwendet sie als Starterkulturen in Milch-

Getreide-, Fleisch- und Fischprodukten, zur Fermentation von Bier, (Reis-)Wein, Obst und

Fruchtsäften, eingelegtem Gemüse, Sauerkraut, Silagen, Sauerteig und Maische. Die Art L. sake

befindet sich als Starterkultur vorwiegend in japanischem Reiswein (Sake), in Sauerkraut und in

Rohwurst wie z.B. Salami (Schlegel, 1985; Rodtong und Tannock, 1993; Mäkelä et al., 1992;

Geisen und Holzapfel, 1995).

1.4.2.2 Penicillium nalgiovense

Die Fähigkeit zur Bildung einer Vielzahl von Primär- und Sekundärmetaboliten macht

Schimmelpilze zu biotechnologisch höchst interessanten Organismen. Dies nutzt man

biotechnologisch bei der Produktion von Enzymen, Pharmazeutika und Aromastoffen sowie zur

Veredelung von Lebensmitteln. Drei Arten der Gattung Penicillium sind bei der

Lebensmittelherstellung von Relevanz: P. camemberti und P. roqueforti zur Produktion von Weich-

bzw. Schimmelkäse sowie P. nalgiovense zur Herstellung von Rohwürsten und anderen

Fleischwaren. Im letzteren Fall erfolgt das Wachstum des Pilzes ausschließlich auf der Oberfläche

der Rohware. Das dichte Mycel gibt Stoffwechselprodukte in das Innere der Wurst oder des

Schinkens ab und hat dabei gleichzeitig die Funktion einer Schutz- und einer Starterkultur.

Beispielhafte Endprodukte aus der Fermentation mit P. nalgiovense sind Salami, Bündner Fleisch,

Tiroler Bauernspeck oder Amerikanischer Knochenschinken (Reiß, 1997).

24

2. Material und Methoden

2.1 Organismen

2.1.1 Herkunft und Eigenschaften der Lactobacillus sake Stämme

Die in dieser Arbeit benutzten, gentechnisch veränderten Lactobacillus sake Stämme wurden von

Dr. M. Zagourec, vom Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), Jouy-en-Josas

(Frankreich) zur Verfügung gestellt, ebenso der Wildtyp, von dem die GVO-Stämme abgeleitet

wurden. Bei den GVO handelte es sich um drei Lactobacillus sake Stämme, die durch homologe

Rekombination mit einem um ein Erythromycin-Resistenzgen (emr) von Streptococcus faecalis

erweiterten, auf pBluescript SK basierenden Vektor pRV 300 (Kok et al. , 1984; Simon and

Chopin, 1988; Leloup et al., 1997) transformiert wurden. Mit diesem Vektor wurde beim Stamm

L. sake ATP das Gen atp, beim Stamm L. sake CLP das Gen clp und beim Stamm L. sake PTS das

Gen pts übertragen. Die anderen Wildtyp-Stämme wurden von der Deutschen Sammlung für

Mikroorganismen (DSM) und vom Institut für Lebensmitteltechnologie (IfLTH) der Universität

Hohenheim bezogen.

Tabelle 2.1: Charakterisierung der in dieser Arbeit verwendeten Lactobacillus sake Stämme.

BEZEICHNUNG STATUS GENTECHNISCHE VERÄNDERUNGEN HERKUNFT

L. sake ATP GVO ATP-Synthase-Gen atp, emr, pBSK INRAL. sake CLP GVO Protease-Gen clp, emr, pBSK INRAL. sake PTS GVO Phosphotransferase-Gen pts, emr, pBSK INRAL. sake 23K Wildtyp (original) Keine INRAL. sake DSM 20017 Wildtyp (alternativ) Keine DSML. sake LTH 938 Wildtyp (alternativ) Keine IfLTHL. sake LTH 947 Wildtyp (alternativ) Keine IfLTHL. sake LTH 948 Wildtyp (alternativ) Keine IfLTH

Die Sequenzen der Gene atp, clp, pts (s. Anhang) wurden uns vom INRA zur Verfügung gestellt,

allerdings nicht die komplette Sequenz des Vektors pRV 300, die bisher auch nicht in den

Datenbanken Genbank oder EMBL veröffentlicht worden ist. Die Funktionen der Gene atp, clp

25

und pts sind in der Tab. 2.1 beschrieben, bezüglich ihrer Herkunft wurde vom INRA lediglich

mitgeteilt, daß sie aus einem Milchsäurebakterium stammen. Bei allen GVO-Stämmen sind die

Zusatz-Gene stabil genomisch integriert, über den Integrationsort und die Kopienzahl liegen

keine Angaben vor (Zagourec, pers. Mitteilung 1997). Bei den Wildtyp-Stämmen, die alternativ

zum Stamm L. sake 23K als Referenz eingesetzt wurden, handelte es sich um ein Umwelt-Isolat

von der DSM und vier Laborstämme, die in lebensmitteltechnologischen Forschungsarbeiten am

IflTH verwendet werden.

2.1.2 Herkunft und Eigenschaften der Penicillium nalgiovense Stämme

Die in dieser Arbeit benutzten Stämme von P. nalgiovense wurden von Dr. R. Geisen von der

Bundesforschungsanstalt für Ernährung (BFE) in Karlsruhe zur Verfügung gestellt. Es handelte

sich dabei um die zwei gentechnisch veränderten Stämme BFE 19 und BFE 20, den Wildtyp-

Stamm BFE 66, der als Wirtstamm für die Transformationen diente, sowie den „alternativen“

Wildtyp BFE 328. Beide GVO-Stämme wurden mit den Plasmiden p3SR2 und pKW 100

transformiert, die an unterschiedlichen Orten im Genom stabil integriert wurden (Geisen und

Leistner, 1989; Geisen, pers. Mitteilung 1998). Die Plasmide sind 13 kb und 8,7 kb groß. Auf den

Plasmiden sind folgende Gene lokalisiert: Ein Acetamidase-Gen amdS von Aspergillus nidulans, das

β-Galactosidase-Gen lacZ von Escherichia coli, ein Ampicillin-Restistenzgen ampr unbekannter

Herkunft, ein Ornithin-Carbamoyltransferase-Gen argB von Aspergillus nidulans sowie der

Oligomycin-C-Resistenzgen-Promotor und der trpC-Terminator von Aspergillus nidulans.

2.2 Kultivierung der Mikroorganismen

2.2.1 Kultivierung von Lactobacillus sake

Zur Kultivierung der L. sake Stämme wurde das Vollmedium MRS (DeMan et al.,1960)

verwendet. Ausnahme: Die Stämme L. sake ATP und L. sake PTS wurden in MRS+-Medium

kultiviert. Die Bakterien wurden mittels 3-Ösen-Ausstrich auf MRS-Agarplatten bzw. MRS+-

Agarplatten ausgebracht und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Einzelne Klone wurden mit einem

sterilen Zahnstocher in 5 ml Medium überführt und ebenfalls über Nacht bei 30 °C unter

Schütteln inkubiert. Anschließend wurde die Vorkultur in 120 ml vorgewärmtes Medium

überführt und nochmals für 24 h bei 30 °C unter Schütteln inkubiert. Den Medien wurde bei der

Kultivierung der GVO-Stämme kein Erythromycin zugegeben, da das Gen emr auch ohne

Selektionsdruck stabil im Genom verbleibt.

26

2.2.2 Kultivierung von Penicillium nalgiovense

Die Schimmelpilze wurden in Malzextrakt-Medium bzw. auf Malzextrakt.Agar bei 25 °C in der

Dunkelheit kultiviert. Ein Bakterienwachstum wurde mit Kanamycin (50 µg/ml) unterdrückt. Für

präparative Zwecke wurden Flüssigkulturen von 250 ml 5 Tage lang unter kräftigem Schütteln

inkubiert.

2.3 DNA-Isolierung

2.3.1 DNA-Isolierung aus Lactobacillus sake

Es wurde eine Methode zur Isolierung der Gesamt-DNA gram-positiver Bakterien angewandt

(Stahl et al., 1990), die in einigen Punkten nach dem Protokoll zur Aufreinigung von DNA über

einen CsCl-Gradienten (Sambrock et al., 1989) modifiziert wurde. 125 ml Bakterienkultur aus

exponentiellem Wachstum wurden in Zentrifugenbecher überführt und 10 min lang bei 4000 x g

und 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10 ml eiskaltem TSE-Puffer suspendiert und

nochmals bei 4000 x g und 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wurde in 3 ml TSES-Puffer suspendiert,

dann 2 ml TSES mit 120 mg Lysozym und 140 U Mutanolysin hinzugefügt, 2 h bei 42 °C

inkubiert und gelegentlich aufgeschüttelt. Zu jeder Probe wurden 3 mg Proteinase K

hinzugegeben und bei 37 °C für 30 min inkubiert. Dem Lysat wurde 1 ml NaCl-Lösung (5%), 2

ml SDS-Lösung (20%) und 10,4 ml TSE-Puffer zugegeben, die Suspension sanft mit einem

Glasstab zu einer homogenen Lösung verrührt und für 15 min bei 65 °C inkubiert. Die

Suspension wurde auf RT abgekühlt und dann 1 mal mit einem Volumen Phenol/Chloroform

extrahiert. Anschließend wurde 10 min bei 16000 x g zentrifugiert. Die wäßrige Oberphase wurde

in ein neues Gefäß überführt und mit 1 Volumen Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert. Erneut

wurde bei 16000 x g für 10 min zentrifugiert. Die DNA wurde durch Zugabe von 0,2 Volumen

Ammoniumacetat-Lösung (10 M) und 2,5 Volumen eiskaltem Ethanol präzipitiert. Durch die

anschließende Zentrifugation für 15 min bei 16000 x g wurde die DNA pelletiert. Das Pellet

wurde in 14 ml TE gelöst und 1,12 ml Ethidiumbromid (10 mg/ml) hinzugegeben.

Anschließend wurden zu der DNA-Lösung 14 g CsCl hinzugegeben und die Proben auf 37 °C

erhitzt, bis sich das CsCl vollständig gelöst hatte. Die DNA-Lösung wurde mit einer

Pasteurpipette luftblasenfrei in die Ultrazentrifugationsröhrchen gefüllt, die Röhrchen mit

flüssigem Paraffin aufgefüllt, auf 0,01 g genau austariert und verschlossen. Die Proben wurden

für 16 h bei 45000 rpm und 20 °C im VT 8651-Rotor zentrifugiert. Die DNA-Bande wurde unter

27

UV-Licht (366 nm) in dem CsCl-Gradienten sichtbar gemacht und mit einer Spritze aus dem

Gradienten herausgesogen. Das Ethidiumbromid wurde durch die Zugabe von 1 Volumen TE-

gesättigtem n-Butanol extrahiert. Diese Extraktion wurde bis zur vollständigen Entfernung des

Ethidiumbromids wiederholt (ca. 3-6 mal). Anschließend wurde die DNA-Lösung in

Dialyseschläuche gefüllt und gegen das 100-fache Volumen TE bei 4 °C über Nacht dialysiert.

Nun wurde die Lösung in ein 13 ml Sarstedt-Röhrchen überführt, 0,2 Volumen

Ammoniumacetat-Lösung (10 M) hinzugegeben und die DNA mit 2,5 Volumen eiskaltem

Ethanol präzipitiert. Die DNA wurde durch Zentrifugation für 30 min bei 12000 x g und 4 °C

pelletiert, das Pellet mit 70% Ethanol gewaschen und die DNA in TE gelöst.

2.3.2 DNA-Isolierung aus Penicillium nalgiovense

Die Isolierung von Gesamt-DNA aus filamentösen Pilzen erfolgte nach der Methode von Zhang

et al. (1996). Das Pilzmycel einer Flüssigkultur wurde durch ein steriles Filterpapier vom Medium

abfiltriert und mit demin. Wasser gewaschen. 5 bis 10 g Mycel wurden in flüssigem Stickstoff mit

einem Mörser sehr fein pulverisiert und in 20 ml CTAB-Puffer suspendiert. Die Suspension

wurde 1 h lang bei 65 °C inkubiert, auf RT heruntergekühlt und mit einem Volumen

Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert. Aus der wäßrigen Phase wurden die Nucleinsäuren mit

0,6 Volumen Iso-Propanol ausgefällt und durch Zentrifugation bei 8000 x g pelletiert. Das Pellet

wurde mit 70% Ethanol gewaschen und in 5 ml demin. Wasser gelöst. Zum RNA-Abbau wurde

3 g RNase zugegeben und 1 h lang bei 37 °C inkubiert. Die Lösung wurde mit einem Volumen

PCI-Mix und anschließend mit einem Volumen Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert. Die

DNA wurde durch Zugabe von 0,1 Volumen Natriumacetat-Lösung (3 M) und 2,5 Volumen

Ethanol präzipitiert und bei 12000 x g abzentrifugiert. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol

gewaschen und die DNA in TE gelöst.

2.4 Standard-Methoden der Molekularbiologie

Falls nicht anders angegeben, wurden alle Methoden nach Sambrook et al. (1989) mit

geringfügigen laborinternen Modifikationen durchgeführt.

2.4.1 Agarose-Gelelektrophorese

Die Agarose (0,8% - 2% in 1 x TAE-Puffer) wurde durch Aufkochen in der Mikrowelle

vollständig gelöst. Die Lösung wurde auf ca. 60 °C abgekühlt, der Flüssigkeitsverlust mit demin.

28

Wasser ausgeglichen und in die vorbereitete Gelkammer gegossen. Nach dem Auspolymerisieren

wurden die DNA-Proben mit 0,1 Volumen Probenauftragspuffer versetzt und das Gel mit den

Proben beladen. Nach der Auftrennung der DNA bei einer Feldstärke von ca. 10 V/cm wurde

das Gel für mindestens 20 min mit Ethidiumbromid (0,5 mg/l in TAE-Puffer) angefärbt, die

DNA im UV-Licht bei 366 nm visualisiert und fotografiert.

2.4.2 Southern Blot

Nach der gelelektrophoretischen Auftrennung der DNA wurde diese im alkalischen

Blotverfahren auf eine Nylonmembran transferiert. Hierzu wurden die Membran und 2

Whatman-Filterpapiere kurz in 2x SSC äquillibriert und in die Blotting-Apparatur gelegt. Darauf

wurde eine Folienmaske und schließlich das Agarosegel luftblasenfrei auf die Membran gelegt.

An der Vakuumpumpe wurde ein Unterdruck von ca. 50 hPa eingestellt. Das Gel wurde während

des 75 - 90 minütigen Blotvorgangs mehrfach mit alkalischer Transferlösung (0,4 M NaOH)

überschichtet. Nach der Entfernung des Gels wurde die Membran kurz in 2 x SSC äquillibriert

und konnte nun direkt zur Hybridisierung verwendet oder bei 4 °C in 2x SSC gelagert werden.

2.4.3 Herstellung von DNA-Sonden

Um DNA-Fragmente als Sonden verwenden zu können, wurden sie nach dem Digoxigenin-

DNA-Labeling-System (Boehringer) markiert. Nach 10 minütiger Hitzedenaturierung der DNA

(ca. 1 µg/15µl) im kochenden Wasserbad und Zwischenlagerung im Eiswasserbad wurden zu der

DNA je 2 µl Hexanucleotidmix und DNA-Labeling-Mix gegeben. Nach der Addition von 1 µl

Klenow-Polymerase (5U/µl) wurde der Reaktionsansatz für 1 - 24 h bei 37 °C inkubiert. Die

Reaktion wird durch Zugabe von 2 µl EDTA-Lösung (0,5 M) gestoppt.

Zur Kontrolle der Markierungseffizienz wurde eine Verdünnungsreihe der markierten DNA

neben einer solchen Reihe mit DIG-markierter Kontroll-DNA (Boehringer) auf eine

Nylonmembran aufgetragen. Nach Antrocknen der Proben wurde die Membran kurz in DIG-

Puffer 1 gewaschen, darauffolgend für 30 min bei RT in DIG-Puffer 2 inkubiert. Der Puffer 2

wurde verworfen und die Membran für 30 min in Anti-DIG-Antikörper-Alkalische-Phosphatase-

Konjugat (Anti-DIG-AP, 1:10000 mit DIG-Puffer 2 verdünnt) inkubiert. Dann folgte 2 x

Waschen für je 15 min in DIG-Puffer 1 sowie 2 min Inkubation der Membran in DIG-Puffer 3.

Die Membran wurde mit 1 ml Detektionslösung (NBT + X-Phosphat) in Folie eingeschweißt

und 1 - 16 h lang im Dunkeln gelagert. Die Intensität der sich entwickelnden Grau- bis

29

Dunkelblaufärbung der einzelnen Dots konnte schließlich miteinander verglichen und daraus die

Markierungseffizienz berechnet werden.

2.4.4 Hybridisierung auf festphasengebundene DNA und DIG-Nachweis

Die durchgeführten Hybridisierungen wurden nach dem Boehringer-Protokoll zur

Hybridisierung mit DIG-markierten Sonden durchgeführt und erfolgten in verschließbaren

Glasröhren, in der Regel unter hoch stringenten Bedingungen. Die auf Kunststoffgaze gelagerte

Membran wurde für mindestens 1 h im Hybridisierungsofen in 10 ml Prähybridisierungslösung

prähybridisiert. 100 ng DIG-markierte Sonde für wurden 10 min lang bei 95 °C denaturiert und

in 5 ml Hybridsierungslösung aufgenommen. Die Prähybridisierungslösung wurde verworfen und

durch die Hybridisierungslösung ersetzt. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht. Nach dem

Abgießen der Hybridisierungslösung folgte 2 mal 5 minütiges Waschen der Membran in 2 x SSC

+ 0,1% SDS bei RT, dann 2 mal 15 minütige Stringenzwäsche in 0,1 x SSC + 0,1% SDS bei 68

°C.

Zur Visualisierung der Sonde wurde die Membran für 1 min in DIG-Puffer 1 äquillibriert, dann

30 min in DIG-Puffer 2 und 30 min mit 1:10000 in Puffer 2 verdünnten Anti-DIG-AP-Konjugat

inkubiert. Es folgte 2 x Waschen für je 15 min in DIG-Puffer 1, sowie Äqullibrieren für 2 min in

DIG-Puffer 3. Die Membran wurde in einen Folienschlauch gelegt, mit 1 - 2 ml

Detektionslösung (NBT + X-Phosphat) benetzt und eingeschweißt. Die Farbreaktion erfolgte für

1 bis 16 h im Dunkeln bei RT. Anschließend wurde die Membran kurz in TE inkubiert und

fotografiert.

2.4.5 Polymerase Kettenreaktion (PCR)

Die Polymerase-Chain-Reaction (PCR) stellt ein in-vitro-Verfahren zur selektiven Anreicherung

von DNA-Fragmenten aus einem Gemisch von Nukleinsäuremolekülen dar und wurde nach

dem PCR Applications Manual von Boehringer (1995) durchgeführt. Für eine Standard-PCR

wurden pipettiert:

10 ng DNA (template)

5 µl 10 x PCR-Puffer

1,5 µl MgCl2 (50 mM)

50 pmol Primer A

50 pmol Primer B

30

0,5 µl dNTP-Mix (jeweils 20 mM)

1 U Taq-Polymerase

ad 50 µl H2O bidest.

50 µl Mineralöl (überschichten)

Die Standard-PCR wurde im Thermocycler mit folgendem Programm durchgeführt: Zuerst

erfolgte eine 5 minütige Denaturierung der DNA bei 95 °C. In dieser Phase erfolgte der „hot

start“ durch die Zugabe der Taq-Polymerase. Das Programm durchlief 25 - 35 folgender Zyklen:

Das Annealing der Primer erfolgte für 1 min, die Elongation für 1 min bei 72 °C und die

Denaturierung der DNA für 45 sec bei 95 °C. Die PCR wurde durch eine finale Elongation bei

72 °C für 5 min abgeschlossen. Die Annealing-Temperatur wurde je nach Sequenz der

eingesetzten Primer nach folgender Formel ermittelt:

Tm = 4 °C x (Fraktion G+C) + 2 °C x (Fraktion A+T)

Tanneal = Tm + 5 °C.

2.4.6 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegel

Die Elution von DNA aus einem Agarosegel wurde mit dem QuiaQuick Gel Extraktions-Kit

(Quiagen) durchgeführt. Die gewünschte DNA-Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten und

der Block gewogen. Pro 100 mg Gewicht wurden 300 µl Puffer QG zugegeben und der

Agaroseblock bei 50 °C bis zu seiner Auflösung inkubiert. Nach Zugabe von einem Volumen

Iso-Propanol wurde die Lösung per Zentrifugation über eine DNA-bindende Membran filtriert.

Im Zentrifugationsverfahren wurde die Membran mit dem Puffer PE gewaschen und die DNA

mit 50 µl Puffer EB eluiert. Je nach Bedarf wurde die DNA anschließend mit Natriumacetat-

Lösung und Ethanol präzipitiert, gewaschen und in einem geringen Volumen TE oder demin.

Wasser gelöst.

2.4.7 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Polyacrylamid-Gel

Die DNA-spots aus einem silbergefärbten 2D-PA-Gel wurden auf einem Leuchttisch mit einem

Skalpell ausgeschnitten und in 100 µl Crush-and-Soak-Puffer (Sambrook et al., 1989) 1 h lang bei

37 °C inkubiert. Die Gelstücke wurden anschließend mit einer Pipettenspitze zerkleinert und die

Suspension über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Suspension wurde bei 12000 x g zentrifugiert

und vom Überstand 1 µl zur Reamplifikation der DNA in eine PCR gegeben.

31

2.4.8 Klonierung von PCR-Fragmenten

2.4.8.1 Ligation und Transformation mit dem Vektor pZErO

Der Vektor pZErO 2.1 wurde mit dem Restriktionsenzym Eco RV geschnitten (blunt ends), die

Reaktion durch Extraktion mit PCI-Mix gestoppt und der Vektor aus der wäßrigen Phase

ausgefällt. Die Vektor-DNA wurde gewaschen und in einem geringen Volumen demin. Wasser

gelöst.

Als Insert-DNA wurden die Endprodukte der Suppression-PCR eingesetzt. Diese wurden aus

einem Agarosegel herauseluiert und in einer PCR mit den nested Primern reamplifiziert. Die

PCR-Fragmente wurden erneut aus einem Agarosegel herauspräpariert und mit dem

Restriktionsenzym Rsa 1 geschnitten, um die Adapter abzutrennen und blunt ends zu erzeugen.

Nach einer weiteren Aufreinigung über ein Agarosegel wurden die DNA-Fragmente in einem

geringen Volumen demin. Wasser gelöst und nach folgendem Pipettierschema mit dem Vektor

ligiert:

7 µl Insert DNA (ca. 500 ng)

1 µl Vektor pZErO (ca. 100 ng)

1 µl 10fach Ligationspuffer

0,1 µl T4 DNA-Ligase (1U)

Die Inkubation des Ligationsansatzes erfolgte für 2 h bei RT. Mit 2 µl jedes Ligationsansatzes

wurden je 200 µl kompetenter Zellen E. coli TOP 10 transformiert. Dazu wurden die

Transformationsansätze 30 min lang auf Eis gehalten, für 90 sec bei 42 °C hitzegeschockt und

noch einmal für 10 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 0,8 ml SOC-Medium wurden die

Transformanden 1 h lang bei 37 °C inkubiert. Je 200 µl dieser Kultur wurden auf LSLB-

Agarplatten ausgestrichen und die Platten über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Selektion der

positiven Klone erfolgte dabei mit 50 µg/ml Kanamycin und 1 mM IPTG. Zur Überprüfung der

Inserts wurde eine Plasmid Mini-Präparation angeschlossen.

2.4.8.2 Ligation und Transformation mit dem Vektor pGEM-T

Der T-overhang-Vektor pGEM-T wurde von der Firma Promega bezogen. Er kann ohne weitere

Vorbereitungen zur Ligation von A-tailing PCR-Produkten verwendet werden.

Als Insert-DNA wurden die Endprodukte der Suppression-PCR eingesetzt. Diese wurden aus

einem 2D-PA-Gel herauseluiert und in einer PCR mit den nested Primern reamplifiziert. Die

32

PCR-Fragmente wurden erneut aus einem Agarosegel herauspräpariert, in einem geringen

Volumen demin. Wasser gelöst und nach folgendem Pipettierschema mit dem Vektor ligiert:

6 µl Insert DNA (ca. 500 ng)

1 µl Vektor pGEM-T (ca. 50 ng)

1 µl 10fach Ligationspuffer

1 µl T4 DNA-Ligase (3U)

Die Inkubation des Ligationsansatzes erfolgte über Nacht bei 10 °C. Mit 2 µl jedes

Ligationsansatzes wurden je 100 µl kompetenter Zellen E. coli TOP 10 transformiert. Dazu

wurden die Transformationsansätze 30 min lang auf Eis gehalten, für 90 sec bei 42 °C

hitzegeschockt und noch einmal für 10 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 0,9 ml SOC-

Medium wurden die Transformanden 1 h lang bei 37 °C inkubiert. Je 100 µl dieser Kultur

wurden auf LSLB-Agarplatten ausgestrichen und die Platten über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die

Selektion der positiven Klone erfolgte dabei mit 100 µg/ml Ampicillin, 80 µg/ml X-Gal und 1

mM IPTG anhand eines Blau/Weiß-Screenings.

Zur Überprüfung der Inserts wurden wenige Zellen einer weißen Kolonie in 20 µl demin. Wasser

suspendiert und 10 min lang bei 98 °C inkubiert. Die Suspension wurde bei 12000 x g

zentrifugiert und 1 µl des Überstands als template in eine PCR mit den nested Primern eingesetzt.

Die Größe der Inserts wurde anschließend in einer Agarose-Gelelektrophorese ermittelt.

2.4.9 Mini-Präparation von Plasmid-DNA

Die „Boiling Mini-Prep“ wurde nach Holmes und Quigley (1981) durchgeführt. Mehrere

Flüssigkulturen (1 ml TB/Kanamycin) wurden mit je einem Klon (s. Kap. 2.4.8.1) beimpft und

über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden pelletiert, mit je 1 ml STE-Puffer gewaschen,

erneut pelletiert und in 350 µl STET-Puffer suspendiert. Zur Suspension wurden 25 µl Lysozym-

Lösung (10 mg/ml) gegeben, kurz bei RT und 40 sec lang bei 100 °C inkubiert. Nach Abkühlung

im Eisbad wurde die Suspension bei 12000 x g zentrifugiert und das Pellet mit einem

Zahnstocher entfernt. Die Plasmid-DNA wurde mit 0,1 Volumen Natriumacetat-Lösung (3 M)

und 1 Volumen Iso-Propanol präzipitiert und bei 12000 x g abzentrifugiert. Das Pellet wurde mit

70% Ethanol gewaschen und für weitere Analysen in einem geringen Volumen TE gelöst.

2.4.10 Präparation von Plasmid-DNA

33

Die Präparation größerer und hoch reiner Mengen an Plasmid-DNA zur Sequenzierung der

Inserts erfolgte mit dem Nucleobond AX Kit der Firma Macherey-Nagel. Es wurden von den

betreffenden Transformanden jeweils 5 ml Flüssigkulturen angelegt (LSLB-Medium mit 50

µg/ml Kanamycin oder 100 µg/ml Ampicillin) und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Zellen

wurden durch Zentrifugation bei 5000 x g pelletiert und 1 x mit STE-Puffer gewaschen. Das

Pellet wurde in 0,4 ml Puffer S1 suspendiert. Durch Zugabe von 0,4 ml stark alkalischem Puffer

S2 und eine 5 minütige Inkubation bei RT wurden die Zellen lysiert. Es wurden 0,4 ml Puffer S3

zugegeben und 5 min lang auf Eis inkubiert. Die Suspension wurde bei 12000 x g 20 min lang

zentrifugiert. Der Überstand wurde durch ein Milchfilter auf eine mit Puffer N2 äquilibrierte

Säule Nucleobond AX 20 gegeben und das Säulenbett 3 x mit je 1 ml Puffer N3 gewaschen.

Anschließend wurde die Plasmid-DNA mit 0,8 ml Puffer N5 eluiert und aus dem Eluat durch

Zugabe von 0,6 ml Iso-Propanol ausgefällt und abzentrifugiert (12000 x g, 20 min). Das Pellet

wurde mit 70% Ethanol gewaschen und die DNA in 100 µl demin.Wasser gelöst.

2.4.11 DNA-Sequenzierung und Sequenzanalyse

Die Sequenzierung der Inserts der aus den Klonierungen hervorgegangenen Plasmide wurde als

Auftragsarbeit an die Firma Genom Analytik GmbH (Bremen) vergeben. Die Sequenzierung

erfolgte im Cycle-Sequencing-Verfahren mit den Primern M13 for/re in der Regel nur in der

Hin-Reaktion, bei längeren Inserts in Hin- und Rück-Reaktion.

Die Analyse der Herkunft der ermittelten Sequenzen erfolgte durch eine Abfrage in der

Datenbank „Genbank“ des NCBI (http://www2.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/). Die

Übereinstimmung einer zu überprüfenden Sequenz mit einer in der Datenbank abgelegten

Sequenz und die Ermittlung der genauen Position im Herkunfts-Gen erfolgte durch Alignments

mit dem Programm BLAST (http://www2.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Bei Sequenzen von

Herkunfts-Genen, die nur Prof. Hildebrandt zugänglich gemacht wurden und in keiner

Datenbank abgelegt worden sind, erfolgte die Analyse ausschließlich durch ein Alignment.

2.5 Representational Difference Analysis (RDA)

Die RDA wurde mit dem PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit der Firma Clontech

durchgeführt, allerdings wurde statt cDNA mit Gesamt-DNA gearbeitet. Damit entfielen die

Arbeitsschritte zur cDNA-Synthese. Außerdem mußte der Arbeitsschritt der Subtraktiven

Hybridisierung gegenüber dem Clontech-Protokoll durch zusätzliche Zugaben von Driver-DNA

34

modifiziert werden, um der größeren Komplexität des Genoms gegenüber der cDNA Rechnung

zu tragen (Thiermann, 1999).

2.5.1 DNA Restriktion

Für einen RDA-Ansatz wurden jeweils 5 µg DNA jedes Stamms in einem Restriktionsansatz von

50 µl mit 15 U Rsa 1 über Nacht bei 37 °C geschnitten. Die Reaktion wurde durch Zugabe von

EDTA gestoppt, der Ansatz auf 200 µl mit TE aufgefüllt und mit einem Volumen PCI-Mix 2 mal

extrahiert. Aus dem wäßrigen Überstand wurde die DNA durch Zugabe von 0,1 Volumen

Natriumacetat-Lösung (3M) und 2,5 Volumen Ethanol ausgefällt und bei 12000 x g

abzentrifugiert. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen und in 15 µl demin. Wasser gelöst.

2.5.2 Adapter Ligation

Es wurden zur Ligation die Adapter der Firma Clontech verwendet, bzw. anhand der Sequenzen

aus dem Manual durch Hybridisierung der Oligonucleotide selbst hergestellte, gleichartige

Adapter. Die geschnittene Tester-DNA wurde mit demin. Wasser 1 + 5 verdünnt. Die Ligation

der Adapter 1 und 2R erfolgte in getrennten Ansätzen. Für einen Ligationsansatz wurden 2 µl der

verdünnten Tester-DNA, 2 µl Adapter-Lösung (10 µM), 1 µl 10fach Ligationspuffer, 400 U T4

DNA-Ligase und demin. Wasser ad 10 µl pipettiert. Je 2 µl eines Ansatzes mit dem Adapter 1

und dem Adapter 2R wurden als nicht subtrahierte Kontrolle vermischt. Alle drei

Ligationsansätze (Tester-1, Tester-2R, Kontrolle) wurden über Nacht bei 16 °C inkubiert. Die

Ligation wurde durch Zugabe von EDTA und eine 5 minütige Inkubation bei 72 °C gestoppt

und der Kontrollansatz für die Suppression-PCR (s. Kap. 2.5.4) mit demin. Wasser 1:1000

verdünnt.

2.5.3 Subtraktive Hybridisierung

Im ersten Schritt erfolgte die Subtraktion der Tester-DNA mit Driver-DNA getrennt für die

Ligationsansätze mit den Adaptern 1 und 2R. Es wurden jeweils 1,5 µl Tester-1 oder Tester-2R

Ligationsansatz vermischt mit 1,5 µl Driver-DNA (aus unverdünntem Restriktionsansatz) und 1

µl 4fach Hybridisierungspuffer. Die Ansätze wurden mit Mineralöl überschichtet, für 1,5 min auf

98 °C erhitzt und anschließend insgesamt 8 h lang bei 63 °C inkubiert. Während dieser

Inkubation wurde nach 1 h und nach weiteren 2 h in jeden Ansatz jeweils 1 µl frisch denaturierte

35

Driver-DNA (3 µl geschnittene Driver-DNA + 1 µl 4fach Hybridisierungspuffer, Inkubation 1,5

min bei 98 °C) zugegeben.

Im zweiten Hybridisierungsschritt wurden die Ansätze Tester-1 und Tester-2R unter Zugabe von

2 µl frisch denaturierter Driver-DNA (s.o.) vereint. Die Hybridisierung erfolgte bei 63 °C. Bei der

Untersuchung bakterieller Genome wurde 18 h lang hybridisiert, bei eukaryotischen Genomen

wurde die Inkubation auf bis zu 60 h ausgedehnt. Durch Zugabe von 200 µl Verdünnungs-Puffer

und eine 7 min lange Inkubation bei 63 °C wurden abschließend unter hoch stringenten

Bedingungen DNA-Doppelstränge mit (zu vielen) Basenfehlpaarungen wieder aufgebrochen.

2.5.4 Suppression-PCR

Die Suppression-PCR setzt sich aus einer ersten Amplifikation und einer anschließenden nested

PCR zusammen.

Für den ersten Amplifikationsschritt wurden pipettiert:

1 µl template (Subtraktive Hybridisierung oder Kontrolle)

2,5 µl 10 x PCR-Puffer

1,5 µl MgCl2 (50 mM)

2,0 µl Primer 1 (10 µM)

0,25 µl dNTP-Mix (jeweils 20 mM)

0,5 U Taq-Polymerase

ad 25 µl H2O bidest.

40 µl Mineralöl (überschichten)

Die erste PCR wurde im Thermocycler mit folgendem Programm durchgeführt: Zuerst erfolgte

eine 5 minütige Auffüllung der Adapter (Komplettierung je eines Strangs) bei 75 °C. In dieser

Phase erfolgte der „hot start“ durch die Zugabe der Taq-Polymerase. Anschließend erfolgte die

primäre Denaturierung für 3 min bei 95 °C. Das Programm durchlief 30 folgender Zyklen: Das

Annealing der Primer erfolgte für 45 sec bei 66 °C, die Elongation für 1,5 min bei 72 °C und die

Denaturierung der DNA für 45 sec bei 95 °C. Die PCR wurde durch eine finale Elongation bei

72 °C für 5 min abgeschlossen.

Für die nested PCR wurde das Produkt der ersten Amplifikation als template mit demin. Wasser

1:10 verdünnt eingesetzt und nach folgendem Pipettierschema verfahren:

1 µl template (aus 1. PCR, 1:10)

2,5 µl 10 x PCR-Puffer

1,5 µl MgCl2 (50 mM)

36

1,0 µl nested Primer n1 (10 µM)

1,0 µl nested Primer n2R (10 µM)

0,25 µl dNTP-Mix (jeweils 20 mM)

0,5 U Taq-Polymerase

ad 25 µl H2O bidest.

40 µl Mineralöl (überschichten)

Zuerst erfolgte eine 5 minütige Denaturierung der DNA bei 95 °C. In dieser Phase erfolgte der

„hot start“ durch die Zugabe der Taq-Polymerase. Das Programm durchlief 11 folgender

Zyklen: Das Annealing der Primer erfolgte für 45 sec bei 68 °C, die Elongation für 1,5 min bei 72

°C und die Denaturierung der DNA für 45 sec bei 95 °C. Die PCR wurde durch eine finale

Elongation bei 72 °C für 5 min abgeschlossen.

2.6 Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-PAGE)

2.6.1 Diskontinuierliche PAGE

Die Auftrennung der DNA-Fragmente in der ersten Dimension erfolgte mit einer

diskontinuierlichen PAGE nach Allen et al. (1989) mit Modifikationen nach Doktycz (1993) in

einem 6%igen PA-Gel.

Für ein Gel von 50 ml wurden 10 ml Acrylamid+Bisacrylamid-Stammlösung (29% + 1%), 7,5 ml

Gelpuffer-Stammlösung (250 mM Formiat/Tris, pH 8,0), 32,5 ml demin. Wasser, 0,35 ml 10%

Ammoniumpersulfat-Lösung (10%) und 20 µl TEMED vermischt und in eine Gießkammer

gefüllt. Die Kammer wurde aus zwei silikonisierten Glasplatten der Maße 16 x 30 cm

zusammengesetzt und die Gelstärke mit Teflonspacern auf 1,5 mm eingestellt. Die aufrecht

stehende Kammer wurde nach dem Gießen der Gellösung mit 2-Butanol versiegelt. Zur

Polymerisation wurde das Gel für 2 h bei RT stehen gelassen.

Das Gel wurde anschließend aus der Kammer herausgenommen und auf die gekühlte (15 °C)

Keramikfläche der Horizontal-Elektrophorese-Apparatur überführt. An den Enden des Gels

wurde jeweils ein Elektrodenpuffer-Reservoir (200 mM HEPES/NaOH, pH 8,0) in Form eines

12 x 1,5 x1 cm großen 2%igen Agaroseblocks placiert. Darauf wurde ein puffergetränkter

Filterpapierstreifen gelegt, um den Kontakt zu den Elektroden sicherzustellen. An der kathodalen

Seite des Gels wurden im Abstand von 1,5 cm vom Puffer-Reservoir Probenapplikator-Plättchen

(1 x 0,25 cm) aufgelegt und mit 10 bis 15 µl DNA-Probenlösung bzw. Längenmarker beladen.

Der Elektrodenhalter wurde auf die Agaroseblöcke gelegt und die elektrophoretische

37

Auftrennung bei einer konstanten Stromstärke von 20 mA durchgeführt. Nach der

Elektrophorese wurde das Gel in einer Ethidiumbromidlösung (0,5 mg/l in EDTA-Puffer 2,5

mM, pH 5,9) 10 min lang gefärbt, unter UV-Licht fotografiert und die Bahn von Interesse zur

Auftrennung in der zweiten Dimension mit einem rolling-cutter ausgeschnitten.

2.6.2 PAGE mit Bisbenzimid-PEG im Horizontalverfahren

Die Auftrennung der DNA-Fragmente erfolgte in der zweiten Dimension mit einer PAGE unter

Zusatz des Farbstoff-PEG-Esters Bisbenzimid-PEG (Handelsname HA-Yellow) in einem

8%igen PA-Gel. Der Farbstoffkopf mit dem veresterten PEG bindet an kurze, AT-reiche

Domänen der DNA, so daß sich in einer Elektrophorese DNA-Fragmente anhand ihrer

Basenzusammensetzung auftrennen lassen (Müller et al., 1981). Die Elektrophorese wurde in

einem Horizontalverfahren mit einer selbst entwickelten Apparatur durchgeführt (Käse, 1997).

2.6.2.1 Herstellung des Trenngels

Für ein Gel von 50 ml wurden 13,3 ml Acrylamid+Bisacrylamid-Stammlösung (29% + 1%), 10

ml EDTA-Pufferlösung (125 mM, pH 5,9), 26,3 ml demin. Wasser, 0,35 ml 10%

Ammoniumpersulfat-Lösung (10%) und 20 µl TEMED vermischt und in eine Gießkammer

gefüllt. Die Kammer wurde aus zwei silikonisierten Glasplatten der Maße 16 x 30 cm

zusammengesetzt und die Gelstärke mit Teflonspacern auf 1,5 mm eingestellt. Die aufrecht

stehende Kammer wurde nach dem Gießen der Gellösung mit 2-Butanol versiegelt. Zur

Polymerisation wurde das Gel für 2 h bei RT stehen gelassen. Das auspolymerisierte Gel wurde

in ca. 500 ml EDTA-Puffer (25 mM, pH 5,9) eine Stunde lang äquilibriert und anschließend in

einen Folienschlauch eingelegt. Zum Gel wurden 150 U Farbstoff HA-Yellow in 100 ml EDTA-

Puffer (25 mM, pH 5,9) gegeben, der Schlauch luftblasenfrei verschweißt und bei 55 °C in der

Dunkelheit 5 h lang inkubiert. Nach Abkühlung auf RT wurde die Farbstofflösung entfernt und

das Gel in die Elektrophorese-Kammer eingelegt.

2.6.2.2 Durchführung der 2D-PAGE im Horizontalverfahren

Das mit HA-Yellow äquilibrierte PA-Gel wurde auf dem Gelschlitten der Apparatur (Gibco BRL

Horizon TM 11/14) mit zwei Agarosestreifen (11 x 1 x 1 cm) so fixiert, daß die überhängenden

Enden in die Puffer-Reservoirs eintauchen konnten. Der Laufpuffer (EDTA 25 mM pH 5,9)

wurde so hoch eingefüllt, daß das Gel gerade nicht überspült wurde. Der Gelstreifen aus der

38

ersten Dimension der Elektrophorese wurde an der kathodalen Seite direkt auf die Geloberfläche

gelegt und mit einer Folie abgedeckt. Die verbleibende Fläche des Trenngels zwischen den

Agaroseblöcken wurde ebenfalls mit einer Folie abgedeckt. Der Laufpuffer wurde mit einer

Flußrate von 10 ml/min umgewälzt und zur elektrophoretischen Trennung eine Spannung von

2,5 V/cm (Trennstrecke = 14 cm) für 16 h angelegt.

2.6.2.3 Silberfärbung von 2D-PA-Gelen

Die Silberfärbung wurde nach Budlowe et al. (1991) in einem Glasgefäß durchgeführt. Das Gel

wurde in 10% Ethanol 6 min lang fixiert, mit demin. Wasser kurz abgespült und die DNA durch

eine 6 min lange Inkubation in 1% HNO3-Lösung oxidiert. Das Gel wurde kurz mit demin.

Wasser abgespült, für 25 min in 0,2% AgNO3-Lösung im Dunkeln inkubiert und anschließend

mit demin. Wasser 3 x gründlich gespült. Die Entwicklung erfolgte mit einer gekühlten (4 °C)

Lösung von 0,02% Formaldehyd in 0,28 M Na2CO3. Die Entwickler-Lösung wurde 2 bis 3 mal

ausgewechselt, sobald sie sich braun verfärbt hatte. Die Entwicklung wurde durch eine 6

minütige Inkubation in 10% Essigsäure gestoppt, sobald die DNA-spots gut sichtbar waren. Das

Gel wurde abschließend in demin. Wasser gründlich gespült und auf einem Leuchttisch

fotografiert.

39

3. Ergebnisse

3.1 Nachweis von Fremdgenen bei drei gentechnisch veränderten Stämmen der ArtLactobacillus sake

3.1.1 Anreicherung von DNA-Fragmenten, die nicht im Genom des Wildtyps L. sake 23Kenthalten sind

Die drei gentechnisch veränderten Stämme L. sake ATP, L. sake CLP und L. sake PTS wurden

einer Representational Difference Analysis (RDA) auf der Ebene ihrer Gesamt-DNA

unterzogen. Als Referenzstamm (Driver) wurde der Wildtyp L. sake 23K verwendet. Durch das

Subtraktionsverfahren und die angeschlossene nested PCR ließen sich bei allen drei untersuchten

Stämmen jeweils vier DNA-Fragmente anreichern. Anhand der gelelektrophoretischen

Auftrennung (s. Abb. 3.1, Bahnen A9, C2 und C3) wurden für diese Fragmente Längen zwischen

220 und 920 bp ermittelt. Es lagen somit insgesamt 12 DNA-Fragmente einer Länge zwischen

180 und 880 bp, abzüglich der Länge der PCR-Adapter zur Klonierung und Sequenzierung vor

(s. Tab. 3.1).

Tabelle 3.1: Länge der DNA-Fragmente, die durch RDA bei den gentechnisch verändertenStämmen von L. sake angereichert wurden.

GVO-STAMML. SAKE

LÄNGE DER DNA-FRAGMENTE (BP)NACH DER NESTED PCR

LÄNGE DER DNA-FRAGMENTE (BP)NACH ENTFERNUNG DER PCR-ADAPTER

ATP 220, 400, 550, 600 180, 360, 510, 560CLP 220, 400, 550, 590 180, 360, 510, 550PTS 220, 400, 550, 920 180, 360, 510, 880

Zur Sequenzierung mußten die DNA-Fragmente nach der nested PCR noch weiter aufgereinigt

werden. Zur Abtrennung des Hintergrunds an nicht spezifischen PCR-Produkten wurden die

entsprechenden Banden aus einem präparativen Agarosegel ausgestanzt, die DNA eluiert und das

Eluat in starker Verdünnung als template für eine erneute PCR mit den nested Primern

eingesetzt. Von diesen PCR-Produkten wurden die Adapter durch eine Restriktion mit dem

40

501404352

242190147

947

1200564

676517

222

831

564

501

352242

501

352242190

A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 C 1 2 3 4

Enzym Rsa 1 entfernt, um sie in den blunt-end geschnittenen Vektor pZErO einfügen zu

können. Die Abb. 3.2 zeigt die Agarosegele mit den entsprechend aufgereinigten DNA-

Fragmenten. Zur Klonierung wurde jeweils die dominierende Bande ausgeschnitten und die

DNA aus der Agarose herauseluiert.

Abbildung 3.1: Anreicherung der für die gentechnisch veränderten Stämme spezifischen DNA-Fragmente durchRDA nach Subtraktion mit DNA des Wildtyps L. sake 23K. Gelelektrophorese in 2% Agarose.Bahn A1: Längenmarker pUC/Hpa 2Bahn A2: Wasser-Kontrolle, 1. PCRBahn A3: Kontrolle L. sake ATP ohne Subtraktion, 1. PCRBahn A4: Subtraktion L. sake ATP gegen L. sake 23K, 1. PCR (geringes Probenvolumen aufgetragen)Bahn A5: Subtraktion L. sake ATP gegen L. sake 23K, 1. PCR (normales Probenvolumen aufgetragen)Bahn A6: Wasser-Kontrolle, nested PCRBahn A7: Kontrolle L. sake ATP ohne Subtraktion, nested PCRBahn A8: Subtraktion L. sake ATP gegen L. sake 23K, nested PCR (geringes Probenvolumen aufgetragen)Bahn A9: Subtraktion L. sake ATP gegen L. sake 23K, nested PCR (normales Probenvolumen aufgetragen)Bahn A10: Längenmarker λ/Hind 3 + Eco R1Bahn B1: Längenmarker pUC/Hpa 2Bahn B2: Subtraktion L. sake CLP gegen L. sake 23K, 1. PCRBahn B3: Kontrolle L. sake CLP ohne Subtraktion, 1. PCRBahn B4: Wasser-Kontrolle, 1. PCRBahn B5: Subtraktion L. sake PTS gegen L. sake 23K, 1. PCRBahn B6: Kontrolle L. sake PTS ohne Subtraktion, 1. PCRBahn B7: Wasser-Kontrolle, nested PCRBahn B8: Subtraktion L. sake CLP gegen L. sake 23K, nested PCRBahn B9: Kontrolle L. sake CLP ohne Subtraktion, nested PCRBahn B10: Wasser-Kontrolle, nested PCRBahn B11: Subtraktion L. sake PTS gegen L. sake 23K, nested PCRBahn B12: Kontrolle L. sake PTS ohne Subtraktion, nested PCRBahn B13: Wasser-Kontrolle, nested PCRBahn B14: Längenmarker Fa. ClontechBahn C1: Längenmarker λ/Hind 3 + Eco R1Bahn C2: Subtraktion L. sake CLP gegen L. sake 23K, nested PCR (präparatives Agarosegel)Bahn C3: Subtraktion L. sake PTS gegen L. sake 23K, nested PCR (präparatives Agarosegel)Bahn C4: Längenmarker pUC/Hpa 2

41

3.1.2 Klonierung und Sequenzierung der für die gentechnisch veränderten Stämmespezifischen DNA-Fragmente

Zur Klonierung wurden der Vektor pZErO mit dem Restriktionsenzym Eco RV und die PCR-

Produkte mit dem Enzym Rsa 1 blunt-end geschnitten und miteinander ligiert. Mit den so

entstandenen Plasmiden wurden kompetente Zellen des Stamms E. coli TOP 10 transformiert.

Die Selektion der positiven Transformanten erfolgte mit Kanamycin. Anhand einer Mini-

Präparation von drei bis vier Klonen je Platte wurde überprüft, ob die Plasmide der positiven

Transformanten auch ein Insert der zu erwartenden Größe enthielten. Von den so ausgewählten

Klonen wurden Plasmid-Präparationen durchgeführt.

Bahn A1: Längenmarker pUC/Hpa 2Bahn A2: Fragment ATP-180Bahn A3: Fragment CLP-180Bahn A4: Fragment ATP-360Bahn A5 Fragment CLP-360Bahn A6: Fragment ATP-510Bahn A7: Fragment CLP-510Bahn A8: Fragment ATP-560Bahn A9: Fragment ATP-560Bahn A10: Längenmarker λ/Hind 3 + Eco R1Bahn B1: Längenmarker λ/Hind 3 + Eco R1Bahn B2: Fragment PTS-880Bahn B3: Fragment CLP-550Bahn B4: Fragment PTS-510Bahn B5: Fragment PTS-360Bahn B6: Fragment PTS-180Bahn B7: Längenmarker pUC/Hpa 2

1375947

831564

564501352

242

147

501

352242

147

A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B 1 2 3 4 5 6 7 Abbildung 3.2:Reinigung undPräparation derangereicherten DNA-Fragmente nachAbtrennung der Adapterzwecks Klonierung undSequenzierung.Gelelektrophorese in 2%Agarose. ZurNomenklatur der DNA-Fragmente s. Tab. 3.1.

42

Die Inserts der aufgereinigten Plasmide wurden mit den Universal-Primern M13 sequenziert. Je

nach Länge des Inserts mußte von Fall zu Fall die Sequenz lediglich in der Hin-Reaktion oder in

einer Hin- und Rück-Reaktion ermittelt werden.

Die Sequenzen der DNA-Fragmente wurden charakterisiert, indem in der NCBI-Datenbank

Genbank nach ähnlichen Sequenzen gesucht wurde und indem sie mit den nicht in der

Datenbank abgelegten, aber unserem Labor zur Verfügung stehenden Sequenzen der zur

Transformation von L. sake 23K eingesetzten Gene atp, clp und pts verglichen wurden. Die

Ergebnisse dieser Datenbankabfragen und der Alignments sind in der Tab. 3.2 wiedergegeben.

Die drei Fragmente von 180, 360 und 510 bp, die bei allen drei Stämmen gleichermaßen durch

die Subtraktion mit der DNA des Wildtyps L. sake 23K angereichert wurden, sind auch gleichen

Ursprungs. Sie stammen aus dem Erythromycin-Resistenzgen (emr) sowie aus einem nicht weiter

charakterisierten Bereich des Vektors, der zur Transformation der Milchsäurebakterien eingesetzt

wurde. Für die Herkunftsbestimmung des Fragments von 510 bp gibt es allerdings nur einen

indirekten Beweis, da die komplette Sequenz des zur Transformation benutzten Vektors pRV

300 (Kok et al., 1984; Simon und Chopin, 1988; Leloup et al., 1997) weder publiziert, noch

unserem Labor zur Verfügung gestellt wurde. Die Abfrage in der Genbank ergab für dieses

Fragment eine Übereinstimmung von 99% mit dem Vektor pH 2515, einem shuttle-Vektor für

Transformationen von E. coli und dem Milchsäurebakterium Lactobacillus casei. Da die Vektoren

pH 2515 und pRV 300 der gleichen Familie angehören, sind große Sequenzübereinstimmungen

als Folge einer Abstammung vom selben Plasmid zumindest naheliegend.

Tabelle 3.2: Charakterisierung der durch RDA bei den gentechnisch veränderten Stämmen vonL. sake angereicherten DNA-Fragmente als Fremdgene.

DNA-FRAGMENT/E EXAKTELÄNGE (BP)

HERKUNFT LAUT DATENBANK-ABFRAGE: GEN, POSITION

ÜBEREIN-STIMMUNG

ATP-180, CLP-180, PTS-180 176 emr, 597 - 773 98%ATP-360, CLP-360, PTS-360 350 emr, 248 - 598 98%ATP-510, CLP-510, PTS-510 513 Vektor pH 2515, 986 - 1499 99%ATP-560 567 unbekannt -CLP-550 556 clp, 1 - 466 98%PTS-880 876 pts, 1 - 720 99%

Das Fragment CLP-550 setzt sich aus dem gesamten clp Gen und nicht charakterisierbaren

flankierenden Bereichen von ca. 80 bp zusammen. Das Fragment PTS-880 ist analog aus dem

kompletten pts Gen und kurzen flankierenden Bereichen unbekannter Herkunft

zusammengesetzt. Für das Fragment ATP-560 ließ sich weder durch eine Datenbankabfrage,

43

noch durch ein Alignment mit dem atp Gen die Herkunft ermitteln. Es ist daher als Artefakt der

RDA zu betrachten.

3.1.3 Anreicherung von DNA-Fragmenten bei einem gentechnisch veränderten Stammvon L. sake durch Subtraktion mit der DNA verwandter Stämme

Zur Überprüfung, ob für eine Anreicherung von Fremdgenen mit einer RDA auch die DNA

eines verwandten Stamms des eigentlichen Wildtyps geeignet ist, wurden Subtraktionen der

Tester-DNA von L. sake CLP mit Driver-DNA der Stämme L. sake DSM 20017, L. sake LTH

938, L. sake LTH 947 und L. sake LTH 948 durchgeführt (s. Abb.3.3). Wurde zur Subtraktion die

Driver-DNA jedes Stamms einzeln eingesetzt, ließ sich beim Test-Stamm L. sake CLP mit der

RDA kein DNA-Fragment anreichern. Die nested PCR produzierte lediglich eine

gelelektrophoretisch nicht differenzierbare Vielzahl von DNA-Fragmenten, wie sie

typischerweise auch im nicht-subtrahierten Kontrollansatz entstehen (wie in Abb. 3.3 A an zwei

Beispielen gezeigt wird).

Abbildung 3.3: Subtraktion des gentechnisch veränderten Stamms L. sake CLP mit DNA von verwandten Stämmendes Wildtyps. Gelbild A: Driver-DNA einzelner Stämme, Gelbild B: Driver-DNA aus der Mischung von vierStämmen. Gelelektrophorese in 2% Agarose.Bahn A1: Längenmarker λ/Hind 3 + Eco R1Bahn A2: Wasser-Kontrolle, 1. PCRBahn A3: Kontrolle L. sake CLP ohne Subtraktion, 1. PCRBahn A4: Subtraktion L. sake CLP gegen L. sake 23K, 1. PCRBahn A5: Subtraktion L. sake CLP gegen L. sake LTH 938, 1. PCRBahn A6: Subtraktion L. sake CLP gegen L. sake DSM 20017, 1. PCRBahn A7: Wasser-Kontrolle, nested PCR

1375947831

564

1375

947831

564501

352242147

501

352242190

A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

44

Bahn A8: Kontrolle L. sake CLP ohne Subtraktion, nested PCRBahn A9: Subtraktion L. sake CLP gegen L. sake 23K, nested PCRBahn A10: Subtraktion L. sake CLP gegen L. sake LTH 938, nested PCRBahn A11: Subtraktion L. sake CLP gegen L. sake DSM 20017, nested PCRBahn A12: Längenmarker pUC/Hpa 2Bahn B1: Längenmarker λ/Hind 3 + Eco R1Bahn B2: Wasser-Kontrolle, 1. PCRBahn B3: Wasser-Kontrolle, nested PCRBahn B4: Kontrolle L. sake CLP ohne Subtraktion, 1. PCRBahn B5: Kontrolle L. sake CLP ohne Subtraktion, nested PCRBahn B6: Subtraktion L. sake CLP gegen L. sake 23K, 1. PCRBahn B7: Subtraktion L. sake CLP gegen L. sake 23K, nested PCRBahn B8: Subtraktion L. sake CLP gegen L. sake pool-DNA geschnitten mit Rsa 1 + Hae 3, 1. PCRBahn B9: Subtraktion L. sake CLP gegen L. sake pool-DNA geschnitten mit Rsa 1 + Hae 3, nested PCRBahn B10: Subtraktion L. sake CLP gegen L. sake pool-DNA geschnitten mit Rsa 1, 1. PCRBahn B11: Subtraktion L. sake CLP gegen L. sake pool-DNA geschnitten mit Rsa 1, nested PCRBahn B12: Subtraktion L. sake CLP gegen L. sake pool-DNA geschnitten mit Hae 3, 1. PCRBahn B13: : Subtraktion L. sake CLP gegen L. sake pool-DNA geschnitten mit Hae 3, nested PCRBahn B14: Längenmarker pUC/Hpa 2

Eine Anreicherung einzelner Fragmente ließ sich dagegen durch die Mischung der Driver-DNA

aus allen vier zur Verfügung stehenden Verwandten des Wildtyps erzielen. Das somit erzeugte

Bandenmuster (s. Abb. 3.3, Bahn B11) differierte allerdings stark von dem des Kontrollansatzes

aus der Subtraktion von L. sake CLP mit dem Wildtyp L. sake 23K (s. Abb. 3.3, Bahn B7). Es

wurden neben den vier Fragmenten, die als Folge der gentechnischen Veränderung durch die

RDA angereichert werden, noch eine Vielzahl weiterer Fragmente im Gelbild sichtbar. Eine

Analyse der Herkunft dieser Fragmente wurde wegen des hohen Aufwands nicht durchgeführt.

Es ist aber davon auszugehen, daß sich die DNA-Fragmente durch eine zweidimensionale

Auftrennung (s. Kap. 3.2.2) so weit aufreinigen lassen würden, daß sie problemlos klonierbar und

sequenzierbar gewesen wären und damit letztlich auch der Nachweis der Fremdgene im Stamm

L. sake CLP gelungen wäre. Die Verwendung eines DNA-Pools zur Subtraktion wäre somit eine

brauchbare Alternative zum Einsatz der Wildtyp-DNA als Driver gewesen, allerdings um den

Preis eines vielfach höheren Arbeitsaufwands.

3.2 Nachweis von Fremdgenen bei zwei gentechnisch veränderten Stämmen der ArtPenicillium nalgiovense

3.2.1 Anreicherung von DNA-Fragmenten, die nicht im Genom des Wildtyps P.nalgiovense BFE 66 vorhanden sind

Mit der Gesamt-DNA der zwei gentechnisch veränderten Stämme P. nalgiovense BFE 19 und BFE

20 wurde eine RDA durchgeführt, wobei als Referenzstamm (Driver) jeweils der Wildtyp P.

45

nalgiovense BFE 66 verwendet wurde. Zum Vergleich wurde die Subtraktion bei beiden GVO-

Stämmen auch mit Driver-DNA des Stamms P. nalgiovense BFE 328, einem Verwandten des

Wildtyps, durchgeführt (s. Kap. 3.2.3). Nach der nested PCR wurde in der Agarose-

Gelelektrophorese bei allen vier Subtraktionsansätzen ein komplexes Bandenmuster sichtbar (s.

Abb. 3.4). Es wurden durch die RDA, bei der als Driver der Wildtyp-Stamm BFE 66 eingesetzt

wurde, etliche DNA-Fragmente zwischen 150 und 850 bp Länge angereichert. Das Verhältnis

zwischen der Anreicherung der (vermeintlich) spezifischen PCR-Produkte und dem

unspezifischen Hintergrund war relativ ungünstig. Die Elution einzelner Fragmente aus dem

Agarosegel und deren direkte Reamplifikation mit den nested Primern erzeugte ein zu hohes

Ausmaß an unspezifischen Nebenprodukten für eine verläßliche Klonierung und Sequenzierung.

Dies ließ sich auch durch eine geringere Stringenz bei den Hybridisierungsschritten der

Subtraktion oder durch das Einsetzen höherer Konzentrationen an Driver-DNA nicht

verändern. Zur Aufreinigung einzelner DNA-Fragmente aus dem komplexen Bandenmuster

heraus wurde daher eine zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-PAGE)

durchgeführt.

3.2.2 Isolierung, Klonierung und Sequenzierung der für die gentechnisch verändertenStämme spezifischen DNA-Fragmente

Die Aufreinigung einzelner DNA-Fragmente mit der 2D-PAGE wurde mit den PCR-

Produktgemischen aus den RDA-Ansätzen P. nalgiovense BFE 19 gegen BFE 66 und BFE 20

501

352

242

147

947831

564

1 2 3 4 5 6 7 8 Abbildung 3.4: Anreicherung der für die zweigentechnisch veränderten Stämme von P.nalgiovense spezifischen DNA-Fragmente durchRDA. Gelelektrophorese in 2% Agarose.

Bahn 1: Längenmarker λ/Hind 3 + Eco R1Bahn 2: Kontrolle P. nalgiovense BFE 19 ohneSubtraktion, nested PCRBahn 3: Kontrolle P. nalgiovense BFE 20 ohneSubtraktion, nested PCRBahn 4: Subtraktion P. nalgiovense BFE 19 gegenP. nalgiovense BFE 66, nested PCRBahn 5: Subtraktion P. nalgiovense BFE 20 gegenP. nalgiovense BFE 66, nested PCRBahn 6: Subtraktion P. nalgiovense BFE 20 gegenP. nalgiovense BFE 328, nested PCRBahn 7: Subtraktion P. nalgiovense BFE 19 gegenP. nalgiovense BFE 328, nested PCRBahn 8: Längenmarker pUC/Hpa 2

46

gegen BFE 66 (s. Abb. 3.4, Bahnen 4 und 5) durchgeführt. In der ersten Dimension erfolgte die

Elektrophorese in einem 6% PA-Gel mit einem diskontinuierlichen Tris-Formiat/Hepes-

Laufpuffer. Die Auftrennung in der zweiten Dimension erfolgte in einem 8% PA-Gel mit einem

EDTA-Laufpuffer, dem der AT-bindende Farbstoff Bisbenzimid-PEG (Handelsname HA-

Yellow) zugesetzt wurde. Die DNA im 2D-Gel wurde mit Silber gefärbt und aus dem PA-Gel

ausgestanzt und herauseluiert. Das Eluat diente dann als template zur Reamplifikation der

Fragmente mit den nested Primern. Dieses Verfahren lieferte nur bei DNA-Fragmenten, die

kürzer als 550 bp waren, nach der Reamplifikation Produkte, die in quantitativer wie qualitativer

Hinsicht zur Klonierung ausreichten. Die DNA-Fragmente > 550 bp wurden daher nicht weiter

analysiert. Die Ergebnisse der Aufreinigung sind in den Abb. 3.5 und 3.6 dargestellt.

Abbildung 3.5: Isolierung und Reamplifikation einzelner DNA-Fragmente, die für den gentechnisch verändertenStamm P. nalgiovense BFE 19 spezifisch sind. Gelbild A: 2D-PAGE (Silberfärbung), im oberen Bildteil Abbildung derersten Dimension, Gelbild B: Gelelektrophorese in 2% Agarose. Die Numerierung der Fragmente im Gelbild Aentspricht der Zuordnung in der unteren Schriftzeile bei Gelbild B sowie der Bezeichnung der Fragmente in Tab.3.3.Bahn B1: Längenmarker λ/Hind 3 + Eco R1Bahn B2: Wasser-KontrolleBahnen B3 bis B11: Reamplifikation der Fragmente BFE 19-1 bis BFE 19-9Bahn B12: Längenmarker pUC/Hpa 2

A 501 404 352 242 190 147 bpB 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

831

564 501

352242147

BFE 19-1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 2

3

4

5 6

7

8

9

47

Zur Klonierung wurden die PCR-Ansätze der Reamplifikation im Agarosegel aufgetrennt, die

jeweils dominierende Bande ausgestanzt und die DNA eluiert. Das Eluat wurde mit dem T-

overhang-Vektor pGEM ligiert. Mit den so hergestellten Plasmiden wurden kompetente Zellen

des Stamms E. coli TOP 10 transformiert. Die Selektion der positiven Transformanten erfolgte

mit Ampicillin und anhand des Blau/Weiß-Screenings. Anhand einer Mini-Präparation von drei

bis vier Klonen je Platte wurde überprüft, ob die Plasmide der positiven Transformanten auch

ein Insert der zu erwartenden Größe enthielten. Von den so ausgewählten Klonen wurden

Plasmid-Präparationen durchgeführt. Die Inserts der aufgereinigten Plasmide wurden mit den

Universal-Primern M13 sequenziert.

Abbildung 3.6: Isolierung und Reamplifikation einzelner DNA-Fragmente, die für den gentechnisch verändertenStamm P. nalgiovense BFE 20 spezifisch sind. Gelbild A: 2D-PAGE (Silberfärbung), im oberen Bildteil Abbildung derersten Dimension, Gelbild B: Gelelektrophorese in 2% Agarose. Die Numerierung der Fragmente im Gelbild Aentspricht der Zuordnung in der unteren Schriftzeile bei Gelbild B sowie der Bezeichnung der Fragmente in Tab.3.3.Bahn B1: Längenmarker λ/Hind 3 + Eco R1Bahn B2: Wasser-KontrolleBahnen B3 bis B19: Reamplifikation der Fragmente BFE 20-1 bis BFE 20-17Bahn B20: Längenmarker pUC/Hpa 2

831

564 501352242147

BFE 20-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14 16 11 13 15 17

B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14 16 18 20 11 13 15 17 19

A 501 404 352 242 190 147 bp

1 23

45

6

7

89

1011

1213

1415

1617

48

Die Sequenzen der DNA-Fragmente wurden charakterisiert, indem in der NCBI-Datenbank

Genbank nach ähnlichen Sequenzen gesucht wurde. Hierbei ist zu betonen, daß die Sequenzen

der zwei Plasmide pKW 100 und p3SR2, die zur Transformation von P. nalgiovense verwendet

wurden, nicht komplett in der Genbank abgelegt sind. Dementsprechend ergab die Abfrage bei

den neun Fragmenten, die aus der RDA von BFE 19 gegen BFE 66 hervorgingen, nur vier

„Treffer“ und fünf mal das Ergebnis „Sequenz unbekannt“ und bei den 13 Fragmenten aus der

RDA von BFE 20 gegen BFE 66 lediglich fünf „Treffer“ und acht mal „Sequenz unbekannt“.

Die Ergebnisse der Datenbankabfragen und Alignments sind in der Tab. 3.3 zusammengestellt.

Tabelle 3.3: Charakterisierung der durch RDA bei den gentechnisch veränderten Stämmen von P.nalgiovense angereicherten DNA-Fragmente als Fremdgene. Bei der Fragmentlänge besteht imVergleich zum Gelbild (s. Abb. 3.5 und 3.6) eine Differenz von 40 bp (Länge der PCR-Adapter).

DNA-FRAGMENT EXAKTELÄNGE (BP)

HERKUNFT LAUT DATENBANK-ABFRAGE:GEN, POSITION

ÜBEREIN-STIMMUNG

BFE 19-1 344 unbekannt -BFE 19-2 282 A. nidulans trpC, 2716 - 2998 98%BFE 19-3 217 + 59 Vektor pBACe 3.6, 5702 - 5919 99%BFE 19-4 265 unbekannt -BFE 19-5 202 unbekannt -BFE 19-6 179 unbekannt -BFE 19-7 161 A. nidulans amdS, 2676 - 2837 100%BFE 19-8 138 unbekannt -BFE 19-9 106 A. nidulans amdS, 1531 -1637 100%BFE 20-1 Fragment war nach 2D-PAGE nicht mehr amplifizierbar und klonierbarBFE 20-2 Fragment war nach 2D-PAGE nicht mehr amplifizierbar und klonierbarBFE 20-3 Fragment war nach 2D-PAGE nicht mehr amplifizierbar und klonierbarBFE 20-4 521 unbekannt -BFE 20-5 482 E. coli lacZ, 715 - 1197 99%BFE 20-6 431 unbekannt -BFE 20-7 327 unbekannt -BFE 20-8 330 unbekannt -BFE 20-9 316 E. coli lacZ, 1193 - 1509 99%BFE 20-10 282 A. nidulans trpC, 2716 - 2998 95%BFE 20-11 266 unbekannt -BFE 20-12 198 + 64 E. coli lacZ, 1897 - 2095 99%BFE 20-13 265 unbekannt -BFE 20-14 202 unbekannt -BFE 20-15 179 unbekannt -BFE 20-16 161 A. nidulans amdS, 2676 - 2837 100%BFE 20-17 138 unbekannt -

49

Mehrere Fragmente stammen aus dem Gen lacZ des Vektors pKW 100, wobei in einem Fall der

Abschnitt des lacZ Gens noch von einer nicht charakterisierbaren Sequenz flankiert wird.

Ebenfalls mehrere Fragmente entstammen dem Gen amdS des Vektors p3SR2. Zwei Fragmente

lassen sich auf das Gen trpC von Aspergillus nidulans zurückführen, das auch aus dem shuttle-

Vektor p3SR2 stammt. Ein Fragment von 276 bp weist über ein Teilstück von 217 bp eine

Übereinstimmung von 99% mit einem nicht näher charakterisierten Abschnitt des Vektors

pBACe 3.6 (einem Cosmid) und große Übereinstimmung mit zahlreichen anderen Plasmiden, u.a.

auch pBR 328 auf. Mit hoher Wahrscheinlichkeit stammt dieses Fragment aus einem der

Abschnitte der Vektoren p3SR2 und pKW 100, die nicht in der Datenbank abgelegt sind.

3.2.3 Anreicherung von DNA-Fragmenten bei den gentechnisch veränderten Stämmenvon P. nalgiovense durch Subtraktion mit der DNA eines verwandten Stamms

Eine RDA mit den beiden gentechnisch veränderten Stämmen von P. nalgiovense unter

Verwendung der Driver-DNA des Stamms P. nalgiovense BFE 328, einem Verwandten des

Wildtyps ergab eine vergleichbar gute bzw. schlechte Anreicherung einzelner DNA-Fragmente (s.

Abb. 3.4, Bahnen 6 und 7). Vergleichbar gut in der Hinsicht, daß die Bandenmuster nach der

nested PCR im gelelektrophoretischen Bild große Ähnlichkeit mit denen aus der RDA mit der

Driver-DNA des Wildtyps BFE 66 aufweisen. Dies ist beim Stamm BFE 20 (s. Abb. 3.4, Bahnen

5 und 6) sehr deutlich zu sehen und beim Stamm BFE 19 zumindest anhand einiger identischer

Banden (s. Abb. 3.4, Bahnen 4 und 7). Vergleichbar schlecht ist das Ergebnis hinsichtlich des

unbefriedigenden Verhältnisses zwischen der Anreicherung einzelner Fragmente gegenüber dem

Hintergrund an nicht spezifischen PCR-Produkten. Hier ist festzuhalten, daß durch die

Subtraktion mit DNA des Stamms BFE 328 bei beiden Test-Stämmen ein stärkerer Hintergrund

verbleibt, der aber für eine Aufreinigung einzelner DNA-Fragmente dank der hohen Auflösung

der 2D-PAGE kein Hindernis gewesen wäre.

Die durch die Subtraktion mit der DNA des Stamms BFE 328 angereicherten Fragmente wurden

aus Kostengründen nicht weiter aufgereinigt, kloniert und sequenziert. Es ist aber davon

auszugehen, daß dieses Verfahren zu den gleichen oder zumindest sehr ähnlichen Ergebnissen

geführt hätte, wie bei den Subtraktions-Ansätzen mit der Driver-DNA des Stamms BFE 66.

50

4. Diskussion

4.1 Ableitung eines generellen Vorgehens zum Nachweis gentechnisch veränderterStarter- und Schutzkulturen in Lebensmitteln

Mit den vorliegenden experimentellen Ergebnissen konnte anhand eines prokaryontischen und

eines eukaryontischen Modellsystems gezeigt werden, daß, ausgehend von der RDA eine

Möglichkeit besteht, gentechnisch veränderte Mikroorganismen zu identifizieren, ohne

Vorkenntnisse darüber zu haben, ob und wie die Organismen manipuliert wurden. Zur

Untersuchung eines Stamms aus einer Starterkultur ist es dabei von großem Vorteil, wenn ein

genetisch nahezu identischer Stamm als nicht gentechnisch veränderter Referenzstamm zur

Verfügung steht. Prinzipielle Voraussetzung ist aber lediglich die Verfügbarkeit eines oder besser

mehrerer verwandter Referenzstämme des zu untersuchenden Mikroorganismus.

Die RDA liefert in Abhängigkeit von der Größe des Genoms des zu untersuchenden

Organismus und in Abhängigkeit von der Paßgenauigkeit der Referenz-DNA eine Vielzahl an

DNA-Fragmenten, die mehr oder minder spezifisch für den zu untersuchenden Stamm sind. Die

2D-PAGE hat sich als leistungsfähiges Trennverfahren erwiesen, um aus dieser Vielzahl eine

überschaubare Anzahl aufgereinigter Fragmente von höherer Spezifität zu gewinnen, die

schließlich sequenziert werden können. Anhand der Sequenzen läßt sich in Abhängigkeit vom

Bestand entsprechender Datenbanken feststellen, ob es sich bei den isolierten DNA-Fragmenten

um Bruchstücke artfremder genetischer Elemente handelt, oder um andere, nicht art-, aber

stammspezifische genetische Elemente.

Das gesamte Verfahren zum Nachweis gentechnisch veränderter Mikroorganismen ist in der

Abb. 4.1 schematisiert wiedergegeben. Es stellt die Basis für einen universellen und produkt-

unspezifischen Nachweis von gentechnisch veränderten Starter- und Schutzkulturen unter den

Voraussetzungen dar, daß die zu untersuchenden Lebensmittel noch vermehrungsfähige Zellen

enthalten und daß passende Referenzstämme zur Verfügung stehen. Das Verfahren kann damit

prinzipiell zur Untersuchung aller Mikroorganismen aus Lebensmitteln eingesetzt werden, die auf

fermentativem Weg hergestellt, veredelt oder konserviert worden sind, solange diese nicht

anschließend sterilisiert wurden. Neben der Überprüfung der korrekten Kennzeichnung

51

derartiger Lebensmittel gemäß der Novel Food Verordnung erlaubt das Nachweisverfahren

außerdem eine Überprüfung der freiwilligen Kennzeichnung „Gentechnikfrei“.

Abbildung 4.1: Fließschema des neu entwickelten Verfahrens zum Nachweis gentechnisch veränderterMikroorganismen als Basis eines universellen Nachweises von gentechnisch veränderten Starter- und Schutzkulturenin Lebensmitteln.

Stamm AMöglicherweise

GVMO

Stamm BNicht gentechnischveränderte Referenz

Verfahren zum Nachweis von gentechnisch veränderten Mikroorganismen

RDA mitGesamt-

DNA

1. Subtraktion gemeinsamer DNA-Sequenzen 2. Anreicherung von DNA-Sequenzen, die für Stamm A spezifisch sind 3. Gelelektrophorese: Komplexes Muster niedermolekularer DNA-Fragmente

2D-PAGE1. PAGE: Trennung

nach Größe2. PAGE: Trennungnach AT-Gehalt

Separation der für Stamm A spezifischen DNA-Fragmente

Re-AmplifikationKlonierung

SequenzierungGenBank Analyse

1. Sequenz-Information über die Herkunft der DNA-Fragmente 2. Nachweis von Fremd-Genen bzw. Fremd-Genfragmenten 3. Nachweis der gentechnischen Veränderung bei Stamm A

52

4.2 Bewertung der Leistungsfähigkeit und Praktikabilität des vorgestelltenNachweisverfahrens

4.2.1 Reproduzierbarkeit und Aufwand

Im Rahmen einer Diplomarbeit zur Optimierung der Versuchsbedingungen für eine RDA mit

Gesamt-DNA (Thiermann, 1999) wurden für das Modellsystem L. sake zahlreiche

Subtraktionsansätze durchgeführt, wobei die Mengen an Driver-DNA und die Zahl der

Hybridisierungsschritte variiert wurden. Als Nebenergebnis dieser Experimente konnte

festgestellt werden, daß die RDA in diesem System bei allen drei untersuchten GVO-Stämmen

gut reproduzierbare Ergebnisse lieferte, also bei gleichen oder vergleichbaren Bedingungen stets

identische DNA-Fragmente subtrahiert bzw. angereichert wurden. Die Versuchsbedingungen

beeinflußten lediglich das Verhältnis der Anreicherung einzelner Fragmente gegenüber dem nicht

spezifischen Hintergrund. Für das eukaryontische Modellsystem P. nalgiovense wurden keine

vergleichbar großen Datenmengen erhoben. Die in der Abb. 3.4 gezeigten gelelektrophoretischen

Muster konnten in zwei weiteren identischen Ansätzen nach visueller Auswertung reproduziert

werden, insofern kann man die Reproduzierbarkeit der RDA als gut bewerten. Gleiches gilt für

die Methode der 2D-PAGE, die ebenfalls im Rahmen einer Diplomarbeit systematisch

untersucht wurde (Käse, 1997) und die weiteren im Verfahren eingesetzten Methoden, die als

Standard-Methoden der Molekularbiologie etabliert sind. Damit kann für das gesamte

Nachweisverfahren von einer guten Reproduzierbarkeit ausgegangen werden.

Der Aufwand des Nachweisverfahrens und die damit verbundenen Kosten sind hoch. Auch

wenn alle Möglichkeiten der Standardisierung und Effektivierung genutzt werden, würde ein

Nachweis noch ca. zwei Wochen Laborarbeit benötigen, zuzüglich der Zeit, die für die

Kultivierung der Mikroorganismen und die Suche nach geeigneten Referenzstämmen benötigt

wird. Damit wäre das Nachweisverfahren wesentlich langwieriger und teurer, als die in Kap. 1.2.3

beschriebenen alternativen universellen Nachweise von Fremdgenen auf Basis der PCR. Das

Nachweisverfahren eignet sich daher weniger gut als Screening, sondern bietet sich an zur

Verifizierung von Ergebnissen eines PCR-Screenings oder zur Kontrolle von Lebensmitteln, bei

denen ein berechtigter Verdacht auf falsche Kennzeichnung gemäß der Novel Food Verordnung

besteht.

Da das Verfahren zur Überprüfung und Bestätigung der Kennzeichnung „Gentechnikfrei“ bisher

ohne echte Alternativen ist, wäre es für diese Anwendung trotz des hohen Aufwands die

Methode der Wahl.

53

4.2.2 Zuverlässigkeit der Ergebnisse

Zur Bewertung der Zuverlässigkeit eines Nachweisverfahrens ist eine Betrachtung sinnvoll, die

nach falsch positiven und falsch negativen Ergebnissen differenziert. Generell ist festzustellen,

daß das Nachweisverfahren in beiden Modellsystemen zu falsch positiven und zu falsch

negativen Einzelergebnissen geführt hat, daß diese Einzelergebnisse aber das Gesamtergebnis der

Untersuchung nur unerheblich beeinflußten. Es konnte bei allen untersuchten Stämmen

eindeutig ein Nachweis der gentechnischen Veränderung des jeweiligen Stamms geführt werden.

Unter einem falsch positiven Teilergebnis soll hier verstanden werden, daß das Verfahren zur

Anreicherung eines DNA-Fragments führt, das sich nach der Sequenzierung nicht eindeutig als

Fremd-Genfragment bestimmen läßt. Im Fall der Untersuchungen bei L. sake kam dies lediglich

einmal vor (Fragment L. sake ATP-560), solange der Wildtyp-Stamm 23K als Referenz benutzt

wurde. Es ist eher unwahrscheinlich, daß dieses Fragment ein Spezifikum des Stamms L. sake

ATP ist, da dieser ja durch Genmanipulation aus dem Wirtsstamm 23K hervorgegangen ist und

die Genome daher bis auf die eingefügten Zusatzgene absolut identisch sein sollten. Daß es sich

um einen Teil des gentechnischen Konstrukts handelt, über das keine Sequenzdaten vorliegen, ist

auch nahezu auszuschließen, da sowohl das Gen atp, als auch der Großteil des

Transformationsvektors bekannt bzw. in einer Datenbank vorhanden sind und da kein analoges

Fragment bei den RDA-Experimenten mit den Stämmen L. sake CLP und PTS auftauchte.

Angesichts der guten Reproduzierbarkeit dieser Experimente ist nicht auszuschließen, daß es sich

um einen Sequenzabschnitt aus dem Genom von L. sake ATP handelte, der zwar im Genom von

L. sake 23K vorhanden ist, durch die RDA aber nicht wirkungsvoll subtrahiert wurde. Die

Ursache hierfür könnte in der Ausbildung von Sekundärstrukturen in Folge längerer, einander

komplementärer Sequenzabschnitte innerhalb dieses DNA-Fragments bestehen, die beim

Vorgang der Subtraktiven Hybridisierung die Anlagerung eines Moleküls der Driver-DNA

verhinderten. Wahrscheinlich beruht dieses falsch positive Signal aber auf einem methodischen

Problem. Die durch die RDA angereicherten DNA-Fragmente wurden vor der Sequenzierung

kloniert. Möglicherweise wurde hierbei ein „falsches“ DNA-Fragment, eines, das aus dem

unspezifischen Hintergrund der Suppression-PCR stammt (s. Abb. 3.2), in den Vektor pZErO

ligiert und dadurch ein „falscher“ Klon zur Sequenzierung ausgewählt. Die starke Anreicherung

spezifischer Tester-DNA-Fragmente durch die RDA gewährleistet nicht, daß nach der Reinigung

eines solchen Fragments über eine Gelelektrophorese keine unspezifischen DNA-Fragmente

mehr vorhanden sind. Eine Aufreinigung über eine 2D-PAGE verbessert das Verhältnis

spezifischer zu unspezifischer DNA-Fragmente bereits deutlich. Nach Erfahrungen in der AG

Prof. Hildebrandt kann man aber erst nach einer weiteren Aufreinigung über eine

54

Gelelektrophorese mit einem an GC-reiche DNA-Motive bindenden Farbstoff („HA-Red“)

davon ausgehen, daß sämtliche Hintergrund-Moleküle entfernt werden. Ohne dieses

(aufwendige) Reinigungs-Verfahren ist daher stets mit falsch positiven Signalen zu rechnen, wenn

auch mit einer niedrigen statistischen Wahrscheinlichkeit.

Im Fall des Modellsystems P. nalgiovense war die Anzahl falsch positiver Teilergebnisse wesentlich

höher, als bei L. sake. Hierbei ist allerdings zu bedenken, daß die Sequenzen der zwei Plasmide,

mit denen der Wirtsstamm BFE 66 transformiert wurde, in den Datenbanken nicht komplett für

die Alignments zur Verfügung standen. Es muß daher völlig offen bleiben, ob die DNA-

Fragmente, deren Herkunft in Tab. 3.3 als unbekannt gekennzeichnet ist, den fremden

genetischen Elementen, einschließlich der Transformationsvektoren, oder dem (großteils nicht

bekannten) Genom von P. nalgiovense BFE 19 bzw. BFE 20 entstammten. Sollte letzteres der Fall

gewesen sein, wäre dies wie bei L. sake durch das methodische Problem der versehentlichen

Sequenzierung eines DNA-Fragments aus dem unspezifischen Hintergrund der unzureichend

aufgereinigten Banden bzw. 2D-Spots zu erklären. Viel wahrscheinlicher ist aber, daß es sich bei

den angereicherten DNA-Fragmenten um unbekannte Abschnitte der Transformationsvektoren

handelte.

In beiden untersuchten Modellsystemen ist es mit dem durchgeführten Nachweisverfahren nicht

gelungen, die eingebrachten fremden genetischen Elemente vollständig zu identifizieren. Dies soll

hier unter dem Aspekt falsch negativer Teilergebnisse diskutiert werden. Im Modell L. sake ist es

gelungen, die Gene clp und pts beim jeweiligen Stamm zu identifizieren und einen Teil des

Vektors sowie das Gen emr bei allen drei GVO-Stämmen zu identifizieren. Nicht gelungen ist die

Identifikation des Gens atp im Stamm L. sake ATP. Dies läßt sich dadurch erklären, daß die Art

L. sake, also auch der Wirtsstamm 23 K über die Gene atp, clp und pts verfügt (Leloup et al., 1997).

Zur Transformation wurden Homologe eines anderen Milchsäurebakteriums eingesetzt. Beim

Gen atp ist der Grad an Übereinstimmung vermutlich so hoch, daß das Fremdgen atp durch das

Homologe atp Gen des Stamms 23 K subtrahiert wurde, im Fall der Gene clp und pts reichte die

Übereinstimmung zur Subtraktion nicht aus, die Fragmente konnten angereichert werden.

Mehrere mögliche Antworten gibt es auf die Frage, warum vom (ohne Insert und emr Gen) ca. 3

kb großen Vektor pRV 300 nur ein Fragment von 513 bp angereichert werden konnte.

Möglicherweise wurde der Vektor nur unvollständig in das Genom der Bakterien integriert, bzw.

im Verlauf einiger Generation wieder teilweise daraus entfernt, da auf diesen Sequenzen keinerlei

Selektionsdruck gelegen hat. Denkbar ist auch, daß aus der Restriktion mit dem Enzym Rsa 1

überwiegend Fragmente einer ungünstigen Größenordnung über 1000 bp oder unter 100 bp

hervorgegangen sind, welche durch die Suppression-PCR nur unzureichend angereichert werden

55

konnten. Leider liegt keine detaillierte Restriktionskarte des Vektors zur Überprüfung dieser

Hypothese vor.

Komplexer stellt sich die Situation im Modellsystem P. nalgiovense dar. Bei beiden untersuchten

Stämmen konnte nur ein Teil der transformierten Gene identifiziert werden, Vektorsequenzen

konnten lediglich in einem Fall und damit in einem äußerst geringen Ausmaß identifiziert werden.

Bei beiden Transformanten gelang der Nachweis des Markergens amdS und des Fremd-

Terminators trpC, beim Stamm BFE 20 außerdem der Nachweis des Markergens lacZ, beim

Stamm BFE 19 der Nachweis eines Transformationsvektors. Die zusätzlichen Markergene ampr

und argB und der Fremd-Promotor konnten nicht nachgewiesen werden. Die unbefriedigende

Ausbeute bei der Identifikation der Vektoren läßt sich damit erklären, daß die Sequenzen beider

Vektoren p3SR2 und pKW 100 nicht in Datenbanken abgelegt sind und deshalb eine

Identifikation nur anhand der hohen Übereinstimmung mit der Sequenz verwandter Vektoren,

wie im Fall des Fragments BFE 19-3, möglich war. Auch der Verlust von Sequenzen, die keinem

Selektionsdruck unterliegen, wird hier eine wichtige Rolle gespielt haben. Dieses Phänomen

dürfte für die Nicht-Nachweisbarkeit der zwei Markergene samt Promotor sogar entscheidend

gewesen sein. Laut Geisen und Leistner (1989) waren diese Gene zwar stabil genomisch

integriert, einer der Autoren bestätigte aber auch (Geisen, pers. Mitteilung 1998), daß eine

Integration über viele Generationszeiten nur durch Selektionsdruck sicherzustellen sei, was bei

der BFE durch Zugabe von Acetamid zum Nährmedium erreicht wurde, was wiederum die

Stabilität des amdS Gens erklärt. Da die Pilze in unserem Labor nur auf Vollmedien gezüchtet

wurden, ist ein Verlust einzelner Marker, auch je nach Stamm in unterschiedlichem Maße,

durchaus plausibel.

Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß die Betrachtung falsch positiver und falsch negativer

Einzelergebnisse den Schluß zuläßt, daß der Erfolg eines Nachweises von fremden genetischen

Elementen in Mikroorganismen bei diesem Verfahren wesentlich von der Stabilität der

Integration dieser Elemente auch ohne Selektionsdruck und vom Bestand der Datenbanken

abhängt, in denen nach ähnlichen Genfragmenten gesucht werden kann. Zur Bewertung der

Zuverlässigkeit sei noch einmal darauf hingewiesen, daß mit dem Verfahren in beiden

Modellsystemen weitgehend anhand der gleichen Fremd-Genfragmente der Nachweis der

gentechnischen Veränderung geführt werden konnte, obwohl unterschiedliche Stämme getestet

wurden. Im Fall von L. sake waren bei den drei GVO-Stämmen jeweils drei angereicherte DNA-

Fragmente identisch (die Fragmente von 176, 350 und 513 bp), im Fall von P. nalgiovense waren

bei den beiden GVO-Stämmen die DNA-Fragmente BFE 19-2 = BFE 20-10 sowie BFE 19-7 =

BFE 20-16. Die mit Gewißheit vorhandenen Fremdgene konnten also in jedem Fall zuverlässig

detektiert werden.

56

4.2.3 Empfindlichkeit und Spezifität

Im Rahmen dieser Arbeit wurden keine Experimente durchgeführt, mit Hilfe derer die

Sensitivität des Nachweisverfahrens exakt zu quantifizieren wäre. Angestrebt wurde eine

maximale Empfindlichkeit des Nachweises von einem single-copy Fremdgen in einem

eukaryontischen Genom. Grundsätzlich ist die Technik der RDA dazu in der Lage, wie anhand

zahlreicher Studien gezeigt wurde (Lisitsyn, 1995). Möglicherweise wurde dies auch mit dem

Modellsystem P. nalgiovense bereits erreicht, aber da keine Angaben über die Kopienzahl der

genomisch integrierten Fremdgene vorlagen, ist ein Beweis nicht möglich. Es gilt aber zu

bedenken, daß mit signifikanten Unterschieden in der Anreicherung durch die RDA erst zu

rechnen ist, wenn der Multiplikationsfaktor eines nachzuweisenden Gens deutlich > 10 ist. Bei

niedrigeren Faktoren spielt es angesichts der Amplifikation der Fremd-Genfragmente in der

Suppression-PCR keine Rolle, ob die Herkunfts-Gene vorher single-copy oder multi-copy

vorlagen.

Um zu einer sicheren Identifikation eines fremden genetischen Elements zu gelangen, muß dieses

vom verwendeten Restriktionsenzym (hier Rsa 1, alternativ jedes andere blunt end schneidende

Enzym mit einer vier bp langen Erkennungssequenz) mindestens zwei mal geschnitten werden,

damit ein Genfragment ohne flankierende Sequenzen der Wirtsstamm-DNA entsteht. Dieses

sollte außerdem noch möglichst zwischen 200 und 700 bp groß sein, da das Prinzip der

Suppression-PCR außerhalb dieser Spanne schlecht funktioniert. Vor diesem Hintergrund ist es

unwahrscheinlich, mit einem einzigen experimentellen Ansatz beim Nachweis eines einzelnen

Fremdgens Erfolg zu haben. Durch parallele Ansätze unter Einsatz verschiedener

Restriktionsenzyme können aber die Erfolgsaussichten der RDA erhöht werden (Thiermann,

1999). Außerdem ist mit dem beschriebenen Extremfall in der Praxis kaum zu rechnen, da in

gentechnisch veränderten Starter- und Schutzkulturen Fremdgene zur Erzielung eines starken

Effekts eher in mehreren Kopien und/oder in Verbindung mit einem starken, nicht regulierten

Promotor, also einem weiteren, potentiell fremden genetischen Element zu finden sein werden.

Auf das Vorhandensein leichter nachweisbarer Markergene und längerer Vektorsequenzen sollte

allerdings nicht spekuliert werden, da sich mittelfristig zumindest im Lebensmittelbereich der

Einsatz markerfreier Transformationstechniken und das nachträgliche Entfernen nicht

erwünschter Sequenzen durchsetzen wird, was im übrigen für alle GVO-Nachweisverfahren eine

große Herausforderung darstellt (Heyer, 1997; Tichy und Simon, 1997; Waiblinger et al., 1997).

Ausgehend von den hier dargestellten experimentellen Ergebnissen läßt sich folgern, daß zum

Nachweis eines gentechnisch veränderten Mikroorganismus mit diesem Verfahren zwei bis drei

fremde genetische Elemente (auch als single copy) ausreichend sind.

57

Die Frage der Sensitivität des Tests ist eng verwoben mit der Frage der Spezifität. Bei dem

vorgestellten Nachweisverfahren handelt es sich um eine Methode zur Charakterisierung

minimaler Unterschiede im Genom von nah verwandten Mikroorganismen bis zur

taxonomischen Ebene des Stamms. Es ist damit nicht spezifisch für gentechnische

Veränderungen. Anhand der experimentellen Ergebnisse wird deutlich, daß immer dann, wenn

zur Subtraktion der DNA des Test-Stamms die DNA eines (weniger) nahen Verwandten oder die

aus einem Pool verwandter Stämme eingesetzt wird, neben den DNA-Fragmenten, die von

fremden genetischen Elementen stammen auch andere stammspezifische DNA-Fragmente

angereichert werden. In anderem Zusammenhang macht man sich schließlich die RDA zur

Generierung stammspezifischer DNA-Sonden zunutze (Darrasse et al., 1994). Die Spezifität des

Nachweises ergibt sich erst nach dem Vergleich der sequenzierten DNA-Fragmente mit dem

Bestand von Datenbanken. Je mehr Sequenzinformationen dort vorliegen, desto leichter fällt eine

Charakterisierung dieser Fragmente als artfremd oder arteigen bzw. als Resultat eines

gentechnischen Eingriffs oder eines natürlichen genetischen Vorgangs, desto spezifischer und

empfindlicher wird also das Nachweisverfahren. Darüber hinaus ist es wichtig, die Menge zu

sequenzierender DNA-Fragmente durch eine gute Auswahl des nicht gentechnisch veränderten

Referenzstamms möglichst stark einzugrenzen. Dies kann nur gelingen, wenn für das

Nachweisverfahren ein schneller Zugriff auf eine möglichst große Stammsammlung besteht und

wenn leistungsfähige Verfahren zur Bestimmung der Verwandtschaftsverhältnisse eingesetzt

werden.

Der Charakter der gentechnischen Veränderung eines Mikroorganismus setzt der Sensitivität und

Spezifität des Nachweises prinzipielle Grenzen. So bestehen gentechnische Veränderungen von

Nahrungsmittelorganismen nicht immer im Hinzufügen von artfremden Strukturgenen oder

genetischen Steuerungselementen, auch wenn dieses Vorgehen zu Recht im Mittelpunkt der

Betrachtung steht. Beim gezielten Ausschalten von Genen beispielsweise durch Gen-Deletion

oder die Produktion einer anti-sense-mRNA wird i.d.R. keine artfremde DNA in das Genom

eingefügt. Bei der gentechnischen Veränderung von Nutzpflanzen und Mikroorganismen ist

ebenso ein Trend zu beobachten, die transformierten Strukturgene nicht mehr hinter virale,

sondern hinter starke, arteigene Promotoren zu placieren. Diese und alle anderen als self-cloning

zu bezeichnenden gentechnischen Veränderungen von Mikroorganismen entziehen sich dem

Nachweis auf Basis einer RDA. Der Nachweis von self-cloning ist aber ein Problem genereller

Natur, weshalb auch bereits in Betracht gezogen wurde, diese Fälle im Sinne der

Kennzeichnungsregelungen nicht als GVO zu betrachten (Heller, 1997). Angesichts des

vermutlich niedrigeren Potentials an Gefahren für Gesundheit und Umwelt, die von GVO

58

ausgehen, die mit self-cloning Verfahren gentechnisch verändert wurden, ist diese Sichtweise

wohl auch gerechtfertigt.

Aber selbst beim Nachweis eines DNA-Fragments aus einem Fremdgen kann zumindest bei

Mikroorganismen noch nicht mit 100%iger Sicherheit auf einen gentechnischen Eingriff

geschlossen werden. Durch horizontalen Gentransfer verbreiten sich z.B.

Antibiotikaresistenzgene, die in der Gentechnologie als Marker Verwendung finden,

natürlicherweise über die Artgrenzen hinweg. Bei Milchsäurebakterien vollzieht sich dieser

Vorgang auch während der fermentativen Lebensmittelproduktion (Knauf et al., 1992). Als

sicherer Nachweis einer gentechnischen Veränderung gilt daher erst der Nachweis einer

Kombination genetischer Elemente, die in der Natur nicht vorkommt (Schulze, 1997). Dies

könnte für das vorgeschlagene Verfahren heißen, daß nur als GVMO-Nachweis gilt, wenn im

Genom genetische Elemente von mindestens zwei fremden Arten oder von einer

verwandtschaftlich sehr weit entfernten Art oder in einer widernatürlichen Kombination

gefunden werden. Dies wäre eine Einschränkung zugunsten der Spezifität, aber zu Lasten der

Empfindlichkeit des Nachweisverfahrens. Die Sensitivität des Nachweises von Fremdgenen

hängt bei einem Verfahren, das auf Subtraktiver Hybridisierung beruht, entscheidend davon ab,

ob im Genom des transformierten Organismus homologe Gene mit großer Sequenz-

Übereinstimmung zu den Fremdgenen vorhanden sind oder nicht. Sind sie vorhanden, könnten

die Fremdgene subtrahiert und damit nicht detektiert werden. Diese Einschränkung der

Empfindlichkeit betrifft vor allem die übertragenen Strukturgene, weniger die

Steuerungselemente und gar nicht die Markergene. Durch die Wahl möglichst hoch stringenter

Bedingungen bei der Subtraktiven Hybridisierung läßt sich dieses Problem zwar reduzieren, aber

nicht gänzlich lösen. Es bleibt eine Möglichkeit, daß gentechnische Veränderungen auf diese

Weise „maskiert“ werden können und sich einem Nachweis entziehen.

Zusammenfassend ist festzuhalten, daß sich mit dem vorgestellten Verfahren GVMO mit recht

hoher Empfindlichkeit nachweisen lassen und daß zwar eine 100%ige Sicherheit des Nachweises

„Gentechnikfrei“ auch mit dieser Methode nicht gegeben ist, man diesem Ziel aber schon ein

großes Stück näher kommt.

4.2.4 Vergleich mit alternativen Nachweisverfahren

Die bisher publizierten Screening-Verfahren zum universellen Nachweis von Fremdgenen setzen

auf den PCR-Nachweis genetischer Elemente, die sehr häufig in gentechnisch veränderten

Pflanzen (Hemmer, 1997; Waiblinger et al., 1997; Greiner et al., 1998) oder Mikroorganismen

(MacCormick et al., 1998) vorkommen. Dieses Vorgehen hat den Vorteil eines hoch sensitiven

59

sowie schnellen und kostengünstigen Verfahrens, bringt aber auch einige Probleme mit sich. So

ist und bleibt die PCR ein Verfahren zum Nachweis eines spezifischen genetischen Elements, für

neu entwickelte genetische Elemente müßten damit ständig neue Nachweisverfahren entwickelt

werden, außerdem würden diese dem Stand der Technologie zwangsläufig hinterherhinken. Auch

ist die Generierung geeigneter Primer-Paare auf die Veröffentlichung der Sequenzen von

genetischen Elementen angewiesen, die in der Lebensmittel-Gentechnologie neu entwickelt und

eingesetzt werden, wobei die notwendige Kooperation von Forschungsinstituten und

Unternehmen aus der Lebensmittelbranche sicher nicht immer gegeben sein wird. Ein weiterer

Nachteil liegt darin begründet, daß die nachzuweisenden genetischen Elemente nicht das

Kriterium erfüllen, hoch spezifisch für eine gentechnische Veränderung zu sein. Sie kommen z.T.

häufig in der Natur vor. Die hohe Zuverlässigkeit von spezifischen PCR-Nachweisverfahren für

GVO wird u.a. dadurch erreicht, daß die Primer-Bindungsstellen beiderseits einer Schnittstelle

zweier genetischer Elemente liegen, die in dieser Kombination in der Natur nicht vorkommen.

Diese Strategie ist bei einem PCR-Screening-Verfahren nicht anwendbar, so daß es durch

Kontaminationen insbesondere bei verarbeiteten Lebensmitteln zu falsch positiven Ergebnissen

kommen könnte.

Das hier vorgestellte Verfahren zum Nachweis von GVMO ist dagegen nahezu unabhängig von

der Bekanntgabe „einschlägiger“ Sequenzen und hat nur eine sehr geringe Anfälligkeit für falsch

positive Ergebnisse. Nachteile bestehen im hohen Aufwand, dem auf gering verarbeitete

Lebensmittel beschränkten Anwendungsgebiet und einer etwas höheren Anfälligkeit für falsch

negative Ergebnisse. Interessanterweise weisen die beiden unterschiedlichen Nachweisverfahren

jeweils dort Schwächen auf, wo das andere System seine Stärken hat. Somit scheint es nicht

sinnvoll zu sein, die Verfahren als Alternativen gegenüber zu stellen. Sie sollten besser als

einander ergänzende Nachweisverfahren betrachtet werden. Diese Sicht entspricht auch eher den

Zielsetzungen des EU-Forschungsprojekts „Entwicklung von Methoden zur Identifikation von

Lebensmitteln, die mit Hilfe von Gentechnik hergestellt wurden“, wonach neben der

Weiterentwicklung von PCR-Screening-Verfahren mit Multiplex-Primern die Bereitstellung von

Verfahren auf anderer methodischer Grundlage zur Unterstützung erstgenannter

Nachweisverfahren ausdrücklich gefordert wird (Schreiber, 1997) 7.

4.3 Weiterentwicklung des Verfahrens und Ausblick

7 Dieses Projekt „DMIF-GEN“ wurde von der EU-Kommission innerhalb des SMT-Programms (Vertrag Nr.SMT4-CT96-2072) von 1996 bis 1999 gefördert und vom BgVV koordiniert. An dem Projekt waren bzw. sind 23Laboratorien aus 11 europäischen Ländern beteiligt.

60

In der Bundesrepublik beschäftigt sich bereits seit 1993 eine Arbeitsgruppe unter Leitung des

Staatlichen Lebensmitteluntersuchungsamts Braunschweig (LUA) und koordiniert vom

Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BgVV) mit der

Entwicklung und Standardisierung von Nachweisverfahren für gentechnisch modifizierte

Lebensmittel. Neue Verfahren werden in Ringversuchen evaluiert, standardisiert und in die

Sammlung von Methoden nach § 35 LMBG aufgenommen (Schulze und Schreiber, 1997). Dieser

Weg sollte auch mit dem hier vorgestellten Verfahren zum Nachweis von gentechnisch

veränderten Mikroorganismen beschritten werden. Vorher sollten allerdings noch alle

Möglichkeiten ausgeschöpft werden, das Verfahren weiterzuentwickeln.

Der Schwachpunkt des Nachweisverfahrens liegt zweifellos in der Bereitstellung geeigneter, nicht

gentechnisch veränderter Referenzstämme. Da es nicht realisierbar ist, daß sich jedes

Lebensmittel-Untersuchungsamt, das das Verfahren einsetzen möchte, eine eigene

Stammsammlung von Starter- und Schutzkulturen aufbaut, muß auf die Erstellung einer

Datenbank hingewirkt werden, in der alle verfügbaren Stämme mit den Bezugsquellen aufgelistet

sind. Anhand dieser Datenbank kann dann ein schneller Zugriff auf die Stämme erfolgen. Weiter

zu entwickeln und (zunächst im eigenen) Labor zu etablieren sind außerdem Verfahren zur

Verwandtschaftsanalyse bei Mikroorganismen. Experimente mit der Auswertung von RAPD-

Mustern (eigene, nicht publizierte Daten) und Restriktionsschnitt-Mustern (Thiermann, 1999) bei

L. sake Stämmen zeigten, daß auf diese Weise genetisch sehr ähnliche von genetisch weiter

entfernten Stämmen einer Art unterschieden werden können. Erst wenn dadurch aus der Fülle

der vorhandenen Stämme die zur Untersuchung eines potentiellen GVMO am besten geeigneten

ausgewählt werden können, wird das Nachweisverfahren schnell und zuverlässig genug sein.

Auf die, für die Zuverlässigkeit des Nachweisverfahrens bedeutsame Bereitstellung von

Sequenzdaten über gentechnische Konstrukte, Transformationsvektoren und Strukturgene der

verschiedensten Organismen wird man wenig Einfluß nehmen können. Gesetzliche Regelungen,

mit denen die Offenlegung von Firmengeheimnissen erzwungen werden könnte, sind

wünschenswert, aber leider nicht zu erwarten. Die Datenmenge in den entsprechenden

Datenbanken wächst aber dank der intensiven Forschungsarbeiten zur Sequenzierung der

Genome zahlreicher Organismen, u.a. im Rahmen des Human-Genom-Projekts ständig an,

außerdem ist es ein Ziel des bereits genannten EU-Projekts DMIF-GEN, eine eigene Datenbank

über alle in Europa gemeldeten gentechnisch veränderten Organismen und Genkonstrukte

aufzubauen (Schreiber, 1997). Dieser „Flaschenhals“ des Nachweisverfahrens wird sich daher

vermutlich nicht als limitierender Faktor erweisen.

Eine Beschleunigung des Nachweisverfahrens ließe sich durch eine Verkürzung oder gar einen

Verzicht auf die Kultivierung der Mikroorganismen erzielen. Die hier beschriebene RDA

61

benötigt von jedem Stamm 2 bis 5 µg DNA. Diese Mengen sind ohne mehrtägige Kultivierung

der Organismen nicht zu erzielen. Es wurde aber inzwischen eine Arbeitsvorschrift der RDA

beschrieben, die von lediglich 500 pg DNA ausgeht (Michiels et al., 1998). Diese geringe Menge

sollte bereits aus wenigen Bakterien-Kolonien bzw. etwas Pilz-Mycel extrahierbar sein.

Weitere Untersuchungen mit gut bekannten GVMO sollten durchgeführt werden, um die

Empfindlichkeit des Verfahrens genauer zu quantifizieren. Insbesondere sollte mit Stämmen

gearbeitet werden, die den Kriterien der Lebensmitteltauglichkeit entsprechen, keine Markergene

und möglichst nur noch ein oder zwei artfremde genetische Elemente enthalten. Nur mit

Modellorganismen, die der 2. Generation gentechnisch veränderter Lebensmittel nahekommen,

kann eine abschließende Bewertung der Leistungsfähigkeit des Nachweisverfahrens

vorgenommen werden.

62

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69

Anhang

Anhang A: DNA-Sequenzen der Gene atp, pts und clp

Sequenz atp (824 bp):

GCGATTCCACTAGTTGTTGCTCGAAGTACAGCGATTGCGGCAACTAACGGCTTATTAATTCGTAATCGCCAAGCAATTGAAGTGGCAGATCAAATTACGATGGTTTTAATGGATAAAACAGGGACATTGACGCAAGGGGCTTTTAAGGTCAATGCGGTTCAACCAACTGGCGAGATGTCAAAAACTCAATTGATGGCTTATATGGGTGCTTTGGAACGACACTCAAGTCATCCATTGGCAACTGGGATTTTAGCTTATAATGACGCTGAAAAAATTACGATGTCCCAAGCTGAAAATGTACAAACGATTCAAGGAATCGGGCTGACAGGCGCAATTGAAGGGCAAACTTATCAAATCGTTACGGCCGATTATCTACAAGAAAAGCAAATCGCATTTGATACGGCAGCCTTTGAAACTTTGGCGGCTAAAGGTAATTCCATTAGTTATCTAATTCAAGGTCAAACTGTCTTAGGGATTGGTCGCGCAAGGGGGTTCAGTTGAAACCAGAAGCACTGACGTTCATCAAGGCATTGAAAAAGCGTCATATCCAACCGGTGATGTTGACTGGGGATAATCAACAGGTTGCCGAAAAGGTGGCGCAACAATTGGbTGGTATGACAGTTCAAGCCAATTTGAAGCCAGAAGATAAGGAAGCACTTGTACAAGATTACCAAGCAAAGGGTGAAGTGGTCTTGATGGTTGGCGATGGTGTCAACGATGCCCCTAGCTTGACGCGAGCTGATATTGGGATTGCAATTGGTGCGGGCACGGATGTCGCAATTGATTCCGCAGATGTRATTTTGGTTAAGAGTAATCCGAACGAT

Sequenz pts (720 bp):

GAAGCTTATAAATCAGTTCTAGAAGGTATGGACGGCAAACCAGTTGTTGTGCGGACAATGGATATTGGTGGAGATAAGAAATTACCTTACTTACCATTACCAGAAGAAATGAATCCGTTCTTAGGCTACCGAGCAATTCGGATTAGTTTAGATCGTGATGATATTTTCAGAACACAATTGCGCGCCTTATTACGTGCTTCTAACTATGGTAAGTTACGGATCATGTTCCCAATGATCGCAACTGTTGCTGAATTCCGTCAAGCTAAAGGGATTCTCGAAGATGAAAAAGCAAAATTAATTGCTGCAGGTCAAACTGTATCTGACGATTTACAAGTTGGGATGATGGTTGAAATTCCAGCCAGCGCCGTATTGGCTAACCAATTTGCTAAAGAAGTCGATTTCTTCAGTATCGGGACGAACGACTTGATTCAATACACAATGGCTGCTGATCGGATGAACGAACGTGTTTCATACCTTTACCAACCTTATAATCCAGCAATCTTACGTCTTATTAAGAACGTCATTGACGCTTCTCATAAAGAAGGTAAGTGGACTGGTATGTGTGGGGAAGCTGCCGGAGATTCAATCATGGCACCACTCCTTGTCGGGATGGGCTTAGATGAATTCTCAATGAGTGCAACTTCTGTGTTACGAGTTCGTAGTTTGATGAAACGTTTAGATACAACTGAATTAACTGATTTAGTTGAAACAGCTGTTAAC

Sequenz clp (466 bp):

CTGCAGATTTAATCTTGGCTTCTAATTCCTTAGGATCCATCAAGGTAATCGTCAAGTTTTTCTTAGAGCCTGCTTCATCCAAAAGGTCGATAGCCTTATCAGGCAAATAACGATCTTGGATATAACGACTAGAAAGGGCCGCTGCTGCTTTAAGCGCCTCGTCCGTATAGTGAACGTGGTGATAACTTTCGTATTTATCTTGAAGCCCTTTGAGAATTAGAACGGTTTCGTCAACAGATGGTTCGTTGACCGCGACCGGTTGAAGACGACGTGCAAGGGCTGCGTCTTTTTCAATCTGACGGAATTCATTATTAGTTGTGGCGCCAACGAGTTGTAATTCGCCACGCGCAAGAGCTGGCTTCAACACGTTACCAGCATCCATGCCGCCTTTCAGACATTTGCCGGCGCCAACGATTTCGTGAATTTCATCAATAAAGAGGATAATCTGCTTATTTTGTTTGAGCTC

70

Anhang B: Medien

LSLB-Medium:10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 0,5 g NaCl ad 1 l demin. Wasser, pH mit NaOH (1 N) auf 7,0einstellen. Autoklavieren. Zur Herstellung von Agarplatten zusätzlich 15 g Agar-Agar zugeben.

MRS-Medium:10 g Trypton, 10 g Fleischextrakt, 5 g Hefeextrakt, 20 g Glucose, 5 g Natriumacetat, 2 gAmmoniumacetat, 2 g tri-Ammoniumcitrat, 2 g di-Kaliumhydrogenphosphat, 1 ml Tween 80,200 mg Magnesiumsulfat, 50 mg Mangansulfat ad 1 l demin. Wasser, pH auf 6,5 einstellen. ZurHerstellung von Agarplatten zusätzlich 15 g Agar-Agar zugeben. Autoklavieren.

MRS+-Medium:s. MRS-Medium, nur statt Glucose sind 20 g Glukonat zu verwenden. Autoklavieren.

Malzextrakt-Medium:30 g Malzextrakt, 3 g Pepton, 5 g Glucose ad 1 l demin. Wasser. Zur Herstellung von Agarplattenzusätzlich 15 g Agar-Agar zugeben. Autoklavieren.

SOC-Medium:20 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 0,5 g NaCl lösen und Zugabe von 10 ml KCl-Lösung (250 mM)ad 1 l demin. Wasser, pH mit NaOH (1 N) auf 7,0 einstellen. Autoklavieren. Vor GebrauchZugabe von 5 ml steriler MgCl2-Lösung (2 M) und 20 ml steriler Glucose-Lösung (1 M).

TB-Medium:12 g Trypton, 24 g Hefeextrakt, 4 ml Glycerin ad 900 ml demin. Wasser. Autoklavieren. VorGebrauch Zugabe von 100 ml steriler Salzlösung (KH2PO4 0,17 M + K2HPO4 0,72 M).

Anhang C: Lösungen

Crush-and-Soak-Puffer:0,5 M Ammoniumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, mit Essigsäure(konz.) pH 8,0 einstellen.

CTAB-Puffer:2% CTAB, 0,1 M Tris, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl, mit HCl (1 N) pH 8,0 einstellen.

Hybridisierungspuffer für die Subtraktive Hybridisierung, 4fach konzentriert:200 mM Hepes, 2 M NaCl, 0,8 mM EDTA, mit NaOH (1 N) pH 8,0 einstellen.

PA-Gelpuffer Formiat/Tris, Stammlösung:In 250 mM Ameisensäure so viel kristallines Tris-Base lösen, bis pH 8,0 erreicht ist.

PAGE-Elektrodenpuffer Hepes/NaOH:200 mM Hepes, mit NaOH (5 N) ad pH 8,0.

71

2D-PAGE-Laufpuffer EDTA/NaOH:25 mM EDTA, mit NaOH (1 N) ad pH 5,9.

PCI-Mix:Salzgesättigtes Phenol + Chloroform + Isoamyl-Alkohol (25 + 24 + 1 Volumenanteile).

1x SSC:0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,0.

STE-Puffer:100 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, mit HCl (1 N) pH 8,0 einstellen.

STET-Puffer:100 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 5% Triton X-100, mit HCl (1 N) pH 8,0 einstellen.

TAE-Gelelektrophorese-Puffer (Stammlösung 50fach):2 M Tris, 1 M Natriumacetat, 0,1 M EDTA, mit Essigsäure (konz.) pH 8,0 einstellen.

TE-Puffer:10 mM Tris, 1 mM EDTA, mit HCl (0,1 N) pH 7,6 bis 8,0 einstellen.

TSE-Puffer:100 mM Tris, 50 mM NaCl, 70 mM EDTA, mit HCl (1 N) pH 8,0 einstellen.

TSES-Puffer:2fach TSE-Puffer + 50% Glucose-Lösung (1 + 1 Volumenanteil).

Verdünnungspuffer für die Subtraktive Hybridisierung:20 mM Hepes, 50 mM NaCl, 0,2 mM EDTA, mit NaOH (0,1 N) pH 8,0 einstellen.

72

Anhang D, Abbildung 1.1: Schematische Darstellung der Representational Difference Analysis

mit dem Clontech PCR-Select cDNA Subtraction Kit (Clontech Laboratories Inc., 1995).

Legende: DNA-Restriktionsfragment (Doppelstrang)

Adapter 1

Adapter 2R

Primer P1

Nested Primer Pn1 und Pn2R

Einander komplementäre DNA-Stränge bzw. die komplementären Sequenzen der Adapter 1 und

2R sind durch unterschiedliche Graustufen, aber gleichartige Symbole dargestellt. Die Adapter 1

und 2R sind ca. 40 Nucleotide lang und unterscheiden sich in einer ca. 20 Nucleotide langen

Basenfolge am 3´-Ende. Die Sequenz des Primers P1 ist identisch mit dem ca. 20 bp langen

äußeren (5´-)Abschnitt beider Adapter 1 und 2R, die Sequenz des Primers Pn1 ist identisch mit

dem ca. 20 Nucleotide langen inneren (3´-)Abschnitt des Adapters 1, die Sequenz des Primers

Pn2R ist identisch mit dem ca. 20 Nucleotide langen inneren (3´-)Abschnitt des Adapters 2R.

Vorbereitung: DNA-Restriktion und Adapter-Ligation

Die Gesamt-DNA des zu untersuchenden, gentechnisch veränderten Stamms (sog. Tester) und

die Gesamt-DNA des nicht gentechnisch veränderten Referenz-Stamms (sog. Driver) wird mit

einem Restriktionsenzym vollständig geschnitten, das DNA-Fragmente einer durchschnittlichen

Länge von ca. 300 bp mit stumpfen Enden erzeugt (z.B. Rsa 1 oder Hae 3). Die fragmentierte

Tester-DNA wird auf zwei Ansätze aufgeteilt. An die 5´-Enden der Fragmente werden die

Adapter 1 und 2R ligiert. Die Adapter bestehen aus einem ca. 40 b langen Oligonucleotid (s.

Legende) und einem 15 b langen Oligonucleotid (ohne Abbildung) mit einer Sequenz, die

komplementär zum 3´-Ende des längeren Oligonucleotids ist. Das kürzere Oligonucleotid ist an

seinem 5´-Ende dephosphoryliert, so daß keine Ligation an den 3´-Enden der doppelsträngigen

DNA-Fragmente erfolgen kann, es wird durch eine Erwärmung nach erfolgter Ligationsreaktion

vom Ligationsprodukt abgespalten. Dieses Oligonucleotid dient der Formierung einer Struktur –

doppelsträngige DNA mit einem Einzelstrangbruch – die von der Ligase als Substrat erkannt

werden kann und damit der Festlegung der Ausrichtung des eigentlichen Adapter-

73

Oligonucleotids. Durch die sehr hohe Konzentration von Adapter-Molekülen und Ligase ist trotz

der ungünstigen Bedingungen (blunt-end-Ligation) eine gute Ausbeute an Fragmenten

gewährleistet, die an beiden Enden in Verlängerung des 5´-endenden Strangs einen Adapter

tragen. Die Tester-DNA ist damit durch eine PCR mit passenden Primern amplifizierbar, Driver-

DNA, die keine Adapter trägt, nicht.

1. Arbeitsschritt: Subtraktive Hybridisierung (1A und 1B)Die fragmentierte Tester-DNA mit dem Adapter 1 wird mit einem hohen Überschuß an Driver-

DNA vermischt, ebenso der Ansatz der Tester-DNA 2R. Durch eine Hitze-Denaturierung

werden die Doppelstränge in Einzelstränge getrennt. Unter hoch stringenten

Hybridisierungsbedingungen können sich anschließend in den Ansätzen 1A und 1B in

Abhängigkeit von Konzentration und Zeit wieder DNA-Doppelstränge ausbilden. Durch den

hohen Überschuß an Driver-DNA werden DNA-Einzelstränge aus der Tester-DNA vorwiegend

mit komplementären Strängen der Driver-DNA hybridisieren (Molekül c). Tester-spezifische

Einzelstränge hingegen verbleiben einzelsträngig (Molekül a) oder hybridisieren mit einem

komplementären Strang aus der Tester-DNA (Molekül b). Hybride oder DNA-Einzelstränge der

Driver-DNA sind als Moleküle d bezeichnet, sie tragen keine Adapter und können daher in der

weiteren Betrachtung vernachlässigt werden.

2. Arbeitsschritt: Vereinigung der Subtraktions-Ansätze A und BIm zweiten Hybridisierungs-Schritt werden die Ansätze 1A und 1B (unter Zugabe frisch

denaturierter Driver-DNA) vereint, ohne sie vorher zu denaturieren. Dadurch können aus

verbliebenen DNA-Einzelsträngen Doppelstränge gebildet werden. Dies betrifft auch die tester-

spezifischen Moleküle a. Hybridisieren in diesem Schritt komplementäre Einzelstränge 1Aa und

1Ba miteinander, so entstehen die Moleküle e, doppelsträngige DNA-Fragmente, die an einem

Ende den Adapter 1 und am anderen Ende den Adapter 2R tragen. Darüber hinaus verbleiben

durch die Vereinigung der Ansätze 1A und 1B die Moleküle b bis d und bei unvollständiger

Hybridisierung auch einige Moleküle a unverändert.

3. Arbeitsschritt: Ergänzung adapter-komplementärer DNA-SequenzenNach dem vollständigen Ablauf des zweiten Hybridisierungs-Schritts wird zu dem Ansatz eine

DNA-Polymerase gegeben, die am 3´-Ende der doppelsträngigen Fragmente Nucleotide anfügt,

die komplementär zur Sequenz der 5´-überstehenden Adapter sind. Dadurch entstehen

Bindungsstellen für die Primer 1 sowie Pn1 und Pn2R. Dies betrifft ausschließlich die Moleküle

b, c und e.

74

4. Arbeitsschritt: Amplifikation durch nested PCRIn der ersten PCR wird der Primer 1 verwendet. Die Moleküle a und d verfügen nicht über

Primer-Bindungsstellen, sie sind nicht amplifizierbar. Die Moleküle c haben nur an einem Ende

eine Primer-Bindungsstelle, es erfolgt daher nur eine lineare Amplifikation. Die Anzahl der

Amplifikate ist damit gegenüber der Anzahl exponentiell amplifizierter DNA-Fragmente

vernachlässigbar. Die Moleküle b haben an beiden Enden eine Primer-Bindungsstelle für den

Primer 1, ihre Amplifikation wird aber durch das Prinzip der Suppression-PCR verhindert. Die

ca. 40 Nucleotide langen Enden der einzelsträngigen Moleküle b sind einander komplementär. Es

kommt dadurch bei der PCR nicht zum Annealing der Primer, statt dessen bildet sich bevorzugt

eine Sekundärstruktur (loop bzw. pan-like structure, s. Abbildung) aus. Bei den Molekülen ereicht die kurze, ca. 20 Nucleotide ausmachende Komplementarität der Enden der Einzelstränge

nicht aus, um die PCR zu unterdrücken. Diese Moleküle weisen entsprechende Primer-

Bindungsstellen auf und können exponentiell amplifiziert werden. Bei der zweiten PCR mit den

nested Primern wird die bevorzugte Amplifikation der Moleküle e gegenüber b zusätzlich

dadurch verstärkt, daß die nested Primer an zwei Abschnitten binden, die in der erforderlichen

Kombination nur bei den Molekülen e vorhanden sind. Die Moleküle b weisen jeweils nur eine

Primer-Bindungsstelle auf und können daher bestenfalls linear amplifiziert werden.

Gesamtbetrachtung: Anreicherung tester-spezifischer DNA-Fragmente

DNA-Fragmente, die ausschließlich im Genom des Tester-Stamms vorkommen, also auch

zusätzlich vorhandene, artfremde genetische Elemente, werden durch die RDA stark

angereichert. Sie unterliegen nicht der Subtraktion durch komplementäre Driver-DNA-

Einzelstränge im ersten Hybridisierungs-Schritt, sondern durchlaufen in idealer Weise den

Prozeß als Moleküle a → e → e → exponentielle Amplifikation. Die DNA-Sequenzen, die

gleichermaßen im Genom des Tester-Stamms und des Driver-Stamms vorkommen, werden im

Regelfall nur linear amplifiziert (c → c → c). Bei den in der zweistufigen Hybridisierung

entstehenden Molekülen b läßt sich nicht bestimmen, ob sie tester-spezifisch sind, oder nicht.

Durch die Schritte b → b → Suppression-PCR ist aber sichergestellt, daß diese Fragmente nur

schwach angereichert werden können. Sowohl durch die Amplifikate der Fragmente c, als auch

durch die der Fragmente b entsteht damit bei der RDA stets ein unvermeidbarer „Hintergrund“.

Die Subtraktions- und die PCR-Bedingungen müssen in jedem Einzelfall entsprechend optimiert

werden, um eine möglichst starke Amplifikation der tester-spezifischen Sequenzen bei möglichst

geringer unspezifischer „Hintergrund-Amplifikation“ zu gewährleisten.

75

Representational Difference Analysis (Clontech)

1A 1B

2

3

4

Fragmentierte Driver-DNA (im Überschuß)

Fragmentierte Tester-DNA mit Adapter 1

Fragmentierte Tester-DNA mit Adapter 2R

a

b

c

d

a

b

c

d

a,b,c,d + e

a

b

c

d

e

b = Suppression-PCR,geringe Amplifikation

e = exponentielle Amplifikation

a,d = keine Amplifikationc = lineare Amplifikation

76

Danksagung

Ich bedanke mich bei Prof. Dr. Armin Hildebrandt für seine Unterstützung durch wertvolle

Ideen und konstruktive Kritik und insbesondere für die Schaffung von Freiräumen, ohne die

kreative wissenschaftliche Arbeit nicht stattfinden kann.

Frau Dr. Zagourec und Herrn Dr. Geisen danke ich für die freundliche Überlassung mehrerer

Mikroorganismen-Stämme.

Meinen Kollegen Matthias Foth und Mirco Thiermann gilt mein herzlicher Dank für die gute und

fruchtbare Zusammenarbeit und allen Kolleginnen und Kollegen unserer Arbeitsgruppe im UFT

danke ich für das ausgezeichnete Betriebsklima und die stete Hilfsbereitschaft bei den vielen

kleinen Problemen im Labor-Alltag.