Die Angewandte Makromolekulare Chemie 126 (1984) 59- 65 (Nr. 2011)

Friedrich-Schiller-Universitat Jena, Sektion Chemie, DDR-6900 Jena

Enzymatisch spaltbare Ester der Carboxymethylcellulose durch

phasentransferkatalysierte 0-Alkylierung

Dieter Klemm, Gunther Geschwend und Manfred Hartmann

(Eingegangen am 30, M a z 1984)

ZUSAMMENFASSUNG: Durch phasentransferkatalysierte 0-Alkylierung von Natriumcarboxymethylcellu-

lose mit a-Brom-a-ethoxy-essigsaureethylester werden wasserldsliche und enzyma- tisch spaltbare Ethoxycarbonyl-ethoxymethylester der Carboxymethylcellulose syn- thetisiert. Die reversible Esterbildung ist zur gezielten Modifizierung von Carboxy- methylcellulose mit Schutzgruppen und Ankergruppen zur Bindung biologischer Wirkstoffe von Bedeutung.

SUMMARY: Water-soluble and enzymatically cleavable ethoxycarbonyl ethoxymethyl esters of

carboxymethyl cellulose are prepared by phase transfer catalyzed 0-alkylation of sodium carboxymethyl cellulose with a-bromo-a-ethoxyethyl acetate. The reversible esterification is important for the directed modification of carboxymethyl cellulose with protective groups as well as with anchor groups for linking bioactive agents.

I . Einleitung

Zur Polymerbindung biologischer Wirkstoffe werden haufig gut zugang- liche Polysaccharide als Trager verwendet, insbesondere Cellulose, Cellulo- sederivate und Starke. Durch chemische Modifizierung dieser polyfunktio- nellen Biopolymeren gelingt es, die fur die Wirkstoffbindung wichtigen Ei- genschaften in weiten Grenzen zu variieren und Polymer-Wirkstoff- Kombinationen mit gesteuerter biologischer Aktivitat bzw. kontrollierter Freisetzung der gebundenen Wirkstoffe herzustellen' -4 .

Als wichtigster kommerziell zuganglicher Celluloseether findet Carboxy- methylcellulose (CMC) aufgrund ihres Quell- und Loseverhaltens, des iono- genen Charakters und der im Vergleich zu Starke erhohten Stabilitat gegen-

0 1984 Hiithig & Wepf Verlag, Base1 OOO3-3146/84/$03.00 59

D. Klemm, G . Geschwend und M. Hartmann

iiber Mikroorganismen vielfaltige Anwendung bei der konventionellen For- mulierung von Pestiziden6 und der galenischen Verarbeitung von Phar- maka' sowie zunehmend auch bei der Herstellung neuartiger Applikations- formen biologisch aktiver Verbindungen. Beispiele hierfiir sind der Ein- schlul3 von Wirkstoffen in Hydrogele', die Immobilisierung von Enzymen9 und die Synthese von herbizidaktiven CMC-Estern mit kontrollierter Wirk- stoff-Freisetzung lo.

In Fortfiihrung von Arbeiten zur synthesechemischen Modifizierung was- serloslicher Cellulose-Tragerpolymeren interessieren uns Moglichkeiten zur Einfuhrung enzymatisch abspaltbarer Substituenten, die als Schutzgruppen und Loslichkeitsvermittler zur gezielten Veranderung von Funktionalitat und Quell- bzw. Losungsverhalten dieser Polymeren sowie als Ankergrup- pen zur reversiblen kovalenten Bindung von Wirkstoffen geeignet sind. Im vorliegenden Beitrag wird uber Synthese und Eigenschaften enzymatisch spaltbarer Ethoxycarbonyl-ethoxymethylester von CMC berichtet.

2. Ergebnisse und Diskussion

Carbonsaureester, die sich formal von geminalen Diolen ableiten, unter- liegen in der Regel einer raschen enzymatischen Spaltung . Unter Verwen- dung verschiedenartiger Acyloxymethylester von Penicillinen und Cephalo- sporinen wird diese Eigenschaft z.B. zur reversiblen Blockierung von Carbo- xylgruppen bei der Herstellung oral wirksamer P-Lactam-Antibiotika ge- nutzt".

Im Falle der Modifizierung von CMC untersuchten wir die Moglichkeit, substituierte Alkoxymethylester als enzymatisch spaltbare Strukturelemente zu verwenden. Als reaktives Ausgangsprodukt ist dazu a-Brom-a-ethoxy- essigsaureethylester (2) geeignet, der sich in einfacher Weise durch Bromie- ren von a-Ethoxy-essigsaureethylester erhalten lafit 1 2 .

Die Esterbildung gelang durch direkte 0-Alkylierung des bei der CMC- Herstellung anfallenden Natriumsalzes (1, Substitutionsgrad DS 0,48 und 0,90), welches unter Variation der Synthesebedingungen mit (2) umgesetzt wurde. Der Gehalt an gebildeten Estergruppen und nicht veresterten Carb- oxylatfunktionen ist in Tab. 1 aufgefuhrt.

Wahrend in Wasser keine Umsetzung erfolgte, trat in DMF-Suspension Alkylierung unter Bildung der gewunschten Ethoxycarbonyl-ethoxymethyl- ester (3) ein, jedoch blieben die Umsatze auch bei Anwendung von zwei Mol- aquivalent (2) je mol Carboxylatgruppen sowie Erwarmen auf 60 "C unter ~ O V O ' ~ .

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Ester der Carboxymethylcellulose

OC2H5 I

/O-CH~-COO-CH-COOC~HS) x Cell a.x : vgl. DS in Tob.1

)o-cH~- COON^),+

Als besonders geeignet zur Herstellung der Ester (3) erwies sich eine pha- sentransferkatalysierte Alkylierung unter Verwendung von Triethylbenzyl- ammoniumchlorid (TEBAC) und insbesondere Tetrabutylammoniumhydro- gensulfat (TBAHSO.,) als Katalysatoren. In einem Zweiphasensystem aus der wwrigen Losung von Na-CMC (1) und der Liisung des Bromids (2) in Dichlormethan wurden bereits bei 30 "C mit einem Umsatz von 45 - 65% die htichsten Substitutionsgrade an Estergruppen erzielt.

PTC-Synthesen sind in den letzten Jahren zunehmend zur chemischen Modifizierung von Polymeren verwendet wordenl4. Bei Umsetzungen an Cellulose und Cellulosederivaten haben sie jedoch bisher nur begrenzt An- wendung gefunden, z.B. zur Herstellung von Cellul~seethern'~*'~.

Werden zur O-Alkylierung von Na-CMC weniger reaktionsfahige Alkyl- halogenide, wie l-Brombutan, Benzylbromid, a-Chloressigsaureethylester und a-Bromessigsaureethylester verwendet, so erfolgt unter den beschriebe- nen Bedingungen - einschliefilich der Variation von Reaktionstemperatur, Reaktionszeit und Phasentransferkatalysator - keine Esterbildung.

Eine Veretherung der alkoholischen Hydroxylgruppen der CMC erfolgt bei der O-Alkylierung mit (2) nicht. Entsprechend wird durch alkalische Ver- seifung von (3) Na-CMC mit den DS-Werten des Ausgangspolymeren (1) zu- ruckerhalten und bei vergleichenden Alkylierungsreaktionen mit mercerisier- ter Cellulose und wasserliislicher Cyanoethylcellulose (DS 0,79) keine Alky- lierung festgestellt.

Die Ethoxycarbonyl-ethoxymethylester (3) sind farblose Produkte, die sich bei DSCH2-cOONa-Werten > 0,30 in Wasser und Mischungen aus Wasser mit DMF bzw. DMSO losen. Die IR-Spektren zeigen die charakteristischen Absorptionsbanden der nicht umgesetzten Carboxylatgruppen bei 1625 cm- ' und der Estergruppen bei 1735 cm -' ( v ~ = ~ ) sowie der Ethoxysubstituenten des Esters bei 1030 und 1120 cm-' ( v ~ - ~ ) .

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Tab. 1. 0-Alkylierung von Na-CMC (1) mit a-Brom-a-ethoxyessigsLureethylester (2) unter Bildung enzymatisch spaltbarer Ethoxycarbonyl-ethoxymethyl- ester der CMC (3).

(1) (2) Reaktionsbedingungen (3) Substitutionsgrad

Tem- Zeit Medium Kataly- pera- sator tur

DS (mola)("C) (h)

1 30 25 HzO - 0,85 c0,lO 2 30 25 0990 <0,10

1 30 15 DMF - 0,78 0,12 1 6 0 5 0,80 0,lO 1 60 15 0,65 0,26 1 60 35 0,62 0,27 2 60 15 0,57 0,33

0,90 1 30 20 HzO/ TEBAC 0,73 0,19 1 30 45 CHzClz 0,61 0,28 2 30 45 0,42 0,47

1 30 10 HzO/ TBAHSO, 0,63 0,28 1 30 20 CHzClz 0,57 0,34 1 30 45 0,46 0 4 1 30 60 0,45 0,46 2 30 45 0,37 0,56

0,48 2 30 45 HzO/ TBAHSO, 0,31 0,22 CHzClz

a Berechnet auf 1 mol Carboxylatgruppen in (1). Nach einer modifiierten Uranylmethode bestimmt 13.

' R = CH(0CzHS)COOCzHS.

Fur die Ermittlung der DS-Werte von (3) konnte die bekannte Uranyl- methode l7 zur Bestimmung des Substitutionsgrades von CMC modifiziert werden. Dabei wurden die Polymeren sowohl unmittelbar als auch nach vor- angegangener Verseifung der Estergruppen hinsichtlich des Gehalts an Car- boxylatfunktionen untersucht und der Gesamtsubstitutionsgrad sowie der Anteil an Ester- und Carboxylatgruppen berechnet 1 3 . Diese Bestimmungs-

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Ester der CarboxymethyIcelIuIose

methode ist allgemein fur wasserlosliche, partiell substituierte CMC-Ester geeignet und wurde insbesondere im DS-Bereich von 0,l bis 0,8 f 0,06 ange- wendet.

Alle dargestellten Ethoxymethylester (3) erwiesen sich als enzymatisch spaltbar. Bei der Einwirkung von Normalserum vom Pferd setzt in wMriger Losung bei Raumtemperatur bereits nach 20 min Reaktionszeit eine deut- liche Hydrolyse der Estergruppen ein, die nach 1 h unter Ruckbildung von Na-CMC mit den DS-Werten des Ausgangspolymeren (1) beendet ist (Tab. 2).

Tab. 2. Enzymatische Spaltung von Ethoxycarbonyl-ethoxymethylestern der CMC (3) in wmriger Serum16sunga bei 25 "C.

Reaktionszeit Substitutionsgrad D~CH~-COOR b (min) DSCHz-COONa

0 20 30 45 60

0,46 0,65 0,78 0,82 0.89

a Normalserum vom Pferd. R = CH(OGH5)COOGH5.

Tab. 3. Hydrolyseverhalten von Ethoxycarbonyl-ethoxymethylestern der CMC (3) in Wasser und wmriger SerumlOsung im Vergleich zu CMC-Methylester.

CMC-Derivat Substitutionsgrad DSCHZ-COONa DSCHz-COOR

Na-CMC (1) 0990 0900 CMC-Ester (3), R = CH(OGH,)COOGH, 0,37 0,56 (3), 24 h bei 25 "C in Wasser 0,35 0,57 (3), 24 h bei 25 "C in wmriger Serum16sunga 0,87b 0900

O,8gc 0,00 CMC-Methylester, R = CH,d 0,27 0960 CMC-Methylester, 24 h bei 25 "C in wlRriger Serumlosung 0,29 0,59

a Normalserum vom Pferd. Vor Behandlung mit 8proz. Natronlauge. Nach Behandlung mit 8proz. Natronlauge. Hergestellt durch Umsetzung von Na-CMC mit SOClz in Methanol.

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Gegenuber Wasser ohne Serumzusatz sind die Ester (3) stabil. Wlhrend z.B. nach 24stundiger Behandlung mit Serumlosung eine vollsttindige Ester- spaltung eingetreten ist, erfolgt in Wasser im gleichen Zeitraum keine Veran- derung der DSc,,-cmR-Werte (Tab. 3). Analoge Reaktionen mit CMC- Methylestern ergaben, dalj diese weder in Serumlosung noch in Wasser einer Esterhydrolyse unterliegen.

Mit den beschriebenen Eigenschaften sind die durch spezifische O-Alky- lierung von Na-CMC erhaltlichen Ethoxycarbonyl-ethoxymethylester als enzymatisch spaltbare Schutzgruppen zur Modifizierung von CMC sowie als Ankergruppen zur reversiblen Polymerbindung biologischer Wirkstoffe von Bedeutung. Diese Moglichkeiten werden gegenwlrtig unter Einbeziehung weiterer Ethoxymethylester der CMC naher untersucht.

3. Experimentelles

Natriumcarboxymethylcellulose (1)

Als Ausgangsmaterial diente ein durch saurehydrolytischen Abbau von Baumwoll- Linters und nachfolgende Zerkleinerung hergestelltes Cellulosepulver (mikrokristal- line Cellulose FND, Spezialpapierfabrik DDR-9303 Niederschlag) mit einem Durch- schnittspolymerisationsgrad DP von 152 (Cuoxam), das in Gegenwart von 1 Sproz. wMriger Natronlauge in Propan-2-01 mit Monochloressigsaure bis zu Substitutions- graden von DS 0,48 -0,W verethert wurdel8.

a-Brom-a-ethoxyessigsaureethylester (2)

a-Ethoxyessigsaureethylester wurde, in siedendem CCb bromiert j2 .

Ausbeute: 68%; Sdp. 100- 101 "C//2,0 kPa (Lit.: 95 -96"C/1,5 kPal2).

Ethoxycarbonyl-ethoxymethylester der Carboxymethylcellulose (3)

Eine Lasung von 2,00 g (8,5 mmol Anhydroglucoseeinheiten) Na-CMC (1, DS 0,90), 1,00 g NaHCO, und 2,9 g (8,5 mmol) TBAHSO, in 30 ml Wasser wird mit der Lasung von 1,65 g (8,5 mmol) bzw. 3,30 g (17 mmol) a-Brom-a-ethoxyessigsaure- ethylester (2) in 20 ml Dichlormethan vermischt und 10 -60 h bei 30°C geriihrt (vgl. Tab. 1). Nach Eintropfen der Mischung in 300 ml Methanol wird das Polymere mit 500 ml80proz. wiU3rigen Methanol gewaschen, zweimal aus Wasser in Methanol um- gefallt, 20 h mit siedendem Ether extrahiert und bei 25 "C/2,0 kPa iiber Phosphor- pentoxid getrocknet. DS-Werte siehe Tab. 1.

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Ester der Carboxymethylcellulose

Enzymatische Spaltung der Ester (3)

Die Losung von 0,70 g (3) in 30 ml Wasser wird mit 0,Ol N wariger Natronlauge und 0,Ol N Essigsaure gegen Bromthymolblau auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und mit 40 mg Normalserum vom Pferd, lyophil getrocknet, in 20 ml Wasser 1 bis 24 h bei 25 "C geriihrt. Nach Einengen bei 25 "C/2,0 kPa auf 10 ml wird das Polymere in Methanol ausgefallt und, wie vorstehend bei der Herstellung von (3) beschrieben, auf- gearbeitet .

Auswaage: 0,55 g; DS siehe Tab. 2 und Tab. 3.

C. L. McCormick, K. W. Anderson, B. H. Hutchinson, J. Macromol. Sci., Rev. Macromol. Chem. Phys. 22 (1982 -83) 57 D. Klemm, G. Geschwend, M. Hartmann, Wiss. Z. Friedrich-Schiller-Univ. Jena, math.-naturwiss. R. 33 (1984) 163 T. A. McGuire, R. E. Wing, W. M. Doane, Starke 33 (1981) 138 K. J. Hiittinger, Chem.-Ztg. 106 (1982) 415 K. Balser, K. Szablikowski, Papier (Darmstadt) 35 (1981) 578 K. Balser, in Ullmanns Encyclopadie der technischen Chemie, 4. Aufl., Bd. 9, Verlag Chemie, Weinheim 1975, S. 208 Ger. 2323 198 (1973), Institut chimii drewesiny Akademii Nauk Latwijskoy SSR; Rischskij medizinskij institut; Riga, UdSSR, Erf.: M. J. Pormale, N. A. Kaschkina, E. I. Wejnberg, A. J. Kalninsch, J. Schuster, W. D. Mikaschan, I. W. Purwinsch, A. P. Skutelis Ger. 3016189(1980), Bayer AG, Erf.: B. Bbmer, H. Schnoring, R. Schmidt, H. J. N i e s s e n L. Goldstein, G. Manecke, Appl. Biochem. Bioeng. 1976, 23

l o D. Klemm, G. Geschwend, M. Hartmann, Acta Polym. 35 (1984) 176 l1 DE-OS 2144457 (1971), Astra Lakemedel AB, Erf.: B. A. Ekstrom, B. 0. H.

Sjaberg l 2 A. Bendisch, G. C. Clements, J. Am. Chem. SOC. 75 (1953) 4075 I 3 D. Klemm, G. Geschwend, Z. Chem. 24 (1984) 95 l4 J. M. J. Frkchet, Polym. Prepr., Am. Chem. SOC., Div. Polym. Chem. 23, 1

(1982) 139 W. H. Daly, J. D. Caldwell, J. Polym. Sci., Polym. Lett. Ed. 17 (1979) 55 W. H. Daly, J. D. Caldwell, Polym. Prepr., Am. Chem. SOC., Div. Polym. Chem. 23, l(1982) 145

l7 C. V. Francis, Anal. Chem. 25 (1953) 941 Japan. 76116889 (1976), 76116890 (1976), Erf.: K. Ohnaka, S. Yokoi, T. Ohmiya

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