Upload
truongkhanh
View
218
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Entwurf und Selektion von EGF-R spezifischen Peptiden,
sowie Generierung und Charakterisierung von
Peptid-Enzym-Fusionen
für die zielgerichtete Lokalisation am
epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor
Inaugural Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde
der Fakultät für Biologie
der Albert-Ludwigs Universität Freiburg
vorgelegt von
Illip Burmester
aus Frankfurt/Main
Mai 2008
Dekan der Fakultät für Biologie: Prof. Dr. Ad Aertsen
Betreuer der Arbeit: Jun.Prof. Dr. Kristian Müller
Co-Referent: PD Dr. Dirk Schneider
Vorsitzender der Dissertationskommision: Prof. Dr. Eberhard Schäfer
Tag der Verkündung des Prüfungsergebnisses: 24.11.2009
Meiner Familie
Danksagungen Juniorprof. Dr. Kristian Müller danke ich für die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe und die
Bereitstellung eines hochinteressanten Themas, welches ich im Rahmen eines Stipendiums
der Novartis Stiftung für therapeutische Forschung bearbeiten durfte.
Dr. Katja Arndt danke ich für ihr immer offenes Ohr und die Diskussionen bei den
Laborseminaren.
Meinem Kumpel Jochen Hecky danke ich für alle schönen und schweren Stunden, die mit
„Badesalz“ und viel Spaß erträglicher wurden.
Annette, ich glaube wir waren ein gutes Team!
Urs, Du warst immer ein sprudelnder Quell der Motivation mit Deiner mitreißenden Art.
Jody, we had a lot of fun in the lab, at lunch time and at the Kohler-Eck!
Allen Mitstreitern im Labor danke ich für die gute Stimmung.
Bei Gudrun Krüger möchte ich mich für Ihren unermesslichen Erfahrungsschatz bedanken,
von dem ich unendlich profitiert habe.
Bei Susanne Knall bedanke ich mich für die gute technische Hilfe.
Dr. Ekkehard Schulze danke ich für die exzellente Unterstützung am LI-COR Odyssey und
bei der konfokalen Immunfluoreszenz.
Prof. Dr. Sippel möchte ich für anregende und kritische Diskussionen danken, die im
schwierigen Fahrwasser für Orientierung sorgten.
Veröffentlichungen und Manuskripte
„EGF-R Targeted Multimeric Peptide-Enzyme Fusion Construct, Generated By Genetic
Fragmentation And Phage Display Selection”
Illip Burmester, Annette Gaida, Katja M. Arndt, Kristian M. Müller
-in Präparation-
„Rational Design of EGF-R Binding Peptides“
A. Gaida, I. Burmester, K. M. Arndt, K. M. Müller
-eingereicht-
„Life CAT/Dead CAT“
S. C. Stebel A. Gaida, I. Burmester, K. M. Arndt, K. M. Müller
-in Präparation-
Posterpräsentationen
Illip Burmester, Kristian M. Müller, “A Dominant Binding Motif of an Antibody Interacting with
EGF-Receptor Identified by Random DNA Fragmentation and Phage Display Selection”
Protein Sorting, Freiburg, Germany, March 6th - 8th 2005
Illip Burmester, Annette Gaida, Kristian M. Müller, “An antibody derived peptide as a
targeting module for the tumor marker EGF-Receptor”
Bioperspectives 2005, Wiesbaden, Germany, May 10th - 12th 2005
Illip Burmester, Annette Gaida, Kristian M. Müller, „Identification of an EGF-Receptor binding
peptide module for tumor targeting based on genetic fragmentation and phage display”,
Targeting the Kinome, Basel, Switzerland, December 4th - 6th 2006
Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne zulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus anderen Quellen direkt oder indirekt übernommenen Daten und Konzepte sind unter Angabe der Quellen gekennzeichnet. Insbesondere habe ich hierfür nicht die entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- beziehungsweise Beratungsdiensten (Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Die Arbeit wurde bisher weder im In- noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Die Bestimmung der Promotionsordnung der Fakultät für Biologie der Universität Freiburg sind mir bekannt, insbesondere weiß ich, dass ich vor Vollzug der Promotion zur Führung des Doktortitels nicht berechtigt bin. ___________________________ Illip Burmester
1 Einleitung ............................................................................ 1
1.1 Die EGF-R Familie .................................................................. 1
1.2 Biologische Funktion des EGF-R ......................................... 2
1.3 Liganden der EGF-R Familie ................................................. 3
1.4 Struktur des EGF-R ................................................................ 4
1.5 Rezeptor Aktivierung ............................................................. 5
1.6 EGF-R in der Tumorbiologie ................................................. 6
1.7 Wichtige Strategien zur zielgerichteten Inaktivierung des EGF-R ..................................................................................... 7
1.7.1 Antikörper ......................................................................................................... 7 1.7.2 Tyrosinkinase Inhibitoren ................................................................................ 9
1.8 Chloramphenikol-Acetyltransferase ................................... 10
1.9 EGF-R spezifischer, monoklonaler Antikörper 425 ........... 12
1.10 Einsatz von Peptiden in der Tumortherapie ....................... 13
2 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit ............................... 14
3 Konzeption der Ansätze ................................................... 15
4 Kapitel 1. Ansätze zum semirationalen Peptiddesign .. 20
4.1 Isolierung des Zielproteins sEGF-R aus A431 Zellkulturüberstand ............................................................. 20
4.2 Phage Display basierte Anreicherung eines EGF-R spezifischen Peptidmoduls aus einer Single-Chain Antikörper Genbibliothek .................................................... 21
4.2.1 Einleitung ........................................................................................................ 21 4.2.2 Ergebnisse ...................................................................................................... 22
4.2.2.1 Generierung der Genbibliothek durch DNase I Fragmentierung des scFv 425 Gens ........................................................................................ 22
4.2.2.2 Phage Display Selektion ........................................................................ 23 4.2.2.3 Bindungs-Rangliste drei dominanter Phagenklone aus der letzten
Selektionsrunde ..................................................................................... 26
4.3 Generierung eines N- und C-terminal Peptid dekorierten Fusionsenzyms: S-CAT-S, und Darstellung der Interaktionsstudien mit dem EGF-R ................................... 27
4.3.1 Einleitung ........................................................................................................ 27 4.3.2 Ergebnisse ...................................................................................................... 27
4.3.2.1 Klonierung der SSHIFTF codierenden Sequenz an das cat-Gen ........ 27 4.3.2.2 Rekombinante Herstellung und Reinigung ........................................... 28 4.3.2.3 Nachweis EGF-R spezifischer Bindung des S-CAT-S Konstrukts
mittels ELISA .......................................................................................... 29 4.3.2.4 Nachweis zellulärer Bindung und Analyse der zellulären Distribution
mittels konfokaler Immunfluoreszenz ................................................... 35 4.3.2.5 Test auf S-CAT-S : sEGF-R Interaktion mittels
Oberflächenplasmonresonanz .............................................................. 39 4.3.2.6 Wirkung des S-CAT-S Konstrukts auf den Wundverschluss von A431
Zellen ....................................................................................................... 42 4.3.2.7 Test auf Interaktion des S-CAT-S Fusionsproteins mit
membranständigem EGF-R auf A431 Zellen mittels Durchflusszytometrie ............................................................................. 45
4.3.3 Diskussion ...................................................................................................... 47
4.4 Das QWSSHIFTF-Streptavidin Konstrukt ........................... 50 4.4.1 Einleitung ........................................................................................................ 50 4.4.2 Ergebnisse ...................................................................................................... 51
4.4.2.1 ELISA basierter Versuch eines Bindungsnachweises für den QWSSHIFTF Streptavidin Komplex an immobilisierte sEGF-R Proteinoberfläche ................................................................................... 51
4.4.2.2 Bindungsnachweis für den QWSSHIFTF : NeutrAvidin Komplex an A431 Zellen mittels Durchflusszytometrie ............................................ 53
4.4.3 Diskussion ...................................................................................................... 55
4.5 Das S-GST-S Fusionsprotein .............................................. 56 4.5.1 Einleitung ........................................................................................................ 56 4.5.2 Ergebnisse ...................................................................................................... 56
4.5.2.1 Rekombinante Herstellung und Reinigung ........................................... 56 4.5.2.2 ELISA basierter Test auf S-GST-S : sEGF-R Interaktion ...................... 58
4.5.3 Diskussion ...................................................................................................... 58
4.6 Das SSHIFTF-Bla-T-Zip Konstrukt ...................................... 59 4.6.1 Einleitung ........................................................................................................ 59 4.6.2 Ergebnisse ...................................................................................................... 60
4.6.2.1 Klonierung und Reinigung ..................................................................... 60 4.6.3 Diskussion ...................................................................................................... 61
5 Kapitel 2 Ansätze zum rationalen Peptiddesign ........... 62
5.1 CDR H3 abgeleitetes Peptid als bindendes Modul für die Fusion an das CAT Enzym .................................................. 62
5.1.1 Einleitung ........................................................................................................ 62 5.1.2 Ergebnisse ...................................................................................................... 63 5.1.3 Das „CDR-Shuffling“ Vektorsystem ............................................................. 63 5.1.4 Klonierung, Reinigung und Interaktionsstudien des H3-CAT-H3
Fusionsproteins ............................................................................................. 66
5.1.4.1 ELISA basierter Test auf CDR H3 vermittelte Bindung des H3-CAT-H3 an immobilisierten sEGF-R .................................................................... 67
5.1.4.2 Untersuchung auf zelluläre Lokalisierung des H3-CAT-H3 mittels konfokaler Immunfluoreszenz ............................................................... 68
5.1.4.3 Biacore .................................................................................................... 69 5.1.5 Diskussion ...................................................................................................... 70
5.2 Der EGF-R Dimerisierungsarm als Inhibitor ...................... 71 5.2.1 Einleitung ........................................................................................................ 71 5.2.2 Ergebnisse ...................................................................................................... 73
5.2.2.1 Reinigung des biotinylierten EGF-R DA Peptids und anschließende Dekoration des Streptavidin zur Generierung eines Streptavidin : EGF-R DA Targetingkomplexes ..................................................................... 73
5.2.2.2 Oberflächenplasmonresonanz basierter Test auf EGFR-DA vermittelte Bindung an den sEGF-R ........................................................................ 75
5.2.2.3 FACS basierter Test auf EGFR-DA vermittelte Lokalisierung von EGFR-DA : NeutrAvidin OregonGreen 488 Komplexen auf A431 Zellen ................................................................................................................. 77
5.2.2.4 EGFR-DA vermittelte Inhibition des Wundverschlusses bei A431 Zellen ....................................................................................................... 78
5.2.3 Diskussion ...................................................................................................... 80
6 Ergänzendes Kapitel, Computer gestützte Simulation . 82
6.1 Einleitung ............................................................................. 82
6.2 Ergebnisse ........................................................................... 83
6.3 Diskussion ............................................................................ 87
7 Material & Methoden ......................................................... 89
7.1 Methoden .............................................................................. 89 7.1.1 Zellkultur ......................................................................................................... 89
7.1.1.1 Anzucht von A431 Kulturen ................................................................... 89 7.1.1.2 Ruhigstellung von Zellen ....................................................................... 89 7.1.1.3 Passagieren von A431 Kulturen für die Isolierung des löslichen
sEGF-R aus Zellkulturüberstand ........................................................... 90 7.1.1.4 Reinigung des sEGF-R aus Zellkulturüberstand .................................. 90 7.1.1.5 Fixieren von Zellen ................................................................................. 91
7.1.2 Phage Display ................................................................................................ 91 7.1.2.1 Amplifikation von Phagen ...................................................................... 91 7.1.2.2 Phagenselektion ..................................................................................... 92
7.1.3 Proteinbiochemische Methoden ................................................................... 93 7.1.3.1 Rekombinante Proteinexpression in E. coli RV308 .............................. 93 7.1.3.2 Zellaufschluss ........................................................................................ 93 7.1.3.3 SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ........................... 94 7.1.3.4 Coomassie-Blau Färbung von Proteingelen ......................................... 95 7.1.3.5 Western-Blot Analyse ............................................................................ 96
7.1.4 Chromatographische Methoden.................................................................... 96 7.1.4.1 Affinitätschromatographische Methoden ............................................. 96 7.1.4.2 Größenausschlusschromatographie .................................................... 98
7.1.5 Bindungsnachweismethoden ........................................................................ 99 7.1.5.1 Konfokale-Immunfluoreszenz ................................................................ 99 7.1.5.2 ELISA..................................................................................................... 100
7.1.5.3 Biacore .................................................................................................. 101 7.1.5.4 Durchflußzytometrie ............................................................................. 102
7.1.6 Zellaktivierungsassays ................................................................................ 102 7.1.6.1 Wundheilungsexperiment .................................................................... 102
7.1.7 Gentechnische Methoden ............................................................................ 104 7.1.7.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ...................................................... 104 7.1.7.2 DNase I Verdau ..................................................................................... 105 7.1.7.3 Präparation von Plasmid-DNA ............................................................. 105 7.1.7.4 Restriktionsverdau ............................................................................... 105 7.1.7.5 Agarose-Gel-Elektrophorese ............................................................... 105 7.1.7.6 Isolation von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen ............................ 106 7.1.7.7 Ligation ................................................................................................. 106 7.1.7.8 Transformation ..................................................................................... 107 7.1.7.9 Kinasierung von Oligonukleotiden...................................................... 107 7.1.7.10 Hybidisierung komplementärer Oligonukleotide............................ 107 7.1.7.11 Dephosphorylierung von Plasmidvektoren .................................... 107
7.2 Material ............................................................................... 108 7.2.1 Zelllinien ....................................................................................................... 108 7.2.2 Bakterienstämme ......................................................................................... 108 7.2.3 Nährmedien .................................................................................................. 108 7.2.4 Rekombinante DNA-Technik ....................................................................... 108 7.2.5 Antikörper ..................................................................................................... 109 7.2.6 Puffer ............................................................................................................ 109
7.2.6.1 Allgemein .............................................................................................. 109 7.2.6.2 sEGF-R Reinigung ................................................................................ 109 7.2.6.3 Reinigung der CAT-Fusionsproteine .................................................. 110 7.2.6.4 Reinigung der GST-Fusionsproteine .................................................. 110 7.2.6.5 Reinigung der β-Laktamase Fusionsproteine .................................... 110 7.2.6.6 SDS-Gelelektrophorese........................................................................ 110
7.2.7 Säulen und Säulenmaterial.......................................................................... 111 7.2.8 Geräte und Software .................................................................................... 111 7.2.9 Chemikalien .................................................................................................. 112 7.2.10 Allgemeine Plastikware ............................................................................ 114
8 Literatur ........................................................................... 115
9 Anhang ............................................................................ 123
9.1 Abkürzungen ...................................................................... 123
9.2 Plasmidkarten .................................................................... 125
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die zentrale Bedeutung des EGF-R bezüglich der Regulation zellulärer Kernprozesse
(Proliferation, Differenzierung, Migration, anti-Apoptose, etc.) bildete die Grundlage für die
Entwicklung zahlreicher EGF-R basierter Therapieansätze. Einige Tyrosinkinaseinhibitoren
und EGF-R Familien spezifische Antikörper wurden bereits für die Behandlung von Tumoren
in Europa und den USA zugelassen.
In der vorliegenden Arbeit sollte die grundlegende Möglichkeit der Verwendung kleiner
Peptide als spezifisch bindende Module für die Fusion mit enzymatisch aktiven
Proteingerüsten ausgelotet werden.
Im semi-rationalen Ansatz wurden aus einer scFv 425 basierten Genbibliothek mittels Phage
Display Peptide isoliert, die den EGF-R spezifisch binden sollten. Phagenklone aus der
letzten Selektionsrunde zeigten in ELISA Experimenten auf immobilisiertem sEGF-R und auf
A431 Zellen ein deutliches Bindungssignal. Den isolierten Sequenzen war ein
charakteristisches HXX-Tripeptidmotiv gemeinsam. Die Struktur des parentalen Antikörpers
mAK 425 zeigte rückversichender weise exponierte Histidinseitenketten in zwei CDR-
Schleifen. Die Ergebnisse der Selektion erschienen daher konsistent.
Durch die Fusion der selektierten Peptidsequenz SSHIFTF an das trimere Enzym
Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT) wurde ein Fusionsprotein generiert (S-CAT-S) und
auf EGF-R spezifische Interaktion getestet. In Abhängigkeit der angewandten Methode
konnte eine spezifische Lokalisation des S-CAT-S Fusionsenzyms am EGF-R nicht
zweifelsfrei nachgewiesen werden. Mittels ELISA und konfokaler Immunfluoreszenz konnte
eine Bindung nachgewiesen werden, zeigte jedoch leichten unspezifischen Hintergrund.
Mittels Durchflusszytometrie und BIAcore konnte dagegen keine Bindung an A431 Zellen
bzw. an sEGF-R nachgewiesen werden. Die Neigung des CATwt Enzyms zu unspezifischer
Bindung und die mutmaßlich geringe Affinität des Peptids könnten für die beobachteten
Phänomene ursächlich gewesen sein.
Eine potentielle Bindestelle des Peptids SSHIFTF konnte unter Verwendung des Programms
AutoDock4 berechnet werden, die mit den experimentellen Ergebnissen und Daten aus der
Literatur konform war. Die berechnete Konformation zeigte das Peptid in einer Interaktion mit
dem EGF-R unter bedeutender Beteiligung des Histidins, welches in auffälliger Weise als
Tripeptidmotiv in allen angereicherten Phagenklonen aus der Selektion präsent war. Für den
parentalen Antikörper mAK 425 wurde eine Kompetition mit dem natürlichen Liganden EGF
beschrieben. Mit dieser Beobachtung konform zeigte die gerechnete Konformation das
Peptid, welches aus der CDR L3 entstammt, in unmittelbarer räumlicher Nähe zur EGF-
Kontaktstelle.
Zusammenfassung
In einem weiteren Projekt wurde die hypervariable Schleife der schweren Kette des mAK 425
(CDR H3) als bindendes Modul abgeleitet, da diese CDR bei vielen Antikörper-Antigen
Kontakten den größten Beitrag zur Bindung leistet, und an das CAT Enzym fusioniert (H3-
CAT-H3). Eine CDR H3 vermittelte Bindung des H3-CAT-H3 Fusionsproteins an den EGF-R
konnte weder mittels ELISA und konfokaler Immunfluoreszenz, noch mittels BIAcore
nachgewiesen werden.
Die Analyse der Kristallstruktur des EGF-R offenbarte einen weiteren potentiellen
Angriffspunkt für die Entwicklung eines EGF-R Inhibitors. Ein Teil der Domäne II, auch
Dimerisierungsarm bezeichnet, ist an zwei, für die Rezeptoraktivierung, wesentlichen
Interaktionen beteiligt. Die intramolekulare Interaktion mit der Domäne IV hält den Rezeptor
in der inaktiven Konformation, während die intermolekulare Interaktion mit dem
Dimerisierungsarm einer weiteren Domäne II den Großteil der Interaktionsfläche im aktiven
Rezeptordimer ausmacht.
Eine Bindung des Dimerisierungsarms (MYNLPTTQMDV) konnte mittels ELISA, BIAcore
und Durchflusszytometrie nicht nachgewiesen werden, was erwartet werden konnte, da der
Dimerisierungsarm in beiden möglichen (aktive und inaktive) Konformationen unzugänglich
vorliegt. Im Wundheilungsexperiment mit A431 Zellen konnte bei Koinkubation von EGF und
Dimerisierungsarm eine Reduktion der EGF induzierten Stimulation auf das Niveau der
Mediumkontrolle beobachtet werden. Bei alleiniger Inkubation mit dem Dimerisierungsarm
wurde die intrinsische Proliferationsrate der A431 Zellen auf ein Maß unter der
Mediumkontrolle reduziert. Mit den experimentellen Ergebnissen konform könnte folgender
Wirkmechanismus postuliert werden: Nach EGF induzierter Rezeptorumlagerung wird für
kurze Zeit die Domäne II exponiert und kann durch den Dimerisierungsarm gebunden
werden, was eine Dimerisierung mit einem zweiten aktiven Rezeptor und folglich die
Aktivierung unterbinden könnte. Ohne EGF induzierte Exponierung der Domäne II könnte
das Peptid dagegen nicht an den EGF-R binden, da die Domäne II in der autoinhibierten,
unzugänglichen Konformation vorläge.
Einleitung
1
1 Einleitung
1.1 Die EGF-R Familie
Die Familie der Epidermalen Wachstums Faktor Rezeptoren (EGF-R) umfasst die vier eng
verwandten Mitglieder EGF-R (ErbB1/HER1), ErbB2 (HER2/Neu), ErbB3 (HER3) und ErbB4
(HER4). Bei dieser Familie handelt es sich um membranintegrale Rezeptor-Tyrosinkinasen
(RTK) mit extrazellulärer Ligandenbindungsdomäne und intrazellulärer Tyrosinkinase
Domäne. Diese regulieren fundamentale zelluläre Prozesse, die das Schicksal einer Zelle
terminieren; dazu gehören Proliferation, Anti-Apoptose, Migration, und Differenzierung. Eine
besondere Aufgabe kommt den verschiedenen Rezeptoren bei der Embryonalentwicklung in
den spezifischen Organen zu.
Aufgrund der Steuerung dieser zentralen zellulären Vorgänge unterliegt die Aktivität der RTK
in normalen Zellen einer strikten Kontrolle. Aktivierende Veränderungen an der Struktur oder
der Signalleitung der RTK führen folglich zu Entwicklung, Progression und auch
aggressiverem Wachstum humaner Tumore.
Beinahe 25 Jahre nach der Entdeckung des EGF-R durch Stanley Cohen und Mitarbeiter im
Jahre 1978 wurde dessen Kristallstruktur in den Jahren 2002/03 durch mehrere
Arbeitsgruppen komplexiert mit EGF (Ogiso, Ishitani et al. 2002), mit TGFa (Garrett, McKern
et al. 2002) und in der inaktiven Konformation (Ferguson, Berger et al. 2003) unabhängig
voneinander gelöst. Die Kristallstrukturen des ErbB2 und ErbB3 Rezeptors wurden von Cho
und Leahy (Cho und Leahy 2002; Cho, Mason et al. 2003) aufgeklärt. Die ErbB4
Kristallstruktur wurde von Bouyain und Leahy (Bouyain, Longo et al. 2005) gelöst.
Strukturelle Besonderheiten weisen der ErbB2 Rezeptor auf, der in einer aktiven
Konformation (Cho, Mason et al. 2003) vorliegt und keinen bekannten Liganden besitzt (Citri,
Skaria et al. 2003), dem ErbB4 Rezeptor fehlt dagegen die Tyrosinkinase Aktivität. Die durch
diese Arbeiten gewonnenen grundlegenden Erkenntnisse zeichnen heute ein detailliertes
Modell der Rezeptoraktivierung auf molekularer Ebene und haben großen Einfluss auf die
Entwicklung von Tumortherapien genommen.
Einleitung
2
1.2 Biologische Funktion des EGF-R
Die Tyrosin-Kinase-Rezeptoren (RTK) der ErbB Familie steuern zentrale zelluläre Vorgänge,
die über das Überleben, die Proliferation, Differenzierung und die Motilität der Zelle
entscheiden. Ein komplexes Geflecht von kreuzvernetzten Signalleitungskaskaden wird
durch die Rezeptoren dieser Familie gesteuert (Abbildung 1). Zu den wichtigsten EGF-R
initiierten Signalkaskaden zählen: ERK, JAK/STAT, PKC und PI-3K.
Die zentrale Bedeutung der ErbB Rezeptoren während der Embryonalentwicklung wurde
durch Knockout-Studien an Mäusen gezeigt. Hierbei zeigten sich die durch Rezeptor
Knockouts verursachten Folgen als besonders schwerwiegend, mit Rezeptor spezifischen
Schwerpunkten bei den betroffenen Organen. EGF-R Knockout Mäuse zeigen embryonale
oder perinatale Letalität. Die Embryos und Neugeborenen weisen starke Schäden der
Lunge, der Haut, des Gastrointestinaltrakts und einiger Bereiche des Gehirns auf (Miettinen,
Berger et al. 1995; Threadgill, Dlugosz et al. 1995; Sibilia, Steinbach et al. 1998). ErbB2
Knockout Mäuse zeigen ebenfalls einen embryonal letalen Phänotyp, jedoch weisen diese
schwere Schäden im peripheren Nervensystem auf (Morris, Lin et al. 1999; Woldeyesus,
Abbildung 1.) EGF-R induzierte Signalleitungskaskaden. Das Phosphorylierungsmuster der intrazellulären regulatorischen Domäne beeinflusst die spatio/temporale Induktion der Signalleitungskaskaden (aus (Reuter, Morgan et al. 2007).
x 2
Einleitung
3
Britsch et al. 1999). Im Gegensatz zu den durchweg letalen Rezeptor Knockouts sind die
Folgen einzelner Liganden-Knockouts weniger dramatisch, was sich in einer mit
wildtypischen Artgenossen vergleichbaren Lebensdauer ausdrückt (Mann, Fowler et al.
1993). Diese Daten lassen vermuten, dass die ErbB Rezeptoren während der Entwicklung
eine zentrale und spezifische Rolle bei der Signalintegration spielen und sich eine gewisse
Redundanz bei den Liganden entwickelt hat.
1.3 Liganden der EGF-R Familie
Zu den Liganden der EGF-R Familie, die zu den Peptidhormonen zählen, gehören EGF,
TGFa, Amphiregulin (AR), Betacellulin (BTC), Epiregulin (EPR), Epigen, Heparin bindendes
EGF (HB-EGF) und die Neureguline (NRG) (Harari und Yarden 2000; Yarden und
Sliwkowski 2001). Die Liganden können nach ihrer Spezifität in drei Klassen unterteilt
werden. Zu den EGF-R spezifischen Liganden zählen EGF, TGFa und AR, die zweite
Gruppe umfasst BTC, HB-EGF und EPR, die eine duale Spezifität für den EGF-R und
ErbB4 aufweisen. NRG-1 und NRG-2 weisen ebenfalls duale Spezifität für die Rezeptoren
ErbB3 und ErbB4 auf, die NRG-3 und NRG-4 dagegen nur für ErbB4.
Einleitung
4
1.4 Struktur des EGF-R
Die Kristallstruktur der extrazellulären Domäne des aktiven EGF-R wurde im Jahre 2003
unabhängig in zwei Gruppen aufgeklärt. Die EGF komplexierte (Ogiso, Ishitani et al. 2002)
und die TGF-a komplexierte Struktur (Garrett, McKern et al. 2002) zeigten übereinstimmend
ausschließlich Rezeptor vermittelte Dimer-Kontakte. Diese Arbeiten deckten somit einen
vollständig neuen Dimerisierungsmechanismus für RTK auf, da alle bis dato bekannten RTK
durch bivalente Liganden dimerisiert und damit
aktiviert wurden. Die Kristallstruktur des EGF
komplexierten EGF-R Dimers zeigte jedoch, dass
zwischen den beiden EGF Molekülen im Dimer eine
Distanz von 79 Å liegt. Der Nomenklatur von Lax et al.
folgend (Lax, Burgess et al. 1988; Lax, Johnson et al.
1988) wird die extrazelluläre Liganden-
Bindungsdomäne in die Domänen I bis IV unterteilt.
Die Domänen I und III vermitteln die Interaktionen zu
den Liganden und sind als rechtshändige -Helices
aufgebaut. Domänen II und IV weisen eine
charakteristische starke Disulfidverbrückung auf.
Domäne II ist maßgeblich an der Rezeptor:Rezeptor-
Interaktion beteiligt und trägt den größten Teil zur
gesamten Kontaktfläche von 1270 Å2 bei. Ein
charakteristisch aus der Struktur herausragender Arm
der Domäne II wurde als Dimerisierungsarm
bezeichnet, welcher wesentliche Kontakte im
Rezeptordimer vermittelt. Domäne IV trägt ebenfalls
einen Teil zur Kontaktfläche des Rezeptordimers bei
und ist weiterhin an der autoinhibitorischen Interaktion mit dem Dimerisierungsarm beteiligt.
An die extrazelluläre Domäne schließen sich die kurze Transmembran- und
Juxtamembrandomäne an, gefolgt von der Tyrosinkinasedomäne und der abschließenden
regulatorischen Domäne, die spezifische Bindemotive für Adapterproteine enthält.
Abbildung 2.) Schematische Repräsentation des EGF-R aus Burgess et al. Mol. Cell, 2003.
Einleitung
5
1.5 Rezeptor Aktivierung
Der Dimerisierungsmechanismus des EGF-R stellt eine Besonderheit unter den RTK dar.
Wie bei dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), dem
Nervenwachstumsfaktor (NGF) und dem humanen Wachstumsfaktor (hGH), wurde zunächst
eine durch Bivalenz des Liganden vermittelte Dimerisierung vermutet (Gullick 1994;
Lemmon, Bu et al. 1997; Tzahar, Pinkas-Kramarski et al. 1997). Die Auflösung der
A.
B.
Abbildung 3.) Vergleich der Proteinstrukturen des aktiven (B.) EGF-R Dimers (PDB-ID: 1IVO) und des inaktiven (A.) EGF-R Monomers (PDB-ID: 1NQL). A. Die inaktive Konformation zeigt den Dimerisierungsarm (orange) in der autoinhibierenden Interaktion mit Domäne IV (grün). Durch die Distanz zwischen den Domänen I und III (grau) kann EGF keine hochaffine Bindung mit beiden Domänen eingehen. B. Nach EGF induzierter Umlagerung des Rezeptors wird die Domäne II aus der inhibierenden Interaktion befreit und interagiert mit der Domäne II eines weiteren aktiven EGF-R Monomers. Der Dimerisierungsarm eines Rezeptors (orange) interagiert dabei mit der Basis (pink) der Domäne II des anderen Rezeptors.
Kristallstrukturen verschiedener Mitglieder der ErbB Rezeptor-Familie in aktivierten und
inaktiven Konformationen (Cho und Leahy 2002; Garrett, McKern et al. 2002; Ogiso, Ishitani
et al. 2002; Cho, Mason et al. 2003; Ferguson, Berger et al. 2003; Garrett, McKern et al.
2003) zeigte aber einen völlig neuen Mechanismus, bei dem je ein Ligand mit nur je einem
Rezeptor interagiert. Die Bindung eines Liganden an ein Rezeptormonomer induziert eine
Konformationsänderung, wobei eine ausgeprägte Umlagerung der Domänen I und III, die die
Kontakte zu den Liganden bilden, relativ zueinander erfolgt, der Dimerisierungsarm der
Domäne II exponiert und aus der inhibitorischen Interaktion mit der Domäne IV befreit wird.
Die Dimerisierung erfolgt hierauf ausschließlich durch Rezeptor-Rezeptor Interaktionen,
I
III
I
III
II
II
Einleitung
6
woran vorwiegend die Domäne II, in geringerem Umfang vermutlich auch Domäne IV
(Berezov, Chen et al. 2002) beteiligt sind. Im Gegensatz zu anderen Rezeptoren sind die
Liganden nicht direkt an der Interaktion beteiligt.
Die Dimerisierung des aktivierten EGF-R erfolgt zu Homodimeren und zu Heterodimeren,
vorzugsweise mit ErbB2 (Graus-Porta, Beerli et al. 1997; Duneau, Vegh et al. 2007). Nach
dieser Signalleitungskaskade initiierenden Homo- bzw. Hetero-Dimerisierung zweier
Rezeptormoleküle, erfolgt die trans-Autophosphorylierung definierter Tyrosinreste in der
jeweiligen intrazellulären Aktivierungsdomäne (Daub, Weiss et al. 1996).
1.6 EGF-R in der Tumorbiologie
Aufgrund der Implikation der ErbB Rezeptoren in zentralen, zellulären Prozessen, die das
Überleben, die Proliferation, Mobilität und Apoptosis von Zellen steuern, findet man sie
entsprechend häufig bei der Entstehung von Tumoren, sowie deren aggressivem Wachstum
und Metastasierung involviert. Für den EGF-R konnte erstmals eine direkte Verbindung
zwischen Rezeptor-Tyrosinkinasen und humanen Tumoren nachgewiesen werden. Erste
Hinweise, dass der EGF-R zur malignen Transformation von Zellen beitragen kann, beruhen
auf einer Arbeit von Downward et al. 1984 (Downward, Yarden et al. 1984), die eine hohe
Homologie einer EGF-R Peptidsequenz zum v-erbB Onkogen feststellten. Durch diese
inspiriert, folgten Arbeiten, die zeigen konnten, dass eine Überexpression des EGF-R oder
ErbB2 die maligne Transformation von NIH-3T3 Zellen induzieren (Di Fiore, Pierce et al.
1987). Weitere Arbeiten konnten den kausalen Zusammenhang zwischen EGF-R Anomalien
und der Entstehung von Tumoren herstellen. Der EGF-R stellt seither einen der wichtigsten
und meist untersuchten Tumormarker dar.
Die häufigsten in Tumoren gefundenen Anomalien der ErbB Rezeptoren sind auf
Genamplifizierung beruhende Überexpression des Rezeptors (Ohgaki, Dessen et al. 2004;
Sunpaweravong, Sunpaweravong et al. 2005), Mutation und damit verbundene konstitutive
Aktivierung des Rezeptors (Humphrey, Wong et al. 1990; Yamazaki, Ohba et al. 1990),
sowie parakrine und autokrine Stimulation durch Liganden zurückzuführen.
Dieser zentralen Bedeutung des EGF-R bei der Entstehung von Tumoren stehen jedoch nur
insgesamt 9 ErbB spezifische Antikörper gegenüber, von denen bis heute nur 3 als
Therapeutika durch die FDA zugelassen wurden, gleichwohl die Idee, Antikörper für EGF-R
spezifische Tumortherapie einzusetzen bereits vor 20 Jahren beschrieben wurde (Murthy,
Basu et al. 1987; Rodeck, Herlyn et al. 1987), was die Komplexität und Problematik der
zielgerichteten Tumortherapie deutlich zum Ausdruck bringt.
Einleitung
7
1.7 Wichtige Strategien zur zielgerichteten Inaktivierung des EGF-R
In den folgenden Abschnitten wird auf die Strategien eingegangen, die zu den klinisch
fortgeschrittenen und intensiv studierten zuzuordnen sind.
1.7.1 Antikörper
Anti-EGF-R Tumortherapien basierend auf Inhibition der Rezeptorfunktion zeigten in der
Klinik keinen so durchschlagenden Erfolg, wie man es von den präklinischen Studien hätte
erwarten können. Dies liegt sicherlich an der Kombination von physiologischen
Veränderungen in Tumorgeweben (Unabhängigkeit und/oder Redundanz vieler Signalwege)
und den suboptimalen Parametern (Tumorpenetration, maximal erreichbare Dosis, etc) vieler
Therapeutika.
Zu den intensiv untersuchten Antikörpern gehört Erbitux (Cetuximab), der durch die
amerikanische „Food and Drug Administration“ (FDA) im Jahre 2004 für die Behandlung von
Patienten mit fortgeschrittenen Kolonkarzinomen zugelassen wurde, die nicht mehr auf
Behandlung mit Irinotecan ansprechen. Die Zulassung beruhte auf einer Studie, die eine
klinische Reaktion von 11% als Monotherapie und 22,9% als Kombinationstherapeutikum
zeigte (Cunningham, Humblet et al. 2004). Mit einer Reaktionsrate von 10% zeigte sich der
vollständig humane Antikörper Panitumumab (ABX-EGF) bei Patienten mit fortgeschrittenem
Kolonkarzinom ähnlich erfolgreich (J. R. Hecht 2004). Auch der humanisierte Antikörper
Matuzumab (EMD 72000) war bei der Behandlung von Kolonkarzinoma nicht erfolgreicher
(Vanhoefer, Tewes et al. 2004); (R. Salazar 2004).
Tabelle 1.) Übersicht über Antikörper in klinischen Studien bzw. mit Zulassung durch die FDA. Stand: Juni 2007
Handelsname Zielprotein Firma Entwicklungsstatus Alternativbezeichnung Typ
Matuzumab EGF-R Merck KGaA klinische Studien EMD 72000 humanisierter AK
Erbitux EGF-R ImClone & Merck FDA Zulassung,
2004 Cetuximab, IMC-C225 chimärer AK
HuMax-EGFR EGF-R in FDA Fast Track
Panitumumab EGF-R Amgen/Abgenix FDA Zulassung,
2006 Vectibix, ABX-EGF vollst. humaner AK
TheraCIM EGF-R YM Biosciences & CIM klinische Studien hR-3 humanisierter AK
Mab 806 EGF-R vIII Ludwig Institut
Herceptin ErbB2 Genentech & Roche FDA Zulassung,
1998 Trastuzumab humanisierter AK
Omnitarg ErbB2 Genentech klinische Studien Pertuzumab, 2C4 humanisierter AK
MDX-211 ErbB2 & Fc
RI klinische Studien
Einleitung
8
Einige Studien zeigten eine höhere Effizienz bei frühzeitigem Einsatz der Antikörper in
Kombination mit Chemo- und Strahlentherapie. In einer Studie konnte für Erbitux eine
Reaktionsrate von 80% nachgewiesen werden (Matar, Rojo et al. 2004). In einer weiteren
Studie mit Patienten, die an fortgeschrittenen Nacken-und-Kopf-Tumoren leiden konnte eine
signifikante Steigerung der mittleren Überlebensdauer von 54 Monaten gegenüber 28
Monaten ohne Erbitux gezeigt werden.
Die beschriebenen Sachverhalte zeigen deutlich den enormen Aufwand zur Optimierung der
Anwendungsparameter für jeden einzelnen Antikörper und die relativ limitierte Effizienz der
entwickelten Antikörper im klinischen Einsatz, entgegen viel versprechender präklinischer
Studien.
Bisher befinden sich 9 anti-ErbB Antikörper in verschiedenen Phasen klinischer Studien, von
diesen erhielten Erbitux und Herceptin die Zulassung für die Behandlung von kolorektal
Karzinomen (Erbitux) bzw. ErbB2 überexprimierenden Brustkrebs (Herceptin) durch die FDA
(Tabelle 1).
Einleitung
9
1.7.2 Tyrosinkinase Inhibitoren
Neben Antikörpern stellen die Tyrosinkinase Inhibitoren (TKI) die zweite große Klasse EGF-
R spezifischer Inhibitoren. Tyrosinkinase Inhibitoren binden reversibel order irreversibel an
die Kinasedomäne des Rezeptors. Auch diese Klasse EGF-R spezifischer Therapeutika
setzt auf die Inhibition der Rezeptorfunktion und unterliegt somit dem gleichen, wie schon für
die Antikörper beschrieben, konzeptionellen Nachteil (1.7.1).
Durch die Verfügbarkeit der Kristallstrukturen der EGF-R Familienmitglieder und dem
Fortschritt in der Computer gestützten Simulation erfuhr die Klasse kleiner Moleküle dennoch
einen großen Aufschwung in der pharmazeutischen Industrie, die im „high throughput“
Verfahren große chemische Bibliotheken auf potentielle Inhibitoren durchsuchten.
Ein prominentes Beispiel eines in präklinischen Studien sehr erfolgreichen (Baselga und
Averbuch 2000; Ciardiello, Caputo et al. 2000), aber in späteren breit angelegten klinischen
Studien wenig erfolgreichen (Thatcher, Chang et al. 2005) TKIs ist Gefitinib. Später sollte
sich herausstellen, dass eine Mutation in der Tyrosinkinase-Domäne indikativ für eine
erfolgreiche Therapie mit Gefitinib war (Lynch, Bell et al. 2004). Ein irreversibler Pan-ErbB-
TKI ist Carnetinib, dessen Funktionsmechanismus auf der Alkylierung eines Cysteins in der
ATP-Bindetasche einerseits (Smaill, Rewcastle et al. 2000) und auf der durch
Ubiquitinylierung induzierten Rezeptordegradation andererseits beruht (Citri, Alroy et al.
2002). Tabelle 2 zeigt eine Übersicht ErbB spezifischer Tyrosinkinase Inhibitoren (Bianco,
Gelardi et al. 2007).
Tabelle 2) Anti-EGF-R Tyrosinkinase Inhibitoren
Substanz Zielprotein Tumor
ZD1839, Gefitinib EGF-R NSCLC
OSI-774, Eroltinib EGF-R, EGF-RvIII NSCLC, Pankreas
CI-1033, Carnetinib Pan-ErbB SCC
ZD6474 EGF-R, VEGF-R-2, RET NSCLC
EKB-569 EGF-R, ErbB2 Kolorektal
PKI-166 EGF-R, ErbB2 Prostata, renal
GW-572016 EGF-R, ErbB2 Brust, NSCLC
ARRY-334543 EGF-R, ErbB2 Brust, Lunge, Epidermis
PD153035 EGF-R Glioma, Brust, SCCHN
AEE788 EGF-R, VEGF-R-2 Glioma, Kolon
BMS 599626 EGF-R, ErbB2 Solide Tumore
Einleitung
10
1.8 Chloramphenikol-Acetyltransferase
Das Enzym Chloramphenikol-Acetyltransferase I (CATI) vermittelt die bakterielle Resistenz
gegen das Antibiotikum Chloramphenicol, einem potenten Inhibitor der bakteriellen
Proteinsynthese mit breitem Wirkspektrum (Schwarz, Kehrenberg et al. 2004). Die CAT
Enzymfamilie wird in die Typ-A und Typ-B Acetyltransferasen unterteilt, wobei zur ersteren
mindestens 16 Gruppen und zu letzterer fünf Gruppen gezählt werden. Das catI Gen wurde
ursprünglich als Teil des Transposons Tn9 in E.coli identifiziert und stellt den Prototypen der
A-1 Gruppe dar (Alton und Vapnek 1979). Die drei aktiven Zentren des homo-trimeren
Enzyms liegen an den Schnittstellen der drei Untereinheiten (Day, Murray et al. 1995), wobei
A.
B.
Abbildung 4.) Stereo-„Cartoon“ Darstellung der bakteriellen Chloramphenikol-Acetyltransferase (CAT, PDB-ID: 1NOCb). A. Aufsicht auf das trimere Enzym. Untereinheiten sind farblich unterschieden. Termini aller Untereinheiten wurden als Kugeln dargestellt. B. Seitenansicht der trimeren CAT, um 90 ° gekippte Darstellung.
Einleitung
11
das H-195 (Nomenklatur für CATIII) das katalytisch aktive Zentrum bildet und entsprechend
hochkonserviert ist (Kleanthous, Cullis et al. 1985).
Die Termini der trimeren CATI sind tolerant gegenüber Modifikationen, liegen exponiert an
der Oberfläche des Enzymkomplexes (Abbildung 4) und bieten damit gute Voraussetzungen
für die Fusion EGF-R spezifischer Peptide. Die sechsfache Valenz der fusionierten Peptide
sollte zudem eine gute Ausgangsbasis für das Zustandekommen eines Aviditätseffekts
darstellen. Die gute rekombinante Expressionsrate des cytosolischen CAT Enzyms in E. coli
RV308 und die effiziente Einschrittreinigung aus Rohzellextrakten machten das Enzym
weiterhin zu einem geeigneten Kandidaten für die Verwendung als Modellenzym.
Einleitung
12
1.9 EGF-R spezifischer, monoklonaler Antikörper 425
Die für die vorliegende Arbeit generierten Peptide wurden aus dem murinen monoklonalen
Antikörper 425 (mAK 425) abgeleitet.
Der mAK 425 wurde erstmals 1987 von Rodeck et al. publiziert (Rodeck, Herlyn et al. 1987)
und zeigte in dieser Studie mit einem Kd-Wert von ~1 nM eine hohe Affinität zum EGF-R auf
A431 Zellen. Bei Konzentrationen > 1nM konnte ein inhibitorischer Effekt auf das Wachstum
von A431 Zellen festgestellt werden, der von den Autoren als zytostatisch, jedoch nicht
zytotoxisch beschrieben wurde. Ferner kompetitiert der mAK 425 mit dem natürlichen
Liganden EGF um die Bindestellen am Rezeptor, induziert effizient die Rezeptor-
Internalisierung, und verhindert auch die Rezeptor-Phosphorylierung (Murthy, Basu et al.
1987).
Bis heute wurde keine Proteinstruktur des
mAK 425 beschrieben, der als Quelle für
die Ableitung zielgerichtet bindender
Peptide diente. Die dreidimensional
Struktur des mAK 425 wurde daher in
Ermangelung einer Kristallstruktur durch
den Dienst „Web Antibody Modelling“
(WAM) berechnet (Abbildung 5).
Die variablen Regionen von Antikörpern,
die die Spitze eines Antikörpers bilden,
bestehen zum einen aus den relativ
konservierten, strukturgebenden
„framework“ Regionen und zum anderen
aus den hypervariablen Schleifen (CDR),
die die Antigenkontaktstelle bilden. Die
hypervariablen Schleifen werden mit
Ausnahme der CDR H3 nach der Anzahl an AS und der Präsenz bestimmter AS in
kanonische Klassen unterteilt. Die Schleifen einer kanonischen Klasse zeigen eine sehr
große Strukturhomologie zwischen unterschiedlichen Antikörpern.
Abbildung 5.) Dreidimensionale Struktur des mAK 425 berechnet mit “WAM”. Die Sequenz des durch Phage Display selektierten und für das S-CAT-S Konstrukt verwendeten Peptids ist rot eingefärbt. Programm: MacPyMOL
Einleitung
13
1.10 Einsatz von Peptiden in der Tumortherapie
Obgleich Peptide adäquate Voraussetzungen sowohl für die Tumortherapie als auch für die
optische Bildgebung von Tumoren aufweisen (Heppeler, Froidevaux et al. 2000), ist die
Verfügbarkeit von EGF-R spezifischen Peptiden bis heute äußerst limitiert.
Aufgrund der geringen Größe von Peptiden weisen diese zwar eine gute Gewebegängigkeit
auf, werden jedoch sehr rasch, in Abhängigkeit der Größe, aus der Blutbahn eliminiert, was
einer spezifischen Anreicherung im Tumorgewebe entgegensteht (DeNardo, Yao et al.
2003). Daher musste die rasche Eliminierung von Peptiden aus dem Blutkreislauf durch
renale Filtration und enzymatische Degradation mithilfe z.B. der PEGylierung optimiert
werden, um den nachteiligen Aspekt der geringen Größe auszugleichen (Caliceti und
Veronese 2003; Werle und Bernkop-Schnurch 2006).
Die Affinität von EGF-R spezifischen Peptiden liegt meist im mikromolaren Bereich (Park,
Zhang et al. 2000; Karasseva, Glinsky et al. 2002), und konnte durch Multimerisierung unter
Ausnutzung des Aviditätseffekts bis in den niedrigen nanomolaren Bereich gesteigert werden
(Houimel, Schneider et al. 2001). Mittels Phage Display konnten Li et al. ein EGF-R
spezifisches Peptid mit mutmaßlich nanomolarer Affinität isolieren (Li, Zhao et al. 2005),
ohne dass bis heute, trotz vielfältiger Einsatzmöglichkeiten und hoher Nachfrage nach
Rezeptor spezifischen Peptiden, eine Folgepublikation nachgelegt werden konnte.
Die Auflistung zeigt die wichtigsten bis heute publizierten, EGF-R Familien spezifischen
Peptide:
KCCYSL, ErbB2 spezifisches Peptid, isoliert mittels Phage Display, (Karasseva,
Glinsky et al. 2002)
Pab-XXXXXX, ErbB2 spezifisches Peptid, isoliert mittels Phage Display, (Houimel,
Schneider et al. 2001)
AHNP, ErbB2 spezifisches Peptid, CDR H3 abgeleitetes Peptid, (Park, Zhang et al.
2000)
GE-11, EGF-R spezifisches Peptid, isoliert mittels Phage Display, (Li, Zhao et al.
2005)
Die offensichtliche Unterrepräsentation EGF-R spezifischer Peptide, obgleich Peptide in der
Bildgebung und Tumortherapie heute bereits eine bedeutende Rolle spielen (Sergeeva,
Kolonin et al. 2006; Balestrieri und Napoli 2007), war Ansporn für die vorliegende Arbeit.
Einleitung
14
2 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit
Seit der Entdeckung des EGF-R und seiner Bedeutung bei der Steuerung zentraler zellulärer
Funktionen, die das Überleben steuern, standen und stehen sowohl Antikörper als auch
Kinase-Inhibitoren besonders im Fokus der molekularen Tumortherapie. Einige Antikörper
(Tabelle 1) und Kinase-Inhibitoren haben in den vergangenen 5 Jahren durch die FDA in den
USA die Zulassung für die Behandlung von Tumoren meist als zweitlinien Therapeutikum
oder Kombinationstherapeutikum mit herkömmlicher Strahlen- und Chemotherapie erhalten.
Das ursprüngliche Ziel dieser Therapeutika war jedoch der Einsatz als Monotherapeutikum,
um Nebenwirkungen, die durch die Strahlen- und Chemotherapie hervorgerufen werden, zu
minimieren. Dieses Ziel konnte bis heute nicht erreicht werden.
Die Wirkmechanismen von Antikörpern (und deren Derivaten) und Kinaseinhibitoren setzen
auf die Inhibition der Rezeptorfunktion, um die aberante Funktion desselbigen, welche als
ursächlich für die Entstehung des Tumors betrachtet wird, zu blockieren und somit die
entarteten Zellen abzutöten. Ein solcher Ansatz bedingt naturgemäß immer einen
erheblichen Selektionsdruck auf die behandelten Zellen, dem diese durch Anpassung und
Mutation entgehen können, wobei die in der Regel höhere Proliferationsrate von Tumorzellen
einen diesbezüglich begünstigenden Faktor darstellt. Auf Dauer besteht also der
konzeptionelle Nachteil, dass sich die behandelten Tumore dem Selektionsdruck und damit
der Behandlung entziehen können (Pao, Miller et al. 2005; Rubin und Duensing 2006;
Wheeler, Huang et al. 2008).
Der in der vorliegenden Arbeit dargestellte Ansatz hingegen zielte nicht auf die Inhibition der
biologischen Funktion des Rezeptors, sondern sollte klären, ob unter Ausnutzung eines
Aviditätseffekts durch Multimerisierung von Peptiden auf einem enzymatisch aktiven
Gerüstprotein eine spezifische Lokalisation eines Targetingkonstrukts am EGF-R und als
Fernziel eine Diskriminierung zwischen Zellen mit normaler und hoher Oberflächendichte des
EGF-R möglich wären.
Eine sekundär administrierte inaktive Wirkstoffvorstufe könnte in einer späteren klinischen
Anwendung am Tumor enzymatisch in die aktive Form des Wirkstoffs umgesetzt werden, der
die Tumorzellen unabhängig von der biologischen Funktion des Rezeptors, abtöten sollte.
Die Vorliegende Arbeit sollte grundlegend die Möglichkeit, Peptide als spezifische
Bindungsmediatoren für eine spätere Anwendung in der Wirkstoffaktivierungstherapie
(Rooseboom, Commandeur et al. 2004; Sharma, Bagshawe et al. 2005; Egri und Takats
2006) ausloten.
Einleitung
15
3 Konzeption der Ansätze
Die fortgeschrittensten und teilweise bereits bis in die klinische Anwendung vorgedrungenen
Ansätze zur Inhibition der EGF-R Funktion in der Tumortherapie haben in den letzten Jahren
ihre klinische Effizienz durch Anwendung als Kombinationstherapeutika deutlich steigern
können und haben sich bei einigen Spezialfällen sogar als sehr erfolgreich erwiesen (Erbitux,
Iressa). Dennoch konnte die klinische Wirkung nicht die hohen Erwartungen aus den
präklinischen Studien einiger Antikörper und TKI erfüllen (Mendelsohn und Baselga 2006).
Diese Umstände verdeutlichen die Notwendigkeit zur Nutzung einer Effektorfunktion über die
einfache Inhibition der Rezeptorfunktion hinaus. Einen Ansatz diese Effektorfunktion mit der
zielgerichteten Markierung des EGF-R zu verknüpfen stellt die Fusion des Pseudomonas
aeruginosa Endotoxins A (ETA) mit dem scFv 425 dar (Bruell, Stöcker et al. 2003). Ein
anderer sehr eleganter Ansatz wurde von Novac et al. publiziert. Hierbei wurde ein
kovalenter, hoch aktiver MHC/Peptid Komplex mit einem aus dem C225 Antikörper
abgeleiteten „single chain“ Antikörper fusioniert. Der MHC/Peptid Komplex induzierte effizient
zytotoxische T-Zellen (CTL) an der Tumorzelle, die daraufhin durch die CTL abgetötet wurde
(Novak, Noy et al. 2007).
Der hier dargestellte Ansatz soll in Ergänzung der vorangehend erwähnten Ansätze die
Möglichkeiten eines zielgerichtet den EGF-R bindenden Peptid/Enzym Konstrukts für die
spätere Anwendung in der Wirkstoffaktivierungstherapie ergründen.
Ein solches Konstrukt benötigt zwei Module, zum einen das Modul, welches die spezifische
Bindung vermittelt, und zum anderen das enzymatisch aktive Modul. Da Antikörper und aus
diesen abgeleitete Fragmente erheblich an Molekulargewicht zu dem bereits großen Gerüst-
Protein hinzufügen würden, wurden in dieser Arbeit kurze Peptide als bindende Module
generiert. In dem hier erstmals beschriebenen Ansatz für die Ableitung einer Peptidbibliothek
aus der Sequenz eines bereits existenten, künstlichen Liganden diente die Sequenz des
scFv 425 als Quelle. Diese Methode kann jederzeit auch auf kombinierte Gen-Bibliotheken
von natürlichen und künstlichen Liganden (z.B. Antikörper, Antikörperfragmente, Kamel-
Antikörper, etc.) erweitert werden.
Einleitung
16
Abbildung 6) Schematische Darstellung der Technik zur Generierung von Peptidbibliotheken aus einzelnen oder kombinierten scFv Genbibliotheken. A. & B. DNase I Fragmentierung des scFv 425 Gens. C. Klonierung der generierten Fragmente in die Sma I Restriktionsschnittstelle des modifizierten Phagenvektors M13 KE. D. 6 Selektionsrunden der Phagenbibliothek auf sEGF-R und A431 Zellen. E. Vergleich der 3 meistvertretenen Phagenklone mittels ELISA. F. Die Sequenz von Klon #3 (SSHIFTF) stammt aus der CDR 3 der leichten Kette des mAk425. G. Sequenz von Klon #3 wurde 5´- und 3´zum cat-Gen kloniert. Fusionsprotein wurde S-CAT-S benannt.
Einleitung
17
Der vermeintliche Nachteil geringerer Affinität eines Peptids sollte durch Fusion an das
trimere Enzym ausgeglichen werden, da durch die Fusion an den N- und C-Terminus der
trimeren Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT) eine sechsfache Valenz erreicht wird und
damit der Aviditätseffekt hervorgerufen werden sollte. Der Aviditätseffekt kann prinzipbedingt
vornehmlich auf EGF-R überexprimierenden Zellen zum tragen kommen, da nur hier
ausreichend Interaktionspartner für das Konstrukt zur Verfügung stehen. Der in der
vorliegenden Arbeit dargestellte Ansatz, Peptide mit mittlerer Affinität als Bindemodule
einzusetzen und durch eine multivalente Präsentation auf einem Enzym, welches zugleich
als Gerüst und enzymatisch aktive Komponente fungiert, aviditätsbasierte Bindung an das
Ziel zu rekonstituieren, wird erstmals beschrieben. Auf diese Weise sollte auch die
Möglichkeit einer Diskriminierung zwischen EGF-R überexprimierenden Tumorzellen und
gesunden Zellen mit geringerer Oberflächenexpression des EGF-R ergründet werden. Durch
Arbeiten anderer Gruppen wurde inzwischen nachgewiesen, dass multivalente Interaktionen
mittlerer aparenter Affinität vorteilhaft für die gleichmäßige Verteilung und Retention des
Konstrukts im und am Tumor sind (Adams, Tai et al. 2006).
Das Enzym CAT wurde in diesem Fall gewählt, da es funktionell als Trimer vorliegt und
beide Termini frei zugänglich an der Oberfläche der Enzymstruktur liegen. Somit eignet sich
das Enzym für eine multivalente Präsentation des bindenden Peptidmoduls. Ferner zeigt sich
CAT tolerant gegenüber Modifikationen an beiden Termini.
Beschreibung der experimentellen Strategie:
Das Gen des scFv 425 wurde durch kontrollierte DNase I Behandlung zu Fragmenten von
ca. 20 bis 30 Basenpaaren verdaut (Abbildung 6,A. & B.). Die generierten Fragmente wurden
„blunt end“ in die Sma I Restriktionsschnittstelle des modifizierten M13 KE Phagenvektors
kloniert (Abbildung 6, C.). Die Peptid präsentierenden Phagen wurden nachfolgend einer
Affinitätsselektion auf immobilisiertem sEGF-R und A431 Zellen unterzogen (Abbildung 6 D.).
Die alternierende Vorgehensweise, bei der zunächst zwei Runden auf immobilisiertem
Rezeptor, dann zwei Runden auf A431 und abschließend wieder auf immobilisiertem
Rezeptor unter schrittweise erhöhter Stringenz selektiert wurde, sollte die Anreicherung von
nicht-EGF-R spezifischen Phagen unterbinden. Nach der letzten Selektionsrunde wurden
Phagen auf Platten vereinzelt und individuelle Klone sequenziert. Die drei häufigsten
Phagenklone wurden amplifiziert und einem ELISA auf immobilisiertem EGF-R unterzogen,
um deren Bindungsfähigkeit zu verifizieren (Abbildung 6, E.). Phagenklon #3 wurde für das
weitere Vorgehen ausgewählt. Die Sequenz dieses Klons stammt aus der hypervariablen
Region der leichten Kette des mAk425 (Abbildung 6, F.) Die selektierte Sequenz wurde an
beide Termini des cat-Gens fusioniert (Abbildung 6, G.). Das Fusionskonstrukt wurde in E.
Einleitung
18
coli RV308 rekombinant exprimiert und in einer Einschrittreinigung mittels
Affinitätschromatographie bereits zu hoher Reinheit isoliert. Abschließend wurde das
gereinigte Protein über eine Gelfiltrationssäule umgepuffert und von Chloramphenicol
abgetrennt. Das gereinigte Fusionsprotein S-CAT-S wurde im nachfolgend weiter
charakterisiert.
Einleitung
19
Gliederung des experimentellen Ergebnisteils:
In Kapitel 1 wird auf den Ansatz des semirationalen Peptiddesigns eingegangen, dieses
umfasst die Fragmentierung der aus dem scFv 425 abgeleiteten genetischen Bibliothek, die
sich daran anschließende Phage Display basierte Selektion eines EGF-R bindenden
Peptids, sowie die Anwendung des selektierten Peptids in Fusionskonstrukten mit den
enzymatisch aktiven „Proteingerüsten“ Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT),
Gluthathion-S-Transferase (GST) und der -Laktamase . Kapitel 1 beschäftigt sich darüber
hinaus mit dem Peptid der Aminosäuresequenz QWSSHIFTF, welches auf der selektierten
Sequenz (SSHIFTF) basierend die gesamte dritte hypervariable Schleife der schweren Kette
des mAK 425 umfasst.
In Kapitel 2 werden zwei Peptide beschrieben, die durch rationales Peptiddesign abgeleitet
wurden. Bei dem Peptid H3 handelt es sich um ein aus dem mAK 425 abgeleitetes Peptid,
welches die gesamte dritte hypervariable Schleife der schweren Kette umfasst. Dieses
Peptid wurde als Fusionskonstrukt mit dem CAT Enzym untersucht. Das zweite in diesem
Kapitel behandelte Peptid wurde anders als alle anderen dargestellten Peptide aus dem
EGF-R selbst abgeleitet.
Im ergänzenden Kapitel wird die computergestützte Vorhersage möglicher
Rezeptorbindungsstellen für die Peptide beschrieben. Da bis heute keine Kristallstruktur des
mAK 425 : EGF-R Komplexes publiziert wurde, wurde der Versuch unternommen, mithilfe
des Programms Autodock4 eine Vorhersage bezüglich einer potentiellen Bindungsstelle am
EGF-R zu treffen.
Ergebnisse
20
4 Kapitel 1. Ansätze zum semirationalen Peptiddesign
In diesem Kapitel soll der semirationale Ansatz zur Ableitung eines EGF-R spezifischen
Peptides für die potentielle Anwendung z.B. in der Wirkstoffaktivierungstherapie dargestellt
werden.
4.1 Isolierung des Zielproteins sEGF-R aus A431 Zellkulturüberstand
Die von A431 Zellen in das Kulturmedium sekretierte Variante des EGF-R (sEGF-R) diente
als Zielmolekül für ELISA, BIAcore und die Phagen-Selektion. Der sEGF-R entsteht bei A431
Zellen aus einer 2.8 kb mRNA, einer Splice-Variante der vollständigen EGF-R mRNA, die für
den sekretierten sEGF-R (115 kDa apparentes Molekulargewicht) kodiert (Mayes und
Waterfield 1984; Ullrich, Coussens et al. 1984). Das Molekulargewicht von 115 kDa kommt
durch ausgeprägte Glykosilierung zustande, die Polypeptidkette selbst weist ein
Molekulargewicht von 70 kDa auf. Der Überstand konfluenter, in Hungermedium (DMEM/F12
Medium ohne FCS) kultivierter A431 Zellen wurde geerntet. Der sEGF-R wurde mittels
Affinitätschromatographie unter Verwendung des EGF-R spezifischen, an Chitinbeads
gekoppelten scFv 425 aus dem Kulturüberstand isoliert. SDS-Gel Analysen bestätigten einen
hohen Reinheitsgrad des isolierten Proteins (Abbildung 7, A.). Typischerweise wurden aus 1
l Kulturüberstand 500 µg - 700 µg Protein gewonnen. Die Identität des isolierten sEGF-R
wurde durch Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen die N-terminale Domäne
des EGF-R in einem Western-Blot bestätigt (Abbildung 7, B.).
A.
B.
Abbildung 7) A. 12.5 % SDS-Gel des aus Zellkulturüberstand isolierten sEGF-R. Der Rezeptor konnte in einer Ein-Schritt Reinigung zu hoher Reinheit isoliert werden. Die ersten vier Elutionsfraktionen wurden aufgetragen. B. Die Identität des isolierten sEGF-R wurde mittels monoklonalem Antikörper (14C8, NanoTools) gegen die N-terminale Domäne durch Western-Blot bestätigt.
Ergebnisse
21
4.2 Phage Display basierte Anreicherung eines EGF-R spezifischen Peptidmoduls aus einer Single-Chain Antikörper Genbibliothek
4.2.1 Einleitung
Die einleitend beschriebenen, bereits in der Entwicklung als auch in der Anwendung weit
fortgeschrittenen EGF-R spezifischen Bindemodule, wie Antikörper und Single-Chain-
Antikörper haben in den letzten Jahren deutliche Erfolge verzeichnet und bilden die
Grundlage für die gesteigerte Effizienz in der Tumortherapie. Jüngere klinische Studien
zeigten aber auch ihre Grenzen auf, da der Wirkmechanismus in der Regel auf reiner
Inhibition der Rezeptorfunktion beruht, einige Tumore aber per se oder sich dem
therapeutische Druck entziehend unabhängig von der EGF-R Aktivierung werden (Pao,
Miller et al. 2005; Rubin und Duensing 2006; Wheeler, Huang et al. 2008). Um diese
Problematik aufzugreifen wurden einige Ansätze veröffentlicht (Würdinger, Verheije et al.
2005; Dalken, Giesubel et al. 2006; Novak, Noy et al. 2006), die auf einer spezifischen
Bindung an den EGF-R beruhen, darüber hinaus aber noch eine Effektorfunktion umfassen
(z.B. ADEPT, GDEPT, Antikörper-Toxin Fusionen). Für solche Strategien sind aus
theoretischen Überlegungen große Antikörper und auch aus diesen abgeleitete Single-
Chain-Antikörper und Fragmente zu groß, da sie an ein potenziell bereits großes Enzym
gekoppelt werden müssen was zu schlechter Tumorpenetration, inhomogener Verteilung im
Gewebe und langer Zirkulation durch die Blutbahn führt.
Der Einsatz von Peptiden als spezifische Bindemodule erscheint daher als der nächste
folgerichtige Evolutionsschritt in dem Bestreben, die molekulare Tumortherapie an die
Parameter für den erfolgreichen klinischen Einsatz zu anzupassen.
Seit der ersten Anwendung der Phage Display Technologie durch Smith et al. (Smith 1985)
wurde diese Technologie unzählige Male eingesetzt, um spezifisch bindende Peptide zu
isolieren. Dabei konnte beobachtet werden, dass häufig Domänen oder Sequenzen natürlich
vorkommender Proteine angereichert wurden (Hartley 2002; Smothers, Henikoff et al. 2002).
Eine Bibliothek mit bereits angereicherten Sequenzen sollte daher die Wahrscheinlichkeit
spezifische Peptide zu isolieren erhöhen. Die Voranreicherung der Bibliothek wurde durch
die Verwendung des scFv 425 Gens umgesetzt, das als genetische Quelle diente.
Ergebnisse
22
4.2.2 Ergebnisse
4.2.2.1 Generierung der Genbibliothek durch DNase I Fragmentierung des scFv 425 Gens
Um eine Ausgangsbibliothek mit möglichst vielen potentiell bindenden Peptiden zu
generieren, wurde das PCR Amplifikat des EGF-R spezifischen scFv 425 Gens, mittels
DNase I Verdau, fragmentiert. Die solchermaßen erzeugten Fragmente wurden nachfolgend
in einen Phagenvektor „blunt end“ in die SmaI Restriktionsschnittstelle hinein kloniert. Die in
den Phagenvektor klonierten Fragmente
werden auf dem Phagen als N-terminale
Gen III Fusionen präsentiert und sind somit
für eine interaktionsbasierte Selektion
zugänglich. Der Verdau wurde nach 30 s,
60 s Und 120 s abgestoppt (Abbildung 8).
Die Größenverteilung der erhaltenen
Fragmente wurde auf einem Harnstoffgel
überprüft. Der Verdau für 120 s ergab die
gewünschte Größenverteilung im Bereich
von 20 bis 60 Basenpaaren. Die
Fragmente wurden nachfolgend einer
Klenow Behandlung unterzogen, um glatte
Enden für die weitere Klonierung zu
generieren. Als Zielvektor diente ein
modifizierter M13KE Vektor, welcher im
Leseraster 5´ zum Gen III für eine SmaI
Restriktionsschnittstelle kodiert. Über SmaI
klonierte Fragmente werden als N-
terminale P III Fusionen auf der
Phagenoberfläche präsentiert und sind folglich einer direkten Interaktionsselektion
zugänglich.
Abbildung 8) Auftrennung der DNA-Fragmente auf einem Harnstoffgel. DNase I Fragmentierung des PCR-Produkts wurde zu den angegebenen Zeitpunkten gestoppt, auf ein Harnstoffgel aufgetragen, elektro-phoretisch aufgetrennt und mit Ethidium-bromid angefärbt.
Ergebnisse
23
4.2.2.2 Phage Display Selektion
Der modifizierte VCS M13 Vektor enthält eine SmaI Restriktionsschnittstelle 5´ zum Gen III
des Phagen. In die SmaI Restriktionsschnittstelle wurden die durch DNase I Verdau und
Klenow behandelten Fragmente „blunt end“ kloniert. Nur Fragmente, die das Leseraster des
nachfolgenden Gen III erhalten produzieren funktionelle Phagen und werden auf der
Phagenhülle präsentiert. Die Peptid präsentierenden Phagen sind folglich einer Selektion auf
Interaktionsbasis zugänglich.
Das Design der Phagen-Selektion wurde so ausgelegt, dass die Anreicherung unspezifisch
bindender Phagen minimiert werden sollte. Die ersten zwei Selektionsrunden fanden auf
immobilisiertem sEGF-R statt, denen zwei Selektionsrunden auf EGF-R überexprimierenden
A431 Zellen folgten. Zum Abschluss wurde wiederum auf immobilisiertem sEGF-R selektiert.
Dieses Vorgehen sollte Phagen eliminieren, die z.B. an denaturierten, immobilisierten sEGF-
R gebunden haben oder an andere Zelloberflächenmoleküle als den EGF-R.
Nach insgesamt sechs Selektionsrunden wurden zunächst 10 individuelle Klone isoliert und
sequenziert, um angereicherte Sequenzen zu identifizieren. Die Aminosäuresequenzen
Tabelle 3) 19 AS Sequenzen Individueller Phagenklone aus der letzten Selektionsrunde. Ein Klon enthielt nur die Sequenz des Ausgangsphagen. Insgesamt wurden 20 Phagenklone sequenziert. Bedingt durch die Klonierungsstrategie stehen den angegebenen Sequenzen die Aminosäuren Methionin und Alanin voran.
S S H I F T F Klon 3
S S H I F T F Klon 4
S S H I F T F Klon 5
H I F T F G S G T Klon 9
H N V R H F S L H N L Q Klon 7
H N V R H F S L H N L Q Klon 10
H N V R H F S L H N L Q Klon 14
H N V R H F S L H N L Q Klon 15
H N V R H F S L H N L Q Klon 17
H N V R H F S L H R Klon 8
G L N S P I H S R Klon 2
G L N S P I H S R Klon 11
G L N S P I H S R Klon 12
G L N S P I H S R Klon 13
G L N S P I H S Klon 19
R Q G G L V Q P S Klon 1
A R A T A T Klon 16
S V T Y M Klon 18
P S P A T Klon 20
Ergebnisse
24
SSHIFTF (drei- bzw. vierfach vertreten) und HNVRHFSLHNLQ (zwei- bzw. dreifach
vertreten) waren am häufigsten vertreten (Tabelle 3). Durch die später durchgeführte
Sequenzierung weiterer zehn Klone wurde das Zahlenverhältnis zu Ungunsten der SSHIFTF
Sequenz zur
HNVRHFSLHNLQ Sequenz (fünf- bzw. sechsfach vertreten) hin verschoben. Die
Aminosäuresequenz SSHIFTF der Klone #3, #4 und #5 entsprach der dritten hypervariablen
Schleife der leichten Kette (CDR L3), während die übrigen isolierten Sequenzen keiner
Aminosäuresequenz aus dem Antikörper entsprachen (Abbildung 9).
Ein Sequenzhomologievergleich mittels T-Coffee (Poirot, O'Toole et al. 2003) erbrachte
einen niedrigen Homologiewert von 32 für die drei häufigsten Sequenzen (Abbildung 10, A.).
Auffallend war die Präsenz von Histidinmotiven in den drei dominanten Sequenzen. Anhand
der Struktur des mAK 425 war die stark exponierte Stellung des Histidin in der CDR L3
deutlich erkennbar, was eine nicht unerhebliche Beteiligung an dem Bindungsschnittstelle
zwischen Antikörper und EGF-R nahelegte (Abbildung 9). Darüberhinaus zeigte die Struktur
einen weiteren, exponierten Histidinrest in der CDR H2. Die herausragende Präsenz zweier
Histidinreste an der Grenzfläche zwischen Antigen und Antikörper untermauerte diese
Hypothese. Daher wurde ein Sequenzhomologievergleich aller mit dem Histidin beginnenden
(Abbildung 10, B.) bzw. in der mittleren Position befindlichen (Abbildung 10, C.) drei
A.
B.
Abbildung 9) A. Dreidimensionales Modell des mAK 425. Die Koordinaten des mAK 425 wurden über den Dienst „Web Antibody Modelling“ (WAM) berechnet. Die durch Phage Display isolierte Sequenz SSHIFTF wurde in orange dargestellt und entspricht der CDR L3, aus die Histidinseitenkette hervorragt. B. Vergrößerung der CDR L3. Exponierte Position der Histidinseitenkette.
Ergebnisse
25
Aminosäure umfassenden Peptidmotive mittels T-Coffee durchgeführt, der gute
Homologiewerte von 79 respektive 71 erbrachte.
Entgegen dem niedrigen Sequenzhomologiewert für die drei dominanten Sequenzen aus der
Phage Display Selektion ergab sich aus der Analyse der Tripeptidmotive in Verbindung mit
der exponierten Lage des Histidins im Modell des mAK 425 eine plausible Erklärung für die
Selektion gerade dieser Sequenzen aus der Peptidbibliothek.
Für das weitere Vorgehen wurde die Sequenz SSHIFTF ausgewählt, da sie in ELISA
Experimenten ein geringfügig höheres Bindungssignal aufwies, vor allem aber direkt einer
antigenbindenden Schleife aus dem parentalem mAK 425 zuzuordnen war, während die
übrigen Sequenzen aus anderen Leserastern stammten.
A.
B.
C.
Abbildung 10) Sequenzhomologievergleich mittels T-Coffee. A. Drei dominante Sequenzen aus der Phage Display Selektion wurden auf mögliche Sequenzhomologie untersucht. Berechnet wurde ein niedriger Wert von 32. B. Berechnung der Sequenzhomologie aller mit Histidin beginnenden Tripeptidmotive aus den drei dominanten Sequenzen lieferte einen guten Wert von 79. C. Alle Tripeptidmotive mit einem Histidin in mittlerer Position erbrachten einen geringfügig niedrigeren Wert von 71.
Ergebnisse
26
4.2.2.3 Bindungs-Rangliste drei dominanter Phagenklone aus der letzten Selektionsrunde
Drei der meist vertretenen Phagenklone aus der letzten Selektionsrunde wurden in einem
ELISA auf immobilisiertem sEGF-R bezüglich ihrer Bindungsfähigkeit getestet (Abbildung 11,
A.), um die für das weitere Vorgehen zu verwendende Peptidsequenz zu ermitteln. Das
Signal des Kontrollphagen VCS M13, der kein Peptid als Gen III Fusion präsentiert, wurde
von allen Signalen subtrahiert. Klon #3 (Peptidsequenz: SSHIFTF) zeigte ein geringfügig
höheres Signal als die Klone #7 (Peptidsequenz: HNVRHFSLHNLQ) und #11
(Peptidsequenz: GLNSPIHSR). Nachfolgend wurde die Bindungskompetenz des
Phagenklons #3, der die Peptidsequenz SSHIFTF präsentiert auf fixierten A431 Zellen
getestet (Abbildung 11, B.), um zu klären, ob auch membranständiger EGF-R auf
Tumorzellen gebunden würde. Der Phagenklon #3 zeigte ein zweifach höheres
Bindungssignal als die zur Kontrolle eingesetzte, unselektierten 12mer Phagenbibliothek
(NEB). Da die unselektierte 12mer Phagenbibliothek bereits einige spezifisch als auch
unspezifisch bindende Phagenklone enthalten kann, stellte dieser experimentelle Aufbau
eine anspruchsvolle Kontrolle dar, was die Bindungskompetenz der Peptidsequenz SSHIFTF
bestätigte.
A.
B.
Abbildung 11) Phagen ELISA. A. auf immobilisiertem sEGF-R mit drei individuellen Klonen aus der letzten Selektionsrunde. Klon #3 (SSHIFTF) wies ein geringfügig höheres Bindungssignal als die Klone #7 (HNVRHFSLHNLQ) und #11 (GLNSPIHSR). Das Signal des Kontrollphagen VCS M13, der keine Peptide als Gen III Fusion präsentiert, fiel sehr gering aus und wurde von allen Signalen subtrahiert. B. Phagenklon #3 wurde auf fixierten A431 Zellen gegen unselektierte Phagen aus der NEB PhD12 Bibliothek getestet. Diese anspruchsvolle Kontrolle wurde gewählt, um zu zeigen, dass der selektierte Phagenklon gegenüber unselektierter, potentielle Binder enthaltender Phagen-Bibliothek überlegene Bindung aufwies.
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
#3 #7 #11
Ab
so
rpti
on
@ 405 n
m
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
#3 NEB 12 mer, unselektiert
Ab
so
prt
ion
@ 4
05 n
m
Ergebnisse
27
Die Peptidsequenz des Klons #3 wurde im Folgenden an beide Termini des Modellenzyms
CAT via kurze Linker Sequenzen fusioniert, um ein zielgerichtet bindendes Modul mit
enzymatischer Aktivität für das „Tumor-Targeting“ zu generieren.
4.3 Generierung eines N- und C-terminal Peptid dekorierten Fusionsenzyms: S-CAT-S, und Darstellung der Interaktions-studien mit dem EGF-R
4.3.1 Einleitung
Nach der Identifizierung eines EGF-R bindenden Peptids mittels Phage Display sollte im
folgenden ermittelt werden, ob die Peptidsequenz (SSHIFTF) eine spezifische Lokalisation
eines Fusionsenzyms am EGF-R vermitteln kann. Das bakterielle, trimere Enzym
Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) schien in mehrfacher Hinsicht gut als
Modellenzym geeignet. Zum einen liegen die Termini der CAT gut zugänglich an der
Oberfläche, zum anderen werden die fusionierten Peptide durch das funktionell trimere
Enzym sechsfach an der Oberfläche präsentiert, was das Zustandekommen eines
bindungsverstärkenden Aviditätseffekts ermöglichen sollte.
Zu diesem Zweck wurde die Peptidsequenz auf genetischer Ebene an das 5´ und 3´ Ende
des cat Gens kloniert. Das resultierende Konstrukt S-CAT-S wurde in E. coli rekombinant
exprimiert, gereinigt und für Bindungsstudien eingesetzt. Dabei wurde ein breites Spektrum
weit verbreiteter und anerkannter Bindungsnachweismethoden, wie ELISA, konfokale
Immunfluoreszenz, BIAcore (Oberflächenplasmonresonanz) und FACS
(Durchflusszytometrie) eingesetzt, in der Absicht, die anfänglich unsicheren ELISA
Ergebnisse validieren zu können.
4.3.2 Ergebnisse
4.3.2.1 Klonierung der SSHIFTF codierenden Sequenz an das cat-Gen
Die durch Phage Display identifizierte Peptidsequenz (SSHIFTF) wurde mittels Primer-
Extension Methode in zwei aufeinander folgenden Schritten 5´ und 3´ an das cat-li Gen
kloniert. Im ersten Schritt wurde unter Verwendung des Oligonukleotids pF_SSHIFTF_CAT
und des Oligonukleotids sr_Hind2 das cat-li Gen 5´ um die SSHIFTF codierende Sequenz in
einer Primer-Extension-PCR erweitert. Das PCR Produkt wurde mit den
Ergebnisse
28
Restriktionsendonukleasen NheI und HindIII verdaut und in einen ebenfalls mit NheI und
HindIII geöffneten pSS30_CATwt Vektor kloniert. Der resultierende Vektor wurde
pIB30_SSHIFTF_CAT benannt, und diente seinerseits als Matrize für die 2. PCR unter
Verwendung des Oligonukleotids sf_lacP1 und des Oligonukleotids pr_CAT_SSHIFTF. Das
resultierende PCR Produkt, welches für ein N- und C-terminal mit der SSHIFTF Sequenz
flankiertes CAT Enzym codiert, wurde wiederum über die Restriktionsschnittstellen NheI und
HindIII in den solchermaßen geöffneten Vektor pSS_30_CATwt kloniert. Der resultierende
Vektor wurde pIB30_SSHIFTF_CAT_SSHIFTF benannt. Die korrekte Sequenz wurde nach
jedem Klonierungsschritt durch Sequenzierung verifiziert. Durch die Klonierungsstrategie
bedingt, kodieren die Vektoren pIB30_SSHIFTF_CAT und pIB30_SSHIFTF_CAT_SSHIFTF
N-terminal zur ersten SSHIFTF Sequenz für zwei zusätzliche Aminosäuren Methionin und
Alanin.
Der Vektor pIB30_SSHIFTF_CAT kodiert für das Konstrukt S-CAT, der Vektor
pIB30_SSHIFTF_CAT_SSHIFTF für das Konstrukt S-CAT-S.
4.3.2.2 Rekombinante Herstellung und Reinigung
Die CAT Konstrukte S-CAT-S, S-CAT und CATwt wurden rekombinant in E. coli RV308
cytoplasmatisch exprimiert und mittels Affinitätschromatographie zu hoher Reinheit isoliert.
Eine Sephadex 200 Gelchromatographie wurde
dennoch angeschlossen, um Chloramphenicol von
den Proben abzureinigen und diese in die
gewünschten Puffer zu überführen. Aus 1 l
Expressionskultur bei 4.6 OD600 konnten ca. 2 mg S-
CAT-S Protein isoliert werden. Das Molekulargewicht
des S-CAT-S Proteins liegt nach Berechnung durch
das Programm GCG bei 29 kDa für das Monomer. Die
Bande des S-CAT-S Proteins lief in denaturierender
SDS-PAGE geringfügig zu niedrig (Abbildung 12), die
korrekte Masse konnte aber massenspekroskopisch
verifiziert werden. Der Massenunterschied zum S-CAT
Protein, das nur eine N-terminale Peptidfusion trägt,
konnte auf dem SDS-Gel nicht aufgelöst werden.
S-CAT-S S-CAT
50 kDa
30 kDa 25 kDa
Marker
Abbildung 12) 12.5 % SDS-Gel nach Coomassie-Färbung. S-CAT-S und S-CAT konnten mittels Einschrittreinigung zu hoher Reinheit isoliert werden.
Ergebnisse
29
4.3.2.3 Nachweis EGF-R spezifischer Bindung des S-CAT-S Konstrukts mittels ELISA
Die sehr gut etablierte und anerkannte Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Methode dient dem schnellen Nachweis eines Antigens. Bei der angewandten Variante des
Sandwich-ELISA wurde der sEGF-R in den Vertiefungen einer 96-Loch Platte immobilisiert.
Am sEGF-R lokalisierte CAT-Konstrukte wurden mittels monoklonalem Maus -CAT
Antikörper und sekundärem -Maus HRP Antikörper durch Farbumschlag nachgewiesen.
Optimierung des hohen, unspezifischen CATwt Hintergrundsignals.
Der primäre Interaktionsnachweis des zielgerichtet bindenden Moduls S-CAT-S wurde
erneut durch ELISA Experimente auf immobilisiertem sEGF-R geführt. In den ersten ELISA
Experimenten zeigte das zur Kontrolle mitgeführte CATwt Protein sehr hohe unspezifische
Hintergrundsignale. Als Ursachen für die hohe unspezifische Bindung des CATwt Proteins
an den sEGF-R wurden verschiedene Möglichkeiten in Betracht gezogen, die sukzessive
ausgetestet wurden. Routinemäßig wurde zunächst versucht mögliche unspezifische
hydrophobe Interaktionen durch Zugabe von Tween20 in steigenden Konzentrationen zu
verringern. Auch eine Erhöhung der Konzentration auf 0.1% und eine Erhöhung der Anzahl
an Waschschritten zeigten keine signifikante Wirkung (Daten nicht gezeigt). Um den Einfluss
freier Cysteine auf die unspezifische Bindung des CATwt zu testen, wurde CATwt in
Gegenwart von 0.5 mM Gluthathion (GSH) inkubiert (Abbildung 13). Die unspezifische
Bindung konnte im besten Fall um 26% verringert werden, bei anderen ELISA Experimenten
zeigte sich jedoch kein signifikanter Unterschied und genügte damit nicht dem Anspruch,
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
% GSH [0.5 mM] Cm [5 mM]
Ab
sorp
tio
n @
40
5 n
m
Abbildung 13) CATwt Hintergrund-signal auf immobilisiertem sEGF-R in Gegenwart von GSH bzw. Chlor-amphenicol. Der Ligand CATwt wurde in PBS, 1% BSA, 0.1% Tween 20 und den jeweils angegebenen Additiva formuliert auf sEGF-R Oberfläche inkubiert, um die unspezifische Bindung zu vergleichen. Die unspezifische Bindung konnte in Gegenwart von GSH leicht gesenkt werden.
Ergebnisse
30
reproduzierbare und eindeutige Aussagen über die Bindungscharakteristika der generierten
CAT Konstrukte treffen zu können.
Weiter wurde untersucht, ob der Entzug von Chloramphenicol durch das Reinigungsprotokoll
einen Einfluss auf die strukturelle Integrität des CAT Proteins haben könnte. Da CAT ein
homo-trimeres Enzym ist, dessen katalytisches Zentrum unter Beteiligung aller drei
Untereinheiten an deren Grenzflächen gebildet wird, lag die Vermutung nahe, dass durch
den Entzug des Substrats die Stabilität des Komplexes beeinträchtigt werden könnte und es
zur Exponierung in der Struktur sonst unzugänglicher Aminosäuren kommen könnte, woraus
eine verstärkte Aggregationsneigung und ein Niederschlag des Proteins auf der Oberfläche
resultieren könnte. Daher wurde das CATwt Protein mit 5 mM Cm versetzt, wobei jedoch
eine verstärkte unspezifische Bindung zu konstatieren war (Abbildung 13).
Definiertere Tests bezüglich des Einflusses der Stabilität des Proteins auf die unspezifische
Bindung, wurden durch Versuche mit verkürzten Varianten des CAT Proteins möglich
(dankenswerter Weise von S. Stebel zur Verfügung gestellt). Da das unspezifische
Hintergrundsignal des CATwt Proteins in etwas geringerem Masse auch auf BSA belegten
Oberflächen deutlich zu messen war, wurde für diesen Versuch BSA anstelle des
zeitaufwändig und kostenintensiv zu isolierenden sEGF-R verwendet. Die N-terminal
(N∆10) und C-terminal (C∆9) verkürzten und dadurch destabilisierten CAT Varianten zeigten
eine sehr hohe unspezifische Bindung verglichen zum CATwt, wobei der Effekt bei der C-
terminal verkürzten Variante, die auch die geringste Stabilität aufweist, am deutlichsten war
(Abbildung 14). Die rückverlängerten und damit wieder stabilisierten Varianten zeigten
übereinstimmend mit der Hypothese ein verringertes Bindungssignal gegenüber den
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
CA
T R
E
Nd10 R
7-
K5
CA
T N
d10
CA
T C
d9
CA
T C
d9
R3-K
1 o
pt.
CA
T C
d9
R3-K
1
CA
Tw
t
Ab
so
rpti
on
@ 4
05 n
m
Abbildung 14) Vergleich der unspezifischen Bindung verschiedener verkürzter und rückverlängerter bzw. optimierter CAT-Varianten, sowie des CATwt Enzyms auf immobilisierter BSA Oberfläche. Verkürzte, nicht rückverlängerte Varianten CAT Cd9 und Nd10 zeigten die höchste unspezifische Bindung auf BSA. Die rückverlängerte Variante CAT RE Nd10 R7-K5 zeigte ein verringertes Signal, welches etwa dem CATwt entsprach. Optimierte Variante CAT Cd9 R3-K1 opt zeigte das niedrigste Signal.
Ergebnisse
31
verkürzten Varianten, aber auch die optimierte, rückverlängerte C∆9 Variante zeigte keine
deutliche Verbesserung im Vergleich zum CATwt (Abbildung 14).
Die Neigung zu unspezifischer Interaktion des CATwt Proteins zeigte sich nicht nur auf dem
immobilisierten sEGF-R, sondern auch auf immobilisierter BSA Oberfläche. Daher wurde ein
möglicher Einfluss der Blockierungslösung auf die unspezifische Bindung untersucht. Neben
Abbildung 15) Vergleich des unspezifischen Hintergrundsignals des CATwt Proteins auf BSA und Milchpulver belegten Oberflächen. Die mit 1% und 4% BSA belegten Oberflächen zeigten ein innerhalb der Fehlertoleranz ähnliches Hintergrundsignal. Milchpulver eignete sich aufgrund des sehr hohen unspezifischen Signals nicht als Blockierungslösung für die CAT Konstrukte.
den üblicherweise eingesetzten 4% BSA wurden 1% BSA und 4% Milchpulver verglichen (
Abbildung 15). Obwohl CATwt auf BSA unspezifische Bindung zeigte, war das Signal auf
der mit 4% stärker mit BSA belegten Oberfläche geringer als auf der mit 1% belegten
Oberfläche. Auf der mit Milchpulver belegten Oberfläche zeigte CATwt das höchste
unspezifische Signal. Die gewünschte Reduktion des Hintergrundsignals wurde erst durch
Verwendung des Polymers Polyvinylpyrolidon (PVP K 30) zur Blockierung erreicht
(Ausgetestet von Annette Gaida, Daten hier nicht gezeigt).
Lösung des Problems nicht reproduzierbarer Bindung des S-CAT-S Konstrukts.
Während der zahlreichen Versuche zur Verringerung des unspezifischen Hintergrundsignals
fiel die schlechte Reproduzierbarkeit des Bindungssignals des S-CAT-S Konstrukts auf.
Durch die Verwendung von PVP in Kombination mit einer Erhöhung der NaCl Konzentration
auf 550 mM konnten letztlich ein gutes Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis, sowie eine gute
Reproduzierbarkeit eingestellt werden.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
4% BSA 1% BSA 4% MP
Ab
sorp
tio
n @
40
5 n
m
Ergebnisse
32
Das S-CAT-S Fusionsprotein zeigte im ELISA ein 4,7-fach höheres Bindungssignal als das
CATwt Protein (Abbildung 16, A.). Ferner wurde als erster Nachweis der Spezifität eine BSA-
Oberfläche einbezogen. Das Bindungssignal von S-CAT-S war auf der BSA-Oberfläche auf
das Niveau des CATwt Proteins reduziert. Vergleicht man das Signal des S-CAT-S auf der
sEGF-R mit der BSA-Oberfläche, so zeigte S-CAT-S ein 6,7-fach höheres Signal auf der
A.
B.
Abbildung 16) Interaktionsnachweis durch ELISA auf immobilisiertem sEGF-R. A. Einschätzung der Bindungsspezifität auf sEGF-R Oberfläche und BSA Vergleichsoberfläche. S-CAT-S zeigt ein signifikant höheres Signal auf immobilisiertem sEGF-R als die CATwt Kontrolle. Auf der BSA Kontrolloberfläche zeigen S-CAT-S und CATwt gleich niedrige Bindung. CATwt Kontrolle weist eine minimal höhere Bindung auf sEGF-R verglichen mit CATwt Oberfläche auf. B. Lokalisierung des zielgerichtet bindenden Moduls am EGF-R in Abhängigkeit von der Valenz der präsentierten Peptide. Das Bindungssignal für S-CAT beträgt nur 38% des S-CAT-S Bindungssignals nach Abzug des CATwt Signals von beiden Werten.
spezifischen Oberfläche (Abbildung 16, A.). Darüber hinaus konnte eine Abhängigkeit der
Bindungsstärke von der Anzahl der auf dem Konstrukt präsentierten Peptide gezeigt werden
(Abbildung 16, B.). Diese Ergebnisse können als erster Hinweis auf eine Peptid vermittelte,
spezifische Lokalisierung des Konstrukts am sEGF-R gewertet werden.
Abbildung 17) Nachweis der Spezifität der S-CAT-S : sEGF-R Interaktion mittels Kompetitions-ELISA. Das S-CAT-S Fusionsprotein wurde mit steigenden Konzentrationen an Kompetitor (scFv 425 Bla) parallel auf immobilisiertem sEGF-R inkubiert. Die linke Säule repräsentiert das Signal des S-CAT-S Fusionsproteins ohne Kompetitor. Die molare Konzentration an Kompetitor steigt von links nach rechts. S-CAT-S wurde mit konstanter Konzentration von 340 nM eingesetzt, der Kompetitor wurde mit einer maximalen Konzentration von 3400 nM eingesetzt.
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
1,80
S-CAT-S CATwt S-CAT-S CATwt
Ab
so
rpti
on
@ 4
05
nm
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
S-CAT-S S-CAT CATwt
Ab
so
rpti
on
@ 4
05 n
m
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,1 10 1000
Ab
so
rpti
on
@ 4
05 n
m
Konzentration Inhibitor [nM]
Ergebnisse
33
Zur Untermauerung der Spezifität der S-CAT-S - sEGF-R Interaktion wurde ein
Verdrängungsexperiment mittels ELISA auf immobilisiertem sEGF-R durchgeführt. Da das
Peptid aus der Sequenz des scFv 425 abgeleitet wurde, war zu erwarten, dass S-CAT-S
durch den scFv 425 zu verdrängen sein sollte. Im Experiment konnte die Verdrängung durch
den scFv 425 Bla in konzentrationsabhängiger Weise gezeigt werden (Abbildung 17). Das
Konstrukt S-CAT-S wurde mit konstanter Konzentration von 340 nM eingesetzt, während die
Konzentration des Inhibitors (scFv 425) auf den zehnfachen Überschuss gesteigert wurde.
Bei der Konzentrationsangabe gilt es zu beachten, das die molare Konzentration für S-CAT-
S immer für das Monomer angegeben ist, das Enzym jedoch überwiegend als Trimer
vorliegt.
Bei 0,34 nM und 3,4 nM Konzentration des scFv 425 Bla konnte noch keine Verdrängung
erzielt werden. Bei equimolarer Konzentration beider Konstrukte wurde das absolute Signal
auf den halben Wert des S-CAT-S Konstrukts ohne Inhibitor verringert. Bei zehnfachem
Überschuss des Inhibitors konnte das Signal auf etwa das Niveau, das typischerweise
CATwt erreicht reduziert werden, was für eine spezifische Interaktion sprechen könnte.
Als weiteres Indiz spezifischer Bindung in ELISA Experimenten wird allgemein ein
sigmoidaler Kurvenverlauf der Bindung bei ansteigender Konzentration des Analyten mit
Sättigung bei hoher Konzentration gewertet. Im sogenannten Titrations-ELISA konnte jedoch
keine für spezifische Bindungen typische Sättigung des Signals nachgewiesen werden. Das
Signal stieg bis zu einer 10 µM Konzentration des S-CAT-S Konstrukts an, ohne eine
Sättigung zu zeigen. Die Sättigung könnte auch erst bei höherer Konzentration einsetzten,
was jedoch nicht getestet wurde, da das S-CAT-S Konstrukt bei Konzentrationen > 30 µM
Abbildung 18) Titrations-ELISA des S-CAT-S Fusionsproteins auf immobilisiertem sEGF-R. S-CAT-S wurde in steigender Konzentration von 1 nM bis 10 µM inkubiert. Das Signal zeigte bis 10 µM Konzentration keine Sättigung
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
1 10 100 1000 10000
Ab
sorp
tio
n @
40
5 n
m
Konzentration [nM]
Ergebnisse
34
zur Aggregation tendiert. Der Bindungsverlauf bei niedrigen Konzentrationen spricht jedoch
für eine spezifische Bindung, da das Signal nicht linear ansteigt, wie es bei unspezifischer
Interaktion mit der Oberfläche zu erwarten wäre.
S-CAT-S ELISA auf A431 Zellen:
Da der ELISA geführte Interaktionsnachweis des S-CAT-S Fusionsproteins auf
immobilisiertem sEGF-R nicht alle Zweifel einer evtl. unspezifischen Bindung ausräumen
konnte, wurden ELISA Experimente auf konfluenten A431 Zellen im 96-Lochplattenformat
durchgeführt. A431 Zellen wurden bis zur Konfluenz in Vollmedium kultiviert und
anschließend für 12 h in Minimalmedium überführt. Die Inkubation des S-CAT-S
Fusionsproteins erfolgte auf fixierten Zellen, um eine mögliche Rezeptor vermittelte
Internalisierung zu verhindern, was die anschließende Detektion mittels HRP gekoppeltem
Nachweisantikörper hätte stören können. Das S-CAT-S Signal war mit 0.8
Absorptionseinheiten um 0.2 höher als das der CATwt Kontrolle (Abbildung 19). Der
Signalunterschied fiel zwar sehr gering aus, zeigte sich aber in mehreren unabhängigen
Versuchen, sodass dieser Unterschied gering aber doch reproduzierbar ausfiel. Den
zellulären ELISA Experimenten war zudem der im Vergleich zu den ELISA-Experimenten auf
immobilisiertem sEGF-R höhere unspezifische Hintergrund des CATwt Enzyms gemein.
Abbildung 19.) Zellulärer ELISA auf fixierten A431 Zellen. Das Bindungssignal des S-CAT-S Konstrukts war auf A431 Zellen tendenziell höher als das Signal der CATwt Kontrolle. Im Rahmen des Fehlers sind die Signale nicht als signifikant verschieden zu werten. Generell war auf A431 Zellen eine Tendenz zu höherem, unspezifischem Signal zu erkennen.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
S-CAT-S CATwt
Ab
sorp
tio
n @
40
5 n
m
Ergebnisse
35
4.3.2.4 Nachweis zellulärer Bindung und Analyse der zellulären Distribution mittels konfokaler Immunfluoreszenz
Die konfokale Laser-Rastermikroskopie, deren Grundprinzip auf eine Erfindung von Minsky
zurückgeht (Minsky 1988), bietet gegenüber der klassischen Fluoreszenzmikroskopie den
Vorteil, dass nur Fluoreszenz aus einer Fokuseben abgebildet wird, während Fluoreszenz,
die außerhalb der Fokusebene emittiert wurde durch eine Lochblende ausgeblendet wird,
woraus sich eine sehr scharfe Abbildung des Präparates ausschließlich aus der Fokusebene
ergibt. Zudem wird der Laserstrahl, der als Lichtquelle dient auf die zu untersuchende Ebene
maximal fokussiert, sodass die Fluoreszenzfarbstoffe nur innerhalb des Strahlengangs
maximal angeregt werden, wodurch die Fluoreszenzfarbstoffe in den übrigen Ebenen
geschont werden und das Ausbleichen des Präparats während der Untersuchung minimiert
wird. Die Tiefenschärfe, also die optische Dicke des Schnittes wird dabei vom den
Durchmesser der Blende und der numerischen Apertur des Objektivs bestimmt. Werden
mehrere Schichten in unterschiedlichen Fokusebenen auf diese Art abgerastert, ergibt sich
ein dreidimensionales Abbild des Präparates.
In Ergänzung zu den ELISA Experimenten wurden konfokale Immunfluoreszenzanalysen
durchgeführt, die eine Aussage über die genaue Lokalisierung des S-CAT-S Konstrukts an
A431 Zellen ermöglichen sollten. Auf fixierten A431 Zellen wäre eine membranständige
Lokalisierung des S-CAT-S Konstrukts zu erwarten, da es nicht zu einer Rezeptor
vermittelten Internalisierung des Rezeptor : S-CAT-S Komplexes kommen sollte, darüber
hinaus wurden die Zellen nicht permeabilisiert, sodass keine intrazellulären Rezeptoren
zugänglich sein sollten.
Fixierte A431 Zellen wurden mit den jeweiligen Konstrukten, gefolgt vom -CAT Antikörper
und zuletzt mit dem AlexaFluor 488 gekoppelten Nachweisantikörper inkubiert, analog wurde
der scFv 425-Bla mittels anti-ß-Laktamase Antikörper nachgewiesen.
Ergebnisse
36
Überlagerung DAPI + 488 nm 488 nm
Abbildung 20) Konfokale Immunfluoreszenzanalyse des S-CAT-S Konstrukts auf A431 Zellen. In der linken Spalte wurden die Fluoreszenzsignale des Kernfarbstoffes DAPI und des Alexa488 gekoppelten Nachweisantikörpers überlagert. In der rechten Spalte wurde das Fluoreszenzsignal für die Konstrukte separat dargestellt. Die membranständige Fluoreszenz des scFv 425 ist deutlich zu erkennen. S-CAT-S und EGF zeigen membranständige und cytosolische Fluoreszenz, sowie charakteristische punktuelle Bereiche hoher Fluoreszenzdichte. Negativkontrolle wies eine schwächere und sehr diffuse Fluoreszenz auf.
S-CAT-S
EGF
neg. Kontrolle
scFv 425
Ergebnisse
37
Das S-CAT-S Fusionsprotein zeigte auf A431 Zellen eine deutliche, cytosolische
Fluoreszenz, die durch ausgeprägte, punktuell konzentrierte Signale charakterisiert war. Der
natürliche Ligand EGF wies ein mit dem S-CAT-S nahezu identisches Fluoreszenzmuster
auf. Das scFv 425-Bla Konstrukt zeigte wie in anderen Versuchen eine scharf umrissene,
membranständige Fluoreszenz. Die Negativkontrolle verursachte eine nicht zu
vernachlässigende Fluoreszenz, die jedoch von erkennbar schwächerer Intensität war.
Die Auswertung des Fluoreszenzsignals in Korrelation zum DAPI Signal mit dem Programm
ImageJ konnte den visuellen Eindruck bestätigen. Das Verhältnis des durchschnittlichen
Fluoreszenzsignals im GFP-Kanal zum durchschnittlichen DAPI-Signal war bei den
Positivkontrollen (scFv 425-Bla und EGF) 2 bis 3-fach höher als das der Negativkontrolle.
Die normalisierte Fluoreszenzintensität des S-CAT-S war 5.6-fach höher als die der
Negativkontrolle, wies jedoch eine hohe Standartabweichung auf.
Abbildung 21.) Auf das DAPI-Signal normalisierte Fluoreszenz des Signals im GFP-Kanal. Näherungsweise wurde die Fluoreszenzintensität im GFP-Kanal pro Zelle berechnet. Negativkontrolle zeigte das geringste Signal. Positivkontrollen wiesen ca. 2-3 fach höhere Fluoreszenzintensität auf.
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
Flu
ore
sze
nz
48
8 n
m /
DA
PI
Ergebnisse
38
In einem weiteren Experiment konnten bei stärkerer Vergrößerung die im Vergleich zum
CATwt stärkere Fluoreszenz des S-CAT-S Fusionsproteins, sowie die cytosolische
Lokalisation verifiziert werden (Abbildung 22). Für das S-CAT-S und CATwt Konstrukt
wurden jeweils die Schnittebenen mit der höchsten Fluoreszenz gezeigt. Der CATwt wies
erneut ein nicht vernachlässigbares Hintergrundsignal auf, das aber schwächer ausfiel als
das Fluoreszenzsignal des S-CAT-S Fusionsproteins.
A. S-CAT-S B. CATwt
Abbildung 22.) Konfokale Immunfluoreszenzanalyse auf fixierten A431 Zellen. A. S-CAT-S zeigte auf A431 Zellen ein stärkeres Fluoreszenzsignal mit höherer Dichte als CATwt. Die cytosolische Distribution war übereinstimmend mit vorherigen Versuchen. B. CATwt wies auf A431 Zellen eine geringere Fluoreszenzdichte auf. Das bei beiden Konstrukten vorhandene Hintergrundsignal wurde in identischer weise durch Anwendung der Schwellenwertfunktion (Pixelmator) abgezogen. Beide Konstrukte wurden mit gleicher Konzentration inkubiert (720 nM für das Monomer kalkuliert).
Ergebnisse
39
4.3.2.5 Test auf S-CAT-S : sEGF-R Interaktion mittels Oberflächenplasmonresonanz
Die auf Oberflächenplasmonresonanz beruhende Technik erlaubt es die Affinität einer
Interaktion in die einzelnen Parameter Assoziation (Ka) und Dissoziation (Kd) aufzulösen.
Diese Technik schien daher besonders gut geeignet, um eine Interaktion zwischen S-CAT-S
und sEGF-R nachzuweisen. Die Interaktionsstudien wurden mit einem BIAcore 3000
durchgeführt. Theoretisch sollte mithilfe dieser Technik der Unterschied in der
Dissoziationsrate zwischen dem hexavalenten S-CAT-S und dem trivalenten S-CAT
Fusionsprotein nachgewiesen werden
können, wie bereits für monovalente bzw.
multivalente „single-chain“ Antikörper
gezeigt werden konnte (Kortt, Dolezal et
al. 2001). Die Menge des auf den
Sensorchip CM-5 gekoppelten sEGF-R
entsprach 3347.4 RU (Abbildung 24).
Stenberg et al konnten zeigen, dass eine
Zunahme von 1000 RU etwa einer
Oberflächenkonzentration von 1 ng/mm²
entspricht (Stenberg, Persson et al.
1991).
Die Bindung der Positivkontrolle EGF an
den sEGF-R konnte trotz ungünstigen
Zeit [s]
0 500 1000 1500 2000
RU
20000
25000
30000
35000
40000
45000
Abbildung 24.) Kopplung des sEGF-R auf einen Sensorchip CM5. 3347.4 RU konnten auf die Oberfläche gekoppelt werden.
Zeit [s]
400 420 440 460 480 500 520
RU
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Abbildung 23.) Sensogramm des EGF auf sEGF-R. Signal war mit 150 RU im Bereich des maximal zu erwartenden Wertes unter Annahme der 1:1 Stöchiometrie. Signal der Referenzflusszelle wurde vom Signal subtrahiert und das verbliebene Signal normalisiert
Ergebnisse
40
Größenverhältnisses für die Oberflächenplasmonresonanz gezeigt werden und entsprach
150 RU (Abbildung 23). Für die in der Literatur beschriebenen Messungen wurde
üblicherweise das EGF auf die Sensoroberfläche gekoppelt und der lösliche sEGF-R darüber
geleitet, um die Messung zu vereinfachen. Nach theoretischen Berechnungen ist bei einer
Kopplung von 3347.4 RU sEGF-R (115 kDa) bei einer 1:1 Stöchiometrie der Bindung bei
vollständiger Sättigung mit EGF (6,4 kDa) ein Signal von ca. 186 RU zu erwarten. Der
gemessene Wert lag mit ca. 150 RU in dieser Größenordnung, womit von ca. 81 %
bindungskompetentem Rezeptor ausgegangen werden konnte.
Das S-CAT-S Konstrukt wurde mit ansteigenden Konzentrationen von 3.25 µM, über 6.5 µM,
bis 13 µM bei einer Flussrate von 20 µl/s über die Sensoroberfläche geleitet. Mithilfe der
Oberflächenplasmonresonanz konnte weder in PBS noch in HEPES Puffer unabhängig von
der Salzkonzentration eine Interaktion mit dem sEGF-R nachgewiesen werden. In allen
Fällen verblieb nach Abzug des Signals der Referenzflusszelle von dem Signal der mit
sEGF-R gekoppelten Flusszelle kein verwertbares, residuales Bindungssignal. Beispielhaft
werden die Messungen unter Verwendung eines mit 550 mM NaCl und 0,01% Tween 20
supplementierten HEPES Puffers dargestellt. Nach Abzug der Referenzflusszelle wurden
negative Werte erhalten, die zudem ausgeprägte Spitzen zu Beginn und Ende der
Probeninjektion zeigten (Abbildung 25). Die Signalspitzen könnten auf eine
Probenverdünnung im Flusssystem des BIAcore Gerätes zwischen den Flusszellen und zum
Abbildung 25.) Oberflächenplasmonresonanzsignal des S-CAT-S Fusionsproteins auf sEGF-R gekoppelter Oberfläche (Sensorchip CM-5). Differenz der Signale von sEGF-R gekoppelter und Referenzflusszelle wurde normalisiert. S-CAT-S wurde in ansteigenden Konzentrationen von 3.25 µM bis 13 µM injiziert. Nach Abzug der Referenzflusszelle konnte kein konzentrationsabhängig ansteigendes Signal detektiert werden.
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
0 10 20 30 40
RU
Zeit [s]
3.25 µM
6.5 µM
13 µM
Ergebnisse
41
anderen auf die niedrig eingestellte Datenerfassungsrate zurückzuführen sein. Das negative
Signal deutet auf einen Puffereffekt hin, obwohl die Proben in dem für die Gelfiltration
identischen Puffer gemessen wurden. Unter der Annahme eines funktional trimeren S-CAT-S
Komplexes (86.7 kDa) sollte bei einer 1:3 Stöchiometrie der S-CAT-S : sEGF-R Interaktion
ein Signal von etwa 841 RU, bei vollständiger Sättigung, zu erwarten gewesen sein. Trotz ca
81 % aktiver Oberfläche konnte keine S-CAT-S : sEGF-R Interaktion mittels
Oberflächenplasmonresonanz nachgewiesen werden.
Ergebnisse
42
4.3.2.6 Wirkung des S-CAT-S Konstrukts auf den Wundverschluss von A431 Zellen
Unter dem Gesichtspunkt einer späteren Anwendung des Konstrukts in der zielgerichteten
Tumortherapie wäre es konzeptionell wünschenswert, dass die Bindung an den EGF-R
nicht zu einer Stimulation der Zelle führt. In Wundheilungsexperimenten wurde die Induktion
EGF CATwt S-CAT-S Ctrl.
0 h
24 h
48 h
Abbildung 26.) Beispiel eines typischen Wundheilungsexperiments an A431 Zellen. In den konfluenten Zellrasen wurde mit einer 1000 µl Pipettenspitze eine Wunde eingeführt, gelöste Zellen mit Minimalmedium entfernt und anschließend mit den angegebenen Konstrukten inkubiert. Der Wundverschluss wurde sofort, nach 24h und 48h dokumentiert. Die zellfreie Fläche wurde unter Verwendung eines Makros mit dem Programm ImageJ dargestellt und berechnet.
Ergebnisse
43
der proliferativen und migratorischen Aktivität von A431 Zellen durch Inkubation mit dem S-
CAT-S Konstrukt analysiert. Bei diesen Experimenten gilt es zu beachten, dass keine direkt
Ableitung der Proliferationsrate der Zellen erfolgen kann, da es nicht möglich ist zwischen
proliferationsbedingter und Antiapoptose bedingter Zunahme der Zellzahl zu unterscheiden.
Es wird folglich ein Mischeffekt aus Proliferation, Antiapoptose und Migration abgegriffen. Da
EGF alle drei Parameter beeinflusst, stellt dieser Experimenttyp dennoch eine gute Methode
dar, um im gesamtzellulären Kontext die Wirkung des S-CAT-S Konstrukts durch Bindung an
den zellulären EGF-R mit der Wirkung des natürlichen Liganden (EGF) zu vergleichen.
Mittels einer 1000µl Pipettenspitze wurde in den konfluenten Zellrasen eine strichförmige
Läsion eingeführt. Abgelöste Zellen wurden durch intensives Waschen entfernt und der
verbliebene Zellrasen anschließend mit den in Minimalmedium formulierten Konstrukten
inkubiert. Die Größe der Wunde wurde nach 24 und 48 Std. durchlichtmikroskopisch
dokumentiert.
Die zellfreie Fläche in Pixel wurde sofort, nach 24 h und 48 h mit dem Programm ImageJ
vermessen (Abbildung 27). Die Differenz der nach 0 h und 24 h vermessenen Wert diente
Abbildung 27.) Wundheilungsexperiment. Der deutlichste Wundverschluss 24 h nach Induktion konnte bei EGF inkubierten Zellen mit 174731 Pixel Differenz zum 0 h Wert festgestellt werden. Die Mediumkontrolle wies einen 1.9-fach verringerten Wundverschluss im Vergleich zur EGF Kontrolle auf. Das S-CAT-S zeigte einen nur 8647 Pixel stärkeren Wundverschluss als die Mediumkontrolle und damit ein 1.74-fach verringerten Wundverschluss verglichen mit der EGF Kontrolle. Die CATwt Kontrolle zeigte mit 72405 Pixel Differenz den geringsten Wundverschluss nach 24 h. Die Verringerung der freien Fläche durch Teilung und Migration von Zellen in die Wundfläche wurde in Pixel 24 h und 48 h nach Induktion ermittelt.
174741
72405
100273
252980
197228
183907
206270
91626
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
EGF CATwt S-CAT-S ctrl.
Verr
ingeru
ng d
er
freie
n F
läche [
Pix
el]
24 h p.I.
48 h p.I.
Ergebnisse
44
als Maß für die Aktivierung der Zellen. Hier wurde ein typisches Wundheilungsexperiment
beispielhaft dargestellt.
Nach 24 Std. war die Wundfläche der mit EGF behandelten Zellen um 174.410 Pixel
verringert und übertraf die Mediumkontrolle um das 1.9-fache. Der Wert für CATwt inkubierte
Zellen lag bei 41 % des Wertes der EGF Kontrolle, der Wert für S-CAT-S bei 57.4 % und die
Mediumkontrolle bei 52.2 %. Mit Ausnahme der EGF inkubierten Zellen lagen die
Unterschiede des Wundverschlusses zwischen CATwt, S-CAT-S und der Mediumkontrolle
im Rahmen des Fehlers für zelluläre Versuche. Es konnte kein induzierender Effekt für das
S-CAT-S festgestellt werden. In Verbindung mit deutlichem Bindungsnachweis des S-CAT-S
an den sEGF-R wäre dies ein vorteilhaftes Ergebnis, da ein stimulierender Effekt für ein
therapeutisches Agens wünschenswert wäre.
Ergebnisse
45
4.3.2.7 Test auf Interaktion des S-CAT-S Fusionsproteins mit membranständigem EGF-R auf A431 Zellen mittels Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrie wird klassischer Weise in der Diagnostik eingesetzt, um mittels
spezifischer, fluoreszenzmarkierter Antikörper Oberflächenmarker auf Zellen nachzuweisen,
wie beispielsweise bei der Diagnose der Leukämie. Ebenso lässt sich die Technik aber auch
für den Nachweis der Bindung eines fluoreszenzmarkierten Konstrukts an Zellen einsetzen.
Der Vorteil der Durchflusszytometrie liegt in der Datenerfassung auf Einzelzellebene mit
nahezu beliebig großem Probenumfang. Typischerweise werden 10.000 bis 20.000 Zellen
erfasst. Demgegenüber vermittelt der ELISA nur ein gemitteltes Abbild über die gesamte
Zellpopulation, auch die konfokale Immunfluoreszenz vermittelt entweder nur einen
Überblick, oder sehr genaue Daten nur auf Grundlage einiger weniger Zellen.
A431 Zellen wurden vereinzelt und mit dem Fusionsprotein S-CAT-S inkubiert, der
Nachweis des Konstrukts erfolgte mittels präinkubiertem primären Ziege anti-CAT Antikörper
und sekundärem anti-Ziege Alexa 488 Antikörper. Als Antikörperkontrollen wurden der
sekundäre Antikörper und präinkubierte primärer und sekundärer Antikörper eingesetzt, und
als weitere Negativkontrolle wurde das CATwt Enzym eingesetzt.
Sowohl das CATwt Enzym, als auch die Antikörperkontrollen zeigten kein Hintergrundsignal
im Vergleich zu ungefärbten Zellen (Abbildung 29). Die membranständige Präsentation des
EGF-R auf A431 Zellen konnte durch die Positivkontrolle scFv 425-Bla, einem Fusionsenzym
aus dem scFv 425 und der -Laktamase, gezeigt werden (Abbildung 28). Für das S-CAT-S
Konstrukt konnte unter den angewandten Bedingungen keine Bindung an A431 Zellen
nachgewiesen werden, die Fluoreszenzintensität war mit dem des CATwt Enzyms, welches
keine spezifischen Peptide präsentiert, identisch (Abbildung 28).
Abbildung 28.) FACS basierter Test auf EGFR : S-CAT-S Interaktion mit A431 Zellen. Die Positivkontrolle scFv 425-Bla wies ein deutliches Fluoreszenzsignal auf. CATwt Enzym zeigte kein Hintergrundsignal. Bindung des S-CAT-S konnte nicht gezeigt werden. Überlagerung der CATwt und S-CAT-S Signale ergab keine Signaldifferenz.
Ergebnisse
46
Abb
ildun
g 2
9)
F
AC
S A
naly
se e
iner
Peptid v
erm
itte
lten L
okalis
ation d
es S
-CA
T-S
Fusio
nspro
tein
s a
n A
431 Z
elle
n.
Die
Positiv
kon
trolle
scF
v 4
25 B
la z
eig
te d
eu
tlic
he F
luore
szenz a
uf
A43
1 Z
elle
n (
ob
ere
Ze
ile).
Prä
sen
z f
unktion
ale
n E
GF
-R a
uf
A43
1 Z
elle
n n
ach V
ere
inze
lun
g
durc
h A
ccuta
se
Verd
au
ko
nnte
bestä
tigt
werd
en.
Die
Antiköp
erk
ontr
olle
n z
eig
ten i
m V
erg
leic
h z
u u
ngefä
rbte
n Z
elle
n e
in s
ehr
geri
nges
Hin
terg
rundsig
nal.
CA
Tw
t N
egativko
ntr
olle
zeig
te e
in g
erin
ges H
inte
rgru
ndsig
nal, d
as n
icht
hö
her
ausfiel, a
ls d
ie A
ntikörp
erk
ontr
olle
n
(unte
re
Zeile
).
Das
S-C
AT
-S
Fusio
nspro
tein
ze
igte
kein
F
luore
szenzsig
na
l a
us
A431
Ze
llen.
Zellen
wurd
en
nic
ht
fixie
rt.
Nach
der
Vere
inzelu
ng
der
Zelle
n w
urd
en a
lle S
chri
tte
auf
Eis
du
rchgefü
hrt
, um
ein
e I
nte
rnalis
ieru
ng d
er
Lig
ande
n z
u v
erm
eid
en
.
Ergebnisse
47
4.3.3 Diskussion
Nach sechs Selektionsrunden auf A431 Zellen und der sezernierten Variante des EGF-R
wurden drei dominante Sequenzen isoliert (SSHIFTF, HNVRHFSLHNLQ, GLNSPIHSR), die
im monoklonalen Phagen-ELISA vergleichbar starke Bindungssignale zeigten (Abbildung
11), was in sich konsistent erschien. Die Sequenz SSHIFTF entstammte als einzige direkt
einer CDR (CDR L3) des parentalen mAK 425, während die übrigen Sequenzen aus
anderen Leserastern entstammten. Ein Sequenzhomologievergleich der mit Histidin
beginnenden Tripeptidmotive (HXX) mittels T-coffee (Poirot, O'Toole et al. 2003) erbrachte
einen guten Homologiewert von 79, der im Lichte einer zweifachen Präsenz eines Histidins
in der Struktur des parentalen mAK 425 (CDR L3 und CDR H2) eine gute Rationale für die
angereicherten Sequenzen lieferte und das Vertrauen in die gute Selektionsmethodik
untermauerte (Abbildung 9, Abbildung 10). Die herausragende Bedeutung von
Tripeptidmotiven bei der Selektion von Peptiden wurde bereits in anderen Arbeiten gezeigt
(Arap, Kolonin et al. 2002; Kolonin, Bover et al. 2006; Kolonin, Sun et al. 2006). Ein weiterer
Aspekt, der eine Rationale für die selektierte Peptidsequenz SSHIFTF lieferte, war die
Beobachtung, dass die CDR L3 bei vielen untersuchten Antikörper-Antigen Paaren für die
meisten inter-Domänenkontakte verantwortlich zeichnete (MacCallum, Martin et al. 1996).
Aufgrund der dargestellten Sachverhalte konnte von einer methodisch und inhaltlich
fundierten Basis der Phage Display basierten Selektion EGF-R spezifischer
Peptidsequenzen, im speziellen der SSHIFTF Sequenz, ausgegangen werden, sodass diese
für die Generierung eines CAT-Fusionsproteins (S-CAT-S) ausgewählt wurde.
Nach anfänglicher schlechter Reproduzierbarkeit des S-CAT-S Bindungssignals in ELISA
Experimenten, welche zum einen auf den variierend hohen Hintergrund des CATwt Enzyms
und zum anderen auf das, unabhängig vom CATwt, schwankende Bindungssignal des S-
CAT-S Fusionsproteins zurückzuführen war, konnten nach ausgiebigen Tests Bedingungen
gefunden werden, unter denen sowohl das CATwt Signal auf niedrigem Niveau, als auch das
S-CAT-S Signal reproduzierbar waren (Abbildung 16). Darüber hinaus konnten unter diesen
Bedingungen in ELISA Experimenten sowohl die konzentrationsabhängige Verdrängung des
S-CAT-S Konstrukts durch den scFv 425 (Abbildung 17), als auch eine Abhängigkeit des
Bindungssignals von der Anzahl präsentierter Peptide gezeigt werden, wobei ersteres auch
mit einem einfachen sterischen Effekt erklärt werden könnte, da es sich beim scFv 425-Bla
um ein Fusionsprotein mit einem relativ großen Enzym (β-Laktamase) handelt. Mittels
zellulärem ELISA auf A431 Zellen konnte ebenfalls eine Bindung des Fusionsproteins
gezeigt werden, wenn das Signal auch nur geringfügig höher war als das Signal der CATwt
Kontrolle, die ein deutliches unspezifisches Signal zeigte (Abbildung 19).
Ergebnisse
48
Da der Bindungsnachweis mittels ELISA nur unter recht spezifischen Bedingungen mit guter
Reproduzierbarkeit gelang, wurden weitere Methoden zum Interaktionsnachweis angewandt,
wobei die Oberflächenplasmonresonanz ebenfalls mit gereinigtem Rezeptor durchgeführt
wurde. Mittels Oberflächenplasmonresonanz konnte jedoch weder unter
Standartbedingungen noch unter den im ELISA getesteten Pufferbedingungen eine Bindung
gezeigt werden (Abbildung 25). Einen möglichen Erklärungsansatz könnte man darin sehen,
dass der sEGF-R während des Kopplungsprozesses, der bei pH 3.4 durchgeführt wurde,
durch erneutes Aussetzen eines niedrigen pH Wertes denaturiert wurde, jedoch ist die
nachgewiesene Bindung des natürlichen Liganden EGF und die daraus errechneten 81%
Aktivität des gekoppelten Rezeptors kontraindikativ für diese Erklärung. Somit konnte mit
zwei unabhängigen Methoden die Bindung des S-CAT-S Konstrukts an den gereinigten
sEGF-R nicht eindeutig und zweifelsfrei nachgewiesen werden.
Mithilfe zwei weiterer, zellbasierter Methoden konnte die Bindung ebenfalls nicht zufrieden
stellend geklärt werden. Als eine anerkannte und weit verbreitete Methode zum
Bindungsnachweis wurde die Durchflusszytometrie eingesetzt. Bei dieser Technik wird die
Bindung an Zelloberflächenmoleküle auf Einzelzellebene mit sehr großem Probenumfang
detektiert. Als Positivkontrollen wurden der scFv 425-Bla und ein EGF NeutrAvidin Oregon
Green 488 Konstrukt eingesetzt, die beide deutliche Fluoreszenzsignale lieferten, sodass
von einer Expression funktionellen Rezeptors auf der Zelloberfläche ausgegangen werden
konnte. Für das S-CAT-S Konstrukt konnte mittels Durchflusszytometrie keine Bindung an
A431 Zellen nachgewiesen werden (Abbildung 28). Die Inkubation der Zellen mit dem S-CAT-
S Konstrukt wurde bei 4°C durchgeführt, um eine potentielle Internalisierung des Konstrukts
zu verhindern, was die anschließende Detektion mit dem sekundären,
fluoreszenzgekoppelten Antikörper verhindert hätte. Somit ist nicht auszuschließen, dass die
Bindung aufgrund der niedrigen Temperatur nicht zustande kommen konnte, obwohl unter
diesen Bedingungen eine Bindung des EGF deutlich gezeigt werden konnte.
Als weitere zellbasierte Methode zum Nachweis einer Peptid vermittelten Bindung des
Fusionsproteins S-CAT-S an A431 Zellen wurde die konfokale Fluoreszenzmikroskopie
hinzugezogen, mit deren Hilfe eine membranständige Lokalisation des Fluoreszenzsignals
im Falle einer Bindung nachgewiesen werden kann. Der als Positivkontrolle eingesetzte scFv
425-Bla zeigte bei diesen Analysen erwartungsgemäß ein deutlich membranständiges
Fluoreszenzsignal (Abbildung 20), da es durch die Fixierung der Zellen nicht zu einer
Internalisierung des membranständigen EGF-R – scFv 425-Bla Komplexes kommen konnte.
Für den natürlichen Ligand EGF wurde sowohl membranständige, als auch cytosolische
Fluoreszenz nachgewiesen, wobei charakteristische Bereiche mit besonders intensiver
Fluoreszenzdichte auftraten. Das Fluoreszenzmuster des Fusionsproteins S-CAT-S war
vergleichbar mit dem Signal des Liganden EGF und zeigte die gleichen Charakteristika. Ein
Ergebnisse
49
cytosolisches Fluoreszenzsignals wäre bei fixierten und nicht permeabilisierten Zellen nicht
unbedingt zu erwarten gewesen, da eine zellvermittelte Internalisierung nicht möglich
gewesen sein sollte, sodass evtl. von einer unzureichenden Fixierung ausgegangen werden
muss. Im Widerspruch zu dieser Interpretation steht aber das deutlich membranlokalisierte
Signal des scFv 425-Bla und das Fehlen cytosolischer Fluoreszenz, obwohl alle Zellen
parallel behandelt wurden. Für den parentalen mAK 425 und den abgeleiteten scFv 425
wurde beschrieben, dass eine EGF-R vermittelte Internalisierung des AK auf A431 Zellen
stattfand (Sunada, Magun et al. 1986; Kreitman 2001). Das relativ hohe Hintergrundsignal
des CATwt Enzyms zeigte sich zuvor auch schon bei den zellulären ELISA Experimenten.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass eine Bindung des S-CAT-S
Fusionsproteins nicht die notwendige Robustheit besitzt, um mit jeder Methode zweifelsfrei
nachgewiesen werden zu können. Die Tatsache, dass weder das S-CAT-S Fusionsprotein,
noch das CATwt Protein einen stimulierenden Einfluss auf A431 Zellen ausübten (Abbildung
26 & Abbildung 27), war aus theoretischen Überlegungen vorteilhaft für die Idee des
späteren potentiellen Einsatzes in der Wirkstoffaktivierungtherapie, jedoch ohne einen
zweifelsfreien Bindungsnachweis nicht von eigenständiger Aussagekraft.
Ergebnisse
50
4.4 Das QWSSHIFTF-Streptavidin Konstrukt
4.4.1 Einleitung
Wie zuvor beschrieben, wurde in der Phage Display basierten Selektion eine Peptidsequenz
isoliert (SSHIFTF), die aus der CDR L3 des mAK 425 stammt, wobei diese nicht die gesamte
elterliche Sequenz umfasste. Es sollte im Folgenden untersucht werden, ob die vollständige
Sequenz der CDR L3 (QWSSHIFTF) der SSHIFTF Sequenz überlegene
Bindungseigenschaften aufweist. Zu diesem Zweck wurde die Sequenz als N-terminal
biotinyliertes Peptid bestellt. Mit diesem Peptid wurden durch Inkubation mit Streptavidin-
A.
B.
Abbildung 30) Darstellung der Peptidsequenz QWSSHIFTF in der modellierten Struktur des mAk 425. A. Vergrößerte Darstellung der Peptidsequenz. B. Stereo-Abbildung der Peptidsequenz. Die Seitenketten des His 93 ragt prominent aus der Struktur heraus.
Ergebnisse
51
HRP oder NeutrAvidin Oregon Green 488 Targeting-Komplexe für ELISA Experimente bzw.
FACS Experimente generiert, was durch den modularen Aufbau einen raschen
Interaktionsnachweis ermöglichte. Aufgrund der starken nicht-kovalenten Interaktion
zwischen Streptavidin und Biotin, eignen sich das dimere, vier Biotinmoleküle bindende
Streptavidin und dessen Derivate gut für die multimere Präsentation EGF-R spezifischer
Peptide zum Bindungsnachweis.
4.4.2 Ergebnisse
4.4.2.1 ELISA basierter Versuch eines Bindungsnachweises für den QWSSHIFTF Streptavidin Komplex an die sEGF-R Proteinoberfläche
Das biotinylierte Peptid QWSSHIFTF wurde in ELISA Experimenten auf Interaktion mit dem
immobilisierten sEGF-R unter zwei experimentellen Konditionen getestet, die einen
Rückschluss auf den Einfluss der Valenz auf die Bindung erlauben sollten. Bei serieller
Inkubation wurden im ersten Schritt wurden zunächst nur die Peptide inkubiert, was das
Zustandekommen eines multimerisierungsbedingten Aviditätseffekts unterbinden sollte.
Nach Entfernung ungebundener Peptide wurden im zweiten Schritt an den EGF-R
gebundene, monomere Peptide mittels Streptavidin detektiert. Bei Präinkubation des Peptids
mit Streptavidin entsteht dagegen ein tetravalenter QWSSHIFTF : Streptavidin-HRP
Komplex, der einen Aviditätseffekt ermöglichen sollte. Dieser Hypothese folgend wäre also
A.
B.
Abbildung 31.) ELISA mit biotinylierten Peptid : Streptavidin Konstrukten. A. Peptide und Streptavidin-HRP wurden seriell auf immobilisiertem sEGF-R inkubiert. Das QWSSHIFTF zeigte ein höheres Bindungssignal als Strep-HRP alleine oder mit Biotin konjugiert. B. Biotinylierte Peptide wurden mit Strep-HRP präinkubiert und anschließend auf dem sEGF-R auf Bindung getestet. Das Bindungssignal des QWSSHIFTF : Strep-HRP Konstrukts war nicht signifikant höher als das Signal der beiden Kontrollkonstrukte. Die EGF : Strep-HRP Positivkontrolle zeigte eine deutlichere Bindung.
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
QWSSHIFTF + Strep-
HRP
Strep-HRP Biot + Strep-HRP EGF
Abs.
@ 4
05 n
m
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
QWSSHIFTF + Strep-
HRP
Strep-HRP Biot + Strep-HRP EGF
Abs.
@ 4
05 n
m
Ergebnisse
52
für die präinkubierten Konstrukte (QWSSHIFTF und EGF) ein höheres Signal zu erwarten als
bei den seriell inkubierten Versuchen. Bei serieller Inkubation war das Signal der EGF-
Positivkontrolle geringfügig höher als die Signale der Negativkontrollen (Abbildung 31, A.).
Das QWSSHIFTF Peptid zeigte, bei großem Fehler, ein höheres absolutes Signal als die
EGF Kontrolle, sodass man nicht von einem eindeutigen Bindungsnachweis ausgehen
konnte (Abbildung 31, A.). Der präinkubierte EGF : Streptavidin-HRP Komplex zeigte ein
erwartungsgemäß hohes Signal (2.3-fach höher als die Negativkontrolle), jedoch konnte für
den QWSSHIFTF : Streptavidin-HRP Komplex kein Bindungssignal detektiert werden, das
signifikant höher war als das der Negativkontrollen, die Differenz der Absorption zu der
Negativkontrolle betrug nur 0.02 Absorptionseinheiten (Abbildung 31, B.). Eine endgültige
Aussage über den Einfluss eines möglichen Aviditätseffekt konnte mangels Bindung des
QWSSHIFTF Peptids nicht getroffen werden, auch für das EGF war dies bei dem gezeigten
Versuch nicht möglich, da die Durchführung der beiden ELISA Experimente unter seriellen
und präinkubierten Bedingungen unabhängig voneinander stattfand. Vorrangig sollte zuerst
die QWSSHIFTF vermittelte Bindung des Targeting-Komplexes gezeigt werden, was auch in
weiteren Versuchen nicht gelang. Aus diesem Grunde wurde auf eine Wiederholung dieses
Vergleichs für EGF verzichtet.
Ergebnisse
53
4.4.2.2 Bindungsnachweis für den QWSSHIFTF : NeutrAvidin Komplex an A431 Zellen mittels Durchflusszytometrie
Ergänzend zu den ELISA basierten Versuchen zum Nachweis einer peptidvermittelten
Bindung wurde versucht mithilfe der Durchflusszytometrie eine Bindung an A431 Zellen
nachzuweisen. Zu diesem Zweck wurde das fluoreszenzmarkierte NeutrAvidin als Modul zur
Multimerisierung des QWSSHIFTF Peptids für FACS Analysen verwendet. NeutrAvidin weist
im Unterschied zu Avidin einen neutralen pI auf und neigt aufgrund der neutralen Ladung
potentiell weniger zu unspezifischen Interaktionen mit der zellulären Matrix, sodass es für
FACS Analysen mit Zellen gut geeignet schien. Die EGF-R spezifische Bindung des Peptids
wurde auf zwei Arten überprüft. In einem Ansatz wurden die biotinylierten Peptide mit
NeutrAvidin Oregon Green 488 vor der Inkubation auf A431 Zellen präinkubiert, so dass ein
mit vier Peptiden dekorierter Komplex resultierte. Im anderen Ansatz wurden zunächst die
Peptide auf den A431 Zellen inkubiert, ungebundene Peptide entfernt und gebundene
Peptide anschließend mit NeutrAvidin Oregon Green 488 detektiert. Als Kontrollen wurden
undekoriertes NeutrAvidin Oregon Green 488 und mit Biotin dekoriertes NeutrAvidin Oregon
Green 488 eingesetzt, die beide ein kaum detektierbares Hintergrundsignal lieferten
(Abbildung 33).
Das als Positivkontrolle eingesetzte EGF zeigte unter beiden experimentellen Bedingungen
deutliche Fluoreszenz, die in zwei Zellpopulationen mit unterschiedlicher
Fluoreszenzintensität zu unterscheiden war, was vermutlich auf nicht gesättigte
Konzentration an Komplexen zurückzuführen war (Abbildung 33). Bei einer Wiederholung mit
präinkubierten Komplexen lieferte die EGF Kontrolle erneut eine deutliche Fluoreszenz,
während das QWSSHIFTF Konstrukt keine Fluoreszenz zeigte (Abbildung 32).
Abbildung 32.) FACS Analyse des QWSSHIFTF : NeutrAvidin Oregon Green 488 Komplexes auf A431 Zellen. Alle Komplexe wurden präinkubiert. Mittels EGF dekorierter Positivkontrolle konnte die membranständige Präsenz des EGF-R nachgewiesen werden. Der QWSSHIFTF dekorierte Komplex zeigte keine Fluoreszenz. Die Überlagerung des EGF Signals mit dem QWSSHIFTF Signal verdeutlichte die nicht messbare QWSSHIFTF vermittelte Bindung.
Ergebnisse
54
Abb
ildun
g 3
3.) F
AC
S A
naly
se d
er Q
WS
SH
IFT
F v
erm
ittelte
n B
ind
un
g a
n A
43
1 Z
elle
n b
ei s
erie
ller In
ku
batio
n b
zw
. Prä
inkub
atio
n. O
bere
Reih
e: A
431 Z
elle
n w
urd
en z
unächst m
it den je
we
iligen P
eptid
e in
kub
iert, u
ng
ebun
den
e P
eptid
e e
ntfe
rnt u
nd a
nschlie
ße
nd m
it Ne
utrA
vid
in
Ore
gon G
ree
n 4
88 d
ete
ktie
rt. NeutrA
vid
in O
reg
on G
reen 4
88 v
eru
rsachte
nur s
ehr g
erin
ge H
inte
rgru
ndsig
na
le v
erg
liche
n m
it unge
färb
ten
Zelle
n (1
. + 2
.Sp
alte
). EG
F d
ekorie
rte P
ositiv
kontro
lle z
eig
te u
nte
r beid
en B
edin
gunge
n e
in d
eutlic
hes F
luore
szenzsig
na
l (3. S
palte
), das z
u
unte
rschie
dlic
he
m A
usm
aß
in z
we
i Pop
ula
tione
n z
u u
nte
rteile
n w
ar. F
ür d
as P
eptid
QW
SS
HIF
TF
kon
nte
unte
r be
ide
n B
ed
ing
ung
en k
ein
e
Bin
du
ng a
n A
431
Zelle
n fe
stg
este
llt werd
en
(4. S
pa
lte).
Ergebnisse
55
4.4.3 Diskussion
Das QWSSHIFTF Peptid, welches der vollständigen CDR L3 des parentalen mAK 425
entspricht, vermittelte weder in ELISA Experimenten, noch bei FACS Analysen eine Bindung
der Streptavidin-HRP respektive NeutrAvidinOG488 Komplexe an den sEGF-R bzw. an
A431 Zellen. In beiden Fällen konnte jedoch für die Positivkontrolle EGF ein deutliches
Bindungssignal festgestellt werden. Die beiden Aminosäuren Q und W scheinen also
mindestens keinen positiven Einfluss auf die Bindung auszuüben. Für das S-CAT-S
Fusionsprotein konnte im ELISA eine Bindung nachgewiesen werden, was bei FACS
Analysen nicht gelang, dagegen konnte für das um die Aminosäuren Q und W veränderte
Peptid auch im ELISA keine Bindung gezeigt werden. Zwar sind die
Streptavidin/NeutrAvidinOG488 Konstrukte nicht direkt mit dem S-CAT-S Fusionsprotein
vergleichbar, da sie sich schon in der Valenz präsentierter Peptide (4 gegenüber 6
präsentierten Peptiden für letzteres Konstrukt) unterschieden, jedoch zeigten die
Experimente, dass auch das vollständig der CDR L3 entsprechende Peptid keine robustere
Bindung an den EGF-R bzw. an A431 Zellen zu vermitteln vermochte.
Ergebnisse
56
4.5 Das S-GST-S Fusionsprotein
4.5.1 Einleitung
Aufgrund der anfänglich hohen Hintergrundsignale durch die Enzymkontrolle CATwt,
wurde alternativ und parallel zur Optimierung der Pufferbedingungen für das CATwt Enzym
ein dimeres Konstrukt auf dem Enzym Glutathion-S-Transferase (GST) basierend generiert.
GST spielt bei der Entgiftung von Xenobiotika in der Leber, wo sie die Konjugation
des Tripeptids GSH katalysieren eine wichtige Rolle (Hayes und Pulford 1995; Hayes und
Strange 1995). Das Enzym GST wird in fast allen Arten und Geweben vorgefunden, wobei
die höchste Aktivität bei Menschen in der Leber, gefolgt von der Niere, vorgefunden wird
(Pacifici, Franchi et al. 1988; Pacifici, Franchi et al. 1988). Eine Überexpression des Enzyms
GST wird häufig bei humanen Tumoren vorgefunden (Tew, Monks et al. 1996). Der Umstand
der Überexpression von GST bei einigen humanen Tumoren diente als Rationale, für die
Entwicklung von Wirkstoffvorstufen, die durch GST im Tumor aktiviert werden (Lyttle,
Satyam et al. 1994; Satyam, Hocker et al. 1996; Gunnarsdottir und Elfarra 1999; Hamilton,
Kavarana et al. 1999).
GST (aus Schistosoma japonicum) eignet sich aus struktureller Sicht für eine
Präsentation der Peptide, da sich die Termini frei zugänglich an der Proteinoberfläche
befinden. Ein potentieller Aviditätseffekt würde bei vier gegenüber sechs präsentierten
Peptiden beim S-CAT-S Konstrukt naturgemäß niedriger ausfallen, jedoch war die Hoffnung
bei ausreichender Affinität des Peptids bei geringerem Hintergrundsignal des GSTwt Enzyms
dennoch eine EGF-R spezifische Lokalisierung des S-GST-S Konstrukts zeigen zu können.
4.5.2 Ergebnisse
4.5.2.1 Rekombinante Herstellung und Reinigung
Die SSHIFTF kodierende Sequenz wurde mittels Primer-Extension-PCR, unter Verwendung
der Oligonukleotide pF_SSHIFTF_CAT und pR_GST_SSHIFTF, an die 5´und 3´ Termini des
gst-li-Gens in pQE16 Hintergrund angehängt. Das PCR-Produkt, welches für das gesamte S-
GST-S Konstrukt codiert, wurde über die Restriktionsschnittstellen NheI und HindIII in den
ebenso geöffneten pLISC Expressionsvektor subkloniert (pIB30_SSHIFTF_GST_SSHIFTF).
Das S-GST-S Konstrukt im pLISC Expressionsvektor wurde in E. coli RV308 exprimiert und
mittels Affinitätschromatographie isoliert. Aus 2 l Kultur konnten ca. 790 µg Protein
Ergebnisse
57
gewonnen werden, was deutlich unter der Ausbeute des GSTwt Enzyms (826 µg Protein aus
1 l Kultur) lag.
Nach der Dialyse wurden 15 µl Probe mittels SDS-PAGE auf korrekte Größe und Reinheit
analysiert. Eine Coomassie Färbung des Gels ergab eine starke, singuläre Proteinbande, die
auf einer Höhe von 27.8 kDa lief, was in guter Übereinstimmung mit dem errechneten
Molekulargewicht von 28.8 kDa liegt (Abbildung 34). Das GSTwt Protein weist ein
Molekulargewicht von 25.8 kDa auf. Korrekte Größe und hohe Reinheit konnten somit
dokumentiert werden.
Abbildung 34.) 12.5 % SDS-PAGE Analyse des S-GST-S Konstrukts. Mittels Coomassie Färbung wurden die Proteinbanden visualisiert. Größe 28.8 kDa konnte auf dem Gel bestätigt werden.
Ergebnisse
58
4.5.2.2 ELISA basierter Test auf S-GST-S : sEGF-R Interaktion
Der ELISA auf immobilisiertem sEGF-R offenbarte ein geringes absolutes Hintergrundsignal
(0.2 bzw. 0.26 Absorptionseinheiten) des GSTwt Enzyms auf sEGF-R immobilisierter
Oberfläche (Abbildung 35). Das S-GST-S zeigte relativ zur GSTwt Kontrolle unterschiedlich
starke Signale in Abhängigkeit der verwendeten Blockierungslösung, war jedoch mit 0.16
bzw. 0.13 Absorptionseinheiten auf sehr geringem Niveau und konnte daher nicht als
indikativ für eine sEGF-R spezifische Bindung angesehen werden.
A. BSA
B. PVP
Abbildung 35.) Test auf eine SSHIFTF vermittelte Lokalisierung des S-GST-S Konstrukts am sEGF-R unter Verwendung von BSA bzw. PVP-K30 als Blockierungslösung. A. Bindungssignal des GSTwt war auf BSA blockierter sEGF-R Oberfläche um 0.04 Aborptionseinheiten geringfügig höher als das Signal des S-GST-S. B. Auf PVP blockierter sEGF-R gekoppelter Oberfläche war das unspezifische Hintergrundsignal des GSTwt um 0.13 Absorptionseinheiten (2-fach) höher als das des S-GST-S.
4.5.3 Diskussion
Für das S-GST-S Konstrukt konnte keine Bindung an den sEGF-R nachgewiesen werden.
Die Bedingungen des GST ELISA wurden analog zu den ersten ELISA Versuchen mit dem
S-CAT-S Konstrukt gehalten. Da kurz nach der Durchführung des ELISA Experiments mit
GST basierten Konstrukte optimale Bedingungen bezüglich der Salzkonzentration in
Verbindung mit PVP als Blockierungslösung für die CAT basierten Konstrukte gefunden
werden konnten, wurde auf eine Optimierung der Parameter für die GST basierten
Konstrukte verzichtet, da diese durch die geringere Valenz präsentierter Peptide
konzeptionell ohnehin benachteiligt sein sollten.
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
GSTwt S-GST-S
Ab
sorp
tio
n @
40
5 n
m
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
GSTwt S-GST-S
Ab
sorp
tio
n @
40
5 n
m
Ergebnisse
59
4.6 Das SSHIFTF-Bla-T-Zip Konstrukt
4.6.1 Einleitung
Die topologischen Eigenschaften der Präsentation bisher vorgestellter, CAT oder GST
basierter Konstrukte unterscheidet sich deutlich von der Präsentation der Peptide auf den
Phagenpartikeln. Auf Phagen werden die Peptide an der Spitze des Phagen präsentiert und
liegen demzufolge räumlich nahe zusammen, was eine hohe lokale Konzentration des
präsentierten Peptids bedingt (Abbildung 36). Auf den globulären Enzymen werden die
Peptide jedoch auf der Proteinoberfläche verteilt präsentiert, was zu einer vergleichsweise
geringeren lokalen Konzentration führen könnte. Da die Resultate der CAT und GST
basierten Konstrukte zu diesem Zeitpunkt noch uneinheitlich ausfielen, wurde ein
alternativer Ansatz gesucht. Dieser sollte den beschriebenen, theoretischen Nachteil unter
Beibehaltung einer enzymatischen Funktion ausgleichen.
Abbildung 36.) Schematische Repräsentation eines M13 Phagenpartikels. PIII Hüllprotein ist blau, PVIII grün und die spiralisierte DNA violett dargestellt. Die Fusion von Peptiden an das PIII Hüllprotein bedingt eine hohe lokale Konzentration des präsentierten Peptids.
Das Hüllprotein PIII des M13 Phagen und damit auch N-terminal fusionierte Peptide werden
in drei bis fünf Kopien an dessen Spitze präsentiert.
Der in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Plückthun entwickelte Tetrazipper (Pack, Müller et al.
1995) sollte es erlauben, ähnliche topologische Bedingungen wie auf dem M13 Phagen für
ein zu präsentierendes Peptid breit zu stellen. Der Tetrazipper sollte als Gerüst zur
Multimerisierung eines EGF-R spezifischen Peptids dienen.
Die enzymatische Funktion hingegen sollte durch die N-terminale Fusion der -Laktamase
bereitgestellt werden, wobei es sich um eine stabilisierte Variante des Proteins handelt
(Hecky und Müller 2005). Ein stabileres Protein bietet Vorteile für eine spätere hypothetische
therapeutische Anwendung im Hinblick auf die rekombinante, industrielle Fertigung des
Therapeutikums, sowie auf die Halbwertzeit bei dessen Applikation im Körper. Parallel wurde
im Labor an einer Variante der -Laktamase gearbeitet, die als Fernziel einer aufgrund der
Ergebnisse
60
prokaryotischen Herkunft bedingten Immunantwort durch Eliminierung dominanter Epitope
ausweichen sollte (Dr. med. Janina Speck).
Das SSHIFTF Peptid wurde als bindendes Modul an den N-Terminus der -Laktamase
fusioniert, womit sich die Bezeichnung des resultierenden Konstrukts analog zu seinem
strukturellen Aufbau zu „S-Bla-TZip“ ergab.
Der funktionelle Komplex stellt sich als Tetramer dar, der vier -Laktamase Enzyme enthält,
an deren N-Termini jeweils ein SSHIFTF Peptid präsentiert wird. Um sterische Probleme
aufgrund der räumlich dichten Packung von vier Enzymen zu vermeiden wurde in den
flexiblen Linker zwischen -Laktamase und Tetrazipper die Aminosäure Prolin inseriert,
welche einen Knick im Linker verursacht.
4.6.2 Ergebnisse
4.6.2.1 Klonierung und Reinigung
Klonierung:
Ausgehend von einer optimierten Variante der -Laktamase wurden durch mehrstufige
Primer Extensions PCR zunächst die Linkersequenzen und schließlich die SSHIFTF bzw.
Tetrazipper kodierenden Sequenzen an das Gen der -Laktamase kloniert. Im ersten Schritt
wurden unter Verwendung der Primerpaare pF_BlaSS_SSHIFTF_li_BlaS3#6 und
pR_BlaS3#6_li_tzip (Abbildung 37, F1 bzw. R1) die SSHIFTF, jeweilige Linker und ein Teil
der Tetrazipper kodierenden Sequenzen an das -Laktamase-Gen kloniert. Das PCR
Abbildung 37.) Schematische Darstellung des genetischen S-Bla-TZip Konstrukts. Verwendete Pimerpaare wurden symbolisch als geschweifte Klammern dargestellt.
Ergebnisse
61
Produkt diente wiederum als Matrize für die zweite PCR unter Verwendung der Primerpaare
prF_NdeI_BlaSS_sigseq_5end und pR2_BlaS3#6_li_tzip (Abbildung 37, F2 bzw. R2). Das
finale PCR Produkt wurde über die Schnittstellen NdeI und HindIII in den identisch
geöffneten Vektor pJH_BlaSS_Blawt kloniert.
Reinigung:
Das S-Bla-TZip Konstrukt wurde aus 3 L RV308 Expressionskultur durch Periplasma-
aufschluss und anschließende Affinitätschromatographie isoliert. Die Reinigung über eine
Phenylboronat-Säule erbrachte mit einem
maximalen Proteinabsorptionswert von 120 mAU
eine geringe Ausbeute. Ein auf Farbumschlag
basierender Aktivitätstest mit dem Substrat
Nitrocefin zeigte, dass die Reinigung prinzipiell
erfolgreich war (Abbildung 38). Der Durchfluss und
eine Waschfraktion zeigten auch 2 min nach
Zugabe des Substrats kaum Aktivität, während in
der Elutionsfraktion #18 sofort nach Zugabe des
Substrats, trotz der inhibierenden Wirkung des mit
Boronat versetzten Elutionspuffers, ein
Farbumschlag zu dunklem rot stattfand. Die
Konzentration des Proteins war zu gering, um
mittels Coomassie Färbung (untere Nachweisgrenze für Proteine ca. 100 ng/Bande) des
SDS-Gels eine Proteinbande nachweisen zu können.
4.6.3 Diskussion
Das S-Bla-TZip Fusionsprotein konnte erfolgreich kloniert werden. Die Expression und
Reinigung gelangen nur zu geringen Mengen, die nicht ausreichend waren, um auf einem
Coomassie gefärbten SDS-Gel nachgewiesen werden zu können. Um geeignete Mengen für
Interaktionsstudien bereitstellen zu können, hätte das Fusionsprotein in größerem Maßstab
exprimiert werden müssen. Ein 10 l Fermenter, in dem OD600 Werte von 80 – 100 erzielt
werden können, hätte vermutlich ausreichende Mengen erbracht. Der Ansatz wurde aus
zeitlichen Gründen nicht weiter verfolgt.
Abbildung 38.) Aktivitätstest des gereinigten S-Bla-TZip Konstrukts. Nitrocefin wurde zu den Proben
gegeben, bei -Laktamase Aktivität erfolgte ein Farbumschlag von gelb zu rot.
Ergebnisse
62
5 Kapitel 2 Ansätze zum rationalen Peptiddesign
In dem vorliegenden Kapitel soll der rationale Ansatz zur Generierung EGF-R spezifischer
Peptide beschrieben werden.
5.1 CDR H3 abgeleitetes Peptid als bindendes Modul für die Fusion an das CAT Enzym
5.1.1 Einleitung
Antikörper sind in der Lage eine beinahe unbegrenzte Varietät an Antigenen spezifisch zu
erkennen. Dieser enormen Vielfalt an Antikörper/Antigen Paaren steht eine verblüffend
geringe Varianz in der Struktur von Antikörpern entgegen. Die variablen, Antigenkontakt
vermittelnden Regionen eines Antikörpers setzen sich aus einer stark konservierten,
strukturgebenden β-Faltblattdomäne und den hypervariablen, antigenbindenden Schleifen
(CDR), die eine große Sequenzvariabilität aufweisen zusammen, wobei die CDRs die
Antigenkontaktfläche ausbilden (Davies, Padlan et al. 1990; Padlan 1994). Kabat und
Kollegen fanden durch einen Vergleich der Sequenzen mehrerer hypervariabler Schleifen
heraus, dass 13 Positionen innerhalb der leichten Kette und sieben Positionen innerhalb der
schweren Kette der hypervariablen Schleifen konserviert sind und folgerten, dass diese
Aminosäuren strukturgebende und keine Spezifität vermittelnde Funktionen erfüllen (Kabat,
Wu et al. 1977; Kabat 1978). Andere Gruppen konnten außerdem zeigen, dass in vielen
CDRs eine Korrelation zwischen der Anzahl der Aminosäuren in einer hypervariablen
Schleife und deren Konformation unabhängig von der Identität der Aminosäuren besteht
(Fehlhammer, Schiffer et al. 1975; Padlan und Davies 1975; Padlan 1977; Padlan 1977;
Padlan, Davies et al. 1977; de la Paz, Sutton et al. 1986). Chothia et al. unterteilten auf
diesen Arbeiten basierend die hypervariablen Schleifen in „Canonische Klassen“ ein
(Chothia und Lesk 1987). Diesem Modell folgend wird eine CDR in Abhängigkeit der Länge
und einiger Schlüsselpositionen in eine der kanonischen Klassen mit übereinstimmender
Konformation des Peptidrückgrats eingeteilt. Die übrigen Aminosäuren der CDR
determinieren die Spezifität zum Antigen und weisen eine hohe Variabilität auf. Die CDR H3
der schweren Kette ließ sich dagegen nicht in kanonische Klassen unterteilen, da sich die
Längenvarianz und die Sequenzvariabilität sehr ausgeprägt darstellten und somit keine
Strukturzuordnung möglich war. In vielen Strukturen wurde aber die bedeutende Rolle der
Ergebnisse
63
CDR H3 bei der Antigenbindung deutlich, da die häufigsten Kontakte von dieser CDR
vermittelt wurden (MacCallum, Martin et al. 1996).
Den semi-rationalen Ansatz zur Ableitung eines EGF-R spezifischen Peptides ergänzend
sollten in einem rationalen Ansatz die hypervariablen, antigenbindenden Schleifen (CDR)
des mAk 425 direkt als spezifisch bindende Peptide abgeleitet werden.
Die CDR H3 der schweren Kette wurde zunächst für die Klonierung an das CAT Enzym
ausgewählt, da diese CDRs häufig den größten Beitrag an der Interaktion mit dem Antigen
leisten (Mariuzza, Phillips, 1987; MacCallum, Martin, 1996). Zudem wurde bereits ein
Peptidomimetikum (AHNP) aus den CDR H3 Schleifen zweier anti-ErbB2 Antikörper, dem
mAk 7.16.4 und Herceptin erfolgreich abgeleitet (Park, Zhang, 2000). Aufgrund dieser Daten
erschien die CDR H3 des mAK 425 als aussichtsreicher Kandidat.
Ein Teilprojekt dieses Ansatzes bestand in der Entwicklung und Klonierung eines flexiblen,
modularen Vektorsystems, welches die zielgerichtete Kombinatorik beliebiger CDR-
kodierender Sequenzen an die 5´ und 3´-Enden des cat-Gens erlauben sollte.
5.1.2 Ergebnisse
5.1.3 Das „CDR-Shuffling“ Vektorsystem
Zielsetzung war die Entwicklung eines modularen Vektorsystems, mit dessen Hilfe die
effiziente und zielgerichtete Klonierung linear verketteter CDRs in beliebigen, gewünschten
Kombinationen ermöglicht werden sollte. Zu selbigem Zwecke wurden sechs
Ausgangsvektoren kloniert, die jeweils für eine CDR kodieren. Die Sequenz der jeweils drei
CDRs aus der schweren und der leichten Kette wurden aus dem mAK 425 abgeleitet.
Die CDR kodierenden Sequenzen wurden als komplementäre Oligonukleotide mit
passenden Überhängen synthetisiert (Dr. Igloi), hybridisiert, kinasiert und in den NheI und
SpeI geöffneten Grundvektor (pKMEf_B_O_S) kloniert. Die CDR Sequenz wird von zwei
Restriktionsschnittstellen mit kompatiblen Überhängen flankiert (NheI 5´ und SpeI 3´ zur
CDR), wobei der NheI Restriktionsschnittstelle noch eine BspHI Sequenz vorangestellt voran
gestellt wurde.
Die Wahl der Restriktionsschnittstellen erlaubt nun eine zielgerichtete Insertion einer CDR Y,
die über die Schnittstellen BspHI und SpeI aus dem Vektor isoliert wurde, 5´ vor eine zweite
CDR X in korrekter Orientierung in den BspHI und NheI geöffneten CDR X kodierenden
Vektor, da NheI und SpeI kompatible Überhänge aufweisen (Abbildung 39, A.). Der
Ergebnisse
64
resultierende Vektor kodiert für zwei linear verknüpfte CDRs, wobei die
Restriktionsschnittstellen an den 5´ und 3´-Termini rekonstituiert wurden, sodass die
Insertion weiterer CDRs möglich ist.
Analog zur Insertion einer CDR 5´ zur CDR X kann verfahren werden, um eine CDR 3´-
terminal einzufügen, dabei wird eine CDR Z über die Restriktionsschnittstellen NheI und
EcoRI aus dem Donorvektor isoliert und in den SpeI und EcoRI geöffneten
Rezipientenvektor, der für die CDR X kodiert, kloniert (Abbildung 39, B.).
Ergebnisse
65
A.
B.
Abbildung 39.) Schematische Darstellung des Vektorsystems zur zielgerichteten Kombination beliebiger CDR codierender Sequenzen zu einer linearen Peptidkette. A. Eine weitere CDR kodierende Seqenz wird in korrekter Orientierung 5´ vor die vorhandene CDR eingefügt. B. Analoges vorgehen, um eine CDR zielgerichtet am 3´ Ende einzufügen.
Ergebnisse
66
5.1.4 Klonierung, Reinigung und Interaktionsstudien des H3-CAT-H3 Konstrukts
Klonierung, rekombinante Expression und Reinigung:
Das Plasmid pIB30_CAT-li fungierte wie schon für das S-CAT-S Konstrukt als
Rezipientenvektor. In zwei Schritten wurden zunächst das H3-CAT und anschließend das
H3-CAT-H3 Fusionsprotein kloniert. Komplementäre, für die CDR H3 (RDYDYDGRYFDY)
kodierende Oligomere (oligo_shuffle_H3_U & oligo_shuffle_H3_L) mit NheI und SpeI
kompatiblen Überhängen wurden hybridisiert und
kinasiert. Im ersten Schritt wurden die CDR H3
kodierende Oligomere in den NheI geöffneten
Vektor kloniert, sodass die Sequenz im
Leseraster 5´ zum CAT-li Gen inseriert wurde
(pIB30_H3_CAT_li_#6). Dieser mit SpeI geöffnete
Vektor diente wiederum als Rezipient für die
Insertion der CDR H3 am 3´ Ende. Der finale
Vektor (pIB30_H3_CAT_H3_#8) kodierte somit
für ein N- und C-terminal mit der CDR H3
Sequenz via Glycin-Serin-Linker dekoriertes CAT
Enzym, welches H3-CAT-H3 benannt wurde.
Das H3-CAT-H3 Fusionsenzym wurde in E. coli
RV308 exprimiert. Zellen wurden durch
Ultraschallbehandlung aufgebrochen und das
Fusionsprotein mittels Affinitätschromatographie
aus dem Zellextrakt isoliert. An die
Affinitätschromatographie wurden je nach
Verwendungszweck eine Dialyse oder Gelfiltration
(für BIAcore Messungen) zur Abtrennung von
Chloramphenicol und Überführung in die jeweiligen Puffer angeschlossen. Das H3-CAT-H3
Fusionsenzym konnte durch eine Einschritt-Affinitätschromatographie bereits zu hoher
Reinheit isoliert werden (Abbildung 40).
Abbildung 40) 12.5 % SDS-PAGE Analyse des H3-CAT-H3 Konstrukts. Mittels Coomassie Färbung wurden die Proteinbanden visualisiert. Proteinbande lief auf der erwarteten Höhe von 31 kDa.
Ergebnisse
67
5.1.4.1 ELISA basierter Test auf CDR H3 vermittelte Bindung des H3-CAT-H3 an immobilisierten sEGF-R
Mittels ELISA wurde auf eine potentielle Interaktion des H3-CAT-H3 Konstrukts mit
immobilisiertem sEGF-R getestet. Als Negativkontrolle wurden der primäre und sekundäre
Antikörper ohne CAT Konstrukte auf dem sEGF-R inkubiert. CAT-li Konstrukt, welches die
Linkersequenzen an N- und C-Terminus präsentiert, wurde als weitere Kontrolle mitgeführt.
Das Signal des H3-CAT-H3 Konstrukts zeigte keinen signifikanten Unterschied zur CAT-li
Kontrolle (0.3 bzw. 0.31 Abs. @ 405 nm) (Abbildung 41). Für das H3-CAT-H3 Konstrukt
konnte somit keine Bindung auf immobilisiertem sEGF-R nachgewiesen werden. Das
Hintergrundsignal des CAT-li Konstrukts war im Vergleich zur Antikörperkontrolle gering
(0.07 Absorptionseinheiten Differenz). Das S-CAT-S Signal war mit einer Absorption von
0.79 2.4-fach höher als das CAT-li Signal.
Abbildung 41) ELISA basierter Test auf H3-CAT-H3 Interaktion mit immobilisiertem sEGF-R. H3-CAT-H3 Signal war nicht höher als des Signal der Negativkontrolle CAT-li. Für das H3-CAT-H3 konnte keine Bindung mittels ELISA nachgewiesen werden. Das Hintergrundsignal des CAT-li Konstrukts war gering im Vergleich zur Antikörperkontrolle (%). Das zum Vergleich mitgeführte S-CAT-S Konstrukt zeigte deutliche Bindung.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
H3-C A T-H3 C at-li % S-C A T -S
Abs. @
405 n
m
Ergebnisse
68
5.1.4.2 Untersuchung auf zelluläre Lokalisierung des H3-CAT-H3 mittels konfokaler Immunfluoreszenz
Mithilfe der Immunfluoreszenz sollte auf Bindung sowie die membranständige Lokalisation
des H3-CAT-H3 Konstrukts auf A431 Zellen getestet werden. Als Positivkontrolle diente das
scFv 425-Bla Konstrukt, welches eine scharfe, membranständige Färbung auf A431 Zellen
zeigte. Deutlich waren die Färbung der strahlenartigen Zellfortsätze, sowie die flächige
Färbung der flachen, breiten Zellfortsätze zu erkennen (Abbildung 42, A.). Wie auch bei
zellulären ELISA Experimenten, zeigte das CATwt Enzym wiederum ein deutliches
Hintergrundsignal (Abbildung 42., A.) Das H3-CAT-H3 Konstrukt zeigte ebenfalls ein
membranständiges Signal, was jedoch nicht stärker als das der CATwt Kontrolle ausfiel und
darüber hinaus nicht durch den scFv 425-Bla kompetitierbar war (Abbildung 42, C.), was auf
eine unspezifische, allein durch das CAT-Gerüstprotein vermittelte, Interaktion hinweist. Da
das Peptid des H3-CAT-H3 Konstrukts der CDR H3 des scFv 425 entspricht, sollte man von
einer Verdrängung durch den scFv 425-Bla ausgehen können.
A. B. C.
Abbildung 42.) Konfokale Immunfluoreszenz an A431 Zellen. Das H3-CAT-H3 Konstrukt wurde zum Test auf membranständige Lokalisation auf A431 Zellen inkubiert. A. scFv 425-Bla wurde als Postivikontrolle für die membranständige Lokalisation des Fluoreszenzsignals eingesetzt. B. Die CATwt Negativkontrolle zeigte ein deutliches Hintergrundsignal. C. Die Fluoreszenz des H3-CAT-H3 Konstrukts war zwar membranständig, jedoch in der Intensität nicht stärker als die CATwt Negativkontrolle und zudem nicht durch den scFv 425-Bla inhibierbar.
Ergebnisse
69
5.1.4.3 Biacore
Als alternative Methode zum ELISA wurde mittels Oberflächenplasmonresonanz versucht
eine mögliche Interaktion zwischen dem sEGF-R und dem H3-CAT-H3 nachzuweisen. Es
wurden 3862 RU Rezeptor auf die Oberfläche eines CM-5 Sensorchips gekoppelt, eine
weitere Flusszelle wurde inaktiviert und diente als Referenzflusszelle. Das H3-CAT-H3
Konstrukt wurde seriell mit ansteigenden Konzentrationen (2.45 µM, 4.9 µM, 9.8 µM) bei
einer Flussrate von 30 µl/min über die Sensoroberfläche geführt, wobei die Proben zunächst
über die Referenzflusszelle und anschließend über die sEGF-R gekoppelte Flusszelle
geleitet wurden.
A. B.
Nach Abzug des Signals der Referenzflusszelle von dem Signal der sEGF-R gekoppelten
Flusszelle konnten keine Bindungskurven für die Bestimmung der kinetischen Parameter
erhalten werden (Abbildung 43). Die Signalspitzen zu Beginn und Ende jeder Injektion waren
auf die geringe Datenerfassungsrate zurückzuführen. Die Darstellung der einzelnen
Bindungskurven auf sEGF-R gekoppelter und Referenzflusszelle machte deutlich, dass
keine konzentrationsabhängige Bindungskurve zu erhalten war (Abbildung 44). Unter den
getesteten Bedingungen ließ sich mittels Oberflächenplasmonresonanz keine Interaktion
zwischen dem sEGF-R und H3-CAT-H3 nachweisen.
21000
22000
23000
24000
25000
26000
200 300 400 500 600
RU
Zeit [s]
3520
3530
3540
3550
3560
3570
3580
200 300 400 500 600
RU
Zeit [s]
Abbildung 43) A. Sensogramm des H3-CAT-H3 Konstrukts auf sEGF-R gekoppelter Flusszelle (rote Linie) und Referenzflusszelle (blaue Linie) Kurvenaussschlag war auf beiden Flusszellen praktisch identisch. B. Sensogramm des H3-CAT-H3 Konstrukts auf sEGF-R gekoppelter Oberfläche nach Abzug des Signals der Referenzflusszelle. Es konnten keine konzentrationsabhängingen Bindungskurven festgestellt werden. Das Konstrukt wurde mit steigenden Konzentrationen (2.45 µM, 4.9 µM, 9.8 µM) bei einer Flussrate von 30 µl/min seriell injiziert.
Ergebnisse
70
Abbildung 44.) Überlagerte Sensogramme des H3-CAT-H3 Konstrukts in ansteigenden Konzentrationen auf sEGF-R und Kontrollflusszelle. Nach Abzug der Referenzflusszelle (gestrichelte Linien) konnte kein Bindungssignal erhalten werden.
5.1.5 Diskussion
Das aus der CDR H3 abgeleitete Peptid vermochte weder in ELISA Experimenten, noch in
konfokalen Immunfluoreszenzanalysen, noch in BIAcore Experimenten eine Bindung des
CAT Enzyms an den sEGF-R bzw. an A431 Zellen zu vermitteln. Bemerkenswerterweise war
das Bindungssignal des H3-CAT-H3 Fusionsproteins konstant niedriger als das wechselnd
hohe Hintergrundsignal des CATwt Enzyms, was auf eine Bedeutung der Termini für das
unspezifische Hintergrundsignal hinweist. Aus den Resultaten ließen sich zwei mögliche
Erklärungsansätze ableiten. Einerseits könnte die Affinität des H3 Peptids zu gering sein, um
eine Bindung des Fusionsprotein H3-CAT-H3 an den EGF-R zu vermitteln. Andererseits
könnte die Affinität des H3 Peptids ausreichend sein, würde jedoch durch Rückbindung an
das CAT-Enzym, bedingt durch die Hyrdophobizität des Peptids, an einer Interaktion mit dem
EGF-R gehindert, wobei gleichzeitig Bereiche des CAT Enzyms, die für die unspezifische
Bindung verantwortlich sind abgeschirmt würden. Ein solches Modell könnte erklären, dass
keine Bindung beobachtet werden konnte und gleichzeitig der unspezifische Hintergrund
konstant unter dem Niveau des CATwt Enzyms lag.
Ergebnisse
71
5.2 Der EGF-R Dimerisierungsarm als Inhibitor
5.2.1 Einleitung
Die Liganden induzierte Dimerisierung aller ErbB Familienmitglieder erfolgt im Gegensatz zu
vielen anderen Rezeptor-Tyrosin-Kinasen gänzlich Rezeptor vermittelt (Burgess, Cho et al.
2003). Maßgeblich an den inter-Rezeptor Interaktionen ist dabei die von Ogiso et al. als
Dimerisierungsarm bezeichnete Schleife der Domäne II beteiligt. Dieser Dimerisierungsarm
umfasst die AS 242 bis 259 (PDB ID: 1IVO) und ragt charakteristisch aus der Struktur
hervor. Im aktiven Rezeptordimer interagiert dabei der Dimerisierungsarm der Domäne II
eines Rezeptors mit der Domäne II des anderen Rezeptors. Diese inter-Domäne II
Interaktion wird einerseits durch hydrophobe Wechselwirkungen der AS Y246, P248 und
Y251 des Dimerisierungsarms mit den AS F230*, F263*, A265*, Y275* und R285* der
Domäne II des Interaktionspartners vermittelt, zum anderen sind Wasserstoffbrücken
A.
B.
Abbildung 45.) A. Darstellung der Wasserstoffbrücken und hydrophoben Interaktionen zwischen dem Dimerisierungsarm eines aktiven Rezeptors mit der Domäne II eines aktiven Rezeptor Partners (aus Ogiso et al. 2002). B. Gleiche Darstellung aus verändertem Blickwinkel
Ergebnisse
72
zwischen den Resten Y251•R285*, Q252•A286* und Y246•C283* beteiligt (Abbildung 45).
Die zentrale Bedeutung der AS R285, Y251 und F263 für die Rezeptordimerisierung konnte
durch Aminosäureaustausche (R285S, Y251S, F263A) gezeigt werden. Die
Kombination des R285S Austausches mit entweder dem Y251A oder dem F263A
Austausch führte zu einem fast vollständigen Verlust der Rezeptoraktivität bezüglich der
Rezeptor- und Erk-Phosphorylierung (Ogiso, Ishitani et al. 2002).
Kristallstrukturen des inaktiven EGF-R (Ferguson, Berger et al. 2003) und des nicht
Liganden gebundenen ErbB3 (Cho, Mason et al. 2003) zeigen den Dimerisierungsarm in
einer weiteren für die EGF-R Biologie wichtigen Interaktion. In diesen Strukturen interagiert
der Dimerisierungsarm intra-molekular mit Resten der Domäne IV, wodurch der
Dimerisierungsarm unzugänglich für einen aktiven Dimerisierungspartner verborgen wird.
Die relative Anordnung der Domänen I und II zueinander ist nahezu identisch in der inaktiven
und der aktiven Konformation, die relative Anordnung der Domänen I und III zueinander
unterscheidet sich zwischen beiden Strukturen aber deutlich. Die Distanz der Domänen
unterbindet dabei eine gleichzeitige Interaktion des EGF mit den Domänen I und III in der
inaktiven Konformation.
Diese zentrale Bedeutung des Dimerisierungsarms sowohl in der aktiven, als auch in der
inaktiven Konformation sollte sich als Ansatz zur Entwicklung eines inhibitorischen Peptids
nutzen lassen. Wie bereits für Peptidomimetika der Domäne IV des ErbB2 Rezeptors (Park,
Zhang et al. 2000) gezeigt, sollte ein Peptid abgeleitet werden, das die Dimerisierung zwei
Abbildung 46.) „Stick“ Darstellung des aus dem Dimerisierungsarm abgeleiteten Peptids (EGFR-DA). Wasserstoffbrücken wurden als gestrichelte Linien mit Distanzen [Å] dargestellt. Seitenketten wurden aus Gründen der Übersicht nicht dargestellt (MacPyMOL).
Ergebnisse
73
aktiver EGF-Rezeptoren nach Liganden induzierter Umlagerung in diesem speziellen Fall
durch Blockierung des Dimerisierungsarms verhindern sollte.
Aus der Struktur des aktiven EGF-R Dimers (PDB ID: 1IVO) wurde die Sequenz
MLYNPTTQMDV als Peptid abgeleitet und EGFR-DA benannt (Abbildung 46). Die
Aminosäuren wurden so ausgewählt, dass N- und C-Terminus in entgegengesetzte
Richtungen weisen, um Modifikationen an den Termini zu ermöglichen, ohne die Struktur des
Peptids zu stören. Aufgrund des Prolin induzierten Knicks in der Peptidsequenz und der
ausgeprägten intramolekularen Wasserstoffbrücken sollte das Peptid in Lösung die
dargestellte Konformation annehmen können.
Das EGFR-DA Peptid wurde in zwei Versionen bestellt, zum einen ohne weitere Modifikation
und zum anderen als biotinylierte Variante, um das Peptid entsprechend auf potentiell
inhibierende Wirkung auf A431 Zellen, bzw. eine mögliche Peptid vermittelte Lokalisation
eines Streptavidin : Peptid Komplexes an den EGF-R zu testen, was wiederum durch einen
potentiellen Aviditätseffekt, bedingt durch die tetravalente Präsentation auf dem
Streptavidinkomplex, begünstigt werden sollte.
5.2.2 Ergebnisse
5.2.2.1 Reinigung des biotinylierten EGF-R DA Peptids und anschließende Dekoration des Streptavidin zur Generierung eines Streptavidin : EGF-R DA Targetingkomplexes
Das EGF-R DA Peptid wurde von der Firma Peptidesynthetics zunächst in einer Variante
bestellt, die einen kurzen Glycinlinker zwischen dem N-terminalen Biotin und der
Peptidsequenz enthielt. Das Peptid wurde in H2O rekonstituiert, war jedoch sehr schwer
löslich und wurde nachfolgend zuerst in Azetonitril (ACN) gelöst und anschließend mit H2O
auf 30% ACN eingestellt. Mit einer kleinen Menge des rekonstituierten Peptids wurde ein
erster analytischer Lauf mit einer Reversed Phase HPLC durchgeführt, die einen
charakteristischen Doppelpeak zeigte. Eine Probe des zweiten Peaks wurde zur
Überprüfung massenspektrometrisch untersucht und lieferte ein korrektes Molekulargewicht.
Mit der verbliebenen Probe wurde daraufhin ein präparativer Lauf an der Reversed Phase
HPLC durchgeführt, der jedoch nicht mehr den charakteristischen Doppelpeak zeigte. Nach
weiteren erfolglosen Versuchen wurde eine Probe erneut massenspektrometrisch
untersucht, wobei sich herausstellte, dass das Peptid degradiert war. Untersuchungen
Ergebnisse
74
seitens des Herstellers zeigten eine vollständige Degradation des Peptids innerhalb weniger
Stunden.
Die finale Version des biotinylierten EGF-R DA Peptids enthielt als alternativen Linker eine
Aminohexansäure zwischen Biotin und Peptidsequenz und wies laut Hersteller eine
Halbwertzeit von ca 72 h auf.
Für Bindungsstudien am BIAcore wurde das Peptid zunächst über die Reversed Phase
HPLC gereinigt, anschließend bei 42-fachem Überschuss 1 h bei 4°C mit Streptavidin
inkubiert, um die Bildung eines Streptavidin : EGF-R DA Komplexes zu ermöglichen. Der
gebildete Komplex wurde über eine Gelfiltrationssäule (Superdex 200) von ungebundenen
Peptiden gereinigt, welche sonst bei Bindungsstudien als Kompetitoren wirken würden. Die
Fraktionen 26 – 30 wurden vereinigt und auf 7 µM konzentriert.
Abbildung 47.) Gelfiltration des Streptavidin : EGF-R DA Komplexes mittels Superdex 200 Säule. Fraktionen 26 – 30 wurden vereinigt und konzentriert. Bei den Fraktionen 37 – 39 handelt es sich vermutlich um überschüssiges Peptid.
Ergebnisse
75
5.2.2.2 Oberflächenplasmonresonanz basierter Test auf EGFR-DA vermittelte Bindung an den sEGF-R
Der biotinylierte Dimerisierungsarm (EGFR-DA) wurde für BIAcore Experimente aus
Gründen der leichteren Detektion mit Streptavidin komplexiert, sodass ein Konstrukt mit
einem Molekulargewicht von ca. 58 kDa entstand. Da das Signal der Bindung proportional
zur Masse ist, können sehr kleine Peptide nur mit Schwierigkeiten detektiert werden. Der
Komplex aus EGFR-DA Peptid und Streptavidin wurde bei 7 µM Konzentration injiziert. Das
Signal der sEGF-R belegten Oberfläche zeigte im Maximum 4 RU Differenz zur
Referenzflusszelle (Abbildung 48). Bei einem Größenverhältnis von ca. 1:2 wäre selbst unter
Annahme einer Stöchiometrie von 2 Rezeptormolekülen zu einem Streptavidin-Komplex
noch ein Signal von ca. 836 RU zu erwarten gewesen. Aufgrund der Größe des Komplexes
von 58 kDa konnte bei einem Signal von 4 RU nicht von einer Bindung ausgegangen
werden. Die Funktionalität der sEGF-R Oberfläche konnte durch den natürlichen Liganden
EGF überprüft werden, der ein Signal von 150 RU auf der gekoppelten Oberfläche zeigte,
was 81% aktivem sEGF-R entsprach (Abbildung 23). Auf die Messung einer
Verdünnungsreihe, die erforderlich ist, um eindeutige Aussagen über Spezifität der Bindung
und die kinetischen Parameter der Bindung zu treffen zu können, wurde verzichtet, da schon
bei einer Konzentration von 7 µM keine Bindungskurve erhalten werden konnte.
A. B.
Abbildung 48.) Der EGFR-DA/Streptavidin Komplex zeigte auf sEGF-R gekoppelter Oberfläche kein Bindungssignal am BIAcore Instrument. A. Normalisierte Signale des Strep:EGFR-DA Komplexes auf Referenz und sEGF-R gekoppelter FZ. Rot = Referenzflusszelle, schwarz = sEGF-R gekoppelte FZ. B. Nach Abzug des Signals der Referenzflusszelle verblieben 4 RU, wobei die Kurve in den negativen Bereich abfiel.
-40
-20
0
20
40
60
80
0 50 100 150
RU
Zeit [s]
-30
-20
-10
0
10
20
30
0 50 100 150
RU
Zeit [s]
Ergebnisse
76
Ferner wurde das unmodifizierte EGFR-DA Peptid bei 273 µM Konzentration getestet. Nach
Abzug der Referenzflusszelle verblieb ein residuales Signal von 6 RU. Unter der Annahme
einer 1:1 Stöchiometrie der Bindung wäre bei einem Größenverhältnis von 1:77 (sEGF-R :
115 kDa, EGFR-DA : 1.5 kDa) ein Signal von maximal 45 RU zu erwarten gewesen. Das
gemessene Signal von 6 RU ließe sich unter der Annahme von ca. 13 % aktivem
(bindungskompetenten) Rezeptor erklären. Da die Messung aber auf derselben Oberfläche
mit 81%iger Aktivität durchgeführt wurde, wie auch schon der EGFR-DA Streptavidin
A.
B.
Abbildung 49.) A. Sensogramm des EGFR-DA Peptids auf sEGF-R gekoppelter (rote Kurve) und Referenzflusszelle (blaue Kurve). Werte beider Flusszellen wurden jeweils auf Referenzlinie normalisiert. B. Differenz zwischen sEGF-R gekoppelter und Referenzflusszelle ergab ein Signal von 6 RU. Bei 100 % bindungskompetentem Rezeptor wären maximal 50 RU zu erwarten gewesen.
-20
0
20
40
60
80
100
200 210 220 230 240 250 260
RU
Zeit [s]
-40
-20
0
20
40
200 210 220 230 240 250 260
RU
Zeit [s]
Ergebnisse
77
Komplex, scheidet diese Möglichkeit aus. Weitere Messungen mit ansteigenden
Konzentrationen hätten Aufschluss über eine Mögliche Bindung und kinetische Parameter
liefern können, konnten jedoch aufgrund der schlechten Löslichkeit nicht durchgeführt
werden. Zusammen mit dem Ergebnis des EGFR-DA : Streptavidin Komplexes konnte daher
nicht von einer eindeutigen Bindung des EGFR-DA Peptids an den sEGF-R ausgegangen
werden.
5.2.2.3 FACS basierter Test auf EGFR-DA vermittelte Lokalisierung von EGFR-DA : NeutrAvidin Oregon Green 488 Komplexen auf A431 Zellen
Mithilfe der Durchflusszytometrie wurde eine peptidvermittelte Bindung des NeutrAvidin
Oregon Green 448 : EGFR-DA Konstrukts an A431 Zellen untersucht. Als Negativkontrolle
wurde NeutrAvidin Oregon Green 488 mit Biotin, als Positivkontrolle dagegen mit
biotinyliertem EGF dekoriert. Die Negativkontrolle zeigte ein sehr geringes Hintergrundsignal,
welches von ungefärbten Zellen kaum zu unterscheiden war (Abbildung 50). Wie aufgrund der
Vorversuche zu erwarten war, zeigte das EGF dekorierte NeutrAvidin Oregon Green 488 auf
A431 Zellen eine sehr deutliche Fluoreszenz (Abbildung 50, zweites Diagramm v.l.), womit
sich die Handhabung der Zellen bei der Vereinzelung und die Färbeprozedur als sehr
konsistent herausstellte. Jedoch gelang es nicht für das EGFR-DA dekorierte Konstrukt eine
Fluoreszenz nachzuweisen. Eine Überlagerung der Fluoreszenzsignale der Biotin-Kontrolle
und des EGFR-DA Komplexes zeigte keine Differenz (Abbildung 50, erstes Diagramm v.r.).
Abbildung 50.) FACS Analyse der EGF-R DA vermittelten Bindung des NeutrAvidin Oregon Green 488 : EGFR-DA Komplexes an A431 Zellen. A431 Zellen wurden vereinzelt, gewaschen und 30´ bei 4°C inkubiert. Ungebundene Komplexe wurden durch zwei Waschschritte entfernt. Die Negativkontrolle (NeutrAvidin 488 + Biotin) zeigte kein Hintergrundsignal, die Positivkontrolle (NeutrAvidin 488 + EGF) zeigte eine deutliche Fluoreszenz. Für den EGFR-DA konnte kein Fluoreszenzsignal nachgewiesen werden. Eine Überlagerung der Negativkontrolle und des EGFR-DA zeigte, dass beide Signale nahezu identisch waren. Die Skalierung des NeutrAvidin 488 + EGF Diagramms unterscheidet sich von den übrigen Diagrammen.
Ergebnisse
78
5.2.2.4 EGFR-DA vermittelte Inhibition des Wundverschlusses bei A431 Zellen
Der EGFR-DA sollte konzeptionell primär als Inhibitor der Rezeptoraktivierung dienen, die
zelluläre Signalkaskaden initiiert, die wiederum Proliferation, Anti-Apoptose und Migration
stimulieren. Diese Parameter lassen sich in Wundheilungsexperimenten abgreifen, da bei
einer Aktivierung der Zellen ein beschleunigter Wundverschluss des verletzten Zellrasens
beobachtet werden kann. Für Wundheilungsexperimente wurde das EGFR-DA Peptid ohne
Modifikationen eingesetzt (Peptidsequenz: MLYNPTTYQMDV). A431 Zellen wurden in 6-
Lochplatten bis zum Erreichen der Konfluenz in Vollmedium kultiviert und anschließend für
24 h in Minimalmedium überführt, um die Zellen von jeglichen Wachstumsfaktoren zu
depletieren. Unter Zuhilfenahme einer 1000 µl Pipettenspitze wurde eine strichförmige
Läsion in den konfluenten Zellrasen eingeführt und abgelöste Zellen anschließend durch
intensives waschen mit Minimalmedium entfernt. Die Zellen wurden sodann mit den in
Minimalmedium formulierten Peptiden inkubiert. Die Dokumentation der Wundschließung
erfolge durchlichtmikroskopisch sofort und nach 45 h (Abbildung 51, A.). Die zellfreie Fläche
wurde im Programm ImageJ unter Verwendung eines Makros in Pixel gemessen. Aus der
Differenz der jeweiligen zellfreien Fläche nach 45 h und 0 h wurde die neu besiedelte Fläche
nach Stimulation als Maß der Zellaktivierung kalkuliert. Wie zu erwarten zeigten EGF
stimulierte Zellen mit einem Wundverschluss von 193528 Pixeln die stärkste Aktivierung
(Abbildung 51, B.). Aufgrund der intrinsischen, EGF unabhängigen Proliferation von A431
Zellen war bei der Mediumkontrolle ein Wundverschluss von 118980 Pixeln zu beobachten,
was 61.5 % der Fläche EGF stimulierter Zellen entsprach. Der EGFR-DA induzierte mit
58364 Pixeln den geringsten Wundverschluss, was 30 % der Fläche EGF induzierter Zellen
entsprach und gleichzeitig um den Faktor 2 geringer war als die Mediumkontrolle. Bei
Koinkubation von EGFR-DA und EGF konnte ein um 54779 Pixel geringerer
Wundverschluss verglichen mit dem EGF induzierten Wundverschluss beobachtet werden,
was einer Inhibition um 28.3 % entsprach. Der absolute Wert des Wundverschlusses lag mit
138749 Pixeln nahe an der Mediumkontrolle und übertraf diese nur um 19769 Pixel.
Ergebnisse
79
A.
B.
Abbildung 51.) Wundheilungsexperiment an konfluenten A431 Zellen. A. Mittels 1000 µl Pipettenspitze wurde eine Läsion in den Zellrasen eingeführt. Peptide wurden in angegebenen Konzentrationen in Minimalmedium formuliert zu den Zellen gegeben. Zellfreie Fläche wurde sofort und 45 h nach Stimulation unter Verwendung des Programms ImageJ analysiert. B. Differenz der zellfreien Fläche wurde als Maß für die Aktivierung gewertet. Stärkster Wundverschluss mit 193528 Pixel war bei EGF inkubierten Zellen zu sehen. Die Mediumkontrolle zeigte einen auf 60 % reduzierten Wundverschluss verglichen mit EGF behandelten Zellen. Durch Koinkubation von EGF mit dem EGFR-DA konnte die stimulierende Wirkung des EGF deutlich reduziert werden und betrug nur 10.2 % mehr als die Mediumkontrolle. Das EGFR-DA Peptid alleine reduzierte den Wundverschluss auf 30 % des Wertes für EGF.
193528
58364
138749118980
0
50000
100000
150000
200000
EGF EGFR-DA EGFR-DA + EGF Mediumkontrolle
Wu
nd
vers
ch
luss [
Pix
el]
Ergebnisse
80
5.2.3 Diskussion
Das Streptavidin : Dimerisierungsarm Konstrukt wurde mittels Oberflächenplasmonresonanz
auf Interaktion mit dem EGF-R getestet. Es konnte jedoch bei steigenden Konzentrationen
von 1.75 µM bis 7 µM keine Interaktion mit dem sEGF-R festgestellt werden. Bei einem
Molekulargewicht von ca 58 kDa für das Streptavidin Konstrukt sollte eine größenbedingte
Nachweislimitierung ausgeschlossen werden können, da unter der Annahme einer 1:1
Stöchiometrie des EGF-R zu Konstrukt Bindungsverhältnisses bei 3495.2 RU gekoppeltem
Rezeptor ein Signal von 1672 RU zu erwarten gewesen wäre. Das maximale Signal von 4
RU, welches zudem keinen charakteristischen Bindungsverlauf zeigte, war nicht indikativ für
eine peptidvermittelte Bindung.
Zusätzlich wurde das unmodifizierte EGFR-DA Peptid bei hoher Konzentration gemessen
(273 µM), um die Möglichkeit eines negativen Einflusses des Streptavidin auf die Faltung
des biotinylierten Peptids als Ursache für die nicht nachweisbare Bindung auszuschließen.
Das gemessene Signal von 6 RU entsprach jedoch ebenfalls nicht dem zu erwartenden Wert
von ca. 45 RU. Diese Messung kann jedoch durch das ungünstige Größenverhältnis von
gekoppeltem Rezeptor (115 kDa) zu Peptid (1.5 kDa) bedingt nicht als eindeutig negativ
gewertet werden. Abhilfe hätte hier ein reverser Ansatz schaffen können, bei dem das Peptid
auf eine Streptavidin Oberfläche gekoppelt wird und der lösliche EGF-R gemessen wird.
Aufgrund eingeschränkter sEGF-R Resourcen konnte dieses Experiment jedoch zum
damaligen Zeitpunkt nicht durchgeführt werden.
Mittels BIAcore Experimenten konnten keine eindeutige Bindung des EGFR-DA Peptids
nachgewiesen werden.
Als zellbasierte Methode zum Nachweis einer Interaktion mit dem EGF-R wurde die
Durchflusszytometrie angewandt. Für den EGFR-DA:NeutrAvidin488 Komplex konnte keine
Bindung an A431 Zellen festgestellt werden, während für die Positivkontrolle
EGF:NeutrAvidin488 ein sehr starkes Fluoreszenzsignal zu verzeichnen war. Die niedrige
Inkubationstemperatur von 4°C könnte sich nachteilig auf eine Bindung auswirken, wurde
aber gewählt, um eine Internalisierung des Komplexes auf den unfixierten Zellen zu
vermeiden. Gleichwohl konnte bei den Messungen am BIAcore bei 20°C ebenfalls keine
Bindung festgestellt werden, sodass dieser Einfluss der Temperatur nicht plausibel erschien.
Die Wirkung des EGFR-DA auf zentrale zelluläre Prozesse, wie Proliferation,
Migration und Anti-Apoptose wurde in einem Wundheilungsexperiment getestet. Der EGF-R
DA könnte eine leicht inhibierende Wirkung auf A431 Zellen ausüben, was sich in einer
Wundschließung äußerte, die sogar um den Faktor 2 unter der Mediumkontrolle lag
(Abbildung 51). Bei Ko-Inkubation von EGFR-DA und EGF resultierte in einer deutlich
verminderten Aktivierung der Zellen verglichen mit EGF behandelten Zellen um 28% auf
Ergebnisse
81
etwa das Niveau der Mediumkontrolle entsprach. Die Wirkung des Dimerisierungsarms
könnte daher bei EGF induzierter Umlagerung und daraus resultierender Exponierung des
DA eintreten. Der aktivierte Rezeptor mit exponiertem, bindungskompetenten
Dimerisierungsarm könnte nach nun erfolgender Bindung des EGFR-DA Peptids nicht mehr
mit einem zweiten aktiven Rezeptor interagieren, wodurch die EGF induzierte Proliferation
unterdrückt würde. Ein solches Modell unterstützend konnte bei Koinkubation von EGF und
EGFR-DA (10-facher Überschuss an EGFR-DA) die aktivierende Wirkung des EGF etwa auf
das Maß der intrinsischen Proliferationsrate reduziert werden. Ein Effekt des EGFR-DA
würde folglich nur bei EGF induzierter Aktivierung und dadurch bedingter
Rezeptorumlagerung eintreten. Mit diesem Modell wären auch die Ergebnisse aus den
Interaktionsstudien mit immobilisiertem Rezeptor konform, unter der Annahme, dass der
Rezeptor zu ca. 90% in der autoinhibierten Konformation vorliegt und somit nicht mit dem
EGFR-DA interagieren könnte. Solche Bedingungen könnten in ELISA und BIAcore
Experimenten zutreffend sein. Mithilfe der Durchflusszytometrie an unfixierten A431 Zellen
konnte keine Bindung des EGF-R DA : NeutrAvidin Oregon Green 488 Konstrukts
festgestellt werden, jedoch wurde nicht mit EGF ko-inkubiert. Um eine eindeutige Aussage
über den Wirkmechanismus des EGF-R Dimerisierungsarms treffen zu können, wären
weitere Experimente notwendig. Zunächst müssten die Wundheilungsexperimente
wiederholt werden, um die Reproduzierbarkeit des gezeigten Ergebnisses zu dokumentieren.
3D Softagar Matrix Experimente mit A431 und wichtiger noch anderen, EGF abhängigen
Zelllinien wären die Methode der Wahl, um den postulierten Wirkmechanismus des EGF-R
DA Peptids zu untersuchen.
Ergebnisse
82
6 Ergänzendes Kapitel, Computer gestützte Simulation
6.1 Einleitung
In Ermangelung einer Kristallstruktur des mAk 425:EGF-R Komplexes war es nicht möglich
potentielle Bindungsstellen für die abgeleiteten Peptide zu identifizieren. Eine Eingrenzung
auf mögliche Epitope, die von den Peptiden erkannt werden könnten, wurde die
computergestützter Vorhersage molekularer Komplexe (molekulares Docking) angewandt.
Die gewonnenen Erkenntnisse sollten es zukünftig ermöglichen, die experimentell
identifizierten Peptide so zu verändern, dass eine optimale Passgenauigkeit in der
Bindetasche erreicht werden kann. Zunächst jedoch wurde das Programm AutoDock 4
(http://autodock.scripps.edu/) angewendet, um die biochemischen und biophysikalischen
Bindungsstudien um rechnerische Erklärungsmodelle zu erweitern.
Einleitend ist zu sagen, dass molekulares Docking nicht die hohe Präzision der Algorithmen
der molekularen Dynamik aufweist, sich jedoch viele mögliche Interaktionspaare in
überschaubarer Zeit testen lassen. Dagegen lässt die exaktere molekulare Dynamik die
Analyse nur weniger Interaktionspaare in vertretbarem zeitlichen Rahmen zu.
AutoDock wurde bereits erfolgreich eingesetzt, um unbekannte Bindungsstellen zu
identifizieren, diese Vorgehensweise wurde als „Blind Docking“ bezeichnet (Hetenyi und van
der Spoel 2002). In diesen Studien wurden jedoch maximal drei Aminosäuren umfassende
Peptide gerechnet, wobei die Größe der Zielproteine mit ca. 250 AS etwa einer Domäne des
EGF-R entsprach.
AutoDock4 (Morris, Goodsell et al. 1998) setzt auf den Lamarck´schen genetischen
Algorithmus (LGA) kombiniert mit Empirischer Funktion der freien Energie, um
Interaktionspaare zu berechnen. Die empirische Funktion der freien Energie wurde anhand
eines Satzes von 30 Protein-Liganden Paaren mit bekannten Kristallstrukturen optimiert.
Ergebnisse
83
6.2 Ergebnisse
Die Koordinaten des aktiven EGF-R Moleküls (PDB-ID: 1IVO) wurden für die Berechnungen
in zwei Domänen unterteilt. Das Docking an die gesamte Rezeptorstruktur hätte
Gridabstände von > 1 Å bedingt, wodurch die Genauigkeit der Berechnung kompromittiert
worden wäre. Durch die Aufteilung in zwei Domänen konnte der Gridabstand auf 0.6 Å
reduziert werden, was für die Berechnung von Liganden-Rezeptor Bindestellen hinreichende
Genauigkeit liefern sollte (Hetenyi und van der Spoel 2002). Geringere Gridabstände wirken
sich zwar positiv auf die Genauigkeit der Berechnung aus, erhöhen aber den Speicherbedarf
invers zur dritten Potenz des Gridabstandes (Hetenyi, Kortvelyesi et al. 2002).
Das Docking wurde in der Regel unter Verwendung folgender Parameter durchgeführt (ca.
35 h Prozessorzeit): Rezeptor = vollständig rigide, Peptid vollständig flexibel, ga_run = 50
(Anzahl individueller Docking Versuche), ga_pop_size = 300 (Anzahl an Individuen in jeder
Generation), ga_num_evals = 25×106 (maximale Anzahl an Energiekalkulationen
insgesamt), ga_num_generations = 2000 (maximale Anzahl an Generationen insgesamt),
sw_max_its = 300 (Anzahl an Solis & Wets Iterationen, lokale Suche), ls_search_freq =
0.06 (Wahrscheinlichkeit für die Durchführung einer lokalen Solis & Wets Suche je
Individuum; für sw_max_its = 300 6 % von 300 Individuen oder, 18 Individuen,
durchlaufen eine lokale Suche). Das Docking bricht bei Erreichen der maximalen Anzahl an
Energiekalkulationen (ga_num_evals) bzw. der maximalen Anzahl an Generationen ab, je
nachdem welcher Wert früher erreicht wird. Hetenyi et al. konnten zeigen, dass die
Genauigkeit der Docking-Ergebnisse bei einer ga_pop_size = 300 ein Plateau erreichte
(Hetenyi und van der Spoel 2002), bei höheren Werten nahm die Anzahl der zur Verfügung
stehenden Kalkulationen pro Individuum ab, sodaß die Wahrscheinlichkeit das
Energieminimum finden zu können abnahm.
Die Docking-Ergebnisse wurden hinsichtlich zweier Kriterien ausgewertet, zum einen wurde
die beste gefundene Konformation mit niedrigster freier Energie der Bindung auf sinnvolle
Interaktionen untersucht, zum anderen wurde das am stärksten bevölkerte Cluster, bei einer
rmsd Toleranz von 12 Å, mit niedrigster freier Energie der Bindung auf Konformationen, die
stimmige Interaktionen zeigten untersucht.
Die beste Konformation aus dem Docking an die Domäne I der EGF-R Struktur wies eine
schwache freie Energie der Bindung von -3.12 kcal/mol auf. Zwei potentielle
Wasserstoffbrückenbindungen konnten zwischen Peptidbackbone und Glu181 des
Rezeptors, sowie dem Met des Peptids und dem Asp167 des Rezeptors mittels
AutodockTools identifiziert werden. Die potentielle Bindestelle war weder mit der EGF-
Kontaktfläche, noch mit der Kontaktfläche zur Domäne III überlappend. Eine Analyse der
Log-Datei zeigte, dass alle 50 Dockingversuche durch Erreichen der maximalen Anzahl an
Ergebnisse
84
Generationen (ga_num_generations = 2000) terminiert wurden, während die Anzahl der
Energiekalkulationen mit 6 - 7×106 konstant um den Faktor 3.8 unter dem erlaubten Wert lag
(ga_num_evals = 25×106). Zudem erschienen 50 Dockingversuche für die große Oberfläche
der EGF-R Domänen zu niedrig angesetzt.
Unter optimierten Parametern (ga_num_generations = 27000, ga_run = 250) wurde das
Docking wiederholt, konnte aber nicht erfolgreich beendet werden, da das
System nach ca. 2-wöchiger Berechnung wegen Überhitzung ausfiel. In einem weiteren
Versuch wurde nur die Anzahl unabhängiger Dockings (ga_run) auf 250 eingestellt. Die
benötigte Prozessorzeit belief sich auf 134 h. Die Konformation mit der niedrigsten freien
Energie der Bindung wies einen Wert von -4.47 kcal/mol auf, vier weitere Konformationen mit
Bindungsenergien von -3.29 kcal/mol bis -3.71 kcal/mol konnten mit diesen Parametern
gefunden werden, die in der vorherigen Berechnung nicht vorhanden waren. Mit insgesamt
17 Konformationen, die Bindungsenergien besser als -2 kcal/mol aufwiesen, konnten im
Vergleich zum Dockingexperiment mit ga_run = 50 (1 Konformation mit Bindungsenergie
besser als -2 kcal/mol) deutlich bessere Ergebnisse erzielt werden (Abbildung 52). Abbildung
52 zeigt Konformationen, die mit einer rms Toleranz von 12.0 Å zu Clustern mit gleichen
Bindungsenergien zusammengefasst wurden. Idealerweise sollten die am stärksten
bevölkerten Cluster zur niedrigsten Bindungsenergie hin konvergieren, sodass letztendlich
nur ein Cluster verbleibt. Bei ga_run = 50 dominierte ein Cluster mit 8 Individuen bei ca. -1
A. ga_run = 50 B. ga_run = 250
Abbildung 52) Cluster-Analyse aller gerechneten Konformationen bei 12 Å rms-Toleranz. A. Bei ga_run = 50 wies die beste gerechnete Konformation eine freie Energie der Bindung von -3.12 kcal/mol auf. B. Bei ga_run = 250 lag die freie Energie der Bindung der besten gerechneten Konformation bei -4.47 kcal/mol. Das am stärksten bevölkerte Cluster wies zudem eine 1 kcal/mol niedrigere freie Energie der Bindung im Vergleich zur Berechnung mit ga_run = 50 auf.
Ergebnisse
85
kcal/mol (Abbildung 52, A.). Die Analyse der gedockten Konformationen dieses Clusters
zeigte jedoch nur Peptidstrukturen, die in gestreckter Konformation vorlagen und nur mit dem
N-terminalen Met Interaktionen mit dem Rezeptor eingingen und wurden daher nicht als
erfolgreiche Dockingversuche gewertet. Die Clusteranalyse des Dockings mit ga_run = 250
(Abbildung 52, B.) zeigte eine deutliche Konvergenz zu niedrigeren Bindungsenergien, da
einerseits die Konformation mit niedrigster Bindungsenergie einen 1.35 kcal/mol niedrigeren
Wert verzeichnete als die beste Konformation bei ga_run = 50 (-4.47 kcal/mol vs. -3.12
kcal/mol), und andererseits das am stärksten bevölkerte Cluster eine um ca. 1 kcal/mol
niedrigere Bindungsenergie aufwies als bei ga_run = 50. Zunächst wurde die Konformation
mit der niedrigsten berechneten Bindungsenergie des Dockings mit ga_run = 250 analysiert.
Unmittelbar auffällig war die direkte räumliche Nähe der berechneten Bindestelle des
MASSHIFTF Peptids zur EGF-Kontaktfläche (Abbildung 53, A.). Die weitere Analyse der
berechneten Peptid-Rezeptor Interaktion zeigte 5 potentielle Wasserstoffbrückenbindungen
zwischen den Seitenketten der AS Glu21R, Gln28R und Asp51R des EGF-R und den
Seitenketten Thr9, His6, dem Stickstoff der Peptidbindung zwischen den AS Met und Ala und
dem N-terminalen Stickstoff des Met. Die Distanzen zwischen den Interaktionspaaren
(Met:Glu21R, His:Glu21R, His:Gln28R, Thr:Asp51R) liegen im Bereich zwischen 2.06 Å und
2.34 Å (Abbildung 53, B.). Weiterhin wurde eine mögliche hydrophobe Interaktion
ausgemacht, in die die Seitenkette des Phe7 des Peptids und die Seitenketten der AS Phe24
und Tyr50 des EGF-R involviert sein könnten, wobei die hydrophoben AS Phe24 und Tyr50
den hydrophoben Boden einer Spalte bilden, in welche die Seitenkette Phe7 hineinragt
(Abbildung 53, C.). Die Orientierung der AS Phe7 und Tyr50 zueinander konnte als
annähernd parallel betrachtet werden, während Phe7 fast im Winkel von 90° aber leicht
versetzt zu Phe24 war.
Ergebnisse
86
A.
B.
C.
Abbildung 53) Autodock4 Programm wurde verwendet, um potentielle Bindungsstellen für das Peptid MASSHIFTF auf der EGF-R Oberfläche zu identifizieren. A. Berechnete Bindungsstelle des MASSHIFTF Peptids am EGF-R liegt in unmittelbarer räumlicher Nähe zur EGF Bindestelle, die Reste der Domäne I und III umfasst. EGF-R: graue „Cartoon“ Darstellung, EGF: goldfarben dargestellt, MASSHIFT Peptid: rot dargestellt. B. Darstellung der fünf potentiellen Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Peptid und EGF-R. Oberfläche des EGF-R und die beteiligten Seitenketten wurden grau dargestellt. „Stick“ Darstellung des Peptids. C. Potentielle, hydrophobe Interaktion der Phenylalaninseitenkette des Peptids mit Phe24
R und Tyr50
R des EGF-R.
Ergebnisse
87
6.3 Diskussion
Die beste gedockte Konformation des Peptids MASSHIFTF an die Domäne I des EGF-R mit
niedrigster freier Energie der Bindung (-4.47 kcal/mol) zeigte das gebundene Peptid in
unmittelbarer räumlicher Nähe zum EGF. Der parentale Antikörper mAK 425 zeigte in
Versuchen EGF-ähnliche aktivierende Eigenschaften und kompetitierte mit EGF um die
Bindung (Rodeck, Herlyn et al. 1987; Rodeck, Williams et al. 1990). Die Bindestelle des
gedockten Peptids, das aus der CDR L3 des mAK 425 stammt, wäre in Übereinstimmung mit
diesen Beobachtungen, da der vollständige Antikörper analog zum natürlichen Liganden die
Domänen I und III, durch Überspannen der EGF-Bindespalte, in der aktiven
Rezeptorkonformation halten könnte. Dies stünde einerseits mit der beobachteten
aktivierenden Eigenschaft des Antikörpers und andererseits mit der Kompetition mit EGF in
Einklang.
Zusätzlich zeigte diese Konformation die His Seitenkette des Peptids in zwei bedeutenden
Wasserstoffbrückenbindungen mit den Seitenketten der AS Glu21R und Gln28R des EGF-R.
Diese Involvierung des His in der Peptid-Rezeptor Interaktion wurde nur in dieser
Konformation gefunden, die gleichzeitig die energetisch günstigste war, was die Bedeutung
der AS His, wie sie schon in der Phage Display basierten Selektion (4.2.2.2) diskutiert wurde
unterstützte. Zwei Beobachtungen wiesen dort auf eine mögliche Bedeutung des His hin: 1.)
zeigte die Struktur des mAK 425 das His in einer deutlich exponierten Orientierung, sodass
die Seitenkette mutmaßlich stark in die Kontaktfläche zwischen Antikörper und Rezeptor
hineinragt (Abbildung 9). 2.) zeigten die selektierten Sequenzen mit His beginnendeTripeptid
Motive mit guten Homologie Werten (4.2.2.2).
Die berechnete freie Energie der Bindung von -4.47 kcal/mol war zwar recht niedrig im
Vergleich zu hoch affinen Interaktionen (Strep-Biot, 17 kcal/mol (PDB-ID: 1STP) (Weber,
Ohlendorf et al. 1989), lag jedoch in einer Größenordnung, die auch für andere niedrig affine
Interaktionen gefunden wurde (Strep-Peptid, 5.3 kcal/mol (PDB-ID: 1PTS) (Weber,
Pantoliano et al. 1992); ABL-SH3-Peptidligand Interaktion 8 kcal/mol (PDB-ID: 1BBZ)
(Pisabarro, Serrano et al. 1998). Diese geringe Bindungsenergie stünde auch in
Übereinstimmung mit den experimentellen Ergebnissen, die vermutlich aufgrund geringer
Affinität in Abhängigkeit des Experimenttyps keine eindeutige Bindung an den EGF-R zeigen
konnten (4.3.3).
Das Docking konnte folglich Bindestelle und Interaktionsmodi errechnen, die mit den
experimentellen Beobachtungen gut in Einklang zu bringen waren, andererseits zeigen die
Clusteranalysen, daß die berechnete Konformation nicht als ausreichend zuverlässig
angesehen werden kann, da sie zwar die niedrigste Bindungsenergie aufwies, nicht aber die
am stärksten bevölkerte Population darstellte.
Ergebnisse
88
Die Konvergenz der stärksten bevölkerten Cluster zu niedrigerer Bindungsenergie hin bei
Erhöhung des ga_run Wertes von 50 auf 250 zeigte, daß die Parameter noch höher
anzusetzen wären, um ein zuverlässigeres Docking zu erhalten. Aufgrund der großen
Oberfläche des EGF-R und der damit einhergehenden Vielfalt an möglichen Bindestellen,
müßte der ga_run Wert vermutlich im vierstelligen Bereich liegen. Ein 10-fach höherer
ga_run Wert würde jedoch auch die Prozessorzeit um den Faktor 10 auf 1340 h erhöhen, da
ein linearer Zusammenhang zwischen benötigter Rechenzeit und dem ga_run Wert besteht.
Die Erhöhung des ga_num_generations Wertes auf 27000 bei ga_run = 250 resultierte in
einem Überlastungsbedingten Abbruch des Dockings nach 2 Wochen Rechenzeit. Diese
Zahlen machen deutlich, dass eine Anhebung beider Parameter (ga_run &
ga_num_generations) die Berechnung nicht mehr in überschaubarem zeitlichen Rahmen auf
einem Einzelplatzsystem durchzuführen zuließ.
Hetenyi et al. konnten mittels Autodock in Blinddocking Versuchen die Konformationen aus
den Kristallstrukturen der untersuchten Protein-Liganden Paare zuverlässig rechnen,
verwendeten dafür aber maximal Tripeptide, wodurch der Rechenaufwand durch die
geringere Anzahl an möglichen Torsionen gegenüber dem hier zu berechnenden Nonapeptid
deutlich reduziert wurde.
In einer jüngst publizierten Arbeit aus der Gruppe von K.M. Ferguson wurde die
Kristallstruktur des Fab-Fragments des auf dem mAk425 basierenden humanisierten
Antikörpers EMD 72000 beschrieben (Schmiedel, Blaukat et al. 2008). Die Struktur zeigte,
dass das Epitop des Fab-Fragments in der Domäne III liegt und dort mit der EGF Bindestelle
überlappt. Diese Ergebnisse stehen in scheinbarem Widerspruch zu den Ergebnissen der
Berechnungen für das SSHIFTF Peptid, es gilt jedoch anzumerken, dass das vollständig
flexibel gerechnete Peptid einen vom Fab-Fragment unterschiedlichen Bindungsmodus
aufweist. Der Histidinrest der CDR L3 zeigte in dieser Struktur, wie schon durch unsere
Berechnungen vermutet, zwei wichtige, Spezifität vermittelnde
Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Rezeptor. Weiter folgern die Autoren, dass keine der
CDR-Schleifen einen dominanten Beitrag zur Bindung leistet, sondern dieser über alle CDR-
Schleifen verteilt ist, was für Antikörper-Antigen Interaktionen wenig verbreitet ist. Diese
Beobachtung könnte die Schwierigkeiten, ein ausreichend affines Peptid aus den CDR-
Schleifen zu isolieren, erklären
Material & Methoden
89
7 Material & Methoden
7.1 Methoden
7.1.1 Zellkultur
7.1.1.1 Anzucht von A431 Kulturen
Aliquots in flüssigem Stickstoff gelagerter A431 Zellen wurden im 37°C Wasserbad
angetaut, durch Zugabe von 10 ml PBS vollständig aufgetaut und darin resuspendiert. Nach
Zentrifugation (1000 x g, 3 min., RT) wurde der Überstand verworfen, die Zellen in 4 ml
Vollmedium resuspendiert und in 25 cm² Gewebekulturflaschen überführt. Zellen wurden bei
37°C unter 5 % CO2 Atmosphäre kultiviert. Für die Reinigung des sEGF-R wurde bei
erreichen der Konfluenz gesplittet und sukzessive auf 175 cm² Gewebekulturflaschen
überführt. Bei beabsichtigter Verwendung für Stimulationsversuche, wurde bei Erreichen von
ca. 15 Zellen je Zellverband im Verhältnis 1:10 gesplittet, um die Zellen synchron im
Zellzyklus zu halten.
Vollmedium: DMEM, 10 % v/v FKS, 1 % v/v Glutamin, 1 % v/v Penicillin/Streptomycin
PBS: 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, pH 7.5
7.1.1.2 Ruhigstellung von Zellen
Vor allen zellulären Experimenten wurden die A431 Zellen von jeglichen
Wachstumsfaktoren depletiert und ruhiggestellt. Vollmedium wurde abgenommen, die Zellen
zweimal mit Minimalmedium gewaschen und für 24 h bei 37°C, 5% CO2 in Minimalmedium
inkubiert.
Minimalmedium: DMEM, 1% v/v Pen/Strep, 1% v/v HEPES (1 M), 1% v/v Hydrocortison, 1% v/v ITS, 1% v/v BSA
Material & Methoden
90
7.1.1.3 Passagieren von A431 Kulturen für die Isolierung des löslichen sEGF-R aus Zellkulturüberstand
Frisch angesetzte A431 Zellen wurden bei Erreichen der Konfluenz sukkzessive von
25 cm2 auf 175 cm2 Gewebekulturflaschen unter schrittweiser Erhöhung des Anteils an
Minimalmedium (1/3 1/2 2/3 Volumenanteile) überführt. Zellkulturüberstand konfluenter
A431 Zellen in 175 cm² Gewebekulturschalen wurde abgenommen, die Zellen 2 × 10 ml PBS
gewaschen und durch ca. 10-minütige Inkubation (2 ml, 5 × Trypsin, 37°C, 5% CO2)
abgelöst. Die vereinzelten Zellen wurden in 10 ml Vollmedium aufgenommen und für 3 min
bei 1000 × g pelletiert. Zellen wurden in 10 ml Vollmedium resuspendiert und zur weiteren
Expansion auf 4 × 175 cm² Gewebekulturflaschen aufgeteilt. Nach erreichen der maximalen
Anzahl zu führender Gewebekulturflaschen wurde im Verhältnis 1:4 gesplittet. Der
Zellkulturüberstand wurde jeweils abgenommen, zentrifugiert (4°C, 30 min, 5000 UPM,
Heraeus Varifuge 3.0), auf final 1 mM EDTA eingestellt, in flüssigem Stickstoff eingefroren
und bis zur weiteren Reinigung in 50 ml Aliquots bei -80°C gelagert.
5× Trypsin/EDTA: 0.25% Trypsin, 0.5 M EDTA, PBS Vollmedium: DMEM: 10 % v/v FKS, 1 % v/v Glutamin, 1 % v/v Penicillin/Streptomycin Minimalmedium: DMEM, 1% v/v Pen/Strep, 1% v/v HEPES (1 M), 1% v/v Hydrocortison,
1% v/v ITS, 1% v/v BSA PBS: 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, pH 7.5
7.1.1.4 Reinigung des sEGF-R aus Zellkulturüberstand
Die sekretierte Spleißvariante des EGF-R (Weber, Gill et al. 1984) wurde durch
Affinitätschromatographie aus dem Überstand serumfrei kultivierter A431 Zellen isoliert (Gill
und Weber 1987). Eine Affinitätsmatrix wurde für die Einschrittreinigung verwendet,
basierend auf einem EGF-R spezifischen scFv 425 Tandem-CBD (Chitin-bindende Domäne)
Fusionskonstrukt (scFv 425-CBD-CBD) und einer Chitin-Säulenmatrix (Chitin Beads, Sigma).
Das scFv 425-CBD-CBD Konstrukt wurde in RV308 exprimiert, die Zellen sedimentiert und
bis zur weiteren Verwendung bei -80°C gelagert. Bei Bedarf wurde das Zellpellet in 20 ml
Zellaufschlusspuffer resuspendiert und durch Sonifizierung aufgeschlossen. Zelldebris wurde
durch Zentrifugation (4°C, 43.000 x g, 45 min) und weitere partikuläre Verunreinigungen
durch Filtration (0.45 µm PVDF Spritzenfilter) abgetrennt. Der Aufschluss wurde auf 0.1 mM
EDTA, 1 M NaCl, 1 % Triton eingestellt. 2 ml Chitin Beads wurden mit 3 x 20 ml
Zellaufschlusspuffer equilibriert (Zentrifugation bei 4°C, 1100 UPM, 10 min) und durch
Inkubation des Zellaufschlusses (über Nacht, 4°C, Rollinkubator) mit dem scFv 425-CBD-
CBD dekoriert. Dekorierte Chitin Beads wurden 3 x mit 20 ml Waschpuffer P1 und 3 x mit
Material & Methoden
91
Waschpuffer P2 gewaschen (4°C, 1100 UPM, 10 min, Heraeus Varifuge 3.0 R) und mit ca.
250 ml bis 300 ml A431 Zellkulturüberstand inkubiert (4°C, über Nacht, Rollinkubator). Mit
sEGF-R beladene Chitin Beads wurden pelletiert (4°C, 1100 UPM, 30 min), mit 40 ml
Waschpuffer P1 und 40 ml P2 gewaschen (4°C, 1100 UPM, 30 min) und in eine 2.5 ml Säule
(MoBiTec) überführt. Gebundener sEGF-R wurde durch eine pH-Wertänderung in 1ml
Fraktionen von der Säule eluiert (Elutionspuffer, Flussrate = 1 ml/min, 4°C) und sofort mit
200 µl 1 M Tris-HCl pH 8.0 neutralisiert. Elutionsfraktionen wurden mittels SDS PAGE
analysiert.
Zellaufschlusspuffer: 20 mM Na-P, 0.3 M NaCl, pH 7.2 Waschpuffer P1: 20 mM Na-P, 0.5 M NaCl, 0.1 mM EDTA, 0.1% Trition-X-100, pH 6.5 Waschpuffer P2: 20 mM Na-P, 0.5 M NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 6.5 Elutionspuffer: 0.1 M Glycin-HCl, 0.5 M NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 2.0
7.1.1.5 Fixieren von Zellen
Zellen wurden gewaschen (2 × Minimalmedium), für 10 min. bei RT in 4% PFA/1×
PBS fixiert, 3 × PBS gewaschen und bis zur weiteren Verwendung auf Eis gehalten.
Minimalmedium: DMEM, 1% v/v Pen/Strep, 1% v/v HEPES (1 M), 1% v/v Hydrocortison, 1% v/v ITS, 1% v/v BSA
PBS: 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, pH 7.5
7.1.2 Phage Display
7.1.2.1 Amplifikation von Phagen
Eine 20 ml E. coli ER2738 Kultur wurde bei OD600 = 0.8 mit 1 × 106 bis 5 × 106
Phagen inokuliert, 10 min bei 37°C inkubiert, um die Infektion zu gewährleisten und
anschließend 6h auf einem Orbitalschüttler inkubiert. Eine längere Amplifikation ist aufgrund
der möglichen Rekombinationsereignisse nicht empfehlenswert. Amplifizierte Phagen
wurden durch Zentrifugation (4°C, 10 min, 5000 UPM, Ausschwinggotor, Varifuge 3.0 R,
Heraeus) von den Bakterien getrennt, in 37.5 ml PBS resuspendiert, durch Zugabe von 1/6
Volumen PEG/NaCl, gefällt (4°C, über Nacht), zentrifugiert (4°C, 30 min, 5000 UPM,
Ausschwingrotor, Varifuge 3.0 R, Heraeus), und weiter 2 x in 1 ml PBST0.05 resuspendiert
und erneut gefällt (1/6 Volumen PEG/NaCl, 4°C, 1h). Phagen wurden final in 1 ml PBST0.05
Material & Methoden
92
resuspendiert. Typischerweise wurden ca. 1 × 1014 Phagen aus der Amplifikation gewonnen,
während ca. 1 × 1011 Phagen aus der Selektion zurückgewonnen werden konnten.
PBST0.05: PBS, 0.05% v/v Tween20
7.1.2.2 Phagenselektion
Die Selektion EGF-R spezifischer Phagen wurde abwechselnd auf immobilisiertem,
aus Zellkulturüberstand isoliertem sEGF-R und auf A431 Zellen durchgeführt. Insgesamt
wurden sechs Selektionsrunden durchlaufen, wobei, beginnend mit immobilisiertem sEGF-R,
alternierend immer je zwei Runden auf immobilisiertem sEGF-R bzw. A431 Zellen
durchgeführt wurden. Dieses Prozedere sollte verhindern, dass zum einen während der
Selektion auf immobilisiertem sEGF-R Phagenklone angereichert werden, die Epitope von
evtl. denaturiertem Rezeptor und damit in der intakten Struktur unzugängliche Epitope
erkennen, und zum anderen während der Selektion auf A431 Zellen solche Phagen
angereichert werden, die andere Oberflächenmarker als den EGF-R erkennen.
2 µg sEGF-R wurden in die Vertiefung einer 96-Loch Platte in Immobilisierungspuffer
auf die Plastikoberfläche gebunden (4°C, über Nacht), 2 x gewaschen (300 µl Waschpuffer)
und verbliebene freie Flächen blockiert (RT, 30 min, Blockierungslösung),
Blockierungslösung wurde abgenommen und 2 x gewaschen. 1×1011 bis 1×1012 Phagen
wurden inkubiert (RT, 1h, unter milder Agitation), 4 × mit 300 µl Waschpuffer gewaschen, um
ungebundene Phagen zu entfernen. Gebundene Phagen wurden durch niedrigen pH eluiert
(RT, 10 min, 200 µl Elutionspuffer) und sofort durch Zugabe von Neutralisierungspuffer
neutralisiert. Die eluierten Phagen wurden für die nächste Selektionsrunde amplifiziert.
Für die Selektion auf A431 Zellen wurden diese in 6-Loch Platten ausgesät, und bei
Erreichen der Konfluenz verwendet. Konfluente A431 Zellen wurden 5 × gewaschen (RT, 2
min, ca. 5 ml PBS) und mit ca. 1×1013 Phagen inkubiert (RT, 1h, unter milder Agitation),
ungebundene Phagen wurden durch fünfmaliges waschen entfernt (RT, 2 min, Waschpuffer
+ 1% w/v BSA). Gebundene Phagen wurden durch niedrigen pH eluiert (RT, 10 min, 1 ml
Elutionspuffer) und sofort durch Zugabe von Neutralisierungspuffer neutralisiert. Zelluläres
Material wurde durch Zentrifugation abgetrennt (RT, 10 min, 20000×g). Die eluierten Phagen
wurden für die nächste Selektionsrunde amplifiziert.
Immobilisierungspuffer: 100 mM NaHCO3, pH 9.4
Blockierungslösung: PBS, 1% w/v BSA, 0.05% v/v Tween20
Waschpuffer: PBS, 0.05% v/v Tween20
Elutionspuffer: 100 mM Glycin-HCl, pH 2.2
Neutralisierungspuffer: 1 M Tris-HCl, pH 8.0
Material & Methoden
93
7.1.3 Proteinbiochemische Methoden
7.1.3.1 Rekombinante Proteinexpression in E. coli RV308
Für die Expression der CAT Konstrukte wurden je 1 l 2xYT Medium aus einem
Glycerinstock inokuliert, mit 25 µg/ml Chloramphenicol (Cm25), 100 µg/ml Ampicillin (Amp100)
und 1 mM IPTG versetzt und über Nacht auf einem Orbitalschüttler bei 37°C inkubiert.
Für die Expression des scFv 425-CBD-CBD Konstrukts wurden 4 l 2xYT (Cm25, 28°C,
Orbitalschüttler) aus einer Übernachtkultur (Cm25, 28°C, Orbitalschüttler) inokuliert und auf
eine OD600 von ca. 0.1 eingestellt. Bei OD600 = 0.8 wurde durch Zugabe von 1 mM IPTG die
Proteinexpression induziert und bis zu einer OD600 = 4/5 weiter agitiert.
Für die Expression der scFv 452-Bla und BlaXaEGF Fusionsproteine wurden 2 l
2xYT (Amp100, Cm25, 28°C, Orbitalschüttler) aus einer Übernachtkultur (Amp100, Cm25, 28°C,
Orbitalschüttler) inokuliert, das weitere Prozedere erfolgte analog zum scFv 425-CBD-CBD
Konstrukt.
2xYT-Medium: 16 g/l Bacto-Trypton, 10 g/l Hefe-Extrakt, 5 g/l NaCl
7.1.3.2 Zellaufschluss
● Präparation von Totalzelllysaten:
Alle CAT und GST basierten Konstrukte wurden aus Totalzellysat von E. coli RV 308
Zellen isoliert. Für den Aufschluss wurden die Zellen sedimentiert (4°C, 3635 RCF, 40 min.),
der Überstand verworfen und das Zellsediment bei -80°C über Nacht gelagert. Zellen wurden
in 40 ml Resuspensionspuffer pro 1 l Kultur resuspendiert und 10 1 min. im
EtOH/Eiswasser Bad unter Verwendung einer 6 mm Nadel sonifiziert (duty cycle 50 %,
Output 6) um die Zellen aufzubrechen. Zelldebris wurde durch Zentrifugation (4°C, 43.000 x
g, 45 min), weitere partikuläre Verunreinigungen durch Filtration (0.45 µm PVDF
Spritzenfilter) abgetrennt. Die Proteinlösung wurde geeigneten chromatographischen
Methoden zur weiteren Reinigung zugeführt.
Resuspensionspuffer 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 1mM DTT, 1 mM EDTA, pH 7.2
Material & Methoden
94
● Periplasmatische Extraktion von β-Laktamase Fusionsproteinen:
Die bakterielle β-Laktamase wird in den periplasmatischen Raum exportiert. Durch
Osmolyse wird nur die äußere Membran aufgebrochen, während die Cytoplasmamembran
erhalten bleibt, sodass der Aufschluss bereits einen ersten Reinigungsschritt darstellt.
Sedimentierte Zellen wurden in 3 ml TES-Puffer/[g] Zellen resuspendiert und 45 min unter
gelegentlicher Agitation auf Eis inkubiert. Partikuläres Material wurde durch Zentrifugation
entfernt (4°C, 43.000 x g, 45 min), der Überstand durch einen 0.45 µm PVDF Spritzenfilter
passiert und abschließend 3 x gegen je 2 l Na-P Puffer dialysiert (4°C, je ca. 8h).
TES: 100 mM Tris-HCl, 500 mM Sucrose, 1 mM EDTA, pH 8.0 Na-P Puffer: 20 mM Na-P, 125 m M NaCl, pH 7.2
7.1.3.3 SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die von Laemmli entwickelte Methode der SDS-Gelelektrophorese wird für die
Auftrennung von Proteinen nach deren Größe verwendet. Die Porengröße eines Gels wird
durch das Verhältnis von monomerem Acrylamid zum Kreuzvernetzer N,N´-Methylen-Bis-
Acrylamid bestimmt. Das negativ geladene Detergens SDS lagert sich mit einem Molekül pro
drei Aminosäuren an das Protein an, was zur Denaturierung des Proteins führt und die
konstante Korrelation zwischen Größe des Proteins und seiner Ladung bedingt. Durch die
negative Ladung erfährt das Protein im elektrischen Feld eine zur Anode hin gerichtete Kraft,
die es durch das Netz aus polymerisiertem Acrylamid treibt. Je größer das Molekül ist, desto
höher ist der Widerstand und desto stärker wird es zurückgehalten. Näherungsweise ist die
zurückgelegte Strecke im Gel umgekehrt proportional zur relativen Molekülmasse (Mr).
Vor dem eigentlichen Trenngel ist das Sammelgel vorgeschaltet, in dem die Cl- Ionen
(Leition) schneller wandern als das bei dem im Sammelgel herrschenden pH-Wert neutral
vorliegenden Glycins (Folgeion), dabei wird ein zum Leition hin immer stärker werdendes
elektrisches Feld aufgebaut. Die Kombination von zunehmendem elektrischen Feld und
geringerer Maschenweite fokusiert die Proteine unmittelbar hinter der Leitionenfront zu einer
scharfen Bande, wodurch die Proteinbanden im Trenngel definierter aufgtrennt werden.
Material & Methoden
95
Je fünf SDS-Gele wurden nach folgender Anweisung gegossen:
Trenngel (12,5%) Sammelgel
Wasser 12 ml 13.6 ml
Acrylamid:Bisacrylamid 30%: 0.8%
15.8 ml 3.4 ml
1,5 M Tris-HCl pH 8.8 8.8 ml -
1 M Tris-HCl pH 6.8 - 2.6 ml
20% (w/v) SDS 187.5 µl 100 µl
10% (w/v) APS 100 µl 200 µl
TEMED 10 µl 20 µl
Für das Trenngel wurden obige Komponenten vermischt, wobei der Radikalstarter APS
zuletzt zugegeben wurde und zügig in die vorbereitete Gießapparatur überführt. Das
Trenngel wurde mit 1 ml Isopropanol je Gel überschichtet, um eine saubere Gelkante zum
Sammelgel hin zu erhalten. Nach der Polymerisierung des Trenngels wurde das Isopropanol
verworfen, das Sammelgel gegossen und der Kamm luftblasenfrei eingesetzt. Die vollständig
bei RT Polymerisierten Gele wurden vorsichtig aus der Gießkammer entnommen und bei
4°C in feuchten Tüchern gelagert. Aufzutrennende Proben wurden mit 5 x Ladepuffer
versetzt, 3 min bei 95°C denaturiert und auf das Gel aufgetragen. Typischerweise wurden 20
µl Probenvolumen pro Tasche aufgetragen.
Die angelegte Spannung von 80 V wurde auf 120 V erhöht, sobald die Lauffront das
Trenngel erreichte. Der Lauf wurde beendet, sobald die Lauffront aus dem Gel herauslief.
Nach Beendigung des Laufes wurden die Proteinbanden entweder direkt im Gel mittels
Coomassie-Blau Färbung dargestellt, oder das Gel einer weiteren Analyse durch Western-
Blot zugeführt.
7.1.3.4 Coomassie-Blau Färbung von Proteingelen
Für die direkte Darstellung von Proteinbanden mittels Coomassie-Blau wurde das Gel
in Coomassie-Lösung unter gelegentlichem Erhitzen inkubiert. Die Entfärbung erfolgte unter
gelegentlicher Erwärmung in 20 % Essigsäure bis das Gel entfärbt, und die Proteinbanden
deutlich sichtbar wurden.
Die Methode hat eine untere Nachweisgrenze von ca. 100 ng/Bande. Die Färbung beruht auf
unspezifischer Interaktion des Coomassie-Brilliant-Blau R-250 mit basischen und
aromatischen Resten der Aminosäuren.
Material & Methoden
96
7.1.3.5 Western-Blot Analyse
Der Western Blot, auch Immunoblot genannt, dient dem spezifischen Nachweis von
Proteinen mittels Antikörper.
Der Western Blot schließt sich an die SDS-Gelelektrophorese an und erfolgt senkrecht zur
ursprünglichen Laufrichtung des Gels. Die Proteine im Gel werden dabei auf eine Membran
(Nitrocellulose oder PVDF) übertragen (blotting). Die Proteine haften auf der Membran durch
unspezifische, hydrophobe Interaktionen. Spezifische Proteinbanden können durch
Verwendung von Antikörpern nachgewiesen und z.B. durch Umwandlung eines
chromogenen Farbstoffes dargestellt werden.
7.1.4 Chromatographische Methoden
7.1.4.1 Affinitätschromatographische Methoden
● Reinigung des sEGF-R aus Zellkulturüberstand
Siehe: 7.1.1.4 Reinigung des sEGF-R aus Zellkulturüberstand
● Reinigung der CAT-Konstrukte
CAT-Konstrukte wurden aus Totalzelllysat im ersten Reinigungsschritt über eine
selbst gepackte Chloramphenicol-Caproat-Agarose-Säule zu hinreichender Reinheit isoliert.
Als Säulenmatrix diente Chloramphenicol Caproat-Agarose (Sigma-Aldrich). 1.5 ml
Säulenmatrix wurden mit 40-fachem Säulenvolumen equilibriert (4°C, 1 ml/min, Ladepuffer),
der Zellaufschluss geladen (4°C, 1 ml/min) und mit 40-fachem Säulenvolumen gewaschen
(4°C, 1 ml/min, Ladepuffer). Gebundene Proteine wurden eluiert (4°C, 1 ml/min,
Elutionspuffer) und in 1 ml Fraktionen aufgefangen. Die gesamte Reinigung fand im 4°C
Konstantraum unter Verwendung einer Peristaltikpumpe statt. Fraktionen # 1 – 10 wurden
vereinigt, mittels VivaSpin 4 in 2 – 3 Durchgängen auf ein residuales Volumen von ca. 1 ml
eingeengt (4°C, 5000 × g) und abschließend einer Gelfiltration zugeführt, um
Chloramphenicol von der Probe abzutrennen, und die Probe in die geeigneten Puffer zu
überführen.
Lade- und Resuspensionspuffer 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 1mM DTT, 1 mM EDTA, pH 7.2 Elutionspuffer 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA,
5 mM Cm, pH 7.2
Material & Methoden
97
● Reinigung der GST-Konstrukte
GST-Konstrukte wurden über eine GSTrap FF 1ml (GE Healthcare/Amersham) Säule
an einer HPLC-Anlage (Äkta Purifier) automatisiert zu hoher Reinheit isoliert. Die HPLC-
Anlage wurde mit folgendem Programm gesteuert:
0.00 Base Volume
0.00 ColumnPosition Position8
0.00 Message „right column?right place?” Screen “No sound”
0.00 PumpAInlet A2
0.00 Flow 1.000 {ml/min}
0.00 Watch_Pressure Greater_Than 0.5 {MPa} PAUSE
0.00 Wavelength 280 {nm} 254 {nm} 215 {nm}
1.00 AutoZeroUV
6.00 InjectionValve Inject
48.00 InjectionValve Load
108.00 PumpBInlet B2
108.00 Fractionation_900 2.000 {ml}
108.00 Gradient 100.0 {%B} 0.00 {base}
120.00 Fractionation_Stop_900
122.00 End_Method
Die Säule wurde vor der Reinigung mit 40-fachem Säulenvolumen in Bindepuffer equilibriert.
Bindepuffer wurde über PumpAInlet A2 und der Elutionspuffer über PumpBInlet B2
angeschlossen. Elutionsfraktionen mit höchsten Proteingehalten wurden vereinigt, aliquotiert
und bei -80°C gelagert.
Bindepuffer 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, pH 7.5 Elutionspuffer 50 mM Tris-HCl, 10 mM Glutathion, reduziert, pH8.0
● Reinigung der β-Laktamase Fusionsproteine
Das aktive Zentrum der β-Laktamase hat eine hohe Affinität zu inhibitorisch
wirkenden Borat und Boronat, was für die affinitätschromatographische Reinigung aus dem
Periplasmaextrakt ausgenutzt wurde. Eine selbst gepackte Phenylboronat Sepharose Säule
(ca. 1.5 ml Säulenvolumen) wurde mit Auftragspuffer (40-faches Säulenvolumen) equilibriert.
Der Probenauftrag und die weitere Reinigung erfolgen computergestützt unter Verwendung
des folgenden Programms an einem Äkta-Purifier HPLC-System:
0.00 Base Volume
0.00 Message “loop loaded und connected?” Screen “No sound”
Material & Methoden
98
0.00 Message „PheBo, A1: 20mM NaP, 0.5M NaCl B1: 20mM NaCl, 0.5M
NaCl, 0.5M Borat” Screen “No sound”
0.00 Alarm_Pressure Enabled 1.5 {MPa} 0.0 {MPa}
0.00 InjectionValve Load
0.00 PumpAInlet A1
0.00 OutletValve WasteF1
0.00 Flow 0.500 {ml/min}
0.00 Gradient 0.0 {%B} 0.00 {base}
0.00 Wavelength 280 {nm} 254 {nm} 215 {nm}
1.00 AutoZeroUV
2.00 InjectionValve Inject
2.00 OutletValve F2
2.00 Fractionation_900 10.000 {ml}
57.00 InjectionValve Load
57.00 Fractionation_900 10.000 {ml}
57.00 Flow 1.000 {ml/min}
137.00 PumpBInlet B1
137.00 Gradient 100.0 {%B} 0.00 {base}
137.00 Fractionation_900 1.000 {ml}
137.00 Flow 0.500 {ml/min}
157.00 PumpAInlet A1
157.00 Gradient 0.0 {%B} 0.00 {base}
157.00 OutletValve WasteF1
157.00 Flow 1.000 {ml/min}
122.00 End_Method
Die proteinhaltigen Elutionsfraktionen wurden vereinigt, 3 × gegen je 2 l Dialyspuffer
dialysiert (4°C, je ca. 8h), steril filtriert (0.45 µm Spritzenfilter) und in Aliquots bei -80°C
gelagert.
Equilibrierungspuffer 20 mM Na-P, 0.5 M NaCl, pH 7.2
Ladepuffer 20 mM Na-P, 0.5 M NaCl, pH 7.2
Elutionspuffer 20 mM Na-P, 0.5 M NaCl, 0.5 M Borat, pH 7.2
Dialysepuffer 20 mM Na-P, 125 m M NaCl, pH 7.2
7.1.4.2 Größenausschlusschromatographie
Über eine Superdex 200 Gelfiltrationssäule (Trennbereich 10 – 600 kDa, ca. 24 ml
Säulenvolumen) wurden die CAT-Konstrukte in HEPES Puffer für BIAcore Untersuchungen
umgepuffert und im Elutionspuffer vorhandenes Chloramphenicol abgetrennt. Streptavidin
Konstrukte wurden ebenfalls mittels Superdex 200 Gelfiltrationssäule von überschüssigen,
ungebundenen Peptiden nach erfolgter Dekoration abgetrennt.
Material & Methoden
99
Die Säule wurde mit 3 Säulenvolumen des Puffers für die späteren Messungen equilibriert,
Für die Reinigung der CAT und Streptavidin Konstrukte wurden 500 µl – 1000 µl
Proteinlösung in einen 1 ml Loop geladen und bei einer Flussrate von 0.7 ml/min auf die
Säule aufgetragen. Über den Fraktionssammler wurden 1 ml Fraktionen aufgefangen. Die
Reinigung erfolgte an einem Äkta-Purifier System. Alle Puffer wurden zuvor filtriert (0.22 µm
Porengröße) und entgast.
HEPES Puffer: 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.2
7.1.5 Bindungsnachweismethoden
7.1.5.1 Konfokale-Immunfluoreszenz
A431 Zellen wurden in IBIDI µ-Dish, kombinierte Kultivierungs- und
Fluoreszenzmikroskopie Schalen, in Vollmedium kultiviert. 24h vor der Färbung wurden die
Zellen in Minimalmedium zur Ruhigstellung überführt, 3 × PBS gewaschen, fixiert (4% PFA
in PBS, 15 min, RT), 3 × PBS gewaschen, in 1 ml Blockierungslösung blockiert (1h, RT) und
erneut 3 × PBS gewaschen. Konstrukte wurden 1h auf den Zellen inkubiert (1h, RT, 720 nM,
ca. 300µl Volumen), ungebundene Konstrukte wurden entfernt (7 × 1 ml PBS). Gebundene
CAT-Fusionsproteine wurden mittels primärem Antikörper detektiert (100 µl), ungebundene
Antikörper entfernt (7 × 1 ml PBS), und mittels sekundärem, fluoreszenzmarkiertem
Antikörper (100 µl) visualisiert. Ungebundene sekundäre Antikörper wurden durch waschen
entfernt (7 × 1 ml PBS). Proben wurden bis zur Analyse dunkel und auf Eis gehalten.
Die Detektion des Fluoreszenzsignals erfolgte an einem Zeiss LSM 510UV inversen,
konfokalen Laser-Scanning Mikroskop.
Vollmedium: DMEM, 10 % v/v FKS, 1 % v/v Glutamin, 1 % v/v Penicillin/Streptomycin
Minimalmedium: DMEM, 1% v/v Pen/Strep, 1% v/v HEPES (1 M), 1% v/v Hydrocortison,
1% v/v ITS, 1% v/v BSA
PBS: 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, pH 7.5
Primärer-AK: Kaninchen-anti-CAT-IgG Antikörper, 1:1000 verdünnt in PBS
Sekundärer-AK: Anti-Kaninchen AlexaFluor488 gekoppelter Antikörper, 1:200 verdünnt in PBS
Material & Methoden
100
7.1.5.2 ELISA
2 µg sEGF-R wurden in Vertiefungen von 96-Loch Platten immobilisiert (20°C, 2 h,
100 µl), überschüssiger Rezeptor wurde entfernt (2 × 300 µl PBS), evtl. freie Flächen
blockiert (20°C, 2 h, 0.5% w/v PVP-K30 in PBS) und die Blockierungslösung entfernt (2 ×
300 µl PBS). Für Protein-ELISA auf A431 Zellen wurden diese in 96-Loch Platten bis zur
Konfluenz in Vollmedium kultiviert, in Minimalmedium überführt und 24 h später gewaschen
(3 × PBS). Die Blockierung freier Oberflächen erfolgte analog zu den sEGF-R belegten
Oberflächen. Konstrukte wurden auf der sEGF-R Oberfläche inkubiert (320 nM in PBS, 550
mM NaCl, 20°C, 45 min, ELISA-Schüttler), ungebundene Konstrukte entfernt (15 × 300 µl
PBS, 550 mM NaCl). sEGF-R lokalisierte CAT-Konstrukte wurden mittels Kaninchen anti-
CAT Antikörper detektiert (20°C, 45 min, 1:1000 verdünnt in PBS, 550 mM NaCl),
überschüssige Antikörper wurden entfernt (15 × 300 µl PBS, 550 mM NaCl), verbliebene
primäre Antikörper durch sekundären, HRP gekoppelten anti-Kaninchen Antikörper detektiert
(20°C, 45 min, 1:1000 verdünnt in PBS, 550 mM NaCl), überschüssige Detektionsantikörper
entfernt (15 × 300 µl PBS, 550 mM NaCl) und durch Zugabe von 100 µl ABTS mittels
Farbumschlag nachgewiesen (Absorption @ 405 nm, Tecan Sunrise ELISAreader).
Für den Phagen-ELISA auf immobilisiertem sEGF-R wurden 2 µg sEGF-R in die
Vertiefungen einer 96-Loch Platte immobilisiert (10°C, 3 h, 100 µl). Für den Phagen-ELISA
auf A431 Zellen wurden diese in Vertiefungen einer 96-Loch Platte bis zur Konfluenz in
Vollmedium kultiviert und 24 h vor dem Experiment in Minimalmedium überführt.
Ungebundener Rezeptor bzw. Minimalmedium wurde durch Waschen entfernt (3 × PBS).
A431 Zellen wurden fixiert (RT, 30 min, 4% PFA in PBS) und anschließend gewaschen (3 ×
PBS). Freie Oberflächen wurden blockiert (16°C, 3 h, 4% BSA w/v in PBS) und die
Blockierungslösung entfernt (3 × PBS). 1×1013 Phagen wurden auf sEGF-R oder A431
Zellen inkubiert (20°C, 40 min, 100 µl PBS, 1% BSA, 0.05% Tween20), ungebundene
Phagen entfernt (6 × PBS, 1% BSA, 0.05 % v/v Tween 20), verbliebene Phagen mittels anti-
M13 HRP konjugiertem Antikörper detektiert (20°C, 40 min, PBS, 1% BSA, 0.05% Tween20),
überschüssige Antikörper entfernt (6 × PBS, 1% BSA, 0.05 % v/v Tween 20) und durh
Zugabe von 100 µl ABTS nachgewiesen. Der Farbumschlag wurde an einem Tecan Sunrise
ELISAreader bei 405 nm verfolgt.
PBS: 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, pH 7.5
Primärer-AK: Kaninchen-anti-CAT-IgG Antikörper, 1:1000 verdünnt in PBS
Sekundärer-AK: Anti-Kaninchen-IgG-HRP Antikörper, 1:1000 verdünnt in PBS
Anti-M13-HRP Antikörper, 1:1000 verdünnt in PBS, 1% BSA, 0.05% Tween20
Material & Methoden
101
7.1.5.3 Biacore
Alle Messungen wurden an einem BIAcore 3000 System unter Verwendung des Sensorchips
CM-5 durchgeführt.
● Kopplung eines CM-5 Sensorchips mit sEGF-R:
sEGF-R wurde gemäß Herstellerangaben auf die Oberfläche eines CM-5 Sensorchip
gekoppelt. Referenzflußzelle wurde nach Herstellerangaben inaktiviert und diente als
Kontrolle, um Puffereffekte zu eliminieren.
4 µl sEGF-R (11.3 µM in HEPES-Puffer) wurden mit 196 µl Acetat-Puffer gemischt und bei
einer Flussrate von 30 µl/min 1 min lang auf die aktivierte Sensoroberfläche gekoppelt. Nach
der Kopplung erfolgte die Inaktivierung der Sensorchipoberfläche. Die Kopplung erfolgte
automatisiert unter Verwendung des folgenden Programms:
DEFINE APROG immobEGFR
CAPTION Amine coupling
FLOW 10
DILUTE R1D1 R1D2 R1D3 50 !EDCpos NHSpos mixpos 50%dilution
* INJECT R1D3 70 !EDC/NHS
-0:10 RPOINT Baseline -b
FLOW 10
* INJECT R1D4 150 !Ligand 4 µl sEGFR + 196 µl Acetat 10mM pH3.4
Flow 10
* INJECT R1D5 70 !Ethanolamine deactivation
EXTRACLEAN !Extra washing of flow cell area
15:00 RPOINT immob !Immobilized amount of ligand
END
MAIN
RACK 1 thermo_c
RACK 2 thermo_a
FLOWCELL 4 !Sensogram in flow cell 4
APROG immobEGFR
APPEND CONTINUE
END
● Aufnahme von Sensorgrammen:
CAT Fusionsenzyme wurden mittels Gelfiltration in HEPES-Puffer überführt, der Laufpuffer
wurde für die Messungen am BIAcore verwendet und zuvor filtriert und entgast. Zu
messende Proteinverdünnungsreihen wurden in das Probenaufnahmerack gestellt. Die
Messungen erfolgten bei 20°C und einer Flussrate von 20 µl/min. Die Probeninjektion
erfolgte durch manuelle Eingabe des Befehls „Kinjekt“ in den Befehlsablaufstapel, unter
Angabe der jeweiligen Position der Probe.
Material & Methoden
102
HEPES-Puffer: 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4
Acetat-Puffer: 10 mM Acetat, pH 3.4
7.1.5.4 Durchflußzytometrie
A431 Zellen wurden in einer 175 cm² Gewebekulturflasche bis zur Konfluenz kultiviert und
unter Verwendung der Accutase vereinzelt. Alle nachfolgenden Schritte erfolgten auf Eis
unter Verwendung eiskalter Puffer. Im Falle einer Fixierung wurden die Zellen in 4% PFA
supplementiertem PBS für 5 min bei RT inkubiert und anschließend gewaschen (3 × PBS).
Vereinzelte Zellen wurden in 20 Aliquots aufgeteilt und mit den entsprechenden Konstrukten
inkubiert (Tabelle 5 & Tabelle 4) (auf Eis, 30 min, 500µl). Ungebundene Konstrukte wurden
entfernt (2 × PBS), durch Koinkubation von primärem und sekundärem Nachweisantikörper
detektiert (auf Eis, 20 min, 500 µl), ungebundene Antikörper entfernt (2 × PBS) und am
Durchflußzytometer nachgewiesen.
PBS: 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, pH 7.5
7.1.6 Zellaktivierungsassays
7.1.6.1 Wundheilungsexperiment
A431 Zellen wurden in 6-Loch Platten bis zur Konfluenz in Vollmedium kultiviert,
sodann für 24h in Minimalmedium überführt, um die Zellen ruhig zu stellen. Zellen wurden
Tabelle 4) Konzentrationen der eingesetzten Peptide bei PräInkubation mit Neutravidin-OregonGreen488
Kon-strukt
CATwt [5.5 µM] S-CAT-S [5.5 µM] scFv 425 Bla [5.5
µM] CAT Kontrolle Bla Kontrolle
1. AK Kaninchen α-CAT IgG
(1:500) Kaninchen α-CAT IgG
(1:500) Maus α-Bla IgG
(1:50) Kaninchen α-CAT IgG
(1:500) Maus α-Bla IgG
(1:50)
2. AK α-Kaninchen IgG AlexaFluor 488
(1:300)
α-Kaninchen IgG AlexaFluor 488
(1:300)
α-Maus IgG AlexaFluor488
(1:300)
α-Kaninchen IgG AlexaFluor 488
(1:300)
α-Maus IgG AlexaFluor488
(1:300)
Tabelle 5) Konzentrationsangaben für die jeweiligen Konstrukte und Antikörper Kombinationen.
Peptid EGF-Biotin [160 nM] Biotin [160 nM] EGFR-DA [160 nM] QWSSHIFTF [160 nM]
Neutravidin-OregonGreen488 [80 nM] [80 nM] [80 nM] [80 nM]
Material & Methoden
103
unmittelbar vor dem Experiment gewaschen (1 × Minimalmedium). Mithilfe einer 1000µl
Einweg-Pipettenspitze bei exakt senkrechter Haltung wurde unter Aufwendung konstanten
Drucks eine strichförmige Wunde in den Zellrasen eingeführt. Abgelöste Zellen wurden durch
gründliches Waschen entfernt (ca. 5 × mit je 3 ml Minimalmedium). Verwundete Zellen
wurden mit entsprechenden Konstrukten, formuliert in Minimalmedium, inkubiert. Der
Wundverschluss wurde an einem Zeiss Axiovert 100 Mikroskop (5-fache Vergrößerung),
ausgestattet mit einer Canon PowerShot A610, sofort, nach 24h und 48h dokumentiert. Um
sicherzustellen, dass immer derselbe Ausschnitt dokumentiert wird, wurde mittels einer
Kanüle ein Strich senkrecht zur Wunde in die Plastikoberfläche gekratzt, der als
Orientierungshilfe am unteren Bildrand diente. Die Brennweite der Digitalkamera wurde über
einen angeschlossenen Rechner eingestellt, da die Zoomwippe der Kamera keine
reproduzierbaren, identischen Brennweiten lieferte.
Die Auswertung der zellfreien Fläche in Pixel wurde mit dem Programm ImageJ und dem
folgenden Makro vorgenommen:
SetForeground Color (0, 0, 0); run ("Size...", "width=1000 height=750 constrain"); run
("FindEdges"); run ("Log"); run ("Enhance Contrast", "saturated=0.5"); run ("Mean...",
"radius=15 separable"); run ("Threshold"); run ("Despeckle"); run ("FillHoles"); run
("Despeckle"); doWand (500,375); run ("Measure")
Die Differenz der zellfreien Fläche zwischen dem Wert 0h und 24h bzw. 48h nach
Stimulation diente als Maß für die zelluläre Aktivierung.
Vollmedium: DMEM, 10 % v/v FKS, 1 % v/v Glutamin, 1 % v/v Penicillin/Streptomycin
Minimalmedium: DMEM, 1% v/v Pen/Strep, 1% v/v HEPES (1 M), 1% v/v Hydrocortison,
1% v/v ITS, 1% v/v BSA
Material & Methoden
104
7.1.7 Gentechnische Methoden
7.1.7.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Definierte DNA-Fragmente können mithilfe der PCR in wiederholten Zyklen durch
Verwendung zur Template-DNA komplementärer Oligonukleotide amplifiziert werden. Die
verwendeten Oligonukleotide können darüberhinaus für zusätzliche Informationen kodieren,
die nicht in der eigentlichen Template-DNA vorhanden sind, und so eine zusätzliche
Sequenz an die Termini der ursprünglichen Templatesequenz anhängen (Primer Extensions
PCR). Das Standardprogramm wurde für die meisten PCR-Reaktionen verwendet, wobei die
annealing Temperatur den verwendeten Oligonukeotiden angepasst wurde:
Tabelle 6) Standard-PCR Programm
Zyklen Vorgang Temp. [°C] Zeit [s]
1 Initiale Denaturierung 94°C 180 s
29 Denaturierung 94°C 30 s
annealing 62°C 30 s
Elongation 72°C 60 s/kb template DNA
(Taq)
1 Finaler Elongationsschritt 72°C 600 s
Analytische PCR Reaktionen wurden in einem Volumen von 20 µl, präparative Reaktionen
dagegen in 50 µl durchgeführt. Üblicherweise wurde eine PCR Reaktion nach folgendem
Schema pipettiert:
Tabelle 7) Pipettierschema eines präparativen PCR Ansatzes
Komponenten Menge [µl]
100 ng template DNA x µl
10 × PCR Puffer 5 µl
MgCl2 [25 mM] 5 µl
dNTPs [20 mM] 2 µl
Vorwärtsprimer [5 pmol/µl] 5 µl
Rückwärtsprimer [5 pmol/µl] 5 µl
Taq 0.5 µl
H2O ad 50 µl
Material & Methoden
105
7.1.7.2 DNase I Verdau
10 µg PCR-Produkt wurden mit 0.2 U DNase I in einer PCR-Maschine fragmentiert
(15 °C, 2 min, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MnCl2, 50 µl), die Reaktion wurde durch
Überführung in eiskalte Stoplösung abgestoppt. Generierte Fragmente wurden auf einem
Harnstoffgel analysiert.
Stoplösung: 5 mM EDTA
7.1.7.3 Präparation von Plasmid-DNA
3 ml eine Übernachtkultur wurden sedimentiert, der Überstand verworfen und das
Zellpellet in Lysispuffer resuspendiert. Die Isolation der DNA erfolgte mittels QIAprep Spin
Miniprep Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Alle optionalen Waschschritte wurden
durchgeführt. Abweichend vom Herstellerprotokoll wurde die Zentrifuge bei der Bindung der
DNA an und bei der Elution von der Säule langsam beschleunigt, was einen positiven
Einfluss auf die Ausbeute hatte. DNA wurde mit 20 µl EB-Puffer von der Säule eluiert.
Isolierte Plasmid-DNA wurde bei -20°C gelagert. Typischerweise wurden ca. 10 µg DNA aus
3 ml Kultur isoliert.
EB-Puffer: 10 mM Tris pH 8.8
7.1.7.4 Restriktionsverdau
Für analytische Zwecke wurde 1 µg DNA durch Restriktionsendonukleaseverdau
analysiert. Bei Restriktionsverdauen mit mehreren Enzymen wurde darauf geachtet, dass
nicht mehr als 10 vol% Enzym zum Ansatz gegeben wurden, da sich sonst das Glycerin im
Puffer negativ auf die Aktivität der Enzyme ausüben kann. Gemäß Herstellerangaben wurde
dem Verdau bei Bedarf BSA hinzugefügt
7.1.7.5 Agarose-Gel-Elektrophorese
Die elektrophoretische Auftrennung von DNA Fragmenten zu Analysezwecken wurde
mit Flachbettagarosegelen durchgeführt. Für die Auftrennung von Fragmenten ab ca. 100 bp
aufwärts wurde ein 1% iges (w/v) Agarosegel in TAE Puffer gegossen. Die Agarose wurde in
entsprechendem Volumen TAE Puffer vollständig aufgelöst (Mikrowelle), abgekühlt, mit
Material & Methoden
106
Ethidiumbromid versetzt, und in den vorbereiteten Gelschlitten eingefüllt. Die
aufzutrennenden Proben (typischerweise 1µg DNA) wurden mit 6-fach DNA-Ladepuffer
vermischt. Nach dem Aushärten des Agarosegels wurde das Gel mit den zu analysierenden
proben beladen, ein Größenstandard aufgetragen und in TAE-Laufpuffer bei ca. 100 V
aufgetrennt, bis der untere Blaumarker des Größenstandards den unteren Gelrand erreichte.
Das Gel wurde an einem 254 nm UV-Tisch mittels CCD-Kamera dokumentiert.
TAE-Puffer (50x): 2 M Tris, 1 M Essigsäure, 0.5 M EDTA, pH 8.0
DNA-Ladepuffer (6x): 50 % Glycin, 0.25 % Bromphenolblau und/oder 0.25 % Xylenblau
7.1.7.6 Isolation von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
DNA-Fragmente wurden wie voran beschrieben über ein Agarosegel aufgetrennt,
wobei im Unterschied zu analytischen Läufen, die angelegte Spannung auf 80 V und der
Agarosegehalt auf 0.8% (w/v) reduziert wurden. Die Isolation der aufgetrennten Fragmente
erfolgte auf einem langwelligeren UV-Tisch (366 nm), um die Schädigung der DNA zu
minimieren. Das Fragment von Interesse wurde mittels Skalpell aus dem Gel
herausgeschnitten und das Gel anschließend zur Überprüfung auf dem 254 nm UV-Tisch
dokumentiert. Die isolierte DNA wurde mittels QIAquick Gel Extraction Kit aus dem
Agarosegelstück nach Herstellerangaben isoliert.
7.1.7.7 Ligation
Die Ligation von DNA Fragmenten wurde mittels T4-DNA Ligase (1 Unit) gemäß
Herstellerangaben üblicherweise in einem Volumen von 10 µl durchgeführt. Das molare
Verhältnis von Vektor zu Insert wurde auf ca. 1:3 eingestellt. Die Reaktion wurde bei 18°C
über Nacht durchgeführt. Die T4-DNA Ligase wurde durch 20 minütiges Erhitzten auf 65°C
inaktiviert.
Material & Methoden
107
7.1.7.8 Transformation
Chemisch kompetente E.coli XL1-Blue wurden zu Klonierungszwecken aufgetaut, mit
5 µl aus dem Ligationsansatz 30 min auf Eis inkubiert, einem Hitzeschock unterzogen (1 min,
42°C) und nach Zugabe von 1 ml 2xYT 1h inkubiert (37°C, Orbitalschüttler). Für
Proteinexpression wurde die Plasmid-DNA in chemisch kompetente E.coli RV308
transformiert.
2xYT-Medium 16 g/l Bacto-Trypton, 10 g/l Hefe-Extrakt, 5 g/l NaCl
7.1.7.9 Kinasierung von Oligonukleotiden
Da synthetisierte Oligonukleotide keine 5´-Phosphatgruppe aufweisen, müssen diese
zunächst kinasiert werden. Hybridisierte Oligonukleotide wurden mit 10 U T4-
Polynukleotidkinase in einem mit 10 x Ligase-Puffer versehenen 15 µl Ansatz 30 min bei
37°C inkubiert und abschließend hitzeinaktiviert (65°C, 15 min). Die Fragmenten konnten
direkt für eine Ligation eingesetzt werden.
T4 DNA-Ligase Puffer (10x): 400 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT,
5 mM ATP
7.1.7.10 Hybidisierung komplementärer Oligonukleotide
Für die Hybridisierung einzelsträngiger, komplementärer Oligonukleotide zu
doppelsträngigen Fragmenten wurde kochendes Wasser in eine Thermoskanne gefüllt, das
Eppendorfreaktionsgefäß in einem Schwimmer hineingegeben, das Gefäß verschlossen und
über Nacht bei 4°C gelagert.
7.1.7.11 Dephosphorylierung von Plasmidvektoren
Um die Religation des Vektors ohne Insert-DNA zu verhindern wurden die terminalen
Phosphatgruppen mittels Shrimp alkalischer Phosphatase (SAP) abgespalten.
Typischerweise erfolgte die Dephosphorylierung in einem 50 µl Ansatz, versetzt mit DNA, 2
U SAP und 10 x SAP-Puffer für 1 h bei 37°C.
SAP-Puffer (10x): 0.1 M Tris-HCl, 0.1M MgCl2, 1 mg/ml BSA, pH 7.5
Material & Methoden
108
7.2 Material
7.2.1 Zelllinien
A431 humane Tumorzelllinie, (DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH, Braunschweig, DSMZ-Nr. ACC 91; ATCC, Manassas, VA, USA)
7.2.2 Bakterienstämme
RV308: E. coli K12-Derivat (DSMZ); su-, ∆lacX74, galISII::OP308, rpsL
XL1-Blue: E. coli K12-Derivat (Stratagene); recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44
relA1 lac [F' proAB lacIq ZΔM15 Tn10 (TetR)]
BL21 E. coli K12 Derivat (Stratagene)
7.2.3 Nährmedien
Luria-Bertani (LB)-Medium 10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Hefe-Extrakt, 5 g/l NaCl
LB-Agar-Platten 15 g Bacto-Agar/l LB-Medium
2xYT-Medium 16 g/l Bacto-Trypton, 10 g/l Hefe-Extrakt, 5 g/l NaCl
Vollmedium DMEM, 10% v/v FKS, 1% v/v Glutamin,
1% v/v Pen/Strep
Minimalmedium DMEM, 1% v/v Pen/Strep, 1% v/v HEPES (1 M), 1% v/v
Hydrocortison, 1% v/v ITS, 1% v/v BSA
7.2.4 Rekombinante DNA-Technik
Puffer für Restriktionsverdau e NEB und Fermentas Puffersysteme
BSA Stocklösung (100x) NEB
ATP Sigma Aldrich
EB-Puffer 10 mM Tris pH 8.8
Restriktionsenzyme NEB und Fermentas
Polymerasen Vent-DNA-Polymerase, Fermentas
Taq-Polymerase, Genaxxon
Shrimp Alkalische Phosphatase (SAP) Fermentas
Material & Methoden
109
SAP-Puffer (10x) Fermentas
T4 Polynukleotid-Kinase (PNK) Fermentas
T4 DNA-Ligase Fermentas
T4 DNA-Ligase Puffer (10x) 400 mM TrisHCl, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT,
5 mM ATP
TAE-Puffer (50x) 2 M Tris, 1 M Essigsäure, 0.5 M EDTA, pH 8.0
DNA-Ladepuffer (6x) 50 % Glycin, 0.25 % Bromphenolblau und/oder
0.25 % Xylenblau
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen
7.2.5 Antikörper
Kaninchen-anti-CAT-IgG Sigma
Maus-anti-Bla-IgG THP Medical Products
Ziege-Anti-Kaninchen-IgG Alexa-Fluor 488 Molecular Probes
Ziege-Anti-Maus-IgG Alexa-Fluor 488 Molecular Probes
Anti-Kaninchen-IgG-HRP Santa Cruz Biotechnology
7.2.6 Puffer
7.2.6.1 Allgemein
PBS 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, pH 7.5
Na-P Puffer 20 mM Na-P, 125 mM NaCl, pH 7.2
HEPES Puffer 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4
7.2.6.2 sEGF-R Reinigung
Zellaufschlusspuffer 20 mM Na-P, 0.3 M NaCl, pH 7.2
Waschpuffer P1 20 mM Na-P, 500 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 0.1% Triton-X-
100, pH 6.5
Waschpuffer P2 20 mM Na-P, 500 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 6.5
Material & Methoden
110
Elutionspuffer 100 M Glycin-HCl, 0.1 mM EDTA, 500 mM NaCl, pH 2.0
Natriumphosphatpuffer 20 mM Na-P, 25 mM NaCl, pH 7.2
7.2.6.3 Reinigung der CAT-Fusionsproteine
● Affinitätschromatographie:
Lade- und Resuspensionspuffer 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 1mM DTT, 1 mM EDTA, pH
7.2
Elutionspuffer 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA,
5 mM Cm, pH 7.2
● Gelfiltration: 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4
7.2.6.4 Reinigung der GST-Fusionsproteine
Bindepuffer 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, pH 7.5
Elutionspuffer 50 mM Tris-HCl, 10 mM Glutathion, reduziert, pH8.0
7.2.6.5 Reinigung der β-Laktamase Fusionsproteine
TES: 100 mM Tris-HCl, 500 mM Sucrose, 1 mM EDTA, pH 8.0
Equilibrierungspuffer 20 mM Na-P, 0.5 M NaCl, pH 7.2
Ladepuffer 20 mM Na-P, 0.5 M NaCl, pH 7.2
Elutionspuffer 20 mM Na-P, 0.5 M NaCl, 0.5 M Borat, pH 7.2
Dialysepuffer 20 mM Na-P, 125 m M NaCl, pH 7.2
7.2.6.6 SDS-Gelelektrophorese
SDS-Auftragspuffer (5x) 250 mM TrisHCl, 50% (v/v) Glycerin, 10% (w/v) SDS,
0.5% (w/v) Bromphenolblau, 500 mM DTT
Laufpuffer (5x) 125 mM TrisHCl, 1 M Glycin, 20% SDS, pH 8.5
Coomassie-Färbelösung 0.05% (w/v) Coomassie Brilliantblau R-250, 10% (v/v)
Essigsäure, 4% (v/v) Isopropanol
Coomassie-Entfärberlösung 20% (v/v) Essigsäure in H2O
Material & Methoden
111
7.2.7 Säulen und Säulenmaterial
GSTrap HP, 1 ml Amersham
Chloramphenicol-Caproat Agarose Sigma
Phenylboronat MoBiTec
Reversed Phase Säulen:
Jupiter 4u Proteo 90A, 250 x 4.6 mm Phenomenex
Jupiter 4u Proteo 90A, 250 x 10 mm Phenomenex
Superdex 200 Gelfiltrationssäule GE Healthcare
7.2.8 Geräte und Software
Beckman J6, Rotor JS4.2 Beckman Coulter
Sorvall RC-5B Rotor SS 34/ Rotor GS 3 Du Pont Instruments
Varifuge 3.0 R Swingout-Rotor Heraeus Sepatech
Centrifuge 5702 Ausschwingrotor A-4-38 Eppendorf
Centrifuge 5417C Rotor F45-30-11 (Tischzentrifuge) Eppendorf
Microlite Rotor IEC 851 (Tischzentrifuge) ThermoIEC
Schüttelplattform GFL 3015 GFL
Thermoschüttler, KTMR 133 HLC
Orbitalschüttler G25 Incubator Shaker New Brunswick Scientific
Rolltisch Schütt
Sonifizierer Branson
PCR-Maschine Mastercycler gradient Eppendorf
UV/Visible Photometer V-550 Jasco
ESI-Massensppektrometer MAT TSQ 700 Finnigan
Brutschrank Heraeus
Heizblock ORI-Block OB-3 Techne
Labovert FS Leitz
LSM 510 UV, konfokales, inverses Mikroskop Zeiss
Flachbettgelapparatur EC classic ThermoEC
SDS-PAGE-Kammer Amersham
Mikrotiterplattenleser Sunrise Tecan
pH-Meter, Microprocessor pH 537 WTW
Sequenzierautomat,
Material & Methoden
112
ABI Prism TM 310 Genetic Analyser Applied Biosystems
HPLC-Anlage, Äkta Purifier Amersham Pharmacia Biotech
Pipetten Gilson, Pipetman
Vortexer Vortex Genie 2
Sotware:
Autodock4: Garret M. Morris, http://autodock.scripps.edu/
MacPyMOL: A PyMOL-based Molecular Graphics Application for MacOS X (2007),
DeLano Scientific LLC, Palo Alto, CA, USA. http://www.pymol.org
Tecan Xreadplus, Tecan
Carl Zeiss AIM, LSM Image Browser, Zeiss
BIAevaluation, BIAcore (GE Healthcare)
GCG, Accelrys, Cambridge United Kingdom
7.2.9 Chemikalien
ABTS Roche
Acrylamid/Bisacrylamid (30:0.8) Roth
Agarose Gibco BRL
Ammoniumperoxosulfat (APS) Sigma, Merck
Ampicillin Roth
Bacto-Agar Difco
Bacto-Hefeextrakt Difco
Bacto-Trypton Difco
Borsäure Roth
Bradford-Reagenz BioRad
Bromphenolblau LKB
Calciumchlorid Sigma
Chitin Beads Sigma
Chloramphenicol Sigma
Chloramphenicol Caproat-Agarose Sigma
Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs) Amersham
Coomassie Brilliant-Blau R-250 Serva
Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma
Dinatriumhydrogencarbonat Merck
Dithiothreitol (DTT) Biomol
Material & Methoden
113
DMEM/F12-Mix Gibco
Essigsäure Roth
Ethanol Roth
Ethidiumbromid Roth
Ethylendiammoniumtetraacetat (EDTA) Sigma
fetales Kälberserum (FKS) Gibco
Glutamin Gibco
Glutaraldehyd Fluka
Glycerin Merck
Glycin Merck
Hepes Gibco
Hoechst 33342 Molecular Probes
Hydrocortison Sigma
Insulin Transferrin Selenium-X-Supplement (ITS) Gibco
Isopropanol Roth
Kaliumacetat Roth
Kaliumdihydrogenphosophat Merck
Magnesiumchlorid Roth
Manganchlorid Merck
Natriumchlorid Roth
Natriumdodecylsulfat (SDS) Roth
Natriumdihydrogenphosphat Merck
Natriumhydrogencarbonat Merck
Natriumhydroxid Roth
N, N, N’, N’-Tetramethylethyldiamin (TEMED) Sigma
Penicillin/Streptomycin Gibco
Rinderserumalbumin Fraktion V (BSA) Roth/Sigma
RPMI 1640 Gibco
Rubidiumchlorid Sigma
Saccharose Roth
Salzsäure Roth
Sephadex G-50 Amersham
Tetracyclin Sigma
Tris-Base Roth
Trypsin Sigma
Tween20 Sigma
Xylencyanol LKB
Material & Methoden
114
7.2.10 Allgemeine Plastikware
1/2 Mikro Einmalküvette Ratiolab
1.5 ml PP-Reaktionsgefäße Nerbe
2.0 ml PP-Reaktionsgefäße Nerbe
15 ml PP-Reaktionsgefäße Greiner
50 ml PP-Reaktionsgefäße Greiner
0.5 ml PCR-Reaktionsgefäße (dünnwandig) Roth
0.2 ml PCR-Reaktionsgefäße (ohne Deckel) PEQLAB
Petrischalen 94/16 mm Greiner
Spritzen (5, 10, 20 ml) Braun
Rotilabo Spritzenfilter (0.22/0.45 µm) Roth
Pipettenspitzen Roth
Petrischalen 6/10 cm Greiner
6-well-Platte Greiner
Gewebekulturflaschen 25 cm2, 175 cm2 Greiner
F96 Maxisorb Nunc Immuno Platte Nunc
Combitips plus 10 ml Eppendorf
Dialyseschläuche (Ausschlussgröße 10 000 Da) Roth
Whatman-Papier 3M
Vivaspin 500 Vivascience Sartorius
Vivaspin 4 Vivascience Sartorius
Referenzen
115
8 Literatur Adams, G., M. Tai, et al. (2006). "Avidity-mediated enhancement of in vivo tumor targeting by
single-chain Fv dimers." Clin. Cancer Res. 12(5): 1599-605. Alton, N. K. und D. Vapnek (1979). "Nucleotide sequence analysis of the chloramphenicol
resistance transposon Tn9." Nature 282(5741): 864-9. Arap, W., M. G. Kolonin, et al. (2002). "Steps toward mapping the human vasculature by
phage display." Nat Med 8(2): 121-7. Balestrieri, M. L. und C. Napoli (2007). "Novel challenges in exploring peptide ligands and
corresponding tissue-specific endothelial receptors." Eur J Cancer 43(8): 1242-50. Baselga, J. und S. D. Averbuch (2000). "ZD1839 ('Iressa') as an anticancer agent." Drugs 60
Suppl 1: 33-40; discussion 41-2. Berezov, A., J. Chen, et al. (2002). "Disabling receptor ensembles with rationally designed
interface peptidomimetics." J. Biol. Chem. 277(31): 28330-9. Bianco, R., T. Gelardi, et al. (2007). "Rational bases for the development of EGFR inhibitors
for cancer treatment." Int J Biochem Cell Biol 39(7-8): 1416-31. Bouyain, S., P. A. Longo, et al. (2005). "The extracellular region of ErbB4 adopts a tethered
conformation in the absence of ligand." Proc Natl Acad Sci U S A 102(42): 15024-9. Bruell, D., M. Stöcker, et al. (2003). "The recombinant anti-EGF receptor immunotoxin
425(scFv)-ETA' suppresses growth of a highly metastatic pancreatic carcinoma cell line." Int. J. Oncol. 23(4): 1179-86.
Burgess, A., H. Cho, et al. (2003). "An open-and-shut case? Recent insights into the
activation of EGF/ErbB receptors." Mol. Cell 12(3): 541-52. Caliceti, P. und F. M. Veronese (2003). "Pharmacokinetic and biodistribution properties of
poly(ethylene glycol)-protein conjugates." Adv Drug Deliv Rev 55(10): 1261-77. Cho, H. S. und D. J. Leahy (2002). "Structure of the extracellular region of HER3 reveals an
interdomain tether." Science 297(5585): 1330-3. Cho, H. S., K. Mason, et al. (2003). "Structure of the extracellular region of HER2 alone and
in complex with the Herceptin Fab." Nature 421(6924): 756-60. Chothia, C. und A. Lesk (1987). "Canonical structures for the hypervariable regions of
immunoglobulins." J Mol Biol 196(4): 901-17. Ciardiello, F., R. Caputo, et al. (2000). "Antitumor effect and potentiation of cytotoxic drugs
activity in human cancer cells by ZD-1839 (Iressa), an epidermal growth factor receptor-selective tyrosine kinase inhibitor." Clin Cancer Res 6(5): 2053-63.
Citri, A., I. Alroy, et al. (2002). "Drug-induced ubiquitylation and degradation of ErbB receptor
tyrosine kinases: implications for cancer therapy." EMBO J 21(10): 2407-17.
Referenzen
116
Citri, A., K. Skaria, et al. (2003). "The deaf and the dumb: the biology of ErbB-2 and ErbB-3." Exp. Cell Res. 284(1): 54-65.
Cunningham, D., Y. Humblet, et al. (2004). "Cetuximab monotherapy and cetuximab plus
irinotecan in irinotecan-refractory metastatic colorectal cancer." N Engl J Med 351(4): 337-45.
Dalken, B., U. Giesubel, et al. (2006). "Targeted induction of apoptosis by chimeric granzyme B fusion proteins carrying antibody and growth factor domains for cell recognition." Cell Death Differ 13(4): 576-85.
Daub, H., F. U. Weiss, et al. (1996). "Role of transactivation of the EGF receptor in signalling
by G-protein-coupled receptors." Nature 379(6565): 557-60. Davies, D. R., E. A. Padlan, et al. (1990). "Antibody-antigen complexes." Annu Rev Biochem
59: 439-73. Day, P. J., I. A. Murray, et al. (1995). "Properties of hybrid active sites in oligomeric proteins:
kinetic and ligand binding studies with chloramphenicol acetyltransferase trimers." Biochemistry 34(19): 6416-22.
de la Paz, P., B. J. Sutton, et al. (1986). "Modelling of the combining sites of three anti-
lysozyme monoclonal antibodies and of the complex between one of the antibodies and its epitope." EMBO J 5(2): 415-25.
DeNardo, S. J., Z. Yao, et al. (2003). "Effect of molecular size of pegylated peptide on the
pharmacokinetics and tumor targeting in lymphoma-bearing mice." Clin Cancer Res 9(10 Pt 2): 3854S-64S.
Di Fiore, P. P., J. H. Pierce, et al. (1987). "Overexpression of the human EGF receptor
confers an EGF-dependent transformed phenotype to NIH 3T3 cells." Cell 51(6): 1063-70.
Downward, J., Y. Yarden, et al. (1984). "Close similarity of epidermal growth factor receptor
and v-erb-B oncogene protein sequences." Nature 307(5951): 521-7. Duneau, J., A. Vegh, et al. (2007). "A dimerization hierarchy in the transmembrane domains
of the HER receptor family." Biochemistry 46(7): 2010-9. Egri, G. und A. Takats (2006). "Monoclonal antibodies in the treatment of lung cancer." Eur J
Surg Oncol 32(4): 385-94. Fehlhammer, H., M. Schiffer, et al. (1975). "The structure determination of the variable
portion of the Bence-Jones protein Au." Biophys Struct Mech 1(2): 139-46. Ferguson, K., M. Berger, et al. (2003). "EGF activates its receptor by removing interactions
that autoinhibit ectodomain dimerization." Mol. Cell 11(2): 507-17. Ferguson, K. M., M. B. Berger, et al. (2003). "EGF activates its receptor by removing
interactions that autoinhibit ectodomain dimerization." Mol Cell 11(2): 507-17. Garrett, T., N. McKern, et al. (2003). "The crystal structure of a truncated ErbB2 ectodomain
reveals an active conformation, poised to interact with other ErbB receptors." Mol. Cell 11(2): 495-505.
Referenzen
117
Garrett, T., N. McKern, et al. (2002). "Crystal structure of a truncated epidermal growth factor receptor extracellular domain bound to transforming growth factor alpha." Cell 110(6): 763-73.
Gill, G. N. und W. Weber (1987). "Purification of functionally active epidermal growth factor
receptor protein using a competitive antagonist monoclonal antibody and competitive elution with epidermal growth factor." Methods Enzymol 146: 82-8.
Graus-Porta, D., R. Beerli, et al. (1997). "ErbB-2, the preferred heterodimerization partner of
all ErbB receptors, is a mediator of lateral signaling." EMBO J. 16(7): 1647-55. Gullick, W. J. (1994). "A new model for the interaction of EGF-like ligands with their
receptors: the new one-two." Eur J Cancer 30A(14): 2186. Gunnarsdottir, S. und A. A. Elfarra (1999). "Glutathione-dependent metabolism of cis-3-(9H-
purin-6-ylthio)acrylic acid to yield the chemotherapeutic drug 6-mercaptopurine: evidence for two distinct mechanisms in rats." J Pharmacol Exp Ther 290(3): 950-7.
Hamilton, D. S., M. J. Kavarana, et al. (1999). "A new method for rapidly generating inhibitors
of glyoxalase I inside tumor cells using S-(N-aryl-N-hydroxycarbamoyl)ethylsulfoxides." J Med Chem 42(10): 1823-7.
Harari, D. und Y. Yarden (2000). "Molecular mechanisms underlying ErbB2/HER2 action in
breast cancer." Oncogene 19(53): 6102-14. Hartley, O. (2002). "The use of phage display in the study of receptors and their ligands." J
Recept Signal Transduct Res 22(1-4): 373-92. Hayes, J. D. und D. J. Pulford (1995). "The glutathione S-transferase supergene family:
regulation of GST and the contribution of the isoenzymes to cancer chemoprotection and drug resistance." Crit Rev Biochem Mol Biol 30(6): 445-600.
Hayes, J. D. und R. C. Strange (1995). "Potential contribution of the glutathione S-
transferase supergene family to resistance to oxidative stress." Free Radic Res 22(3): 193-207.
Hecky, J. und K. M. Müller (2005). "Structural perturbation and compensation by directed
evolution at physiological temperature leads to thermostabilization of beta-lactamase." Biochemistry 44(38): 12640-54.
Heppeler, A., S. Froidevaux, et al. (2000). "Receptor targeting for tumor localisation and
therapy with radiopeptides." Curr Med Chem 7(9): 971-94. Hetenyi, C., T. Kortvelyesi, et al. (2002). "Mapping of possible binding sequences of two
beta-sheet breaker peptides on beta amyloid peptide of Alzheimer's disease." Bioorg Med Chem 10(5): 1587-93.
Hetenyi, C. und D. van der Spoel (2002). "Efficient docking of peptides to proteins without
prior knowledge of the binding site." Protein Sci 11(7): 1729-37. Houimel, M., P. Schneider, et al. (2001). "Selection of peptides and synthesis of pentameric
peptabody molecules reacting specifically with ErbB-2 receptor." Int J Cancer 92(5): 748-55.
Referenzen
118
Humphrey, P. A., A. J. Wong, et al. (1990). "Anti-synthetic peptide antibody reacting at the fusion junction of deletion-mutant epidermal growth factor receptors in human glioblastoma." Proc Natl Acad Sci U S A 87(11): 4207-11.
J. R. Hecht, A. P., I. Malik, A. Venook, J. Berlin, G. Croghan, B. L. Wiens, S. Visonneau, S.
Jerian, N. J. Meropol (2004). "ABX-EGF monotherapy in patients (pts) with metastatic colorectal cancer (mCRC): An updated analysis." Proc Am Soc Clin Oncol 23: 248.
Kabat, E. A. (1978). "The structural basis of antibody complementarity." Adv Protein Chem
32: 1-75. Kabat, E. A., T. T. Wu, et al. (1977). "Unusual distributions of amino acids in
complementarity-determining (hypervariable) segments of heavy and light chains of immunoglobulins and their possible roles in specificity of antibody-combining sites." J Biol Chem 252(19): 6609-16.
Karasseva, N. G., V. V. Glinsky, et al. (2002). "Identification and characterization of peptides
that bind human ErbB-2 selected from a bacteriophage display library." J Protein Chem 21(4): 287-96.
Kleanthous, C., P. M. Cullis, et al. (1985). "3-(Bromoacetyl)chloramphenicol, an active site
directed inhibitor for chloramphenicol acetyltransferase." Biochemistry 24(20): 5307-13.
Kolonin, M. G., L. Bover, et al. (2006). "Ligand-directed surface profiling of human cancer
cells with combinatorial peptide libraries." Cancer Res 66(1): 34-40. Kolonin, M. G., J. Sun, et al. (2006). "Synchronous selection of homing peptides for multiple
tissues by in vivo phage display." FASEB J 20(7): 979-81. Kortt, A., O. Dolezal, et al. (2001). "Dimeric and trimeric antibodies: high avidity scFvs for
cancer targeting." Biomol Eng 18(3): 95-108. Kreitman, R. J. (2001). "Chimeric fusion proteins--Pseudomonas exotoxin-based." Curr Opin
Investig Drugs 2(9): 1282-93. Lax, I., W. H. Burgess, et al. (1988). "Localization of a major receptor-binding domain for
epidermal growth factor by affinity labeling." Mol Cell Biol 8(4): 1831-4. Lax, I., A. Johnson, et al. (1988). "Chicken epidermal growth factor (EGF) receptor: cDNA
cloning, expression in mouse cells, and differential binding of EGF and transforming growth factor alpha." Mol Cell Biol 8(5): 1970-8.
Lemmon, M. A., Z. Bu, et al. (1997). "Two EGF molecules contribute additively to
stabilization of the EGFR dimer." Embo J 16(2): 281-94. Li, Z., R. Zhao, et al. (2005). "Identification and characterization of a novel peptide ligand of
epidermal growth factor receptor for targeted delivery of therapeutics." Faseb J 19(14): 1978-85.
Lynch, T. J., D. W. Bell, et al. (2004). "Activating mutations in the epidermal growth factor
receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib." N Engl J Med 350(21): 2129-39.
Lyttle, M. H., A. Satyam, et al. (1994). "Glutathione-S-transferase activates novel alkylating
agents." J Med Chem 37(10): 1501-7.
Referenzen
119
MacCallum, R. M., A. C. Martin, et al. (1996). "Antibody-antigen interactions: contact analysis
and binding site topography." J Mol Biol 262(5): 732-45. Mann, G. B., K. J. Fowler, et al. (1993). "Mice with a null mutation of the TGF alpha gene
have abnormal skin architecture, wavy hair, and curly whiskers and often develop corneal inflammation." Cell 73(2): 249-61.
Matar, P., F. Rojo, et al. (2004). "Combined epidermal growth factor receptor targeting with
the tyrosine kinase inhibitor gefitinib (ZD1839) and the monoclonal antibody cetuximab (IMC-C225): superiority over single-agent receptor targeting." Clin. Cancer Res. 10(19): 6487-501.
Mayes, E. L. und M. D. Waterfield (1984). "Biosynthesis of the epidermal growth factor
receptor in A431 cells." Embo J 3(3): 531-7. Mendelsohn, J. und J. Baselga (2006). "Epidermal growth factor receptor targeting in
cancer." Semin Oncol 33(4): 369-85. Miettinen, P. J., J. E. Berger, et al. (1995). "Epithelial immaturity and multiorgan failure in
mice lacking epidermal growth factor receptor." Nature 376(6538): 337-41. Minsky, M. (1988). "Memoir on inventing the confocal scanning microskope." Scanning 10:
128-138. Morris, G., D. Goodsell, et al. (1998). "Automated docking using a Lamarckian genetic
algorithm and an empirical binding free energy function." Journal of Computational Chemistry 19(14): 1639-1662.
Morris, J. K., W. Lin, et al. (1999). "Rescue of the cardiac defect in ErbB2 mutant mice
reveals essential roles of ErbB2 in peripheral nervous system development." Neuron 23(2): 273-83.
Murthy, U., A. Basu, et al. (1987). "Binding of an antagonistic monoclonal antibody to an
intact and fragmented EGF-receptor polypeptide." Arch Biochem Biophys 252(2): 549-60.
Novak, H., R. Noy, et al. (2006). "Selective antibody-mediated targeting of class I MHC to
EGFR-expressing tumor cells induces potent antitumor CTL activity in vitro and in vivo." Int. J. Cancer 120(2): 329-36.
Novak, H., R. Noy, et al. (2007). "Selective antibody-mediated targeting of class I MHC to
EGFR-expressing tumor cells induces potent antitumor CTL activity in vitro and in vivo." Int J Cancer 120(2): 329-36.
Ogiso, H., R. Ishitani, et al. (2002). "Crystal structure of the complex of human epidermal
growth factor and receptor extracellular domains." Cell 110(6): 775-87. Ohgaki, H., P. Dessen, et al. (2004). "Genetic pathways to glioblastoma: a population-based
study." Cancer Res 64(19): 6892-9. Pacifici, G. M., M. Franchi, et al. (1988). "Tissue distribution of drug-metabolizing enzymes in
humans." Xenobiotica 18(7): 849-56. Pacifici, G. M., M. Franchi, et al. (1988). "Glutathione S-transferase in humans: development
and tissue distribution." Arch Toxicol 61(4): 265-9.
Referenzen
120
Pack, P., K. Müller, et al. (1995). "Tetravalent miniantibodies with high avidity assembling in
Escherichia coli." J Mol Biol 246(1): 28-34. Padlan, E. A. (1977). "Structural basis for the specificity of antibody-antigen reactions and
structural mechanisms for the diversification of antigen-binding specificities." Q Rev Biophys 10(1): 35-65.
Padlan, E. A. (1977). "Structural implications of sequence variability in immunoglobulins."
Proc Natl Acad Sci U S A 74(6): 2551-5. Padlan, E. A. (1994). "Anatomy of the antibody molecule." Mol Immunol 31(3): 169-217. Padlan, E. A. und D. R. Davies (1975). "Variability of three-dimensional structure in
immunoglobulins." Proc Natl Acad Sci U S A 72(3): 819-23. Padlan, E. A., D. R. Davies, et al. (1977). "Model-building studies of antigen-binding sites:
the hapten-binding site of mopc-315." Cold Spring Harb Symp Quant Biol 41 Pt 2: 627-37.
Pao, W., V. A. Miller, et al. (2005). "Acquired resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib
or erlotinib is associated with a second mutation in the EGFR kinase domain." PLoS Med 2(3): e73.
Park, B. W., H. T. Zhang, et al. (2000). "Rationally designed anti-HER2/neu peptide mimetic
disables P185HER2/neu tyrosine kinases in vitro and in vivo." Nat Biotechnol 18(2): 194-8.
Pisabarro, M. T., L. Serrano, et al. (1998). "Crystal structure of the abl-SH3 domain
complexed with a designed high-affinity peptide ligand: implications for SH3-ligand interactions." J Mol Biol 281(3): 513-21.
Poirot, O., E. O'Toole, et al. (2003). "Tcoffee@igs: A web server for computing, evaluating
and combining multiple sequence alignments." Nucleic Acids Res 31(13): 3503-6. R. Salazar, J. T., F. Rojo, E. Jimenez, I. Montaner, E. Casado, G. Sala, J. Tillner, R. Malik, J.
Baselga (2004). "Dose-dependent inhibition of the EGFR and signalling pathways with the anti-EGFR monoclonal antibody (MAb) EMD 72000 administered every three weeks (q3w). A phase I pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) study to define the optimal biological dose (OBD)." Proc Am Soc Clin Oncol 22(14S): 127.
Reuter, C., M. Morgan, et al. (2007). "Targeting EGF-receptor-signalling in squamous cell
carcinomas of the head and neck." Br. J. Cancer 96(3): 408-16. Rodeck, U., M. Herlyn, et al. (1987). "Tumor growth modulation by a monoclonal antibody to
the epidermal growth factor receptor: immunologically mediated and effector cell-independent effects." Cancer Res 47(14): 3692-6.
Rodeck, U., M. Herlyn, et al. (1987). "Interactions between growth factor receptors and
corresponding monoclonal antibodies in human tumors." J Cell Biochem 35(4): 315-20.
Rodeck, U., N. Williams, et al. (1990). "Monoclonal antibody 425 inhibits growth stimulation of carcinoma cells by exogenous EGF and tumor-derived EGF/TGF-alpha." J Cell Biochem 44(2): 69-79.
Referenzen
121
Rooseboom, M., J. N. Commandeur, et al. (2004). "Enzyme-catalyzed activation of anticancer prodrugs." Pharmacol Rev 56(1): 53-102.
Rubin, B. P. und A. Duensing (2006). "Mechanisms of resistance to small molecule kinase
inhibition in the treatment of solid tumors." Lab Invest 86(10): 981-6. Satyam, A., M. D. Hocker, et al. (1996). "Design, synthesis, and evaluation of latent
alkylating agents activated by glutathione S-transferase." J Med Chem 39(8): 1736-47.
Schmiedel, J., A. Blaukat, et al. (2008). "Matuzumab binding to EGFR prevents the
conformational rearrangement required for dimerization." Cancer Cell 13(4): 365-73. Schwarz, S., C. Kehrenberg, et al. (2004). "Molecular basis of bacterial resistance to
chloramphenicol and florfenicol." FEMS Microbiol Rev 28(5): 519-42. Sergeeva, A., M. G. Kolonin, et al. (2006). "Display technologies: application for the
discovery of drug and gene delivery agents." Adv Drug Deliv Rev 58(15): 1622-54. Sharma, S. K., K. D. Bagshawe, et al. (2005). "Advances in antibody-directed enzyme
prodrug therapy." Curr Opin Investig Drugs 6(6): 611-5. Sibilia, M., J. P. Steinbach, et al. (1998). "A strain-independent postnatal neurodegeneration
in mice lacking the EGF receptor." Embo J 17(3): 719-31. Smaill, J. B., G. W. Rewcastle, et al. (2000). "Tyrosine kinase inhibitors. 17. Irreversible
inhibitors of the epidermal growth factor receptor: 4-(phenylamino)quinazoline- and 4-(phenylamino)pyrido[3,2-d]pyrimidine-6-acrylamides bearing additional solubilizing functions." J Med Chem 43(7): 1380-97.
Smith, G. P. (1985). "Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned
antigens on the virion surface." Science 228(4705): 1315-7. Smothers, J. F., S. Henikoff, et al. (2002). "Tech.Sight. Phage display. Affinity selection from
biological libraries." Science 298(5593): 621-2. Stenberg, E., B. Persson, et al. (1991). "Quantitative determination of surface concentration
of protein with surface plasmon resonance using radiolabeled proteins." Journal of Colloid and Interface Science 143(2): 513-526.
Sunada, H., B. E. Magun, et al. (1986). "Monoclonal antibody against epidermal growth
factor receptor is internalized without stimulating receptor phosphorylation." Proc Natl Acad Sci U S A 83(11): 3825-9.
Sunpaweravong, P., S. Sunpaweravong, et al. (2005). "Epidermal growth factor receptor and
cyclin D1 are independently amplified and overexpressed in esophageal squamous cell carcinoma." J. Cancer Res. Clin. Oncol. 131(2): 111-9.
Tew, K. D., A. Monks, et al. (1996). "Glutathione-associated enzymes in the human cell lines
of the National Cancer Institute Drug Screening Program." Mol Pharmacol 50(1): 149-59.
Thatcher, N., A. Chang, et al. (2005). "Gefitinib plus best supportive care in previously treated patients with refractory advanced non-small-cell lung cancer: results from a randomised, placebo-controlled, multicentre study (Iressa Survival Evaluation in Lung Cancer)." Lancet 366(9496): 1527-37.
Referenzen
122
Threadgill, D. W., A. A. Dlugosz, et al. (1995). "Targeted disruption of mouse EGF receptor: effect of genetic background on mutant phenotype." Science 269(5221): 230-4.
Tzahar, E., R. Pinkas-Kramarski, et al. (1997). "Bivalence of EGF-like ligands drives the
ErbB signaling network." Embo J 16(16): 4938-50. Ullrich, A., L. Coussens, et al. (1984). "Human epidermal growth factor receptor cDNA
sequence and aberrant expression of the amplified gene in A431 epidermoid carcinoma cells." Nature 309(5967): 418-25.
Vanhoefer, U., M. Tewes, et al. (2004). "Phase I study of the humanized antiepidermal
growth factor receptor monoclonal antibody EMD72000 in patients with advanced solid tumors that express the epidermal growth factor receptor." J Clin Oncol 22(1): 175-84.
Weber, P. C., D. H. Ohlendorf, et al. (1989). "Structural origins of high-affinity biotin binding
to streptavidin." Science 243(4887): 85-8. Weber, P. C., M. W. Pantoliano, et al. (1992). "Crystal structure and ligand-binding studies of
a screened peptide complexed with streptavidin." Biochemistry 31(39): 9350-4. Weber, W., G. N. Gill, et al. (1984). "Production of an epidermal growth factor receptor-
related protein." Science 224(4646): 294-7. Werle, M. und A. Bernkop-Schnurch (2006). "Strategies to improve plasma half life time of
peptide and protein drugs." Amino Acids 30(4): 351-67. Wheeler, D. L., S. Huang, et al. (2008). "Mechanisms of acquired resistance to cetuximab:
role of HER (ErbB) family members." Oncogene. Woldeyesus, M. T., S. Britsch, et al. (1999). "Peripheral nervous system defects in erbB2
mutants following genetic rescue of heart development." Genes Dev 13(19): 2538-48. Würdinger, T., M. Verheije, et al. (2005). "Soluble receptor-mediated targeting of mouse
hepatitis coronavirus to the human epidermal growth factor receptor." J. Virol. 79(24): 15314-22.
Yamazaki, H., Y. Ohba, et al. (1990). "A deletion mutation within the ligand binding domain is
responsible for activation of epidermal growth factor receptor gene in human brain tumors." Jpn J Cancer Res 81(8): 773-9.
Yarden, Y. und M. X. Sliwkowski (2001). "Untangling the ErbB signalling network." Nat Rev
Mol Cell Biol 2(2): 127-37.
Anhang
123
9 Anhang
9.1 Abkürzungen Abb. Abbildung
ABTS 2,2’-Azino-di-3-Ethylbenzthiazolin-Sulfonat
Amp Ampicillin
APS Ammoniumperoxodisulfat
AS Aminosäure
ATP Adenosintriphosphat
Bla β-Lactamase-Protein
bla β-Lactamase-Gen
Bp Basenpaare
BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumine)
CAT Chloramphenicol-Acetyltransferase-Protein
cat Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen
Da Dalton
DAPI 4,6’-Diamidino-2-phenylindol
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
DNase Desoxyribonuklease
dNTPs Desoxyribonukleotidtriphosphate
dsDNA doppelsträngige DNA
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EGF epidermaler-Wachstumsfaktor
EGF-R epidermaler-Wachstumsfaktor-Rezeptor
sEGF-R lösliche, sekretierte Variante des EGF-R
Ax Absorption bei x nm
EtBr Ethidiumbromid
FKS Fetales Kälberserum (fetal calf serum)
FITC Fluorescein-5-Isothiocyanat
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
ITS Insulin Transferrin Selenium
× g Mehrfaches der Gravitation
Anhang
124
KOAc Kaliumacetat
LB Luria-Bertani
Lsg. Lösung
M Molar (mol/l)
MOPS 3-Morpholinopropansulfonsäure
OD Optische Dichte
PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction)
PP Polypropylen
RNA Ribonukleinsäure
RNase Ribonuklease
RT Raumtemperatur (etwa 25 °C)
SDS Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate)
TBE Tris-Borat-EDTA
TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin
TFB Transformationspuffer (transformation buffer)
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
UPM Umdrehungen pro Minute
u Unit
v/v Volumen pro Volumen (volume per volume)
w/v Gewicht pro Volumen (weight per volume)
wt Wildtyp
Anhang
125
9.2 Plasmidkarten
M13KE_SmaI:
(Circular) (MinSite=6) MAP of: M13ke_SmaI.seq check: 5466 from: 1 to: 7238
M13KE VECTOR CONTAINING A NEWLY DESIGNED OLIGO (NOT INGKES)
TO INTRODUCE SmaI SITE INTO Acc65I and EagI opened M13KE
Vector contains NO Cys flanking the SmaI site
Using Enzyme data from: ~/../gcg_data/kk_annot_rebase.txt FileCheck: 6152
REBASE version 305 gcgenz.305
=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=
REBASE, The Restriction Enzyme Database http://rebase.neb.com
Copyright (c) Dr. Richard J. Roberts, 2003. All rights reserved.
=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=
Rich Roberts Apr 30 2003 . . .
Using translation scheme from: ~/../gcg_data/kk_translate1.txt FileCheck: 3604
met atg and val gtg as start codon modified by K. Mueller
Standard Translation Table
With 390 enzymes: *
MinOpen: 25 MaxCuts: 2
April 12, 19107 11:57 ..
AATGCTACTACTATTAGTAGAATTGATGCCACCTTTTCAGCTCGCGCCCCAAATGAAAATATAGCTAAACAGGTTATTGACCATTTGCGAAATGTATCTA
1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 100
a N A T T I S R I D A T F S A R A P N E N I A K Q V I D H L R N V S N -
ATGGTCAAACTAAATCTACTCGTTCGCAGAATTGGGAATCAACTGTTACATGGAATGAAACTTCCAGACACCGTACTTTAGTTGCATATTTAAAACATGT
101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 200
a G Q T K S T R S Q N W E S T V T W N E T S R H R T L V A Y L K H V -
TGAGCTACAGCACCAGATTCAGCAATTAAGCTCTAAGCCATCCGCAAAAATGACCTCTTATCAAAAGGAGCAATTAAAGGTACTCTCTAATCCTGACCTG
201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300
a E L Q H Q I Q Q L S S K P S A K M T S Y Q K E Q L K V L S N P D L -
XmnI
|
TTGGAGTTTGCTTCCGGTCTGGTTCGCTTTGAAGCTCGAATTAAAACGCGATATTTGAAGTCTTTCGGGCTTCCTCTTAATCTTTTTGATGCAATCCGCT
301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 400
a L E F A S G L V R F E A R I K T R Y L K S F G L P L N L F D A I R F -
TTGCTTCTGACTATAATAGTCAGGGTAAAGACCTGATTTTTGATTTATGGTCATTCTCGTTTTCTGAACTGTTTAAAGCATTTGAGGGGGATTCAATGAA
401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 500
a A S D Y N S Q G K D L I F D L W S F S F S E L F K A F E G D S M N -
TATTTATGACGATTCCGCAGTATTGGACGCTATCCAGTCTAAACATTTTACTATTACCCCCTCTGGCAAAACTTCTTTTGCAAAAGCCTCTCGCTATTTT
501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600
a I Y D D S A V L D A I Q S K H F T I T P S G K T S F A K A S R Y F -
GGTTTTTATCGTCGTCTGGTAAACGAGGGTTATGATAGTGTTGCTCTTACTATGCCTCGTAATTCCTTTTGGCGTTATGTATCTGCATTAGTTGAATGTG
601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 700
a G F Y R R L V N E G Y D S V A L T M P R N S F W R Y V S A L V E C G -
GTATTCCTAAATCTCAACTGATGAATCTTTCTACCTGTAATAATGTTGTTCCGTTAGTTCGTTTTATTAACGTAGATTTTTCTTCCCAACGTCCTGACTG
701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 800
a I P K S Q L M N L S T C N N V V P L V R F I N V D F S S Q R P D W -
GTATAATGAGCCAGTTCTTAAAATCGCATAAGGTAATTCACAATGATTAAAGTTGAAATTAAACCATCTCAAGCCCAATTTACTACTCGTTCTGGTGTTT
801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900
a Y N E P V L K I A * -
CTCGTCAGGGCAAGCCTTATTCACTGAATGAGCAGCTTTGTTACGTTGATTTGGGTAATGAATATCCGGTTCTTGTCAAGATTACTCTTGATGAAGGTCA
901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1000
a M S S F V T L I W V M N I R F L S R L L L M K V S -
BsrGI
|
GCCAGCCTATGCGCCTGGTCTGTACACCGTTCATCTGTCCTCTTTCAAAGTTGGTCAGTTCGGTTCCCTTATGATTGACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCT
1001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1100
a Q P M R L V C T P F I C P L S K L V S S V P L * -
BsaBI
|
AAGTAACATGGAGCAGGTCGCGGATTTCGACACAATTTATCAGGCGATGATACAAATCTCCGTTGTACTTTGTTTCGCGCTTGGTATAATCGCTGGGGGT
1101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200
a M E Q V A D F D T I Y Q A M I Q I S V V L C F A L G I I A G G -
Anhang
126
SnaBI BspHI
| |
CAAAGATGAGTGTTTTAGTGTATTCTTTCGCCTCTTTCGTTTTAGGTTGGTGCCTTCGTAGTGGCATTACGTATTTTACCCGTTTAATGGAAACTTCCTC
1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1300
a Q R * -
BbvCI
|
ATGAAAAAGTCTTTAGTCCTCAAAGCCTCTGTAGCCGTTGCTACCCTCGTTCCGATGCTGTCTTTCGCTGCTGAGGGTGACGATCCCGCAAAAGCGGCCT
1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400
a -
BbvCI
|
TTAACTCCCTGCAAGCCTCAGCGACCGAATATATCGGTTATGCGTGGGCGATGGTTGTTGTCATTGTCGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTGTTTAAGAA
1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500
a -
ATTCACCTCGAAAGCAAGCTGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAA
1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1600
a V K K L L F A I -
SmaI
KpnI AvaI |
Acc65I | XmaI | EagI
| | | | |
TTCCTTTAGTGgtacctttctattctcactctgcccccgggggatcGGCCGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAATCCCATACAGAAAATTCATTTAC
1601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1700
a P L V V P F Y S H S A P G G S A E T V E S C L A K S H T E N S F T -
BsmI
|
TAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGATCGTTACGCTAACTATGAGGGTTGTCTGTGGAATGCTACAGGCGTTGTAGTTTGTACTGGTGACGAAACT
1701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800
a N V W K D D K T L D R Y A N Y E G C L W N A T G V V V C T G D E T -
CAGTGTTACGGTACATGGGTTCCTATTGGGCTTGCTATCCCTGAAAATGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTG
1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1900
a Q C Y G T W V P I G L A I P E N E G G G S E G G G S E G G G S E G G -
EciI
|
GCGGTACTAAACCTCCTGAGTACGGTGATACACCTATTCCGGGCTATACTTATATCAACCCTCTCGACGGCACTTATCCGCCTGGTACTGAGCAAAACCC
1901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2000
a G T K P P E Y G D T P I P G Y T Y I N P L D G T Y P P G T E Q N P -
BseRI
|
CGCTAATCCTAATCCTTCTCTTGAGGAGTCTCAGCCTCTTAATACTTTCATGTTTCAGAATAATAGGTTCCGAAATAGGCAGGGGGCATTAACTGTTTAT
2001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100
a A N P N P S L E E S Q P L N T F M F Q N N R F R N R Q G A L T V Y -
Bme1580I
|
ACGGGCACTGTTACTCAAGGCACTGACCCCGTTAAAACTTATTACCAGTACACTCCTGTATCATCAAAAGCCATGTATGACGCTTACTGGAACGGTAAAT
2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2200
a T G T V T Q G T D P V K T Y Y Q Y T P V S S K A M Y D A Y W N G K F -
AlwNI BstYI
| |
TCAGAGACTGCGCTTTCCATTCTGGCTTTAATGAAGATCCATTCGTTTGTGAATATCAAGGCCAATCGTCTGACCTGCCTCAACCTCCTGTCAATGCTGG
2201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2300
a R D C A F H S G F N E D P F V C E Y Q G Q S S D L P Q P P V N A G -
CGGCGGCTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGCGGCTCTGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGCTCTGAGGGAGGCGGTTCCGGTGGT
2301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400
a G G S G G G S G G G S E G G G S E G G G S E G G G S E G G G S G G -
GGCTCTGGTTCCGGTGATTTTGATTATGAAAAGATGGCAAACGCTAATAAGGGGGCTATGACCGAAAATGCCGATGAAAACGCGCTACAGTCTGACGCTA
2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2500
a G S G S G D F D Y E K M A N A N K G A M T E N A D E N A L Q S D A K -
FalI ClaI
| |
AAGGCAAACTTGATTCTGTCGCTACTGATTACGGTGCTGCTATCGATGGTTTCATTGGTGACGTTTCCGGCCTTGCTAATGGTAATGGTGCTACTGGTGA
2501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2600
a G K L D S V A T D Y G A A I D G F I G D V S G L A N G N G A T G D -
XmnI
|
TTTTGCTGGCTCTAATTCCCAAATGGCTCAAGTCGGTGACGGTGATAATTCACCTTTAATGAATAATTTCCGTCAATATTTACCTTCCCTCCCTCAATCG
2601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700
a F A G S N S Q M A Q V G D G D N S P L M N N F R Q Y L P S L P Q S -
Anhang
127
AfeI BtgI
| |
GTTGAATGTCGCCCTTTTGTCTTTAGCGCTGGTAAACCATATGAATTTTCTATTGATTGTGACAAAATAAACTTATTCCGTGGTGTCTTTGCGTTTCTTT
2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2800
a V E C R P F V F S A G K P Y E F S I D C D K I N L F R G V F A F L L -
MslI
|
TATATGTTGCCACCTTTATGTATGTATTTTCTACGTTTGCTAACATACTGCGTAATAAGGAGTCTTAATCATGCCAGTTCTTTTGGGTATTCCGTTATTA
2801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2900
a Y V A T F M Y V F S T F A N I L R N K E S * -
TTGCGTTTCCTCGGTTTCCTTCTGGTAACTTTGTTCGGCTATCTGCTTACTTTTCTTAAAAAGGGCTTCGGTAAGATAGCTATTGCTATTTCATTGTTTC
2901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000
a -
CspCI CspCI AfeI
| | |
TTGCTCTTATTATTGGGCTTAACTCAATTCTTGTGGGTTATCTCTCTGATATTAGCGCTCAATTACCCTCTGACTTTGTTCAGGGTGTTCAGTTAATTCT
3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3100
a -
CCCGTCTAATGCGCTTCCCTGTTTTTATGTTATTCTCTCTGTAAAGGCTGCTATTTTCATTTTTGACGTTAAACAAAAAATCGTTTCTTATTTGGATTGG
3101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3200
a -
TaqII
|
GATAAATAATATGGCTGTTTATTTTGTAACTGGCAAATTAGGCTCTGGAAAGACGCTCGTTAGCGTTGGTAAGATTCAGGATAAAATTGTAGCTGGGTGC
3201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300
a M A V Y F V T G K L G S G K T L V S V G K I Q D K I V A G C -
AAAATAGCAACTAATCTTGATTTAAGGCTTCAAAACCTCCCGCAAGTCGGGAGGTTCGCTAAAACGCCTCGCGTTCTTAGAATACCGGATAAGCCTTCTA
3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3400
a K I A T N L D L R L Q N L P Q V G R F A K T P R V L R I P D K P S I -
TATCTGATTTGCTTGCTATTGGGCGCGGTAATGATTCCTACGATGAAAATAAAAACGGCTTGCTTGTTCTCGATGAGTGCGGTACTTGGTTTAATACCCG
3401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3500
a S D L L A I G R G N D S Y D E N K N G L L V L D E C G T W F N T R -
TTCTTGGAATGATAAGGAAAGACAGCCGATTATTGATTGGTTTCTACATGCTCGTAAATTAGGATGGGATATTATTTTTCTTGTTCAGGACTTATCTATT
3501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3600
a S W N D K E R Q P I I D W F L H A R K L G W D I I F L V Q D L S I -
GTTGATAAACAGGCGCGTTCTGCATTAGCTGAACATGTTGTTTATTGTCGTCGTCTGGACAGAATTACTTTACCTTTTGTCGGTACTTTATATTCTCTTA
3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3700
a V D K Q A R S A L A E H V V Y C R R L D R I T L P F V G T L Y S L I -
TTACTGGCTCGAAAATGCCTCTGCCTAAATTACATGTTGGCGTTGTTAAATATGGCGATTCTCAATTAAGCCCTACTGTTGAGCGTTGGCTTTATACTGG
3701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3800
a T G S K M P L P K L H V G V V K Y G D S Q L S P T V E R W L Y T G -
TAAGAATTTGTATAACGCATATGATACTAAACAGGCTTTTTCTAGTAATTATGATTCCGGTGTTTATTCTTATTTAACGCCTTATTTATCACACGGTCGG
3801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3900
a K N L Y N A Y D T K Q A F S S N Y D S G V Y S Y L T P Y L S H G R -
BsaBI
|
TATTTCAAACCATTAAATTTAGGTCAGAAGATGAAATTAACTAAAATATATTTGAAAAAGTTTTCTCGCGTTCTTTGTCTTGCGATTGGATTTGCATCAG
3901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4000
a Y F K P L N L G Q K M K L T K I Y L K K F S R V L C L A I G F A S A -
TATA_box->
TATA_box-> | EarI
| | |
CATTTACATATAGTTATATAACCCAACCTAAGCCGGAGGTTAAAAAGGTAGTCTCTCAGACCTATGATTTTGATAAATTCACTATTGACTCTTCTCAGCG
4001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4100
a F T Y S Y I T Q P K P E V K K V V S Q T Y D F D K F T I D S S Q R -
PacI
|
TCTTAATCTAAGCTATCGCTATGTTTTCAAGGATTCTAAGGGAAAATTAATTAATAGCGACGATTTACAGAAGCAAGGTTATTCACTCACATATATTGAT
4101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4200
a L N L S Y R Y V F K D S K G K L I N S D D L Q K Q G Y S L T Y I D -
TTATGTACTGTTTCCATTAAAAAAGGTAATTCAAATGAAATTGTTAAATGTAATTAATTTTGTTTTCTTGATGTTTGTTTCATCATCTTCTTTTGCTCAG
4201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4300
a L C T V S I K K G N S N E I V K C N * -
GTAATTGAAATGAATAATTCGCCTCTGCGCGATTTTGTAACTTGGTATTCAAAGCAATCAGGCGAATCCGTTATTGTTTCTCCCGATGTAAAAGGTACTG
4301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4400
a -
Anhang
128
TTACTGTATATTCATCTGACGTTAAACCTGAAAATCTACGCAATTTCTTTATTTCTGTTTTACGTGCTAATAATTTTGATATGGTTGGTTCAATTCCTTC
4401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4500
a -
CATAATTCAGAAGTATAATCCAAACAATCAGGATTATATTGATGAATTGCCATCATCTGATAATCAGGAATATGATGATAATTCCGCTCCTTCTGGTGGT
4501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4600
a -
AclI
|
TTCTTTGTTCCGCAAAATGATAATGTTACTCAAACTTTTAAAATTAATAACGTTCGGGCAAAGGATTTAATACGAGTTGTCGAATTGTTTGTAAAGTCTA
4601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4700
a -
Bme1580I
BsiHKAI
ApaLI |
| |
ATACTTCTAAATCCTCAAATGTATTATCTATTGACGGCTCTAATCTATTAGTTGTTAGTGCACCTAAAGATATTTTAGATAACCTTCCTCAATTCCTTTC
4701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4800
a -
AlfI
|
TACTGTTGATTTGCCAACTGACCAGATATTGATTGAGGGTTTGATATTTGAGGTTCAGCAAGGTGATGCTTTAGATTTTTCATTTGCTGCTGGCTCTCAG
4801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4900
a -
CGTGGCACTGTTGCAGGCGGTGTTAATACTGACCGCCTCACCTCTGTTTTATCTTCTGCTGGTGGTTCGTTCGGTATTTTTAATGGCGATGTTTTAGGGC
4901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5000
a -
MscI
|
TATCAGTTCGCGCATTAAAGACTAATAGCCATTCAAAAATATTGTCTGTGCCACGTATTCTTACGCTTTCAGGTCAGAAGGGTTCTATCTCTGTTGGCCA
5001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5100
a -
Tzip->
|
GAATGTCCCTTTTATTACTGGTCGTGTGACTGGTGAATCTGCCAATGTAAATAATCCATTTCAGACGATTGAGCGTCAAAATGTAGGTATTTCCATGAGC
5101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5200
a -
GTTTTTCCTGTTGCAATGGCTGGCGGTAATATTGTTCTGGATATTACCAGCAAGGCCGATAGTTTGAGTTCTTCTACTCAGGCAAGTGATGTTATTACTA
5201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5300
a -
PsiI
|
ATCAAAGAAGTATTGCTACAACGGTTAATTTGCGTGATGGACAGACTCTTTTACTCGGTGGCCTCACTGATTATAAAAACACTTCTCAAGATTCTGGCGT
5301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5400
a -
BsiHKAI
|
ACCGTTCCTGTCTAAAATCCCTTTAATCGGCCTCCTGTTTAGCTCCCGCTCTGATTCCAACGAGGAAAGCACGTTATACGTGCTCGTCAAAGCAACCATA
5401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5500
a -
f1-ori-|
f1ori_IG5'|
||
GTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCT
5501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5600
a -
f1ori_DNA5'
NaeI |
BsrFI | |
NgoMIV | | BanII
| | | |
TTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCG
5601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5700
a V L Y G T S -
AloI
PpiI
TaqII DraIII f1ori_DNA3' | DrdI
| | | | |
ACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAG
5701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5800
a T P K N L I W V M V H V V G H R P D R R F F A L * V -
Anhang
129
AloI
PpiI AvaI PsiI
| | |
TGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGAACCACCATCAAACAGG
5801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5900
a D S C S K L E Q H S T L S R A I L L I Y K G F C R F R N H H Q T G -
BsmBI
|
ATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCGCTGGTGAA
5901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6000
a F S P A G A N Q R G P L A A T L S G P G G E G Q S A V A R L A G E -
BbeI
SfoI |
BsaHI| |
NarI| |
KasI|| |
||| |
AAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGC
6001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6100
a K K N H P G A Q Y A N R L S P R V G R F I N A A G T T G F P T G K R -
lacO1->
mRNA_lac->
-35lac-| -10lac-| |
lacI-|BtsI CAP-> CAP-| -35lac-> | -10lac-> | |
| | | | | | | | |
GGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTG
6101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6200
a A V S A T Q L M * -
EcoO109I
PpuMI
PstI|
lacO1-| S/DI-> lacZ'-> HindIII SphI SbfI| EcoRI
| | | | | || |
AGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGT
6201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6300
a M T M I T P S L H A C R S S N S L A V V L Q R -
BmrI EarI PvuI
| | |
CGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCC
6301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6400
a R D W E N P G V T Q L N R L A A H P P F A S W R N S E E A R T D R P -
FspI BglI Bsu36I
| | |
CTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGA
6401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6500
a S Q Q L R S L N G E W R F A W F P A P E A V P E S W L E C D L P E -
BpmI
Eco57MI EciI TstI
| | |
GGCCGATACGGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTAACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTT
6501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6600
a A D T V V V P S N W Q M H G Y D A P I Y T N V T Y P I T V N P P F -
BtgI TstI
| |
GTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTTC
6601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6700
a V P T E N P T G C Y S L T F N V D E S W L Q E G Q T R I I F D G V P -
f1ori_IG3'
AclI SwaI
| |
CTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTAAATATTTGCTTATACAATCTTCCTG
6701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6800
a I G * -
BpmI
Eco57MI
ClaI|
||
TTTTTGGGGCTTTTCTGATTATCAACCGGGGTACATATGATTGACATGCTAGTTTTACGATTACCGTTCATCGATTCTCTTGTTTGCTCCAGACTCTCAG
6801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 6900
a -
BglII
BstYI MslI
| |
GCAATGACCTGATAGCCTTTGTAGATCTCTCAAAAATAGCTACCCTCTCCGGCATTAATTTATCAGCTAGAACGGTTGAATATCATATTGATGGTGATTT
6901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 7000
a -
GACTGTCTCCGGCCTTTCTCACCCTTTTGAATCTTTACCTACACATTACTCAGGCATTGCATTTAAAATATATGAGGGTTCTAAAAATTTTTATCCTTGC
7001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 7100
a -
Anhang
130
GTTGAAATAAAGGCTTCTCCCGCAAAAGTATTACAGGGTCATAATGTTTTTGGTACAACCGATTTAGCTTTATGCTCTGAGGCTTTATTGCTTAATTTTG
7101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 7200
a -
CTAATTCTTTGCCTTGCCTGTATGATTTATTGGATGTT
7201 ---------+---------+---------+-------- 7238
a M I Y W M -
Enzymes that do cut and were not excluded:
lacI-| CAP-> CAP-| -35lac-> -35lac-| -10lac-> -10lac-| lacO1-> lacO1-| mRNA_lac-> S/DI-> lacZ'-> Tzip->
f1ori_IG5' f1ori_IG3' f1ori_DNA5' f1ori_DNA3' TATA_box-> f1-ori-| Acc65I AclI AfeI AlfI AloI
AlwNI ApaLI AvaI BanII BbeI BbvCI BglI BglII Bme1580I BmrI BpmI BsaBI BsaHI
BseRI BsiHKAI BsmI BsmBI BspHI BsrFI BsrGI BstYI Bsu36I BtgI BtsI ClaI CspCI
DraIII DrdI EagI EarI EciI Eco57MI EcoO109I EcoRI FalI FspI HindIII KasI KpnI
MscI MslI NaeI NarI NgoMIV PacI PpiI PpuMI PsiI PstI PvuI SbfI SfoI
SmaI SnaBI SphI SwaI TaqII TstI XmaI XmnI
Enzymes that do not cut:
lacI-> tHP-> tHP-| lacZ-| S/DII-> SD-2-> T7g10up1-> T7g10up1-| T7g10up2-> T7g10up2-| T7g10SD-> T7g10SD-|
T7g10SDs-> T7g10SDs-| OmpA-> OmpA-| pelB-> pelB-| pelB_Sfi-| pelB_FseNot-> pelB_FseNot-| phoA-> phoA-|
sFLAG-> sFLAG-| sFLAG_Eco-| lFLAG-> lFLAG-| glyli1-> glyli1-| glyli2-> glyli2-| glyli3-> glyli3-| glyli4->
glyli4-| linkerA-> linkerA-| linkerB-> linkerB-| McPC_VH-> McPC_VH-| McPC_VL-> McPC_VLm-> McPC_VL-| McPCconst->
McPCconst-| 425_VH-> 425_VH-| 425_VL-> 425-VL1-| 425-VL2-| M1-VH-> M1-VH-| M1-VHm-| M1-VLs-> M1-VLl-> M1-VL-|
hinge_v1-> hinge_v1-| hinge_v2-> hinge_v2-| hinge_v3-> hinge_v3-| hinge_v4-> hinge_v4-| zip-> zip-| Tzip-|
dhlx-> dhlx-| trimA-> trimA-| trimB-> trimB-| trimC-> trimC-| polzip-> polzip-| lacrepE-> lacrepE-| lacrepK->
lacrepK-| hetROPa-> hetROPa-| loopnewa-> loopnewa-| hetROPb-> hetROPb-| loopnewb-> loopnewb-| CH1-> CH1-|
CL-> CL-| biot37-> biot37-| biot54-> biot54-| groES-> groES-| p53-> p53-| spacer2-> spacer2-| spacer3->
spacer3-| his5-> his5-| his5EG-> his5EG-| his5-> his5-| his6-> his6-| lpp-> lpp-| T7term-> T7term-|
hok/sok_ins5' hok/sok_ins3' hok/sok5' hok/sok3' hok5' hok3' sok5' sok3' parB5' parB3' skp_cas5'
skp_cas3' skp5' skp3' bla_sig-> bla_sig-| bla-> bla-| CAT-> CAT-| colEI_cas-> colEI_cas-| ori->
<-ori_ini ori_rep5' ori_rep3' ori_rep_wt3' WinZipA1-> WinZipA1-| WinZipA2-> WinZipA2-| WinZipB1-> WinZipB1-| WinZipB2->
WinZipB2-| DHFR[1]-> DHFR[1]-| DHFR[2]-> DHFR[2]-| dummy-> dummy-| CATdel6-| CATdel8-| CATdel9-| CATdel11-| CATdel4->
CATdel7-> CATdel11-> EGFP-> F64L S65T H231L EGFP-| transcript_start enhancer_region-> enhancer_region-|
transl_ini-> transl_ini-| f1_ori-> SV40_ori-> SV40_ori-| pUC_ori-> PUC_ori-| CMV_promoter-> CMV_promoter-| mRNA_3'_end
Kan/Neo-R-> Kan/Neo-R-| AarI AatII AccI AcuI AflII AgeI AhdI AleI ApaI AscI
AsiSI AvrII BamHI BbsI BcgI BciVI BclI BfrBI BlpI BmgBI BmtI BplI BsaI
BsgI BsiWI BspEI BssHII BssSI BstAPI BstBI BstEII BstXI BstZ17I EcoICRI EcoNI EcoRV
FseI FspAI HincII HpaI MfeI MluI NcoI NheI NotI NruI NsiI PasI PflMI
PfoI PmeI PmlI PshAI PspOMI PspXI PsrI RsrII SacI SacII SalI SanDI SapI
ScaI SexAI SfiI SgrAI SpeI SrfI StuI StyI Tth111I XbaI XcmI XhoI ZraI
Enzymes excluded; MinCuts: 1 MaxCuts: 2
padenyl_signal-> padenyl_signal-| AflIII ApoI AseI BaeI BaeI BanI Bpu10I BpuEI BsaAI
BsaWI BsaXI BsaXI BseYI BsiEI Bsp1286I BspMI BsrBI BsrDI BtgZI DraI EaeI HaeII
Hin4I Hin4I MmeI MspA1I NdeI NspI PciI PvuII SfcI SmlI SspI TaqII TatI
pKMEf_Basis_Oligo_Shuff (Circular) (MinSite=6) MAP of: pKMEF_Basis_Oligo_Shuff check: 6587 from: 1 to: 3814
Oligo: Basis_Oligo_Shuff was cloned into pKMEf425bla. 425bla fragment
was excised by XbaI + HindIII digest, the oligo was inserted into
same restriciotn sites. Vector contains restriction sites to clone
in CDRs.
Using Enzyme data from: ~/../gcg_data/kk_annot_rebase.txt FileCheck: 4535
REBASE version 305 gcgenz.305
=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=
REBASE, The Restriction Enzyme Database http://rebase.neb.com
Copyright (c) Dr. Richard J. Roberts, 2003. All rights reserved.
=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=
Rich Roberts Apr 30 2003 . . .
Using translation scheme from: ~/../gcg_data/kk_translate1.txt FileCheck: 3604
met atg and val gtg as start codon modified by K. Mueller
Standard Translation Table
With 348 enzymes: *
MinOpen: 60 MaxCuts: 2
May 23, 19103 14:10 ..
PflMI EarI lacI->
| | |
acccgacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgtta
1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 100
a T R H H R M A Q N L S R Y G M I A P G R E S I Q G G E C E T S N V I -
b V V N V K P V T L -
c -
BstAPI
|
tacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaag
101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 200
a R C R R V C R C L L S D R F P R G E P G Q P R F C E N A G K S G S -
b Y D V A E Y A G V S Y Q T V S R V V N Q A S H V S A K T R E K V E A -
c -
Anhang
131
BsgI
|
cggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccct
201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300
a G D G G A E L H S Q P R G T T T G G Q T V V A D W R C H L Q S G P -
b A M A E L N Y I P N R V A Q Q L A G K Q S L L I G V A T S S L A L -
c -
Hin4I BmrI BsaHI
| | |
gcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcc
301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 400
a A R A V A N C R G D * -
b H A P S Q I V A A I K S R A D Q L G A S V V V S M V E R S G V E A -
c -
AflIII
ApaLI MluI BclI BsgI
| | | |
tgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcct
401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 500
a -
b C K A A V H N L L A Q R V S G L I I N Y P L D D Q D A I A V E A A C -
c -
BbsI BmrI
| |
gcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagca
501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600
a -
b T N V P A L F L D V S D Q T P I N S I I F S H E D G T R L G V E H -
c -
ApaI
BanII
BstEII PspOMI |
| | |
tctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcact
601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 700
a -
b L V A L G H Q Q I A L L A G P L S S V S A R L R L A G W H K Y L T -
c -
BcgI BcgI
| |
cgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttccca
701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 800
a -
b R N Q I Q P I A E R E G D W S A M S G F Q Q T M Q M L N E G I V P T -
c -
BssHII
|
ctgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggacatctcggtagtgggata
801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900
a -
b A M L V A N D Q M A L G A M R A I T E S G L R V G A D I S V V G Y -
c -
HincII
BbsI HpaI
| |
cgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaa
901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1000
a M L Y P A V N H H Q T G F S P A G A N Q R G P L A A T -
b D D T E D S S C Y I P P L T T I K Q D F R L L G Q T S V D R L L Q -
c -
BsaXI
BbeI |
SfoI | |
BsaHI| | |
NarI| | |
KasI|| | |
||| | |
ctctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctcccc
1001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1100
a L S G P G G E G Q S A V A R L T G E K K N H P G A Q Y A N R L S P -
b L S Q G Q A V K G N Q L L P V S L V K R K T T L A P N T Q T A S P R -
c -
KpnI
tHP-> |
EaeI AseI lacI-|Acc65I| |
| | | || |
gcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcggtacccgataaaagcggcttcctgacaggagg
1101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200
a R V G R F I N A A G T T G F P T G K R A V S G T R * -
b A L A D S L M Q L A R Q V S R L E S G Q * -
c -
Anhang
132
CAP-> -35lac-| -10lac-|
tHP-| AseI | CAP-| -35lac-> | -10lac-> |
| | | | | | | |
ccgttttgttttgcagcccacctcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgt
1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1300
a -
b -
c -
BmtI
BplI|
lacO1-> lacZ-| NheI ||
mRNA_lac-> lacO1-| S/DI-> lacZ'-> XbaI| BspHI AfeI| ||
| | | | || | || ||
gtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgaatttCTAGAGAAGGAGATATACtcATGagcAGCgctagcACC
1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400
a -
b -
c -
EcoRI
BanII |
SacI |
EcoICRI | |
AvaI | | | HindIII BstAPI
SpeI XhoI | | |his5-> his5-| | lpp-> DraIII lpp-|
| | | | | | | | | | |
AGCACTAGTggctcgagctcggaattcCACCATCATCACCATTAGtAagcttgacctgtgaagtgaaaaatggcgcacattgtgcgacattttttttgtc
1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500
a -
b V K N G A H C A T F F L S -
c -
f1ori_IG5'
BamHI |
| |
tgccgtttaccgctactgcgtcacggatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacactt
1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1600
a -
b A V Y R Y C V T D P H A P C S G A L S A A G V V V T R S V T A T L -
c -
f1ori_DNA5'
NaeI |
NgoMIV | |
| | |
gccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcggggcatccctttag
1601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1700
a -
b A S A L A P A P F A F F P S F L A T F A G F P R Q A L N R G I P L G -
c -
DraIII
BsaAI | f1ori_DNA3'
| | |
ggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
1701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800
a -
b F R F S A L R H L D P K K L D * -
c -
AloI
PpiI
AloI BsaXI | PsiI
| | | |
tttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggatt
1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1900
a -
b -
c -
SspI f1ori_IG3'
| |
ttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcactt
1901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2000
a -
b -
c -
ttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgtcgagacgttgggtgaggttccaactttc
2001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100
a -
b -
c -
Bpu10I CAT->
| |
accataatgaaataagatcactaccgggcgtattttttgagttatcgagattttcaggagctaaggaagctaaaatggagaaaaaaatcactggatatac
2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2200
a -
b -
c M E K K I T G Y T -
Anhang
133
caccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacg
2201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2300
a -
b -
c T V D I S Q W H R K E H F E A F Q S V A Q C T Y N Q T V Q L D I T -
BspEI
DraI Hin4I BsmI |
| | | |
gcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggagttccgtatgg
2301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400
a -
b -
c A F L K T V K K N K H K F Y P A F I H I L A R L M N A H P E F R M A -
caatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaata
2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2500
a V F T L V T P F S M S K L K R F H R S G V N T -
b -
c M K D G E L V I W D S V H P C Y T V F H E Q T E T F S S L W S E Y -
ccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatg
2501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2600
a T T I S G S F Y T Y I R K M W R V T V K T W P I S L K G L L R I C -
b -
c H D D F R Q F L H I Y S Q D V A C Y G E N L A Y F P K G F I E N M -
BtgI
MscI NcoI
PflMI DraI EaeI | StyI SspI
| | | | | |
tttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaat
2601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700
a F S S Q P I P G * -
b -
c F F V S A N P W V S F T S F D L N V A N M D N F F A P V F T M G K Y -
BsmI
|
attatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatcatgccgtctgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattaca
2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2800
a -
b -
c Y T Q G D K V L M P L A I Q V H H A V C D G F H V G R M L N E L Q -
ScaI
TatI | CAT-|
| | |
acagtactgcgatgagtggcagggcggggcgtaatttttttaaggcagttattggtgcccttaaacgcctggtgctacgcctgaataagtgataataagc
2801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2900
a -
b -
c Q Y C D E W Q G G A * -
BsiEI
BstBI Tth111I | AgeI
| | | |
ggatgaatggcagaaattcgaaagcaaattcgacccggtcgtcggttcagggcagggtcgttaaatagccgcttatgtctattgctggtttaccggttta
2901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000
a -
b -
c M A E I R K Q I R P G R R F R A G S L N S R L C L L L V Y R F I -
Bsu36I Bpu10I BtgI
| | |
ttgactaccggaagcagtgtgaccgtgtgcttctcaaatgcctgaggccagtttgctcaggctctccccgtggaggtaataattgctcgacatgaccaaa
3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3100
a -
b -
c D Y R K Q C D R V L L K C L R P V C S G S P R G G N N C S T * -
colEI_cas->
PpiI |
| |
atcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgct
3101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3200
a -
b -
c -
AcuI
|
tgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagat
3201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300
a -
b -
c -
Anhang
134
ori_rep3'
|
accaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtg
3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3400
a -
b -
c -
AlwNI BsiEI ApaLI
| | |
gctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgca
3401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3500
a -
b -
c -
ori_rep5'
|
cacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacag
3501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3600
a -
b -
c -
BssSI
|
gtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctc
3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3700
a -
b -
c -
ori->
<-ori_ini
|
tgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggc
3701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3800
a V M L V R G A E P M E K R Q Q R G L F T V P G L L L A -
b -
c -
colEI_cas-|
|
cttttgctcacatg
3801 ---------+---- 3814
a F C S H -
b M -
c -
Enzymes that do cut and were not excluded:
lacI-> lacI-| tHP-> tHP-| CAP-> CAP-| -35lac-> -35lac-| -10lac-> -10lac-| lacO1-> lacO1-| mRNA_lac->
S/DI-> lacZ'-> lacZ-| his5-> his5-| lpp-> lpp-| f1ori_IG5' f1ori_IG3' f1ori_DNA5' f1ori_DNA3' CAT->
CAT-| colEI_cas-> colEI_cas-| ori-> <-ori_ini ori_rep5' ori_rep3' Acc65I AcuI AfeI AflIII AgeI
AloI AlwNI ApaI ApaLI AseI AvaI BamHI BanII BbeI BbsI BcgI BclI BmrI
BmtI BplI Bpu10I BsaAI BsaHI BsaXI BsgI BsiEI BsmI BspEI BspHI BssHII BssSI
BstAPI BstBI BstEII Bsu36I BtgI DraI DraIII EaeI EarI EcoICRI EcoRI Hin4I HincII
HindIII HpaI KasI KpnI MluI MscI NaeI NarI NcoI NgoMIV NheI PflMI PpiI
PsiI PspOMI SacI ScaI SfoI SpeI SspI StyI TatI Tth111I XbaI XhoI
Enzymes that do not cut:
S/DII-> SD-2-> T7g10up1-> T7g10up1-| T7g10up2-> T7g10up2-| T7g10SD-> T7g10SD-| T7g10SDs-> T7g10SDs-| OmpA->
OmpA-| pelB-> pelB-| pelB_Sfi-| pelB_FseNot-> pelB_FseNot-| phoA-> phoA-| sFLAG-> sFLAG-| sFLAG_Eco-|
lFLAG-> lFLAG-| glyli1-> glyli1-| glyli2-> glyli2-| glyli3-> glyli3-| glyli4-> glyli4-| linkerA-> linkerA-| linkerB->
linkerB-| McPC_VH-> McPC_VH-| McPC_VL-> McPC_VLm-> McPC_VL-| McPCconst-> McPCconst-| 425_VH-> 425_VH-| 425_VL->
425-VL1-| 425-VL2-| M1-VH-> M1-VH-| M1-VHm-| M1-VLs-> M1-VLl-> M1-VL-| hinge_v1-> hinge_v1-| hinge_v2-> hinge_v2-|
hinge_v3-> hinge_v3-| hinge_v4-> hinge_v4-| zip-> zip-| Tzip-> Tzip-| dhlx-> dhlx-| trimA-> trimA-|
trimB-> trimB-| trimC-> trimC-| polzip-> polzip-| lacrepE-> lacrepE-| lacrepK-> lacrepK-| hetROPa-> hetROPa-|
loopnewa-> loopnewa-| hetROPb-> hetROPb-| loopnewb-> loopnewb-| CH1-> CH1-| CL-> CL-| biot37-> biot37-|
biot54-> biot54-| groES-> groES-| p53-> p53-| spacer2-> spacer2-| spacer3-> spacer3-| his5EG-> his5EG-|
his5-> his5-| his6-> his6-| T7term-> T7term-| hok/sok_ins5' hok/sok_ins3' hok/sok5' hok/sok3' hok5'
hok3' sok5' sok3' parB5' parB3' skp_cas5' skp_cas3' skp5' skp3' bla_sig-> bla_sig-| bla->
bla-| ori_rep_wt3' WinZipA1-> WinZipA1-| WinZipA2-> WinZipA2-| WinZipB1-> WinZipB1-| WinZipB2-> WinZipB2-| DHFR[1,2]->
DHFR[1,2]-| DHFR[3]-> DHFR[3]-| AarI AatII AccI AflII AhdI AleI AscI AsiSI AvrII
BaeI BbvCI BfrBI BglI BglII BlpI BmgBI BsaI BsaBI BseRI BsiWI BspMI BsrGI
BstZ17I ClaI EagI EcoNI EcoO109I EcoRV FalI FseI FspI FspAI MfeI NdeI NotI
NruI NsiI NspI PacI PciI PfoI PmeI PmlI PpuMI PshAI PsrI PstI PvuI
RsrII SacII SalI SanDI SapI SbfI SexAI SfiI SgrAI SmaI SnaBI SphI SrfI
StuI SwaI XmaI XmnI ZraI
Enzymes excluded; MinCuts: 1 MaxCuts: 2
AclI ApoI BanI BciVI Bme1580I BpmI BpuEI BsaWI BsaXI BseYI BsiHKAI BsmBI Bsp1286I
BsrBI BsrDI BsrFI BstXI BstYI BtsI DrdI EciI Eco57MI HaeII Hin4I MmeI MslI
MspA1I PpiI PvuII SfcI SmlI TaqII TaqII XcmI
Anhang
135
pKMEf_shuffle_H1 BmtI
BplI|
lacO1-> lacZ-| NheI ||
mRNA_lac-> lacO1-| S/DI-> lacZ'-> XbaI| BspHI AfeI| ||
| | | | || | || ||
GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTTCTAGAGAAGGAGATATACtcATGagcAGCgctagcGGT
1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400
c M S S A S G -
EcoRI
BanII |
SacI |
EcoICRI | |
AvaI | | |
PspXI | | |
XhoI | | | HindIII
AlwNI SpeI AloI| | | |his5-> his5-| | lpp->
| | || | | | | | | |
ggcGGCACCAGCCACTGGATGCACGGTTCAGgcaCTAGTggctcgagctcggaattcCACCATCATCACCATTAGtAAGCTTGACCTGTGAAGTGAAAAA
1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500
c G G T S H W M H G S G T S G S S S E F H H H H H * M -
pKMEf_shuffle_H2
BmtI
BplI|
lacO1-> lacZ-| NheI ||
mRNA_lac-> lacO1-| S/DI-> lacZ'-> XbaI| BspHI AfeI| ||
| | | | || | || ||
GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTTCTAGAGAAGGAGATATACtcATGagcAGCgctagcGGT
1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400
c M S S A S G -
EcoRI
BanII |
SacI |
EcoICRI | |
AvaI | | |
PspXI | | |
EagI SpeI XhoI | | |his5->
| | | | | | |
ggcGGCGAGTTTAATCCCAGCAACGGCCGTACTAACTACAATGAGAAATTCAAGAGCGGTTCAGgcaCTAGTggctcgagctcggaattcCACCATCATC
1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500
c G G E F N P S N G R T N Y N E K F K S G S G T S G S S S E F H H H H -
f1-ori-|
HindIII BstAPI f1ori_IG5'|
his5-| | lpp-> DraIII lpp-| BamHI ||
| | | | | | ||
ACCATTAGtAAGCTTGACCTGTGAAGTGAAAAATGGCGCACATTGTGCGACATTTTTTTTGTCTGCCGTTTACCGCTACTGCGTCACGGATCCCCACGCG
1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1600
c H *
pKMEf_shuffle_H3 BmtI
BplI|
lacO1-> lacZ-| NheI ||
mRNA_lac-> lacO1-| S/DI-> lacZ'-> XbaI| BspHI AfeI| ||
| | | | || | || ||
GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTTCTAGAGAAGGAGATATACtcATGagcAGCgctagcGGT
1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400
c M S S A S G -
EcoRI
BanII |
SacI |
EcoICRI | |
AvaI | | |
PspXI | | | HindIII
EagI SpeI XhoI | | |his5-> his5-| |
| | | | | | | | |
ggcGGCCGGGACTATGATTACGACGGACGGTACTTTGACTACGGTTCAGgcaCTAGTggctcgagctcggaattcCACCATCATCACCATTAGtAAGCTT
1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500
c G G R D Y D Y D G R Y F D Y G S G T S G S S S E F H H H H H * -
Anhang
136
pKMEf_shuffle_L1
BmtI
BplI|
lacO1-> lacZ-| NheI ||
mRNA_lac-> lacO1-| S/DI-> lacZ'-> XbaI| BspHI AfeI| ||
| | | | || | || ||
GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTTCTAGAGAAGGAGATATACtcATGagcAGCgctagcGGT
1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400
c M S S A S G -
EcoRI
BanII |
SacI |
EcoICRI | |
NspI AvaI | | |
AflIII | PspXI | | | HindIII
PciI | FalI SpeI XhoI | | |his5-> his5-| |
| | | | | | | | | | |
ggcGGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAACTTACATGTATGGTTCAGgcaCTAGTggctcgagctcggaattcCACCATCATCACCATTAGtAAGCTTGACCTG
1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500
c G G S A S S S V T Y M Y G S G T S G S S S E F H H H H H * -
pKMEf_shuffle_L2 BmtI
BplI|
lacO1-> lacZ-| NheI ||
mRNA_lac-> lacO1-| S/DI-> lacZ'-> XbaI| BspHI AfeI| ||
| | | | || | || ||
GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTTCTAGAGAAGGAGATATACtcATGagcAGCgctagcGGT
1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400
c M S S A S G -
EcoRI
BanII |
SacI |
EcoICRI | |
AvaI | | |
PspXI | | | HindIII
SpeI XhoI | | |his5-> his5-| | lpp->
| | | | | | | | |
ggcGGCGACACATCCAACCTGGCTTCTGGTTCAGgcaCTAGTggctcgagctcggaattcCACCATCATCACCATTAGtAAGCTTGACCTGTGAAGTGAA
1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500
c G G D T S N L A S G S G T S G S S S E F H H H H H * -
pKMEf_shuffle_L3 BmtI
BplI|
lacO1-> lacZ-| NheI ||
mRNA_lac-> lacO1-| S/DI-> lacZ'-> XbaI| BspHI AfeI| ||
| | | | || | || ||
GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTTCTAGAGAAGGAGATATACtcATGagcAGCgctagcGGT
1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400
c M S S A S G -
EcoRI
BanII |
SacI |
EcoICRI | |
AvaI | | |
PspXI | | | HindIII
SpeI XhoI | | |his5-> his5-| |
| | | | | | | |
ggcGGCCAGCAGTGGAGTAGTCACATATTCACGGGTTCAGgcaCTAGTggctcgagctcggaattcCACCATCATCACCATTAGtAAGCTTGACCTGTGA
1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500
c G G Q Q W S S H I F T G S G T S G S S S E F H H H H H * -
Anhang
137
pIB30_H3_li_CAT_li_H3 (Circular) (MinSite=6) MAP of: pIB30_H3-li_CAT-li_H3.seq check: 1607 from: 1 to: 4533
Ausgangsvektor pSS30CATwt,Linker und Schnittstellen(Nhe u. Spe)
wurden mittels PCR eingefuegt
Primer p_f_CAT_Nhe_linker bzw. p_r_CAT_Spe_linker
Using Enzyme data from: ~/../gcg_data/kk_annot_rebase.txt FileCheck: 69
REBASE version 305 gcgenz.305
=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=
REBASE, The Restriction Enzyme Database http://rebase.neb.com
Copyright (c) Dr. Richard J. Roberts, 2003. All rights reserved.
=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=
Rich Roberts Apr 30 2003 . . .
Using translation scheme from: ~/../gcg_data/kk_translate1.txt FileCheck: 3604
met atg and val gtg as start codon modified by K. Mueller
Standard Translation Table
With 362 enzymes: *
MinOpen: 25 MaxCuts: 2
August 26, 19104 15:05 ..
PflMI EarI lacI->
| | |
ACCCGACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGTGAAACCAGTAACGTTA
1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 100
b V V N V K P V T L -
BstAPI
|
TACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAG
101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 200
b Y D V A E Y A G V S Y Q T V S R V V N Q A S H V S A K T R E K V E A -
BsgI
|
CGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCT
201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300
b A M A E L N Y I P N R V A Q Q L A G K Q S L L I G V A T S S L A L -
GCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCC
301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 400
b H A P S Q I V A A I K S R A D Q L G A S V V V S M V E R S G V E A -
AflIII
MluI BclI BsgI
| | |
TGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCT
401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 500
b C K A A V H N L L A Q R V S G L I I N Y P L D D Q D A I A V E A A C -
BbsI
|
GCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCA
501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600
b T N V P A L F L D V S D Q T P I N S I I F S H E D G T R L G V E H -
ApaI
BanII
BstEII PspOMI |
| | |
TCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACT
601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 700
b L V A L G H Q Q I A L L A G P L S S V S A R L R L A G W H K Y L T -
BcgI
|
CGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCA
701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 800
b R N Q I Q P I A E R E G D W S A M S G F Q Q T M Q M L N E G I V P T -
BssHII EcoRV
| |
CTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATA
801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900
b A M L V A N D Q M A L G A M R A I T E S G L R V G A D I S V V G Y -
HincII
BbsI HpaI
| |
CGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAA
901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1000
b D D T E D S S C Y I P P L T T I K Q D F R L L G Q T S V D R L L Q -
Anhang
138
BsaXI
BbeI |
SfoI | |
NarI| | |
BsmBI KasI|| | |
| ||| | |
CTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCC
1001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1100
b L S Q G Q A V K G N Q L L P V S L V K R K T T L A P N T Q T A S P R -
lacI-| CAP-> CAP-|
| | |
GCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATT
1101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200
b A L A D S L M Q L A R Q V S R L E S G Q * -
lacO1->
mRNA_lac->
-35lac-| -10lac-| |
-35lac-> | -10lac-> | | lacO1-| S/DI-> lacZ'->
| | | | | | | |
AGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTA
1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1300
b -
lacZ-| BmtI
XbaI| NdeI NheI | EagI
|| | | | |
CGAATTTctagataacgagggcaacatATGgctagcGGTggcGGCCGGGACTATGATTACGACGGACGGTACTTTGACTACGGTTCAGgcactagcggtg
1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400
b M A S G G G R D Y D Y D G R Y F D Y G S G T S G G -
gctccggtggtggctctggcggtggcgAGaaaaaaATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCA
1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500
b S G G G S G G G E K K I T G Y T T V D I S Q W H R K E H F E A F Q -
GTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTT
1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1600
b S V A Q C T Y N Q T V Q L D I T A F L K T V K K N K H K F Y P A F -
BspEI
BsmI |
| |
ATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAgTTCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACA
1601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1700
b I H I L A R L M N A H P E F R M A M K D G E L V I W D S V H P C Y T -
CCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTG
1701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800
b V F H E Q T E T F S S L W S E Y H D D F R Q F L H I Y S Q D V A C -
BsmBI PflMI
| |
TTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAAC
1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1900
b Y G E N L A Y F P K G F I E N M F F V S A N P W V S F T S F D L N -
BtgI
NcoI
MscI StyI
| |
GTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATC
1901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2000
b V A N M D N F F A P V F T M G K Y Y T Q G D K V L M P L A I Q V H H -
CATdel6-|
CATdel8-| |
ScaI | |
CATdel9-|| | |
CATdel11-| || | |
BsmI | TatI|| | | CAT-|
| | ||| | | |
ATGCCGTCTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGggtggcggttctggtggcgg
2001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100
b A V C D G F H V G R M L N E L Q Q Y C D E W Q G G A G G G S G G G -
EagI SpeI HindIII lpp->
| | | |
ctccggtggcactagcGGTggcGGCCGGGACTATGATTACGACGGACGGTACTTTGACTACGGTTCAGgcactagttgataagcttGACCTGTGAAGTGA
2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2200
b S G G T S G G G R D Y D Y D G R Y F D Y G S G T S * -
BstAPI f1ori_IG5'
DraIII lpp-| BamHI |
| | | |
AAAATGGCGCACATTGTGCGACATTTTTTTTGTCTGCCGTTTACCGCTACTGCGTCACGGATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGG
2201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2300
b M A H I V R H F F C L P F T A T A S R I P T R P V A A H * -
Anhang
139
f1ori_DNA5'
NaeI |
NgoMIV | |
| | |
TGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTT
2301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400
b -
DraIII
BsaAI |
| |
CCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTA
2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2500
b V L Y G T S T P K N L I R V M V H V -
AloI AloI
f1ori_DNA3' | DrdI BsaXI |
| | | | |
GTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCC
2501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2600
b V G H R P D R R F F A L * V D S C S K L E Q H S T L -
PsiI
|
TATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAAC
2601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700
b S R S I L L I Y K G F C R F R P I G * -
f1ori_IG3'
|
AAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGC
2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2800
b V A L F G E M C A E P L F V Y F S K Y I Q I C I R -
BspHI EarI bla_sig->
| | |
TCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGC
2801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2900
b S * -
bla-> AcuI
bla_sig-|| BssSI |
|| | |
ATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTC
2901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000
b M L K I S W V H E W V T S N W I S -
XmnI
|
AACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTG
3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3100
b T A V R S L R V F A P K N V F Q * V A R Y Y P V L -
ScaI
BcgI TatI |
| | |
ACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGAC
3101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3200
b T P G K S N S V A A Y T I L R M T W L S T H Q S Q K S I L R M A * -
PvuI
|
AGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTT
3201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300
b -
TTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAG
3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3400
b -
FspI
|
CAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGG
3401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3500
b -
BglI BsaI
| |
ACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCA
3501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3600
b -
AhdI
|
GATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGA
3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3700
b -
Anhang
140
bla-|
|
TTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTT
3701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3800
b -
BspHI colEI_cas->
| |
TGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTT
3801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3900
b -
AcuI
|
CTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTG
3901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4000
b -
ori_rep3'
|
GCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCT
4001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4100
b -
AlwNI
|
GCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGC
4101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4200
b V A I S R V L P G W T Q D D S Y R I R R S G R A -
ori_rep5'
|
TGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCG
4201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4300
b E R G V R A H S P A W S E R P T P N * -
BssSI
|
AAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCC
4301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4400
b -
ori->
DrdI <-ori_ini
| |
TGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGG
4401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4500
b -
colEI_cas-|
|
TTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATG
4501 ---------+---------+---------+--- 4533
b -
Enzymes that do cut and were not excluded:
lacI-> lacI-| CAP-> CAP-| -35lac-> -35lac-| -10lac-> -10lac-| lacO1-> lacO1-| mRNA_lac-> S/DI-> lacZ'->
lacZ-| lpp-> lpp-| f1ori_IG5' f1ori_IG3' f1ori_DNA5' f1ori_DNA3' bla_sig-> bla_sig-| bla-> bla-|
CAT-| colEI_cas-> colEI_cas-| ori-> <-ori_ini ori_rep5' ori_rep3' CATdel6-| CATdel8-| CATdel9-| CATdel11-|
AcuI AflIII AhdI AloI AlwNI ApaI BamHI BanII BbeI BbsI BcgI BclI BglI
BmtI BsaI BsaAI BsaXI BsgI BsmI BsmBI BspEI BspHI BssHII BssSI BstAPI BstEII
BtgI DraIII DrdI EagI EarI EcoRV FspI HincII HindIII HpaI KasI MluI MscI
NaeI NarI NcoI NdeI NgoMIV NheI PflMI PsiI PspOMI PvuI ScaI SfoI SpeI
StyI TatI XbaI XmnI
Enzymes that do not cut:
tHP-> tHP-| S/DII-> SD-2-> T7g10up1-> T7g10up1-| T7g10up2-> T7g10up2-| T7g10SD-> T7g10SD-| T7g10SDs->
T7g10SDs-| OmpA-> OmpA-| pelB-> pelB-| pelB_Sfi-| pelB_FseNot-> pelB_FseNot-| phoA-> phoA-| sFLAG->
sFLAG-| sFLAG_Eco-| lFLAG-> lFLAG-| glyli1-> glyli1-| glyli2-> glyli2-| glyli3-> glyli3-| glyli4-> glyli4-|
linkerA-> linkerA-| linkerB-> linkerB-| McPC_VH-> McPC_VH-| McPC_VL-> McPC_VLm-> McPC_VL-| McPCconst-> McPCconst-|
425_VH-> 425_VH-| 425_VL-> 425-VL1-| 425-VL2-| M1-VH-> M1-VH-| M1-VHm-| M1-VLs-> M1-VLl-> M1-VL-| hinge_v1->
hinge_v1-| hinge_v2-> hinge_v2-| hinge_v3-> hinge_v3-| hinge_v4-> hinge_v4-| zip-> zip-| Tzip-> Tzip-|
dhlx-> dhlx-| trimA-> trimA-| trimB-> trimB-| trimC-> trimC-| polzip-> polzip-| lacrepE-> lacrepE-| lacrepK->
lacrepK-| hetROPa-> hetROPa-| loopnewa-> loopnewa-| hetROPb-> hetROPb-| loopnewb-> loopnewb-| CH1-> CH1-|
CL-> CL-| biot37-> biot37-| biot54-> biot54-| groES-> groES-| p53-> p53-| spacer2-> spacer2-| spacer3->
spacer3-| his5-> his5-| his5EG-> his5EG-| his5-> his5-| his6-> his6-| T7term-> T7term-| hok/sok_ins5'
hok/sok_ins3' hok/sok5' hok/sok3' hok5' hok3' sok5' sok3' parB5' parB3' skp_cas5' skp_cas3' skp5'
skp3' CAT-> ori_rep_wt3' WinZipA1-> WinZipA1-| WinZipA2-> WinZipA2-| WinZipB1-> WinZipB1-| WinZipB2-> WinZipB2-|
DHFR[1]-> DHFR[1]-| DHFR[2]-> DHFR[2]-| dummy-> dummy-| CATdel4-> CATdel7-> CATdel11-> AarI AatII AccI
Acc65I AfeI AflII AgeI AleI AlfI AscI AsiSI AvaI AvrII BaeI BbvCI BfrBI
BglII BlpI BmgBI BplI Bpu10I BsaBI BseRI BsiWI BspMI BsrGI BstBI BstZ17I Bsu36I
ClaI CspCI EcoICRI EcoNI EcoO109I EcoRI FalI FseI FspAI KpnI MfeI NotI NruI
NsiI NspI PacI PciI PfoI PmeI PmlI PpuMI PshAI PspXI PsrI PstI RsrII
SacI SacII SalI SanDI SapI SbfI SexAI SfiI SgrAI SmaI SnaBI SphI SrfI
StuI SwaI Tth111I XhoI XmaI ZraI
Enzymes excluded; MinCuts: 1 MaxCuts: 2
AclI ApaLI ApoI AseI BanI BcgI BciVI Bme1580I BmrI BpmI BpuEI BsaHI BsaWI
BsaXI BseYI BsiEI BsiHKAI Bsp1286I BsrBI BsrDI BsrFI BstXI BstYI BtgZI BtsI DraI
EaeI EciI Eco57MI HaeII Hin4I Hin4I MmeI MslI MspA1I PpiI PpiI PvuII SfcI
SmlI SspI TaqII TaqII XcmI
Anhang
141
pIB30_SSHIFTF_CAT_SSHIFTF
(Circular) (MinSite=6) MAP of: pIB30_SSHIFTF_CAT_SSHIFTF.seq check: 3649 from: 1 to: 4455
Ausgangsvektor pSS30CATwt,Linker und Schnittstellen(Nhe u. Spe)
wurden mittels PCR eingefuegt
Primer p_f_CAT_Nhe_linker bzw. p_r_CAT_Spe_linker
Using Enzyme data from: ~/../gcg_data/kk_annot_rebase.txt FileCheck: 69
REBASE version 305 gcgenz.305
=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=
REBASE, The Restriction Enzyme Database http://rebase.neb.com
Copyright (c) Dr. Richard J. Roberts, 2003. All rights reserved.
=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=
Rich Roberts Apr 30 2003 . . .
Using translation scheme from: ~/../gcg_data/kk_translate1.txt FileCheck: 3604
met atg and val gtg as start codon modified by K. Mueller
Standard Translation Table
With 362 enzymes: *
MinOpen: 25 MaxCuts: 2
November 5, 19104 14:49 ..
PflMI EarI lacI->
| | |
ACCCGACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGTGAAACCAGTAACGTTA
1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 100
b V V N V K P V T L -
BstAPI
|
TACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAG
101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 200
b Y D V A E Y A G V S Y Q T V S R V V N Q A S H V S A K T R E K V E A -
BsgI
|
CGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCT
201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300
b A M A E L N Y I P N R V A Q Q L A G K Q S L L I G V A T S S L A L -
GCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCC
301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 400
b H A P S Q I V A A I K S R A D Q L G A S V V V S M V E R S G V E A -
AflIII
MluI BclI BsgI
| | |
TGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCT
401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 500
b C K A A V H N L L A Q R V S G L I I N Y P L D D Q D A I A V E A A C -
BbsI
|
GCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCA
501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600
b T N V P A L F L D V S D Q T P I N S I I F S H E D G T R L G V E H -
ApaI
BanII
BstEII PspOMI |
| | |
TCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACT
601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 700
b L V A L G H Q Q I A L L A G P L S S V S A R L R L A G W H K Y L T -
BcgI
|
CGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCA
701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 800
b R N Q I Q P I A E R E G D W S A M S G F Q Q T M Q M L N E G I V P T -
BssHII EcoRV
| |
CTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATA
801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900
b A M L V A N D Q M A L G A M R A I T E S G L R V G A D I S V V G Y -
HincII
BbsI HpaI
| |
CGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAA
901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1000
b D D T E D S S C Y I P P L T T I K Q D F R L L G Q T S V D R L L Q -
Anhang
142
BsaXI
BbeI |
SfoI | |
NarI| | |
BsmBI KasI|| | |
| ||| | |
CTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCC
1001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1100
b L S Q G Q A V K G N Q L L P V S L V K R K T T L A P N T Q T A S P R -
lacI-| CAP-> CAP-|
| | |
GCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATT
1101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200
b A L A D S L M Q L A R Q V S R L E S G Q * -
lacO1->
mRNA_lac->
-35lac-| -10lac-| |
-35lac-> | -10lac-> | | lacO1-| S/DI-> lacZ'->
| | | | | | | |
AGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTA
1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1300
b -
lacZ-| BmtI
XbaI| NdeI NheI |
|| | | |
CGAATTTctagataacgagggcaacatATGgctagcAGTAGTCACATATTCACGTTCggtggctccggtggtggctctggcggtggcgAGaaaaaaATCA
1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400
b M A S S S H I F T F G G S G G G S G G G E K K I T -
CTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCT
1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500
b G Y T T V D I S Q W H R K E H F E A F Q S V A Q C T Y N Q T V Q L -
BspEI
BsmI |
| |
GGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAg
1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1600
b D I T A F L K T V K K N K H K F Y P A F I H I L A R L M N A H P E -
TTCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCT
1601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1700
b F R M A M K D G E L V I W D S V H P C Y T V F H E Q T E T F S S L W -
GGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTAT
1701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800
b S E Y H D D F R Q F L H I Y S Q D V A C Y G E N L A Y F P K G F I -
BtgI
NcoI
BsmBI PflMI MscI StyI
| | | |
TGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACC
1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1900
b E N M F F V S A N P W V S F T S F D L N V A N M D N F F A P V F T -
BsmI
|
ATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTCTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTA
1901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2000
b M G K Y Y T Q G D K V L M P L A I Q V H H A V C D G F H V G R M L N -
CATdel6-|
CATdel8-| |
ScaI | |
CATdel9-|| | |
CATdel11-| TatI|| | | CAT-| SpeI
| ||| | | | |
ATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGggtggcggttctggtggcggctccggtggcAGTAGTCACATATTCACGTTCactagttg
2001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100
b E L Q Q Y C D E W Q G G A G G G S G G G S G G S S H I F T F T S * -
BstAPI f1ori_IG5'
HindIII lpp-> DraIII lpp-| BamHI |
| | | | | |
ataagcttGACCTGTGAAGTGAAAAATGGCGCACATTGTGCGACATTTTTTTTGTCTGCCGTTTACCGCTACTGCGTCACGGATCCCCACGCGCCCTGTA
2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2200
b M A H I V R H F F C L P F T A T A S R I P T R P V -
GCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTT
2201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2300
b A A H * -
Anhang
143
f1ori_DNA5'
NaeI |
NgoMIV | |
| | |
TCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTT
2301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400
b V L Y G T S T P K N L -
DraIII AloI AloI
BsaAI | f1ori_DNA3' | DrdI BsaXI |
| | | | | | |
GATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCC
2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2500
b I R V M V H V V G H R P D R R F F A L * V D S C S -
PsiI
|
AAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACA
2501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2600
b K L E Q H S T L S R S I L L I Y K G F C R F R P I G * -
f1ori_IG3'
|
AAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAA
2601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700
b V A L F G E M C A E P L F V Y F S K -
BspHI EarI bla_sig->
| | |
ATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCG
2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2800
b Y I Q I C I R S * -
bla-> AcuI
bla_sig-|| BssSI |
|| | |
CCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGT
2801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2900
b M L K I S W V H E W -
XmnI
|
GGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGT
2901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000
b V T S N W I S T A V R S L R V F A P K N V F Q * V -
ScaI
BcgI TatI |
| | |
GGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAA
3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3100
b A R Y Y P V L T P G K S N S V A A Y T I L R M T W L S T H Q S Q K -
PvuI
|
AGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGG
3101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3200
b S I L R M A * -
ACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAG
3201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300
b -
FspI
|
CGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGA
3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3400
b -
BglI BsaI
| |
TGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGG
3401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3500
b -
AhdI
|
TATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATC
3501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3600
b -
bla-|
|
GCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAA
3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3700
b -
Anhang
144
BspHI colEI_cas->
| |
GGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGG
3701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3800
b -
ATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCA
3801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3900
b -
AcuI ori_rep3'
| |
ACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAG
3901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4000
b -
AlwNI
|
CACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACC
4001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4100
b V A I S R V L P G W T Q D D S Y R -
GGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTA
4101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4200
b I R R S G R A E R G V R A H S P A W S E R P T P N * -
ori_rep5' BssSI
| |
TGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAA
4201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4300
b -
ori->
DrdI <-ori_ini
| |
ACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGC
4301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4400
b -
colEI_cas-|
|
CAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATG
4401 ---------+---------+---------+---------+---------+----- 4455
b -
Enzymes that do cut and were not excluded:
lacI-> lacI-| CAP-> CAP-| -35lac-> -35lac-| -10lac-> -10lac-| lacO1-> lacO1-| mRNA_lac-> S/DI-> lacZ'->
lacZ-| lpp-> lpp-| f1ori_IG5' f1ori_IG3' f1ori_DNA5' f1ori_DNA3' bla_sig-> bla_sig-| bla-> bla-|
CAT-| colEI_cas-> colEI_cas-| ori-> <-ori_ini ori_rep5' ori_rep3' CATdel6-| CATdel8-| CATdel9-| CATdel11-|
AcuI AflIII AhdI AloI AlwNI ApaI BamHI BanII BbeI BbsI BcgI BclI BglI
BmtI BsaI BsaAI BsaXI BsgI BsmI BsmBI BspEI BspHI BssHII BssSI BstAPI BstEII
BtgI DraIII DrdI EarI EcoRV FspI HincII HindIII HpaI KasI MluI MscI NaeI
NarI NcoI NdeI NgoMIV NheI PflMI PsiI PspOMI PvuI ScaI SfoI SpeI StyI
TatI XbaI XmnI
Enzymes that do not cut:
tHP-> tHP-| S/DII-> SD-2-> T7g10up1-> T7g10up1-| T7g10up2-> T7g10up2-| T7g10SD-> T7g10SD-| T7g10SDs->
T7g10SDs-| OmpA-> OmpA-| pelB-> pelB-| pelB_Sfi-| pelB_FseNot-> pelB_FseNot-| phoA-> phoA-| sFLAG->
sFLAG-| sFLAG_Eco-| lFLAG-> lFLAG-| glyli1-> glyli1-| glyli2-> glyli2-| glyli3-> glyli3-| glyli4-> glyli4-|
linkerA-> linkerA-| linkerB-> linkerB-| McPC_VH-> McPC_VH-| McPC_VL-> McPC_VLm-> McPC_VL-| McPCconst-> McPCconst-|
425_VH-> 425_VH-| 425_VL-> 425-VL1-| 425-VL2-| M1-VH-> M1-VH-| M1-VHm-| M1-VLs-> M1-VLl-> M1-VL-| hinge_v1->
hinge_v1-| hinge_v2-> hinge_v2-| hinge_v3-> hinge_v3-| hinge_v4-> hinge_v4-| zip-> zip-| Tzip-> Tzip-|
dhlx-> dhlx-| trimA-> trimA-| trimB-> trimB-| trimC-> trimC-| polzip-> polzip-| lacrepE-> lacrepE-| lacrepK->
lacrepK-| hetROPa-> hetROPa-| loopnewa-> loopnewa-| hetROPb-> hetROPb-| loopnewb-> loopnewb-| CH1-> CH1-|
CL-> CL-| biot37-> biot37-| biot54-> biot54-| groES-> groES-| p53-> p53-| spacer2-> spacer2-| spacer3->
spacer3-| his5-> his5-| his5EG-> his5EG-| his5-> his5-| his6-> his6-| T7term-> T7term-| hok/sok_ins5'
hok/sok_ins3' hok/sok5' hok/sok3' hok5' hok3' sok5' sok3' parB5' parB3' skp_cas5' skp_cas3' skp5'
skp3' CAT-> ori_rep_wt3' WinZipA1-> WinZipA1-| WinZipA2-> WinZipA2-| WinZipB1-> WinZipB1-| WinZipB2-> WinZipB2-|
DHFR[1]-> DHFR[1]-| DHFR[2]-> DHFR[2]-| dummy-> dummy-| CATdel4-> CATdel7-> CATdel11-> AarI AatII AccI
Acc65I AfeI AflII AgeI AleI AlfI AscI AsiSI AvaI AvrII BaeI BbvCI BfrBI
BglII BlpI BmgBI BplI Bpu10I BsaBI BseRI BsiWI BspMI BsrGI BstBI BstZ17I Bsu36I
ClaI CspCI EagI EcoICRI EcoNI EcoO109I EcoRI FalI FseI FspAI KpnI MfeI NotI
NruI NsiI NspI PacI PciI PfoI PmeI PmlI PpuMI PshAI PspXI PsrI PstI
RsrII SacI SacII SalI SanDI SapI SbfI SexAI SfiI SgrAI SmaI SnaBI SphI
SrfI StuI SwaI Tth111I XhoI XmaI ZraI
Enzymes excluded; MinCuts: 1 MaxCuts: 2
AclI ApaLI ApoI AseI BanI BcgI BciVI Bme1580I BmrI BpmI BpuEI BsaHI BsaWI
BsaXI BseYI BsiEI BsiHKAI Bsp1286I BsrBI BsrDI BsrFI BstXI BstYI BtgZI BtsI DraI
EaeI EciI Eco57MI HaeII Hin4I Hin4I MmeI MslI MspA1I PpiI PpiI PvuII SfcI
SmlI SspI TaqII TaqII Xcm
Anhang
145
pIB30_SSHIFTF_GST_SSHIFTF
(Circular) (MinSite=6) MAP of: pIB30_SSHIFTF_GST_SSHIFTF.seq check: 6958 from: 1 to: 4457
ASSEMBLE August 1, 19105 16:09
Symbols: 1 to: 1331 from: catwt.seq ck: 424 , 1 to: 1331
pLisc_SAF: Cloning the VL gene from pHJ300FF with SacI/HindIII into
pLisc_SF to remove the KpnI site in VL. This enyzme now cuts once.
H11: Contains the H40 (P40A) and the H6364 (SA6364AD) mutation.
Symbols: 1332 to: 1375 from: pf_sshiftf_cat.seq ck: 6620, 8 to: 51 . . .
Using Enzyme data from: ~/../gcg_data/kk_annot_rebase.txt FileCheck: 8708
REBASE version 305 gcgenz.305
=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=
REBASE, The Restriction Enzyme Database http://rebase.neb.com
Copyright (c) Dr. Richard J. Roberts, 2003. All rights reserved.
=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=
Rich Roberts Apr 30 2003 . . .
Using translation scheme from: ~/../gcg_data/kk_translate1.txt FileCheck: 3604
met atg and val gtg as start codon modified by K. Mueller
Standard Translation Table
With 387 enzymes: *
MinOpen: 25 MaxCuts: 2
August 1, 19105 16:21 ..
PflMI lacI->
| |
ACCCGACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGTGAAACCAGTAACGTTA
1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 100
b V V N V K P V T L -
BstAPI
|
TACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAG
101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 200
b Y D V A E Y A G V S Y Q T V S R V V N Q A S H V S A K T R E K V E A -
CGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCT
201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300
b A M A E L N Y I P N R V A Q Q L A G K Q S L L I G V A T S S L A L -
GCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCC
301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 400
b H A P S Q I V A A I K S R A D Q L G A S V V V S M V E R S G V E A -
AflIII
MluI BclI
| |
TGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCT
401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 500
b C K A A V H N L L A Q R V S G L I I N Y P L D D Q D A I A V E A A C -
BbsI
|
GCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCA
501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600
b T N V P A L F L D V S D Q T P I N S I I F S H E D G T R L G V E H -
ApaI
BanII
BstEII PspOMI |
| | |
TCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACT
601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 700
b L V A L G H Q Q I A L L A G P L S S V S A R L R L A G W H K Y L T -
CGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCA
701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 800
b R N Q I Q P I A E R E G D W S A M S G F Q Q T M Q M L N E G I V P T –
BssHII EcoRV
| |
CTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATA
801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900
b A M L V A N D Q M A L G A M R A I T E S G L R V G A D I S V V G Y -
HincII
BbsI HpaI
| |
CGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAA
901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1000
b D D T E D S S C Y I P P L T T I K Q D F R L L G Q T S V D R L L Q -
Anhang
146
BsaXI
BbeI |
SfoI | |
NarI| | |
PvuII BsmBI KasI|| | |
| | ||| | |
CTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCC
1001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1100
b L S Q G Q A V K G N Q L L P V S L V K R K T T L A P N T Q T A S P R -
PvuII lacI-| CAP-> CAP-|
| | | |
GCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATT
1101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200
b A L A D S L M Q L A R Q V S R L E S G Q * -
lacO1->
mRNA_lac->
-35lac-| -10lac-| |
-35lac-> | -10lac-> | | lacO1-| S/DI-> lacZ'->
| | | | | | | |
AGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTA
1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1300
b -
lacZ-| BmtI
XbaI| NdeI NheI | EcoNI
|| | | | |
CGAATTTctagataacgagggcaacatATGGctagcAGTAGTCACATATTCACGTTCggtggctccggtggtggctctggcggtggcTCCCCTATACTAG
1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400
b M A S S S H I F T F G G S G G G S G G G S P I L G -
EcoO109I SapI
| |
GTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGA
1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500
b Y W K I K G L V Q P T R L L L E Y L E E K Y E E H L Y E R D E G D -
MscI
|
TAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCATCATA
1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1600
b K W R N K K F E L G L E F P N L P Y Y I D G D V K L T Q S M A I I -
NspI
AflIII |
TATA_box-> PciI |
| | |
CGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTG
1601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1700
b R Y I A D K H N M L G G C P K E R A E I S M L E G A V L D I R Y G V -
BstBI
XmnI |
| |
TTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCA
1701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800
b S R I A Y S K D F E T L K V D F L S K L P E M L K M F E D R L C H -
SwaI BclI hok/sok3'
| | |
TAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCG
1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1900
b K T Y L N G D H V T H P D F M L Y D A L D V V L Y M D P M C L D A -
ScaI
TatI |
| |
TTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCT
1901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2000
b F P K L V C F K K R I E A I P Q I D K Y L K S S K Y I A W P L Q G W -
GGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCCAAAATCGGATCTGggtggcggttctggtggcggctccggtggcAGTAGTCACATATTCACGTTCta
2001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100
b Q A T F G G G D H P P K S D L G G G S G G G S G G S S H I F T F * -
f1-ori-|
BstAPI f1ori_IG5'|
HindIII lpp-> DraIII lpp-| BamHI ||
| | | | | ||
gtaaaagcttGACCTGTGAAGTGAAAAATGGCGCACATTGTGCGACATTTTTTTTGTCTGCCGTTTACCGCTACTGCGTCACGGATCCCCACGCGCCCTG
2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2200
b -
TAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCC
2201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2300
b -
Anhang
147
f1ori_DNA5'
NaeI |
NgoMIV | |
| | |
TTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAAC
2301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400
b -
DraIII AloI AloI
BsaAI | f1ori_DNA3' | DrdI BsaXI |
| | | | | | |
TTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTT
2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2500
b -
PsiI
|
CCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAA
2501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2600
b -
padenyl_signal->
SspI f1ori_IG3' padenyl_signal-| |
| | | |
CAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCT
2601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700
b -
BspHI SspI bla_sig->
| | |
AAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGT
2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2800
b -
bla-> AcuI
bla_sig-|| BssSI |
|| | |
CGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGA
2801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2900
b -
XmnI
|
GTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTAT
2901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000
b -
ScaI
TatI |
| |
GTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGA
3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3100
b -
PvuI
|
AAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGA
3101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3200
b -
GGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACG
3201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300
b -
FspI
|
AGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTG
3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3400
b -
padenyl_signal->
padenyl_signal-| |
BglI | | BsaI
| | | |
GATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGC
3401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3500
b -
AhdI
|
GGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGA
3501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3600
b -
bla-|
|
TCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAA
3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3700
b -
Anhang
148
pUC_ori->
BspHI colEI_cas-> |
| | |
AAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAA
3701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3800
b -
GGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTAC
3801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3900
b -
AcuI ori_rep3'
| |
CAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGT
3901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4000
b -
AlwNI
|
AGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTA
4001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4100
b -
CCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGC
4101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4200
b -
ori_rep5' BssSI
| |
TATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGG
4201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4300
b M R K R H A S R R E K G G Q V S G K R Q G R N R R A H E G A S R G -
ori->
DrdI <-ori_ini
| |
AAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAAC
4301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4400
b K R L V S L * V M L V R G A E P M E K R -
PUC_ori-| colEI_cas-|
| |
GCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATG
4401 ---------+---------+---------+---------+---------+------- 4457
b Q Q R G L F T V P G L L L A F C S H -
Enzymes that do cut and were not excluded:
lacI-> lacI-| CAP-> CAP-| -35lac-> -35lac-| -10lac-> -10lac-| lacO1-> lacO1-| mRNA_lac-> S/DI-> lacZ'->
lacZ-| lpp-> lpp-| hok/sok3' f1ori_IG5' f1ori_IG3' f1ori_DNA5' f1ori_DNA3' bla_sig-> bla_sig-| bla->
bla-| colEI_cas-> colEI_cas-| ori-> <-ori_ini ori_rep5' ori_rep3' TATA_box-> f1-ori-| pUC_ori-> PUC_ori-|
padenyl_signal-> padenyl_signal-| AcuI AflIII AhdI AloI AlwNI ApaI BamHI BanII BbeI
BbsI BclI BglI BmtI BsaI BsaAI BsaXI BsmBI BspHI BssHII BssSI BstAPI BstBI
BstEII DraIII DrdI EcoNI EcoO109I EcoRV FspI HincII HindIII HpaI KasI MluI MscI
NaeI NarI NdeI NgoMIV NheI NspI PciI PflMI PsiI PspOMI PvuI PvuII SapI
ScaI SfoI SspI SwaI TatI XbaI XmnI
Enzymes that do not cut:
tHP-> tHP-| S/DII-> SD-2-> T7g10up1-> T7g10up1-| T7g10up2-> T7g10up2-| T7g10SD-> T7g10SD-| T7g10SDs->
T7g10SDs-| OmpA-> OmpA-| pelB-> pelB-| pelB_Sfi-| pelB_FseNot-> pelB_FseNot-| phoA-> phoA-| sFLAG->
sFLAG-| sFLAG_Eco-| lFLAG-> lFLAG-| glyli1-> glyli1-| glyli2-> glyli2-| glyli3-> glyli3-| glyli4-> glyli4-|
linkerA-> linkerA-| linkerB-> linkerB-| McPC_VH-> McPC_VH-| McPC_VL-> McPC_VLm-> McPC_VL-| McPCconst-> McPCconst-|
425_VH-> 425_VH-| 425_VL-> 425-VL1-| 425-VL2-| M1-VH-> M1-VH-| M1-VHm-| M1-VLs-> M1-VLl-> M1-VL-| hinge_v1->
hinge_v1-| hinge_v2-> hinge_v2-| hinge_v3-> hinge_v3-| hinge_v4-> hinge_v4-| zip-> zip-| Tzip-> Tzip-|
dhlx-> dhlx-| trimA-> trimA-| trimB-> trimB-| trimC-> trimC-| polzip-> polzip-| lacrepE-> lacrepE-| lacrepK->
lacrepK-| hetROPa-> hetROPa-| loopnewa-> loopnewa-| hetROPb-> hetROPb-| loopnewb-> loopnewb-| CH1-> CH1-|
CL-> CL-| biot37-> biot37-| biot54-> biot54-| groES-> groES-| p53-> p53-| spacer2-> spacer2-| spacer3->
spacer3-| his5-> his5-| his5EG-> his5EG-| his5-> his5-| his6-> his6-| T7term-> T7term-| hok/sok_ins5'
hok/sok_ins3' hok/sok5' hok5' hok3' sok5' sok3' parB5' parB3' skp_cas5' skp_cas3' skp5' skp3'
CAT-> CAT-| ori_rep_wt3' WinZipA1-> WinZipA1-| WinZipA2-> WinZipA2-| WinZipB1-> WinZipB1-| WinZipB2-> WinZipB2-|
DHFR[1]-> DHFR[1]-| DHFR[2]-> DHFR[2]-| dummy-> dummy-| CATdel6-| CATdel8-| CATdel9-| CATdel11-| CATdel4-> CATdel7->
CATdel11-> EGFP-> F64L S65T H231L EGFP-| transcript_start enhancer_region-> enhancer_region-| transl_ini->
transl_ini-| f1_ori-> SV40_ori-> SV40_ori-| CMV_promoter-> CMV_promoter-| mRNA_3'_end Kan/Neo-R-> Kan/Neo-R-| AarI
AatII AccI Acc65I AfeI AflII AgeI AleI AlfI AscI AsiSI AvaI AvrII BaeI
BbvCI BfrBI BglII BlpI BmgBI BplI Bpu10I BsaBI BseRI BsiWI BsmI BspEI BspMI
BsrGI BstZ17I Bsu36I BtgI ClaI CspCI EagI EcoICRI EcoRI FalI FseI FspAI KpnI
MfeI NcoI NotI NruI NsiI PacI PfoI PmeI PmlI PpuMI PshAI PspXI PsrI
PstI RsrII SacI SacII SalI SanDI SbfI SexAI SfiI SgrAI SmaI SnaBI SpeI
SphI SrfI StuI StyI Tth111I XhoI XmaI ZraI
Enzymes excluded; MinCuts: 1 MaxCuts: 2
AclI ApaLI ApoI AseI BanI BcgI BcgI BciVI Bme1580I BmrI BpmI BpuEI BsaHI
BsaWI BsaXI BseYI BsgI BsiEI BsiHKAI Bsp1286I BsrBI BsrDI BsrFI BstXI BstYI BtgZI
BtsI DraI EaeI EarI EciI Eco57MI HaeII Hin4I Hin4I MmeI MslI MspA1I PpiI
PpiI SfcI SmlI TaqII TaqII XcmI
Anhang
149
pKMEf425Bla
(Circular) (MinSite=6) MAP of: pKMEf425bla.seq check: 4352 from: 1 to: 5401
pAK400(length:5936bp)
Using Enzyme data from: ~/../gcg_data/kk_annot_rebase.txt FileCheck: 69
REBASE version 305 gcgenz.305
=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=
REBASE, The Restriction Enzyme Database http://rebase.neb.com
Copyright (c) Dr. Richard J. Roberts, 2003. All rights reserved.
=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=
Rich Roberts Apr 30 2003 . . .
Using translation scheme from: ~/../gcg_data/kk_translate1.txt FileCheck: 3604
met atg and val gtg as start codon modified by K. Mueller
Standard Translation Table
With 362 enzymes: *
MinOpen: 25 MaxCuts: 2
August 27, 19104 14:08 ..
EarI lacI->
| |
ACCCGACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGTGAAACCAGTAACGTTA
1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 100
c P T P S N G A K P F A V W H D S A R K R V N S G W * -
BstAPI
|
TACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAG
101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 200
c -
BsgI
|
CGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCT
201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300
c -
GCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCC
301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 400
c -
AflIII
MluI BclI BsgI
| | |
TGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCT
401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 500
c M T R M P L L W K L P -
BbsI
|
GCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCA
501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600
c A L M F R R Y F L M S L T R H P S T V L F S P M K T V R D W A W S I -
ApaI
PspOMI |
| |
TCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACT
601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 700
c W S H W V T S K S R C * -
BcgI
|
CGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCA
701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 800
c M R A S F P -
BssHII
|
CTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGACATCTCGGTAGTGGGATA
801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900
c L R C W L P T I R W R W A Q C A P L P S P G C A L V R T S R * -
HincII
BbsI HpaI
| |
CGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAA
901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1000
c -
Anhang
150
BbeI
SfoI |
NarI| |
KasI|| |
||| |
CTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCC
1001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1100
c -
KpnI
tHP-> |
lacI-|Acc65I| |
| || |
GCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGGTACCCGATAAAAGCGGCTTCCTGACAGGAGG
1101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200
c -
-35lac-| -10lac-|
tHP-| CAP-> CAP-| -35lac-> | -10lac-> |
| | | | | | |
CCGTTTTGTTTTGCAGCCCACCTCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGT
1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1300
c -
T7g10SDs-> pelB->
lacO1-> lacZ-| | T7g10SDs-||
mRNA_lac-> lacO1-| S/DI-> lacZ'-> XbaI| | NdeI||
| | | | || | |||
GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTTCTAGAGAAGGAGATATACATATGAAATACCTATTGCCT
1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400
c M K Y L L P -
sFLAG->
pelB_Sfi-||
NcoI ||
NaeI | ||
SfiI| | || 425_VH->
NgoMIV|| |pelB-||| sFLAG-|| PstI
||| | ||| || |
ACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCGGACTACAAAGACGAAGTGCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAAGC
1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500
c T A A A G L L L L A A Q P A M A D Y K D E V Q L Q Q S G A E L V K P -
StuI
|
CTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCCGGCTACACCTTCACCAGCCACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGGCTGGACAAGGCCTTGAGTG
1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1600
c G A S V K L S C K A S G Y T F T S H W M H W V K Q R A G Q G L E W -
EagI AccI
| |
GATCGGAGAGTTTAATCCCAGCAACGGCCGTACTAACTACAATGAGAAATTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTAC
1601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1700
c I G E F N P S N G R T N Y N E K F K S K A T L T V D K S S S T A Y -
NspI
|
ATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCCAGTCGGGACTATGATTACGACGGACGGTACTTTGACTACTGGGGCCAAG
1701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800
c M Q L S S L T S E D S A V Y Y C A S R D Y D Y D G R Y F D Y W G Q G -
glyli2->
BseRI 425_VH-|| 425_VL-> SacI
PshAI | Bsu36I || glyli2-|| EcoICRI |
| | | || || | |
GGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGACATCGAGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCAT
1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1900
c T T V T V S S G G G G S G G G G S G G G G S D I E L T Q S P A I M -
KpnI
FalI|
Acc65I ||
NspI | ||
BspMI AflIII | | ||
PstI | PciI | | || BamHI
| | | | | || |
GTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACTATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAACTTACATGTATTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAGA
1901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2000
c S A S P G E K V T M T C S A S S S V T Y M Y W Y Q Q K P G S S P R -
EcoO109I
AloI PpuMI
| |
CTCCTGATTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGTTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGG
2001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100
c L L I Y D T S N L A S G V P V R F S G S G S G T S Y S L T I S R M E -
Anhang
151
AscI
425-VL2-| BssHII
| |
AGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTCACATATTCACGTTCGGCTCGGGgACAGAACTgGAGATCAAACGgGGCTCGGGCGC
2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2200
c A E D A A T Y Y C Q Q W S S H I F T F G S G T E L E I K R G S G A -
bla-> BssSI
| |
GCCGGGTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATC
2201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2300
c P G H P E T L V K V K D A E D Q L G A R V G Y I E L D L N S G K I -
XmnI
|
CTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGC
2301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400
c L E S F R P E E R F P M M S T F K V L L C G A V L S R I D A G Q E Q -
ScaI
BcgI TatI |
| | |
AACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATG
2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2500
c L G R R I H Y S Q N D L V E Y S P V T E K H L T D G M T V R E L C -
PvuI
|
CAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGG
2501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2600
c S A A I T M S D N T A A N L L L T T I G G P K E L T A F L H N M G -
GATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGT
2601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700
c D H V T R L D R W E P E L N E A I P N D E R D T T M P V A M A T T L -
FspI
|
TGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTC
2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2800
c R K L L T G E L L T L A S R Q Q L I D W M E A D K V A G P L L R S -
BsaI
|
GGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCC
2801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2900
c A L P A G W F I A D K S G A G E R G S R G I I A A L G P D G K P S -
AhdI bla-|
| |
CGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGggcct
2901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000
c R I V V I Y T T G S Q A T M D E R N R Q I A E I G A S L I K H W A S -
BsaBI
SfiI his5->| his5-| HindIII lpp-> BstAPI lpp-|
| || | | | | |
cggGGGCCgatcaccatcatcaccatcattagtAAGCTTGACCTGTGAAGTGAAAAATGGCGCACATTGTGCGACATTTTTTTTGTCTGCCGTTTACCGC
3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3100
c G A D H H H H H H * M A H I V R H F F C L P F T A -
f1ori_IG5'
BamHI |
| |
TACTGCGTCACGGATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAG
3101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3200
c T A S R I P T R P V A A H * -
f1ori_DNA5'
NaeI |
NgoMIV | |
| | |
CGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAG
3201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300
c V -
BsaAI f1ori_DNA3'
| |
TGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAG
3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3400
c L Y G T S T P K N L I R V M V H V V G H R P D R R F F A L * -
AloI PsiI
| |
TCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGG
3401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3500
c V D S C S K L E Q H S T L S R S I L L I Y K G F C R F R -
Anhang
152
SspI f1ori_IG3'
| |
CCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGT
3501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3600
c P I G * V A L F G E M C -
GCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGtcgagacgttGGGTGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAAT
3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3700
c A E P L F V Y F S K Y I Q I C I R S C R D V G * -
Bpu10I CAT->
| |
AAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATA
3701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3800
c M E K K I T G Y T T V D I -
TCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGA
3801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3900
c S Q W H R K E H F E A F Q S V A Q C T Y N Q T V Q L D I T A F L K T -
BspEI
BsmI |
| |
CCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAgTTCCGTATGGCAATGAAAGACGG
3901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4000
c V K K N K H K F Y P A F I H I L A R L M N A H P E F R M A M K D G -
TGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTC
4001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4100
c E L V I W D S V H P C Y T V F H E Q T E T F S S L W S E Y H D D F -
CGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAG
4101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4200
c R Q F L H I Y S Q D V A C Y G E N L A Y F P K G F I E N M F F V S A -
MscI NcoI SspI
| | |
CCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGG
4201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4300
c N P W V S F T S F D L N V A N M D N F F A P V F T M G K Y Y T Q G -
CATdel8-|
ScaI |
CATdel9-|| |
CATdel11-| || |
BsmI | TatI|| |
| | ||| |
CGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTCTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGAT
4301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4400
c D K V L M P L A I Q V H H A V C D G F H V G R M L N E L Q Q Y C D -
CATdel6-| CAT-|
| |
GAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGATAATAAGCGGATGAATGGCAG
4401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4500
c E W Q G G A * M A E -
BstBI Tth111I AgeI
| | |
AAATTCGAAAGCAAATTCGACCCGGTCGTCGGTTCAGGGCAGGGTCGTTAAATAGCCGCTTATGTCTATTGCTGGTTTACCGGTTTATTGACTACCGGAA
4501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4600
c I R K Q I R P G R R F R A G S L N S R L C L L L V Y R F I D Y R K -
Bsu36I Bpu10I
| |
GCAGTGTGACCGTGTGCTTCTCAAATGCCTGAGGCCAGTTTGCTCAGGCTCTCCCCGTGGAGGTAATAATTGctcgACATGACCAAAATCCCTTAACGTG
4601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4700
c Q C D R V L L K C L R P V C S G S P R G G N N C S T * -
colEI_cas->
|
AGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAA
4701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4800
c -
ACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTC
4801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4900
c -
ori_rep3'
|
CTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTG
4901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5000
c V -
GCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTT
5001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5100
c A I S R V L P G W T Q D D S Y R I R R S G R A E R G V R A H S P A W -
Anhang
153
ori_rep5'
|
GGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGC
5101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5200
c S E R P T P N * -
BssSI
|
GGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTC
5201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5300
c -
ori->
<-ori_ini colEI_cas-|
| |
GATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACAT
5301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5400
c -
G
5401 - 5401
c -
Enzymes that do cut and were not excluded:
lacI-> lacI-| tHP-> tHP-| CAP-> CAP-| -35lac-> -35lac-| -10lac-> -10lac-| lacO1-> lacO1-| mRNA_lac->
S/DI-> lacZ'-> lacZ-| T7g10SDs-> T7g10SDs-| pelB-> pelB-| pelB_Sfi-| sFLAG-> sFLAG-| glyli2-> glyli2-|
425_VH-> 425_VH-| 425_VL-> 425-VL2-| his5-> his5-| lpp-> lpp-| f1ori_IG5' f1ori_IG3' f1ori_DNA5' f1ori_DNA3'
bla-> bla-| CAT-> CAT-| colEI_cas-> colEI_cas-| ori-> <-ori_ini ori_rep5' ori_rep3' CATdel6-| CATdel8-|
CATdel9-| CATdel11-| AccI Acc65I AflIII AgeI AhdI AloI ApaI AscI BamHI BbeI
BbsI BcgI BclI Bpu10I BsaI BsaAI BsaBI BseRI BsgI BsmI BspEI BspMI BssHII
BssSI BstAPI BstBI Bsu36I EagI EarI EcoICRI EcoO109I FalI FspI HincII HindIII HpaI
KasI KpnI MluI MscI NaeI NarI NcoI NdeI NgoMIV NspI PciI PpuMI PshAI
PsiI PspOMI PstI PvuI SacI ScaI SfiI SfoI SspI StuI TatI Tth111I XbaI
XmnI
Enzymes that do not cut:
S/DII-> SD-2-> T7g10up1-> T7g10up1-| T7g10up2-> T7g10up2-| T7g10SD-> T7g10SD-| OmpA-> OmpA-| pelB_FseNot->
pelB_FseNot-| phoA-> phoA-| sFLAG_Eco-| lFLAG-> lFLAG-| glyli1-> glyli1-| glyli3-> glyli3-| glyli4-> glyli4-|
linkerA-> linkerA-| linkerB-> linkerB-| McPC_VH-> McPC_VH-| McPC_VL-> McPC_VLm-> McPC_VL-| McPCconst-> McPCconst-|
425-VL1-| M1-VH-> M1-VH-| M1-VHm-| M1-VLs-> M1-VLl-> M1-VL-| hinge_v1-> hinge_v1-| hinge_v2-> hinge_v2-| hinge_v3->
hinge_v3-| hinge_v4-> hinge_v4-| zip-> zip-| Tzip-> Tzip-| dhlx-> dhlx-| trimA-> trimA-| trimB->
trimB-| trimC-> trimC-| polzip-> polzip-| lacrepE-> lacrepE-| lacrepK-> lacrepK-| hetROPa-> hetROPa-| loopnewa->
loopnewa-| hetROPb-> hetROPb-| loopnewb-> loopnewb-| CH1-> CH1-| CL-> CL-| biot37-> biot37-| biot54->
biot54-| groES-> groES-| p53-> p53-| spacer2-> spacer2-| spacer3-> spacer3-| his5EG-> his5EG-| his5->
his5-| his6-> his6-| T7term-> T7term-| hok/sok_ins5' hok/sok_ins3' hok/sok5' hok/sok3' hok5' hok3'
sok5' sok3' parB5' parB3' skp_cas5' skp_cas3' skp5' skp3' bla_sig-> bla_sig-| ori_rep_wt3' WinZipA1->
WinZipA1-| WinZipA2-> WinZipA2-| WinZipB1-> WinZipB1-| WinZipB2-> WinZipB2-| DHFR[1]-> DHFR[1]-| DHFR[2]-> DHFR[2]-|
dummy-> dummy-| CATdel4-> CATdel7-> CATdel11-> AarI AatII AfeI AflII AleI AlfI AsiSI
AvrII BaeI BbvCI BfrBI BglII BlpI BmgBI BmtI BplI BsiWI BspHI BsrGI BstZ17I
ClaI CspCI EcoNI EcoRI EcoRV FseI FspAI MfeI NheI NotI NruI NsiI PacI
PfoI PmeI PmlI PspXI PsrI RsrII SacII SalI SanDI SapI SbfI SexAI SgrAI
SmaI SnaBI SpeI SphI SrfI SwaI XhoI XmaI ZraI
Enzymes excluded; MinCuts: 1 MaxCuts: 2
AclI AcuI AloI AlwNI ApaLI ApoI AseI AvaI BanI BanII BcgI BciVI BglI
Bme1580I BmrI BpmI BpuEI BsaHI BsaWI BsaXI BsaXI BseYI BsiEI BsiHKAI BsmBI Bsp1286I
BsrBI BsrDI BsrFI BstEII BstXI BstYI BtgI BtgZI BtsI DraI DraIII DrdI EaeI
EciI Eco57MI HaeII Hin4I Hin4I MmeI MslI MspA1I PflMI PpiI PpiI PvuII SfcI
SmlI StyI TaqII TaqII XcmI
Anhang
154
pKB2_425_CBD_CBD
(Circular) (MinSite=6) MAP of: pKB2_425_CBD_CBD.seq check: 3317 from: 1 to: 5954
FEATURES Location/Qualifiers
-35_signal 17_20
/label=-35\lacI
-10_signal 42_48
/label=-10\lacI
CDS 83_1165 . . .
Using Enzyme data from: ~/../gcg_data/kk_annot_rebase.txt FileCheck: 6152
REBASE version 305 gcgenz.305
=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=
REBASE, The Restriction Enzyme Database http://rebase.neb.com
Copyright (c) Dr. Richard J. Roberts, 2003. All rights reserved.
=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=
Rich Roberts Apr 30 2003 . . .
Using translation scheme from: ~/../gcg_data/kk_translate1.txt FileCheck: 3604
met atg and val gtg as start codon modified by K. Mueller
Standard Translation Table
With 390 enzymes: *
MinOpen: 25 MaxCuts: 2
May 21, 19108 22:27 ..
EarI lacI->
| |
acccgacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgtta
1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 100
c P T P S N G A K P F A V W H D S A R K R V N S G W * -
tacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaag
101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 200
c -
cggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccct
201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300
c -
gcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcc
301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 400
c -
AflIII
ApaLI MluI BclI
| | |
tgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcct
401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 500
c M T R M P L L W K L P -
BbsI
|
gcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagca
501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600
c A L M F R R Y F L M S L T R H P S T V L F S P M K T V R D W A W S I -
ApaI
BstEII PspOMI |
| | |
tctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcact
601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 700
c W S H W V T S K S R C * -
BcgI
|
cgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttccca
701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 800
c M R A S F P -
BssHII
|
ctgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggacatctcggtagtgggata
801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900
c L R C W L P T I R W R W A Q C A P L P S P G C A L V R T S R * -
BbsI HpaI
| |
cgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaa
901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1000
c -
Anhang
155
BbeI
SfoI |
NarI| |
KasI|| |
||| |
ctctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctcccc
1001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1100
c -
KpnI
tHP-> |
AseI lacI-|Acc65I| |
| | || |
gcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcggtacccgataaaagcggcttcctgacaggagg
1101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200
c -
CAP-> -35lac-| -10lac-|
tHP-| AseI | CAP-| -35lac-> | -10lac-> |
| | | | | | | |
ccgttttgttttgcagcccacctcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgt
1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1300
c -
T7g10SDs-> pelB->
lacO1-> lacZ-| | T7g10SDs-||
mRNA_lac-> lacO1-| S/DI-> lacZ'-> XbaI| | NdeI||
| | | | || | |||
gtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgaatttctagagaaggagatatacatatgaaatacctattgcct
1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400
c M K Y L L P -
sFLAG->
pelB_Sfi-||
NcoI ||
NaeI | ||
BglI| | ||
SfiI| | || 425_VH->
NgoMIV|| |pelB-||| sFLAG-||
||| | ||| ||
acggcagccgctggattgttattactcgcggcccagccggccatggcggactacaaagacgaagtgcaactgcagcagtctggggctgaactggtgaagc
1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500
c T A A A G L L L L A A Q P A M A D Y K D E V Q L Q Q S G A E L V K P -
StuI
|
ctggggcttcagtgaagttgtcctgcaaggcttccggctacaccttcaccagccactggatgcactgggtgaagcagagggctggacaaggccttgagtg
1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1600
c G A S V K L S C K A S G Y T F T S H W M H W V K Q R A G Q G L E W -
AccI
|
gatcggagagtttaatcccagcaacggccgtactaactacaatgagaaattcaagagcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctac
1601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1700
c I G E F N P S N G R T N Y N E K F K S K A T L T V D K S S S T A Y -
NspI
|
atgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgtgccagtcgggactatgattacgacggacggtactttgactactggggccaag
1701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800
c M Q L S S L T S E D S A V Y Y C A S R D Y D Y D G R Y F D Y W G Q G -
BseRI glyli2->
BstEII 425_VH-|| 425_VL-> SacI
PshAI | Bsu36I || glyli2-|| EcoICRI |
| | | || || | |
ggaccacggtcaccgtctcctcaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgacatcgagctcacccagtctccagcaatcat
1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1900
c T T V T V S S G G G G S G G G G S G G G G S D I E L T Q S P A I M -
KpnI
FalI|
Acc65I ||
NspI | ||
AflIII | | ||
PciI | | || BamHI
| | | || |
gtctgcatctccaggggagaaggtcactatgacctgcagtgccagctcaagtgtaacttacatgtattggtaccagcagaagccaggatcctcccccaga
1901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2000
c S A S P G E K V T M T C S A S S S V T Y M Y W Y Q Q K P G S S P R -
EcoO109I
PpuMI
|
ctcctgatttatgacacatccaacctggcttctggagtccctgttcgtttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagccgaatgg
2001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100
c L L I Y D T S N L A S G V P V R F S G S G S G T S Y S L T I S R M E -
Anhang
156
EcoRI
XhoI 425-VL1-||
| ||
aggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagtcacatattcacgttcggctcggggacagaactcgagatcaaacgggaattcggcgg
2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2200
c A E D A A T Y Y C Q Q W S S H I F T F G S G T E L E I K R E F G G -
AhdI
AvrII MfeI |
| | |
tggctccgaaggcggtggcagcgaaggtggcggcctaggcaccacaaatcctggtgtatccgcttggcaggtcaacacagcttatactgcgggacaattg
2201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2300
c G S E G G G S E G G G L G T T N P G V S A W Q V N T A Y T A G Q L -
NheI
|
gtcacatataacggcaagacgtataaagctctgcagccccacacctccttggcaggatgggaaccatccaacgttcctgccttgtggcagcttcaagcta
2301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400
c V T Y N G K T Y K A L Q P H T S L A G W E P S N V P A L W Q L Q A S -
AhdI
BmtI StuI MfeI |
| | | |
gcggtggcctgaccggtctgaactcaggcctcacgacaaatcctggtgtatccgcttggcaggtcaacacagcttatactgcgggacaattggtcacata
2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2500
c G G L T G L N S G L T T N P G V S A W Q V N T A Y T A G Q L V T Y -
HindIII
BlpI |
BmtI| |
NheI || |
| || |
taacggcaagacgtataaagctctgcagccccacacctccttggcaggatgggaaccatccaacgttcctgccttgtggcagcttcaagctagctaagct
2501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2600
c N G K T Y K A L Q P H T S L A G W E P S N V P A L W Q L Q A S * -
f1-ori-|
f1ori_IG5'|
lpp-> lpp-| BamHI ||
| | | ||
tgacctgtgaagtgaaaaatggcgcacattgtgcgacattttttttgtctgccgtttaccgctactgcgtcacggatccccacgcgccctgtagcggcgc
2601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700
c M A H I V R H F F C L P F T A T A S R I P T R P V A A H -
attaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgcc
2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2800
c * -
f1ori_DNA5'
NaeI |
NgoMIV | |
| | |
acgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagg
2801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2900
c V L Y G T S T P K N L I R -
BsaAI f1ori_DNA3'
| |
gtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactgg
2901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000
c V M V H V V G H R P D R R F F A L * V D S C S K L E -
PsiI
|
aacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaattt
3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3100
c Q H S T L S R S I L L I Y K G F C R F R P I G * -
f1ori_IG3'
SspI f1_ori->|
| ||
aacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacatt
3101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3200
c V A L F G E M C A E P L F V Y F S K Y I -
caaatatgtatccgctcatgtcgagacgttgggtgaggttccaactttcaccataatgaaataagatcactaccgggcgtattttttgagttatcgagat
3201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300
c Q I C I R S C R D V G * -
CAT->
|
tttcaggagctaaggaagctaaaatggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttca
3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3400
c M E K K I T G Y T T V D I S Q W H R K E H F E A F Q -
DraI
|
gtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggccttt
3401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3500
c S V A Q C T Y N Q T V Q L D I T A F L K T V K K N K H K F Y P A F -
Anhang
157
BspEI
BsmI |
| |
attcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggagttccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttaca
3501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3600
c I H I L A R L M N A H P E F R M A M K D G E L V I W D S V H P C Y T -
ccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtg
3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3700
c V F H E Q T E T F S S L W S E Y H D D F R Q F L H I Y S Q D V A C -
PasI DraI
| |
ttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaac
3701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3800
c Y G E N L A Y F P K G F I E N M F F V S A N P W V S F T S F D L N -
MscI NcoI SspI
| | |
gtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatc
3801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3900
c V A N M D N F F A P V F T M G K Y Y T Q G D K V L M P L A I Q V H H -
CATdel6-|
CATdel8-| |
ScaI | |
CATdel9-|| | |
CATdel11-| || | |
BsmI | TatI|| | | CAT-|
| | ||| | | |
atgccgtttgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattacaacagtactgcgatgagtggcagggcggggcgtaatttttttaaggcagtta
3901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4000
c A V C D G F H V G R M L N E L Q Q Y C D E W Q G G A * -
BstBI Tth111I
| |
ttggtgcccttaaacgcctggttgctacgcctgaataagtgataataagcggatgaatggcagaaattcgaaagcaaattcgacccggtcgtcggttcag
4001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4100
c -
NotI
|
ggcagggtcgttaaatagccgcttatgtctattgctggtttaccggtttattgactaccggaagcagtgtgaccgtgtgcttctcaaatgcctgcggccg
4101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4200
c -
skp_cas5'
XhoI SpeI| BspHI SacII HpaI
| || | | |
cctcgagactagtagatcgtcctgggtcatgacaaccgcggacgcctggcacaagcctaaatgctcacggtattttgggttaaccatgaacgtaatgtga
4201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4300
c -
McPC_VL->
SgrAI EcoRV | AlfI
| | | |
cctgtttgtgcagattgcatggacgcaacgccggtgatgacgatatcgccatcaccgtgtagttctgcatccaactgctgcgctaaatcagccagtcgaa
4301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4400
c -
skp3' ClaI
| |
ttgaaggcattacttatttaacctgtttcagtacgtcggcagtgatgtcttttacatcgctgctgttgtaagcaacggcgtttgcatcaacaaccagatc
4401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4500
c -
EcoRV
BsaBI | BmgBI
| | |
gatatcctggctgttggcaacggatttcacagcagtctggatacgagtaaccagtttgccgcgttcttcgttggaacgacgtgcgcgatcctgctcaaaa
4501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4600
c V R D P A Q K -
AsiSI
BlpI BmgBI PvuI
| | |
gcctgcgctttctgagcaaaagtctggcgctgagccatcacgtctttttccagcttagtgcgatcgctgcccgctttcatggactgcagctttttcattt
4601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4700
c P A L S E Q K S G A E P S R L F P A * -
tagcctgcagatcggtttccatacgctgcagttcgctggcacggcctttgaactcattttccagcgtgttagaaacaccggttttctgcgctacctgctg
4701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4800
c -
Anhang
158
BsaI skp5'
| |
gaacaggctgcccatgttgacgattgcaattttgtcagccgcctgagcagaagttgccagtgctaaaccgagacctgcagctaataaccactttttcaca
4801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4900
c -
AlfI
|
ataaactccttaccatcccatttgcaccggagggtgcagttctttgcgtggcccggcgatcttatattgatcgcctaaagtcatcgctacactaccacta
4901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5000
c -
SexAI
|
cattcctttgtggagaacacttaccaggttttaccgatgttaaactggaactgttctgccttgtctccatcgtactttttgaacggctgggcgtaggaga
5001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5100
c V E N T Y Q V L P M L N W N C S A L S P S Y F L N G W A * -
NotI
skp_cas3' |
AccI | |
BcgI SalI| SpeI | |
| || | | |
acaccaacggccccaatggggacatccattgtaatgcgatacccgcagacatacggatattgcttggatctgtcgacactagtgcggccgctttgctcag
5101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5200
c -
pUC_ori->
colEI_cas-> |
| |
gctctccccgtggaggtaataattgctcgacatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaagga
5201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5300
c -
tcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaa
5301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5400
c V V C L P D Q E L P T -
ori_rep3'
|
ctctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagc
5401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5500
c L F P K V T G F S R A Q I P N T V L L V * -
accgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccg
5501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5600
c -
ApaLI
|
gataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctat
5601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5700
c -
ori_rep5' BssSI
| |
gagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaa
5701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5800
c -
ori->
<-ori_ini
|
cgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgcc
5801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5900
c -
PUC_ori-| colEI_cas-|
| |
agcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatg
5901 ---------+---------+---------+---------+---------+---- 5954
c M -
Enzymes that do cut and were not excluded:
lacI-> lacI-| tHP-> tHP-| CAP-> CAP-| -35lac-> -35lac-| -10lac-> -10lac-| lacO1-> lacO1-| mRNA_lac->
S/DI-> lacZ'-> lacZ-| T7g10SDs-> T7g10SDs-| pelB-> pelB-| pelB_Sfi-| sFLAG-> sFLAG-| glyli2-> glyli2-|
McPC_VL-> 425_VH-> 425_VH-| 425_VL-> 425-VL1-| lpp-> lpp-| skp_cas5' skp_cas3' skp5' skp3' f1ori_IG5'
f1ori_IG3' f1ori_DNA5' f1ori_DNA3' CAT-> CAT-| colEI_cas-> colEI_cas-| ori-> <-ori_ini ori_rep5' ori_rep3'
CATdel6-| CATdel8-| CATdel9-| CATdel11-| f1_ori-> f1-ori-| pUC_ori-> PUC_ori-| AccI Acc65I AflIII AhdI
AlfI ApaI ApaLI AseI AsiSI AvrII BamHI BbeI BbsI BcgI BclI BglI BlpI
BmgBI BmtI BsaI BsaAI BsaBI BseRI BsmI BspEI BspHI BssHII BssSI BstBI BstEII
Bsu36I ClaI DraI EarI EcoICRI EcoO109I EcoRI EcoRV FalI HindIII HpaI KasI KpnI
MfeI MluI MscI NaeI NarI NcoI NdeI NgoMIV NheI NotI NspI PasI PciI
PpuMI PshAI PsiI PspOMI PvuI SacI SacII SalI ScaI SexAI SfiI SfoI SgrAI
SpeI SspI StuI TatI Tth111I XbaI XhoI
Enzymes that do not cut:
S/DII-> SD-2-> T7g10up1-> T7g10up1-| T7g10up2-> T7g10up2-| T7g10SD-> T7g10SD-| OmpA-> OmpA-| pelB_FseNot->
pelB_FseNot-| phoA-> phoA-| sFLAG_Eco-| lFLAG-> lFLAG-| glyli1-> glyli1-| glyli3-> glyli3-| glyli4-> glyli4-|
Anhang
159
linkerA-> linkerA-| linkerB-> linkerB-| McPC_VH-> McPC_VH-| McPC_VLm-> McPC_VL-| McPCconst-> McPCconst-| 425-VL2-|
M1-VH-> M1-VH-| M1-VHm-| M1-VLs-> M1-VLl-> M1-VL-| hinge_v1-> hinge_v1-| hinge_v2-> hinge_v2-| hinge_v3-> hinge_v3-|
hinge_v4-> hinge_v4-| zip-> zip-| Tzip-> Tzip-| dhlx-> dhlx-| trimA-> trimA-| trimB-> trimB-|
trimC-> trimC-| polzip-> polzip-| lacrepE-> lacrepE-| lacrepK-> lacrepK-| hetROPa-> hetROPa-| loopnewa-> loopnewa-|
hetROPb-> hetROPb-| loopnewb-> loopnewb-| CH1-> CH1-| CL-> CL-| biot37-> biot37-| biot54-> biot54-|
groES-> groES-| p53-> p53-| spacer2-> spacer2-| spacer3-> spacer3-| his5-> his5-| his5EG-> his5EG-|
his5-> his5-| his6-> his6-| T7term-> T7term-| hok/sok_ins5' hok/sok_ins3' hok/sok5' hok/sok3' hok5'
hok3' sok5' sok3' parB5' parB3' bla_sig-> bla_sig-| bla-> bla-| ori_rep_wt3' WinZipA1-> WinZipA1-|
WinZipA2-> WinZipA2-| WinZipB1-> WinZipB1-| WinZipB2-> WinZipB2-| DHFR[1]-> DHFR[1]-| DHFR[2]-> DHFR[2]-| dummy->
dummy-| CATdel4-> CATdel7-> CATdel11-> EGFP-> F64L S65T H231L EGFP-| transcript_start enhancer_region->
enhancer_region-| TATA_box-> transl_ini-> transl_ini-| SV40_ori-> SV40_ori-| CMV_promoter-> CMV_promoter-| mRNA_3'_end
Kan/Neo-R-> Kan/Neo-R-| AarI AatII AfeI AflII AleI AscI BaeI BbvCI BfrBI BglII
BplI BsiWI BsrGI BstZ17I CspCI EcoNI FseI FspI FspAI NruI NsiI PacI PfoI
PmeI PmlI PspXI PsrI RsrII SanDI SapI SbfI SmaI SnaBI SphI SrfI SwaI
XmaI XmnI ZraI
Enzymes excluded; MinCuts: 1 MaxCuts: 2
padenyl_signal-> padenyl_signal-| AclI AcuI AgeI AloI AloI AlwNI ApoI AvaI BanI
BanII BcgI BciVI Bme1580I BmrI BpmI Bpu10I BpuEI BsaHI BsaWI BsaXI BsaXI BseYI
BsgI BsiEI BsiHKAI BsmBI Bsp1286I BspMI BsrBI BsrDI BsrFI BstAPI BstXI BstYI BtgI
BtgZI BtsI DraIII DrdI EaeI EagI EciI Eco57MI HaeII Hin4I Hin4I HincII MmeI
MslI MspA1I PflMI PpiI PpiI PstI PvuII SfcI SmlI StyI TaqII TaqII TstI
TstI XcmI pIB_425_TZip
(Circular) (MinSite=6) MAP of: pIB_425_TZip.seq check: 6825 from: 1 to: 4626
ASSEMBLE September 2, 19105 17:11
Symbols: 1 to: 1307 from: pkm30425pcchcl.seq ck: 3908, 1 to: 1307
Stammbaum: pASK30 - pLisc - pACKzip - pKMsclhfzip
kloniert aus SalI XbaI Verdau des pACKzip (Vektorfragment 3980Bp) und
pLisc_safh11 (Fragment 677 Bp)
enthaelt: McPc603sc, 3 Mutationen in der schweren Kette (h11), Linker . . .
Using Enzyme data from: ~/../gcg_data/kk_annot_rebase.txt FileCheck: 6152
REBASE version 305 gcgenz.305
=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=
REBASE, The Restriction Enzyme Database http://rebase.neb.com
Copyright (c) Dr. Richard J. Roberts, 2003. All rights reserved.
=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=
Rich Roberts Apr 30 2003 . . .
Using translation scheme from: ~/../gcg_data/kk_translate1.txt FileCheck: 3604
met atg and val gtg as start codon modified by K. Mueller
Standard Translation Table
With 390 enzymes: *
MinOpen: 25 MaxCuts: 2
September 2, 19105 17:16 ..
PflMI EarI lacI->
| | |
ACCCGACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGTGAAACCAGTAACGTTA
1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 100
b V V N V K P V T L -
BstAPI
|
TACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAG
101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 200
b Y D V A E Y A G V S Y Q T V S R V V N Q A S H V S A K T R E K V E A -
BsgI
|
CGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCT
201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300
b A M A E L N Y I P N R V A Q Q L A G K Q S L L I G V A T S S L A L -
GCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCC
301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 400
b H A P S Q I V A A I K S R A D Q L G A S V V V S M V E R S G V E A -
AflIII
MluI BclI BsgI TstI
| | | |
TGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCT
401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 500
b C K A A V H N L L A Q R V S G L I I N Y P L D D Q D A I A V E A A C -
GCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCA
501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600
b T N V P A L F L D V S D Q T P I N S I I F S H E D G T R L G V E H -
Anhang
160
ApaI
BanII
BstEII PspOMI |
| | |
TCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACT
601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 700
b L V A L G H Q Q I A L L A G P L S S V S A R L R L A G W H K Y L T -
BcgI
|
CGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCA
701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 800
b R N Q I Q P I A E R E G D W S A M S G F Q Q T M Q M L N E G I V P T -
BssHII EcoRV
| |
CTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATA
801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900
b A M L V A N D Q M A L G A M R A I T E S G L R V G A D I S V V G Y -
HincII
HpaI
|
CGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAA
901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1000
b D D T E D S S C Y I P P L T T I K Q D F R L L G Q T S V D R L L Q -
BbeI
SfoI |
NarI| |
PvuII BsmBI KasI|| |
| | ||| |
CTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCC
1001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1100
b L S Q G Q A V K G N Q L L P V S L V K R K T T L A P N T Q T A S P R -
PvuII lacI-| CAP-> CAP-|
| | | |
GCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATT
1101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200
b A L A D S L M Q L A R Q V S R L E S G Q * -
lacO1->
mRNA_lac->
-35lac-| -10lac-| |
-35lac-> | -10lac-> | | lacO1-| S/DI-> lacZ'->
| | | | | | | |
AGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTA
1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1300
b -
sFLAG->
pelB_Sfi-||
BtgI ||
NcoI ||
StyI ||
NaeI | ||
T7g10SDs-> pelB-> BglI| | ||
lacZ-| | T7g10SDs-|| SfiI| | ||
XbaI| | NdeI|| NgoMIV|| |pelB-|||
|| | ||| ||| | |||
CGAATTTctagagaaggagatatacatatgaaatacctattgcctacggcagccgctggattgttattactcgcggcccagccggccatggcggactaca
1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400
b M K Y L L P T A A A G L L L L A A Q P A M A D Y K -
425_VH->
sFLAG-|| PstI PflMI
|| | |
aagacgaagtgcaactgcagcagtctggggctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagttgtcctgcaaggcttccggctacaccttcaccagcca
1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500
b D E V Q L Q Q S G A E L V K P G A S V K L S C K A S G Y T F T S H -
StuI EagI
| |
ctggatgcactgggtgaagcagagggctggacaaggccttgagtggatcggagagtttaatcccagcaacggccgtactaactacaatgagaaattcaag
1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1600
b W M H W V K Q R A G Q G L E W I G E F N P S N G R T N Y N E K F K -
AccI NspI
| |
agcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgtgccagtc
1601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1700
b S K A T L T V D K S S S T A Y M Q L S S L T S E D S A V Y Y C A S R -
BseRI glyli2->
BstEII 425_VH-||
PshAI | BsmBI ||
StyI BtgI | | Bsu36I ||
| | | | | ||
gggactatgattacgacggacggtactttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcggg
1701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800
b D Y D Y D G R Y F D Y W G Q G T T V T V S S G G G G S G G G G S G -
Anhang
161
BanII
SacI
EcoICRI |
TstI | |
425_VL-> | | | BspMI
glyli2-|| | | | PstI |
|| | | | | |
tggcggcggatctgacatcgagctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcactatgacctgcagtgccagctcaagtgta
1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1900
b G G G S D I E L T Q S P A I M S A S P G E K V T M T C S A S S S V -
KpnI
FalI|
Acc65I ||
NspI | ||
AflIII | | ||
PciI | | || BamHI
| | | || |
acttacatgtattggtaccagcagaagccaggatcctcccccagactcctgatttatgacacatccaacctggcttctggagtccctgttcgtttcagtg
1901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2000
b T Y M Y W Y Q Q K P G S S P R L L I Y D T S N L A S G V P V R F S G -
EcoO109I
AloI PpuMI
| |
gcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagtcacatattcac
2001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100
b S G S G T S Y S L T I S R M E A E D A A T Y Y C Q Q W S S H I F T -
hinge_v2->
EcoRI | Tzip->
XhoI 425-VL1-|| | AccI hinge_v2-||
| || | | ||
gttcggctcggggacagaactcgagatcaaacgggaattcccgaaaccgtctaccccgccgggttcttctcgtctgaaacagatcgaagacaaactggaa
2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2200
b F G S G T E L E I K R E F P K P S T P P G S S R L K Q I E D K L E -
HindIII
Tzip-| | lpp->
| | |
gaaatcctgtctaaactgtaccacatcgaaaacgaactggctcgtatcaaaaaactgctgggtgaacgtTGATAAGCTTGACCTGTGAAGTGAAAAATGG
2201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2300
b E I L S K L Y H I E N E L A R I K K L L G E R * M A -
f1-ori-|
f1ori_IG5'|
BstAPI lpp-| BamHI ||
| | | ||
CGCACATTGTGCGACATTTTTTTTGTCTGCCGTTTACCGCTACTGCGTCACGGATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTG
2301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400
b H I V R H F F C L P F T A T A S R I P T R P V A A H * -
f1ori_DNA5'
NaeI |
NgoMIV | |
| | |
GTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTC
2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2500
b -
BsaAI
|
AAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCC
2501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2600
b V L Y G T S T P K N L I R V M V H V V G H -
f1ori_DNA3' AloI
| |
ATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCG
2601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700
b R P D R R F F A L * V D S C S K L E Q H S T L S R -
PsiI SspI
| |
GTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATAT
2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2800
b S I L L I Y K G F C R F R P I G * -
padenyl_signal->
f1ori_IG3' padenyl_signal-| | BspHI
| | | |
TAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAG
2801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2900
b V A L F G E M C A E P L F V Y F S K Y I Q I C I R S * -
SspI EarI bla_sig->
| | |
ACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGC
2901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000
b -
Anhang
162
bla->
bla_sig-|| BssSI
|| |
CTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCG
3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3100
b M L K I S W V H E W V T S N W I S T A -
XmnI
|
GTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGG
3101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3200
b V R S L R V F A P K N V F Q * V A R Y Y P V L T P G -
ScaI
BcgI TatI |
| | |
GCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGA
3201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300
b K S N S V A A Y T I L R M T W L S T H Q S Q K S I L R M A * -
PvuI
|
GAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACA
3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3400
b -
ACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGC
3401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3500
b -
FspI
|
AACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTT
3501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3600
b -
padenyl_signal->
padenyl_signal-| |
BglI | | BsaI
| | | |
CTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTA
3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3700
b -
AhdI
|
AGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCA
3701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3800
b -
bla-|
|
TTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAAT
3801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3900
b -
pUC_ori->
BspHI colEI_cas-> |
| | |
CTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCG
3901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4000
b -
TAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAG
4001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4100
b -
ori_rep3'
|
CAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATC
4101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4200
b -
CTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGG
4201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4300
b V A I S R V L P G W T Q D D S Y R I R R S G R A E R -
ori_rep5'
|
GGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAG
4301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4400
b G V R A H S P A W S E R P T P N * -
BssSI
|
AAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGG
4401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4500
b -
Anhang
163
ori->
<-ori_ini PUC_ori-|
| |
TTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGG
4501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4600
b -
colEI_cas-|
|
CCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATG
4601 ---------+---------+------ 4626
b -
Enzymes that do cut and were not excluded:
lacI-> lacI-| CAP-> CAP-| -35lac-> -35lac-| -10lac-> -10lac-| lacO1-> lacO1-| mRNA_lac-> S/DI-> lacZ'->
lacZ-| T7g10SDs-> T7g10SDs-| pelB-> pelB-| pelB_Sfi-| sFLAG-> sFLAG-| glyli2-> glyli2-| 425_VH-> 425_VH-|
425_VL-> 425-VL1-| hinge_v2-> hinge_v2-| Tzip-> Tzip-| lpp-> lpp-| f1ori_IG5' f1ori_IG3' f1ori_DNA5'
f1ori_DNA3' bla_sig-> bla_sig-| bla-> bla-| colEI_cas-> colEI_cas-| ori-> <-ori_ini ori_rep5' ori_rep3'
f1-ori-| pUC_ori-> PUC_ori-| padenyl_signal-> padenyl_signal-| AccI Acc65I AflIII AhdI AloI ApaI
BamHI BanII BbeI BcgI BclI BglI BsaI BsaAI BseRI BsgI BsmBI BspHI BspMI
BssHII BssSI BstAPI BstEII Bsu36I BtgI EagI EarI EcoICRI EcoO109I EcoRI EcoRV FalI
FspI HincII HindIII HpaI KasI KpnI MluI NaeI NarI NcoI NdeI NgoMIV NspI
PciI PflMI PpuMI PshAI PsiI PspOMI PstI PvuI PvuII SacI ScaI SfiI SfoI
SspI StuI StyI TatI TstI XbaI XhoI XmnI
Enzymes that do not cut:
tHP-> tHP-| S/DII-> SD-2-> T7g10up1-> T7g10up1-| T7g10up2-> T7g10up2-| T7g10SD-> T7g10SD-| OmpA-> OmpA-|
pelB_FseNot-> pelB_FseNot-| phoA-> phoA-| sFLAG_Eco-| lFLAG-> lFLAG-| glyli1-> glyli1-| glyli3-> glyli3-|
glyli4-> glyli4-| linkerA-> linkerA-| linkerB-> linkerB-| McPC_VH-> McPC_VH-| McPC_VL-> McPC_VLm-> McPC_VL-| McPCconst->
McPCconst-| 425-VL2-| M1-VH-> M1-VH-| M1-VHm-| M1-VLs-> M1-VLl-> M1-VL-| hinge_v1-> hinge_v1-| hinge_v3-> hinge_v3-|
hinge_v4-> hinge_v4-| zip-> zip-| dhlx-> dhlx-| trimA-> trimA-| trimB-> trimB-| trimC-> trimC-|
polzip-> polzip-| lacrepE-> lacrepE-| lacrepK-> lacrepK-| hetROPa-> hetROPa-| loopnewa-> loopnewa-| hetROPb-> hetROPb-|
loopnewb-> loopnewb-| CH1-> CH1-| CL-> CL-| biot37-> biot37-| biot54-> biot54-| groES-> groES-|
p53-> p53-| spacer2-> spacer2-| spacer3-> spacer3-| his5-> his5-| his5EG-> his5EG-| his5-> his5-|
his6-> his6-| T7term-> T7term-| hok/sok_ins5' hok/sok_ins3' hok/sok5' hok/sok3' hok5' hok3' sok5'
sok3' parB5' parB3' skp_cas5' skp_cas3' skp5' skp3' CAT-> CAT-| ori_rep_wt3' WinZipA1-> WinZipA1-|
WinZipA2-> WinZipA2-| WinZipB1-> WinZipB1-| WinZipB2-> WinZipB2-| DHFR[1]-> DHFR[1]-| DHFR[2]-> DHFR[2]-| dummy->
dummy-| CATdel6-| CATdel8-| CATdel9-| CATdel11-| CATdel4-> CATdel7-> CATdel11-> EGFP-> F64L S65T H231L
EGFP-| transcript_start enhancer_region-> enhancer_region-| TATA_box-> transl_ini-> transl_ini-| f1_ori-> SV40_ori->
SV40_ori-| CMV_promoter-> CMV_promoter-| mRNA_3'_end Kan/Neo-R-> Kan/Neo-R-| AarI AatII AfeI AflII
AgeI AleI AlfI AscI AsiSI AvrII BaeI BbvCI BfrBI BglII BlpI BmgBI BmtI
BplI Bpu10I BsaBI BsiWI BsmI BspEI BsrGI BstBI BstZ17I ClaI CspCI EcoNI FseI
FspAI MfeI MscI NheI NotI NruI NsiI PacI PasI PfoI PmeI PmlI PspXI
PsrI RsrII SacII SalI SanDI SapI SbfI SexAI SgrAI SmaI SnaBI SpeI SphI
SrfI SwaI Tth111I XmaI ZraI
Enzymes excluded; MinCuts: 1 MaxCuts: 2
AclI AcuI AloI AlwNI ApaLI ApoI AseI AvaI BanI BbsI BcgI BciVI Bme1580I
BmrI BpmI BpuEI BsaHI BsaWI BsaXI BsaXI BseYI BsiEI BsiHKAI Bsp1286I BsrBI BsrDI
BsrFI BstXI BstYI BtgZI BtsI DraI DraIII DrdI EaeI EciI Eco57MI HaeII Hin4I
Hin4I MmeI MslI MspA1I PpiI PpiI SfcI SmlI TaqII TaqII TstI XcmI
Anhang
164
pIB_SSHIFTF_BlaFLshuff3#6_TZip
(Circular) (MinSite=6) MAP of: pIB_SSHIFTF_BlaFLshuff3#6_Tzip.seq check: 8556 from: 1 to: 4789
ASSEMBLE July 19, 19105 14:12
Symbols: 1 to: 1381 from: pkje_blafl_shuff3_#6.seq ck: 4703, 1 to:
1381
blawt-Expr. in Minvektor
Planung:16.01.01
Symbols: 1382 to: 1426 from: pf_blass_sshiftf_li_bla_s3_#6.seq ck: 6985,
43 to: 87
ASSEMBLE July 12, 19105 09:42 . . .
Using Enzyme data from: ~/../gcg_data/kk_annot_rebase.txt FileCheck: 8708
REBASE version 305 gcgenz.305
=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=
REBASE, The Restriction Enzyme Database http://rebase.neb.com
Copyright (c) Dr. Richard J. Roberts, 2003. All rights reserved.
=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=
Rich Roberts Apr 30 2003 . . .
Using translation scheme from: ~/../gcg_data/kk_translate1.txt FileCheck: 3604
met atg and val gtg as start codon modified by K. Mueller
Standard Translation Table
With 387 enzymes: *
MinOpen: 25 MaxCuts: 2
July 19, 19105 14:27 ..
PflMI EarI lacI->
| | |
ACCCGACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGTGAAACCAGTAACGTTA
1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 100
c P T P S N G A K P F A V W H D S A R K R V N S G W * -
BstAPI
|
TACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAG
101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 200
c -
BsgI
|
CGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCT
201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300
c -
GCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCC
301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 400
c -
AflIII
MluI BclI BsgI
| | |
TGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCT
401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 500
c M T R M P L L W K L P -
GCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCA
501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600
c A L M F R R Y F L M S L T R H P S T V L F S P M K T V R D W A W S I -
ApaI
BanII
BstEII PspOMI |
| | |
TCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACT
601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 700
c W S H W V T S K S R C * -
BcgI
|
CGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCA
701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 800
c M R A S F P -
BssHII
|
CTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGACATCTCGGTAGTGGGATA
801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900
c L R C W L P T I R W R W A Q C A P L P S P G C A L V R T S R * -
Anhang
165
HincII
HpaI
|
CGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAA
901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1000
c -
BsaXI
BbeI |
SfoI | |
NarI| | |
KasI|| | |
||| | |
CTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCC
1001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1100
c -
KpnI
tHP-> |
lacI-|Acc65I| |
| || |
GCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGGTACCCGATAAAAGCGGCTTCCTGACAGGAGG
1101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200
c -
-35lac-| -10lac-|
tHP-| CAP-> CAP-| -35lac-> | -10lac-> |
| | | | | | |
CCGTTTTGTTTTGCAGCCCACCTCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGT
1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1300
c -
T7g10SDs-> bla_sig->
lacO1-> lacZ-| | T7g10SDs-||
mRNA_lac-> lacO1-| S/DI-> lacZ'-> XbaI| | NdeI||
| | | | || | |||
GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTTCTAGAGAAGGAGATATACAtATGagtattcaacatttc
1301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1400
c M S I Q H F -
BmtI
bla_sig-| |
NheI | | bla->
| | | |
cgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctAGcAGTCACATATTCACGTTCggtggcggtagcggtggcggtagtCACC
1401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500
c R V A L I P F F A A F C L P V F A S S H I F T F G G G S G G G S H P -
AcuI
BssSI |
| |
CAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTT
1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1600
c E T L V K V K D A E D Q L G A R V G Y I E L D L N S G K I L E S F -
XmnI
|
TCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAgGAGCAACTCGGTCGC
1601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1700
c R P E E R F P M M S T F K V L L C G A V L S R I D A G Q E Q L G R -
ScaI
BcgI TatI |
| | |
CGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCA
1701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800
c R I H Y S Q N D L V E Y S P V T E K H L T D G M T V R E L C S A A I -
PvuI FspI
| |
TAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTgCTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCgCAACATGGGGGATCATGTAAC
1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1900
c T M S D N T A A N L L L T T I G G P K E L T A F L R N M G D H V T -
FspI
|
TCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGAcGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTA
1901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2000
c R L D R W E P E L N E A I P N D E R D T T T P V A M A T T L R K L -
TTAtCTGGtGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGtCCTTCCGG
2001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100
c L S G E L L T L A S R Q Q L I D W M E A D K V A G P L L R S V L P A -
BsaI
|
CTGGtTGGTTTATaGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCtCGTATCGTAGT
2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2200
c G W F I A D K S G A G E R G S R G I I A A L G P D G K P S R I V V -
Anhang
166
AhdI bla-|
| |
TATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGaGCCTCACTGATTAAGCATtggGGTGGCggcggtggc
2201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2300
c I Y T T G S Q A T M D E R N R Q I A E I G A S L I K H W G G G G G -
SmaI
SrfI
AvaI |
XmaI | Tzip->
| | |
agcccgggcggtggcagccgtctgaaacagatcgaagacaaactggaagaaatcctgtctaaactgtaccacatcgaaaacgaactggctcgtatcaaaa
2301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400
c S P G G G S R L K Q I E D K L E E I L S K L Y H I E N E L A R I K K -
HindIII BstAPI
Tzip-| | lpp-> DraIII lpp-| BamHI
| | | | | |
aactgctgggtgaacgtTAGTAAGCTTGACCTGTGAAGTGAAAAATGGCGCACATTGTGCGACATTTTTTTTGTCTGCCGTTTACCGCTACTGCGTCACG
2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2500
c L L G E R * M A H I V R H F F C L P F T A T A S R -
f1-ori-|
f1ori_IG5'|
||
GATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTT
2501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2600
c I P T R P V A A H * -
f1ori_DNA5'
NaeI |
NgoMIV | |
| | |
TCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCA
2601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700
c V L Y G T -
DraIII AloI
BsaAI | f1ori_DNA3' |
| | | |
CCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTT
2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2800
c S T P K N L I R V M V H V V G H R P D R R F F A L * -
AloI
BsaXI | PsiI
| | |
AATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAA
2801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2900
c V D S C S K L E Q H S T L S R S I L L I Y K G F C R F R P I G * -
SspI f1ori_IG3'
| |
AAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCC
2901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000
c V A L F G E M C A E P L -
TATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGtcgagacgttGGGTGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACC
3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3100
c F V Y F S K Y I Q I C I R S C R D V G * -
Bpu10I CAT->
| |
GGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCAT
3101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3200
c M E K K I T G Y T T V D I S Q W H -
CGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAA
3201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300
c R K E H F E A F Q S V A Q C T Y N Q T V Q L D I T A F L K T V K K N -
BspEI
BsmI |
| |
ATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAgTTCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGAT
3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3400
c K H K F Y P A F I H I L A R L M N A H P E F R M A M K D G E L V I -
ATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTA
3401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3500
c W D S V H P C Y T V F H E Q T E T F S S L W S E Y H D D F R Q F L -
PflMI
|
CACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGG
3501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3600
c H I Y S Q D V A C Y G E N L A Y F P K G F I E N M F F V S A N P W V -
Anhang
167
BtgI
NcoI
MscI StyI SspI
| | |
TGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCT
3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3700
c S F T S F D L N V A N M D N F F A P V F T M G K Y Y T Q G D K V L -
CATdel6-|
CATdel8-| |
ScaI | |
CATdel9-|| | |
CATdel11-| || | |
BsmI | TatI|| | |
| | ||| | |
GATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTCTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGC
3701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3800
c M P L A I Q V H H A V C D G F H V G R M L N E L Q Q Y C D E W Q G -
CAT-| BstBI
| |
GGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGATAATAAGCGGATGAATGGCAGAAATTCGAAAGC
3801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3900
c G A * M A E I R K Q -
Tth111I AgeI
| |
AAATTCGACCCGGTCGTCGGTTCAGGGCAGGGTCGTTAAATAGCCGCTTATGTCTATTGCTGGTTTACCGGTTTATTGACTACCGGAAGCAGTGTGACCG
3901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4000
c I R P G R R F R A G S L N S R L C L L L V Y R F I D Y R K Q C D R -
Bsu36I Bpu10I BtgI
| | |
TGTGCTTCTCAAATGCCTGAGGCCAGTTTGCTCAGGCTCTCCCCGTGGAGGTAATAATTGctcgACATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCC
4001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4100
c V L L K C L R P V C S G S P R G G N N C S T * -
pUC_ori->
colEI_cas-> |
| |
ACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACC
4101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4200
c -
AcuI
|
AGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAG
4201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4300
c -
ori_rep3' AlwNI
| |
CCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGT
4301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4400
c V A I S R -
GTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGAC
4401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4500
c V L P G W T Q D D S Y R I R R S G R A E R G V R A H S P A W S E R P -
ori_rep5'
|
CTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGA
4501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4600
c T P N * -
BssSI
|
ACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGAT
4601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4700
c -
ori->
<-ori_ini PUC_ori-| colEI_cas-|
| | |
GCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATG
4701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+--------- 4789
c -
Enzymes that do cut and were not excluded:
lacI-> lacI-| tHP-> tHP-| CAP-> CAP-| -35lac-> -35lac-| -10lac-> -10lac-| lacO1-> lacO1-| mRNA_lac->
S/DI-> lacZ'-> lacZ-| T7g10SDs-> T7g10SDs-| Tzip-> Tzip-| lpp-> lpp-| f1ori_IG5' f1ori_IG3' f1ori_DNA5'
f1ori_DNA3' bla_sig-> bla_sig-| bla-> bla-| CAT-> CAT-| colEI_cas-> colEI_cas-| ori-> <-ori_ini
ori_rep5' ori_rep3' CATdel6-| CATdel8-| CATdel9-| CATdel11-| f1-ori-| pUC_ori-> PUC_ori-| Acc65I AcuI AflIII
AgeI AhdI AloI AlwNI ApaI AvaI BamHI BanII BbeI BcgI BclI BmtI Bpu10I
BsaI BsaAI BsaXI BsgI BsmI BspEI BssHII BssSI BstAPI BstBI BstEII Bsu36I BtgI
DraIII EarI FspI HincII HindIII HpaI KasI KpnI MluI MscI NaeI NarI NcoI
NdeI NgoMIV NheI PflMI PsiI PspOMI PvuI ScaI SfoI SmaI SrfI SspI StyI
TatI Tth111I XbaI XmaI XmnI
Anhang
168
Enzymes that do not cut:
S/DII-> SD-2-> T7g10up1-> T7g10up1-| T7g10up2-> T7g10up2-| T7g10SD-> T7g10SD-| OmpA-> OmpA-| pelB-> pelB-|
pelB_Sfi-| pelB_FseNot-> pelB_FseNot-| phoA-> phoA-| sFLAG-> sFLAG-| sFLAG_Eco-| lFLAG-> lFLAG-| glyli1->
glyli1-| glyli2-> glyli2-| glyli3-> glyli3-| glyli4-> glyli4-| linkerA-> linkerA-| linkerB-> linkerB-| McPC_VH->
McPC_VH-| McPC_VL-> McPC_VLm-> McPC_VL-| McPCconst-> McPCconst-| 425_VH-> 425_VH-| 425_VL-> 425-VL1-| 425-VL2-|
M1-VH-> M1-VH-| M1-VHm-| M1-VLs-> M1-VLl-> M1-VL-| hinge_v1-> hinge_v1-| hinge_v2-> hinge_v2-| hinge_v3-> hinge_v3-|
hinge_v4-> hinge_v4-| zip-> zip-| dhlx-> dhlx-| trimA-> trimA-| trimB-> trimB-| trimC-> trimC-|
polzip-> polzip-| lacrepE-> lacrepE-| lacrepK-> lacrepK-| hetROPa-> hetROPa-| loopnewa-> loopnewa-| hetROPb-> hetROPb-|
loopnewb-> loopnewb-| CH1-> CH1-| CL-> CL-| biot37-> biot37-| biot54-> biot54-| groES-> groES-|
p53-> p53-| spacer2-> spacer2-| spacer3-> spacer3-| his5-> his5-| his5EG-> his5EG-| his5-> his5-|
his6-> his6-| T7term-> T7term-| hok/sok_ins5' hok/sok_ins3' hok/sok5' hok/sok3' hok5' hok3' sok5'
sok3' parB5' parB3' skp_cas5' skp_cas3' skp5' skp3' ori_rep_wt3' WinZipA1-> WinZipA1-| WinZipA2->
WinZipA2-| WinZipB1-> WinZipB1-| WinZipB2-> WinZipB2-| DHFR[1]-> DHFR[1]-| DHFR[2]-> DHFR[2]-| dummy-> dummy-|
CATdel4-> CATdel7-> CATdel11-> EGFP-> F64L S65T H231L EGFP-| transcript_start enhancer_region->
enhancer_region-| TATA_box-> transl_ini-> transl_ini-| f1_ori-> SV40_ori-> SV40_ori-| CMV_promoter-> CMV_promoter-|
mRNA_3'_end Kan/Neo-R-> Kan/Neo-R-| AarI AatII AccI AfeI AflII AleI AlfI AscI AsiSI
AvrII BaeI BbvCI BfrBI BglI BglII BlpI BmgBI BplI BsaBI BseRI BsiWI BspHI
BspMI BsrGI BstZ17I ClaI CspCI EagI EcoICRI EcoNI EcoO109I EcoRI EcoRV FalI FseI
FspAI MfeI NotI NruI NsiI NspI PacI PciI PfoI PmeI PmlI PpuMI PshAI
PspXI PsrI PstI RsrII SacI SacII SalI SanDI SapI SbfI SexAI SfiI SgrAI
SnaBI SpeI SphI StuI SwaI XhoI ZraI
Enzymes excluded; MinCuts: 1 MaxCuts: 2
padenyl_signal-> padenyl_signal-| AclI ApaLI ApoI AseI BanI BbsI BcgI BciVI Bme1580I
BmrI BpmI BpuEI BsaHI BsaWI BsaXI BseYI BsiEI BsiHKAI BsmBI Bsp1286I BsrBI BsrDI
BsrFI BstXI BstYI BtgZI BtsI DraI DrdI EaeI EciI Eco57MI HaeII Hin4I Hin4I
MmeI MslI MspA1I PpiI PpiI PvuII SfcI SmlI TaqII TaqII XcmI