Enzymatikpraktikum für Leistungskurse Skriptum

Skriptversion: 28.06.2005

Name: Datum:

Enzymatikpraktikum für die gymnasiale Oberstufe Kenntnisse über Funktion und Bau der Enzyme sind unerlässlich für das Verständnis des Stoffwechsels. Als Stoffwechsel bezeichnet man die Summe aller chemischen Vorgänge, die in Lebewesen ablaufen. Bei Zimmertemperaturen laufen diese chemischen Reaktionen aber extrem langsam ab, so dass sie durch Katalysatoren (Biokatalysatoren = Enzyme) beschleunigt werden müssen. Die Enzymkinetik ist ein Fachbereich der Biochemie. Sie beschreibt, wie schnell und effizient chemische Reaktionen verlaufen, bei denen Enzyme wirken. Experimente

1. Katalytische Zersetzung des Zellgiftes Wasserstoffperoxid 2. Hitzewirkung auf Urease 3. Enzyme sind Eiweiße 4. Amylasenachweis im Speichel 5. pH-Abhängigkeit der Amylase-Aktivität 6. Temperatur-Abhängigkeit der Urease-Aktivität 7. Abbau von Harnstoff bei verschiedenen Substratkonzentrationen 8. Hemmung von Katalase durch Bleiionen 9. Hemmung von Urease durch Kupferionen 10. Harnstoffbestimmung im Urin

Inhalte: Markus Förg, Dirk Stiebler, Melanie Odenigbo Copyrights 2005: GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH, Neuherberg

Versuch 1

3

Katalytische Zersetzung des Zellgiftes Wasserstoffperoxid Eine verdünnte Lösung von Wasserstoffperoxid ist bei Raumtemperatur relativ stabil. Allerdings ist Wasserstoffperoxid ein energiereicher Stoff, so dass er sich langsam zersetzt. Thermisch und katalytisch kann dieser Prozess beschleunigt w erden. Wasserstoffperoxid ist aufgrund seiner oxidativen Wirkung ein Zellgift, das im Stoffwechsel als Zw ischenprodukt entstehen kann. Katalase katalysiert den Abbau von Wasserstoffperoxid und f indet sich in fast allen aerob lebenden Mikroorganismen, in Pflanzen und allen tierischen Organen, dort vor allem in den Peroxisomen (Katalase kann als Oxidase w irken).

Material: Reagenzgläser, Spatel, Reagenzglasgestell, Glimmspan, Stopfen, Skalpell, Pinzette, Petrischalen Wasserstoffperoxid-Lösung (3 %), Braunstein, Kartoffel, Leber, Muskelfleisch, Fettgewebe, Katalaselösung

Planen Sie ein Experiment, mit dem Sie den Katalasegehalt verschiedener Stoffe qualitativ bestimmen können. a, Führen Sie zunächst mit Sauerstoff aus der Flasche, den Sie in ein Reagenzglas abfüllen

(sonst Brandgefahr!!), eine Blindprobe zur Prüfung der Methode durch. Erst vollständig planen, dann durchführen!

geplanter Versuchsablauf: Erw artung: An dieser Stelle w ird das Experiment durchgeführt... Beobachtung: Auswertung: Erstellen Sie auch die Reaktionsgleichung für die Zersetzung des Wasserstoffperoxids:

Versuch 1

4

b, Planen Sie nun den Versuch zur Bestimmung des Katalasegehalts von Kartoffeln, Leber, Muskelfleisch, Fettgewebe und einer Katalaselösung im Vergleich zu Braunstein (MnO2)! Erst vollständig planen, dann durchführen!

geplanter Versuchsablauf: Kartoffel Leber Muskelf leisch Fettgew ebe Katalase Braunstein ����

Erw artung

An dieser Stelle w ird das Experiment durchgeführt...

Beobachtung

Auswertung: Frage: Warum enthalten die Leberzellen sehr viel Katalase?

Versuch 2

5

Hitzewirkung auf Urease Urease kommt besonders in Pflanzensamen, Bakterien, Krebsen und Meeres-Muscheln vor. Insbesondere die Ureasen der Bodenbakterien spielen eine wichtige Rolle im Stickstoffkreislauf. Ohne Sie w äre eine Stickstoffdüngung durch den in Abw esenheit von Enzymen sehr hydrolysebeständigen Harnstoff, eines Bestandteils der Jauche, nicht möglich. Diese Reaktion kann im Reagenzglas durchgeführt werden.

Material: Reagenzgläser, Spatel, Reagenzglasgestell, Reagenzglasklammer, Bunsenbrenner, Waage, Wägetrichter Harnstoff, Phenolphthalein, destilliertes Wasser, Urease

Planen Sie ein Experiment, mit dem Sie die Einwirkung von moderater Hitze (knapp 100°C) auf Urease qualitativ bestimmen können. geplanter Versuchsablauf: Erw artung: An dieser Stelle w ird das Experiment durchgeführt... Beobachtung: Auswertung: Erstellen Sie auch die Reaktionsgleichung für die Harnstoffspaltung (Harnstoff (NH2)2CO): Frage: Über w elches Teilchen w ird die Harnstoffspaltung nachgew iesen?

NH2

NH2

CO

Harnstoff

Versuch 3

6

Enzyme sind Eiweiße Enzyme sind Katalysatoren, die Stoffwechselreaktionen in Lebew esen beschleunigen. Diese Katalysatoren w erden von den Organismen nach genetisch verankerter Bauanleitung hergestellt und gehören in die Stoffklasse der Eiw eiße.

Material: Reagenzgläser, Bunsenbrenner, Tropfpipetten, Spatel Urease, Hühnereiweißlösung, Öl, Zucker, Salz, dest. Wasser, 1%-Ninhydrin-Lösung

Planen Sie ein Experiment, mit dem Sie nachweisen können, dass Enzyme Eiweiße sind. a, Führen Sie zunächst eine Blindprobe mit dest. Wasser, Hühnereiweißlösung, Öl, Zucker und

Salz zum Kennen lernen der Methode durch.

Versuchsablauf Bemerkungen

1. Herstellen der fünf Probelösungen: a, ca. 2ml dest. Wasser b, 1 Tr. Hühnereiw eiß c, 1 Tr. Öl d, 1 Spatelspitze Zucker e, 1 Spatelspitze Salz b, - e, in je ca. 2 ml dest. Wasser lösen bzw. emulgieren.

Sauber arbeiten! Keine Verunreinigungen verschleppen!

2. 1ml Ninhydrin-Lösung zugeben. Sauber arbeiten!

Besonders auf die Pipettenspitze achten!

3. Alle Proben bis zum Sieden erhitzen und kurz heiß halten.

Vorsicht vor Siedeverzügen! Wärme über 80°C erhöht die Reaktionsgeschwindigkeit und verkürzt so die Dauer von 24 h auf wenige Sekunden.

Beobachtung: Auswertung: Frage: Wieso w urden gerade diese Kontrollsubstanzen verwendet?

Versuch 3

7

b, Planen Sie nun den Versuch zum Nachweis, dass Enzyme Eiweiße sind! Erst vollständig planen, dann durchführen!

geplanter Versuchsablauf: Erw artung: An dieser Stelle w ird das Experiment durchgeführt... Beobachtung: Auswertung:

Versuch 4

8

Amylasenachweis im Speichel Im menschlichen Körper beginnt die Verdauung bereits im Mund. Die Aufspaltung der Stärke w ird durch α-Amylase im Speichel gestartet. Dabei w erden die 1,4 � glykosidischen Bindungen zw ischen Glucosemolekülen gespalten.

Material: Bunsenbrenner, Reagenzglasklammer, Reagenzgläser, Pasteurpipetten, kleines Becherglas, Messzylinder (10mL), Spatel

Chemikalien: Stärke-Lösung, Lugol´sche Lösung (I2/KI), Fehling I, Fehling II, Aqua dest.

Planen Sie ein Experiment, mit dem Sie nachweisen können, dass im Speichel tatsächlich Amylase enthalten ist. a, Führen Sie zunächst Blindproben mit Stärke-Lösung und Glucose zum Kennen lernen der

Methoden durch.

Versuchsablauf Bemerkungen

Herstellen der drei Probelösungen:

a, Eine Spatelspitze Glucose w ird in ca. 6 ml Wasser gelöst, die Lösung auf zwei Reagenzgläser aufgeteilt . b, Zw ei Reagenzgläser mit Stärkelösung. c, Zwei Reagenzgläser mit dest. Wasser.

1. Zu einem Satz je einen Tropfen Lugol�sche Lösung geben. 2. In einem Reagenzglas je 3 ml Fehling I und Fehling II

vermischen. Lösung muss frisch hergestellt werden.

3. Je 2 ml des Fehling-Reagenz zu dem zw eiten Satz geben

und vorsichtig erw ärmen. Reagenzglas dabei immer leicht schütteln.

Vorsicht! Sehr leicht Siedeverzug! Die Reagenzglasmündung nicht auf Menschen richten!!!

Größte Gefahrenquelle im Kurs!!

Beobachtung: Glucose-Lösung Stärke-Lösung dest. Wasser

+ Lugol�sche Lösung

+ Fehling-Reagenz

Auswertung:

Versuch 4

9

b, Führen Sie nun den experimentellen Nachweiß, dass in Ihrem Speichel Amylase enthalten ist! Erst vollständig planen, dann durchführen!

geplanter Versuchsablauf:

(Tipp: Funktioniert nur mit viel Speichel gut. Dazu nicht wenig Speichel durch „zuzeln“ aufschäumen, sondern längere Zeit „meditieren“ und möglichst intensiv eine quietschsaure Zitrone imaginieren. Den Speichel in ein Becherglas laufen lassen. Schaumbildung vermeiden.)

Erw artung: An dieser Stelle w ird das Experiment durchgeführt... Beobachtung: Auswertung: Für Chemiker: Erstelle die Redoxgleichung für den Fehling-Nachw eis! (Tipp: Es entsteht eine Polyhydroxycarbonsäure) Frage: Warum ist es w ichtig die Nahrung gut zu kauen?

Versuch 5

10

pH-Abhängigkeit der Amylase-Aktivität Die menschliche Amylase, eigentlich α-Amylase, gehört zu den Verdauungsenzymen. Sie besteht aus zwei Untereinheiten, die Stärke und Glykogen abbauen. Auf diese Weise machen sie die aufgenommenen Kohlenhydrate für den Körper verwertbar. Man unterscheidet Speichel-Amylase und Pankreas-Amylase. Die Pankreas-Amylase ist für die Verdauung w eit bedeutender als die Speichel-A mylase. Ziel dieses Versuches ist es, die pH-Abhängigkeit der Aktivität der Amylase quantitativ zu bestimmen.

Material: pH-Meter, Magnetrührer, 13 Bechergläser (50 ml), Messpipetten (10ml, 25 ml), Peleusball, Stoppuhr, Taschenrechner (scientific), Photometer, Küvetten (1mL), Mikropipette (1mL), Pipettenspitzen, Küvettenständer,

Chemikalien: Stärkelösung, Amylase-Lösung (3%), Natriumphosphatlösung (c=0,2 mol/L), Natriumhydrogenphosphat-Lösung (c = 0,2 mol/l), Citronensäure-Lösung (c = 0,2 mol/l), Lugol´sche Lösung (I2 / KI � Lösung)

Versuchsablauf Bemerkungen

1. Ansetzen der 12 Pufferlösungen. Dazu die beiden Lösungen

entsprechend der angegebenen Angaben zusammengeben:

pH-Wert 4,6 5,0 5,4 5,8 6,2 6,8 7,4 8,0 8,6 9,2 9,8 10,4

V (Na2HPO4 aq) ml 12,4 13,0 14,0 14,7 15,7 17,4 19,0 19,6

V (Na3PO4 aq) ml 18,40 18,50 18,60 18,90

V (Citr.säure) ml 7,6 7,0 6,0 5,3 4,3 2,6 1,0 0,4 1,60 1,50 1,40 1,10

2. Überprüfen der pH-Werte der Pufferlösungen mit dem pH-Meter. Bei

pH-Abweichungen >0,2 korrigieren Sie durch Zugabe der entsprechenden Lösung. Notieren Sie stets Ihren exakten pH-Wert.

pH-Meter ist bereits geeicht

3. Zugabe von je 5 ml Stärke-Lösung. 4. Zugabe je eines Tropfens Lugolscher Lösung pro Becherglas Entstehen einer blauen Lösung 5. Erstes Becherglas auf den Magnetrührer stellen, Rührfisch

hineingeben und langsam rühren

6. Eichen Sie das Photometer mit einer wassergefüllten Küvette bei 535

nm. Küvette in Rack B stellen und im Menü „Leerprobe einstellen“ drücken

7. 1,0 mL Amylaselösung in die Lösung im Becherglas geben und die

Stoppuhr starten Benutzen Sie die Mikropipette!

8. Messen Sie die Extinktion der Lösung im Photometer. Dazu möglichst

zügig eine Küvette mit der zu messenden Lösung füllen! Bei einer Extinktion E < 0,250 stoppen Sie die Zeit.

9. Wiederholen der Schritte 5-9 mit den anderen 11 Reaktionsansätzen

Versuch 5

11

Auswertung: 1. Erstellen eines pH-Wert-Zeit-Diagramms 2. Ablesen des pH-Optimums für die Amylase aus dem Diagramm 3. Diskussion des Kurvenverlaufes. Fragen: 1. Worauf nimmt die Änderung des pH-Wertes bei Enzymen Einfluß? 2. Die meisten menschlichen Enzyme w eisen pH-Optima im neutralen Bereich auf. Wo finden sich

die markantesten Abw eichungen im menschlichen Stoffwechsel?

Versuch 6

12

Temperatur-Abhängigkeit der Urease-Aktivität Chemische Reaktion verlaufen immer mit einem Energieumsatz. Mit steigender Umgebungs-temperatur steigt auch die Energie von Substrat und Enzym und damit auch die Kollisionsw ahrscheinlichkeit der Teilchen. Entsprechend w ird die Reaktionsgeschw indigkeit beeinflusst. Ziel dieses Versuches ist es, die Temperatur-Abhängigkeit der Aktivität der Urease quantitativ zu bestimmen.

Material: Wasserbäder, Trafo, Amperemeter, Leitfähigkeitselektroden, Magnetrührer, Thermometer, Timer, Mikroliterpipette, Eppendorfgefäße, 50ml-Vollpipette mit Peläusball, 5x 100ml Bechergläser hoch, großes Becherglas frisch bereitete Harnstoff-Lösung (w ≈ 0,05 %), Urease-Lösung (w ≈ 2 %), dest. Wasser

Versuchsablauf Bemerkungen

1. Schaltplan für Messkreislauf aufzeichnen. Die Spannungsquelle muss

nicht reguliert werden. 2. 50 ml der Harnstoff lösung bei Raumtemperatur in ein

Becherglas geben und die Leitfähigkeit bestimmen. Einen Rührfisch dazugeben und langsam rühren.

3. 1 ml der Urease-Lösung zugeben

Reaktion genau 2 Minuten unter Rühren laufen lassen

4. Graue Hülse von den Elektroden abziehen

Achtung: Elektroden nicht verbiegen!! Nach 2 min das Rühren stoppen(!), Elektroden in das Becherglas absenken und die Leitfähigkeit messen

Bei der Harnstoffzersetzung entstehen Ionen, diese werden bei der Leitfähigkeitsmessung erfasst.

5. Reaktionsschritte 2 - 4 bei folgenden Temperaturen

wiederholen: ca. 5 °C, ca. 45 °C, ca. 65 °C, ca. 75 °C Dazu Harnstoff-Lösung und Urease separat im entsprechenden Wasserbad min. 5 Minuten auf Temperatur bringen.

Thermometer und Elektroden zwischen jeder Messung gründlich reinigen! Rühren nicht vergessen!

Frage: In w elchem Temperaturbereich haben die meisten menschlichen Enzyme ihr Optimum?

Versuch 6

13

Auswertung: 1. Erstelle ein Temperatur-Leitfähigkeits-Diagramm 2. Diskutiere die Kurve, indem Du sie in zw ei Bereiche einteilst und diesen bestimmte Ursachen

zuw eist

Versuch 7

14

Abbau von Harnstoff bei verschiedenen Substratkonzentrationen Die Umsetzungsgeschwindigkeit eines Substrates durch ein Enzym hängt hauptsächlich davon ab, wie schnell sich der Enzym-Substrat-Komplex bildet. Diese Eigenschaft des Enzyms stellt eine charakteristische Größe dar und w ird als Michaelis-Menten-Konstante bezeichnet. Sie hat die Dimension einer Konzentration [mol/ l] und ist als diejenige Substratkonzentration zu verstehen, bei der die halb-maximale Reaktionsgeschw indigkeit erreicht w ird. Ziel dieses Versuches ist es, die Abhängigkeit der Aktivität der Urease von der Substratkonzentration quantitativ zu bestimmen.

Material: Trafo, Amperemeter, Leitfähigkeitselektroden, Magnetrührer, Thermometer, Timer, Mikroliterpipette, großes Becherglas, 6x 100ml-Messzylinder, 6x 100ml Becherglas hoch, Parafilm, 500ml Erlenmayerkolben frisch bereitete Harnstoff-Lösung (w ≈ 0,05 %), Urease-Lösung (w ≈ 2 %), dest. Wasser

Versuchsablauf Bemerkungen

1. Schaltplan für Messkreislauf aufzeichnen Die Spannungsquelle muss

nicht reguliert werden. 2. 100 ml einer 0,05 % Harnstoff lösung in den ersten

Messzylinder füllen. 50 ml davon in den zw eiten Messzylinder geben und diesen auf 100 ml mit destilliertem Wasser auffüllen. Mit Parafilm verschließen. Dazu ein ca. 2x2 cm großes Stück abschneiden und den dehnbaren Film vom bedruckten Trägermaterial lösen. Den Film über die Öffnung ziehen und durch verdrehen abdichten. Zum Mischen mehrfach stürzen. Anschließend diesen Schritt noch 4 mal wiederholen.

Anfertigen einer Verdünnungsreihe Ergebnis sind sechs verschiedene Lösungen.

3. Jew eils 40 ml der Harnstoff lösungen in je ein Becherglas

umfüllen

4. In das Becherglas mit der kleinsten ( !) Harnstoff-

konzentration den Rührfisch geben, langsam rühren und dann 1 ml Ureaselösung zugeben

Vermeidet Messfehler durch Verunreinigung. Genau bei Ureasezugabe mit dem Zeitnehmen beginnen!

5. Reaktionsgemisch 2 min lang rühren 6. Graue Hülse von den Elektroden abziehen

Achtung: Elektroden nicht verbiegen!! Nach 2 min das Rühren stoppen(!), Elektroden in das Becherglas absenken und die Leitfähigkeit messen

Bei der Harnstoffzersetzung entstehen Ionen, diese werden bei der Leitfähigkeitsmessung erfasst.

7. Schritt 3 - 5 mit den anderen 5 Harnstoffkonzentrationen in

aufsteigender Konzentration w iederholen

Versuch 7

15

Auswertung: 1. Übertrage die Messw erte in Excel in die Datei km von Urease-Schüler 2. Berechne die Michaelis-Menten-Konstante aus dem Wert 1/kM des Linew eaver-Burk-Diagramms Fragen: 1. Warum kann man die Leitfähigkeitsmessw erte direkt zur Berechnung verwenden und muss nicht

zunächst die Reaktionsgeschw indigkeit errechnen? 2. Warum erfolgt die kM � Berechnung im Linew eaver-Burk-Diagramm und nicht im Konzentrations-

Stromstärke-Diagramm? 3. Wo kann man im Linew eaver-Burk-Diagramm 1/vmax bzw . 1/1/2vmax ablesen?

Versuch 8

16

Hemmung von Katalase durch Bleiionen Katalase besteht aus vier Untereinheiten, jede enthält eine Häm-Gruppe in der Form des Ferriprotoporphyrins IX (eisenhalt ig). Ziel dieses Versuches ist es, den Einfluss eines Schwermetallions auf die Aktivität der Katalase qualtitativ zu bestimmen.

Material: Reagenzgläser, Pasteurpipetten, 10ml-Messzylinder, Messer, Mörser mit Pistill Bleinitrat-Lösung (1%), Wasserstoffperoxid-Lösung (3%),dest. Wasser, Kartoffeln

Versuchsablauf Bemerkungen

Handschuhe anziehen! Bleiverbindungen sind giftig! 1. Zw ei Reagenzgläser mit 5 ml destilliertem Wasser bzw . 5

ml Bleinitratlösung (1%) füllen.

2. Zugabe je eines Stückes frisch geschnittener, gequetschter

Kartoffel, 5 Minuten w arten.

3. Je ca. 2 ml Wasserstoffperoxidlösung (3%) in die beiden

Reagenzgläser geben.

4. Wiederholen Sie den Versuch, verwenden Sie aber statt

der Kartoffel die Katalase-Lösung. Vergleichen Sie die beiden Lösungen vor der Zugabe der Wasserstoffperoxidlösung!

Wartezeit entfällt.

Beobachtung: Auswertung: Fragen: 1. Welche Reaktion der Blei-Ionen mit dem Enzym ist denkbar? 2. Auf welche Struktur der Enzyme nehmen die Bleiionen Einfluß? 3. Warum w urden die früher häufig verw endet Bleirohre abgeschafft?

Versuch 9

17

Hemmung von Urease durch Kupferionen Die Urease aus Schw ertbohnen war eines der ersten Enzyme überhaupt,, die um das Jahr 1930 durch James Batcheller Sumner gereinigt und kristallisiert w erden konnte. Sehr viel später konnte aufgeklärt w erden, das die Urease aus Schw ertbohnen ein Metalloenzym ist und Nickel enthält. Ziel dieses Versuches ist es, den Einfluss eines Schwermetallions auf die Aktivität der Urease qualtitativ zu bestimmen.

Material: Reagenzgläser, Pasteurpipetten, 10ml-Messzylinder Kupfersulfat-Lösung, Harnstoff-Lösung (10 %), Urease, Bromthymolblau, Salzsäure (c= 0,1 mol/l)

Versuchsablauf Bemerkungen

1. Ein Reagenzglas mit ca. 10 ml Harnstoff lösung (10%) füllen 2. 6 Tropfen Bromthymolblau-Lösung und 2 Tropfen

verdünnte Salzsäure zugeben.

3. Reaktionsgemisch auf zwei Reagenzgläser verteilen. 4. In einen Versuchansatz gibt man noch einen Tropfen

Kupfersulfatlösung. Warum sind beide Ansätze unterschiedlich gefärbt?

5. Je eine Spatelspitze Urease auf die Flüssigkeitsoberfläche

in jedem Reagenzglas geben und anschließend 3 Minuten beobachten.

Beobachtung: Auswertung: Frage: Welche Reaktion der Kupfer-Ionen mit dem Enzym ist denkbar?

Versuch 10

18

Harnstoffbestimmung im Urin

A) Allgemeines

Ziel des Versuches ist es, die Konzentration von Harnstoff im Urin unter verschiedenen physiologischen Belastungen zu untersuchen. Mit verschiedenen Tests kann diese Filtrationsleistung der Nieren untersucht werden.

Harnstoff ist das Haupt-Abbauprodukt des Eiweißstoffwechsels. Er wird in der Leber aus Spaltprodukten von Proteinen gebildet und zu etwa 90 % über die Nieren ausgeschieden. Deshalb kommt es bei einem Abfall der Filtrationsleistung der Nieren zu einem Anstieg der Harnstoff-Konzentration im Blutserum. Die Menge an Harnstoff im Blut wird aber auch von der Eiweißaufnahme mit der Nahrung und vom Proteinabbau beeinflusst. Eine Steigerung der Harnstoffkonzentration kann also verschiedene Ursachen haben. (Quelle: www.m-ww.de)

• Harnstoff erhöht o Verminderte Durchblutung der Niere (Kreislaufschock, etc.) o Gesteigerter Eiweißabbau (große Verletzungen, Verbrennungen, Blutungen, Fieber,

Krebsnekrosen) o Nierenfiltrationsstörung (Glomerulonephiritis, Pyelonephritis, Nephrosklerose, Vergiftungen) o Verlegung der Harnwege (Steine, Tumoren, etc.)

• Harnstoff vermindert o Eiweißarme Ernährung o Kinder o Schwangere

B) Menge des Harns Achtung: Probanden mit Herz-, Kreislauf- Nieren- und sonstigen Erkrankungen dürfen diesen Selbstversuch nicht durchführen!

Insgesamt sollen mindestens zwei Schülern (je ein Bouillon- und ein Teetrinker) den Selbstversuch durchführen. Bitte beachten Sie dass Sie als Versuchsperson ab 1 Stunde vor Praktikumsbeginn nichts mehr essen und trinken sowie am Versuchstag bis zum Versuchende auf den Genuss von Kaffee verzichten sollten! Versuchsprinzip: In Abhängigkeit von der Eigenschaften einer oral aufgenommenen Lösung werden der Zeitverlauf der Harnproduktion untersucht.

Versuch 10

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Durchführung:

Material: Messzylinder (1000ml), Vorratsgefäß (10ml), Folienstift, Tee, Bouillon

Versuchsablauf Bemerkungen

1. Entleeren Sie Ihre Blase zu Praktikumsbeginn. Nach 30 min

entleeren Sie zum zweiten Mal die Blase und messen das Harnvolumen in einem Messzylinder.

Sie haben nun einen Kontrollwert (t = 0 min), der ein Maß für die Harnproduktion unter Normalbedingungen darstellt. Da die Harnproduktion kontinuierlich abläuft, multiplizieren Sie diesen Wert mit dem Faktor 2, um die Harnproduktion unter Normalbedingungen für 60 min zu erhalten.

2. Ein Teil des Harns (ca. 10 ml) füllen Sie in ein kleines

Vorratsgefäß, das Sie vorher mit Namen und Messbedingungen kennzeichnen, den Rest verwerfen Sie (bitte bereits auf der Toilette!).

3. Sofort nach der Blasenentleerung trinken Sie 1 l Tee bzw.

Bouillon innerhalb von 10 min. Entleeren Sie dann nach 60 min die Blase, messen Sie das Harnvolumen und füllen Sie wieder ca. 10 ml in ein beschriftetes Vorratsgefäß.

4. Tragen Sie die Werte für die Harnmenge in die Tabelle ein.

Harnmenge (l) Kontrollharn/60 min Versuchsharn/60 min Teetrinker

Bouillontrinker

C) Enzymatische Bestimmung von Harnstoff

Versuchsprinzip Der enzymatische Test, auch optischer Test genannt, basiert auf der Tatsache dass NADH (Nicotinamid-AdeninDinucleotid-Hydroeen) zwischen 300 und 400 nm Licht absorbiert, während das oxidierte NAD in diesem Wellenlängenbereich keine Absorption aufweist. Damit kann jede Dehydrogenase-Reaktion, bei der NADH oxidiert oder NAD reduziert werden, indem man mit einem Photometer diese Lichtabsorption misst. Durch Koppeln mit einem Dehydrogenasesystem können auch Enzymreaktionen gemessen werden, die von NADH bzw. NAD unabhängig sind. Dabei nützt man aus dass das Reaktionsprodukt dieser enzymatischen Reaktion mit einer Dehydrogenase unter Verbrauch von NADH oder NAD weiter umgesetzt werden kann. Der Verbrauch an den NAD-Nukleotiden ist dann proportional der Bildung des Produktes der zu bestimmenden Enzymreaktion.

Versuch 10

20

Der Bestimmung des Harnstoffs in unserem Versuch liegt folgendes Reaktionsprinzip zu Grunde:

Urease Harnstoff + H2O 2 NH3 + CO2

GIDH* 2 α-Ketoglutarat + 2 NADH + 2 NH4

+ 2L-Glutamat + 2 NAD+ + 2 H2O

* = Glutamat-Dehydrogenase Die NADH-Abnahme kann mit dem Photometer bestimmt werden. Als Meßgröße wird die Extinktion E bestimmt. Unter dem Begriff der Extinktion versteht man die Schwächung der Strahlung durch Absorption und Streuung beim Durchgang durch ein Medium, hier durch eine wässrige Lösung. Gemessen wird ∆E bei 340 nm, sie ist der Ammoniakmenge proportional. Aus einem Mol Harnstoff entstehen 2 Mole Ammoniak. Durchführung: Sie bestimmen die Harnstoffkonzentration in Harn und Serum sowie in drei Analysenlösungen (Standard 1-3).

Material: Küvetten (2ml), Mikropipetten, 4 Messkolben (100ml), 4 Messzylinder (10ml), Folienstift, Parafilm, Schere, Photometer

Chemikalien: Triethanolamin(TE)-Puffer (0,5 M), α-Ketoglutarat (35mM), NADH (3.5 mM), GIDH (ca. 430 U/ml), Ureasesuspension (ca. 5500 U/ml), Aqua dest.

Versuchsablauf Bemerkungen

1. Verdünnen Sie zunächst die beiden Harnproben 1:1000, indem

sie 100 µl Harn im Messkolben mit dest. H2O auf 100 ml auffüllen.

Unbedingt gut mischen!!! Stopfen auf den Messkolben geben und den Messkolben mehrmals auf den Kopf stellen.

2. Verdünnen Sie das Serum und die Analysenlösung 1:10, indem

Sie im Messzylinder 1 ml mit 9 ml dest. H2O vermischen. Gut mischen! Dazu den Messzylinder mit Parafilm verschließen.

3. Stellen sie nun 9 Küvetten in das Rack und beschriften Sie sie

mit: KH Person X, VH Person X, KH Person Y, VH Person Y, Serum, A1, A2, A3, Leerwert.

Küvetten nur an den mattierten Seiten anfassen! Abkürzungen: KH (Kontrollharn) VH (Versuchsharn) A1 (Analysenlösung 1) Leerwert (Versuchsansatz mit H2O)

Versuch 10

21

4. Pipettieren sie in jede Küvette folgende Reagenzien:

- 2.00 ml TE-Puffer - 0.20 ml α-Ketoglutarat - 0.20 ml NADH - 0.04 ml GIDH - 0.20 ml Probe (für den Leerwert H2O verwenden)

5. Füllen Sie eine Küvette mit 3,0 mL TE-Puffer und stellen Sie die

Extinktion des Photometers bei 340 nm auf Null. Küvette in Rack B stellen und im Menü „Leerprobe einstellen“ drücken

6. Verschließen Sie die fertig beschickten Küvetten mit einem

kleinen Stück Parafilm und mischen Sie den Inhalt.

Nicht Schütteln, nur auf den Kopf stellen. Luftblasen verfälschen die Messung erheblich!!!

7. Nach dem Mischen warten Sie 5 min, bis die Extinktion sich nicht

mehr ändert. Dann wird die Extinktion E1 bei 340 nm abgelesen und in die Tabelle eingetragen.

Küvette in nacheinander in Rack 1 stellen

8. Geben sie jetzt 0.04 ml Ureasesuspension in jede Küvetten und

warten Sie 60 Minuten. Welche Reaktionen laufen jetzt ab?

9. Verschließen Sie die fertig beschickten Küvetten mit einem

kleinen Stück Parafilm und mischen Sie den Inhalt. Nicht Schütteln, nur auf den Kopf stellen.

10. Lesen Sie die Extinktion E2 nach 1 Stunde ebenfalls bei 340 nm

ab. Achtung: vorher Photometer noch mal mit TE-Puffer auf Null stellen!

Probe E1 E2 ∆E ∆Ekorrigiert Leerwert

KH ..........................

VH ..........................

KH ..........................

VH ..........................

Serum

Analysenlösung 1

Analysenlösung 2

Analysenlösung 3

Versuch 10

22

Auswertung: Berechnen sie ∆E für jede Probe und korrigieren sie jeden Wert wie folgt: (E1 � E2)Probe � (E1 � E2) Leerwert = ∆Ekorrigiert. Die Harnstoffkonzentrationen errechnen sich wie folgt: KH/VH (mmol/l) = ∆Ekorrigiert ⋅ 1077 Serum/Analysenlösung.= ∆Ekorrigiert ⋅ 10.77 (mmol/l)

Probe Konzentration Harnstoff (mmol/l) Kontrollharn (KH) ����������

Versuchsharn (VH) ����������

Kontrollharn (KH) ����������

Versuchsharn (VH) ����������

Serum

Analysenlösung 1

Analysenlösung 2

Analysenlösung 3

Fragen: Formulieren sie basierend auf ihren Messergebnissen die Hauptfunktionen der Niere in Bezug auf die Harnstoffausscheidung! Beziehen Sie dazu auch den zeitlichen Verlauf der Harnstoffausscheidung mit ein!

Notizen

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>Das GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit Die GSF konzentriert ihre Forschungsarbeiten auf eine der wichtigsten Fragen unserer Gesellschaft, die Gesundheit des Menschen in seiner Umwelt. Ziel ist es, Risiken für die menschliche Gesundheit durch Umweltfaktoren zu erkennen, Mechanismen der Krankheitsentstehung zu entschlüsseln sowie Konzepte zu entwickeln, um die Gesundheit des Menschen und seine natürlichen Lebensgrundlagen auch für die Zukunft zu schützen. Als Forschungseinrichtung des Bundes und des Freistaats Bayern mit Sitz in Neuherberg, im Norden Münchens, sind wir Mitglied der Helmholtz-Gemeinschaft, der größten öffentlichen Forschungsorganisation Deutschlands. > Über das Gläserne Labor Das Gläserne Labor wurde speziell für Schülerinnen und Schüler eingerichtet. Hier sollen sie zu bestimmten naturwissenschaftlichen Themen möglichst eigenständig, aber natürlich nach Anleitung, experimentieren und dabei entdecken, wie faszinierend naturwissenschaftliche Phänomene sind und Spaß haben an der Experimentier- und Forschertätigkeit.

Zusätzlich sollen die Schülerinnen und Schüler die GSF als Forschungseinrichtung kennen lernen und verstehen, wie Grundlagenforschung funktioniert und warum sie wichtig bzw. nötig ist. Je nach Thema werden aktuelle Forschungsprojekte der GSF vorgestellt.

Das GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit übernimmt als Mitglied der Helmholtz-Gemeinschaft Verantwortung für die Qualität der naturwissenschaftlich-technischen Bildung unserer Kinder. Das Gläserne Labor dient als Institution, um dieser Anforderung durch unterrichtsergänzende Angebote gerecht zu werden. Es wurde am GSF � Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit mit großzügiger finanzieller Unterstützung der Helmholtz-Gemeinschaft eingerichtet. > Weitere Informationen Besuchen Sie uns im Internet. Dort finden sie aktuelle Informationen und das Anmeldeformular: www.gsf.de/gsf-lab Bei Fragen stehen wir telefonisch unter 089. 3178 � 2725 zur Verfügung. Auf ein baldiges Wiedersehen freut sich ihr Team vom Gläsernen Labor! Gläsernes Labor Abteilung Öffentlichkeitsarbeit GSF – Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit Ingolstädter Landstrasse 1 85764 Neuherberg