This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

Enzym-Elektrophorese in Einschluß-Polymerisaten des Acrylamids. A. Amylasen, Phosphorylasen

R O L F S I E P M A N N u n d H E R M A N N S T E G E M A N N

Institut für Biochemie der Biologischen Bundesanstalt, D 351 Hann.-Münden

(Z . Naturforschg. 22 b, 949—955 [ 1 9 6 7 ] ; eingegangen am 24. Februar 1967)

Amylases of bacteria, barley, sweet potatoes, and white potatoes were separated by electro-phoresis in Polyacrylamide gels containing soluble starch. After incubation in acetate buffer and staining in iodine solution, the zones of enzyme activity remained unstained. The zones of crystal-line a-amylase (bacillus subtilis) and of crude a-amylase (bacteriae) were found to be identical. The main zone of the crystalline ^-amylase (Ipomoea batatas) was identical with the zone of crude /̂ -amylase (barley) and with the amylase zone of the potato (Solanum tuberosum) extracts. Using 5 mm slots, 1 ng of amylase is traceable. Crystalline /?-amylase yielded, in addition to the main zone, a minor zone nearer to the anode. The a-amylases had three zones of different properties.

Phosphorylases were demonstrated as starch synthesizing and as starch degrading enzymes by making use of the reaction: "glycogen + glucose-l-phosphat ^ starch+phosphate". Glycogen was polymerized into the gel to demonstrate the synthesis of starch, and incubation was carried out with glucose-1-phosphate. The starch formed was stained with iodine. The extracts of freshly harvested tubers yielded four zones, whereas those of stored tubers yielded two zones, and leaves and sprouts each showed one zone. — To observe starch degradation by phosphorylases, starch was polymerized into the Polyacrylamide, and the gels were incubated in phosphate buffer. After treatment with iodine, an unstained zone was observed which corresponded to the most intense phosphorlase zone (close to the anode) in the glycogen gel. This zone was more intense in the tuber extracts than in leaves and sprouts.

Pig heart extract contained the phosphorylase in the b form. Three zones have been observed. — Extracts of rat muscle and heart yielded phosphorylases which corresponded in their migration rate and in their requirement for adenosine-5'-monophosphate to the b form of pig heart phosphorylase. The same was true for the migration rate of liver phosphorylase.

Crystalline a-phosphorylase of rabbit muscle required the addition of cystein to the electro-phoresis buffer during separation. Two zones of activity could be demonstrated.

Die gel-elektrophoretische Auftrennung der Pro-teine und einiger Enzyme von Kartoffeln zeigte, daß die Vorratsproteine der Knolle sortenspezifisch, also genetisch bedingt sind, und nicht von der Düngung usw. beeinflußt werden. Ein Zusammenhang mit dem Virusbefall war nicht sicher zu beobachten 2 .

Unter den Enzymen vermutet man seit langem direkte oder mittelbare Träger von Resistenzeigen-schaften gegen mikrobiellen Befall3 . Hier werden vor allem die Oxidasen genannt, aber es besteht kein Grund, andere an entscheidenden Auf- oder Abbau-vorgängen beteiligten Fermente auszuschließen. Unter den Katalysatoren des Kohlenhydrat-Stoff-wechsels sind die Amylasen und Phosphorylasen noch dadurch ausgezeichnet, daß sie entweder emi-nente Bedeutung in der fabrikatorischen Verarbei-tung von stärkehaltigen Produkten haben 4 oder in

1 V. LOESCHCKE U. H . STEGEMANN, Phytochemistry 5,985 [1966]. 2 V. LOESCHCKE U. H . STEGEMANN, Z. Naturforschg. 21 b, 879

[1966]. 3 K. TOMIYAMA, Annu. Rev. Phytopathology 1, 295 [1963]. 4 Enzymes in Food Processing, herausgeg. von G. REED,

Acad. Press, New York 1966.

der klinischen Biochemie Aufschluß geben über pathologische Veränderungen5 . Die vorliegende Arbeit bringt einige Ergebnisse über die zuletzt ge-nannten Enzyme aus Bakterien, höheren Pflanzen und Säugetiermuskel nach Gel-Elektrophorese. Als Trennmedium diente Polyacrylamid ( P A A ) , in das während der Polymerisation ein hochmolekulares Substrat oder der Starter (primer) eingeschlossen wurde. Neben den abbauenden Eigenschaften eines Enzyms wird hier die synthetische Leistung im Gel zu einem äußerst empfindlichen Nachweis herange-zogen.

Material

Kartoffelknollen der Sorten Rosa und Magna, Keime von Magna und Aquila und Blätter von Magna. Ein Teil der Knollen der Sorte Magna lagerte von Oktober

5 Physiologische Chemie, herausgeg. von B. FLASCHENTRÄGER u. E. LEHNARTZ, Springer, Berlin (1951 — 1966), speziell Band I I / 2 a; R . L . SEARCY, P . WILDING U. J . E. B E R K , Clin, chim. Acta [Amsterdam] 15, 189 [1967] ; D-Glucose u. verw. Verbindungen, herausgeg. von H . BARTHELHEIMER, W . HEYDE U. W . THORN, F . Enke-Verlag, Stuttgart 1966.

1965 bis Juli 1966 bei + 2 ° C / + 8 ° C im Keller, ein anderer Teil und die Knollen von Rosa waren frisch geerntet worden. Keime der Sorte Magna und Aquila wurden im Juli von vorjährigen Knollen abgebrochen, gewaschen, tiefgefroren und (wie für Knollen beschrie-ben) entsaftet. Blätter von Magna waren im August auf unserem Versuchsfeld geerntet worden. Die weitere Behandlung zur Gewinnung des Saftes erfolgte wie bei den Knollen und Keimen. — Die gewaschenen Knollen wurden in der Tiefkühltruhe bei —20 °C ca. 24 Stdn. durchgefroren, partiell aufgetaut, nach Ab-ziehen der Schale in Stücke zerschnitten und möglichst rasch in einem stabilen Perlontuch mit einer hydrau-lischen Presse entsaftet 6. Der Saft wurde sofort 20 Min. bei 8000 g und 2° zentrifugiert, der Überstand für die Enzymuntersuchungen portionsweise eingefroren. Mehr-maliges Auftauen des eingefrorenen Saftes ist wegen des damit verbundenen Verlustes an Enzymaktivität zu vermeiden.

Das Herz eines frisch geschlachteten Schweines wurde in Scheiben geschnitten, auf Eis gelegt und alsbald in einem Multimix mit Eisstücken zerkleinert, durch ein Perlontuch gepreßt, der Saft unter Kühlung bei 8000 g zentrifugiert und der Uberstand für die Phosphorylase-Untersuchung eingefroren. — Ratten waren zuerst mit 50 mg/kg Pentabarbital-Natrium intraperitoneal nar-kotisiert worden und anschließend wurde 0,3 mg/kg Dihydroergotamin subcutan injiziert. Herz, Leber und Muskel waren im tiefgefrorenen Zustand zerkleinert, bei 0 °C in Substratlösung, pn 6,0 (0,02-m. Glucose-1-phosphat, 0,03-m. Natrium-/?-glycerophosphat, 0,5% Glykogen) zerrieben und bei 10000 g unter Kühlung zentrifugiert worden. Den Uberstand benutzten wir für die Phosphorylase-Untersuchung *.

Vergleichsenzyme

Amylasen: Krist. ct-Amylase aus Bacillus subtilis (Nagase, Osaka, Japan), bakerielle nicht krist. a-Amy-lase (Mann Res. Lab., New York), krist. /^-Amylase aus Bataten (Worthington, Freehold, N. J., Charge BA 5642), nicht krist. /^-Amylase aus Gerste (Nutr. Bio-chem. Corp., Cleveland, Kontroll-Nr. 6059). Die a- und ß-Amylase-Enzympräparate wurden gelöst und ver-dünnt in 0,04-m. Acetatpuffer, pn 5,6.

Phosphorylase: Krist. a-Phosphorylase aus Kanin-chenmuskel (Mann Res. Lab., New York), Verdünnun-gen in Puffer von 0,0015-m. EDTA/0,l-m. Natrium-fluorid/0,002-m. Natrium-/?-glycerophosphat, mit Essig-säure auf PH 6,6 eingestellt.

Methoden

a) Bestimmung der Aktivität

1 ml Amylaselösung oder Extrakt wurde mit 0,75 ml 0,04-m. Acetatpuffer PH 5,6, 2,70 ml 0,1-proz. Stärke-lösung und 0,05 ml 1 -m. Calciumchloridlösung bei 37 °C bzw. 50 °C für 15 bzw. 60 Min. bebrütet, dann sofort mit Eiswasser gekühlt, 0,2 ml 10-proz. Schwefel-

säure zugesetzt (zentrifugieren falls ein Niederschlag auftritt), mit Wasser auf etwa 20 ml gebracht, gefolgt von 1 ml 0,01-m. Jodlösung (in 0,014-m. KJ) und mit Wasser auf 25 ml aufgefüllt. Die Extinktion bei 620 nm der auf Raumtemperatur gebrachten Testlösungen wurde dann mit der Extinktion von Standard-Stärke-lösungen verglichen. (Einzelheiten und Diskussion die-ser Bestimmung vgl. S T E G E M A N N , LOESCHCKE und S I E P -

MANN, European Potato Journal, in Vorbereitung.) Die kristalline Phosphorylase testeten wir nach C O R I

et al. 7.

b) Gel-Elektrophoresen

Die Gelelektrophorese wurde durchgeführt wie bei 1. c . 2 , jedoch mit Umlaufpumpe. Das Gel bereiteten wir aus 5% Acrylamid, 0,3% V.V'-Methylenbisacryl-amid und 0,1% lösliche Stärke nach Z U L K O W S K I bzw. Glykogen (Merck 1257 bzw. 4202) in Puffer, zur Polymerisation von 100 ml setzten wir zu 190 /A Di-methylaminopropionitril und 160 mg frisches Ammo-niumpersulfat. Für die Trennungen benutzten wir die Apparatur für senkrechte Elektrophorese der E. C. App. Corp., Philadelphia, mit der Matritze zur Her-stellung von vier Trögen. Bromphenolblau als Leit-farbstoff wurde jeweils nur dem Saft von einer Bahn kurz vor dem Füllen der Tröge zugegeben, um eine Beeinflussung der Enzyme möglichst zu vermeiden.

Puffer: a) 0,042-m. Tris (mit 0,0017-m. EDTA/ 0,050-m. Borsäure) pn 8,2 und b) 0,038-m. Borsäure (mit 0,01-m. NaCl/0,004-m. Natriumtetraborat) pn 8,2. — Bei Benutzung des Trispuffers und einer Kühl-sole von —3 °C (150 mA, 300 V) betrug die Laufzeit 70 bis 80 Min., mit dem Boratpuffer (150 mA, 150 V) ca. 140 Minuten.

Die Gele wurden nach der Elektrophorese in Längs-streifen geschnitten und je nach Bebrütungsart 10 Min. bei 0° gewaschen in 0,04-m. Acetatpuffer PH 5,6 (mit 0,02-m. CaCl2) oder in 0,1-m. Natriumcitrat-NaOH-Puffer pn 5,1 resp. 6,6 oder in 0,067-m. Phosphat (Sö-rensen) pu 5,1 resp. PH 7,0. Danach bebrütet man die Gelstreifen zum Nadiweis der Amylasen in dem stärke-haltigen Gel eine Stde. bei 50 °C in 0,04-m. Acetat-puffer pn 5,6 (mit 0,02-m. CaCl2), zum Nachweis der Phosphorylasen im glykogenhaltigen Gel vier Stdn. bei 30 °C in 0,1-m. Citratpuffer mit 0,02-m. des Dikalium-salzes von A-D-Glucose-1-phosphat (G-l-P), eingestellt auf pn 5,1. Bei einigen Gelstreifen setzten wir Cystein-hydrochlorid (0,06-m.) zur Inkubationslösung (Citrat-puffer pn 6,6 mit G-l-P) zu, wodurch sich der pH-Wert auf 5,1 einstellte. Zum Nachweis der Phosphorylase in Gelen mit Stärke wurde vier Stdn. bei 30 °C in 0,067-m. Phosphatpuffer PH 5,1 inkubiert.

6 H. STEGEMANN u. V. LOESCHCKE, Z. Naturforschg. 1 8 B , 195 [1963].

* Wir danken Herrn Dr. H.-D. SÖLING (Göttingen) für die Präparation der Rattenorgane.

7 G . T . CORI , B . ILLINGWORTH U. P . J . KELLER, i n : S . P . COLO-WICK and N. O . KAPLAN, Meth. Enzymol., Bd. 1 , S . 2 0 0 , Academic Press, New York 1955.

R. S I E P M A N N und H. S T E G E M A N N , Enzym-Elektrophorese in Einschluß-Polymerisaten des Acrylamids. A. Amylasen, Phosphory-lasen (S. 949)

Abb. 3. Abb. 4.

m

Abb. 5. Abb. 6.

• I

Abb. 7.

Bei einigen Extrakten aus Tierorganen lag die Phos-phorylase in der b -Form vor. Es mußte hier außer dem G - l - P noch Adenosin-5 ' -monophosphat (0,001-m.) zuge-setzt werden, der pH-Wert der Inkubationslösung wurde auf 6,6 eingestellt.

Nach dem Inkubieren kamen die Gele in eine 0,01 -m. Jodlösung (in 0,014-m. KJ-Lösung) . Bei den mit Cystein inkubierten Streifen mußte wegen der starken Reduktionswirkung des Cysteins mehrere Stdn. mit mehrmals gewechselter Jodlösung angefärbt werden. Z u m Aufbewahren der gefärbten Gele diente 5-proz. Essigsäure in 30% Methanol.

Ergebnisse

A m y l a s e n

a) Vergleich einer Standard-Aktivitätsbestimmung mit unserem Nachweis in Polyacrylamid

Vergleicht man die in Spaltansätzen durchgeführ-ten quantitativen Aktivitätsbestimmungen (ausführ-liche Darstellung im European Potato Journal, in Vorbereitung) mit der qualitativ festzustellenden Aufhellung des PAA-Gels, so entsprechen intensive Banden im Elektrophorese-Test 5 0 - 9 0 % Spaltung

in den quantitativen Ansätzen: es ist das die Enzym-menge, die bei 50 °C in 15 Min. von 2,7 mg Stärke 50 — 90% hydrolysiert. Das entspricht bei einer 20 mm breiten Phoresebahn 100 — 200 Nanogramm kristalliner ot-Amylase (B. subtilis) oder einer glei-chen Menge ß-Amylase (Batate). Bei den nicht kri-stallinen a- (Bakterien) - und ß- (Gerste)-Amylasen erwies sich für die Elektrophorese 20 /ug als geeig-nete Enzymmenge (Abb. 1)* . Die Nachweisempfind-lichkeit liegt für die kristallinen Amylasen in einer 5-mm-Bahn unter einer Nanogramm. Für die kri-stalline a-Amylase zeigt die Abb. 2 eine Konzentra-tionsreihe.

b) Vergleich von Amylase-Eigenschaften verschiede-nen Ursprungs

Für die Phorese benutzten wir pro Bahn 200 /u\ Preß-Saft aus Knollen, Blättern und Keimen von Kartoffeln und verglichen die erhaltenen Zonen mit den käuflichen Präparaten (Abb, 1) . Die kristalline und die rohe a-Amylase haben identische Aktivitäts-zonen, im Kartoffelsaft war sie nicht nachweisbar. Die kristalline /^-Amylase aus Bataten ist in ihrer

Abb. 1. a- und /?-Amylasen. Nachweis im PAA-Gel mit 0,1% Stärke nach Elektrophorese in Trispuffer, Anode hier und bei allen folgenden Abbildungen unten, von links nach rechts: 20/ug nicht kristalline a- Amylase aus Bakterien. 20 /ug nicht kristalline /?-Amylase aus Gerste. 200 ng kristalline a-Amy-lase aus Bacillus subtilis. 200 ng kristalline ß-Amylase aus Ipomoea batatas. 200 /ul Saft aus „Magna"-Knollen. Bebrü-

tung 1 Stde. bei 50° in Acetatpuffer pn 5,6.

Abb. 2. a-Amylase (kristallin) aus Bacillus subtilis. Nach-weis im PAA-Gel mit 0,1% Stärke nach Elektrophorese in Boratpuffer. Von links nach rechts 200, 50, 10 und 2 Nano-

gramm Enzym. Bebrütung wie bei Abb. 1.

Abb. 3. /?-Amy läse, Q-Enzym (? ) und Phosphorylasen in 200 /u 1 Saft aus Kartoffelknollen Sorte „Rosa" nach PAA-Elektrophorese (Bahn 1 mit 0,1% Stärke, Bahn 2 und 3 mit 0,1% Glykogen) in Boratpuffer. Puffer für 4-stdg. Bebrütung bei 30° von links nach rechts: Acetat pH 5,6; Phosphat pH 7,0 mit Glucose-l-phosphat; desgleichen pH 5,1. Bahn 2 und 3 :

Phosphorylasen. Q-Enzym (? ) auf Bahn 1 unten.

Abb. 4. Phosphorylasen in abnehmender Konzentration aus „Rosa"-Knollen. Nachweis im PAA-Gel mit 0,1% Glykogen nach Elektrophorese in Boratpuffer. Von links nach rechts |>1] 50, 10, 2,5, 0,5 Saft. Zum Füllen der Tröge jeweils 200 /u\ entsprechende Saft-Verdünnung in 0,06-m. Cystein-lösung (pH 6,6) benutzt. Bebrütung 4 Stdn. bei 30 °C mit

Glucose-l-phosphat in Citratpuffer pH 5,1.

* Abbn. 1 - 7 s. Tafel S. 950 a u. b.

Abb. 5. Verschiedene Phosphorylasen aus „Rosa"-Knollen, „Aquila"-Keimen und „Aquila"-Keimspitzen. Nachweis im PAA-Gel mit 0,1% Glykogen (Bahnen 1, 3, 5, 6) , bzw. Stärke (Bahnen 2, 4) nach Elektrophorese in Boratpuffer. Bahnen 1 und 2 : 200 /ul Saft „Rosa"-Knollen; Bahnen 3 und 4 : 200 //I Saft „Aquila"-Keime; 5 : 2 0 0 / d Saft „Aquila"-Keimspitzen; 6 : 200 /ul Saft „Magna"-Knollen, vorjährige Ernte, Bebrü-tung 4 Stdn. bei 30 °C mit Glucose-l-phosphat in Citratpuffer PH 5,1 (Bahnen 1, 3, 5, 6) in Phosphatpuffer pu 5,1 (Bah-

nen 2, 4) .

Abb. 6. Phosphorylase-Isoenzyme aus Schweineherzmuskel (Bahnen 1 a, 1 b, 2, 3) und a-Phosphorylase (kristallin) aus Kaninchenmuskel (Bahnen 4, 5) . Nachweis im PAA-Gel mit 0,1% Glykogen nach Elektrophorese in Boratpuffer (Bahn 1), in Trispuffer (Bahnen 2, 3) und in Boratpuffer mit Cystein (Bahnen 4, 5) . Bahn 1 mit 200 /ul, Bahn 2 mit 5 /ul, Bahn 3 mit 2,5 ,«1 Extrakt, Bahnen 4 und 5 mit 1,3 pg kristalliner a-Phosphorylase in EDTA/Natrium-/?-Glycerophosphat, pn 6,6. Bebrütung 4 Stdn. bei 30 ° C : Bahn l a mit Glucose-l-phosphat in Citratpuffer PH 6,6 und Adenosin-5'-monophos-phat, Bahn 1 b ohne AMP. Bahnen 2, 3, 5 : Bedingungen wie

1 a, Bahn 4 : Bedingungen wie 1 b.

Abb. 7. Phosphorylase aus Rattenorganen. Nachweis im PAA-Gel mit 0,1% Glykogen nach Elektrophorese in Boratpuf-fer. Alle Bahnen mit 200 /ul Extrakt. Bahn 1: Leber, Ratte zuerst Dihydroergotamin, dann Pentobarbital-Na injiziert, Bahn 2 : Leber, Ratte zuerst Pentobarbital-Na, dann Dihydro-ergotamin. Bahn 3 : Herz. Bahn 4 : Muskel. Bebrütung 4 Stdn. bei 30 °C mit Glucose-l-phosphat in Citratpuffer pH 6,8, bei Streifen 2, 4, 6, 8 mit Adenosin-5'-monophosphat, bei Streifen

1, 3, 5, 7 mit Cystein (pH 6,8) ohne AMP.

anodenfernen Zone identisch mit der nicht kristalli-nen ß-Amylase aus Gerste und mit der Amylase aus Magna-Knollen. Dieselbe j(?-Amylase-Zone wurde bei allen oben einzeln aufgeführten Säften gefunden. Sowohl bei den kristallinen wie bei den nicht kristal-linen a-Amylase-Enzympräparaten als auch bei der kristallinen /^-Amylase war nach mehrmonatigem Aufbewahren der gefrorenen Enzymlösungen die charakteristische obere (anodenferne) Zone nach elektrophoretischer Auftrennung nicht mehr vorhan-den. Parallel dazu verfolgten wir die Aktivitätskurve der kristallinen /^-Amylase in Lösung und stellten eine um etwa 50% verminderte Aktivität fest. — Bei Saft aus frisch geernteten Knollen der Kartoffelsorte Rosa trat eine zusätzliche, weiter als die /^-Amylase nach der Anode hin wandernde enzymaktive Zone auf (Abb. 3, Bahn 1).

P h o s p h o r y l a s e n

Die Phosphorylasen wurden als Stärke syntheti-sierende und als Stärke abbauende Fermente nach-gewiesen. Die Synthese ließ sich im Saft von Kar-toffelknollen (Magna und Rosa, Ernte 1966) nach der Phorese im glykogenhaltigen PAA-Gel in 4 Zo-nen zeigen, Abb.5, Bahn 1. Wurden die Gele nach der Phorese anstatt in Citratpuffer in Phosphatpuf-fer inkubiert, so waren nur noch 3 Zonen weniger intensiv ausgebildet, Abb. 3, Bahn 3. Eine noch wei-tere Schwächung der Intensität der Zonen bzw. gänz-liches Verschwinden von zwei der drei Zonen trat auf, wenn dieser Phosphatpuffer (pn 5,1) auf pa 7,0 eingestellt wurde, Abb. 3, Bahn 2. - Abb. 4 bringt eine Konzentrationsreihe von 50 bis 0,5 jul Saft aus Rosa-Knollen. Zusatz von Cystein (0,06-m.) oder von Adenosin-5'-monophosphat (0,001-m.) zu der Inkubationsflüssigkeit beeinflußte die Intensität der Stärkeaufbau-Zonen nicht.

Aus Saft von Magna-Knollen der vorjährigen Ernte ließen sich — auch unter optimalen Bedingun-gen in Citratpuffer — nur zwei Phosphorylase-Zonen sichtbar machen (Abb. 5, Bahn 6 ) . — In Säften aus Keimen (Aquila und Magna) und aus Blättern (Magna) konnte man nur die — verglichen

** Da die einander entsprechenden Gelstreifen (Abb. 5, Bahn 1 und 2, Bahn 3 und 4) aus verschiedenen Elektrophore-sen stammten (die eine Glykogen, die andere Stärke ent-haltendes Gel) mußte für gute Vergleichbarkeit auf Ein-haltung der gleichen Bedingungen geachtet werden, vor allem müssen beide Ausgangslösungen beim Einfüllen in den R a y m o n d - Behälter die gleiche Temperatur haben.

mit dem Knollensaft — anodennahe Phosphorylase-Zone nachweisen (Abb. 5, Bahn 3 ) . Im Saft aus Aquila-Keimspitzen waren zwei Zonen schwach aus-gebildet (Abb. 5, Bahn 5) .

Spiegelbildlich zur breiten anodennahen Zone der Stärkesynthese in PAA-Gelen mit Glykogen sieht man in Gelen mit Stärke bei Inkubieren in Phos-phatpuffer die Zone des Stärkeabbaues durch die Extrakte. Abb. 5, Bahn 2, bringt diese Abbauzone bei Saft aus Rosa-Knollen. (Die ß-Amylase deutet sich in der kathodennahen Zone an.) Von glei-cher Intensität erhielten wir die Phosphorylasezone aus Magna-Knollen der vorjährigen und der dies-jährigen Ernte. In Säften aus Keimen (Aquila und Magna) und aus Blättern (Magna) war sie schwä-cher ausgebildet (Abb. 5, Bahn 4) **.

In den Extrakten aus tierischem Gewebe, die wir zu Vergleichszwecken an glykogenhaltigen Gelen elektrophoretisch auftrennten, ließ sich nur die b-Form der Phosphorylase mit Sicherheit nachwei-sen. Abb. 6 gibt die Ergebnisse für Schweineherz wieder, ohne Adenosin-5'-monophosphat findet man keine Aktivität (rechte Hälfte von B a h n l ) . Abb. 7 bringt die Phosphorylase-Aktivität aus Rattenorga-nen. Bei der Trennung des kristallinen Enzyms (a-Form) mußte Cystein zum Elektrophorese-Puffer zugesetzt werden. Ohne den Cysteinzusatz war bei 1,3 /(g Enzym per Bahn lediglich am Startpunkt eine schmale Zone der Stärkebildung zu beobachten. 0,03-m. Cystein im Phoresepuffer — der pn-Wert war nach dem Cysteinzusatz mit konz. Natronlauge wieder auf pn 8,2 gebracht worden — schützen das Enzym soweit, daß nach Bebrüten in Citratpuffer und G-l-P zwei Stärkezonen sichtbar waren (Abb. 6, Bahn 4 ) . AMP-Zusatz intensivierte die Zonen (Abb. 6, Bahn 5) .

Diskussion

Ein Aktivitätsnachweis und eine schnelle, präzise wie aufschlußreiche Untersuchung von Aktivatoren und Inhibitoren von Enzymen ist mit Hilfe der Gel-elektrophorese möglich. Nach der Trennung brachte man bisher meist kleinmolekulare Substrate mit dem

Wir bevorzugten in diesem Fall entionisiertes Wasser, das anschließend glasdestilliert wurde. Nur wenn diese Bedin-gungen erfüllt sind, ist eine konstante Wanderungsge-schwindigkeit der Enzyme in den verschiedenen Phoresen garantiert und nur dann lassen sich direkte Vergleiche zwi-schen Gelen aus verschiedenen Versuchen anstellen.

eingeschlossenen Enzym in Berührung und erhöhte häufig die Empfindlichkeit durch Kupplung des ge-spaltenen Substrates zu einem Farbstoff. Für Des-oxyribonuclease ist eine Untersuchung in PAA-DNS beschrieben 8.

Die Einschlußpolymerisation von Stärke in PAA — von uns für den Amylasentest seit längerer Zeit ohne Elektrophorese angewandt — gestattet nach der Elektrophorese der Enzyme festzustellen, ob sie einheitlich sind, ob sie auf gleiche Faktoren gleich reagieren und ähnliches mehr. Die Einschlußpoly-merisation von Startern (primern) gestattet einen weiteren Schritt, nämlich die synthetische Leistung von Enzymen — in unserem Falle der Phosphory-lase — zu verfolgen. In einer vorausgegangenen Veröffentlichung wurde die Methodik schon kurz skizziert9. Es ist erklärlich, daß ungeladene hoch-molekulare Einschlüsse wie Stärke und Glykogen weniger die guten Elektrophorese-Eigenschaften des PAA beeinflussen als geladene. Dabei ist es gleich-gültig, ob die Zusätze kovalent an das PAA gebun-den oder ohne chemische Bindung eingeschlossen sind. Das Prinzip scheint sich aber nicht nur für die zitierten Fermente zu bewähren, sondern ebenfalls für Cellulasen, Pektinasen 9a und für geladene Ein-schlüsse (unveröffentlicht). Ebenso gelingen mittel-bare Nachweise. Während der Elektrophorese wird die Enzym-Reaktion durch Kühlung so verlangsamt, daß ein störender Ab- oder Aufbau nicht eintritt. Der Temperaturkoeffizient des enzymatischen Pro-zesses muß groß genug sein. Man kann aber audi den pn-Wert für den Lauf so wählen, daß das Enzym noch nicht wirken kann und so die Reaktion mit dem Substrat unterdrückt wird. Wir haben nach Möglichkeit beide Effekte berücksichtigt. Um den optimalen pn-Wert für die Enzymwirkung einzu-stellen, wuschen wir vor der Inkubation (bei 30° oder 50°) mit dem geeigneten Puffer bei 0°, um den Elektrophoresepuffer auszutauschen.

Amylasen

Zur Identifizierung der Amylasen in Gelen wurde die weniger empfindliche und durch Diffusion stär-

8 J . B. B O Y D U. H. K. MITCHELL, Analyt. Biochem. [New York] 13, 28 [1965].

9 R. SIEPMANN u. H. STEGEMANN, Naturwissenschaften 54, 116 [1967].

9 a H. STEGEMANN, Hoppe-Seylers Z. physiol. Chem. 348, 951 [1967].

10 K. S ICK U. J. T. NIELSEN, Hereditas 51, 291 [1964]. 11 S. N O R B Y , Exp. Cell Res. 36,663 [1964].

ker gestörte Abklatsch-10~12>14 bzw. Imprägnierungs-Technik 15 '16 verschiedentlich angewendet oder man benutzte Stärkegel13. Während bei uns das Enzym direkt am Ort mit dem Substrat reagieren kann, muß es bei der Abklatsch-Technik erst zum Sub-strat diffundieren. Hier wie dort werden durch An-färben mit Jod alle die Bereiche nicht markiert, in denen das Enzym die Stärke abgebaut hat und die sich daher mit Jod nicht mehr blau färbt.

Die untersuchten pflanzlichen Amylasen sind nicht einheitlich, wie dies auch schon bei tierischen Amy-lasen 1 0 - 1 2 ' 14-16 u n ( j b e i m Mais13 festgestellt wurde. Dabei ist es interessant, daß bei der Lagerung die Gesamtaktivität der kristallinen /^-Amylase um 50% abnimmt, wenn man sie in Lösung mißt, daß aber keineswegs beide Zonen den (allerdings nur qualita-tiv feststellbaren) Aktivitätsverlust zeigen, sondern nur die langsamer wandernde, aktivere Komponente später fast nicht mehr existiert. Da bei der a-Amy-lase die Gefahr bestand, daß die Calcium-entziehende Wirkung der Äthylendiamintetraessigsäure das Enzym teilweise inaktiviert, wurde noch eine elek-trophoretische Auftrennung in Boratpuffer durchge-führt. Eine Inaktivierung der a-Amylase durch Äthylendiamintetraessigsäure im Tris-Puffer hat nicht stattgefunden. Ein Vergleich zwischen Abb. 1, Bahn 3, und Abb. 2 zeigt, daß die Wanderung der Enzyme im Tris-Puffer und in Boratpuffer bei glei-chem pn-Wert verschieden ist. Die Säfte zeigten in Boratpuffer die gleiche Zahl von Zonen.

Im Saft von frisch geernteten Rosa-Knollen (Abb. 3, Bahn 1) sieht man neben der „jö-Amylase" eine weitere Zone. Sie ist nicht identisch mit einer der unteren Zonen aus den Amylase-Enzympräpa-raten. G I L B E R T und P A T R I K , die die Isolierung von Q-Enzym (debranching enzyme, transglucosidase nach a-1.6) aus Kartoffelknollen durchführten17, berichten, daß sie dieses Enzym nur in frisch ge-ernteten rotschaligen Kartoffeln feststellen konnten. Möglicherweise handelt es sich bei der unteren Zone in Abb. 3, Bahn 1, um dieses Q-Enzym. Ein Ver-gleichsenzym stand uns leider nicht zur Verfügung.

1 2 W . W . D O A N E , Amer. Zool. 5 , 697 [1965]. 13 J. G . SCANDALIOS, Planta 6 9 , 2 4 4 [ 1 9 6 6 ] . 14 A. O G E R U . L . BISHOPS, Clin. chim. Acta [Amsterdam] 1 3 ,

670 [1966]. 15 Z. O G I T A , Jap. J. Genetics 3 7 , 518 [1962]. 16 H. K I K K A W A , Annu. Rep. sei. Works, Fac. Sei., Osaka Univ.

11, 41 [1963], zitiert nach C. A. 61, 3464 b.

Phosphorylasen

Der Phosphorylase-Nachweis in PAA-Gelen wurde auf zwei verschiedene Arten durchgeführt: 1. In Gel mit einpolymerisiertem Glykogen als Starter und Glucose-1-phosphat in der Inkubationslösung ist die synthetisierende Eigenschaft des Enzyms dadurch zu erkennen, daß in der Enzymzone Stärke (Dextrin) aufgebaut und durch Blaufärbung mit Jod sichtbar gemacht wird. 2. In Gel mit einpolymerisierter Stärke und Phosphatpuffer in der Inkubationslösung (um die Bildung von Glucose-l-phosphat aus Stärke und Phosphationen zu ermöglichen) ist die Stärke spaltende Eigenschaft sichtbar an den nach Jodfär-bung aufgehellten Zonen. Die blauen Phosphory-lase-Zonen in den Glykogengelen und die aufgehell-ten Phosphorylase-Zonen in den Stärkegelen ver-hielten sich zueinander wie Bild und Spiegelbild (Abb. 5, Bahnen 1 und 2, Bahnen 3 und 4 ) .

In einer Konzentrationsreihe (Abb. 4) ließ sich die Phosphorylase aus Kartoffesknollen bis zu 0,5 ju\ Saft/Bahn nachweisen. Da man weiß 20, daß aus 5 kg Kartoffeln (entsprechend etwa 2,5 l Saft) 80 mg Phosphorylase zu gewinnen sind, kann man unter der Voraussetzung einer 15-proz. Ausbeute errech-nen, daß nach unserem Verfahren weniger als 50 ng Enzym nachzuweisen sind. Cysteinzusatz zu der In-kubationsflüssigkeit beeinflußte die Intensität der Phosphorylase-Zonen aus Kartoffelsäften nicht. Das bestätigt die Befunde von LEE 20 mit Spaltansätzen. — In Glykogengelen liefern Säfte von Rosa- und Magna-Knollen vier Phosphorylase-Zonen, Magna-Knollen der vorjährigen Ernte zwei, Säfte von Kei-men (Magna, Aquila) und Blättern (Magna) eine Zone (Abb. 5) .

Nach Phorese in Glykogengelen ließ sich der Ein-fluß des Inkubationsmediums auf den Stärkeaufbau demonstrieren. Phosphationen im Inkubations-medium drängten die Stärkesynthese zurück (Glyko-gen + Glucose-l-phosphat ^ Stärke + Phosphat), Abb. 5, Bahn 1, zu vergleichen mit Abb. 3, Bahn 3. Eine Erniedrigung der Wasserstoffionenkonzentra-tion im Inkubationsmedium von pg 5,1 auf pn 7,0 hatte das gänzliche Verschwinden von zwei Zonen und eine Verringerung der Intensität der übrig blei-1 7 G . A. GILBERT U. A. D. P A T R I C K , Biochem. J. 51, 181 [1952]. 1 8 G . T. C O R I u. C. F. C O R I , J. biol. Chemistry 1 3 5 , 733 [1940]. 1 9 C . S. H A N E S U. E. J. M A S K E L L , Biochem. J. 3 6 , 76 [1942]. 20 Y. P. LEE. Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 43, 18,

25 [I960]. 21 J. F . FREDERICK, Phytochemistry 1, 153 [1962].

benden Zone zur Folge, Abb. 3, Bahn 2. So lassen sich an PAA-Gelen die von C O R I 18 und H A N E S und M A S K E L L 19 festgestellten Gesetzmäßigkeiten bezüg-lich der Einwirkung des pu-Wertes auf die Stärke-synthese bestätigen.

Auch F R E D E R I C K 2 1 - 2 3 fand in Algenextrakten 2

Phosphorylase-Zonen. Allerdings wendet er bei der Disc-Elektrophorese einen anderen Nachweis an: Maltoheptaose wird zum Glucan aufgebaut und — weil letzteres in die Substratlösung diffundiert — wird das freigesetzte anorganische Phosphat über das Ca- und Ag-Salz nach UV-Bestrahlung als metal-lisches Silber identifiziert. Von den 2 Zonen benö-tigte die eine Adenosin-5'-monophosphat zur Akti-vierung. Bei den Kartoffelsäften erhielten wir mit Adenosin-5'-monophosphat in der Inkubationsflüs-sigkeit dieselben Zonen in derselben Intensität wie ohne Adenosinmonophosphat. Einen allgemeinen Überblick über den neuesten Stand der Glykogen-und Stärkesynthese und des Abbaus bringt WHELAN2 4 . So ist man auf Grund der Arbeiten von L E L O I R und Mitarbb. von der Auffassung abgekom-men, zumindest der Muskel-Phosphorylase bei den Synthesen eine entscheidende Rolle zuzuschreiben. Der Glykogen- und Stärkeaufbau in der Zelle geht danach über Nucleosid-diphosphat-zucker. Dieser Auffassung schließen sich F I S C H E R und K R E B S in einem kürzlich gehaltenen Vortrag an 25. Die inter-essante Hypothese der Autoren, daß die Phosphory-lase intracellulär in partiell phosphorylierten Zwi-schengliedern zwischen der a- und b-Form vorliegt, wird unter anderem durch Hybridisierungen zwi-schen Phospho- und Dephospho-Formen der Phos-phorylase gestützt. Diese Autoren bringen ein Phero-gramm von Phosphorylase b aus Kaninchenherz-und Kaninchenskelettmuskel, die Ergebnisse der „disc-electrophorese" stammen aus einer nicht ver-öffentlichten masterthesis. Nach Hybridisierung der beiden Enzyme wurden drei Zonen beobachtet. Die Auswirkung von „Kreuzungen" zwischen Phospho-und Dephosphoformen auf die Enzymstruktur haben die Autoren dann aber in Sedimentationsanalysen untersucht.

Unsere gelelektrophoretischen Untersuchungen zeigen ebenfalls beim Extrakt aus Schweineherz drei 2 2 J . F . FREDERICK Phytochemistry 2 , 4 1 3 [ 1 9 6 3 ] . 2 3 J . F . FREDERICK, Annu. New York Acad. Sei. 1 2 1 , 634

[ 1 9 6 4 ] , 2 4 W . J . W H E L A N , Biochem. J . 1 0 0 , 1 8 P [ 1 9 6 6 ] . 25 E. H . FISCHER U. E. G. K R E B S , Federat. Proc. 2 5 , 1 5 1 1 — 2 0

[ 1 9 6 6 ] .

Zonen (Abb. 6, Bahn 2) , die Phosphorylase lag in der b-Form vor, sie stammte von einem mit Schlag-bolzen getöteten Tier. Ohne Adenosin-5'-monophos-phat wurde Stärke nicht synthetisiert, selbst nicht bei so hoher Auftragsmenge, die mit AMP zu einer breiten verschmierten Zone führt (Abb. 6, Bahn 1).

Die Ratten waren mit Pentobarbital-Natrium ein-geschläfert worden. Die Phosphorylase aus Herz war ohne Adenosin-5'-monophosphat inaktiv, aus Mus-kel sehr schwach aktiv, bei der Phosphorylase aus Leber ließ sich die Aktivität durch Zusatz von Ade-nosin-S'-monophosphat steigern (Abb. 7) .

Die Wanderungsgeschwindigkeit der Leberphos-phorylase entsprach der Wanderungsgeschwindig-keit der Phosphorylasen aus Herz und Muskel. Das Mol.-Gew. der Leberphosphorylase vom Hund ent-spricht in etwa dem Mol.-Gew. der b-Form der Muskelphosphorylase23 oder der Hälfte des Mol.-Gew. der a-Form. Über mögliche elektrophoretische Umwandlungen von Phosphorylase a und Zwischen-stufen wird zur Zeit gearbeitet.

Herrn P. HÖPFEL danken wir für die sehr geschickte Mitarbeit bei der Durchführung der Versuche, der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t (Bad Godesberg) für ihre finanzielle Unterstützung.

Homocylindrocarpidin und 17-Demethoxy-cylindrocarpidin, zwei neue Alkaloide aus Tabernaemontana amygdalifolia *

H A N S ACHENBACH

Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen der Universität Freiburg i. Br.

( Z . Naturforschg. 22 b , 9 5 5 — 9 5 7 [ 1 9 6 7 ] ; eingegangen am 10 . Februar 1967)

Chromatography of the extract of the root bark of Tabernaemontana amy gdali folia yielded two dihydroindole alkaloids. On the basis of spectral data, mainly conventional and high-resolution mass spectrometry, they were shown to be Homocylindrocarpidine (I) and 17-Demethoxy-cylindro-carpidine (II), respectively.

Durch wiederholte Chromatographie einer basi-schen Fraktion aus Tabernaemontana amygdalifolia wurden zwei weitere Alkaloide (I, II) isoliert. Die bei 120° (10 _ 3 Torr) destillierbaren Verbindungen haben folgende Daten (Tab. 1) :

emp. [OC]DD Amax [nm] Formel * * ( C H C 1 3 ) (Äthanol 96%)

I C24H32N2O4 • - 8 2 ° (c - 1,7) 219 (e = 32800) 256 (e = 11400)

I I C22H28N2O3 -- 4 9 ° (c = 1,9) 213 (e - 19800) 253 (e - 10700)

Tab. 1. Physikalische Daten von Homocylindrocarpidin (I) und 17-Demethoxy-cylindrocarpidin (II).

Die abgeleiteten Strukturen des Homocylindrocar-pidins (I) und 17-Demethoxy-cylindrocarpidins (II)

* 5. Mitteilung über „Massenspekrometrische Untersuchun-gen an Naturstoffen". — 4. Mitteilung: H. A C H E N B A C H , Te-trahedron Letters [London] 1967,1793.

** Die elementare Zusammensetzung des Molekülions und der wichtigsten Fragmente wurde mit einem doppelfokus-sierenden Massenspektrometer CEC 21-110 nach dem ,peak-matching'-Verfahren bestimmt (Direkteinlaß; 70eV).

basieren vorwiegend auf den Ergebnissen massen-spektrometrischer Untersuchungen:

H o m o c y l i n d r o c a r p i d i n : R" = - 0 C H 3 ; R"= -C0C 2 Hs

1 7 - D e m e t h o x y - c y l i n d r o c a r p i d i n : R ' = - H ; R"=-C0CH3

I : R' = OCH3; R " = COC,H5 II: R' = H ; R " = COCH3

In den Massenspektren von I und II (Abb. 1) er-kennt man ein Fragmentierungsverhalten, wie es nach den grundlegenden Arbeiten von BIEMANN und Mitarb.1 - 3 für Verbindungen mit dem Kohlenstoff-

Wir sind hierfür Herrn Dr. P . SCHULZE und der Fa. Bell & Howell, Friedberg, zu Dank verpflichtet.

1 K . B I E M A N N , M . F R I E D M A N N - S P I T E L L E R U. G . S P I T E L L E R , Tetra-hedron Letters [London] 1961, 485.

2 K . B I E M A N N , M . F R I E D M A N N - S P I T E L L E R U . G . SPITELLER, J . Amer. chem. Soc. 85, 631 [1963].

3 K. B I E M A N N , in: Mass Spectrometry, S. 315, McGraw-Hill, New York 1962.