Entwicklung neuer analytischer Methoden zur Erweiterung ... · ISO International Standard Organisation Kap. Kapitel kDa Kilo-Dalton kHz Kilohertz λ Wellenlänge min. Minute µm Mikrometer

Neue Ansätze in der Qualitätssicherung von Honig

DISSERTATION

zur Erlangung des akademischen Grades

Doctor rerum naturalium

(Dr. rer. nat.)

vorgelegt

der Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften der

Technischen Universität Dresden

von

Staatl. gepr. Lebensmittelchemiker Klaus Beckmann

Geboren am 4.10.1973 in Bielefeld

Gutachter: Prof. Dr. Karl Speer

Prof. Dr. Hans Büning-Pfaue

Dr. Cord Lüllmann

eingereicht am: 14.08.2008

Tag der Verteidigung: 04.12.2008

1 1. Einführung

1

Meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. K. Speer, danke ich für die Überlassung des

Dissertationsthemas und die Betreuung, die trotz der räumlichen Distanz

hervorragend funktionierte.

Bei Frau G. Beckh und Herrn Dr. C. Lüllmann von der Firma Quality Services

International bedanke ich mich für die Betreuung vor Ort und den Freiraum, der mir

bei der Durchführung dieser Arbeit eingeräumt wurde.

Dem gesamten Team von Quality Services International danke ich für das

ausgezeichnete Arbeitsklima und die stete Hilfsbereitschaft.

Mein ganz besonderer Dank geht an Frau Sarah Englisch, Frau Karin Tausendfreund

und Herrn Shendi Xiao für ihre wertvolle Hilfe und Unterstützung bei der praktischen

Durchführung dieser Arbeit.

1. Einführung 2

2

Für meine Familie

3 1. Einführung

3

Zusammenfassung Die Qualität von Honig ist in zahlreichen Normen geregelt, welche allerdings ständig

den aktuellen Rahmenbedingungen angepasst werden müssen. Ziel dieser Arbeit

war es, Lösungen für zwei Fragestellungen zu erarbeiten, die derzeit im Fokus der

Qualitätssicherung von Honig stehen.

Der erste Teil behandelt die Substanz Phenylacetaldehyd, welche ausgehend von

der Aminosäure Phenylalanin als natürlicher Stoff, aber auch als Rückstand nach

Einsatz als Bienenvertreibungsmittel im Honig vorliegen kann. Letzteres war der

Grund dafür, dass Stiftung Warentest im April 2004 verschiedene Honige abgewertet

hatte. In dieser Arbeit sollte geprüft werden, von welchen Faktoren der natürliche

Gehalt an Phenylacetaldehyd abhängt, um beurteilen zu können, ob die Substanz

natürlicherweise oder als Rückstand im Honig vorhanden sein kann.

Untersuchungen der Phenylalaningehalte verschiedener Honige ergaben, dass die

ermittelten Konzentrationen sortenabhängig sehr unterschiedlich waren. Zur

analytischen Bestimmung der Phenylacetaldehydgehalte wurde zunächst eine in der

Literatur beschriebene Headspace-GC/MS-Methode eingesetzt, die sich jedoch als

ungeeignet erwies, da durch die Probenvorbereitung Phenylalanin bereits in

Phenylacetaldehyd umgewandelt wurde. Mit der daraufhin entwickelten

Extraktionsmethode ließen sich die Gehalte hingegen sicher bestimmen.

Im nächsten Schritt wurden verschiedene Honige sowie Zuckersirupe, mit und ohne

Phenylalanin dotiert, bei unterschiedlichen Bedingungen gelagert. Dabei zeigte sich,

dass durch erhöhte Temperatur und UV-Licht die Gehalte an Phenylacetaldehyd

deutlich zunahmen. Auch hierbei war ein unmittelbarer Zusammenhang zwischen

den Phenylalanin- und Phenylacetaldehydgehalten zu beobachten.

Die Ergebnisse verdeutlichen, dass die Abwertungen von Stiftung Warentest nicht

zulässig waren, da weder die Phenylalaningehalte der beanstandeten Proben

bekannt waren noch die äußeren Bedingungen, denen diese Honige beim Transport

und der Lagerung ausgesetzt waren.

1. Einführung 4

4

Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Filtration von Honig. Diese ist seit

Inkrafttreten der neuen Honigverordnung von 2004 zulässig. Beimischungen

gefilterter Honige zu ungefilterten Honigen sind allerdings illegal, und es galt, eine

Methode zu entwickeln, um einen derartigen Zusatz nachzuweisen.

Vergleichende Untersuchungen von Honigen vor und nach Filtration ergaben

zunächst, dass die Enzymaktivitäten, vor allem die der Saccharase, durch einen

solchen Prozess gemindert werden. Daraufhin wurde eine Methode zur

gelchromatographischen Trennung der Honigenzyme bzw. -proteine entwickelt. In

den Chromatogrammen war zu beobachten, dass insbesondere der Peak der

Saccharase abnahm.

Es war indes noch keine eindeutige Differenzierung von gefilterten und ungefilterten

Honigen möglich. Daher wurde im folgenden Schritt eine Methode erarbeitet, mit der

die Proteine der Saccharase elektrophoretisch aufgetrennt wurden. Dabei zeigte

sich, dass von den beiden dominierenden Banden, die die Saccharase ungefilterter

Honige aufwies, nach Filtration eine Bande nahezu verschwunden war.

Mit Hilfe einer quantitativen densitometrischen Auswertung wurden dann die

Verhältnisse der Farbdichtewerte der beiden Banden berechnet. Bei ungefilterten

Honigen lag dieses Verhältnis bei ungefähr 3, während dieses nach einer Filtration

bei mindestens 30 lag. Zumischversuche gefilterter Honige zu ungefilterten Honigen

ergaben, dass mit dieser Methode ein Nachweis gefilterter Honige ab 15 % möglich

ist.

5 1. Einführung

5

Inhaltsverzeichnis

1. Einführung ....................................................................................................... 8 2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig ................... 10

2.1. Honigerzeugung ......................................................................................... 10 2.2. Inhaltsstoffe des Honigs.............................................................................. 11

2.2.1. Hauptbestandteile........................................................................... 11 2.2.2. weitere Bestandteile ....................................................................... 13 2.2.3. Enzyme .......................................................................................... 15

2.2.3.1. Diastase ................................................................................................. 16 2.2.3.2. Saccharase ............................................................................................. 16 2.2.3.3. Glucose-Oxidase ..................................................................................... 17 2.2.3.4. weitere Enzyme ....................................................................................... 18

2.3. Qualitätsuntersuchungen von Honig ........................................................... 18 2.3.1. Bestimmung der botanischen und regionalen Herkunft .................. 19 2.3.2. Parameter zum Nachweis von Verfälschungen .............................. 21 2.3.3. Untersuchung auf Wärmeschädigung ............................................ 23 2.3.4. weitere Parameter zur Prüfung der Honigqualität ........................... 25 2.3.5. Rückstandsanalytik......................................................................... 26

3. Phenylacetaldehyd – Rückstand oder natürlicher Bestandteil ................... 28

3.1. Charakterisierung von Phenylacetaldehyd .................................................. 28 3.2. Phenylacetaldehyd in Honig ....................................................................... 28 3.3. Problemstellung .......................................................................................... 30 3.4. Bienenvertreibungsmittel ............................................................................ 31

3.4.1. Phenylacetaldehyd als Bienenvertreibungsmittel ........................... 32 3.5. Einflüsse auf den Phenylacetaldehydgehalt ............................................... 33

3.5.1. Analytik der freien Aminosäuren ..................................................... 33 3.5.2. Phenylacetaldehyd-Analytik mittels Headspace-GC/MS ................ 35 3.5.3. Ergebnisse und Schlussfolgerungen .............................................. 36

3.6. Bestimmung von Phenylacetaldehyd nach Extraktion ................................ 37 3.6.1. Methodenentwicklung ..................................................................... 37 3.6.2. Methodenvalidierung ...................................................................... 38

3.7. Lagerungsversuche .................................................................................... 40 3.7.1. Lagerungsparameter ...................................................................... 41 3.7.2. Ergebnisse der Lagerungsversuche ............................................... 41 3.7.3. Schlussfolgerungen ........................................................................ 43

4. Filtration von Honig ........................................................................................ 45

4.1. Begriffsbestimmung und lebensmittelrechtliche Situation ........................... 45 4.2. Anlass für eine Honigfiltration ..................................................................... 46 4.3. Technologisches Verfahren der Filtration ................................................... 48 4.4. Problemstellung .......................................................................................... 50 4.5. Probenorganisation ..................................................................................... 51 4.6. Auswirkung einer Filtration auf unterschiedliche Honigparameter .............. 52

4.6.1. Sensorik ......................................................................................... 52 4.6.2. Elementaranalysen ......................................................................... 52 4.6.3. Leitfähigkeit, pH-Wert und Säuregrad ............................................ 53 4.6.4. Flavonoide und Phenolcarbonsäuren ............................................. 53

1. Einführung 6

6

4.6.5. Spektroskopische Untersuchungen ................................................ 54 4.6.5.1. Farbmessungen nach Pfund .................................................................... 54 4.6.5.2. IR-Absorption .......................................................................................... 54 4.6.5.3. UV-Absorption ......................................................................................... 55

4.6.6. Zuckerprofile ..................................................................................... 56 4.6.6.1. Bestimmung der Oligosaccharide ............................................................ 56

4.6.7. HMF-Gehalt .................................................................................... 60 4.6.8. Mikroskopische Untersuchung ....................................................... 62 4.6.9. Enzymaktivität der Diastase ........................................................... 63 4.6.10. Enzymaktivität der Saccharase ...................................................... 64 4.6.11. Zusammenfassung der Screeningversuche ................................... 65

4.7. Methode zum Nachweis einer Filtration ...................................................... 65 4.7.1. Bestimmung der Proteinkonzentrationen ........................................ 66 4.7.2. Gelchromatographie zur Trennung der Honigenzyme .................... 69

4.7.2.1. Identifizierung der Honigenzyme .............................................................. 71 4.7.2.2. Vergleich gefilterter und ungefilterter Honige............................................ 75 4.7.2.3. Zusammenfassung der Ergebnisse der GPC ........................................... 76

4.7.3. Elektrophorese ............................................................................... 77 4.7.3.1. Elektrophorese von Saccharasefraktionen ............................................... 79 4.7.3.2. Ergebnisse der Elektrophorese ................................................................ 81 4.7.3.3. Zumischungen von gefilterten zu ungefilterten Honigen ........................... 84 4.7.3.4. Densitometrische Auswertung ................................................................. 85 4.7.3.5. Methodenvalidierung ............................................................................... 90 4.7.3.6. Ergebnisse und Schlussfolgerungen ........................................................ 94

5. Material und Methoden ................................................................................... 98

5.1. Phenylacetaldehyd (Kapitel 3) ................................................................... 98 5.1.1. Chemikalien, Geräte und Hilfsmittel ............................................... 98 5.1.2. Probenliste ..................................................................................... 99 5.1.3. Methode: Bestimmung der freien Aminosäuren ............................. 99 5.1.4. Methode: Phenylacetaldehyd-Bestimmung mittels Headspace- .....

GC/MS ............................................................................................ 100 5.1.5. Methode: Phenylacetaldehyd-Bestimmung nach Extraktion ........... 101 5.1.6. Methodenvalidierung ...................................................................... 103 5.1.7. Durchführung der Lagerungsversuche ........................................... 104

5.2. Filtration von Honig (Kapitel 4) ................................................................... 105 5.2.1. Chemikalien, Geräte und Hilfsmittel ............................................... 105 5.2.2. Probenliste ..................................................................................... 107 5.2.3. Screening-Versuche ....................................................................... 108

5.2.3.1. Methode: Bestimmung der Oligosaccharide ............................................. 108 5.2.3.2. weitere Untersuchungen .......................................................................... 109 5.2.3.3. DIN-Methoden ......................................................................................... 110 5.2.3.4. extern durchgeführte Untersuchungen ..................................................... 110

5.2.4. Methode: Bestimmung des Proteingehaltes nach Bradford ............ 111 5.2.5. Methode: Gelchromatographie ....................................................... 112

5.2.5.1. Bestimmung der Glucose-Oxidase-Aktivität ............................................. 112 5.2.6. Methode: Elektrophoretische Untersuchung ................................... 113 5.2.7. Methodenvalidierung ...................................................................... 114

6. Literatur ............................................................................................................ 116

7 1. Einführung

7

U Umdrehungen UV ultraviolett

Abkürzungsverzeichnis Å Ångström Abb. Abbildung Abschn. Abschnitt AID absolute integrated density Anl. Anlage BSA Bovine Serum Albumin c Konzentration CCD Charge-coupled Device DAD Diodenarray-Detektor DID differential integrated density DIN Deutsche Industrie-Norm EC Enzyme Commission EG Europäische Gemeinschaft EN Europäische Norm Fa. Firma F/G Fructose-Glucose-Verhältnis GC Gaschromatographie GPC Gelpermeationschromatographie h Stunde HMF Hydroxymethylfurfural HPLC Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie ICP induktiv gekoppeltes Plasma IR infrarot ISO International Standard Organisation Kap. Kapitel kDa Kilo-Dalton kHz Kilohertz λ Wellenlänge min. Minute µm Mikrometer MS Massenspektrometrie m/z Masse pro Ladung n Probenzahl NaAc Natriumacetat nm Nanometer PAA Phenylacetaldehyd PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese ppm parts per million (entspricht mg/kg) RHmV Rückstandshöchstmengen-Verordnung RI Refraktionsindex SDS Natriumdodecylsulfat sek. Sekunde Tab. Tabelle

1. Einführung 8

8

Abb. 1.a: Honigjäger (6000 Jahre alte Höhlenmalerei bei Valencia, Spanien)

1. Einführung

Honig ist ein Lebensmittel, welches von Honigbienen (Apis mellifera) aus

Blütennektar oder Honigtau erzeugt wird.

Seit Jahrtausenden wird Honig als naturbelassenes und

hochwertiges Erzeugnis zum unmittelbaren Verzehr oder

zum Süßen von Speisen genutzt (Abb. 1.a). Der Name

stammt aus dem indogermanischen ab, wo er seiner Farbe

wegen als „der Goldfarbende“ bezeichnet wurde.

Vor allem in Deutschland besitzt dieses Lebensmittel einen

hohen Stellenwert. Die deutsche Bevölkerung verzehrt pro

Jahr ca. 100.000 t Honig, was einem Pro-Kopf-Verbrauch

von etwa 1,4 kg entspricht und damit den höchsten

Durchschnittskonsum der Welt darstellt. Die einheimischen

Imker produzieren dabei ungefähr ein Viertel der benötigten

Menge, der restliche Honig wird importiert.

Die Verbraucher stellen hohe Ansprüche an die Qualität von Honig. Diese wird im

deutschen und im europäischen Lebensmittelrecht in zahlreichen Normen geregelt,

wobei die honigspezifischen Qualitätsparameter in der deutschen Honigverordnung

festgelegt sind. Darüber hinaus legen die Abfüller und Importeure häufig zusätzliche

Spezifikationen fest, um ihre Produkte von denen der Mitbewerber abzuheben.

Die Qualitätsmerkmale unterliegen jedoch einem stetigen Wandel und müssen stetig

aktuellen Gegebenheiten, aber auch rechtlichen Anforderungen angepasst werden.

So gilt es Verfahren zum Nachweis von neu zugelassenen Substanzen, die im

Pflanzenschutz oder in der Bienenhaltung zum Einsatz kommen, zu entwickeln oder

Verfälschungen des Honigs analytisch nachzuweisen. Dahingehend müssen sowohl

Analysemethoden erarbeitet als auch Grenzwerte festgelegt werden.

Zielsetzung dieser Arbeit war es, die Qualitätssicherung von Honig aktuellen

Fragestellungen anzupassen.

Im ersten Teil wurde die Problematik des Stoffes Phenylacetaldehyd aufgegriffen.

Dieser kann als Bienenvertreibungsmittel zur Vereinfachung der Honigernte

9 1. Einführung

9

eingesetzt werden und somit als Rückstand im Honig vorliegen. Das führte dazu,

dass Stiftung Warentest im Jahr 2004 Honige aufgrund analytischer Befunde

beanstandete. Die Substanz kann jedoch auch natürlicherweise im Honig vorliegen,

so dass die Aufgabe darin bestand, den Bildungsmechanismus von

Phenylacetaldehyd genauer zu untersuchen. Anhand der zu ermittelten Daten sollte

dem Handel die Möglichkeit gegeben werden, eindeutig zu erkennen, ob

Phenylacetaldehyd als Rückstand oder als natürlicher Bestandteil im Honig

vorhanden ist.

Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Auswirkungen der Filtration von Honig gemäß

der Honigverordnung aus 2004 (LFGB) untersucht. Durch die Filtration werden dem

Honig Pollen entzogen, so dass sich die botanische und geographische Herkunft

mittels mikroskopischer Pollenanalyse nicht mehr feststellen lassen. Die Folge sind

mögliche illegale Beimischungen von billigen filtrierten Honigen zu teuren Sorten und

ein Preisverfall dieser hochwertigen Produkte. Es gab bislang noch keine

Möglichkeit, derartige Zusätze zu detektieren.

Forschungsziel war es somit, eine analytische Methode zu entwickeln, um in

Honigmischungen einen unzulässigen Zusatz von filtrierten Honigen nachweisen zu

können. Dabei wurde eine Forderung des Agrarausschusses des Bundesrates

aufgegriffen, welcher im Rahmen der Zustimmung zur neuen Honigverordnung im

Jahr 2003 darum gebeten hatte, die Forschung zu verstärken, um

Nachweismethoden für eine Verschneidung zu erarbeiten.

2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig 10

10

Abb. 2.1.a: Biene beim Sammeln von Nektar

Abb. 2.1.b: Bienen beim Verdeckeln der Waben

2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig

2.1. Honigerzeugung

Honig entsteht aus Nektar bzw. Honigtau, welcher von Bienen gesammelt und

weiterverarbeitet wird. Bei Honigtau, dem Rohstoff für den Waldhonig, handelt es

sich um die zuckerhaltigen Abscheidungsprodukte von Blattläusen.

Die Säfte werden zunächst von der Biene

aufgenommen (Abb. 2.1.a) und gelangen in die

Honigblase. Ein Teil davon wird in den Darm

abgegeben und dient den Bienen als Nahrung.

Die heimkommenden Sammlerinnen geben den

unverbrauchten Honigblaseninhalt an die

Stockbienen ab. Gleiches passiert auch

zwischen den Stockbienen, so dass die

Pflanzensäfte ständig von Honigblase zu

Honigblase wechseln. Bei diesen Vorgängen wird die Flüssigkeit mit bieneneigenen

Absonderungen angereichert, die vor allem lange Zuckerketten zerkleinern und

aufspalten. Je mehr Bienen der Rohhonig auf diese Weise auf seinem Weg zur

Einlagerung passiert, desto höher ist am Ende der Enzymgehalt des ausgereiften

Honigs.

Danach wird der Honig von den Stockbienen in Waben eingelagert. Während des

Reifungsprozesses wird der Honig eingedickt. Der Wassergehalt der Honigrohstoffe

liegt bei ca. 75 % und wird während der

Honigreifung im Bienenstock bis auf 20 %

erniedrigt. Dies geschieht üblicherweise

innerhalb weniger Tage. Erst wenn der

Wassergehalt unter 20 % gesunken ist,

werden die Waben verdeckelt (Abb. 2.1.b),

und der Honig gilt als reif. Da dies aber von

verschiedenen Faktoren abhängig ist, zum

Beispiel Klima oder Volksstärke, kann es in

11 2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig

11

Abb. 2.1.c: Honig-schleuder

seltenen Fällen vorkommen, dass Bienen auch Honig mit höherem Wassergehalt

verdeckeln.

Bei der Honigernte durch die Imker werden die

verdeckelten Waben dem Stock entnommen. Die

Gewinnung des Honigs erfolgt üblicherweise mittels

Schleudern, bei denen der Honig durch Zentrifugalkräfte

aus den Waben herausgedrückt wird (Abb. 2.1.c)

[LÜLLMANN & HORN (2006)].

Anschließend wird der Honig gesiebt, um

Verunreinigungen wie Wachspartikel, Bienenteile oder

Bestandteile der Waben zu entfernen. Die Siebe bestehen

aus einem grobmaschigen Obersieb und einem

feinmaschigen Untersieb, wobei die maximale

Maschenweite der Siebe 200 µm beträgt [LÜLLMANN &

HORN (2006)].

Je nach Zustand des Honigs können weitere Aufarbeitungsschritte folgen, wie zum

Beispiel das Klären zum Entfernen kleinster Wachsteilchen oder das Verflüssigen

kristallisierter Honige (siehe dazu Kap. 4.2.).

2.2. Inhaltsstoffe des Honigs

2.2.1. Hauptbestandteile

Wasser und Kohlenhydrate (Zucker) ergeben zusammen etwa 90 % der Masse von

Honig.

Kohlenhydrate

Kohlenhydrate stellen mit ca. 70 % den Hauptbestandteil des Honigs dar, wobei die

Monosaccharide D-Fructose (im Folgenden nur „Fructose“) (33 - 42 %) und D-

Glucose (im Folgenden nur „Glucose“) (27 - 36 %) (Abb. 2.2.1.a) den

überwiegenden Anteil ausmachen. Als weitere Einzelzucker wurde lediglich das

Vorhandensein von Galactose in Spuren beobachtet [VAL et al. (1998)].


12

Abb. 2.2.1.a: D-Glucose (links) und D-Fructose (rechts)

Fructose und Glucose entstammen direkt dem Nektar, werden aber auch durch

Hydrolyse des Disaccharids Saccharose mit Hilfe des Enzyms Saccharase gebildet.

Da letzteres im Honig unter entsprechenden Voraussetzungen aktiv bleibt, können

während der Lagerung weitere Anteile an Saccharose umgesetzt werden (siehe Kap. 2.2.3.2.).

Das Verhältnis von Fructose und Glucose (F/G) ist unter anderem von der

Blütentracht abhängig und liegt zumeist auf der Seite der Fructose. Eine Ausnahme

bilden Rapshonige, bei denen der Anteil an Glucose überwiegen kann.

Weiterhin sind im Honig unterschiedliche Disaccharide zu finden. Am häufigsten

kommen Saccharose (Rohrzucker), Maltose, Isomaltose, Turanose und Trehalose

vor. Die Konzentrationen dieser Zucker unterliegen dabei großen Schwankungen.

Beispielsweise ist der Gehalt an Saccharose bedingt durch die Tracht und den

Einspeichelungsgrad an Saccharase durch die Biene. Manche Disaccharide sind

aber auch auf enzymatische Aktivitäten von Mikroorganismen zurückzuführen [LIPP

(1994)].

Trisaccharide, wie zum Beispiel Erlose, Melezitose und Maltotriose, sowie Tetra- und

Pentasaccharide sind ebenfalls im Honig zu finden. Honigtauhonige enthalten im

Schnitt mehr höhermolekulare Zucker als Blütenhonige, was damit zu erklären ist,

dass diese Kohlenhydrate durch Enzymsysteme der Blattlaus synthetisiert werden

[LIPP (1994)].

Di-, Tri- und höhere Saccharide können im Honig bis zu 10 % vorhanden sein.

Generell kann die Verteilung bzw. Menge der Kohlenhydrate charakteristisch für

bestimmte Honigsorten sein [FÖLDHÁZI (1994), MATEO & BOSCH-REIG (1997)]

(vergleiche Kap. 2.3.1.).


13

Wasser

Der Wassergehalt in reifen Honigen liegt zwischen 16 und 20 % (vergleiche Kap. 2.1.). Eine Ausnahme bilden Heidehonige, die durchschnittlich etwas höhere Gehalte

aufweisen.

2.2.2. weitere Bestandteile

Organische Säuren

Honig enthält eine Reihe niedermolekularer organischer Säuren, die unterschiedliche

Ursprünge haben können. Dominierend ist die Gluconsäure als Produkt der Glucose-

Oxidase (siehe Kap. 2.2.3.3.). Aber auch Citronensäure, Brenztraubensäure und DL-

Milchsäure wurden in vielen Honigsorten nachgewiesen [NOZAL et al. (2003), PILZ-

GÜTHER & SPEER (2004)].

L-Äpfelsäure kann hingegen in höheren Konzentrationen ein Indikator für eine

Gärung des Honigs sein [PATSCHKY & SCHÖNE (1970)].

Das Vorhandensein hoher Gehalte von Ameisensäure oder Oxalsäure deutet auf

eine Behandlung der Bienen gegen Varoose hin [BOGDANOV et al. (2003)].

Flavonoide und Phenolcarbonsäuren

Phenolcarbonsäuren und Flavonoide sind vielfach untersuchte Stoffgruppen, die in

unterschiedlichen Mengen im Honig in Abhängigkeit von der Tracht vorhanden sind.

In verschiedenen Sortenhonigen wurden beispielsweise p-Hydroxybenzoesäure, p-

Cumarsäure, Kämpferol oder Chrysin in Konzentrationen von 0,1 bis 15 mg/kg

beobachtet [GHELDOF et al. (2002)]. Es handelt sich dabei um so genannte

sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe, die nicht nur farb- und aromagebende

Eigenschaften besitzen, ihnen werden auch antioxidative Wirkungen zugesprochen.

Aromakomponenten

Das Spektrum der Substanzen im Honig, die für die Organoleptik verantwortlich sind,

ist sehr vielfältig. Die Sensorik ist neben dem Pollenspektrum auch das wichtigste

Beurteilungskriterium zur Unterscheidung von Honigsorten (vergleiche Kap. 2.3.1.).

Kohlenwasserstoffe, Alkohole, Carbonylverbindungen und Ester stellen die

hauptsächlichen Stoffgruppen dar, die Beiträge zum Aroma liefern. Bestimmte


14

Verbindungen können sogar als Marker für einzelne Sorten herangezogen werden.

Beispiele sind 2,3-Pentandion für Eukalyptushonige oder 3-Methyl-2-butanol für

Sonnenblumenhonige [RADOVIC et al. (2001)].

Mineralstoffe und Spurenelemente

Die Zusammensetzung der mineralischen Bestandteile unterliegt starken

Schwankungen je nach Honigart und Herkunft. Kalium bildet das Hauptelement der

Asche [SOUCI et al. (1994)], wobei die Zusammensetzung von vielen Faktoren

abhängig ist. Verschiedene Arbeiten haben bereits gezeigt, dass die Profile

bestimmter Spurenelemente auf den botanischen Ursprung von Honigen hindeuten

können [DEVILLERS et al. (2002), NANDA et al. (2003)].

Aminosäuren

Unter den freien Aminosäuren, die der Honig enthält, dominiert das Prolin mit einem

Mindestgehalt von 66 % und einem durchschnittlichen Gehalt von 80 - 90 %, wobei

der größte Anteil auf Sekretzugabe durch die Bienen zurückzuführen ist. Viele

andere Aminosäuren entstammen dagegen der Tracht. Kap. 3.5.1. behandelt diese

Stoffgruppe ausführlicher, zur Bestimmung von Prolin siehe Kap. 2.3.4.

Proteine

Der Proteingehalt im Honig stammt zum überwiegenden Teil von der Biene, wird

aber auch durch die Tracht mitbestimmt. Er ist dabei von vielen Faktoren abhängig,

zum Beispiel Art der Tracht, Zustand des Bienenvolkes oder der Jahreszeit. Beim

Großteil der Proteine handelt es sich um Enzyme (siehe Kap. 2.2.3.), aber auch

kolloidale Eiweißsubstanzen kommen im Honig vor.

Der Gehalt der Proteine schwankt stark und liegt zwischen 0,01 bis 0,17 % (siehe

dazu auch Kap. 4.7.1.).

IGLESIAS et al. nahmen 2006 chromatographische Proteinuntersuchungen ohne

Berücksichtigung der Enzymaktivitäten vor, um zu zeigen, dass es möglich ist,

anhand der Eiweißprofile eine Unterscheidung zwischen Blüten- und

Honigtauhonigen zu treffen.


15

2.2.3. Enzyme

Der überwiegende Teil biochemischer Reaktionen in lebenden Organismen wird von

Enzymen gesteuert. Enzyme sind katalytisch wirkende, meist komplex aufgebaute

Proteine. Sie besitzen eine chemisch uneinheitliche Oberfläche, aus der an

verschiedenen Stellen funktionelle Gruppen herausragen. Katalytische Reaktionen

laufen dabei an dem sogenannten aktiven Zentrum, in dem das Enzym mit einem

definierten Substrat reagiert. Dies wird als „Substratspezifität“ bezeichnet. Das

Enzym, welches mit einem Substrat reagiert, bestimmt auch die Art der Reaktion,

was „Wirkungsspezifität“ genannt wird.

Nach dem Vorschlag der Enzyme Commission (EC) der IUPAC (International Union

of Pure and Applied Chemistry) werden die Enzyme nach ihrer Wirkspezifität in

sechs Gruppen eingeteilt: Oxidoreduktasen (Gruppe 1), Transferasen (2),

Hydrolasen (3), Lyasen (4), Isomerasen (5) und Ligasen (6).

Entscheidend für die Enzymaktivität sind der pH-Wert und die Temperatur. Der pH-

Wert beeinflusst die Ionisation funktioneller Gruppen der Aminosäuren und ist häufig

auch Voraussetzung dafür, dass das Substrat als Ion vorliegt, um eine Interaktion mit

dem aktiven Zentrum zu ermöglichen. Extreme pH-Werte können allerdings zu einer

Denaturierung, also einer irreversiblen Änderung der Sekundär- und Tertiärstruktur

der Enzyme führen, womit das Enzym seine katalytischen Fähigkeiten verliert.

Die Temperatur bestimmt die Geschwindigkeit enzymatischer Reaktionen. Diese

steigt mit zunehmender Temperatur, so dass die pro Zeiteinheit gebildete Menge des

Produktes erhöht wird. Ab einer bestimmten Temperatur beginnt jedoch auch hier

eine Denaturierung, so dass diese beiden Effekte (Erhöhung der

Reaktionsgeschwindigkeit und Denaturierung) den Bereich des Temperaturoptimums

bestimmen [LEISTNER & BRECKLE (1997)].

Honig enthält eine Reihe von Enzymen, die entweder von der Biene oder von der

Pflanze eingetragen werden können.


16

2.2.3.1. Diastase

Die α-Amylase des Honigs, die sogenannte Diastase, gehört zu der Enzymgruppe

der Hydrolasen und stammt aus dem Kopfdrüsensekret der Bienen. Die Diastase

wird dem Honig während der Reifung zugesetzt. Vermutlich wird dieses Enzym zum

Aufschluss der Pollennahrung herangezogen.

Das Molekulargewicht beträgt 57 kDa [BABACAN & RAND (2005)], das pH-Optimum

liegt im Bereich von 4,6 bis 5,3 und das Temperaturoptimum bei 55 °C [BABACAN &

RAND (2007)].

Diastase erweist sich als relativ wärmeunempfindlich. Die Inaktivierungstemperatur

liegt zwischen 60 und 100 °C. Ist keine Enzymaktivität nachweisbar, so ist dies ein

Indiz für einen unreifen Honig bzw. für eine Verfälschung. Zur Ermittlung der

Diastaseaktivität siehe Kap. 2.3.3.

Es wurde eine Abhängigkeit der Diastaseaktivität von der Honigsorte festgestellt

(siehe dazu Kap. 2.2.3.2.).

2.2.3.2. Saccharase

Das Vorhandensein der Saccharase im Honig wurde erstmals von NELSON &

COHN (1924) erwähnt.

Die Saccharase, auch Invertase genannt, ist eine α-Glucosidase und das Enzym,

welches für die Hydrolyse der Saccharose des Nektars während der Honigreifung

verantwortlich ist. Des Weiteren bewirkt dieses Enzym Transglucosidierungen im

Honig, die unter anderem zum Entstehen des Trisaccharids Erlose führen [WHITE &

MAHER (1953)]. Allerdings weisen auch Zuckerfütterungshonige bei Fütterung mit

Trockenzucker hohe Invertaseaktivitäten auf. Der Grund ist, dass das Angebot des

Hauptnahrungsmittels sehr groß ist und damit die Enzymproduktion der Biene

angeregt wird. Nach etwa 10 Tagen sind die Bausteine der Enzymbildung im

Bienenkörper allerdings erschöpft, so dass die Saccharaseaktivität in dem aus

diesen Zuckern hergestellten Honig wieder sinkt. Somit ist dieses Enzym weniger ein

Parameter für Verfälschung als ein Parameter für den Reifegrad eines Honigs

[BERGNER & HAHN (1972a)].

Das Temperaturoptimum der Saccharase liegt zwischen 40 und 50 °C, der optimale

pH-Bereich bei 6,0 (CHO (1994)].


17

Gegen Erhitzung ist die Invertase wesentlich empfindlicher als die Diastase. So

beträgt die Halbwertszeit der Saccharase bei 40 °C ca. 10 Tage, während die der

Diastase bei 31 Tagen liegt. Eine Erhitzung auf 60 °C führt schon nach wenigen

Stunden zum vollständigen Aktivitätsverlust. Ein besonders schonend behandelter

Honig wird daher auch eine relativ hohe Saccharasezahl aufweisen [BONHEVI et al.

(2000)]. Allerdings wird die Ausgangsaktivität ebenfalls von der Honigsorte

mitbestimmt. So besitzen beispielsweise Akazienhonige im Allgemeinen niedrige,

Honigtauhonige dagegen hohe Aktivitäten. Es wurde weiterhin eine ungefähre

Korrelation zwischen Diastase- und Saccharaseaktivitäten beobachtet [PERSANO-

ODDO et al. (1999), SERRANO et al. (2007)]. Zur Ermittlung der Saccharaseaktivität

siehe Kap. 2.3.3.

Zum Molekulargewicht (MG) der Saccharase sind in der Literatur unterschiedliche

Angaben zu finden. HUBER & MATHISON gaben 1976 einen Bereich von 51 – 82

kDa an, EDELHÄUSER & BERGNER (1987) ermittelten ein MG von 57 kDa und

CHO (1994) eines von 76 kDa.

2.2.3.3. Glucose-Oxidase

Die Glucose-Oxidase (EC-Nr. 1.1.3.4) gehört zu den Oxidoreduktasen und setzt

Glucose über das Gluconolacton zu Gluconsäure und Wasserstoffperoxid um (Abb. 2.2.3.3.a) [DUSTMANN (1971)]. Letzteres besitzt eine keimtötende Wirkung und ist

damit für antibakterielle Effekte des Honigs verantwortlich.

Das pH-Optimum dieses Enzyms liegt bei 6,1, das Temperaturoptimum bei 40 °C

[SCHEPARTZ & SUBERS (1964)]. Das Enzym ist sehr wärme- und lichtempfindlich

[DUISBERG & WARNECKE (1959)], so dass eine unsachgemäße Lagerung zu einer

Abnahme der Aktivität und somit zum Verlust der inhibinen Wirkung führen kann.

Abb. 2.2.3.3.a: Umsetzung von Glucose zur Gluconsäure durch die Glucose-Oxidase


18

2.2.3.4. weitere Enzyme

Die Katalase ist ein Enzym, welches Wasserstoffperoxid zu Wasser und Sauerstoff

zersetzt. Es kann somit die antibakterielle Wirkung der Glucose-Oxidase

abschwächen. Das Vorliegen im Honig ist trachtabhängig, da die Katalase dem

Pollen und Nektar entstammt [DUSTMANN (1971)].

Darüber hinaus wird über das Vorkommen einer sauren Phosphatase vom

Phosphormonoestertyp berichtet [GÜNTHER & BURCKHART (1967)].

LOW et al. fanden 1986 das Enzym β-Glucosidase in verschiedenen Honigen,

welches von den Bienen eingetragen wird.

Honig enthält noch weitere Enzyme. Einige davon finden in Kap. 3.2. Erwähnung.

2.3. Qualitätsuntersuchungen von Honig

In der DIN EN ISO 9000:2000-01 ist Qualität definiert als „Vermögen einer

Gesamtheit inhärenter Merkmale eines Produkts (...) zur Erfüllung von Forderungen

von Kunden und anderen interessierten Parteien“. Die Qualitätssicherung umfasst

dabei alle diejenigen geplanten und systematischen Tätigkeiten, die notwendig sind,

um ein hinreichendes Vertrauen zu schaffen, dass ein Produkt die festgelegten

Qualitätsanforderungen erfüllen wird.

In der deutschen und europäischen Lebensmittelgesetzgebung sind

Qualitätsparameter für Honig in einer Vielzahl von Rechtsnormen geregelt. Dabei ist

in erster Linie die Honigverordnung vom 16.1.2004 als vertikale Vorschrift

heranzuziehen, mit der die Richtlinie 2001/110/EG der Europäischen Union vom

20.12.2001 umgesetzt wurde. Dort sind neben der zulässigen Kennzeichnung auch

Mindest- und Höchstmengen bzw. -werte für viele Substanzgruppen verankert.

Nach Anl. 2 Abschn. I dürfen Honig keine anderen Stoffe als Honig zugefügt werden,

was bedeutet, dass beispielsweise eine Beimischung von Fremdzuckern generell

verboten ist.


19

Weiterhin dürfen auch keine honigeigenen Bestandteile entzogen werden. Eine

Ausnahme bilden gefilterte Honige. Dieser Sachverhalt wird in Kap. 4. ausführlich

behandelt.

Ferner findet man in den Leitsätzen des Deutschen Lebensmittelbuches Kennzahlen

für besondere Auslobungen von Honig, die hier in Zusammenhang mit § 3 Abs. 3

Nr. 3 der Honigverordnung zu sehen sind.

Die Rechtsnormen stellen die grundsätzlichen gesetzlichen Mindestanforderungen

an die Qualität von Honig dar. Die Inverkehrbringer von Honig legen darüber hinaus

häufig noch weitergehende Spezifikationen für ihre Produkte fest, die zusätzliche

Parameter umfassen können.

2.3.1. Bestimmung der botanischen und regionalen Herkunft

Melissopalynologie

Bei der Pollenanalyse von Honig, die als Melissopalynologie bezeichnet wird, werden

im Sediment mikroskopisch die verschiedenen Pollentypen identifiziert. Die

Auszählung der vorherrschenden Pollenarten ergeben die Haupttrachtquellen, und

das gesamte Pollenspektrum erlaubt die Aussage der geographischen Herkunft.

Der Pollenanteil im Honig entspricht jedoch in vielen Fällen nicht dem Anteil an

Nektar aus der betreffenden Pflanze. Häufige Gründe sind eine nicht einheitliche

Tracht, wenn Nektar- und Pollenangebote in den unterschiedlichen Jahreszeiten

differieren. Darüber hinaus produzieren einige Pflanzen, vielfach Neuzüchtungen,

kaum noch Pollen. Beispiele sind Sonnenblume oder Lavendel. Zu einer Irreführung

bei der Sortenbestimmung von Honigen können auch Pflanzen beitragen, die

übermäßig viele Pollen produzieren, wie zum Beispiel die Edelkastanie. Derartige

Über- und Unterrepräsentierungen müssen bekannt sein, um die Herkunft des

Honigs fehlerfrei zu bestimmen. Eine Sortendeklaration für „Edelkastanie“ bedeutet,

dass 90 % Edelkastanienpollen im entsprechenden Honig vorhanden sein müssen,

wohingegen bei einem Lavendelhonig ein Anteil von 10 bis 20 % ausreicht [TALPAY

(1985)].


20

Nach § 3 Abs. 3 der Honigverordnung dürfen Angaben zur botanischen und

regionalen Herkunft nur gemacht werden, wenn der Honig neben den

organoleptischen und physikalisch-chemischen auch die entsprechenden

mikroskopischen Merkmale aufweist.

Elektrische Leitfähigkeit

Die gemeinsam mit der Pollenanalyse durchgeführte Messung der elektrischen

Leitfähigkeit lässt Aussagen darüber zu, ob ein Blütenhonig, ein Honigtauhonig oder

eine Mischung vorliegt.

Die Bestimmung erfolgt durch Messung des elektrischen Widerstands nach

DIN 10753 und wird in mS/cm (milli-Siemens) angegeben. Von einzelnen

Ausnahmen abgesehen charakterisieren Werte unter 0,5 mS/cm Blütenhonige,

Werte über 0,8 mS/cm Honigtau- bzw. Waldhonige, Mischungen liegen zwischen

0,5 und 0,8 mS/cm.

Nach der Honigverordnung, Anl. 2 Abschn. II Nr. 4, muss die elektrische Leitfähigkeit

für Honigtau- und Kastanienhonige mindestens 0,8 mS/cm betragen, für alle anderen

Honigarten dürfen 0,8 mS/cm nicht überschritten werden.

Die elektrische Leitfähigkeit erlaubt außerdem eine indirekte Aussage über den

Mineralstoffgehalt des Honigs. Bei der Ausscheidung von Nektar gelangen weniger

Mineralstoffe aus dem Phloemsaft in den Honigrohstoff als der bei der Abscheidung

des überflüssigen Phloemsafts durch Pflanzensauger. Je höher die elektrische

Leitfähigkeit ist, desto höher ist der Mineralstoffgehalt.

Sensorik

Da Honige definierter Herkunft typische organoleptische Merkmale aufweisen, wird

parallel zur mikroskopischen Untersuchung eine Verkostung durchgeführt, um die

Befunde zu verifizieren.

Zuckerprofil

Das Zuckerprofil gibt die Menge und Art der im Honig üblicherweise vorhandenen

Zucker an.

Das F/G-Verhältnis ist abhängig von der Trachtquelle. Akazienhonig ist

beispielsweise durch hohe F/G-Werte gekennzeichnet, das Minimum für eine


21

Sortendeklaration ist ein Verhältnis von 1,40. Weiterhin bestimmt dieser Quotient

zusammen mit dem Wassergehalt im Wesentlichen das Kristallisationsverhalten

eines Honigs (vergleiche dazu Kap. 4.2.).

Die Bestimmung des Zuckerspektrums erfolgt mittels HPLC (Aminsäule und RI-

Detektion) nach der DIN 10758.

Nach der Honigverordnung, Anl. 2 Abschn. II Nr. 1, beträgt der erforderliche

Mindestgehalt an reduzierenden Zuckern (Glucose und Fructose) 60 % in

Blütenhonigen bzw. 45 % in Honigtauhonigen. Der Gehalt an Saccharose darf 5 %

nicht überschreiten. Ausnahmen bilden beispielsweise Robinien- (10 %) oder

Lavendelhonige (15 %).

Ein erhöhter Saccharosegehalt könnte ein Hinweis auf Zuckerfütterung sein, wenn er

nicht im Zusammenhang mit der Honigsorte steht. Robinienhonig kann zum Beispiel

natürlicherweise höhere Saccharosewerte aufweisen, da der Nektar überwiegend

aus diesem Zucker besteht.

2.3.2. Parameter zum Nachweis von Verfälschungen

13C-Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie

Die 13C-Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie weist den unerlaubten Zusatz von

Produkten aus C4-Pflanzen nach, wie zum Beispiel hydrolysierte Maisstärke oder

Zuckerrohrsirup.

Nach den Hauptformen des photosynthetischen Kohlenstoffmetabolismus kann man

die Landpflanzen in drei Gruppen einteilen. Die erste Gruppe ist die der C3-Pflanzen,

bei denen 3-Phosphorglycerinsäure als Primärprodukt der CO2-Fixierung entsteht. Zu

dieser Gruppe gehört die überwiegende Anzahl an Nektarquellen für die

Honigerzeugung.

Bei der zweiten Gruppe, zu denen unter anderem viele tropische Gräser gehören,

entstehen Dicarbonsäuren als erste Produkte der CO2-Fixierung. Mais und

Zuckerrohr gehören ebenfalls zu dieser Pflanzengruppe. Maisstärke ist zum Beispiel

Ausgangsprodukt für die Gewinnung von High-Fructose-Sirupen, die sich in ihrer

Zuckerzusammensetzung und hinsichtlich des F/G-Verhältnisses unwesentlich von

Honig unterscheiden und sich daher hervorragend zur Verfälschung eignen.


22

Saccharose aus Rohrzucker wird als Winterfutter und zur Fütterung von

Bienenvölkern in trachtarmen Zeiten eingesetzt, wobei über die Messung von

Saccharose nicht unbedingt ein Missbrauch nachweisbar ist.

Die dritte Pflanzengruppe, sogenannte CAM-Pflanzen (Crassulacean acid

metabolism), zu denen viele sukkulente Pflanzen gehören, wie Crassulaceae,

Euphorbiaceae, Cactaceae, spielen auf dem Weltmarkt als Trachtquellen für die

Honigerzeugung nur eine untergeordnete Rolle.

Da sich oben erwähnte Pflanzengruppen auch hinsichtlich der Fixierung des natürlich

vorkommenden, schwereren 13C-Isotops unterscheiden, kann man auf Grund des

δ13C-Wertes eine klare Unterscheidung treffen. C3-Pflanzen liegen in ihrem δ13C-

Wert bei -25 ‰, während C4-Pflanzen bei -10 bis -12 ‰ liegen.

Da die Nektarquellen des Honigs zu den C3-Pflanzen gehören, ist eine Beimischung

von Maiszucker- bzw. Zuckerrohrzuckerprodukten über das δ 13C-Verhältnis

nachweisbar. Die Werte für unverfälschten Honig liegen bei < -23,5 ‰.

Die Bestimmung wird nach der offiziellen AOAC Methode 998.12 von 1998 unter

Einbeziehung des internen Standards nach WHITE & WINTERS (1989)

durchgeführt. Hierbei ist die Differenz zwischen dem δ 13C-Wert der Proteinfraktion

des Honigs und δ13C-Wert des reinen Honigs für die Berechnung des zugesetzten

Zuckergehaltes ausschlaggebend.

Bei einer Differenz von > -1,0 geht man von einer sicheren Verfälschung aus. Diese

Differenz entspricht einer Verfälschung von ca. 7 % und stellt somit die

Nachweisgrenze dar, ab der ein analytisch abgesicherter Zusatz von Zucker bzw.

Zuckersirup festzustellen ist.

Eine Verfälschung mit Produkten aus Rübenzucker ist über diese Methode nicht

möglich, da die Zuckerrübe (Beta vulgaris) wie die Nektarquellen zu den C3-Pflanzen

gehört.


23

2.3.3. Untersuchung auf Wärmeschädigung

Hydroxymethylfurfural

5-Hydroxymethylfurfural (HMF) ist der klassische Parameter für Lager- und

Erhitzungsschäden des Honigs (Strukturformel siehe Abb. 2.3.3.a). Gleichzeitig dient

der HMF-Gehalt als Indikator für andere wärmebedingte Reaktionen des Honigs, wie

zum Beispiel Aromaverlust bzw. -veränderungen oder Bräunungsreaktionen. HMF

entsteht als Produkt der Maillard-Reaktion bei einer irreversiblen Dehydratisierung

von Zuckern, respektive der Fructose, unter Säureeinwirkung. Der Gehalt an HMF ist

bei frischem Honig praktisch null und erhöht sich mit Dauer der Lagerung und durch

Erwärmung, zum Beispiel bei der Verflüssigung der Rohware während des

Abfüllprozesses. Der Gehalt steigt exponentiell mit Höhe der einwirkenden

Temperatur und Dauer der Einwirkung an [TOSI et al. (2002)].

PICHLER et al. zeigten 1984, dass die wichtigsten im Honig vorkommenden Zucker

zu HMF abgebaut werden können, allerdings in recht unterschiedlichem Maße.

Demnach entsteht HMF beispielsweise bis zu 150-mal schneller aus Fructose als

aus Glucose.

Weiterhin beobachteten sie, dass die Bildung von HMF umso schneller vonstatten

geht, je niedriger der pH-Wert des Honigs ist.

Die Bestimmung des HMF-Gehalts wird photometrisch nach der DIN 10751 (nach

Winkler) durchgeführt. Nach der Honigverordnung, Anl. 2 Abschn. II Nr. 6, darf der

HMF-Gehalt von Speisehonig bei maximal 40 mg/kg, der von Honigen aus

tropischen Gebieten bei maximal 80 mg/kg liegen.

Nach den Leitsätzen für Honig des Deutschen Lebensmittelbuches, Abschn. II Nr. 2,

weisen Honige mit bestimmten Qualitätsmerkmalen, wie zum Beispiel „kalt

geschleudert“, eine maximale HMF-Konzentration von 20 mg/kg auf.

Abb. 2.3.3.a: Strukturformel von Hydroxymethylfurfural


24

Diastaseaktivität

Da die Diastase wärmeempfindlich ist, stellt sie einen guten Indikator dar, ob dem

Honig bei der Verarbeitung eine Schädigung zugefügt wurde.

Die Bestimmung der Diastaseaktivität erfolgt photometrisch nach Schade

(DIN 10750), wobei die Farbintensität einer Stärkelösung gemessen wird, die mit Jod

einen blaugefärbten Komplex bildet. Die Aktivität wird als dimensionslose

Diastasezahl angegeben und entspricht unter den Bedingungen des Verfahrens der

Enzymaktivität in 1 g Honig, die eine Stärkemenge von 0,01 g von einem definierten

Blauwert an in 1 h bei 40 °C zu einem vorgegebenen Endpunkt abzubauen vermag.

Die meisten Honige weisen Diastasezahlen zwischen 8 und 24 auf.

Die Honigverordnung schreibt in Anl. 2 Abschn. II Nr. 7 eine Diastasezahl von

mindestens 8 vor, bei Honigarten mit einem geringen natürlichen Enzymgehalt und

HMF-Werten unter 15 mg/kg mindestens 3.

Saccharaseaktivität

Die Saccharase ist deutlich wärmeempfindlicher als die Diastase. Für eine

Auslobung des Honigs mit den Begriffen „kaltgeschleudert“ oder „wabenecht“ soll die

Saccharasezahl nach Hadorn entsprechend den Leitsätzen des Deutschen

Lebensmittelbuches, Abschn. II Nr. 2, mindestens 7 betragen.

Die Saccharase-Bestimmung wird photometrisch nach Siegenthaler (DIN 10759-1)

durchgeführt. Dabei wird das Substrat p-NPG (p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranosid)

umgesetzt, wodurch aus dem Nitrophenol das Nitrophenolat-Anion entsteht.

Anschließend wird nach einer definierten Reaktionszeit die Extinktion

spektralphotometrisch bei 400 nm gemessen. Das Ergebnis wird in die Hadornzahl

umgerechnet.

Die Methode nach Hadorn stellt genauso wie die Methode nach Gontarski eine

alternative Technik zur Bestimmung der Saccharaseaktivität in Honig dar. Die

Siegenthaler-Methode hat sich jedoch als präziser (bessere Werte für

Wiederholbarkeit und Vergleichbarkeit) und komfortabler erwiesen (VON DER OHE

et al. (1999)].


25

2.3.4. weitere Parameter zur Prüfung der Honigqualität

Prolin

Der Prolingehalt gibt Auskunft über die Reife eines Honigs, wobei Werte unter

180 mg/kg nach Untersuchungen an Zuckerfütterungshonigen als Zeichen unreifen

bzw. eventuell verfälschten Honigs interpretiert werden können. Einschränkend wird

jedoch erwähnt, dass auch bei Massentrachten Werte von unter 200 mg/kg

beobachtet wurden [VON DER OHE et al. (1991)].

Der Prolingehalt ist im Zusammenhang mit dem Säuregrad zu sehen. Bei

Säuregraden unter 17 bzw. unter 10 bei Sorten wie Akazie, Raps und Prolinwerten

unter 200 mg/kg besteht begründeter Verdacht auf Verfälschung.

Der Gehalt an Prolin wird photometrisch nach der DIN 10754 bestimmt.

Säuregrad, pH-Wert

Bienenhonig ist schwach sauer, Blütenhonig weist im Allgemeinen einen pH-Wert

zwischen 3,3 und 4,6 auf, Honigtauhonig liegt meist zwischen 4,2 und 5,5 [LIPP

(1994)]. Obwohl letzterer mehr Säuren enthält, werden diese durch den höheren

Gehalt an Mineralstoffen und Aminosäuren abgepuffert. Der pH-Wert beeinflusst die

Enzymaktivität und die Bildung von HMF.

Je reifer der Honig ist, desto höher liegt der Säuregrad.

Nach Anl. 2 Abschn. 1 der Honigverordnung darf Honig keinen künstlich veränderten

Säuregrad aufweisen. Nach Anl. 2 Abschn. II Nr. 5 gibt es einen maximalen Wert von

50 mEqu/kg (Milliäquivalente Säure pro kg), der auf der Bestimmung freier Säuren

beruht. Der Säuregehalt von Honig liegt zwischen 0,1 bis 0,4 %, brechnet als

Äpfelsäure.

Die beiden Parameter, pH und Säuregrad, werden potentiometrisch nach der

DIN 10756 gemessen.

Wassergehalt

Unter dem Wassergehalt eines Honigs wird der refraktrometrisch ermittelte Gehalt an

Wasser verstanden, angegeben als Massenanteil in g/100 g. Die Bestimmung des

Wassergehalts erfolgt nach DIN 10752.

Generell gilt, dass hoher Wassergehalt ein Zeichen unreif geernteten Honigs ist, der

dann gärungsgefährdet ist.


26

Nach der Honigverordnung, Anl. 2 Abschn. II Nr. 2, darf der Wassergehalt von

Blüten- und Honigtauhonigen nicht über 21 %, der von Heidehonigen nicht über 23 %

liegen.

2.3.5. Rückstandsanalytik

Bei Rückständen handelt es sich um Stoffe, die nach bestimmten technischen

Vorgängen im Produkt zurückbleiben. Bei Lebensmitteln meint man damit

üblicherweise Restmengen von Pflanzenschutzmitteln oder Tierarzneimitteln. Diese

werden dann zusammen mit dem Lebensmittel aufgenommen und können im

menschlichen Organismus, vor allem im Fettgewebe, akkumulieren.

Pflanzenschutzmittel, Schädlingsbekämpfungsmittel

Rückstände von Pestiziden oder Bioziden können in den Honig gelangen, wenn die

Pflanzen, die die Bienen zur Bestäubung nutzen, mit derartigen Mitteln behandelt

wurden. Die Rückstandshöchstmengen-Verordnung (RHmV) regelt die zulässigen

Höchstwerte für derartige Rückstände.

Die Bestimmung von Pflanzenschutzmittel-Rückständen erfolgt bisher meistens nach

der DFG S19-Methode, einer Multimethode, mit der eine Vielzahl von Substanzen

detektiert werden kann.

Tierarzneimittel

Werden Bienenkrankheiten, wie zum Beispiel Amerikanische Faulbrut oder Varroose

(Brutmilbenkrankheit), mit pharmazeutischen Substanzen behandelt, so können

diese Stoffe auf den Honig übergehen. In der Verordnung 2377/90/EG sind für viele

dieser Substanzen Höchstmengen festgelegt.

Derartige Rückstände werden üblicherweise mittels GC/MS oder LC/MS

nachgewiesen.


27

Bienenvertreibungsmittel

Viele Imker verwenden Repellents, um die Bienen aus dem Stock zu vertreiben und

damit die Honigernte zu erleichtern. Auf diese Thematik wird in Kap. 3.4. genauer

eingegangen.

Um Rückstände von Bienenvertreibungsmitteln analytisch zu bestimmen, müssen

substanzspezifische Nachweismethoden angewandt werden.

3. Phenylacetaldehyd – Rückstand oder natürlicher Bestandteil 28

28

3. Phenylacetaldehyd – Rückstand oder natürlicher Bestandteil

3.1. Charakterisierung von Phenylacetaldehyd

Bei Phenylacetaldehyd (CAS-Nummer: 122-78-1) handelt es sich um eine in reiner

Form farblose bis hellgelbe, ölähnliche Flüssigkeit, die in Alkohol und Ether löslich,

mit Wasser aber nicht mischbar ist. Die Substanz besitzt die Molmasse 120,15 g/mol

und kommt natürlicherweise in vielen Blüten, wie zum Beispiel Raps oder Flieder, vor

[OMURA et al. (1999), OH et al. (2008)]. Phenylacetaldehyd duftet in reiner Form

nach Hyazinthen und besitzt einen Geruchsschwellenwert von 4 µg/l Wasser. Der

Schmelzpunkt liegt bei –10 °C, der Siedepunkt bei 195 °C. Die Dichte beträgt

0,939 g/ml [TERNES et al. (2005)]. Die Substanz kann als Bestandteil von

ätherischen Ölen als Kontaktallergen wirken, wird aber bei oraler Aufnahme als nicht

toxisch für den Organismus eingestuft [SANCHEZ-POLITTA et al. (2007)].

3.2. Phenylacetaldehyd in Honig

Phenylacetaldehyd gehört zu den natürlichen Aromabestandteilen des Honigs.

ALISSANDRAKIS et al. (2007) fanden beispielsweise bei der Analyse flüchtiger

Komponenten hohe Gehalte in griechischen Thymianhonigen, wohingegen

CASTRO-VAZQUEZ et al. (2006) diese auch in spanischen Honigtauhonigen

feststellten. GUYOT et al. (1999) und RADOVIC et al. (2001) bestimmten weiterhin

höhere Phenylacetaldehyd-Konzentrationen in Heidehonigen.

Phenylacetaldehyd kann dabei aus der Aminosäure Phenylalanin auf zwei

verschiedenen Wegen gebildet werden [SPEER & MONTAG (1987), DEIFEL

(1989)].

Beim enzymatischen Abbau werden die einzelnen Reaktionsschritte durch

honigeigene Enzyme katalysiert. Zunächst erfolgt eine Transaminierung des

Phenylalanins zu Phenylbrenztraubensäure mit Hilfe der Phenylalanin-Amino-

Transferase, anschließend wird die Phenylbrenztraubensäure durch Phenylpyruvat-

Decarboxylase in Phenylacetaldehyd übergeführt. Letzteres kann dann entweder zu

29 3. Phenylacetaldehyd – Rückstand oder natürlicher Bestandteil

29

Abb. 3.2.a: Bildungsmechanismus von Phenylacetaldehyd mit Hilfe von Enzymen

Phenylessigsäure oxidiert (durch Aldehyd-Dehydrogenase) oder zu Phenylethanol

reduziert werden (durch Alkohol-Dehydrogenase) (Abb. 3.2.a).

Ein anderer Bildungsweg für Phenylacetaldehyd aus Phenylalanin ist der Strecker-

Abbau. Dabei reagiert das Phenylalanin mit dem in der Maillard-Reaktion gebildeten

3-Desoxyoson als reaktivem α-Diketon unter Transaminierung und Decarboxylierung

über das Aminoketon zum Phenylacetaldehyd (Abb. 3.2.b). Das schwach saure

Milieu des Honigs und erhöhte Temperaturen sind Voraussetzung für den Ablauf

dieser Reaktion [vergleiche auch BEHLITZ & GROSCH (1992)].

Abb. 3.2.b: Bildungsmechanismus von Phenylacetaldehyd innerhalb des Strecker-Abbaus


30

Abb. 3.3.a: Stiftung Warentest 4/2004

3.3. Problemstellung

Bei Honiguntersuchungen von Stiftung Warentest im

Jahr 2004 (Abb. 3.3.a) wurden sechs Honigproben

sensorisch abgewertet mit dem Kommentar

„Geschmack nach Phenylacetaldehyd“. Diese

Honige wurden weiterhin aufgrund eines „erhöhten”

Gehalts an Phenylacetaldehyd (zwischen 1,0 und

2,6 mg/kg) beanstandet (Tab. 3.3.b). Es handelte

sich bei diesen Produkten allesamt um Blütenhonige

aus Südamerika. Phenylacetaldehyd wurde dabei

als unerlaubter Rückstand interpretiert, was dazu

führte, dass alle beanstandeten Honige als

„rückstandsbelastet” eingestuft wurden und in der

Rubrik Rückstände die Beurteilung „ausreichend (4,5)” statt „sehr gut (0,5)” erhielten.

Die Gesamtnote bei allen sechs Proben war aufgrund der Sensorik und der

analytischen Befunde an Phenylacetaldehyd „mangelhaft“ [STIFTUNG WARENTEST

4/2004].

Honigprobe Aldi Nord / Vom

Besten Imkerhonig

Immenhof Imkerhonig

Kaiser´s Tengel-mann / Bären-

freund Blütenhonig

Lebkuchen Schmidt

Blütenhonig

Penny / Immenland Imker-Honig

Auslese

Wal Mart / Great Value

Blütenhonig Auslese

Phenylacet-aldehydbefund

[mg/kg] 2,5 1,2 1,6 2,6 1,0 1,5

Tab. 3.3.b: In Stiftung Warentest 4/2004 aufgrund der Phenylacetaldehydbefunde abgewertete Honigproben

Die aufgrund der Phenylacetaldehydgehalte vorgenommenen Abwertungen

erschienen indes nicht schlüssig und waren der Grund dafür, die Bildung von

Phenylacetaldehyd noch einmal genauer zu prüfen. Dabei sollten die Faktoren

untersucht werden, die den natürlichen Gehalt an Phenylacetaldehyd beeinflussen

können.

Zunächst werden Funktion und Einsatz von Bienenvertreibungsmitteln näher

betrachtet.


31

Abb. 3.4.a: Smoker zum Vertrei-ben der Bienen

Abb. 3.4.b: „Fume Pad“ zum Be-netzen mit Bee Repellents

3.4. Bienenvertreibungsmittel

Bienenvertreibungsmittel (englisch „Bee Repellents“) sind Stoffe, welche dazu

dienen, die Bienen während der Honigernte aus dem Stock zu vertreiben und somit

die Ernte zu erleichtern.

In kleinen Imkereien werden für diesen Zweck häufig Smoker genutzt (Abb. 3.4.a),

die auch in Deutschland im Imkereibedarf erhältlich sind. Dabei wird die Vertreibung

der Bienen mit Hilfe von Rauch bewerkstelligt, welcher im Innern eines

Edelstahlbehälters durch trockenes Holz, Sträucher oder auch Tannennadeln

erzeugt wird [GRAHAM (1993)]. Rauch wirkt auf die Bienen als Alarmsignal für

bevorstehendes Feuer, was dazu führt, dass sich die Bienen mit Honigvorräten

vollsaugen, was sie träge und somit sanfter macht [BOVAN (2006)]. Der Smoker

ersetzt die früher gebräuchliche Imkerpfeife.

In Nordamerika war dagegen Phenol als Repellent weit verbreitet [DAHARU &

SPORNS (1985)], wird aber wegen der Toxizität nicht mehr angewendet. KWAN &

SPORNS (1989) berichteten ferner über den Einsatz von Propionsäure, Benzaldehyd

oder auch Buttersäure-Anhydrid zum Vertreiben der Bienen. Auch die Eignung

verschiedener ätherischer Öle wird diskutiert, um die Imker vor den Stichen der

Bienen zu schützen [GUPTA (1987)].

Für die Anwendung wird Faserstoff mit der jeweiligen Substanz, üblicherweise in

Verdünnung, benetzt und auf den Bienenstock gelegt, woraufhin die Bienen nach

wenigen Minuten in den unteren Teil des Stocks wandern. Faserstoffe, für

Bienenstöcke passend gerahmt, sind als sogenannte „Fume Pads“ kommerziell

erhältlich (Abb. 3.4.b).


32

Die Substanzen haben unterschiedliche Temperaturoptima, so dass der Einsatz

auch von den klimatischen Bedingungen abhängig gemacht wird. Benzaldehyd kann

beispielsweise am bestem in einem Temperaturbereich von 18 - 27 °C angewendet

werden, wohingegen Buttersäure-Anhydrid besser in einem Bereich von 28 - 38 °C

genutzt wird [GRAHAM (1993)].

Grundsätzlich ist beim Verwenden dieser Stoffe zu beachten, dass eine falsche

Anwendung (Überdosierung) zu sensorischen Problemen und auch zu Rückständen

im Honig führen kann. Das Bayerische Landesamt für Gesundheit und

Lebensmittelsicherheit (LGL) hat beispielsweise 2005 Rückstände bis zu 0,15 mg/kg

an N, N-Diethyl-m-toluamid (DEET) in Honigen gefunden, ein Repellent, welches zur

Abwehr von Mücken genutzt wird und auch als Spray im Imkereifachhandel

angeboten wird. Die Rechtslage bei der Betrachtung derartiger Rückstände ist

allerdings unklar, in der RHmV gibt es keine expliziten Höchstmengen für die

genannten Substanzen. Bei DEET-haltigen Präparaten handelt es sich um Produkte

im Sinne der Biozid-Produkt-Richtlinie 98/8/EG und somit um Wirkstoffe zur

Schädlingsbekämpfung. Nach § 1 RHmV ist daher bei diesen Erzeugnissen ein

allgemeiner Grenzwert von 0,01 mg/kg anzuwenden [LGL BAYERN (2005)].

Bei Substanzen, die natürlicherweise im Honig vorliegen können, gestaltet sich die

Beurteilung weitaus schwieriger, denn es muss geklärt sein, aus welcher Quelle der

entsprechende Stoff stammt. Es wurden beispielsweise natürliche Vorkommen von

Phenol in neuseeländischen Waldhonigen bis 0,2 mg/kg beobachtet [BECKH &

LÜLLMANN (1998)].

Eine Alternative zu chemischen Repellents sind zum Beispiel sogenannte „Bee

Blower“, benzinbetriebene Geräte, mit denen die Bienen aus den Stöcken geblasen

werden. Diese machen die Bienen jedoch auch aggressiv, daher ist deren Einsatz

nicht weit verbreitet.

3.4.1. Phenylacetaldehyd als Bienenvertreibungsmittel Auch Phenylacetaldehyd kann als Bienenvertreibungsmittel eingesetzt werden.

Dabei ergeben sich für den Imker folgende Vorteile im Vergleich zu anderen

Repellents:


33

- Phenylacetaldehyd ist nicht toxisch und daher in seiner Anwendung

unbedenklich und einfach.

- Phenylacetaldehyd ist organoleptisch als Fremdstoff nur sehr schwer

zu identifizieren, da der Stoff auch natürlicherweise im Honig

vorkommen kann.

- Phenylacetaldehyd ist eine lipophile Substanz und akkumuliert nach

Anwendung zum Teil im Wachs. Dadurch sinkt die Gefahr, dass

erhöhte Rückstände im Honig wiederzufinden sind.

Da Phenylacetaldehyd auch auf den Honig übergehen kann, wäre es in einem

solchen Fall sehr wohl als Rückstand zu betrachten. Aber es muss bewiesen sein,

dass die Substanz von außen eingetragen wurde.

Phenylacetaldehyd bedarf keiner Zulassung, es obliegt dem Imker, ob er diesen Stoff

verwendet.

Daten über die Häufigkeit des Einsatzes von Phenylacetaldehyd als

Bienenvertreibungsmittel und über die Mengen existieren allerdings nicht.

3.5. Einflüsse auf den Phenylacetaldehydgehalt

Ziel dieser Arbeit war es nun, die Faktoren zu untersuchen, die den natürlichen

Gehalt an Phenylacetaldehyd im Honig beeinflussen. Dies können der Gehalt an

Phenylalanin, aber auch unterschiedliche Lagerungsbedingungen der Honige sein.

3.5.1. Analytik der freien Aminosäuren Da die Aminosäure Phenylalanin sowohl bei der Strecker-Reaktion als auch beim

enzymatischen Abbau die Ausgangssubstanz bei der Synthese des

Phenylacetaldehyds darstellt (vergleiche Kap. 3.2.), wurden zunächst verschiedene

Honigsorten auf ihre Phenylalaningehalte untersucht.

Dabei wurde die Honigprobe mit internem Standard (L-Norleucin) versetzt, in Wasser

gelöst und nach Zugabe von Sulfosalicylsäure (10 %) über Nacht im Kühlschrank

belassen. Nach Zentrifugation und Membranfiltration wurde das Filtrat mit Natrium-


34

Abb. 3.5.1.a: Aminosäuren-Chromatogramm von Akazien- und Lavendelhonig (IS = Interner Standard L-Norleucin)

Tab. 3.5.1.b.: Phenylalaningehalte ausgewählter Honige

Citratpuffer verdünnt und mit Hilfe eines Aminosäureanalysators chromatographiert

(Methode siehe Kap. 5.1.3.).

Alle Proben wurden entsprechend den aufgeführten Bedingungen analysiert. Die

Chromatogramme eines Akazienhonigs und eines Lavendelhonigs sind in Abb.

3.5.1.a gegenübergestellt. Die Ergebnisse bestätigten Literaturangaben, dass die

Gehalte einzelner freier Aminosäuren in Abhängigkeit von der Tracht erheblich

differieren können [BERGNER & HAHN (1972b); GILBERT et al. (1981); SPEER &

MONTAG (1986); COMETTO et al. (2003); BERNAL et al. (2005)]. Im Rahmen

dieser Arbeit waren allerdings nur die Gehalte für Phenylalanin von Interesse. Die für

die einzelnen Honige ermittelten Phenylalaningehalte sind in Tab. 3.5.1.b

zusammengestellt.

Honig Phenylalanin [mg/kg]

Tanne < 5

Akazie 26,6

Wildblüte 450

Lavendel 1369


35

Abb. 3.5.2.a: Massenspektrum von Phenylacetaldehyd

Besonders hervorzuheben sind die hohen Phenylalaningehalte für den Wildblüten-

und für den Lavendelhonig. Bei letzterem wurde sogar der Gehalt an Prolin

übertroffen. Ein solches Ergebnis ist aber nicht ungewöhnlich, da auch schon

HERMOSÍN et al. (2003) und COTTE et al. (2004) über derart hohe Gehalte

berichtet hatten. So fanden COTTE et al. beispielsweise in Tannenhonigen einen

mittleren Gehalt an Phenylalanin von 5,5 mg/kg (n = 37), hingegen in Lavendel-

honigen durchschnittlich 1152,8 mg/kg (n = 53).

3.5.2. Bestimmung von Phenylacetaldehyd mittels Headspace-GC/MS Ein Verfahren für die Analytik von Phenylacetaldehyd in Honig mittels statischer

Headspace-GC/MS-Analytik wurde von BOGDANOV et al. (2004) vorgestellt. Eine

derartige Methode wurde im Kantonslabor Basel 2003 zur Gehaltsbestimmung im

Rahmen einer Schwerpunktsuntersuchung zu Rückständen von Imkerei-Hilfsstoffen

in Honig genutzt [FREY (2003)].

Danach wurde die Honigprobe direkt in ein Headspace-Vial eingewogen, und es

wurden interner Standard (para-Dichlorbenzol-d4), Natriumchlorid und Wasser

zugesetzt. Während der Inkubation des Vials bei 80 °C erfolgte die Überführung des

flüchtigen Phenylacetaldehyds in die Gasphase. Ein Aliquot der Gasphase wurde in

die GC/MS injiziert. Phenylacetaldehyd wurde über die Retentionszeit und mittels

Vergleich der Massenspektren identifiziert (Massenspektrum siehe Abb. 3.5.2.a)



36

Abb. 3.5.3.a: Phenylacetaldehyd-Ergebnisse der mit Phenylalanin dotierten Proben

3.5.3. Ergebnisse und Schlussfolgerungen Mit der Headspace-Methode wurden neben einem von der Zuckerzusammensetzung

honigähnlichen Sirup (Fructose/Glucose-Verhältnis 1,2, Wassergehalt 25 %)

verschiedene monoflorale Honige analysiert. Dabei zeigte sich, dass die

Phenylacetaldehydgehalte in starkem Maße von der jeweiligen Honigsorte abhängig

sind. Lavendelhonige, die typischerweise reich an Phenylalanin sind, wiesen

beispielsweise immer einen sehr hohen Gehalt an Phenylacetaldehyd auf,

wohingegen die Konzentrationen für Akazienhonige (wenig Phenylalanin) relativ

gering waren. Im Sirup wurde erwartungsgemäß kein Phenylacetaldehyd

nachgewiesen.

Um die Auswirkungen des Phenylalanins auf den Gehalt an Phenylacetaldehyd zu

dokumentieren, wurden die Proben mit Phenylalanin dotiert. Wie erwartet, stiegen

mit zunehmender Phenylalaninkonzentration auch die gemessenen Gehalte an

Phenylacetaldehyd an (Abb. 3.5.3.a).

Allerdings fiel auf, dass die Inkubationstemperatur einen Einfluss auf die Menge des

gebildeten Phenylacetaldehyds hatte (Abb. 3.5.3.b): Je höher die Temperatur des

Inkubatorofens war (bei gleicher Inkubationszeit), desto höher war der gemessene

Gehalt an Phenylacetaldehyd. Damit war die gewählte Headspace-Methode zur

Erfassung des Phenylacetaldehydgehaltes für Honige nicht geeignet, da sich aus

Phenylalanin während der Inkubationszeit bereits Phenylacetaldehyd bildet. Dieses

konnte eindeutig aus den Ergebnissen für den mit Phenylalanin dotierten Sirup

abgeleitet werden.

0

2

4

6

8

10

12

14

0 500 1000

Zugabe von Phenylalanin [ppm]

Phen

ylac

etal

dehy

d [p

pm]

AkazienhonigZuckersirupWildblütenhonig


37

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

30 50 60 70 80 90

Temp. [°C]

Phen

ylac

etal

dehy

d [p

pm]

AkazienhonigZuckersirup + Phenylalanin (250 ppm)Wildblütenhonig

Abb. 3.5.3.b: Einfluss der Inkubationstemperatur bei der Headspace-Methode auf die Phenylacetaldehyd-Konzen-trationen (Inkubationszeit 2 h)

3.6. Bestimmung von Phenylacetaldehyd nach Extraktion

3.6.1. Methodenentwicklung

Es wurde eine alternative Methode zur Bestimmung dieser Substanz mittels Flüssig-

Flüssig-Extraktion in Anlehnung an TIMMROTH & SPEER (2003) entwickelt.

Dazu wurde eine wässrige Honiglösung mit tert.-Butylmethylether extrahiert und

anschließend zentrifugiert. Ein Teil der Etherphase wurde eingeengt und ein Aliquot

davon direkt zur GC/MS-Messung eingesetzt (Methode siehe Kap. 5.1.5.).

Durch die schonende Aufarbeitung (keine Wärmebehandlung) wurde eine Bildung

von Phenylacetaldehyd bei der Probenvorbereitung verhindert. Abb. 3.6.1.a zeigt am

Beispiel eines Zuckersirups, welchem Phenylalanin (250 mg/kg) zugesetzt worden

war, dass bei der Extraktionsmethode kein Phenylacetaldehyd gebildet wurde.


38

Abb. 3.6.1.a: Vergleich der Chromatogramme von Headspace- und Extraktionsmethode bei einem mit Phenylalanin dotierten Zuckersirup

3.6.2. Methodenvalidierung Die Methodenvalidierung soll als Instrument der Qualitätssicherung Auskunft darüber

geben, ob eine Analysenmethode geeignet ist, eine vorgegebene spezifische

Aufgabe zu erfüllen. Die Begriffsdefinition für „Validierung“ nach DIN ISO 8402 lautet:

„Bestätigen aufgrund einer Untersuchung und durch Bereitstellung eines objektiven

Nachweises, dass die besonderen Forderungen für einen speziellen beabsichtigten

Gebrauch erfüllt worden sind."

Die Ermittlung der Verfahrenskenndaten erfolgte nach KROMIDAS (1999).

Wiederholpräzision

Ein Akazienhonig, ein Waldhonig sowie ein polyfloraler Honig wurden auf ihre

Phenylacetaldehydgehalte untersucht. Danach wurden die Proben vor der

Aufarbeitung jeweils sechs Mal mit je 0,6 mg/kg Phenylacetaldehyd dotiert, und es

wurden anschließend die Konzentrationen bestimmt. Nach Abzug der natürlichen

Gehalte konnten die prozentualen Wiederfindungen ermittelt werden.

Die Wiederfindungsraten lagen bei allen Proben zwischen 80 und 110 %, wie aus

Abb. 3.6.2.a am Beispiel des Akazienhonigs hervorgeht. Somit war die

Wiederholpräzision ausreichend (siehe Kap. 5.1.6.).


39

Abb. 3.6.2.b: Linearität am Beispiel des Akazienhonigs (Korrelationskoeffizient: 0,997)

Linearität

Zur Bestimmung der Linearität wurden drei Honige (Akazie, Wald und polyfloraler

Honig) jeweils mit Phenylacetaldehyd in Konzentrationen von 0,12 bis 6,0 mg/kg

dotiert und die Gehalte bestimmt (Aufstockversuche siehe Kap. 5.1.6.). Für den

Konzentrationsbereich der Dotierungen wurden auch die in Stiftung Warentest

genannten Werte berücksichtigt, welche zwischen 1,0 und 2,6 mg/kg lagen (siehe

Kap. 3.3.).

Korrelationskoeffizienten von 0,994 bis 0,997 belegen, dass die Messsignale im

geforderten Konzentrationsbereich direkt proportional zu den Analytkonzentrationen

sind und die Methode somit in diesem Bereich linear ist (Abb. 3.6.2.b).

010

20304050

607080

90100

0 1 2 3 4 5 6 7

Messung

Wie

derf

indu

ng [%

]

Abb. 3.6.2.a: Wiederfindungsraten von Phenylacetaldehyd (0,6 mg/kg) in Akazienhonig

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00

Dotierung [mg/kg]

gem

esse

ne P

AA

-Kon

z. [m

g/kg

]


40

Bestimmungsgrenze

Als Bestimmungsgrenze wird die kleinste quantifizierbare Menge bezeichnet, also die

Menge, die mit einer vorgegebenen Richtigkeit und Präzision quantitativ erfasst

werden kann.

Die Bestimmungsgrenze wurde hier nicht experimentell ermittelt, sondern aus

Gründen der Vereinfachung abgeschätzt, was nach KROMIDAS (1999) zulässig ist.

Sie ergab sich aus einem Signal/Rausch-Verhältnis im Chromatogramm von 10:1

und wurde bei 0,1 mg/kg festgelegt.

3.7. Lagerungsversuche

Mit der entwickelten Methode sollten nun verschiedene Parameter untersucht

werden, die den Gehalt an Phenylacetaldehyd beeinflussen dürften. Die Gehalte

hängen, wie oben gezeigt, maßgeblich vom Phenylalaningehalt des jeweiligen

Honigs ab.

In weitergehenden Untersuchungen sollte nun geklärt werden, inwieweit ein

unmittelbarer Zusammenhang zwischen dem Gehalt an Phenylacetaldehyd eines

Honigs und seinem Gehalt an Phenylalanin besteht und inwiefern sich die

Konzentration des Phenylacetaldehyds im Laufe einer Lagerung in Abhängigkeit der

gewählten Bedingungen verändert.

Für die Versuche wurden der Akazien- und der Wildblütenhonig mit ihren recht

unterschiedlichen Phenylalaningehalten ausgewählt (siehe Tab. 3.5.1.b). Weiterhin

wurden der honigähnliche Zuckersirup in reiner Form sowie mit 250 mg/kg

Phenylalanin dotiert für die Untersuchungen eingesetzt. Bei allen vier Proben wurde

der Anfangsgehalt an Phenylacetaldehyd mit Hilfe der Extraktionsmethode ermittelt.

Die Ergebnisse sind in Tab. 3.7.a dargestellt.


41

Probe Phenylalanin

[mg/kg] Phenylacetaldehyd zu Beginn

[mg/kg]

Akazie 26,6 0,20

Wildblüte 450 2,7

Zuckersirup n.n. n.n.

Zuckersirup, dotiert 250 n.n.

Tab. 3.7.a: Phenylalanin- und Phenylacetaldehydgehalte (mg/kg) ausgewählter Honige (n.n. = nicht nachweisbar)

3.7.1. Lagerungsparameter

Jede der vier Proben wurde auf jeweils drei Gefäße aufgeteilt. Je ein Gefäß wurde im

Dunkeln bei Raumtemperatur (22 °C) gelagert, eines bei erhöhter Temperatur

(39 °C) und eines bei 22 °C unter UV-Licht unter Nutzung einer Pflanzenlichtlampe,

welche UV-A-Strahlung emittiert (Wellenlängenbereich 400 – 320 nm). Die erhöhte

Temperatur und das UV-Licht sollten dabei Bedingungen simulieren, wie sie beim

Lagern abgefüllter Ware allgemein oder in wärmeren Gebieten, auch in offenen

Fässern, sowie bei längerem Transport vorherrschen können (tropisches Klima,

Sonneneinstrahlung).

In definierten Abständen wurden über einen Zeitraum von 14 Wochen Proben

entnommen und der Gehalt an Phenylacetaldehyd mit der oben beschriebenen

Extraktionsmethode in Doppelbestimmung analysiert.

3.7.2. Ergebnisse der Lagerungsversuche

Wie zu erwarten war, konnte zu Beginn der Untersuchungen weder im reinen noch

im mit Phenylalanin dotierten Sirup Phenylacetaldehyd nachgewiesen werden. Der

Akazienhonig enthielt hingegen 0,20 mg/kg, der Wildblütenhonig sogar 2,7 mg/kg.

Auch hier zeigte sich, dass die Gehalte maßgeblich durch die unterschiedlichen

Phenylalaningehalte (Tab. 3.7.a) beeinflusst wurden.

Dass Phenylalanin in Phenylacetaldehyd umgewandelt wird, lässt sich eindrucksvoll

am dotierten Zuckersirup belegen. War zu Beginn des Experiments noch kein

Phenylacetaldehyd nachzuweisen, stieg die Konzentration mit zunehmender


42

Abb. 3.7.2.a: Chromatogramme (TIC): Wildblütenhonig (zwei Wochen gelagert bei 22 °C bzw. 39 °C) (Trennbedingungen siehe Kap. 5.1.5.)

Lagerungszeit zunächst stetig an. Schon nach zwei Wochen wurden Gehalte von

0,61 mg/kg (bei Raumtemperatur) bzw. 2,8 mg/kg (bei 39 °C und unter UV-Licht)

gemessen.

In den Lagerungsversuchen konnte ferner aufgezeigt werden, dass die

Konzentrationen an Phenylacetaldehyd (mit Ausnahme des reinen Zuckersirups) im

Dunkeln bei Raumtemperatur nur schwach, bei erhöhter Temperatur und unter UV-

Einwirkung zum Teil aber erheblich verändert wurden (Abb. 3.7.2.b), ein deutliches

Zeichen für enzymatische und/oder beginnende Strecker-Reaktionen. Abb. 3.7.2.a

zeigt anhand zweier Chromatogramme eines Wildblütenhonigs die unterschiedlichen

Gehalte an Phenylacetaldehyd nach zweiwöchiger Lagerung bei zwei verschiedenen

Temperaturen.

Sowohl der Akazienhonig als auch der Wildblütenhonig zeigten im Verlauf der

Lagerung ein ähnliches Verhalten. Bei beiden Honigen stieg die jeweilige

Konzentration an Phenylacetaldehyd zunächst über zwei Wochen an, um danach

allerdings wieder abzufallen. Daraus kann geschlossen werden, dass

Folgereaktionen abliefen, die zu einer Verminderung des nachweisbaren freien

Phenylacetaldehyds führen.

Phenylacetaldehyd


43

Abb. 3.7.2.b: Ergebnisse der Lagerungsversuche

3.7.3. Schlussfolgerungen Anhand der in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse wurde eindeutig aufgezeigt, dass

Honige während der Lagerzeit und des Transports erhebliche Änderungen in ihren

Phenylacetaldehydgehalten erfahren können. Die Zunahme der Konzentrationen war

bei erhöhter Temperatur bzw. unter Einfluss von UV-Licht signifikant höher als unter

Raumtemperatur. Als ganz entscheidend für die Phenylacetaldehydgehalte hatte sich

der natürliche Phenylalaningehalt eines Honigs herausgestellt.

Unter Zugrundelegung der vorgestellten Ergebnisse durfte daher die Aussage, dass

Phenylacetaldehyd in den festgestellten Konzentrationen (1,0 - 2,6 mg/kg) bei den

von Stiftung Warentest untersuchten Proben als Bienenvertreibungsmittel eingesetzt

wurde und somit als Rückstand anzusehen ist, nicht getroffen werden. Dies gilt um

so mehr, solange weder die Gehalte an Phenylalanin noch die äußeren

Bedingungen, denen die Honige ausgesetzt waren, bekannt sind.


44

Die beanstandeten Honige hatten aufgrund ihrer Herkunft von der Ernte bis zur

Ankunft in Deutschland eine Lager- und Transportzeit von durchschnittlich zwei

Monaten hinter sich [WALTER LANG HONIG-IMPORT GMBH (2005)]. Die Lagerung

erfolgt üblicherweise in Fässern bei den gegebenen Temperaturen, der Transport

wird dann in ungekühlten Containern per Schiff durchgeführt. Da die abgewerteten

Honige allesamt aus Süd- bzw. Mittelamerika stammten, darf angenommen werden,

dass die ermittelten Phenylacetaldehydgehalte natürlichen Ursprungs sind. Der mit

Phenylalanin dotierte Zuckersirup zeigte, dass sich schon nach zwei Wochen

Lagerungszeit bei erhöhter Temperatur ein Gehalt von 2,8 mg/kg gebildet hat,

welcher höher ist als die maximale Konzentration, die Stiftung Warentest gefunden

hat.

45 4. Filtration von Honig

45

4. Filtration von Honig 46

46

4. Filtration von Honig

4.1. Begriffsdefinition und lebensmittelrechtliche Situation

Nach § 2 Abs. 3 der früheren deutschen Honigverordnung vom 13. Dezember 1976

durften dem Honig keine honigeigenen Bestandteile entzogen werden.

Mit der neuen Honigverordnung vom 16. Januar 2004 wurde die europäische

Richtlinie 2001/110/EG umgesetzt und die alte Verordnung abgelöst. Eingeführt

wurde damit auch die neue Verkehrsbezeichnung „Gefilterter Honig“ für „Honig, der

gewonnen wird, indem anorganische oder organische Fremdstoffe so entzogen

werden, dass Pollen in erheblichem Maße entfernt werden“ (Anl. 1 Abschn. II Nr. 8).

Da die Vermarktung dieser Produkte seit dem 1. August 2003 zugelassen ist, ist es

seit dem also möglich, Honige in den Verkehr zu bringen, denen honigeigene

Bestandteile entzogen worden sind. Allerdings dürfen diese Erzeugnisse nicht die

Verkehrsbezeichnung „Honig“ tragen, sondern müssen als „Gefilterter Honig“

deklariert sein.

Bei Honigen, die nicht gefiltert wurden, dürfen nach § 3 Abs. 3 die Bezeichnungen

„ergänzt werden durch Angaben (1.) zur Herkunft aus Blüten oder lebenden

Pflanzenteilen, wenn der Honig vollständig oder überwiegend den genannten Blüten

oder Pflanzen entstammt und die entsprechenden organoleptischen, physikalisch-

chemischen und mikroskopischen Merkmale aufweist; (2.) zur regionalen,

territorialen oder topographischen Herkunft, wenn der Honig ausschließlich die

angegebene Herkunft aufweist; (3.) zu besonderen Qualitätsmerkmalen“.

In der Begründung zur Richtlinie 2001/110/EG, Punkt (7), ist explizit darauf

hingewiesen worden, dass Honigen mit besonderen Angaben kein gefilterter Honig

beigemischt werden darf. Dort heißt es: „Dem Honig, dessen Verkehrsbezeichnung

durch Angaben, die sich auf die Herkunft aus Blüten oder Pflanzenteilen oder auf die

regionale, territoriale oder topographische Herkunft beziehen, oder durch besondere

Qualitätsangaben ergänzt werden, darf kein gefilterter Honig zugesetzt werden.“


47

4.2. Anlass für eine Honigfiltration

In den USA kommt der größte Teil der Honige gefiltert auf den Markt [CRANE

(1979), PROBST (2004)]. Der Grund für die Produzenten, solche Verfahren

anzuwenden, ist der, den Kristallisationsprozess des Honigs aufzuhalten.

Kristallisation ist ein physikalisches Phänomen, wobei der kristallisierende Stoff

keinerlei chemischen Veränderungen unterworfen ist. Die Voraussetzung für eine

Kristallisation ist das Überschreiten des Löslichkeitsprodukts, das heißt, das

Vorliegen einer übersättigten Lösung.

Honig besitzt mit einem Gehalt von etwa 80 % eine sehr hohe Zuckerkonzentration

und ist mit Glucose und Fructose übersättigt. Die Glucosekonzentration im Honig

liegt zwischen 33 - 35 % (vergleiche Kap. 2.2.1.).

Als Kristallbildner können nur Glucose und das Trisaccharid Melezitose fungieren.

Melezitose kommt aber üblicherweise nur in wenigen Blatthonigtrachten vor. Die

Glucoseübersättigung führt dazu, dass sich zwangsläufig Kristalle im Honig bilden.

Starterkristalle, wozu winzige Glucosekristalle, aber auch Pollen und Schmutzpartikel

gehören, beschleunigen die Kristallbildung [BHANDARI et al. (1999)].

Ein höherer Anteil an Fructose kann die Kristallisation wieder abschwächen [WHITE

(1978)]. So neigen beispielsweise Akazienhonige mit einem F/G von zumeist über

1,5 nur selten zum Auskristallisieren, während dieses Verhältnis bei Rapshonigen

zwischen 0,95 und 1,05 liegt und Honige dieser Tracht üblicherweise sehr schnell

kristallisieren.

Einen wichtigen Einflussfaktor auf das Kristallisationsverhalten stellt weiterhin der

Wasseranteil dar. Die Kristallisationsneigung des Honigs sinkt mit zunehmendem

Wassergehalt infolge der abfallenden Zuckerkonzentration. Bei einem Glucosegehalt

von unter 30 % findet keine Kristallbildung mehr statt [SCHLEY & BÜSKES-SCHULZ

(1987)].

Auch die Lagerungstemperatur des Honigs hat Einfluss auf die Kristallisation. Bei

Temperaturen von unter 5 °C verringert sich die Diffusionsgeschwindigkeit der

Glucosemoleküle, und die Kristallisation wird gehemmt. Hohe Temperaturen von

über 25 °C führen zu einer Abnahme des Übersättigungsgrades der Glucose, was

ebenfalls zu verminderter Kristallbildung führt [WILSON & MARVIN (1931)]


48

Abb. 4.2.a: nicht kristallisierter (links) und kristal-lisierter Honig (rechts)

Eine Kristallisation von Honig ist

indes unerwünscht, denn neben

der erschwerten technologischen

Handhabung führt sie zu einer

Trübung des Produktes (Abb.

4.2.a). Grobkristallisierte, körnige

Honige werden häufig abgelehnt

und als minderwertig empfunden.

Weiterhin wird das Wachstum

von osmophilen Hefen gefördert,

was zur Fermentation des Honigs

führen kann. Der Grund ist, dass durch das bei der Kristallisation frei werdende

Wasser der aw-Wert erhöht wird. Dieser liegt bei nicht kristallisiertem Honig bei etwa

0,6, wohingegen die Untergrenze für Hefenwachstum 0,88-0,94 beträgt [BROWN

(1990)]. Die geringe Wasseraktivität und der hohe osmotische Druck lassen somit bei

nicht kristallisiertem Honig kein Hefewachstum zu. Durch das Kristallwasser steigt

jedoch der aw-Wert, und die Gefahr einer Gärung steigt [DONER (1977)].

Es wird somit vielfach als notwendig erachtet, den Kristallisationsprozess

abzuschwächen und somit den Honig länger in einem flüssigen Zustand zu halten,

um auch zusätzlich die weitere Bearbeitung zu vereinfachen.

Neben der Filtration sind in der Literatur verschiedene Verfahren beschrieben, wie

dieses Ziel erreicht werden kann. DYCE schlug 1931 vor, Honige einer

Pasteurisation zu unterziehen, indem die Erzeugnisse stufenweise zunächst auf

49 °C, dann auf 66 °C erwärmt werden, so dass die Zuckerkristalle zerstört werden.

Auch bereits vorhandene Hefezellen werden dabei abgetötet.

ASSIL et al. (1991) modifizierten dieses Verfahren. Sie berichteten, dass Honige

über zwei Jahre flüssig bleiben, wenn sie zunächst fünf Minuten auf 77 °C erhitzt

werden, anschließend schnell auf Raumtemperatur abgekühlt werden und dann

mindestens fünf Wochen bei 0 °C gelagert werden.

Nach KALOYEREAS & OERTEL (1958) hat der Einsatz von Ultraschallwellen

(9 kHz/sek. für 15-30 min) ähnliche Wirkungen. Derart behandelter Honig bleibt für

15 Monate stabil.


49

Die vorgestellten Methoden beruhen auf der Zerstörung von bereits vorhandenen

Glucosekristallen. Mittels Filtration gelingt es, auch mögliche weitere

Kristallisationskeime wie Pollen oder honigfremde Partikel zu entfernen. Daher ist

dies die in den USA populärste Technologie.

4.3. Technologisches Verfahren der Filtration

Filtration ist ein Vorgang, bei dem unterschiedliche Komponenten voneinander

getrennt werden.

PAINE et al. beschrieben 1934 als erstes eine Filtration von Honig unter Aufwand

von Überdruck mit dem Ziel, kolloidale Substanzen aus dem Produkt zu entfernen.

Die Prozessschritte und Apparaturen wurden später modifiziert, die Methode wird

aber im Prinzip noch heute von Abfüllern in den USA angewandt [CRANE (1979),

VON DER OHE (2006)]. In Abb. 4.3.a ist der technologische Ablauf einer Filtration

schematisch dargestellt.

Abb. 4.3.a: Prozessschritte bei der Honigfiltration (Schema)

A) Vorerwärmung des unbehandelten Honigs (ca. 45 °C)

B) Erhitzung: - Temp.: 80 °C - Zeit: 3 - 5 min.

D) Filtration durch Polyethylen-Membranen: - Porengröße 20 µm - Druck: 3 - 5 bar

E) Abkühlung auf Abfüll-temperatur (35 - 40 °C)

C) Zugabe von Kieselgur (0,02 % bezogen auf die Honigmenge)


50

Die Vorerwärmung (A) dient zunächst dazu, die Viskosität des Honigs soweit zu

verringern, dass eine technologische Bearbeitung, in diesem Fall das Überführen in

die Filtrationsanlage, ermöglicht wird.

Es erfolgt dann eine kurzzeitige Erhitzung auf 80 °C (B). Die Zeit (3 - 5 min.) ist so

gewählt, dass honigeigene sensible Komponenten, wie beispielsweise die Aktivität

der Diastase, weitestmöglich erhalten bleiben sollen.

Anschließend wird Kieselgur (Diatomeenerde) mit einer durchschnittlichen

Partikelgröße von 50 µm beigemischt (C), und zwar zu 0,02 % bezogen auf die

eingesetzte Honigmenge. Kieselgur dient als adsorptives Filterhilfsmittel, wobei

bestimmte Verbindungen selektiv auf der Oberfläche des Hilfsstoffes angereichert

werden. Es besteht zu ca. 86 % aus Silizium, weitere Bestandteile sind Natrium

(5 %), Magnesium (3 %), Eisen sowie andere Mineralstoffe. Der Stoff besitzt winzige

Poren (0,5 bis 10 µm), wodurch beispielsweise kleinste Bienenteile, Wachsanteile

und einige Bakterien aus dem Honig entfernt werden können [NHB (2004)]. Laut

FDA (1987) gilt die Nutzung von Kieselgur in der Lebensmittelindustrie als

unbedenklich für die menschliche Gesundheit. Demnach hat der Stoff GRAS-Status

(„Generally recognized as safe“).

Die eigentliche Honigfiltration (D) erfolgt über Polyethylen-Membranen mit einer

Porengröße von 20 µm. Der Druck, der aufgewendet werden muss, um die Honig-

Kieselgur-Suspension durch die Filter zu pressen, liegt zwischen 3 und 5 bar,

abhängig von der Honigsorte. Die Porengröße ist ausreichend, um die Pollen aus

dem Honig zu filtern, denn die durchschnittlichen Pollengrößen der nektarliefernden

Pflanzen liegen zwischen 26 und 48 µm [STANLEY & LINSKENS (1975), VON DER

OHE, K. & W. (2002)] (Tab. 4.3.b).

Pollenart Ø-Größe [µm] Weißklee 26 Kastanie 26

Raps 27 Baumheide (Erica) 30

Sonnenblume 31 Besenheide (Calluna) 35

Rotklee 37 Lavendel 38

Buchweizen 48

Tab. 4.3.b: Durchschnittliche Pollengrößen nektarliefernder Pflanzen


51

Nach Abschluss der Filtration wird der Honig auf eine Temperatur abgekühlt, mit

welcher die Abfüllung in die Verkaufsgebinde erfolgen kann (E). Diese liegt zwischen

35 und 40 °C.

4.4. Problemstellung

Die mikroskopische Pollenanalyse (Melissopalynologie) ist bisher die entscheidende

Methode zur botanischen und regionalen Identifizierung der Herkunft des Honigs.

Pollenart und prozentuale Zusammensetzung geben eindeutige Hinweise auf den

pflanzlichen und geographischen Ursprung des Honigs (siehe Kap. 2.3.1.). Hiermit

können auch Verfälschungen aufgeklärt werden, wenn teure Honige mit

preiswerteren Sorten gestreckt werden - ein Umstand, der häufig vorkommt. Die

Pollenanalyse dient demnach besonders dem Verbraucherschutz und dem Schutz

des redlichen Handelsbrauchs.

Wird nun durch Filtration ein Großteil der Pollen entfernt, so ist eine mikroskopische

Bestimmung der Herkunft des Honigs nicht mehr möglich. Die Gefahr einer

Verfälschung wächst daher, da ein gefilterter Honig geringerer Qualität mit einem

naturbelassenen Honig hoher Qualität geschönt werden kann und dieses

mikroskopisch nicht feststellbar ist. Solche Methoden sind wirtschaftlich interessant,

da Honige besonderer Herkunft hohe Marktpreise erzielen [SALLER (2003)] und zum

Beispiel die in Europa erzeugten Honige teurer sind als importierte Rohware

[STATISTISCHES BUNDESAMT (2003)].

In Deutschland sowie im europäischen Ausland stieß daher der Punkt „Gefilterter

Honig“ der EG-Richtlinie aufgrund der dadurch bestehenden Gefahr einer

Verfälschung in hohem Maße auf Ablehnung [REITINGER (2002), SCHWENKEL

(2002)].

Bei der Verabschiedung der neuen Honigverordnung bat der Agrarausschuss des

Bundesrates die Bundesregierung, die Forschung zu verstärken, um einfache und

kostengünstige Methoden zum Nachweis einer unerlaubten Vermischung sicher zu

erkennen. Der Bundesrat begründete dies mit dem „Interesse des

Verbraucherschutzes“ und damit, dass „der Herkunftsnachweis von Honig erschwert,

die Überwachung der Einhaltung der Honigverordnung aufwändiger“ sei. Solche

Nachweismethoden „dienen auch der Absatzsicherung von hochwertigem


52

einheimischen Honig“. Es sollte spätestens zwei Jahre nach Inkrafttreten der

Verordnung darüber Bericht erstattet werden, welche Nachweismethoden geeignet

sind, Verfälschungen sicher zu erkennen [DRUCKSACHE 847/1/03 (2003)].

Ziel der vorliegenden Arbeit war es nun, eine analytische Methode zu entwickeln, mit

der es gelingt, einen Nachweis für eine Filtration auch in Mischungen zu erbringen.

Zunächst galt es, gefilterte Honige zu charakterisieren und mittels Screening-

Versuchen Parameter herauszuarbeiten, um gefilterte und ungefilterte Honige zu

differenzieren.

4.5. Probenorganisation

Die Referenzproben, mit denen die analytischen Untersuchungen durchgeführt

werden sollten, wurden direkt von US-amerikanischen Abfüllern und Importeuren

organisiert, welche Honigfiltrationen großtechnisch routinemäßig durchführen. Dabei

wurden Honige verschiedener botanischer und geographischer Ursprünge bezogen.

Folgende Firmen stellten dabei authentisches Probenmaterial zur Verfügung:

- Sioux Honey Association (Sioux City, Iowa)

- Burleson´s Honey, Inc. (Waxahachie, Texas)

- Golden Heritage Food, LLC (Hillsboro, Kansas)

Die Honige wurden unmittelbar vor und nach dem eigentlichen Filtrationsprozess

entnommen. Bei den Proben vor Filtration war die Vorerwärmung abgeschlossen,

nicht jedoch die kurzzeitige Erhitzung. Es war noch kein Kieselgur zugefügt worden,

und die Honige waren noch keinen hohen Drücken ausgesetzt. Die Proben nach

Filtration wurden sofort nach Passieren der Filtrationsmembran entnommen und auf

Raumtemperatur abgekühlt. So konnte gewährleistet werden, dass Einflüsse weiterer

Prozessschritte bzw. -parameter auszuschließen waren.

Insgesamt wurden 40 Probenpaare untersucht, das heißt 40 Honige vor und 40 nach

Filtration (Liste siehe Kap. 5.2.2.).

Direkt nach Probeneingang wurde die Authentizität der Honige bestätigt, um die

Unverfälschtheit und die botanische und regionale Herkunft sicherzustellen. Dabei


53

wurden folgende Kenngrößen ermittelt: Sensorik, Pollenspektrum, Zuckerspektrum, 13C-Stabilisotopen-Analytik, pH-Wert, Säuregrad, Wassergehalt, HMF-Gehalt,

Diastase- und Saccharaseaktivität (siehe Kap. 2.3.1. bis 2.3.4.).

Alle gelieferten ungefilterten Honigproben erwiesen sich als unverfälscht und

entsprachen den Vorgaben der Honigverordnung.

Bei den gefilterten Honigen konnten hinsichtlich Zuckerspektrum, 13C-Stabilisotopen-

Analytik, Prolingehalt, pH-Wert, Säuregrad, Wassergehalt und Diastaseaktivität keine

Auffälligkeiten festgestellt werden. Siehe aber hierzu Kap. 4.6.

4.6. Auswirkung einer Filtration auf unterschiedliche Parameter

4.6.1. Sensorik

Zur Beurteilung der sensorischen Unterschiede zwischen gefilterten und ungefilterten

Honigproben wurden paarweise Vergleichsprüfungen („Duo-Tests“) nach BUSCH-

STOCKFISCH (2002) durchgeführt. Dabei handelt es sich um attributbezogene

Unterschiedsprüfungen, bei denen der Prüfer jeweils Probenpaare erhält. Die Paare

bestanden aus den ungefilterten Honigen und ihren gefilterten Pendants. Es war

darüber zu befinden, ob sich die Proben anhand der olfaktorischen und

gustatorischen Merkmale differenzieren lassen. Alle gelieferten Honigproben wurden

zu den Untersuchungen herangezogen und von jeweils drei geschulten Prüfern

bewertet.

Die Auswertungen der Prüfungen zeigten, dass gefilterte Honige nur marginale

Unterschiede zu ungefilterten Honigen aufwiesen. Diese fielen auch lediglich im

direkten Vergleich auf.

4.6.2. Elementaranalysen

Analysen der Elemente wurden durchgeführt, um zu überprüfen, ob Reste von

Kieselgur in den gefilterten Honigen wiederzufinden sind. Dazu gehören Silizium,

aber auch charakteristische Metalle wie zum Beispiel Natrium (siehe Kap. 4.3.). Die

Untersuchungen wurden mittels ICP-MS durchgeführt. Es wurden allerdings keine

Unterschiede zwischen gefilterten und ungefilterten Honigen festgestellt.


54

4.6.3. Leitfähigkeit, pH-Wert und Säuregrad

Die analytische Bestimmung der Leitfähigkeit erfolgte nach DIN 10753 (siehe Kap. 2.3.1.), die des pH-Wertes und des Säuregrades potentiometrisch nach DIN 10756

(siehe Kap. 2.3.4.).

In den vergleichenden Untersuchungen stellte sich heraus, dass alle drei Parameter

durch den Filtrationsprozess nicht verändert wurden, so dass eine Differenzierung

gefilterter und ungefilterter Honige über diese Kenngrößen nicht möglich war.

4.6.4. Flavonoide und Phenolcarbonsäuren

Die Überlegung zur Untersuchung dieses Parameters war, dass das bei der Filtration

eingesetzte Kieselgur selektiv Komponenten dieser Substanzgruppen aus dem

Honig entfernen kann.

TRAUTVETTER et al. untersuchten 2006 gefilterte und ungefilterte Honige auf das

Spektrum der Flavonoide und Phenolcarbonsäuren mittels HPLC-DAD nach

Extraktion mit Ethylacetat. Die Ergebnisse zeigten, dass die Gehalte dieser Stoffe

durch eine Filtration keinen Veränderungen unterworfen waren. Die Messungen

erbrachten somit keine Erkenntnisse hinsichtlich einer Unterscheidung gefilterter und

ungefilterter Honige (Chromatogramme siehe Abb. 4.6.4.a).

Abb. 4.6.4.a: DAD-Chromatogramme (λ = 254 nm) eines amerikanischen Kleehonigs vor (schwarz) und nach Filtration (rot)

Minutes0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

mA

U

0

50

100

150

200

250

300DAD-254nm28748 S2 prefiltration, USA (06.02.07)

DAD-254nm28749 S2 postfiltration, USA (06.02.07)


55

4.6.5. Spektroskopische Untersuchungen

Es gibt bereits verschiedene Ansätze, spektralphotometrische Messungen zum

Nachweis einer Honigverfälschung mit Zuckersirup oder zur simultanen Bestimmung

von Qualitätsparametern zu nutzen, wie zum Beispiel Gehalte an bestimmten

Zuckern, HMF bzw. Prolin oder auch Leitfähigkeit und Säuregrad [LICHTENBERG-

KRAAG et al. (2002), DANIEL KELLY et al. (2004), RUOFF et al. (2006)]. Dem liegt

das Prinzip zugrunde, dass bestimmte Substanzen bzw. Substanzgruppen in

definierten Wellenlängenbereichen Absorptionseffekte zeigen, die umso stärker

ausfallen, je höher der Gehalt an diesen Stoffen ist.

In dieser Arbeit sollte durch Scannen eines möglichst großen Wellenlängenbereichs

überprüft werden, ob spezifische Banden in den Spektren auftreten, die eine

vorhergehende Filtration anzeigen bzw. ob honigtypische Banden nach einer

Filtration verschwinden.

4.6.5.1. Farbmessungen nach Pfund Mit Hilfe eines Lovibond-Gerätes wird das Ausmaß der Verschiebung der Honigfarbe

zu der eines Standard-Honigs verglichen. Die Werte werden in mm Pfund

angegeben. Anhand der Ergebnisse erfolgt eine Einstufung in die Pfund-Skala. Helle

Honige wie zum Beispiel Akazie liegen im Bereich 5 bis 25 mm Pfund, dunkle Sorten

wie Waldhonige erreichen Werte bis 120 mm Pfund [PERSANO-ODDO & PIRO

(2004)].

Die Vergleichmessungen gefilterter und ungefilterter Honige zeigten keine

abweichenden Farbwerte untereinander.

4.6.5.2. IR-Absorption Energetisch liegt die Infrarotstrahlung im Bereich der Schwingungsniveaus von

Molekülbindungen, was bedeutet, dass die Absorption zu Schwingungsanregungen

dieser Bindungen führt.

Es wurde der Bereich von 500 bis 4000 nm gescannt. Vergleichende Messungen

filtrierter und unfiltrierter Honige zeigten keine signifikanten Unterschiede. Es traten

außerdem keine spezifischen Banden auf, die direkt einen Hinweis auf eine Filtration


56

hätten geben können (Abb. 4.6.5.2.a). Aus diesem Grund wurde auch keine

Zuordnung von Banden zu einzelnen Strukturen vorgenommen.

Abb. 4.6.5.2.a: IR-Spektren eines unfiltrierten (links) und eines filtrierten amerikanischen Kleehonigs (rechts)

4.6.5.3. UV-Absorption Mittels Strahlung von sichtbarem und ultraviolettem Licht werden Valenzelektronen in

Orbitalen der äußeren Schalen angeregt.

Es wurden die Absorptionen von Honigen bei definierten Wellenlängen im Vis- und

Ultraviolett-Bereich gemessen, und zwar bei 300, 420, 525, 600 und 700 nm. Zur

Messung wurden die Honigproben in Quarzglas-Küvetten gefüllt und gegebenenfalls

Luftblasen entfernt.

Honige, die nach der Honigverordnung filtriert wurden, zeigten wie auch bei den IR-

Messungen im Vergleich zu den Originalproben nur geringe Abweichungen in den

Absorptionen (Abb. 4.6.5.3.a).

Abb. 4.6.5.3.a: UV-Messungen eines unfiltrierten (links) und eines filtrierten amerikanischen Kleehonigs (rechts)


57

4.6.6. Zuckerprofile

Zu prüfen war, ob die Konzentrationen einzelner Zucker im Honig durch eine

Filtration derart beeinflusst werden, dass eine Differenzierung zu unfiltriertem Honig

möglich ist.

Die Bestimmung der Saccharide erfolgte mittels HPLC und Brechungsindex- (RI-)

Detektion nach DIN 10758 (siehe Kap. 2.3.1.). 1,25 g Honig wurden dabei in 50 ml

Wasser gelöst und direkt zur Messung eingesetzt.

Mit dieser Methode wurden folgende Kohlenhydrate identifiziert: Glucose, Fructose

(Monosaccharide), Saccharose, Turanose, Maltose, Trehalose, Isomaltose

(Disaccharide) sowie Erlose, Melezitose und Maltotriose (Trisaccharide).

Die Zuckerprofile gefilterter und ungefilterter Honige waren nahezu identisch (siehe

Abb. 4.6.6.a).

Abb. 4.6.6.a: Zuckerspektren eines unfiltrierten (links) und eines filtrierten amerikanischen Kleehonigs (rechts)

4.6.6.1. Bestimmung der Oligosaccharide

Bei Oligosacchariden handelt es sich um Kohlenhydrate, die aus 3 bis 10

Einzelzuckern bestehen. Darüber hinaus werden sie als Polysaccharide bezeichnet

[FREDE (2006)]. Honige enthalten Anteile an diesen höheren Zuckern zwischen

1 und 3 %.

Ziel war es, zu überprüfen, ob durch Filtration die höheren Saccharide selektiv in

ihren Gehalten gemindert werden. Sie sind größer und haben eine geringere

Zeit Zeit

Signalhöhe Signalhöhe


58

Polarität als die Monosaccharide. Sie könnten durch das eingesetzte Kieselgur eher

beeinflusst werden.

Diese Zucker sind aufgrund ihrer geringen Gehalte mit der Methode nach DIN 10758

nicht zu erfassen, denn die Honige liegen dabei in einer zu großen Verdünnung vor.

Bei konzentrierteren Honiglösungen, mit denen man die geforderten Gehalte hätte

messen können, bestand jedoch das Problem, dass durch die großen Anteile von

Fructose und Glucose im Honig die HPLC-Säule überladen würde. Somit war die

Aufgabe, diese beiden Monosaccharide abzutrennen und die größeren Zucker

anzureichern, so dass deren Bestimmung gelingen kann.

Als Ansatz für die Methodenentwicklung diente eine Applikation von LIPP et al.

(1988), die ein Verfahren zum Nachweis von Glucose- und Hochfructosesirupen in

Honig vorstellten. Sie fraktionierten die Saccharide im Honig mittels einer

Kieselgur/Aktivkohle-Mischung, wobei zunächst die kleinen Zucker mit 7%- und

10%igem Ethanol von der Säule gewaschen wurden. Die Oligosacharide wurden mit

50%igem Ethanol eluiert, wobei man sich die unterschiedliche Löslichkeit der

Zuckerbausteine in Alkohol zunutze machte. Diese Fraktion wurde anschließend zur

Ionenaustausch-HPLC verwendet.

Die Methode wurde derart modifiziert, dass zunächst eine gelchromatographische

(GPC-) Trennung der Honigzucker an Fractogel TSK HW-40 (S) ® der Firma Merck

erfolgte. Als Eluent diente bidestilliertes Wasser, die Peakerfassung wurde mittels RI-

Detektion vorgenommen. Zunächst eluierten dabei die größeren Zucker vor den

kleineren (Chromatogramm siehe Abb. 4.6.6.1.a). Der Vorteil dieser Methode ist,

dass die Oligosaccharide mit der GPC nahezu quantitativ separiert werden und mit

kleinen Einzelfraktionen eine genauere Trennung von den Monosacchariden

vorgenommen werden kann. Glucose und Fructose können bei den Honigen zwar

nicht vollständig abgetrennt werden, die Konzentrationen dieser beiden

Kohlenhydrate in den Fraktionen waren jedoch so gering, dass die analytische

Bestimmung der größeren Zucker gelingen konnte.

Die Eluate, in denen sich die höheren Zucker befanden, wurden isoliert und

zusammengeführt. Nach Aufkonzentrierung wurde die Probe zur analytischen HPLC

eingesetzt.


59

Abb. 4.6.6.1.a: GPC-Chromatogramm eines ungefilterten amerikanischen Kleehonigs. In den Fraktionen 5 und 6 befinden sich die Oligosaccharide.

Die analytische Trennung dieser Fraktionen erfolgte an einer Ionenaustauschersäule

mit einer wässrigen NaOH/NaAc-Lösung als Eluenten in einem isokratischen

System. Das Prinzip beruht darauf, dass Kohlenhydrate als schwache Säure (pK-

Werte zwischen 12 und 14) bei hohem pH-Wert mindestens zum Teil ionisiert sind

und sich somit mit Natronlauge/Acetatpuffer an einem Latex-Anionentauscher

trennen lassen. Dabei kam die gepulste amperometrische Detektion zum Einsatz, bei

der die Zucker an einer Goldelektrode oxidiert werden [DIONEX CORPORATION

(2005)].

Als Vergleichsstandards dienten Maltooligosaccharide, also Kohlenhydrate mit

definierten Mengen an unterschiedlichen Glucosebausteinen (Abb. 4.6.6.1.b).

Es ist mit dieser Methode möglich, in einem HPLC-Lauf Honigzucker zu trennen, die

zwischen 3 und 9 Monosaccharid-Einheiten enthalten. Die genaue Durchführung der

Methode ist in Kap. 5.2.3.1. beschrieben.

Ziel dieser Untersuchungen war es, eine Differenzierung gefilterter und ungefilterter

Honige mit Hilfe der Oligosaccharid-Chromatogramme zu erarbeiten. Nach der

Aufnahme von Oligosaccharid-Profilen verschiedener Honige vor und nach Filtration

konnte nicht bestätigt werden, dass signifikante Veränderungen durch den


60

Filtrationsprozess eintreten. Die Gehalte an größeren Zuckern variierten, wie auch

die an den Mono- und Disacchariden, nur in einem geringen Bereich (Abb. 4.6.6.1.c, d). Aus diesem Grund wurde keine genaue Identifizierung einzelner Oligosaccharide

in den Honigproben vorgenommen.

Abb. 4.6.6.1.b: Chromatogramm der analytischen HPLC einer Maltooligosaccharid- Standardmischung Retentionszeiten: 3.67 Maltotriose (3 Glucose-Einheiten, G3)

4.76 Maltotetraose (G4) 6.40 Maltopentaose (G5) 8.82 Maltohexaose (G6)

12.58 Maltoheptaose (G7) 18.32 Maltooctaose (G8) 26.82 Maltononanose (G9)

Abb. 4.6.6.1.c: Oligosaccharid-Chromatogramm eines ungefilterten amerikanischen Kleehonigs

Zeit

Zeit

Signalhöhe

Signalhöhe


61

Abb. 4.6.6.1.d: Oligosaccharid-Chromatogramm des gefilterten Kleehonigs

4.6.7. HMF-Gehalt

Die Bestimmung der Gehalte an Hydroxymethylfurfural erfolgte mittels HPLC nach

DIN 10751-3.

Sämtliche Proben wiesen nach einer Filtration deutliche Erhöhungen in den HMF-

Konzentrationen auf (Abb. 4.6.7.a und b). Der in der Honigverordnung festgelegte

Grenzwert von 40 mg/kg wurde jedoch in keinem der Fälle überschritten.

HMF ist ein Produkt der Maillard-Reaktion und gilt als Parameter für eine

Wärmeschädigung von Honig (siehe Kap. 2.3.3.). Da Honig vor der eigentlichen

Filtration kurzzeitig erhitzt wird (vergleiche Kap. 4.3.), lag die Vermutung nahe, dass

damit der Anstieg der HMF-Konzentrationen zu erklären war. Um dies zu belegen,

wurden daraufhin ungefilterte Honigproben mit bekannten HMF-Gehalten im Labor

für 5 Minuten in einen Trockenschrank (80 °C) gestellt und anschließend auf die

HMF-Konzentrationen untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass derartige

Bedingungen zu einer Erhöhung von HMF führen (Abb. 4.6.7.c).

Für eine Differenzierung von gefiltertem und ungefiltertem Honig ist HMF nicht

geeignet, denn auch bestimmte Transport- und Lagerungsbedingungen können zu

einem Ansteigen der Konzentrationen führen und sind nicht allein durch einen

vorherigen Filtrationsprozess zu erklären.

Zeit

Signalhöhe


62

Abb. 4.6.7.a: HMF-Chromatogramme eines ungefilterten (links) und eines gefilterten amerikanischen Kleehonigs

Abb. 4.6.7.b: HMF-Gehalte verschiedener Honigproben vor und nach Filtration

Zeit Zeit

Signalhöhe Signalhöhe

HMF

HMF

Signalhöhe


63

Abb. 4.6.7.c: HMF-Gehalte verschiedener Honige vor und nach Erhitzung (5 min. auf 80 °C)

4.6.8. Mikroskopische Untersuchung

Die mikroskopische Untersuchung wurde nach LOUVEAUX et al. (1970)

durchgeführt.

Nach einer Filtration waren erwartungsgemäß keine Pollen mehr zu sehen, denn die

verwendete Porengröße können sie nicht passieren (vergleiche Kap. 4.3.).

Der Gehalt an Hefezellen war nach einer Filtration deutlich geringer als vorher.

Offensichtlich wird durch den Prozess ein großer Anteil entfernt. Möglich sind auch

eine komplette Abtrennung der Hefezellen und eine erneute Vermehrung während

des Transports und der Lagerung, wenn wieder Hefezellen in die Honige gelangen.

So wäre dann das Vorhandensein von Hefen auch nach der Filtration zu erklären.

Pilzsporen waren in den meisten Honigen nicht detektierbar. Durch die Filtration wird

ihre Anzahl nur marginal reduziert. Die Größen von Pilzsporen und Hefezellen sind

sehr variabel und liegen im Allgemeinen zwischen 3 und 15 µm [MÜLLER & WEBER

(1996)].

In wenigen Honigen waren vor der Filtration Stärkekörner mikroskopisch

nachweisbar, bei sämtlichen gefilterten Proben jedoch nicht.


64

Auch größere Partikel, die keinen Honigbestandteilen zugeordnet werden konnten,

waren nach Filtration nicht mehr im Honig vorhanden. Dies gilt gleichermaßen für

Reste des Filterhilfsmittels Kieselgur.

Für eine Differenzierung ist eine mikroskopische Untersuchung zwar geeignet, ein

Nachweis von Mischungen gefilterter und ungefilterter Honige ist allerdings nicht

möglich.

4.6.9. Enzymaktivität der Diastase

Die Untersuchung der Diastaseaktivität erfolgte photometrisch nach Schade (DIN

10750) (siehe Kap. 2.3.3.).

Es wurde bei sämtlichen Proben eine Abnahme der Diastaseaktivität festgestellt. Die

Minderung betrug allerdings lediglich zwischen 5 und 15 % (Abb. 4.6.9.a), was für

eine präzise Abgrenzung gefilterter und ungefilterter Honige nicht ausreichend ist.

Abb. 4.6.9.a: Veränderungen der Diastaseaktivitäten nach Filtration am Beispiel verschiedener Honigsorten


65

4.6.10. Enzymaktivität der Saccharase

Die Bestimmung der Saccharaseaktivität wurde photometrisch nach Siegenthaler

(DIN 10759-1) durchgeführt und wird als Hadorn-Zahl ausgedrückt (siehe Kap.

2.3.3.).

Die Enzymaktivitäten der Saccharase waren nach Filtration deutlichen

Veränderungen unterworfen. Diese wurden bei allen Proben auf ein Minimum

abgesenkt, die Verluste lagen zumeist bei mehr als 90 % (Abb. 4.6.10.a).

Im Vergleich zu den Diastaseaktivitäten waren die Unterschiede vor und nach

Filtration hier zwar beträchtlich, trotzdem gestaltete sich eine eindeutige

Differenzierung in Mischungen schwierig, da die Saccharase wärmeempfindlich ist

(vergleiche Kap. 2.2.3.2.) und die Aktivitäten somit auch durch andere äußere

Faktoren beeinflusst werden können.

Abb. 4.6.10.a: Veränderungen der Saccharaseaktivitäten nach Filtration am Beispiel verschiedener Honigsorten


66

4.6.11. Zusammenfassung der Screeningversuche

Von den analytischen Parametern kamen nur wenige in Frage, mit denen man

gefilterten und ungefilterten Honig hätte unterscheiden können. Veränderungen

waren im mikroskopischen Bild, beim HMF-Gehalt und bei den Enzymaktivitäten von

Diastase und Saccharase zu beobachten.

Mischungen von gefilterten und ungefilterten Honigen ließen sich indes mit Hilfe

dieser Kenngrößen nicht feststellen, denn dazu waren entweder die Abweichungen

zu gering oder die Parameter zu sehr von weiteren Gegebenheiten beeinflussbar.

Theoretisch wäre es möglich, eine Differenzierung über die Enzymaktivitäten

vorzunehmen: Während die Aktivität der Diastase nach Filtration nur schwach

abnahm, erfuhr die der Saccharase große Verluste. Da jedoch die Aktivitäten beider

Enzyme in ungefilterten Honigsorten sehr stark schwankten, gelang dies nicht.

Allerdings erschien eine eingehendere Untersuchung der Proteine hinsichtlich eines

Nachweises sinnvoll, da es sich bei beiden Enzymen um Eiweissstoffe handelt und

beide durch den Filtrationsprozess unterschiedlich beeinflusst werden.

4.7. Methode zum Nachweis einer Filtration

Die Beobachtungen, dass die Enzymaktivitäten im Honig nach einer Filtration

abnehmen, führten zu der Fragestellung, ob Enzyme durch den Prozess denaturiert

oder aus dem Honig entfernt wurden. Wäre ersteres der Fall, lägen sie nach

Filtration weiterhin mindestens zum Teil vor, und es könnte sich eine eingehendere

Untersuchung anschließen.

Da die Enzyme überwiegend aus Eiweißstoffen bestehen, sollte eine Bestimmung

des Gesamtproteingehaltes im Honig Aufschluss über diese Fragestellung geben.

Nimmt der Proteingehalt nach Filtration deutlich ab, werden Eiweiße aus dem Honig

herausfiltriert. Wären nur schwache oder gar keine Verluste zu beobachten, sollten

die Enzyme weiterhin, mindestens zu einem Teil in denaturierter Form, im Honig

vorhanden sein.


67

Abb. 4.7.1.a: Struktur von Coomassie Brillant Blue G-250

4.7.1. Bestimmung der Proteinkonzentrationen

In der Literatur werden verschiedene Methoden zur Messung von Eiweißgehalten in

Honig vorgeschlagen. BOGDANOV verglich 1981 quantitative Methoden zur

Proteinbestimmung von KJEDAHL (1883), LUND (1910), LOWRY et al. (1951) und

der Biuret-Methode mit der Methode nach BRADFORD (1976).

Die Bestimmung nach Bradford hat sich danach als sehr geeignet für die Matrix

Honig erwiesen. Die alternativen Methoden sind entweder für die Routine zu

aufwändig oder liefern aufgrund der sehr geringen Proteingehalte des Honigs nur

ungenaue Ergebnisse.

Die Proteinbestimmung nach Bradford basiert auf der unspezifischen Bindung des

Farbstoffes Coomassie Brillant Blue G-250 (Abb. 4.7.1.a) an kationische und

unpolare hydrophobe Seitenketten der Aminosäuren (vor allem Arginin). Diese

Substanz besitzt zwar eine höhere Nachweisgrenze für Proteine als R-250 (Abb. 4.7.1.b), färbt diese aber deutlich schneller und wird deshalb bevorzugt für den

Bradford-Nachweis eingesetzt [WESTERMEIER & MAROUGA (2005)].

Bei der ungebundenen (kationischen), rötlich gefärbten Form des Stoffes liegt das

Absorptionsmaximum bei 470 nm. Durch die Komplexbildung mit Proteinen wird die

Substanz in seiner blauen, unprotonierten, anionischen Sulfatform stabilisiert, und

das Absorptionsspektrum verschiebt sich auf ein Maximum bei 595 nm. Da der

Extinktionskoeffizient des Farbstoff-Protein-Komplexes sehr viel höher ist als der des

freien Farbstoffes, kann die Zunahme der Absorption durch die Bildung des

Komplexes mit hoher Empfindlichkeit gegenüber der Absorption des freien

Farbreagenz photometrisch gemessen werden und ist somit ein Maß für die

Proteinkonzentration der Lösung [REISNER et al. (1975)].

Abb. 4.7.1.b: Struktur von Coomassie Brillant Blue R-250 (besitzt 2 Methylgruppen weniger)


68

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 5 10 15 20 25 30

Standardkonzentration BSA [µg/ml]

Abso

rptio

n

Abb. 4.7.1.c: Eichgerade für die Proteinbestimmung nach Bradford mit BSA

Der Bildungsprozess des Komplexes verläuft sehr schnell (ca. 2 min.) und hält

vergleichsweise lang an (mehr als eine Stunde) [AZEREDO et al. (2003)], wodurch

viele Proben zunächst gleichzeitig aufgearbeitet und danach zusammen gemessen

werden können. Coomassie Brillant Blue G-250 hat neben der Spezifität für Protein-

Peptid-Bindungen den Vorteil, dass es von Pufferchemikalien und reduzierenden

Stoffen kaum gestört wird. Die Methode versagt allerdings, wenn in der

Proteinlösung Substanzen enthalten sind, die in stark phosphorsauren Lösungen

grobflockige Niederschläge bilden (z. B. Detergenzien wie Desoxycholat). Störungen

des Tests werden auch durch andere Tenside wie Natriumdodecylsulfat (SDS) und

Triton X-100 verursacht. Da Honig derartige Substanzen nicht enthält und diese in

der Applikation auch nicht zu Einsatz kommen, ist die Bradford-Methode zur

Messung der Proteinkonzentrationen in Honig geeignet.

Die verdünnte Honiglösung (1:40 mit Wasser) wurde mit G-250 versetzt, welches in

ethanolischer Phosphorsäure gelöst war, anschließend wurde die Absorption bei

595 nm gemessen. Zur Kalibrierung wurde eine Eichgerade mit BSA (Bovine Serum

Albumine) erstellt (Abb. 4.7.1.c).

Die Ergebnisse ergaben, dass der Proteingehalt der Honige zwischen 0,01 und

0,07 % variierte. Die geringsten Konzentrationen wurden in Akazienhonigen ermittelt;

sie lagen in der Regel unter 0,02 %. Lediglich Wald- (bis 0,1 %) und vor allem

Heidehonige (bis 0,17 %) wiesen deutlich höhere Konzentrationen auf (siehe Abb.


69

4.7.1.c). Dies entsprach Gehalten, die auch in der Literatur publiziert worden waren

und ebenfalls mit der Bradford-Methode ermittelt worden waren [BOGDANOV

(1981), AZEREDO et al. (2003)]. Die in den genannten Arbeiten beschriebenen

außergewöhnlich hohen Werte für Heidehonige konnten somit ebenfalls bestätigt

werden.

Einfluss der Filtration

Um den Einfluss einer Filtration auf die Proteinkonzentrationen von Honig zu

dokumentieren, wurden Honigproben vergleichend vor und nach Filtration auf ihre

Proteingehalte untersucht. Anhand der Vergleichsmessungen war zu beobachten,

dass nach einer Filtration maximal 10 % der Eiweißstoffe verloren gehen (Abb. 4.7.1.c). Bei gefilterten Honigen war also noch ein großer Anteil der Proteine

vorhanden, daher konnten im nächsten Arbeitsschritt weitergehende Enzym- und

Proteinuntersuchungen durchgeführt werden.

Abb. 4.7.1.c: Proteinkonzentrationen verschiedener Honigsorten vor und nach Filtration


70

4.7.2. Gelchromatographie zur Trennung der Honigenzyme

Gelchromatographie (GPC), die auch als Gelpermeationschromatographie,

Gelfiltration oder Ausschlusschromatographie bezeichnet wird, ist die Bezeichnung

für eine als Säulenchromatographie durchgeführte Flüssigkeitschromatographie. Die

stationäre Phase besteht aus einem heteroporösen gequollenen Netzwerk (zum

Beispiel vernetztes Polyacrylamid oder Polystyrol), dessen Porengrößenverteilung

über mehrere Größenordnungen variiert. Die Fraktionierung erfolgt nach

Molekülgröße (Molekularsieb-Effekt). Eine Lösung des zu untersuchenden Polymers

wird durch das Gel gegeben, wobei kleinere Moleküle in alle Poren eindringen

können und ihnen daher das gesamte Volumen der mobilen Phase in der Trennsäule

zur Verfügung steht. Folglich werden sie länger in der Säule zurückgehalten als die

größeren Moleküle [YAU et al. (1979)].

Mittels GPC lassen sich demnach auch Proteine und Enzyme trennen, so dass es

sinnvoll erschien, für diesen Schritt auf eine solche Applikation zurückzugreifen. Ziel

war es, ein möglichst breites Spektrum von Proteinen und Enzymen des Honigs zu

erhalten, um zu überprüfen, ob bestimmte Substanzen aus dieser Gruppe durch eine

Filtration mehr beeinflusst werden als andere, so wie das schon bei den Aktivitäten

der Diastase und der Saccharase beobachtet worden war. In der GPC würde sich

dies dadurch ausdrücken, dass sich die Korrelationen von Peaks im

Chromatogramm nach Filtration im Vergleich zu denen ungefilterter Honige deutlich

verschieben würden.

Als Grundlage diente eine Methode von BERGNER & DIEMAIR (1975), die schon

auf ähnliche Weise Enzyme des Honigs isolieren konnten. Nach der Anreicherung

mittels Dialyse (48 h) erfolgte dort die Chromatographie an Sephadex G-200-Gel,

womit viele Proteine getrennt werden konnten, jedoch Diastase und Saccharase

zusammen in einem Peak eluierten. Ein Lauf dauerte dabei 24 - 28 h. Die

Abtrennung der Diastase gelang anschließend unter Verwendung von hydrophober

Wechselwirkungschromatographie [BERGNER & SABIR (1977)].

Bei der Methodenentwicklung für diese Arbeit fiel die Wahl des Gels für die

Chromatographie auf Toyopearl HW-55S ® der Firma Tosoh Bioscience. Es handelt

sich dabei um ein modifiziertes Methacrylat-Copolymer mit einer Partikelgröße von


71

30 µm. Die Porengröße beträgt 500 Å und die Ausschlussgrenze für Moleküle

150 kDa. Dies erschien ausreichend, da das größte im Honig bekannte

vorkommende Enzym, die Glucose-Oxidase, ein Molekulargewicht von 120 kDa

aufweist (vergleiche Kap. 2.2.3.3.). Die Partikel besitzen eine schwach polare

Oberfläche und lassen somit zusätzlich eine geringe Retention aufgrund

hydrophober Wechselwirkungen zu, was die Trennung von Diastase und Saccharase

begünstigen sollte.

Eine Aufkonzentrierung der Honigproben vor der Chromatographie war aufgrund der

geringen Proteinkonzentrationen notwendig (vergleiche Kap. 4.7.1.). Dazu wurden

Vivaspin 20 - 10.000 ®-Gefäße der Firma Sartorius eingesetzt (Abb. 4.7.2.a), die als

Zentrifugalkonzentratoren bezeichnet werden. Diese fassen ein Probenvolumen von

20 ml und besitzen eine Membran mit einem MWCO („Molecular Weight Cut-Off“)

von 10 kDa. Das heißt, Substanzen, die ein höheres Molekulargewicht als 10 kDa

haben, werden von der Membran zurückgehalten. Die Abtrennung der Proteine und

anderer größerer Komponenten von der Matrix erfolgte mittels Zentrifugation (20 –

30 min., abhängig von der Honigsorte) bei 4000 U/min. 20 ml der Honiglösung (1:1

mit Wasser) wurden dabei auf 3 ml eingeengt. Anschließend wurde das Gefäß

zweimal mit je 1 ml Wasser nachgespült. Es resultierte somit ein Volumen von 5 ml,

was eine Anreicherung um den Faktor 4 bedeutete. Dieses Retentat mit den

abgetrennten Proteinen wurde für die GPC eingesetzt. Die Probenschleife der GPC

betrug 2 ml, so dass mit jeder Probe zwei Injektionen möglich waren.

Als Eluent für die Gelchromatographie diente ein Phosphatpuffer (0,1 mol/l, pH 6,0),

detektiert wurde bei λ = 280 nm, da Proteine bei dieser Wellenlänge ein

Absorptionsmaximum aufweisen. Die Flussrate betrug 2 ml/min.

Abb. 4.7.2.a: Vivaspin 20 - 10.000 ®-Gefäß

(„Zentrifugalkonzentrator“)


72

4.7.2.1. Identifizierung der Honigenzyme Zunächst wurden Enzymstandards von Diastase, Saccharase und Glucose-Oxidase

chromatographiert. Die kommerziell erhältliche Saccharase (EC 3.2.1.26), die

üblicherweise aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae gewonnen wird, entspricht

jedoch nicht dem Typ, der im Honig vorkommt. Bei der Honigsaccharase handelt es

sich um eine α-Glucosidase (vergleiche Kap. 2.2.3.2.), während es sich bei

käuflichen Standards um β -Fructosidasen handelt, die also bei der Spaltung der

Saccharose die Fructose-Seite angreifen. Aus diesem Grund lässt sich deren

Enzymaktivität auch nicht mit der Siegenthaler-Methode (siehe Kap. 2.3.3.)

bestimmen [EDELHÄUSER (1983)].

Der Grund, dieses Enzym trotzdem einzusetzen, war, dass es ein Molekulargewicht

270 kDa besitzt und somit in der Säule nicht zurückgehalten wurde, da Moleküle, die

größer als 150 kDa sind, nicht in die Poren des Gels eindringen können (vergleiche

Kap. 4.7.2.). Dies diente somit als ein Parameter für die Qualität der Trennung, da es

noch vor der Glucose-Oxidase eluieren sollte. Weiterhin ließ sich damit zusätzlich die

Totzeit ermitteln, also die Zeit, die die mobile Phase braucht, um das

chromatographische System von der Injektion bis zur Detektion zu durchlaufen.

Es wurde zusätzlich eine Mischung von Glucose, Fructose und Saccharose in

Wasser vermessen. Diese Substanzen absorbieren sehr schwach bei 280 nm, in

hoher Konzentration können sie aber trotzdem erfasst werden. Um ein ausreichend

großes GPC-Signal zu erhalten, wurden Konzentrationen von je 1,5 g Glucose und

Fructose bzw. 0,3 g Saccharose in 20 ml hergestellt.

Aufgrund der geringen Größe der Saccharide im Vergleich zu den Proteinen war zu

erwarten, dass nach den Zuckern keine Makromoleküle mehr eluieren. Somit konnte

der Elutionsbereich der Eiweißfraktion der Honige im Chromatogramm eingegrenzt

werden.

In Abb. 4.7.2.1.a ist ein Chromatogramm einer Mischung von Saccharase, Glucose-

Oxidase, Diastase, Glucose, Fructose und Saccharose in Wasser abgebildet. Es

zeigte sich, dass die einzelnen Enzyme unter diesen Bedingungen voneinander und

von den Zuckern getrennt werden konnten. Das Peakmaximum der Saccharase lag

bei 10 min., das der Glucose-Oxidase bei 22 min., das der Diastase bei 33 min. Die

Zucker wurden hingegen erst zwischen der 40. und 50. min. eluiert.


73

Abb. 4.7.2.1.a: GPC-Chromatogramm von Saccharase (S), Glucose-Oxidase (G), Diastase (D) und den Zuckern Glucose, Fructose und Saccharose (Z) und die jeweiligen Konzentrationen in wässriger Lösung

Bei den Honigen wurden zunächst die nach 4.7.2. hergestellten Konzentrate

ungefilterter Proben chromatographiert. Die GPC-Chromatogramme eines Klee- und

eines Akazienhonigs sind in Abb. 4.7.2.1.b und c dargestellt.

Abb. 4.7.2.1.b: GPC-Chromatogramm eines amerikanischen Kleehonigs (ungefiltert) (Z = Zuckerpeak)

S G

D Z

Komponente Konzentration in H2O Saccharase 10 mg/25 ml

Glucose-Oxidase 5 mg/25 ml Diastase 20 mg/25 ml Glucose 1,5 g/25 ml Fructose 1,5 g/25 ml

Saccharose 0,3 g/25 ml

Z


74

Abb. 4.7.2.1.c: GPC-Chromatogramm eines rumänischen Akazienhonigs (ungefiltert) (Z = Zuckerpeak)

Zunächst wurde entsprechend der Standards auch bei den Honigen die Enzym- bzw.

Proteinfraktion eingegrenzt, indem die Retentionszeit der Zucker bestimmt wurde.

Das mutmaßliche zwischen ca. 40 - 50 min. auftretende Signal wies eine ähnlich

charakteristische Form auf wie der Standard von Glucose, Fructose und Saccharose

(leichtes Tailing) (vergleiche Abb. 4.7.2.1.a). Zur Bestätigung wurden die einzelnen

Peaks isoliert und mittels HPLC auf die Zuckerprofile untersucht (vergleiche Kap. 2.3.1.). Die Signale nach 40 - 50 min. zeigten Zuckerprofile, welche den jeweils

reinen Honigen entsprachen, während in den weiteren Fraktionen keine Zucker

gemessen wurden. Somit entsprach der Elutionsbereich von Zucker-

Standardlösungen dem von realen Honiglösungen.

Die GPC-Chromatogramme aller Honige wiesen vor den Zuckern vier Peaks auf. Es

galt nun, die jeweiligen Enzymaktivitäten zu identifizieren. Dazu wurden die

einzelnen Signale mittels Fraktionssammler aufgefangen und nach Einengen mit

Vivaspin 20 - 10.000 ® jeweils die Aktivitäten von Saccharase, Diastase und Glucose-

Oxidase untersucht. Dabei kamen die Methoden nach Kap. 2.3.3. zum Einsatz. Die

Bestimmung der Aktivität der Glucose-Oxidase wurde mit Hilfe von Peroxid-

Teststäbchen vorgenommen, jedoch gelang damit lediglich eine qualitative Aussage

(positiv/negativ) (Methode siehe Kap. 5.2.5.1.).

Z


75

Aktivität Honig (Bsp.) Saccharase Diastase

Kleehonig 104 30 (Abb. 4.7.2.1.b) Akazienhonig 23 8,5

(Abb. 4.7.2.1.c)

Tab. 4.7.2.1.e: Aktivitäten von Saccharase und Diastase des Klee- und des Akazienhonigs aus Abb. 4.7.2.1.b bzw. c

Abb. 4.7.2.1.d zeigt beispielhaft die Fraktionierung des Kleehonigs aus

Abb. 4.7.2.1.b und die Enzymaktivitäten der jeweiligen Peaks (Tabelle). Die

Aktivitäten der Diastase sind in Schade-Einheiten, die der Saccharase als Hadorn-

Zahlen angegeben.

Abb. 4.7.2.1.d: Chromatogramm des Kleehonigs (vergl. Abb. 4.7.2.1.b): Fraktionierung der Proteinsignale 1 - 4 (blaue Striche) (Z = Zuckerpeak) und die Ergebnisse der Untersuchungen der Enzymaktivitäten in den einzelnen Fraktionen Die Glucose-Oxidase konnte demnach dem Peak Nr. 2 zugeordnet werden. Die

Retentionszeit stimmte mit der des Standards überein (siehe Abb. 4.7.2.1.a).

Gleiches galt für die Diastase: Peak Nr. 4 zeigte eine hohe Aktivität, und das

Peakmaximum lag bei dem des Standard-Enzyms.

Die Saccharase konnte aufgrund der Aktivität dem Peak Nr. 3 zugeordnet werden.

Peak Nr. 1 zeigte keine Aktivität für eines der drei Enzyme.

Weiterhin war ein unmittelbarer Zusammenhang zwischen den Signalhöhen von

Diastase und Saccharase im GPC-Chromatogramm und den korrespondierenden

Enzymaktivitäten der ursprünglichen Honige zu erkennen. Honige mit hohen

Aktivitäten wiesen entsprechend große Signale auf, bei geringen Aktivitäten fielen

diese kleiner aus. Dies ist beispielhaft in Tab. 4.7.2.1.e dargestellt.

Aktivität

Peak-Nr. Glucose-Ox. Diastase Saccharase

1 neg. - - 2 pos. - 2,4 3 neg. 2,1 135,5 4 neg. 16,7 8,1 Z neg. 0,4 -

Z (45 min.)

4 (32 min.)

2 (23 min.)

3 (29 min.)

1 (17 min.)


76

Es war bei den Chromatogrammen bereits optisch zu erkennen, dass mit der

Methode keine Basislinientrennung aller Komponenten erreicht wurde. Die Verteilung

der Enzymaktivitäten von Diastase und Saccharase bei den Peaks Nr. 2 - 4 belegte

dies, denn deren Aktivitäten waren über jeweils drei Signale verteilt.

Es kam folglich zu leichten Überlagerungen von Glucose-Oxidase, Saccharase und

Diastase. Es war ebenso nicht auszuschließen, dass zusätzliche Komponenten zu

weiteren Überlagerungen führten.

Die Trennung wurde aber als ausreichend befunden, um Differenzen zwischen

gefilterten und ungefilterten Honigen anhand von GPC-Chromatogrammen

feststellen zu können.

4.7.2.2. Vergleich gefilterter und ungefilterter Honige

Im nächsten Schritt wurden gefilterte Honige gemessen und die Chromatogramme

mit denen der ungefilterten Proben verglichen. In Abb. 4.7.2.2.a sind als Beispiel die

Chromatogramme des ungefilterten Kleehonigs aus Abb. 4.7.2.1.b und des

gefilterten Analogons gegenübergestellt.

Abb. 4.7.2.2.a: GPC-Chromatogramme des ungefilterten (links) und des gefilterten Kleehonigs (rechts) (G = Glucose-Oxidase, S = Saccharase, D = Diastase, Z = Zucker)

Dabei war vor allem die verhältnismäßig starke Abnahme jenes Peaks auffällig,

welcher der Saccharase zugeordnet werden konnte, während sich die Größe des

Diastase-Peaks nur wenig verändert hatte. Dies bestätigte die Beobachtungen der

Analytik der Enzymaktivitäten (siehe Kap. 4.6.8. und 4.6.9.). Auch weitere Signale

waren nach Filtration deutlich reduziert, wohingegen bei den Peaks, die hinter den

Proteinen auftraten, kaum Verschiebungen zu beobachten waren.

Z

D

S

G

D

S

G

Z


77

Diese Beobachtungen bestätigten sich nach Vergleichsuntersuchungen von

insgesamt 20 gefilterten und ungefilterten Honigproben.

Bei einer Minderung der Saccharaseaktivität von 90 % (vergleiche Kap. 4.6.9.) nach

Filtration sollte jedoch auch die Reduzierung des entsprechenden Signals in der

GPC wesentlich ausgeprägter sein. Die Abnahme fiel dafür jedoch zu gering aus.

Dies kann zwei Ursachen haben. Eine Erklärung wäre, dass die Saccharase nach

Filtration zwar inaktiv ist, wenn zum Beispiel die Quartärstruktur des Proteins

verändert wäre, das Enzym aber als solches noch vollständig vorhanden ist. Somit

würde das Molekulargewicht und damit auch der Peak in der GPC unverändert

bleiben. Ein weiterer Grund kann eine Überlagerung der Saccharase mit anderen

Proteinen bzw. Makromolekülen sein.

4.7.2.3. Zusammenfassung der Ergebnisse der GPC Die gelchromatographische Methode zur Trennung von Honigenzymen von

BERGNER & DIEMAIR bzw. BERGNER & SABIR (siehe Kap. 4.7.2.) wurde

hinsichtlich Dauer und Trennschärfe optimiert. Saccharase und Diastase konnten in

einem Lauf getrennt werden. Der Zeitraum einer Messung wurde von mehr als 24 h

auf 90 min. reduziert, der der Probenvorbereitung (Aufkonzentrierung) sogar von

48 h auf maximal 30 min. Somit konnte bei gleichem apparativem Aufwand eine

Vielzahl von Proben vergleichsweise schnell gemessen werden.

Die Gelchromatographie von ungefilterten Honigen zeigte, dass in der Fraktion der

Proteine und Enzyme, also vor den Zuckern, vier Peaks im Chromatogramm

auftraten, von denen drei den Enzymen Glucose-Oxidase, Saccharase und Diastase

zugeordnet werden konnten. Allerdings traten Koelutionen weiterer Makromoleküle

auf.

Untersuchungen filtrierter und nicht filtrierter Honige ergaben, dass mit dieser

Analysentechnik prinzipiell Unterschiede herausgestellt werden konnten. Mittels

direkter Vergleiche der Chromatogramme konnten gefilterte und ungefilterte Proben

differenziert werden. Allein aufgrund der unterschiedlichen Signalhöhen in den

Chromatogrammen ließ sich jedoch eine Filtration noch nicht beweisen, vor allem


78

nicht in Mischungen, denn ungefilterte Honige mit natürlichen geringen

Enzymaktivitäten hätten kleinere Signale aufweisen können als gefilterte Honige,

deren Aktivitäten vor Filtration sehr hoch waren.

Da das Signal der Saccharase bei gefilterten Honigproben allerdings deutlich

weniger reduziert wurde, als es die Messungen der Enzymaktivitäten erwarten

ließen, war zu vermuten, dass dieses Enzym noch weiterhin im Honig vorhanden

war. Es sollte nun aufbauend auf diesen Erkenntnissen eine Methode etabliert

werden, mit der das Proteinspektrum der Saccharase dargestellt wird. Es konnte

angenommen werden, dass so Unterschiede vor und nach Filtration signifikanter

herausgearbeitet werden könnten. Als geeignete Methode wurde die Elektrophorese

ausgewählt.

4.7.3. Elektrophorese

Die zwei wichtigsten physikalisch-chemischen Eigenschaften der Proteine, nämlich

Molekülgröße und Ladungszustand, werden überwiegend zu ihrer Trennung und

Charakterisierung verwendet, wobei elektrophoretische Trennmethoden eine

wichtige Stellung einnehmen.

Unter dem Begriff Elektrophorese werden Trennverfahren zusammengefasst, die die

Wanderung geladener Teilchen in einem elektrischen Gleichstromfeld ausnutzen.

Man unterscheidet trägerfreie und trägergebundene Elektrophoresesysteme, wobei

die trägergebundenen Systeme weit mehr verbreitet sind. Die wichtigsten

Trägermaterialien für die sogenannte Gelelektrophorese sind unter anderem Stärke,

Agarose sowie Polyacrylamid, wobei letzteres weitaus am meisten für die

Gelelektrophorese von Proteinen verwendet wird. Die Polyacrylamid-

Gelelektrophorese wird als „PAGE“ abgekürzt. Bei der Gelelektrophorese werden die

einzelnen Substanzen nicht durch ihre unterschiedlichen Ladungen getrennt,

sondern durch einen Siebeffekt des Gels aufgrund der unterschiedlichen Größe und

Gestalt des Probenmaterials. Der Siebeffekt eines Polyacrylamidgels hängt von der

Porengröße ab, welche sich exakt und reproduzierbar verändern lässt.

Standardmäßig wird die SDS-PAGE zur Trennung von Proteingemischen eingesetzt.

SDS („Sodium dodecyl sulfate“) ist ein anionisches Detergenz, welches die


79

Eigenladung von Proteinen so effektiv überdeckt, dass Micellen mit konstanter

negativer Ladung pro Masseneinheit entstehen (1,4 g SDS pro 1 g Protein). Bei der

Probenvorbereitung werden die Proben mit einem Überschuss von SDS auf 95 °C

erhitzt und so die Sekundär- und Tertiärstrukturen durch Aufspalten der

Wasserstoffbrücken und durch Streckung der Moleküle aufgelöst.

Disulfidbrückenbindungen werden durch Zugabe einer reduzierenden

Thiolverbindung, zum Beispiel β-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol (DTT),

aufgespalten (Auflösen der Quartärstruktur). Dadurch wird gewährleistet, dass nur

die molare Masse des Proteins als Trennkriterium wirkt. Bei der SDS-Elektrophorese

wandert der SDS-Protein-Komplex im elektrischen Feld zum Plus-Pol [KLEINERT

(1990), SCHWEDT (1992)].

Üblichweise wird zur Bestimmung von Polypeptiden und Proteinen die Methode nach

LAEMMLI (1970) in einem diskontinuierlichen Tris-HCl/Tris-Glycin Puffersystem

genutzt (Tris: Tris(hydroxymethyl-)aminomethan). Ein weitporiges Sammelgel (Tris-

Glycin-Puffer pH 6,8; 3 - 4 % Acrylamid) überschichtet ein engmaschiges Trenngel

(Tris-Glycin-Puffer pH 8,8, 5 – 20 % Acrylamid). Der pH-Wert des Sammelgels liegt

sehr nahe am isoelektrischen Punkt von Glycin. Dadurch hat Glycin zu Beginn der

Trennung eine sehr niedrige elektrophoretische Mobilität (Folgeion). Die Chloridionen

in den Puffern haben hingegen eine sehr hohe Mobilität (Leitionen). Die Mobilität der

Proteine liegt zwischen den Folgeionen und Leitionen. Beim Anlegen des

elektrischen Feldes beginnen in diesem diskontinuierlichen System alle Ionen mit der

gleichen Geschwindigkeit zu wandern. Im Bereich der Leitionen stellt sich eine

niedrige Feldstärke ein, wohingegen im Bereich der Ionen mit niedriger Mobilität die

Feldstärke sehr hoch ist. Somit befinden sich die Proteine in einem

Feldstärkegradienten und bilden während der Elektrophorese einen Stapel in der

Reihenfolge ihrer Mobilitäten („Stacking-Effekt“). Dadurch erfolgt eine Vortrennung

und Aufkonzentrierung der einzelnen Proteinklassen beim Start. Beim Auftreffen auf

das Trenngel erfahren die Proteine einen hohen Reibungswiderstand und es gibt

einen „Stau“, was zur weiteren Zonenschärfung führt. Das niedermolekulare Folgeion

Glycin wird dadurch nicht beeinflusst und überholt die Proteine. Im Trenngel wirkt

nun auf alle Proteine die gleiche Feldstärke, und ausschließlich die Größe ist für die

Wandergeschwindigkeit ausschlaggebend.


80

4.7.3.1. Elektrophorese von Saccharasefraktionen

Eine Möglichkeit der elektrophoretischen Trennung von Honigproteinen wurde von

MARSHALL & WILLIAMS (1987) beschrieben. Sie nutzten die SDS-PAGE

zusammen mit der Färbetechnik Silver Staining zur Sichtbarmachung der

Proteinbanden. Dabei wurden die reinen Honige mit Laemmli-Puffer und β-

Mercaptoethanol versetzt, für wenige Minuten auf 95 °C erhitzt und nach Abkühlung

direkt zur Elektrophorese eingesetzt. Es zeigte sich, dass die Verwendung von Gelen

sinnvoll war, welche die Trennung von 10 bis 200 kDa ermöglichten, da die

Hauptbanden der Honigproteine in diesem Bereich lagen.

Diese Methode wurde aufgegriffen, um das Proteinspektrum der

Saccharasefraktionen von Honigen aus der GPC zu charakterisieren.

Die entsprechenden GPC-Isolate wurden zur Anreicherung der Proteine mittels

Zentrifugalkonzentratoren auf ein definiertes Volumen von 1 ml eingeengt, um für

eine spätere Quantifizierung einheitliche Bedingungen zu erhalten. Anschließend

erfolgte die Denaturierung der Proteine analog zu MARSHALL & WILLIAMS, indem

100 µl des Konzentrates mit 50 µl Roti Load ® (Firma Carl Roth) gemischt wurden,

welches Laemmli-Puffer und β-Mercaptoethanol enthielt. Das Gemisch wurde erhitzt,

und genau 20 µl der Probenlösung wurden für die Elektrophorese eingesetzt


Um später eine näherungsweise Molekulargewichtsbestimmung der Proteinbanden

vornehmen zu können, wurde auf einer Spur des Gels ein Marker mit definierten

Proteinen aufgetragen. Zu diesem Zweck diente Roti Mark Standard ® (Carl Roth),

welcher aus sieben Proteinen von 14,5 kDa bis 200 kDa besteht und somit den

geforderten Größenbereich abdeckte.

Als Gel wurde Ready Gel 4-20 % Tris HCl ® von der Firma Bio-Rad verwendet. Es

handelt sich dabei um ein Gradientengel mit einem Anteil an Acrylamid von 4 bis

20 %. Dies ermöglicht eine Auftrennung von hoch- und niedermolekularen Proteinen

auf einem Gel in dem Bereich, der bei diesen Proben erforderlich war. Der Anteil an

Acrylamid im Gel ist deshalb bedeutend, da eine zu hohe Konzentration dazu führt,

dass Substanzen mit einem hohen Molekulargewicht ausgeschlossen werden,


81

wohingegen zu wenig Acrylamid den Siebeffekt abschwächen kann [HJERTÉN

(1963)].

Die Pufferlösung für die Elektrophorese bestand aus 10 x Tris/Glycin/SDS-Puffer ®

(Bio-Rad) in Wasser. Bei einer Spannung von 200 V betrug die Dauer der

Elektrophorese 45 min.

Anstatt Silver Staining wurde bei dieser Arbeit auf die Coomassie-Färbetechnik

zurückgegriffen. Silver Staining besitzt zwar eine wesentlich niedrigere

Nachweisgrenze, hat aber die Nachteile, dass diese Methode umständlich zu

handhaben, schwer reproduzierbar und nicht quantifizierbar ist, da verschiedene

Proteine mit unterschiedlicher Intensität gefärbt werden [REHM (2006)].

Daher kam der Farbstoff Coomassie Brillant Blue R-250 zum Einsatz (siehe hierzu

Kap. 4.7.1. und Abb. 4.7.1.b). Die Nachweisgrenze liegt dabei bei 100 ng pro

Bande. Das Gel wurde dazu nach Beendigung des Elektrophoresevorgangs in eine

Eisessig-haltige Fixierlösung gegeben, da der Coomassie-Farbstoff nur im sauren

Milieu an die Proteine binden kann. An den Färbevorgang schloss sich eine

Entfärbung an, wodurch der Background des Gels gering gehalten wurde und die

Proteinbanden deutlicher hervortraten.

Zur Dokumentation wurden die frisch entfärbten Gele mit einer CCD-Kamera

fotografiert, um die Farbechtheit zu gewährleisten und Ausbleichungen zu

verhindern.

In Abb. 4.7.3.1.a ist das Schema der Elektrophorese von Saccharasefraktionen

dargestellt, Abb. 4.7.3.1.b zeigt die Elektrophorese-Apparatur (Mini-PROTEAN III

Cell ®, Firma Bio-Rad) mit Spannungsquelle.


82

Abb. 4.7.3.1.b: Elektrophorese-Apparatur mit Spannungsquelle

Abb. 4.7.3.1.a: Schema der Elektrophorese zur Untersuchung der Proteine von Saccharase-fraktionen der Honige aus der GPC

4.7.3.2. Ergebnisse der Elektrophorese

Elektrophorese ungefilterter Honige

Die elektrophoretischen Untersuchungen der Saccharasefraktionen von Sorten- und

polyfloralen Honige zeigten, dass grundsätzlich zwei dominierende Banden auftraten.

Es handelte sich dabei um Proteine mit den Molekulargewichten von ca. 65 kDa und

40 kDa, wobei letztere über einen größeren Molekulargewichtsbereich verlaufen war.

Die Proben wiesen auch weitere Banden auf, diese waren jedoch nicht bei allen


83

Abb. 4.7.3.2.a: Elektrophorese der Saccharasefraktionen verschiedener Sortenhonige (1: Proteinmarker, 2: Klee, 3: Wald, 4: Linde, 5: Akazie)

Honigen, und wenn, dann nur schwach zu erkennen. Die Bandenspektren

unterschieden sich insgesamt trotz unterschiedlicher Trachtursprünge aber kaum

voneinander, was zu erwarten war aufgrund der Tatsache, dass die Saccharase der

Biene und nicht der Pflanze entstammt (siehe Kap. 2.2.3.2.).

Abb. 4.7.3.2.a zeigt das Bild eines frisch entfärbten Gels von Saccharasefraktionen

verschiedener Sortenhonige. Die tiefblauen Felder stellen die Proteinbanden da. Mit

Hilfe des Proteinmarkers (Spur 1) erfolgte die näherungsweise Zuordnung der

Molekulargewichte.

Die Farbintensitäten der beiden genannten Hauptbanden korrelierten dabei ungefähr

mit den Saccharaseaktivitäten der jeweiligen Honige: Der Waldhonig (Hadornzahl

113) wies die am stärksten ausgeprägten Banden auf, der Akazienhonig (23) die am

schwächsten. Es war weiterhin auffällig, dass ein Zusammenhang zwischen den

beiden Hauptbanden existierte: Intensiv gefärbte 65 kDa-Banden gingen mit

ebenfalls intensiven 40 kDa-Banden einher. Somit war anzunehmen, dass beide

Proteine denselben Ursprung haben und von der Saccharase abstammten.


84

Neben den Saccharasefraktionen wurden auch reine Honige elektrophoretisch

untersucht, um die Gelbilder zu vergleichen. Dazu wurden die wässrigen

Honiglösungen in der gleichen Weise wie die GPC-Isolate aufgearbeitet. Dies

entsprach der Methode, die bereits MARSHALL & WILLIAMS nutzten.

Die Bandenspektren stimmten mit den Ergebnissen von MARSHALL & WILLIAMS

überein. Es stellte sich allerdings heraus, dass die Verwendung des reinen Honigs

Schwierigkeiten bereitete, da zum einen Substanzen aus der Honigmatrix einen

deutlich stärkeren Background auf dem Gel erzeugten und zum anderen die weiteren

Honigproteine zu Überlagerungen führten, was eine Auswertung erheblich

erschwerte (Beispiel siehe Abb. 4.7.3.2.b). Da bei den Saccharasefraktionen viele

Stoffe, wie zum Beispiel Proteine anderer Enzyme und die Zucker, zum größten Teil

abgetrennt waren (vergleiche Kap. 4.7.2.1.), hoben sich die so erzeugten Banden

stärker ab, was sich auch für eine spätere Quantifizierung als Vorteil erwies.

Abb. 4.7.3.2.b: Elektrophorese eines amerikanischen polyfloralen Honigs: Saccharasefraktion (links) und reiner Honig (rechts)

Elektrophorese gefilterter Honige

In Abb. 4.7.3.2.c ist beispielhaft die Elektrophorese von Saccharasefraktionen

filtrierter Honige dargestellt. Es fiel auf, dass die 65 kDa-Bande nahezu

verschwunden war, während sich die Intensität der 40 kDa-Bande nicht verändert

hatte. Es fand also offensichtlich eine selektive Beeinflussung des Proteinspektrums

in der Saccharasefraktion durch den Filtrationsprozess statt.


85

Abb. 4.7.3.2.c: Elektrophorese verschiedener filtrierter Honige (1: Proteinmarker, 2: Klee, 3: Wald, 4: Linde, 5: Akazie)

Es war folglich mittels dieser Analysentechnik möglich, filtrierte und unfiltrierte

Honige optisch eindeutig zu differenzieren.

4.7.3.3. Zumischungen von gefilterten zu ungefilterten Honigen

Im nächsten Schritt sollte durch Zumischversuche geklärt werden, ob die 65 kDa-

Bande schwächer wird, je mehr filtrierter Honig im Erzeugnis vorhanden ist. Dazu

wurden gefilterte und ungefilterte Honige in bestimmten Verhältnissen vermengt und

die resultierenden Proben auf die gleiche Weise untersucht.

Ein Beispiel dieser Zumischversuche ist in Abb. 4.7.3.3.a exemplarisch

dokumentiert. Hier wurde einem naturreinen Kleehonig vor der Untersuchung

filtrierter Blütenhonig beigemischt, und zwar zu 25, 50 bzw. 75 %. Die

vorhergehenden Beobachtungen bestätigten sich bereits visuell: Mit höheren

Zumischungsgraden des filtrierten Honigs nahm die Intensität der 65 kDa-Bande ab.


86

Abb. 4.7.3.3.a: Elektrophorese von Beimischungen (A: Kleehonig, unfiltriert, B: Blütenhonig, filtriert, sowie Zumischungen des filtrierten Honigs zu 75, 50 und 25 %)

Demnach ist es mittels Kopplung von Gelchromatographie und Elektrophorese

möglich, über die Farbintensitäten der beiden Hauptbanden filtrierten Honig in

unfiltrierten Honigen nachzuweisen.

Zur exakten Ermittlung des Anteils von filtriertem Honig in einer Mischung mussten

die Intensitäten der Proteinbanden nun in Zahlenwerten ausgedrückt werden.

4.7.3.4. Densitometrische Auswertung

Eine Möglichkeit der quantitativen Auswertung von Gelbildern in der Elektrophorese

ist die Densitometrie (Farbdichtemessung).

Für die densitometrische Auswertung wurde die Software Gelscan 5.1 ® der Firma

BioSciTec genutzt. Das Foto des Gels wurde in Gelscan eingelesen und dort in

Graustufen dargestellt. Die Erkennung der Banden erfolgte zunächst automatisch.

Die für die Quantifizierung nicht benötigten Banden wurden daraufhin manuell

eliminiert. Die Molekulargewichte des Proteinmarkers wurden definiert, anschließend

erfolgte die automatische Berechnung der Molekulargewichte der Probenbanden. Die

eigentliche Quantifizierung wurde dann derart vorgenommen, dass den Pixeln in


87

Abb. 4.7.3.4.a: Gelbild von BSA-Lösungen in den Konzentrationen 0,3 mg/ml (2) – 0,6 mg/ml (3) – 0,9 mg/ml (4) – 1,2 mg/ml (5) – 1,5 mg/ml (6) – 1,8 mg/ml (7) – 2,1 mg/ml (8) und 2,4 mg/ml (9) (1: Proteinmarker)

einer Bande Farbwerte nach dem binären System zugeordnet wurden (0 - 255). Je

dunkler die Farbe war, desto höher lag der Wert. Die einzelnen Farbwerte wurden

mit deren Häufigkeit in der jeweiligen Bande multipliziert. Anschließend wurde der

Background des Gels abgezogen, der durch Grundfärbung und auch durch

angefärbte weitere Probenbestandteile hervorgerufen wurde. Es resultierte der

dimensionslose Farbdichtewert der Proteinbande.

Es musste im ersten Schritt geprüft werden, ob die Quantifizierung überhaupt mit

ausreichender Güte vorgenommen werden konnte, also ob eine lineare Abhängigkeit

zwischen Proteinkonzentration und Farbdichtewert bestand. Dazu wurden je 10 µl

Standardprotein-Lösungen von BSA (Bovine Serum Albumine) in Wasser mit

aufsteigenden Konzentrationen von 0,3 bis 2,4 mg/ml auf das Gel aufgetragen, und

nach beendeter Elektrophorese und Färbung wurden mittels Gelscan die

Farbdichtewerte ermittelt. Abb. 4.7.3.4.a zeigt das Gelbild einer Messung von BSA-

Standards mit unterschiedlichen Konzentrationen.


88

Abb. 4.7.3.4.b: Gelbild der BSA-Standards und die Molekulargewichte der identifizierten Banden in Gelscan

Im Folgenden wird die Auswertung anhand der Messungen des BSA-Standards

demonstriert. In Abb. 4.7.3.4.b ist das in Gelscan eingebundene Bild mit den

bestimmten Molekulargewichten dargestellt.

Die Proteinbanden mit den Molekulargewichten von ca. 60 und ca. 40 kDa wurden in

diesem Fall zur Kalkulation der Farbdichtewerte herangezogen. Als Ergebnis erhält

man eine tabellarische Auflistung der Messwerte, die in Tab. 4.7.3.4.c aufgeführt

sind. In den jeweiligen Spalten sind folgende Informationen zu finden:

- „Lane“: Nr. der Probenspur (Lane 1 ist im Allgemeinen der Proteinmarker)

- „Band“: Proteinbande, die zur Quantifizierung genutzt wird

- „Height“: höchster Farbwert in der jeweiligen Bande

- „AID“: „Absolute integrated density“: berechneter Farbdichtewert mit

Background

- „IBG“: „Integrated background“: Anteil des Backgrounds vom Farbdichtewert

- „DID“: „Differential integrated density“: Farbdichtewert mit abgezogenem

Background

- „% DID”: Anteil an der Gesamtheit der Banden

- „RF“: „Rate of flow“: Strecke, die ein Protein auf dem Gel zurückgelegt hat

- „Mol. Weight“: berechnetes Molekulargewicht (in kDa)


89

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

0 5 10 15 20 25 30

Konzentration BSA-Standard

Farb

dich

tew

ert 6

0 kD

a-B

ande

Abb. 4.7.3.4.d: Linearitäten des AID und des DID der Bande 60 kDa der BSA-Standard-Lösungen

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

0 5 10 15 20 25 30

Konzentration BSA-Standard

Farb

dich

tew

ert 4

0 kD

a-B

ande

Abb. 4.7.3.4.e: Linearitäten des AID und des DID der Bande 40 kDa der BSA-Standard-Lösungen

Tab. 4.7.3.4.c: Tabellarische Aufstellung der Messwerte der BSA-Standardlösungen nach Auswertung mit Gelscan

Der AID und der DID stellen also die Farbdichtewerte der jeweiligen Bande dar. Es

sollte nun geprüft werden, ob mit linear zunehmender Konzentration der BSA-Lösung

auch der AID bzw. der DID linear ansteigen. Abb. 4.7.3.4.d und e zeigen die

Regressionsgeraden der beiden Banden. Die Linearität war mit

Korrelationskoeffizienten von 0,98 (AID) bis 0,99 (DID) ausreichend, so dass auch

die Quantifizierung der Proteinbanden der Honigproben angegangen werden konnte.

Lane Band Height AID IBG DID % DID RF Mol.Weight 1 1 86 581 553 28 2,5 33 200,0 2 103 818 738 80 7,1 70 119,0 3 129 1197 979 218 19,3 108 64,0 4 123 1436 1235 201 17,8 143 43,0 5 148 1292 1067 225 19,9 189 29,0 6 134 1146 990 156 13,8 227 20,0 7 147 1222 1000 222 19,6 257 14,5 2 1 158 1649 1218 431 92,9 116 59,2 2 104 784 651 33 7,1 153 40,0 3 1 175 2213 1530 683 90,9 120 56,8 2 115 923 855 68 9,1 154 39,7 4 1 177 2669 1800 869 88,4 122 55,6 2 121 1034 920 114 11,6 154 39,7 5 1 177 3013 2001 1012 90,1 122 55,6 2 123 1115 940 135 9,9 153 40,0 6 1 179 3506 2275 1231 86,9 122 55,6 2 138 1253 1067 186 13,1 152 40,3 7 1 181 3724 2366 1358 89,5 122 55,6 2 137 1378 990 218 10,5 151 40,6 8 1 181 4100 2511 1525 87,3 122 55,6 2 141 1489 1164 298 12,7 150 40,9 9 1 180 4425 2484 1716 88,0 118 58,0 2 138 1625 1078 325 12,0 147 41,8


90

Die Berechnung der Farbdichtewerte der Proteinbanden aus den

Saccharasefraktionen der Honigproben wird am Beispiel des Kleehonigs, des

filtrierten Blütenhonigs und der Zumischungen aus Abb. 4.7.3.3.a dargelegt. Abb. 4.7.3.4.f zeigt das Gelbild mit den markierten Banden, die zur Quantifizierung

herangezogen wurden. In Abb. 4.7.3.4.g sind die Molekulargewichte der beiden

Hauptbanden mittels Gelscan berechnet. In Tab. 4.7.3.4.h sind die einzelnen

Messwerte für diese Proben aufgelistet.

Lane Band Height AID IBG DID % DID RF Mol.Weight

2 (=A) 1 170 3273 2153 1120 25,5 109 63,4

2 182 10274 6994 3280 74,5 151 43,0

3 (=B) 1 122 747 662 85 2,7 98 73,9

2 178 8571 5559 3012 97,3 139 42,7

4 (=75 %) 1 128 1348 1223 125 3,9 98 65,1

2 172 7965 4893 3072 96,1 136 43,4

5 (=50 %) 1 151 2167 1913 254 6,8 101 63,1

2 181 10007 6542 3465 93,2 138 43,0

6 (=25 %) 1 145 2558 2196 362 9,6 101 63,1

2 177 8862 5454 3408 90,4 141 42,4

Abb. 4.7.3.4.h: Tabellarische Aufstellung der Messwerte der Honigproben aus Abb. 4.7.3.3.a nach Auswertung mit Gelscan (rot markiert: Änderungen des DID bei der 65 kDa-Bande)

Bande

Abb. 4.7.3.4.f: unfiltrierter Kleehonig (A), filtrierter Blütenhonig (B) sowie Beimischungen von B in A zu 25, 50 bzw. 75 % (1: Bande 65 kDa, 2: Bande 40 kDa)

Abb. 4.7.3.4.g: Auswertung mittels Gelscan: Berechnung der Molekulargewichte der Banden

1

2


91

Die Ergebnisse der Auswertung bestätigten die vorherigen Beobachtungen: Die

Probe nach Filtration wies sowohl beim AID als auch beim DID einen deutlich

geringeren Farbdichtewert bei der 65 kDa-Bande auf als bei der unfiltrierten Probe,

während die Werte für die 40 kDa-Bande relativ konstant blieben. Somit ließ sich an

der Veränderung der Bandenverhältnisse nicht nur erkennen, ob ein filtrierter Honig

vorlag, auch ein Zusatz von filtriertem zu unfiltriertem Honig war in diesem Beispiel

detektierbar.

Es zeigte sich, dass zur Bewertung der Befunde der DID herangezogen werden

sollte, da hierbei der Background nicht in die Berechnungen mit einbezogen wurde

und somit der DID deutlich konstantere Werte für die 40 kDa-Bande lieferte als der

AID. Dies konnte bereits bei der Auswertung der BSA-Standardlösungen festgestellt

werden, denn auch hier war der Korrelationskoeffizient des DID etwas höher als der

des AID.

4.7.3.5. Methodenvalidierung

Es mussten im nächsten Schritt die Parameter untersucht werden, die belegen, dass

diese Methode generell geeignet ist, gefilterte Honige auch in Mischungen zu

erkennen. Die Grundlage zur Ermittlung der Verfahrenskenndaten bildete die Arbeit

von KROMIDAS (1999).

Reproduzierbarkeit:

Um die Reproduzierbarkeit der Methode zu prüfen, wurden zwei ungefilterte Honige

jeweils viermal unter Wiederholbedingungen aufgearbeitet und elektrophoretisch auf

zwei Gelen untersucht. Als Honigproben wurden ein Akazienhonig (geringe

Saccharaseaktivität) und ein Waldhonig (hohe Saccharaseaktivität) ausgewählt.

Die absoluten Farbdichtewerte des Waldhonigs waren wie erwartet deutlich höher als

die des Akazienhonigs, wobei sich die Verhältnisse der 40 kDa- und der 65 kDa-

Banden relativ konstant verhielten. Die jeweiligen Farbdichtewerte aller Messungen

wiesen mit durchschnittlich 8 % geringe Standardabweichungen auf, demnach besaß

die Methode eine hohe Wiederholpräzision und war somit gut reproduzierbar

(Durchführung und Ergebnisse siehe Kap. 5.2.7.).


92

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 20 40 60 80 100 120

Verhältnis 40 kDa zu 65 kDa

Zum

isch

ungs

grad

[%]

Abb. 4.7.3.5.a: Linearität der Bandenverhältnisse bei Zumischung eines filtrierten Blütenhonigs zu einem Kleehonig (Korrelationskoeffizient 0,98)

Linearität:

Es wurde geprüft, ob die Verhältnisse der 40 kDa- und der 65 kDa-Bande mit

steigenden Zumischungsgraden filtrierten Honigs linear zunehmen. Dazu wurden

fünf verschiedenen ungefilterten Sorten- und polyfloralen Honigen gefilterte Honige in

den Verhältnissen 25 %, 50 % und 75 % beigemischt und deren Saccharase-

fraktionen aus der GPC elektrophoretisch untersucht (Durchführung siehe Kap. 5.2.7.).

Mit einem durchschnittlichen Korrelationskoeffizienten von 0,98 wurde die Forderung

nach ausreichender Linearität erfüllt. In Abb. 4.7.3.5.a ist exemplarisch die

Regressionsgerade von Messungen einer Zumischung filtrierten Blütenhonigs zu

einem Kleehonig dargestellt.

Robustheit – Aufkonzentrierungen der Saccharasefraktionen:

Es wurde geprüft, inwieweit sich unterschiedliche Verdünnungsstufen einer

Saccharasefraktion auf die Bandenverhältnisse auswirken. Die Ermittlung dieses

Parameters war aus dem Grund wichtig, da die Einengung der Eluate nach der

Gelchromatographie mittels der Zentrifugalkonzentratoren nur recht ungenau

vorgenommen werden konnten.

Dazu wurden bei drei unfiltrierten Honigproben je fünf Verdünnungsstufen der

Saccharasefraktion erstellt und elektrophoretisch untersucht (siehe Kap. 5.2.7.). Abb. 4.7.3.5.b zeigt am Beispiel eines Kleehonigs, dass die Farbdichtewerte wie


93

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0 1 2 3 4 5 6

Verdünnungsstufe

Farb

dich

tew

ert

Abb. 4.7.3.5.b: Area-Werte der Banden (rot: 65 kDa, grün: 40 kDa) bei unterschiedlichen Verdünnungen eines Kleehonigs

erwartet zwar abnahmen, die Verhältnisse in den jeweiligen Verdünnungen jedoch

konstant blieben.

Robustheit - Ausschluss von Hitzeeinfluss

Obwohl die gefilterten Honige von unterschiedlichen Lieferanten stammten (siehe

Kap. 4.5.), bei denen vermutlich auch jeweils unterschiedliche Filtrationsparameter

zum Einsatz kamen, zeigten alle Proben hinsichtlich des Verlustes der

Saccharaseaktivität bzw. des Verschwindens der 65 kDa-Bande das gleiche Bild.

Trotzdem galt die Frage zu klären, ob dieser Effekt mit dem Hitzeeinfluss während

des Filtrationsprozesses zu begründen war, welcher generell gegeben ist. Die

Überprüfung dieses Faktors war aufgrund der Hitzeempfindlichkeit der Saccharase

von großer Wichtigkeit (siehe Kap. 2.2.3.2.). Wäre allein die Wärmezufuhr für das

Verschwinden des 65 kDa-Proteins verantwortlich, so wäre die erarbeitete Methode

kein garantierter Nachweis für eine vorherige Filtration, denn auf den Honig kann

Hitze in vielfältiger Weise einwirken, beispielsweise beim Transport oder den

großtechnischen Abfüllvorgängen.

Zur Absicherung wurden ungefilterte Honige im Labor entsprechend der

Filtrationsbedingungen wenige Minuten im Trockenschrank auf 80 °C erwärmt

(vergleiche Kap. 4.3.) und anschließend vor und nach Wärmezufuhr vergleichend

untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass in der kurzen Zeit, die für die

Viskositätsverminderung der Honige notwendig ist, keine Beeinflussung des


94

Proteinspektrums der Saccharasefraktionen festzustellen war. In Abb. 4.7.3.5.c ist

anhand eines Blütenhonigs ersichtlich, dass es keine signifikanten Unterschiede

zwischen dem Gelbild vor und dem nach der Erwärmung gab; die Intensität der

65 kDa-Bande veränderte sich nicht. Eine Veränderung des Proteinspektrums der

Saccharasefraktion war somit allein durch Hitze nicht zu erklären, sondern musste

auf eine Filtration zurückzuführen sein.

Abb. 4.7.3.5.c: Proteinspektrum der Saccharasefraktionen eines Blütenhonigs vor (links) und nach Erwärmung (rechts) auf 80 °C

Robustheit – Ausschluss von Auswirkungen der Überlagerungen bei den GPC-Peaks

Bei der Auftrennung der Proteine in der GPC kam es zu Überlagerungen, wie in Kap. 4.7.2.1. dargelegt. Bei der Validierung der elektrophoretischen Analytik war zu

prüfen, inwieweit Veränderungen der Gelbilder zu beobachten waren, wenn die

Fraktionierung der Peaks etwas ungenauer erfolgte. Dazu wurden Honigproben

identisch aufgearbeitet, wobei die Peaks zum einen unmittelbar zu Beginn bzw. am

Ende und zum anderen jeweils fünf min. vorher und nachher abgenommen wurden.

Die densitometrischen Auswertungen der Gelbilder ergaben, dass sich die

Farbdichtewerte der 40 kDa- und der 65 kDa-Bande nur marginal, deren Verhältnisse

sogar überhaupt nicht veränderten. Die Überlagerungen haben demnach keine

Auswirkungen auf das Analyseergebnis.


95

4.7.3.6. Ergebnisse und Schlussfolgerungen

Es wurden insgesamt 40 Honige vor und nach Filtration mit der vorgestellten

Methode gemessen und mit Gelscan ausgewertet.

Die erhaltenen Ergebnisse verdeutlichen, dass sich die Intensität und somit der

Farbdichtewert der 40 kDa-Bande nach einer Filtration praktisch nicht veränderte.

Die 65 kDa-Bande war hingegen kaum noch vorhanden. Das führte dazu, dass der

Quotient der Farbdichtewerte der 40 kDa- und der 65 kDa-Bande bei gefilterten

Honigen im allgemeinen deutlich höher als 30 war, während er bei gefilterten

Honigen grundsätzlich zwischen 2 und 3 lag. In Abb. 4.7.3.6.a sind als Beispiel noch

einmal die Messwerte der Honigproben sowie die entsprechenden

Bandenverhältnisse aus Abb. 4.7.3.4.h aufgeführt (unfiltrierter Kleehonig, filtrierter

Honig und jeweilige Zumischungen des filtrierten Honigs zu 25 %, 50 % und 75 %).

Abb. 4.7.3.6.a: Messwerte der densitometrischen Auswertung und Verhältnisse der Banden bei Kleehonig, gefiltertem Honig sowie Zumischungen

In Abb. 4.7.3.6.b ist ein Streudiagramm der Farbdichtewerte verschiedener

Honigproben vor und nach Filtration dargestellt. Darin ist zu erkennen, dass bei den

ungefilterten Proben die Intensitätswerte der 40 kDa-Bande mit denen der 65 kDa-

Bande korrelierten. Hohen Werten für die 40 kDa-Bande stehen auch hohe Werte für

die 65 kDa-Bande gegenüber. Dies gibt einen weiteren Hinweis darauf, dass beide

Proteine einer identischen Quelle entstammen, und zwar der Saccharase (siehe

Kap. 4.7.3.2.).

Kleehonig gefilterter Zumischung (ungefiltert) Honig 75 % 50 % 25 %

40 kDa 3280 3012 3072 3465 3408

65 kDa 1120 85 125 254 362

Verhältnis 40/65 2,9 35,4 24,6 13,6 9,4


96

Abb. 4.7.3.6.b: Darstellung der Farbdichtewerte ausgewählter Honigproben (ungef.: ungefiltert, gef.: gefiltert)

Bei den Beimengungen gefilterter zu ungefilterten Honigen ließ sich beobachten,

dass mit zunehmenden Anteilen filtrierten Honigs die Intensität der 65 kDa-Bande

abnahm, während die der 40 kDa-Bande konstant blieb. Dies drückte sich dann auch

entsprechend in den Farbdichtewerten aus. Das Verhältnis verschob sich bei einem

25%igen Zusatz gefilterten Honigs zum ungefilterten Produkt von anfangs ca. 3

(ungefiltert) auf durchschnittlich 7 – 10, wobei ein Bandenverhältnis von mehr als 6

generell einen Zusatz gefilterten Honigs anzeigte. Höhere Beigaben erhöhten den

Quotienten entsprechend. Bei sämtlichen Mischungen war dabei eine lineare

Abhängigkeit mit ansteigenden Zumischungsgraden des filtrierten Honigs zu

verzeichnen.

Die Kopplung von Gelchromatographie und Elektrophorese stellt somit eine

geeignete Methode dar, um filtrierte Honige in einer Mischung mit unfiltriertem Honig

quantitativ nachzuweisen.

In Abb. 4.7.3.6.c ist das Schema der Aufarbeitung und der Untersuchung noch

einmal zusammenfassend aufgeführt.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

0 1000 2000 3000 4000 5000

Farbdichtewert 40 kDa

Farb

dich

tew

ert 6

5 kD

a

Klee ungef.Klee gef.Linde ungef.Linde gef.Akazie ungef.Akazie gef.Wald 1 ungef.Wald 1 gef.Wald 2 ungef.Wald 2 gef.polyfloral ungef.polyfloral gef.


97

Abb. 4.7.3.6.c: Schema der Methode zum Nachweis von gefiltertem Honig

Das Verhältnis zweier definierter Banden im Gelbild der Elektrophorese von

Saccharasefraktionen der Gelchromatographie gab dabei Aufschluss über die Menge

des Zusatzes an gefiltertem Honig. Eine Zumischung von 25 % gefilterten Honigs

zeigte bei allen Proben ein signifikant verändertes Bandenverhältnis im Vergleich

zum ungefilterten Erzeugnis, diese Menge konnte also in sämtlichen Honigen

nachgewiesen werden.

Differenzierte man dabei die Honigsorten, so konnte diese Grenze weiter abgesenkt

werden. Wurde beispielsweise einem Akazienhonig, der üblicherweise eine geringe

Saccharaseaktivität und somit niedrige Farbdichtewerte der Banden aufwies, ein

gefilterter Honig beigemischt, der vor Filtration eine hohe Aktivität besaß (wie zum

Beispiel Waldhonig), so änderte sich das Verhältnis der Banden bereits bei einem

Lösen des Honigs in Wasser (1:1)

Aufkonzentrieren der Lösung

Gelchromatographische Auftrennung

Isolierung der Saccharasefraktion

Aufkonzentrieren der Fraktion

Versetzen mit Laemmli-Puffer und β-Mercaptoethanol

Elektrophorese

Auswertung mit Gelscan

Berechnung des Quotienten der Banden 40 kDa und 65 kDa


98

Zusatz von 15 % sehr deutlich. Der Grund war, dass die Intensität der 40 kDa-Bande

durch die Beimischung verstärkt wurde und dadurch die 65 kDa-Bande relativ stärker

abnahm.

Unabhängig von der Saccharaseaktivität des gefilterten Honigs konnte auch alleine

die des ungefilterten Erzeugnisses von Bedeutung sein, ab welchem

Zumischungsgrad der gefilterte Honig nachgewiesen werden konnte. Wurde Honigen

mit sehr hohen Saccharaseaktivitäten, wie zum Beispiel Waldhonigen, gefilterter

Honig zugesetzt, so war auch hier bei einem Zusatz von 15 % eine deutliche

Änderung des Bandenverhältnisses 40/65 kDa zu beobachten. Grundsätzlich war

nach Untersuchung der 40 Honigproben festzustellen, dass mit zunehmender

Saccharaseaktivität des unfiltrierten Honigs die Nachweisgrenze für einen

zugesetzten filtrierten Honig sank.

Eine allgemeine Nachweisgrenze für gefilterten Honig konnte somit noch nicht

festgelegt werden, denn die Verschiebung der Bandenverhältnisse war, wie oben

dargelegt, abhängig von den Saccharaseaktivitäten des ungefilterten Honigs sowie

des gefilterten Honigs vor dem eigentlichen Filtrationsprozess. Es müssen weitere

Honige untersucht werden, um den Datenpool zu vergrößern. In Zukunft können

möglicherweise feste und in Einzelfällen niedrigere Nachweisgrenzen definiert

werden, wenn statistische Messungen belegen, dass bereits Bandenverhältnisse

40/65 kDa von weniger als 6 einen Zusatz von gefiltertem Honig sicher anzeigen.

Mit der Möglichkeit des Nachweises von Zumischungen von filtriertem zu unfiltriertem

Honig wird dem Hersteller bzw. dem Importeur die Möglichkeit gegeben,

einwandfreie Produkte einzukaufen, womit gleichzeitig der Verbraucherschutz

gewährleistet ist. Genauso erhält auch die amtliche Lebensmittelüberwachung ein

Instrument, um die Einhaltung der Honigverordnung zu gewährleisten. Somit wurde

letztendlich auch die Empfehlung des Agrarausschusses des Bundesrates erfüllt

(siehe Kap. 4.4.), der gefordert hatte, Nachweismethoden für die Verschneidung von

Honig mit gefiltertem Honig zu entwickeln.

99 5. Material und Methoden

99

5. Material und Methoden 100

100

5. Material und Methoden

5.1. Phenylacetaldehyd (Kapitel 3)

5.1.1. Chemikalien, Geräte und Hilfsmittel

Chemikalien

Substanz Reinheit Lieferant Sulfosalicylsäure x 2 H2O > 99 % Sigma Natriumcitrat p.a. Sigma Ninhydrin > 97 % Sigma Methanol p.a. Merck Natriumchlorid p.a. Merck tert.-Butylmethylether p.a., 99,5 % Merck Propylenglykol > 99,5 % Fluka

Tab. 5.1.1.a: Liste der verwendeten Chemikalien Standardsubstanzen

Substanz Reinheit Lieferant Phenylacetaldehyd > 90 % Sigma D-Phenylalanin > 98 % Sigma L-Norleucin > 99,0 % Sigma para-Dichlorbenzol-d4 99 % Sigma

Tab. 5.1.1.b: Liste der Standardsubstanzen allgemeine Geräte

Analysenwaage LSM200, Fa. PCE Magnetrührer RET, Fa. Ikamag Zentrifuge Rotina 46, Fa. Hellich Eindampfsystem Vapotherm Mobil S, Fa. Barkey Schüttler SM-30, Fa. Edmund Bühler Multipette Multipette plus, Fa. Eppendorf Eppendorf-Pipette Reference 10-100, Fa. Eppendorf Dispensette Calibrex 520, Fa. Socorex Brutschrank BM 400, Fa. Memmert Pflanzenlichtlampe Natura R80 (60 W), Fa. Conrad

Tab. 5.1.1.c: Liste der verwendeten Geräte

101

101

Hilfsmittel

Einmalspritzen (6 ml) Fa. O. Kohl Membranfilter (Porengröße 0,2 µm) Fa. Sartorius Vials für Headspace-GC (10 ml) Fa. O. Kohl Zentrifugenröhrchen (50 ml) Fa. O. Kohl HPLC-Vials (2 ml) Fa. O. Kohl HPLC-Vials, graduiert (2 ml, Graduierung 0,2 ml) Fa. O. Kohl

Tab. 5.1.1.d: Liste der verwendeten Hilfsmittel

5.1.2. Probenliste

Honigproben, die für die Untersuchungen herangezogen wurden:

botanische Herkunft geographische Herkunft interne Probennummer Akazie Rumänien 87056 Lavendel Frankreich 84334 Tanne Polen 85206 Wald Italien 85212 Wildblüte (polyfloral) Mexiko/Yucatan 83996 polyfloral Argentinien 84247 Zuckersirup "Meliose" 74011

Tab. 5.1.2.a: Liste der verwendeten Honigproben

5.1.3. Methode: Bestimmung der freien Aminosäuren

Probenvorbereitung

- 10 g Honig in 150 ml-Becherglas einwiegen, 2 ml L-Norleucin-Standardlösung

zugeben (67,5 mg in 100 ml bidest. Wasser) und ca. 20 ml bidest. Wasser

zugeben

- mit Hilfe eines Magnetrührers lösen und Lösung in 100 ml-Standzylinder

überführen, so dass das Endvolumen exakt 50 ml beträgt

- 5 ml 10%ige Sulfosalicylsäure zusetzen, umschütteln, und Standzylinder über

Nacht im Kühlschrank belassen

- ein Aliquot des Überstandes zentrifugieren (20 min. bei 13.000 U/min.)


102

102

- ein Aliquot des Überstandes membranfiltrieren (0,2 µm), Filtrat mit 0,2 M

Natrium-Citratpuffer (pH 2,20) im Verhältnis 1:1 verdünnen und 20 – 100 µl

der Lösung in den Aminosäureanalysator injizieren

Geräte

Gerät: Pharmacia LKB, Alpha Plus

Harz: Kationenaustauscher der Fa. Grüning, D-82140 Olching

125 x 4,6 mm PEEK, 5 µm

Analysenparameter

Flüsse: Na-Citratpuffer 16 ml/h

Ninhydrin 11 ml/h

Reaktionstemp.: 135 °C

Auswertung

- über externen Standard

5.1.4. Methode: Phenylacetaldehyd-Bestimmung mittels Headspace-

GC/MS

Probenvorbereitung

- 5 g Honig in Headspace-Vial einwiegen

- 50 µl internen Standard (para-Dichlorbenzol-d4 in Methanol, 1 ng/µl), 2 g

Natriumchlorid und 2,5 ml bidest. Wasser zugeben und Vial fest verschließen

- Vial 2 h bei 80 °C inkubieren

- 100 µl der Gasphase in GC/MS injizieren

Ansetzen der Standardlösung

- Stammlösung: 25 µl Phenylacetaldehyd in 25 ml Proplyenglykol lösen

(c = 1000 mg/l)

- 1,5 ml der Stammlösung mit Propylenglykol auf 50 ml auffüllen (c = 30 mg/l)


103

103

Geräte

GC: Varian 3400 Cx

MS: Varian Saturn 2000 MS/MS

Autosampler: Chromtech Combi PAL

Säule: Kapillarsäule Chrompack CP Sil8 Low Bleed MS

30 m x 0,25 mm, Filmdicke 0,25 µm

Analysenparameter

Injektortemp.: 260 °C

Trägergas Helium 6.0

Trägergas-Fluss: 1,3 ml/min. constant flow

Transferline-Temp.: 220 °C

Ion Trap-Temp.: 200 °C

Temp.-Programm: 1. 50 °C, 10 min

2. 20 °C/min. bis 260 °C

3. 260 °C, 20 min

Auswertung

- Identifizierung von Phenylacetaldehyd:

o Retentionszeit:13,1 min.

o Vergleich der Massenspektren: NIST-Datenbank

o Berechnung der Gehalte: über Hauptfragment m/z = 91

o Qualifier: Fragmente m/z = 92, m/z = 65 und m/z = 63

- Auswertung: über externen Standard

5.1.5. Methode: Phenylacetaldehyd-Bestimmung nach Extraktion

Probenvorbereitung

- 2,5 g Honig in Zentrifugenrohr einwiegen und in 10 ml Wasser lösen

- 10 ml tBME (tert.-Butylmethylether) zugeben und 15 min. durch Schütteln

extrahieren

- 5 min. bei 4000 U/min. zentrifugieren


104

104

- von der klaren (oberen) Etherphase genau 2 ml abnehmen und in ein

graduiertes HPLC-Vial geben, welches vorher leer gewogen wurde

- Extrakt im Luftstrom bei 40 °C auf ca. ¼ einengen und Vial nochmals wiegen

- Über Wägewerte und Dichte von tBME (0,74 g/ml) das Volumen berechnen:

(m2 – m1) [g]

VE [ml] = ρ [g/ml]

VE = Volumen des eingeengten Extraktes

m1 = Masse des leeren Vials

m2 = Masse des Vials mit Probenextrakt

ρ = Dichte von tBME

- Lösung in HPLC-Vial umfüllen, 3 µl zur GC/MS-Messung einsetzen

Ansetzen der Standardlösung

(siehe Kap. 5.1.4.)

Geräte

(siehe Kap. 5.1.4.)

Analysenparameter

(siehe Kap. 5.1.4.)

Auswertung

- Identifizierung von Phenylacetaldehyd und Auswertung: siehe Kap. 5.1.4.

- Berechnung des Phenylacetaldehydgehaltes in der Probe:

cPAA [mg/l] x VE [ml] x 5

ω [mg/kg] = 2,5 g

ω = Konzentration Phenylacetaldehyd in der Probe

cPAA = Konzentration von Phenylacetaldehyd in der Etherlösung

VE = Volumen der Messlösung


105

105

5.1.6. Methodenvalidierung Wiederholpräzision

- Bestimmung der Phenylacetaldehyd-Konzentrationen

- Dotierung von 6 x 50 µl der Phenylacetaldehyd-Standardlösung (siehe Kap. 5.1.4.) zu jeweils 2,5 g der Honigprobe

- Erneute Bestimmung der Phenylacetaldehyd-Konzentrationen und Abzug der

natürlichen Gehalte

Probe (Nr.)

natürlicher Gehalt PAA

[mg/kg]

Dotierung PAA-Standardlösung

[µl] Dotierung

PAA [mg/kg]

gemessener PAA-Gehalt

[mg/kg]

Wiederfin-dungsrate

[%] Akazie 0,20 50 0,60 0,68 80 (87056) 0,72 87

0,67 78 0,71 85 0,71 85 0,70 83

Wald 0,10 50 0,60 0,75 107 (85212) 0,61 87

0,72 103 0,65 93 0,67 96 0,72 103

polyfloral 0,72 50 0,60 1,2 92 (84247) 1,4 104

1,3 98 1,0 78 1,3 97 1,4 106

Tab. 5.1.6.a: Ergebnisse der Wiederfindungsmessungen Linearität

- Bestimmung der Phenylacetaldehyd-Konzentrationen

- 6 Dotierungen der Phenylacetaldehyd-Standardlösung (siehe Kap. 5.1.4.) zu

jeweils 2,5 g der Honigprobe

- Erneute Bestimmung der Phenylacetaldehyd-Konzentrationen und Abzug der

natürlichen Gehalte


106

106

Probe (Nr.)

natürlicher Gehalt PAA

[mg/kg]

Dotierung PAA-Standardlösung

[µl] Dotierung

PAA [mg/kg]

gemessener PAA-Gehalt

[mg/kg] Korrelations-

koeffizient Akazie 0,20 10 0,12 0,37 0,997 (87056) 15 0,18 0,43

25 0,30 0,47 50 0,60 0,88 100 1,2 1,4 200 2,4 2,8 500 6,0 5,8

Wald 0,10 10 0,12 0,18 0,994 (85212) 15 0,18 0,31

25 0,30 0,52 50 0,60 0,61 100 1,2 1,1 200 2,4 2,0 500 6,0 6,5

polyfloral 0,72 10 0,12 0,72 0,995 (84247) 15 0,18 0,96

25 0,30 1,2 50 0,60 1,2 100 1,2 1,8 200 2,4 3,4 500 6,0 6,4

Tab. 5.1.6.b: Ergebnisse der Linearitätsmessungen

5.1.7. Durchführung der Lagerungsversuche

- Einwaage von 3 mal ca. 20 g Probe in klare Glasgefäße, Gefäße mit Deckel

verschließen

- Lagerung eines Gefäßes im Brutschrank bei 39 °C, eines in einem Schrank

bei Raumtemperatur und eines in einem Schrank unter Einfluss einer

Pflanzenlichtlampe

- Nach 2, 8 und 14 Wochen Entnahme von jeweils ca. 5 g Probe und

Bestimmung der Gehalte an Phenylacetaldehyd


107

107

5.2. Filtration von Honig (Kapitel 4)

5.2.1. Chemikalien, Geräte und Hilfsmittel

Chemikalien

Substanz Reinheit Lieferant Natriumazid reinst, 99 % Fluka Natronlauge 50 % Fluka Natriumacetat-Trihydrat p.a., > 99 % Merck Bariumhydroxid Octahydrat p.a., > 98 % Merck Kaliumdihydrogenphosphat 99,5 % Merck di-Natriumhydrogenphosphat p.a. Merck Methanol p.a. Merck Roti-Load 1 Gelladepuffer Roth Ready Gel 4-20 % Tris-HCl Bio-Rad Tris/Glycin/SDS-Puffer Bio-Rad Ready Gel 4-20 % Tris HCl Bio-Rad Essigsäure 100 % (Eisessig) 100 % Merck Rotiphorese Blau R Coomassie Roth Quick Start Bradford Protein Assay Dye Reagent Bio-Rad

Tab. 5.2.1.a: Liste der verwendeten Chemikalien Standardsubstanzen

Substanz Reinheit Lieferant Maltooligosaccharide 98 % Sigma D(-)-Fructose reinst Merck D(+)-Glucose > 99.5 % Fluka D(+)-Saccharose > 99.5 % Fluka Saccharase Fluka Diastase 34,5 units/mg Sigma Glucose-Oxidase Sigma Roti-Mark Standard Protein-Marker Roth Bovine Serum Albumin (BSA) Standard Set Bio-Rad

Tab. 5.2.1.b: Liste der Standardsubstanzen


108

108

allgemeine Geräte

Analysenwaage LSM200, Fa. PCE Magnetrührer RET, Fa. Ikamag Zentrifuge Rotina 46, Fa. Hellich Vortex-Mischer Genie 2, Fa. Kleinfeld Heizbad VC, Fa. Julabo Schüttler SM-30, Fa. Edmund Bühler Rotationsverdampfer VV 2000, Fa. Heidolph Multipette Multipette plus, Fa. Eppendorf Eppendorf-Pipette Reference 10 - 100, Fa. Eppendorf Dispensette Calibrex 520, Fa. Socorex Farbbestimmungsgerät C 221 Honey Color Analyzer, Fa. Hanna Spektrometer IR 470, Fa. Shimadzu UV-Spektrometer Cary 1, Fa. Varian Mikroskop Axiostar plus, Fa. Carl Zeiss CCD-Fotokamera Power Shot G7, Fa. Canon Leuchtpult LP-503, Fa. Hama Auswertesoftware f. Elektrophorese Gelscan 5.1 für Windows, Fa. BioSciTec

Tab. 5.2.1.c: Liste der verwendeten Geräte Hilfsmittel

Einmalspritzen (6 ml) Fa. O. Kohl Membranfilter (Porengröße 0,45 µm) Fa. Sartorius UV-Küvette makro (1,5 ml) Fa. Brand Halbmikroküvette PS (1,5 ml) Fa. Nerbe Plus Irtran 2-Fenster Fa. Harrick Objektträger und Deckgläser Fa. Assistent HPLC-Spritze 100 µl Fa. Hamilton Zentrifugalkonzentratoren Vivaspin 20 - 10.000 Fa. Sartorius Peroxid-Test (0,5 - 25 mg/l H2O2) Fa. Merck Gelfärbeschalen MIDI Fa. Roth Gelschaufeln Fa. Roth

Tab. 5.2.1.d: Liste der verwendeten Hilfsmittel


109

109

5.2.2. Probenliste

Honigproben, die für die Untersuchungen herangezogen wurden (aufgelistet sind nur

die ungefilterten Proben):

botanische Herkunft geographische Herkunft interne Probennummer Akazie Rumänien 3557 Akazie Südosteuropa 97736 Akazie Südosteuropa 3555 Akazie Südosteuropa 4888 Eukalyptus Australien 4971 Eukalyptus Südamerika 4218 Eukalyptus USA 28750 Klee Argentinien 3537 Klee Argentinien 3548 Klee Neuseeland 3544 Klee Neuseeland 3559 Klee USA 86672 Klee USA 543 Klee USA 28748 Linde Bulgarien 3561 Linde Rumänien 3545 Linde Südosteuropa, Südamerika 3549 Raps Deutschland 3547 Raps Österreich 3541 Raps Osteuropa 6722 Raps Tschechien 3543 Sonnenblume Argentinien 3564 Sonnenblume Osteuropa 3552 Sonnenblume Südosteuropa 3542 Sonnenblume Ukraine 3546 Sonnenblume Ungarn 3562 Wald/Honigtau Italien 98406 Wald/Honigtau Italien 4753 Wald/Honigtau Spanien 3558 Wald/Honigtau Südamerika 5543 Wald/Honigtau Südamerika 17146 polyfloral Argentinien 3563 polyfloral Brasilien 97355 polyfloral Bulgarien 98310 polyfloral Dänemark 4301 polyfloral Mexiko 99496 polyfloral Süd-, Mittelamerika 275 polyfloral Südosteuropa 3550 polyfloral USA 98864 polyfloral USA 28746 Heide (Erika) Spanien 29204 Heide (Calluna) Deutschland 24171

Tab. 5.2.2.a: Liste der verwendeten Honigproben


110

110

5.2.3. Screening-Versuche

5.2.3.1. Methode: Bestimmung der Oligosaccharide Probenvorbereitung GPC

- 5 g Honig in ein Fingerglas einwiegen und in 5 ml Wasser lösen

- Lösung membranfiltrieren und 1 ml der Lösung für die GPC einsetzen

- Eluent ansetzen: 0,2 g Natriumazid in 1 l bidest. Wasser lösen

Geräte GPC

Säule: Merck Superperformance 16

Gel: Fractogel TSK HW-40 (S)

Pumpe: ProMinent Gamma/L

Detektor: Waters R 401

Fraktionssammler: LKB 17000 Minirac

Schreiber: ABB SE 120

Analysenparameter GPC

Fluss: 2 ml/min.

Fraktionierung: Reagenzglaswechsel alle 7 min.

Probenvorbereitung analytische HPLC

- Oligosaccharide in den Fraktionen 3 bis 5

- Fraktionen zusammenführen und am Rotationsverdampfer einengen

- Aufnehmen in 0,5 ml bidest. Wasser

- Lösung membranfiltrieren und 10 µl für die analytische HPLC einsetzen

- Eluent ansetzen: 5,4 ml Natronlauge 50 % und 13,6 g Natriumacetat-Trihydrat

in 1 l bidest. Wasser lösen

Geräte analytische HPLC

Säule: Dionex CarboPac PA-100

Vorsäule: CarboPac PA-100 Guard

Pumpe: Merck 655 A-11

Detektor: HP 1049A

Integrator: Merck D-2500


111

111

Analysenparameter analytische HPLC

Fluss: 0,8 ml/min.

Detektion: Potentiale/Pulszeiten: 0,1 V/120 ms, 0,6 V/300 ms,

-0,8 V/300 ms

Auswertung

- Die Auswertung erfolgt optisch durch den Vergleich der Chromatogramme von

Honigproben vor und nach Filtration. Näheres siehe Kap. 4.6.6.1.

5.2.3.2. weitere Untersuchungen

Farbmessung nach Pfund

- Honig in Einmalküvette füllen und gegebenenfalls Luftbläschen entfernen;

kristallisierte Honige mittels Wärme (50 °C) klären

- Kalibrierung des Kolorimeters (Lovibond-Gerät) mittels Standard-Honig

- Messung der Honigproben und Ablesen des Pfund-Wertes

IR-spektroskopische Untersuchung

- Honig auf Irtran 2-Fenster (ZnS) dünn Ausstreichen

- Scan von 500 bis 4000 nm im IR-Spektrometer

- Auswertung: Vergleich der IR-Spektren

UV-spektroskopische Untersuchung

- Honig in Quartzküvette füllen und gegebenenfalls Luftbläschen entfernen;

kristallisierte Honige mittels Wärme (50 °C) klären

- Messung der UV-Absorptionen bei 300, 420, 525, 600 und 700 nm

- Auswertung: Vergleich der Absorptionen


112

112

Mikroskopische Untersuchung

- 10 g Honig in 18 ml Wasser lösen

- Lösung bei 4000 U/min. 10 min. zentrifugieren, Wasser abdekantieren,

nochmals 18 ml zugegeben und nochmals zentrifugieren

- Sediment auf Objektträger geben, bei max. 40 °C trocknen und mit Deckglas

abdecken

- Untersuchung des Sedimentes unter dem Mikroskop bei 400facher

Vergrößerung

- Auswertung:

o Identifizieren möglichst aller vorhandenen Pollenarten

o Auszählen von mindestens 300 Pollen in 100er-Schritten

o wurde von Fachpersonal durchgeführt

5.2.3.3. DIN-Methoden

Leitfähigkeit: DIN 10753

pH-Wert, Säuregrad: DIN 10756

Zuckerprofil: DIN 10758

Bestimmung von HMF: DIN 10751

Bestimmung der Diastaseaktivität: DIN 10750

Bestimmung der Saccharaseaktivität: DIN 10759-1

5.2.3.4. extern durchgeführte Untersuchungen

Elementaranalysen

- durchgeführt von der Fa. Indikator, Wuppertal, mittels ICP-MS nach DIN

38406-E29


113

113

Flavonoide und Phenolcarbonsäuren

- durchgeführt von TRAUTVETTER et al.; Arbeitskreis Prof. Speer (TU

Dresden)

5.2.4. Methode: Bestimmung des Proteingehaltes nach Bradford

- Eichgerade mittels BSA-Standard nach folgendem Schema erstellen:

BSA-Standard [mg/ml] Volumen [µl]

Volumen Verdünnungswasser [ml]

Protein-Konz. [µg/ml]

2 40 3,16 25 2 35 3,47 20

1,5 35 3,47 15 1 35 3,47 10

0,75 35 3,47 7,5 0,5 35 3,47 5 0,25 35 3,47 2,5

0,125 35 3,47 1,25 blind 3,2 0

Tab. 5.2.4.a: Verdünnungsschritte des BSA-Standards zum Erstellen der Eichgerade

- Verdünnen der Honigprobe mit Wasser 1:40 und membranfiltrieren

- 2 ml Probe bzw. Standardlösung mit 2 ml Bradford-Färbereagenz mischen

und 5 min. bei Raumtemperatur stehen lassen

- Messung der Standards und der Proben bei 595 nm

Auswertung

- Bestimmung der Proteingehalte der Proben mittels Vergleich zu der

Eichgerade der BSA-Standards


114

114

5.2.5. Methode: Gelchromatographie

Probenvorbereitung

- 4 g Honig in 25 ml Wasser lösen und membranfiltrieren

- 20 ml der Lösung in Vivaspin 20 - 10.000 geben („Zentrifugalkonzentrator“)

- bei 4000 U/min. zentrifugieren und bis auf ein Restvolumen von 3 ml einengen

(Dauer abhängig von der Honigsorte, zwischen 15 und 30 min.)

- Retentat in 5 ml-Messkolben geben, zwei mal mit je 1 ml Wasser nachspülen,

Kolben bis zur Marke auffüllen und 2 ml der Lösung in die GPC einsetzen

- Eluent ansetzen: 0,1 M-Phosphatpuffer pH 6 (11,66 g KH2PO4 und 2,56 g

NaHPO4 auf 1000 ml Wasser)

Geräte

Säule: Merck Superperformance 10 (600/10)

Gel: Toyopearl HW-55S

Detektor: Merck L4250 UV-Vis

Schreiber: ABB SE 120

Analysenparameter

Flussrate: 2,5 ml/min

Wellenlänge: 280 nm

Auswertung

- Identifizierung über externe Enzymstandards und durch manuelle

Peakfraktionierung und anschließende Verifizierung mittels Einzelnachweisen

der Enzymaktivitäten

5.2.5.1. Bestimmung der Glucose-Oxidase-Aktivität

- GPC-Eluat abnehmen und etwas Glucose zugeben, ca. 5 min. warten

- Peroxid-Teststäbchen für 1 sek. in wässrige Lösung eintauchen,

überschüssige Flüssigkeit ablaufen lassen

- Nach 15 sek. Farbveränderung beobachten

- Auswertung: Blaufärbung zeigt Glucose-Oxidase-Aktivität an


115

115

5.2.6. Methode: Elektrophoretische Untersuchung

Probenvorbereitung

- Saccharasefraktion mittels Zentrifugalkonzentrator (s.o.) auf 0,6 ml einengen,

Retentat in 1 ml-Messkolben geben, zweimal mit je 0,2 ml Wasser nachspülen

und Kolben bis zur Marke auffüllen

- 100 µl des Konzentrates mit 50 µl Roti-Load 1 versetzen, mittels Vortex-

Mischer homogenisieren

- 5 min. auf 95 °C erhitzen, abkühlen lassen und Lösung zur Elektrophorese

einsetzen

- 10 µl Roti-Mark Standard in eine und 20 µl der Probenlösungen in weitere Gel-

Taschen auftragen (Ready Gel 4 - 20 % Tris HCl)

- Pufferlösung ansetzen: 30 ml 10x Tris/Glycin/SDS-Puffer mit 270 ml bidest.

Wasser mischen

Geräte

Elektrophoresekammer: Bio-Rad MiniProtean III Cell

Spannungsquelle: Bio-Rad Power Pac 300 Power Supply

Analysenparameter

Spannung: 200 V

Dauer: 45 min.

Gelfärbung

- nach Abschluss der Elektrophorese das Gel für 15 min. in Fixierlösung geben

(40 ml Methanol + 10 ml Eisessig + 50 ml bidest. Wasser)

- Gel 2 h mit Coomassie-Lösung färben (Rotiphorese Blau R)

- anschließend zum Entfärbevorgang Gel 3 h in die Fixierlösung geben

- frisch entfärbtes Gel auf Leuchtpult auflegen und mit CCD-Kamera

fotografieren

Auswertung

- Auswertung des Gelbildes mittels Gelscan 5.1 (siehe Kap. 4.7.3.4.)


116

116

5.2.7. Methodenvalidierung

Reproduzierbarkeit

- elektrophoretische Untersuchung zweier ungefilterter Honige mit

unterschiedlichen Saccharaseaktivitäten

- Auswertung des DID und Berechnung der Standardabweichungen

Farbdichtewerte des DID Banden- Probe Aufarbeitung 40 kDa 65 kDa verhältnis Akazie 1 1860 592 3,1 (97736) 2 1772 520 3,4

3 1750 621 2,8 4 1995 680 2,9

Standardabweichung +/- 111 = 6,0 % +/- 66 = 11 % Wald 1 4420 1580 2,8

(3558) 2 4115 1871 2,2 3 4831 1617 3,0 4 4098 1639 2,5

Standardabweichung +/- 343 = 7,9 % +/- 132 = 8,2 %

Tab. 5.2.7.b: Bestimmung der Reproduzierbarkeit

Linearität

- elektrophoretische Untersuchung ungefilterter und gefilterter Honige

- Zumischungen von 25, 50 und 75 % je eines gefilterten Honigs zu je einem

ungefilterten Honig und elektrophoretische Untersuchung der Mischungen

- Auswertung des DID

A B Verhältnis 40 kDa- zu 65 kDa-Bande bei

Zumischungsverhältnis von B zu A Probe

ungefiltert Probe gefiltert 0% 25% 50% 75% 100% Korrelations-koeffizient

Akazie polyfloral 3,1 9,4 13,6 24,6 35,4 0,98 (97736) (98865)

Klee polyfloral 2,9 10,8 13,2 29,8 35,4 0,97 (28748) (98865)

Sonnenblume polyfloral 2,2 13,0 23,9 32,1 35,4 0,98 (3552) (98865) Wald Klee 2,8 7,1 23,2 42,7 70,8 0,97

(3558) (28749) polyfloral Klee 3,2 6,2 35,4 52,3 70,8 0,98 (98864) (28749)

Tab. 5.2.7.b: Ergebnisse der Linearitätsmessungen


117

117

Robustheit - Aufkonzentrierungen der Saccharasefraktionen

- GPC von ungefilterter Honige und Aufkonzentrierung der Saccharasefraktion

- Verdünnungen aus Konzentrat (A) herstellen:

B 0,1 ml A + 0,1 ml bidest. Wasser

C 0,1 ml B + 0,1 ml bidest. Wasser

D 0,1 ml C + 0,1 ml bidest. Wasser

E 0,1 ml D + 0,1 ml bidest. Wasser

- elektrophoretische Untersuchung der Proben und Auswertung des DID

Bandenverhältnis 40 kDa zu 65 kDa Honig A B C D E Klee 2,9 3,2 2,5 2,9 2,7

(28748) Wald 2,8 2,8 3,3 3,2 2,8

(3558) polyfloral 3,2 3,5 3,4 2,7 3,4 (98864)

Tab. 5.2.7.c: Ergebnisse der Messungen zur Bestimmung der Robustheit


7. Literatur 118

118

7. Literatur ALISSANDRAKIS, E.; TARANTILIS, P. A.; HARIZANIS, P. C.; POLISSIOU, M.

Comparison of the volatile composition in Thyme honeys from several origins in Greece Journal of Agricultural and Food Chemistry 55 (2007), S. 8152-8157

ASSIL, H. I.; STERLING, R.; SPORNS, P. Crystal control in processed liquid honey Journal of Food Science 56 (1991), S. 1034-1041 AZEREDO, L. D. C.; AZEREDO, M. A. A.; DE SOUZA, S. R.; DUTRA, V. M. L.

Protein contents and physicochemical properties in honey samples of Apis mellifera of different floral origins Food Chemistry 80 (2003), S. 249-254

BABACAN, S.; RAND, A. G. Purification of amylase from Honey Journal of Food Science 70 (2005), S. 413-418 BABACAN, S.; RAND, A. G. Characterization of honey amylase Journal of Food Science 72 (2007), S. 50-55 BECKH, G.; LÜLLMANN, C.

Phenol – ein natürlicher Bestandteil neuseeländischen Waldhonigs? Deutsche Lebensmittel-Rundschau 94 (1998), S. 149-152

BEHLITZ, H. D.; GROSCH, W.

Lehrbuch der Lebensmittelchemie Springer-Verlag, 4. Aufl. (1992) (ISBN 3-540-554491), S. 247-249

BERGNER, K. G.; DIEMAIR, S.

Proteine des Bienenhonigs – II. Gelchromatographie, enzymatische Aktivität und Herkunft von Bienenhonig-Proteinen Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und –Forschung 157 (1975), S. 7-13

BERGNER, K. G.; HAHN, H. J. Zum Vorkommen und zur Herkunft der freien Aminosäuren in Honig Apidologie 3 (1972a), S. 5-34 BERGNER, K. G.; HAHN, H. J.

Isolation and determination of free amino acids in honey Deutsche Lebensmittel-Rundschau 68 (1972b), S. 5-12

BERGNER, K. G.; SABIR, D. M.

Proteine des Bienenhonigs – III. Abtrennung der Honigamylase durch hydrophobe Wechselwirkungschromatographie Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und –Forschung 165 (1977), S. 85-86

BERNAL, J. L.; NOZAL, M. J.; TORIBIO, L.; DIEGO, J. C.; RUIZ, A.

A comparative study of several HPLC methods for determining free amino acid profiles in honey Journal of Separation Science, 28 (2005), S. 1039-1047

BHANDARI, B.; D´ARCY, B.; KELLY, C.

Rheology and crystallization kinetics of honey: Present status. International Journal of Food Properties 23 (1999), S. 217-226

119 7. Literatur

119

BOGDANOV, S. Bestimmung von Honigprotein mit Coomassie Brilliantblau G 250

Mitteilungen auf dem Gebiet der Lebensmitteluntersuchung und Hygiene 72 (1981), S. 411-417

BOGDANOV, S.; CHARRIÈRE, J. D.; IMDORF, A.; KILCHENMANN, V.; FLURI, P.

Determination of residues in honey after treatments with formic and oxalic acid under field conditions

Apidologie 33 (2002), S. 399-409 BOGDANOV, S.; KILCHENMANN, V.; SEILER, K.; PFEFFERLI, H.; FREY, T.; ROUX, B.; WENK, P.; NOSER, J.

Residues of para-dichlorobenzene in honey and beeswax Journal of Apicultural Research 43 (2004), S. 14-16

BONHEVI, J. S.; TORRENTO, M. S.; RAICH, J. M. Invertase activity in fresh and processed honeys Journal of the Science of Food and Agriculture 80 (2000), S. 507-512 BOVAN, S.

Phenylacetaldehydgehalte in einheimischen Sortenhonigen Diplomarbeit, Universität Hohenheim - Institut für Lebensmitteltechnologie (2006), S. 15

BRADFORD, M. M.

A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding

Analytical Biochemistry 72 (1972), S. 248-254 BROWN, A. D. Microbial Water Stress Physiology

John Wiley & Sons, 1. Aufl. (1990) (ISBN 0-471-92579-9) BUSCH-STOCKFISCH, M. Praxishandbuch Sensorik in der Produktentwicklung und Qualitätssicherung Behr´s Verlag (2002) (ISBN 978-3-86022-958-3), Kap. 1.6 CASTRO-VAZQUEZ, L.; DIAZ-MAROTO, M. C.; PEREZ-COELLO, M. S.

Volatile composition and contribution to the aroma of Spanish honeydew honeys. Identification of a new chemical marker Journal of Agricultural and Food Chemistry 54 (2006), S. 4809-4813

CHO, N. C. Purification and characterization of honey sucrase Korean Biochemistry Journal 27 (1994), S. 509-513 COMETTO, P. M.; FAYE, P. F.; DI PAOLA NARANJO, R. D.; RUBIO, M. A.; ALDAO, M. A. J.

Comparison of free amino acids profile in honey from three Argentinean regions Journal of Agricultural & Food Chemistry 51 (2003), S. 5079-5087

COTTE, J. F.; CASABIANCA, H.; GIROUD, B.; ALBERT, M.; LHERITIER, J.; GRENIER-LOUSTALOT, M. F.

Characterization of honey amino acid profiles using high-pressure liquid chromatography to control authenticity Journal of Analytical and Bioanalytical Chemistry 378 (2004), S. 1342-1350

CRANE, E. Honey – A comprehensive survey Heinemann, 2. Aufl. (1979) (ISBN 434-90270-5), S. 282-284 DAHARU, P. A.; SPORNS, P.

Residue levels and sensory evaluation of the bee repellent, phenol, found in honey Canadian Institute of Food Science and Technology Journal 18 (1985), S. 63-66

7. Literatur 120

120

DANIEL KELLY, J. F.; DOWNEY, G.; FOURATIER, V. Initial study of honey adulteration by sugar solutions using midinfrared (MIR) spectroscopy and chemometrics

Journal of Agricultural and Food Chemistry 52 (2004), S. 33-39 DEIFEL, A.

Die Chemie des Honigs Chemie in unserer Zeit 23 (1989), S. 25-33

DEVILLERS, J.; DORÉ, J. C.; MARENCO, M.; POIRIER-DUCHÈNE, F.; GALAND, N.; VIEL, C.

Chemometrical analysis of 18 metallic and nonmetallic elements found in honeys sold in France

Journal of Agricultural and Food Chemistry 50 (2002), S. 5998-6007 DIONEX CORPORATION

Analysis of carbohydrates by high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAE-PAD) Technical Note 20 (2005), S. 1-13

DONER, L. W. The sugars of honey – A review Journal of the Science of Food and Agriculture 28 (1977), S. 433-456 DRUCKSACHE 847/1/03: Empfehlung des federführenden Agrarausschusses und des Gesundheitsausschusses an den Bundesrat vom 8.12.2003 DUISBERG, H.; WARNECKE, B. Erhitzungs- und Lichteinfluß auf Fermente und Inhibine des Honigs

Zeitschrift für Lebensmitteluntersuchung und –forschung 111 (1959), S. 111-119 DUSTMANN, J. H.

Messung von Wasserstoffperoxid und Enzymaktivität in mitteleuropäischen Honigen Zeitschrift für Bienenforschung 9 (1971), S. 66-73

DUSTMANN, J. H.

Über die Katalaseaktivität in Bienenhonig aus der Tracht der Heidekrautgewächse (Ericaceae) Zeitschrift für Lebensmitteluntersuchung und -forschung 145 (1971), S. 292-295

DYCE, E. J. Fermentation and crystallization of honey and heating of crystallized honey Bee World 13 (1931), S. 14-18 EDELHÄUSER, M. Zur Kenntnis der Saccharase in Honigen Dissertation, Universität Stuttgart (1983), S. 76 EDELHÄUSER, M.; BERGNER, K. G.

Proteine des Bienenhonigs VIII. Honigsaccharase, Isolierung chromatographisches Verhalten und Eigenschaften Zeitschrift für Lebensmitteluntersuchung und –forschung 184 (1987), S. 189-194

FDA – U. S. Food and Drug Administration GRAS Notice No. GRN 000087 (1987) FÖLDHÁZI, G.

Analysis and quantification of sugars in honey of different botanical origin using high performance liquid chromatography Acta Alimentaria 23 (1994), S. 299-311

FREDE, W. Taschenbuch für Lebensmittelchemiker Springer-Verlag, 2 Aufl. (2006) (ISBN 3-540-28198-3), S. 306

121 7. Literatur

121

FREY, T. Rückstände von Antiparasitika und Imkerei-Hilfsstoffen in Honig

Kantonslabor Basel, Bericht Nr. 26 (25/09/2003), S. 1-2 GHELDOF, N.; WANG, X. H.; ENGESETH, N. J.

Identification and quantification of antioxidant components of honeys from various floral sources

Journal of Agricultural and Food Chemistry 50 (2002), S. 5870-5877 GILBERT, J.; SHEPHERD, M. J.; WALLWORK, M. A.; HARRIS, R. G.

Determination of the geographical origin of honeys by multivariate analysis of gas chromatographic data on their free amino acid content Journal of Apicultural Research 20 (1981), S. 125-135

GRAHAM, J. M.

The hive and the honey bee Dadant & Sons, 2. Aufl. (1993) (ISBN 0-915698-09-9), S. 561 sowie S. 662

GÜNTHER, F.; BURCKHART, D. Bestimmung der Gesamtphosphatase in Honig Deutsche Lebensmittel-Rundschau 63 (1967), S. 41-43 GUPTA, M.

Essential oils: a new source of bee repellents Chemistry & Industry 5 (1987), S. 161-163

GUYOT, C.; SCHEIRMAN, V.; COLLIN, S. Floral origin markers of heather honeys: Calluna vulgaris and Erica arborea Food Chemistry 64 (1999), S. 3-11 HERMOSÍN, I.; CHICÓN, R. M.; CABEZUDA, M. D.

Free amino acid composition and botanical origin of honey Food Chemistry 83 (2003), S. 263-268

HJERTÉN, S. “Molecular sieve” electrophoresis in cross-linked polyacrylamide gels Journal of Chromatography 11 (1963), S. 66-70 HONIGVERORDNUNG

V. v. 16.01.2004 BGBl. I S. 92 i. d. F. v. 22.02.2006 (BGBl. I S. 444)

HUBER, R. E.; MATHISON, R. D. Physical, chemical, and enzymatic studies on the major sucrase of honey bees (Apis mellifera) Canadian Journal of Biochemistry 54 (1976), S. 153-164

IGLESIAS, M. T.; MARTIN-ÁLVAREZ, P. J.; POLO, M. C.; DE LORENZO, C.; PUEYO, E.

Protein analysis of honeys by fast protein liquid chromatography: application to differentiate floral and honeydew honeys

Journal of Agricultural and Food Chemistry 54 (2006), S. 8322-8327 KALOYEREAS, S. A.; OERTEL, E.

Crystallization of honey as affected by ultrasonic waves, freezing and inhibitors American Bee Journal 98 (1958), S. 442-443

KLEINERT, T.

Elektrophoretische Methoden in der Proteinanalytik Thieme-Verlag, 1. Aufl. (1990) (ISBN 3-13-756601-0), S. 11-26

KROMIDAS, S. Validierung in der Analytik Wiley-VCH, 1. Aufl. (1999) (ISBN 3-527-28748-5)

7. Literatur 122

122

KWAN, S.; SPORNS, P. Analysis of bee repellents in honey Journal of Apicultural Research 27 (1989), S. 162-168

LAEMMLI, U. K.

Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature 227 (1970), S. 680-685

LEISTNER, E.; BRECKLE, S. W. Pharmazeutische Biologie I – Grundlagen und Systematik Gustav Fischer Verlag, 5. Aufl. (1997) (ISBN 3-437-25281), S. 128-132 LGL BAYERN - Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit

Jahresbericht 2005, S. 183 LICHTENBERG-KRAAG, B.; HEDTKE, C.; BIENEFELD, K. Infrared spectroscopy in routine analysis of honey Apidologie 33 (2002), S. 327-337 LIPP, J. Handbuch der Bienenkunde – Der Honig Ulmer-Verlag, 3. Aufl. (1994) (ISBN 3-8001-7417-0), S. 91 sowie S. 103 LIPP, J.; ZIEGLER, H.; CONRADY, E.

Detection of high-fructose and other syrups in honey with high-pressure liquid chromatography Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung 187 (1988), S. 334-338

LOUVEAUX, J.; MAURIZIO, A.; VORWOHL, G.

Internationale Kommission für Bienenbotanik der I.U.B.S. – Methodik der Melissopalynologie Apidologie 1 (1970), S. 193-209 LOW, N.; VA VONG, K.; SPORNS, P. A new enzyme, β-Glucosidase, in honey Journal of Apicultural Research 25 (1986), S. 178-181 LOWRY, O. H.; ROSENBROUGH, N. J.; FARR, A. L.; RANDALL, R. J. Protein measurements with the Folin phenol reagent Journal of Biological Chemistry 193 (1951), S. 265-275 LÜLLMANN, C.; HORN, H.

Das große Honigbuch Kosmos-Verlag, 3. Aufl. (2006) (ISBN 3-440-108384), S. 57-60

LUND, R.

Über die Untersuchung des Bienenhonigs unter spezieller Berücksichtigung der stickstoffhaltigen Bestandteile Mitteilungen auf dem Gebiet der Lebensmitteluntersuchung und Hygiene (1910), S. 38-58

MARSHALL, T.; WILLIAMS, K. M.

Electrophoresis of honey: characterization of trace proteins from a complex biological matrix by silver staining Analytical Biochemistry 167 (1987), S. 301-303

MATEO, R.; BOSCH-REIG, F. Sugar profiles of Spanish unifloral honeys Food Chemistry 60 (1997), S. 33-41 MÜLLER, G.; WEBER, H. Mikrobiologie der Lebensmittel – Grundlagen Behr´s Verlag, 8. Aufl. (1996) (ISBN 3-86022-209-0), S. 3

123 7. Literatur

123

NANDA, V.; SARKAR, B. C.; SHARMA, H. K.; BAWA, A. S. Physico-chemical properties and estimation of mineral content in honey produced from different plants in Northern India

Journal of Food Composition and Analysis 16 (2003), S. 613-619 NELSON, J. M.; COHN, D. J. Invertase in honey Journal of Biological Chemistry 61 (1924), S. 193-224 NHB – National Honey Board (USA) Brief review of filtration methods http://www.honey.com/downloads/filtration.pdf (2004), S. 1-7 NOZAL, M. J.; BERNAL, J. L.; DIEGO, J. C.; GÓMEZ, L. A.; HIGES, M.

Determination of low molecular weight organic acids in honey with series-coupled ion-exclusion columns Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 26 (2003), S. 1231-1253

OH, S. Y.; SHIN, H. D.; KIM, S. J.; HONG, J.

Rapid determination of floral aroma compounds of lilac blossom by fast gas chromatography combined with surface acoustic wave sensor

Journal of Chromatography A, 1-2 (2008), S. 170-178 OMURA, H.; HONDA, K.; HAYASHI, N.

Chemical and chromatic bases for preferential visiting by the cabbage butterfly, Pieris rapae, to rape flowers Journal of Chemical Ecology 25 (1999), S. 1895-1906

PAINE, H. S.; GERTLER, S. I.; LOTHROP, R. E.

Colloidal constituents of honey influence on properties and commercial value Industrial & Engineering Chemistry 26 (1934), S. 73-81

PATSCHKY, A.; SCHÖNE, H. J.

Zur Zusammensetzung und Beurteilung von Met Deutsche Lebensmittel-Rundschau 66 (1970), S. 150-157

PERSANO-ODDO, L.; PIAZZA, M. G.; PULCINI, P. Invertase activity in honey Apidologie 30 (1999), S. 57-65 PERSANO-ODDO, L.; PIRO, R. Main European unifloral honeys: descriptive sheets Apidologie 35 (2004), S. 38-81 PICHLER, F. J.; VORWOHL, G.; GIERSCHNER, K. H. Faktoren, die die Bildung von Hydroxymethylfurfural im Honig beeinflussen Apidologie 15 (1984), S. 171-188 PILZ-GÜTHER, D.; SPEER, K.

Entwicklung einer GC-Methode für die simultane Bestimmung von organischen Säuren in Honig

Deutsche Lebensmittel-Rundschau 100 (2004), S. 84-87 PROBST, J.

Sioux Honey Association, Sioux City, IA (USA) persönliche Information (2004)

RADOVIC, B. S.; CARERI, M.; MANGIA, A.; MUSCI, M.; GERBOLES, M.; ANKLAM, E.

Contribution of dynamic headspace GC-MS analysis of aroma compounds to authenticity testing of honey Food Chemistry 72 (2001), S. 511-520

7. Literatur 124

124

REHM, H. SDS-Gele färben www. laborjournal.de/rubric/methoden/methoden/v55.html (2005) REISNER, A. H.; NEMES, P.; BUCHOLTZ, C.

The use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels Analytical Biochemistry 64 (1975), S. 509-516

REITINGER, A.

Richtlinie 2001/110/EG des Rates vom 20. Dezember 2001 über Honig - Erläuterungen von IM Anton Reitinger Bienenvater 3 (2002), S. 14-17

RICHTLINE 2001/110/EG des Rates vom 20. Dezember 2001 über Honig RUOFF, C.; IGLESIAS, M. T.; LUGINBÜHL, W.; BOSSET, J. O.; BOGDANOV, S.; AMADO, R.

Quantitative analysis of physical and chemical measurands in honey by mid-infrared spectrometry

European Food Research and Technology 223 (2006), S. 22-29 SALLER, S.

Rheinischer Honig ausgezeichnet Landwirtschaftliche Correspondenz Niederrhein 46 (2003)

SANCHEZ-POLITTA, S.; CAMPANELLI, A.; PASHE-KOO, F.; SAURAT, J. H.; PILETTA, P.

Allergic contact dermatitis to phenylacetaldehyde: a forgotten allergen? Contact Dermatitis 56 (2007), S. 171–172

SCHEPARTZ, A. I.; SUBERS, M. H.

The glucose oxidase of honey – I. Purification and some general properties of the enzyme Biochimica et Biophysica Acta 85 (1964), , S. 228-237

SCHLEY, P.; BÜSKES-SCHULZ, B.

Die Kristallisation des Bienenhonigs – Teil 1: Grundlegende Zusammenhänge Die Biene 1 (1987), S. 5-10

SCHWEDT, G.

Taschenatlas der Analytik Thieme-Verlag, 1. Aufl. (1992) (ISBN 3-13-759301-8), S. 174

SCHWENKEL, J.

Hintergrundinformation: Richtlinie des EU-Rates zu Honig ADIZ 3 (2002), S. 9

SERRANO, S.; ESPEJO, R.; VILLAREJO, M.; LUISA JODRAL, M. Diastase and invertase activities in Andalusian honeys International Journal of Food Science and Technology 42 (2007), S. 76-79 SOUCI, S. W.; FACHMANN, W.; KRAUT, H. Die Zusammensetzung der Lebensmittel Medpharm Scientific Publishers, 5. Aufl. (1994) (ISBN 3-88763-0270), S. 1001 SPEER, K.; MONTAG, A.

Distribution of free amino acids in honeys, especially in German and French heather honeys Deutsche Lebensmittel-Rundschau 82 (1986), S. 248-253

SPEER, K.; MONTAG, A. Abbauprodukte des Phenylalanins als Aromakomponenten in Honig Deutsche Lebensmittel-Rundschau 83 (1987), S. 103-107

125 7. Literatur

125

STANLEY, R. G.; LINSKENS, H. F. Pollen Urs Freund-Verlag, 1. Aufl. (1985) (ISBN 3-924-73300-7), S. 27 STIFTUNG WARENTEST

Honig – Kein reiner Genuss Ausg. 4 (2004), S. 20-26

STATISTISCHES BUNDESAMT

Außenhandelsstatistik „Natürlicher Honig“, Jan./Sept. 2003 TALPAY, B. Spezifikationen für Trachthonige Deutsche Lebensmittel-Rundschau 81 (1985), S. 148-152 TERNES, W.; TÄUFEL, A.; TUNGER, L.; ZOBEL, M.

Lebensmittel-Lexikon Behr´s Verlag, 4. Aufl. (2005) (ISBN 3-899-471652), S. 1409-1410

TIMMROTH, R.; SPEER, K. Development of analytical indicator substances for honeys contaminated with yeasts Proceedings Euro Food Chem XII, Brugge, Belgium 24-26 September 2003, Vol., S. 142-145

TOSI, E.; CIAPPINI, M. E. RÉ; LUCERO, H Honey thermal treatment effects on hydroxymethylfurfural content Food Chemistry 77 (2002), S. 71-74 TRAUTVETTER, S.; KÖLLING-SPEER, I.; SPEER, K.

Auswirkungen einer Filtration auf die Phenolcarbonsäuren und Flavonoide des Honigs Lebensmittelchemie 61 (2007), S. 132 VAL, A.; HUIDOBRO, J. F.; SÁNCHEZ, M. P.; MUNIATEGUI, S.; FERNANDEZ-MUINO, M. A.; SANCHO, M. T. Enzymatic determination of galactose and lactose in honey Journal of Agricultural and Food Chemistry 46 (1998), S. 1381-1385 VON DER OHE, K.; VON DER OHE, W. Celler Melissopalynologische Sammlung (2002) VON DER OHE, W. Gefilterter Honig Das Bieneninstitut Celle informiert 50 (2006), S. 1 VON DER OHE, W.; DUSTMANN, J. H.; VON DER OHE, K. Prolin als Kriterium der Reife des Honigs Deutsche Lebensmittel-Rundschau 87 (1991), S. 383-386 VON DER OHE, W.; VON DER OHE, K.; RAUDE-ROBERG, L.; DUSTMANN, J. H. Comparison of methods for determination of saccharase activity in honey Apidologie 30 (1999), S. 412-413 WALTER LANG HONIG-IMPORT GMBH Information aus 2005 WESTERMEIER, R.; MAROUGA, R. Protein detection methods in proteomics research Bioscience Reports 25 (2005), S. 19-32 WHITE, J. W. JR. Honey Advances in food research 24 (1978), S. 287

7. Literatur 126

126

WHITE, J. W. JR.; MAHER, J. Transglucosidation by honey invertase Archives of Biochemistry and Biophysics 42 (1953), S. 360-367 WHITE, J. W. JR.; WINTERS, K.

Honey protein as internal standard for stable carbon isotope ratio detection of adulteration of honey

Journal – Association of official Analytical Chemists 72 (1989), S. 907-911 WILSON, H. F.; MARVIN, G. E. The effect of temperature on honey in storage Journal of Economic Entomology 24 (1931), S. 589-598 YAU, W.; KIRKLAND, J.; BLY, D.

Modern size exclusion liquid chromatography: practice of gel permeation and gel filtration chromatography

John Wiley & Sons, 1. Aufl. (1979) (ISBN 978-0-471-03387-5)

127 7. Literatur

127

Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter

und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die

aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche

kenntlich gemacht. Die Arbeit wurde bisher weder im Inland noch im Ausland in

gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.

Die vorliegende Arbeit wurde unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. K. Speer (TU

Dresden, Professur für Spezielle Lebensmittelchemie/Lebensmittelproduktion) in der

Zeit von April 2004 bis Dezember 2007 bei der Firma Quality Services International

GmbH in Bremen angefertigt.

Documents

Entwicklung neuer analytischer Methoden zur Erweiterung ... · ISO International Standard Organisation Kap. Kapitel kDa Kilo-Dalton kHz Kilohertz λ Wellenlänge min. Minute µm Mikrometer