Arch. exper. Path. u. Pharmakol., Bd. 220, S. 321--333 (1953).

Aus dem Tuberkulose-Forschungsinstitut Borstel, ]nstitut fiir experimentelle Bio- logie und Medizin (Direktor: Professor Dr. Dr. E. FREERKSEN).

Enzymatisehe Inaktivierung yon Isonicotins~iure- hydrazid im menschlichen und tierischen 0rganismus.

Von RUDOLF B~NICKE und WALTRAUD REIF.

Mit 5 Textabbildungen.

(Eingegangen a~ 10. Mai 1953.)

Von den zur Zeit in der Klinik verwendeten Tuberkulostat ika wie Conteben, p-Aminosalicyls~ure, Streptomycin und Isonicotins~ure- hydrazid besitzt letzteres die weitaus gr5Bte tuberkulostatische Wirk- samkeit in vitro. Ob aber diese hohe, in vitro ermittelte Aktivi t£t auch in vivo roll zur Wirkung kommen kann, hi~ngt von verschiedenen Faktoren ab, yon denen im folgenden die ffir die therapeutische Eignung so wesent- liche Eigenschaft der Stabilit~t gegenfiber den Enzymen des Makro- organismus behandelt werden soll.

Ein erster Hinweis fiber das Schicksal eines Therapeutikums im Makroorganismus kann aus Versuchen fiber seine Wiederausscheidung

d u r c h die Niere gewonnen werden. Die darfiber bisher ffir das I N t t vor- liegenden Mitteilungen, in denen die Wiederausscheidung fiberein- s t immend mit 50--75~o der applizierten Dosis angegeben wird, kSnnten zu der Auffassung verleiten, da~ das applizierte I N H im menschliehen Organismus keine nennenswerte Wirkungseinbul3e infolge enzymatischen Ab- oder Umbaues erf~hrt. Das ist aber nach unseren Untersuchungen keineswegs der Fall. Das I N t t wird im menschlichen Organismus zu einem betri~chtlichen Teil zu unwirksamen Verbindungen um- oder ab- gebaut. Wean die Inaktivierung des I N H bisher nicht erkannt wurde, so lag das wohl im wesentlichen an der Unzul~nglichkeit der verwendeten INH-Best immungsmethoden. Die zumeist verwendete chemische Me- thode nach KELLY und POET besitzt nicht die ffir solche Untersuchungen erforderliche Spezifit~t. Mit ihr wird nicht nur freies, tuberkulostatisch wirksames I N H erfal3t, sondern auch samtliche an der NHe-Gruppe gebundenen, durch Kochen im sauren Milieu hydrolysierbaren, tuber- kulostatisch unwirksamen Umwandlungsprodukte. Wir haben schon in friiheren Publikationen (BSNICKE [1--3]) darauf hingewiesen, dal3 bei Verwendung mikrobiologischer oder spezifischerer chemischer INH- Bestimmungsmethoden, mit denen nur tuberkulostatisch wirksames I N H meBbar ist, die hohen Wiederausscheidungswerte yon 50- -75%

322 R. B6~Ic~E und W. REI~:

nicht reproduzierbar sind. Wir erhielten mit diesen INH-:Nachweis- methoden erheblich geringere Ausscheidungswerte. In Fortsetzung dieser Arbeiten waren wir bestrebt, die Untersuchungen fiber die Wiederaus- scheidung des INH, seiner Abbau- und Umwandlungsprodukte unter Verwendung mSglichst verschieden~rtiger Nachweisraethoden in quali- tativer und quantitativer Hinsicht zu ergi~nzen.

Methodischer Teil.

1. M ikrobiologische I N H- Bestimmung.

Zwei mikrobiologische INH-Bestimmungsmethoden wurden von uns verwendet, der Lochtest und der Reihenverdfinnungstest. Der Lochtest besitzt gegenfiber dem Reihenverdfinnungstest den Vorteil der gr513eren Genauigkeit und der schnelleren Ablesbarkeit des Me~ergebnisses. Sein Nachteil ist die geringere Empfindlichkeit. Die Nachweisgrenze liegt bei 2,5 v/ml, w~hrend imVerdfinnungstest noch 0,1--0,2 y/ml mel~bar sind. Die relativ geringen INH-Konzentrationen im Blutplasma haben wir daher mit Hflfe des Verdfinnungstestes bestimmt. Der INH-:Nachweis im Urin erfolgte im Lochtest, dessen technische Durchffihrung yon uns an anderer Stelle (BSNmKE [1]) ausffihrlich beschrieben worden ist.

Die Bestimmung der INH-Konzentration im Blutscrum wurde mit ttilfe des Verdfinnungstestes wie folgt durchgefiihrt: Von dem auf seinen INH-Gehalt zu untersuchenden Serum wird mit sterilem, INH-freicn Serum eine Verdfinnungs- reihe in fallenden 2er Potenzen hergestellt. RShrchen 1 enthilt 0,5 ml des zu unter- suchenden Serums, RShrchen 2 0,5 ml des zu untersuchenden Serums, dem 0,5 ml INtt-freies Blutserum zugefiigt wird. Nach guter Durehmischung werden davon 0,5 ml in ein drittcs RShrchen iibertragen und 0,5 ml INH-freies Serum zugeffigt, gut durchmischt und wiederum davon 0,5 ml in ein 4. RShrchen gegeben usw. ])as 12. R5hrchen (Kontrollr5hrchen) enthilt nur 0,5 ml INH-freies Serum. Alle RShr- chen der Reihe werden mit 4,5 ml synth. NihrlSsung fiir Tuberkelbakterien nach LOCKEMANN o, uf 5 ml aufgefiillt und mit einem Tropfen einer 15tigigen DcBos- Kultur yon Mycobact. tuberculosis Typus humanus (Greifswald), 1:100 mit phys. NaC1 verdiinnt, beimpft. Nach 20tigiger Bebriitungszeit bei 37 ° C wird festgestellt, bis zu welchem RShrchen der Reihe das Wachsturu des Testbakteriums ausgeblieben ist. Durch Vergleich mit einer Kontrollreihe wird die INH-Kouzentration des zu untersuehenden Serums ermittelt.

2. Chemische Methoden.

a) M e t h o d e n a c h KELLY u n d POET.

Nach dieser Methode wird die tIydrazingruppe des I N H hydrolytisch abgespalten und durch Reaktion mit p-Dimethylaminobenzaldehyd in einen gelben Farbstoff fiberffihrt, der im Photometer quantitativ be- stimmbar ist. Da auch andere in ~ther-Amylalkohol-Mischung 15sliche Substanzen des Urins mit p-Dimethylaminobenzaldehyd ~hnliche F~r- bung ~n ergeben, ist es notwendig, zu jeder Messung eine Leerbestimmung durchzuffihren, die allerdings bei Patienten, die unter INIt-Medikation

Enzymatische Inaktivierung yon Isonieotins~urehydrazid. 323

stehen, nur schwer mSglich ist. Auch bei Versuchspersonen, die zur Prf i fung der Wiede raussche idung des I H N eine e inmal ige I N H - D o s i s erhal ten , m a c h t die Berf icks icht igung dieses T a tbe s t a nde s Schwierig- kei ten , da die K o n z e n t r a t i o n dieser fg rbenden Subs tanzen innerha lb von 24 S td s t a rken Schwankungen unter l iegt . Wi r haben daher bei diesen Versuchspersonen u n m i t t e l b a r vor A p p l i k a t i o n des I N H den Ur in zur L e e r w e r t b e s t i m m u n g un te r such t u n d glauben, dadurch die durch die f~rbenden Subs tanzen bedingte Ungenau igke i t geminde r t zu haben.

Wie bere i t s e in le i tend aus- geffihrt , wi rd mi t dieser Me- 16 thode n ich t nur freies, tuber - ~, ku los t a t i sch wi rksames I N H ~'.~72 errant , sondern auch si~mtliche an der NH2-Gruppe subs t i tu - i e r t e n U m w a n d l u n g s p r o d u k t e , ~ B die durch Kochen im sauren Milieu hyd ro ly s i e rba r sind. ~

S i e ist also keine spezifische I N H - B e s t i m m u n g s m e t h o d e . c

Im einzelnen wurde der INH- Nachweis im Urin wie folgt durch- gefiihrt: 3 ml Urin werden mit 3,2 g Ammonsulfat, 1 ml 0,5 n NaOH und 40 m120% iger Isoamyl-

\ \

i

42 o,~

\ \

\ i i i I

o,s o,8 ~o 1,2 Ex t/n h h'o n

Abb. I. E ichkurve zur Bes t immung yon I N t t (GesamtzINt t ) (Methode nach KELLY und POET).

alkohol-Xther-Mischung versetzt und 10 min mechanisch geschiittelt. Im Scheide- triehter wird die organische Phase abgetrennt. 30 ml des Isoamylalkohol-~ther- Extraktes werden mit 4 ml 0,1 n HC1 versetzt und 5 min geschiittelt. Von dem sauren Extrakt werden 3 ml in ein graduiertes R5hrchen iibertragen, 0,5 ml 6 n HC1 und 1 ml p-Dimethylaminobenzaldehyd-LSsung zugefiigt und gut gemischt. Zur vollsti~ndigen Hydrolyse wird 45 min auf 100 °C im Wasserbad erhitzt, auf Raum- temperatur abgekfihlt und mit 0,1 n HC1 auf 4 ml aufgefiillt. Ansehliel3end wird im Photometer (Zeil~-Filter S 42) die Extinktion gegen einen Blindwert gemessen. Der Blindwert setzt sich zusammen aus 3 ml n/10 HC1, 1 ml p-Dimethylaminobenz- aldehyd-LSsung und 0,5 ml 6 n tiC1. Er wird wie ohen beschrieben, erhitzt und auf 4 ml aufgefiillt. Die zu der gemessenen Extinktion gehSrige INH-Konzentration ergibt sich aus der Eichkurve (Abb. 1), die nach der gleichen Methode aus w~l]rigen INH-L6sungen bekannter Konzentration angelegt wird.

Der Nachweis im Serum erfotgt auf die gleiehe Weise, jedoch mit einer halb- stiindigen Dauer des Ausschiittelns.

Reagenzien: a) 20%ige LSsung von Isoamylalkohol p. a. in Xther, b) p-Dimethylaminobenzaldehyd-L6sung.

1,2 g p-Dimethylaminobenzaldehyd werden in 20 ml absol. Methanol gelSst und 2 ml 12 n HC1 zugeffigt.

b) N a c h w e i s y o n f r e i e m I N H .

Die un te r a) beschr iebene Methode nach KELLY und POET wurde yon uns so abgewande l t , dab nur das freie I N H , n ich t abe r die Um- wand lungsproduk te , erfaBt werden. Sie be ruh t a u f der R e a k t i o n der

324 R. BONICKE und W. REIF:

freien NH2-Gruppe des I N H mit p -Dimethy laminobenza ldehyd un te r

Bi ldung eines gelben Farbstoffes, der photomet r i sch ausgewer te t wird.

Sie stell t also wegen des Verzichts auf die Hydro lyse eine Vereinfachung

der Methode von KELLY und POINT dar, besi tzt jedoch eine geringere

Empfindl ichkei t .

Nachweis im Urin. 6 ml Urin werden in einer 100 ml-GlasstSpselflasche nach Zugabe yon 6,4 g Ammonsulfat und 2 ml 0,5n NaOH mit 80 ml 20%iger Isoamyl- alkohol-.~ther-Mischung 10 min mechanisch geschiittelt. 60 ml des organischen

100

.~ 80

~ 6o

i :2= Z

2O

0

\ \

\ \

\ \

I I I i I

~z o,~ 0,# #,# ~,o 1,z l,q Extinktion

Abb. 2. Eichkurve zur Best immung yon ISTH (freies INH) (unhydrolysierte Methode),

Extraktes werden in eine 100 ml- GlasstSpselflasche pipettiert und 5 min lang mit 4 ml 0,1 n HC1 ge- schtittelt. 2 ml der salzsauren LSsung werden mit 1 ml Wasser, 1 ml 20%- iger Trichloressigs~ure und 1 ml EnRLXCH-Reagens versetzt und nach einer halben Stunde photometriert (Zeiss-Fflter S 42); gemessen wurde gegen den gleichbehandelten Leer- ur inals Blindwert. Die zu der ge- messenen Extinktion gehSrige INH- Konzentration ergibt sich aus der Eichkurve (Abb. 2), die nach der gleichen Methode aus INH-LSsun- gen (LSsungsmittel ~ Urin) bekann- ter Konzentration angelegt wird.

Der Nachweis im Serum erfolgt wie der im Urin (mit ~stiindiger Dauer des Ausschiittelns).

Reagenzien. EHRLTCI~-Reagenz: 3 g p-Dimethylaminobenzaldehyd werden in 100 ml Eisessig gelSst und 100 ml 54,4°/oige 4 m Natriumacetat-L6sung zugeftigt.

c) N a c h w e i s y o n I s o n i c o t i n s ~ u r e .

Zum Nachweis der I N S wird die bekannte Reak t ion der Pyr id in-

der iva te mi t B r o m c y a n und primKren Aminen verwendet . Wir h ie l ten

uns im wesent l ichen an das yon RuBIN, DREKTER, SCHEINER und DE

RIrTER beschriebene Verfahren.

Nachweis im Urin. 2 ml Urin (oder verdiinnter Urin) werden im graduierten RShrchen mit 4 ml aqua dest. und 1,8 ml 4,5 n HC1 versetzt. Nach Zugabe von 2,2 ml 4,5 n NaOH und Phenolphthalein als Indicator wird mit 2 n HCI bis zum Umschlag yon Rot nach Farblos titriert und mit Ammonreagens auf 12 ml aufgefiillt. 5 ml dieser Mischung werden mit 1 ml 10~oiger BromcyanlSsung ver- setzt und nach genau 4 min photometriert. An Stelle der Versuchsl6sung werden 2 ml aqua dest. nach dem glcichen Verfahren behandelt. Zum Verglei01 wird INH- freier Urin, der derselben Versuchsperson unmittelbar vor Applikation des INH entnommen wird, nach dem gleichen Verfahren gemessen. Eichkurve Abb. 3.

Nachweis in der Leber. Frische Leber wird zu einem homogenen Brei zerkleinert, und zu 12 g werden 2,4 mg (bzw. 1,8 oder 1,2 mg) INI-I gegeben, gut vermischt und 2 Std im Brutschrank bei 37 ° C gehalten. Danach wird mit 48 ml physiologischer

Enzymatische Inaktivierung yon Isonicotinsaurehydrazid. 325

NaC1 24 Std im Eisschrank eluiert. Der Auszug wird filtriert, mit Natriumwolfra- mat-Schwefelsiiure enteiweil3t und die INS aus dem Filtrat nach obigem Ver- fahren bestimmt.

Reagenzien. Natriumwolframat-Schwefelsiiure. 10%iges Natriumwolframat wird mit dem gleichen Volumen 2/3 n Schwefels~ure gemischt.

Gepuffertes Ammonreagens, s. unten.

d) B e s t i m m u n g v o n I N H d u r c h U m w a n d l u n g i n I N S .

Die U m w a n d l u n g von I N H in INS erfolgt durch Kochen im sauren Milieu; anschliel~end wird oxydiert . I n Abwand lung des Verfahrens nach RUBIN, DREKTER, SCI-[EINER und DE RTTTER verwendeten wir n icht K a l i u m p e r m a n g a n a t als Oxydat ionsmit te l , sondern Cerisulfat, das uns wegen der Eindeut igke i t der Reduk t ion vom 4-wertigen zum 3-wertigen Cer geeigneter erschien. Die nach dieser Methode in KSrperfliissigkeiten wie Urin, Blu t se rum oder Liquor e rmi t te l ten I N S - K onz e n t r a t i one n setzen sich zusammen aus Isonicotinsiiure, die sieh aus I N H durch die Wi rkung kSrpereigener Enzyme (Leber) bildet, sowie aus freiem I N H u n d gebundenem INH, die durch das Nachweisverfahren in INS um- gewandel t werden.

Quantitativer Nachweis im Urin: 2 ml Urin (oder je nach zu erwartender INH-Konzentration entsprechend ver-

diinnter Urin) werden im graduierteu RShrchen mit 2 ml n/10 Schwefelsiiure 20 rain im siedenden Wasserbad erhitzt. In die heil]e LSsung werden 0,5 ml 4 n Schwefel- s~ure und 0,8 ml 6 n HC1 gegeben und yon einer 15% igen Cerisulfat-LSsung in 0,5 n Schwefelsi~ure [Ce(SO4) 2 . 4H20 ]bis zur b]eibenden Gelbfiirbung zugetropft. Nach Reduktion des iiberschiissi- gen Cerisulfats mit 1% iger Ascor- bins~ure-LSsung werden zur Neu- tralisation 2,2 ml 4,5 n NaOH zugeffigt. Dabei entsteht je nach Menge des zugefiigten Cerisulfats ein mehr oder weniger starker Niederschlag. Nach Zugabe yon 1Tropfen Phenolphthalein wird mit 2 n HC1 bis zum Umschlag yon Rot nach Farblos titriert und mit Ammonreagens auf 12 ml aufge- fiillt. Es wird vom Niederschlag abfiltriert und 5 ml des Filtrats mit 1 ml 10%iger Bromcyan-LSsung versetzt und nach 4 min photo- metriert. Eichkurve siehe Abb. 3.

30

~. 20

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0 I I I I I I ~ ' ~

Exf/nkt/on

\

Abb. 3. Eichkurve zur Bcst immung des I N H als INS. (Abbau dutch Hydrolysc und Oxydation.)

Reagenzien. Gepuffertes Ammonreagens: 87 g K2HPO 4 p. a. und 107 g NHaC1 p. a. werden unter Zugabe yon 6,7 ml 28% igem Ammoniak zu einem Liter gelSst.

Yersuchsergebnisse.

I n der Zeit yon M~rz bis Dezember 1952 wurden yon uns an einer grSl~eren Zahl yon k ranken und gesunden Versuchspersonen Messungen fiber die Wiederausscheidung des I N H durchgefiihrt . Durch die Ver-

326 R. BSNICKE und W. REIF:

wendung verschiedenartiger INH-Bestimmungsmethoden war es mSglich, gleichzeitig mit den quantitativen Ausscheidungsverh~ltnissen die so wichtige Frage zu kli~ren, in welcher Form das INH zur Exkretion ge- langt, ob frei oder gebunden, oder ob als S~ure.

Den Versuchspersonen (VP) wurden einmalig 200 oder 300 mg INH verabreicht. Unmittelbar nach der Medikation wurde der 24stfindige Urin gesammelt und aus der gemessenen INH-Konzentrat ion und der Menge des gesammelten Urins die absolute bzw. prozentuale Aus- scheidung errechnet. Folgende Ergebnisse wurden erzielt:

Tabene 1. Ausscheidung von Isonicotins4urehydrazid durch die Niere. INH-Bestimmung: mikrobiologisch (1)

Lfd. Ausscheidung (24 Std) Nr. Pat ient INH-Pr~para t ill %

9 10 ll 12 13 14 15 16 17 18 19 20

La. Ehr.

Mu. ? To. Mau. 2 Fo. $ He.

Ma. Stfi. Eh. Gu. Ja. S Kra. Krii. 3 Le. 3 Pe. Po. d R~. d We. 3

Neoteben Neoteben Neoteben Neoteben Neoteben Neoteben Neoteben Neoteben

Neoteben Neoteben Rimifon Rimifon Rimifon Rimifon Rimifon Rimifon Rimifon Rimifon Rimifon Rimifon

Tagesdosis in g in mg

0,7 185,6 0,7 93,3 0,7 142,7 0,8 37,2 0,6 57,6 0,6 123,3 0,6 19,8 0,5 77,5

0,25 24,2 0,3 13,9 0,25 72,2 0,4 18,5 0,2 12,2 0,25 42,8 0,3 36,8 0,3 14,7 0,25 70,7 0,35 26,8 0,3 43,6 0,3 11,0

26,5 13,3 20,4 4,7 9,6

20,5 3,3

15,5

9,7 4,6

28,9 4,6 6,1

17,1 12,3 4,9

28,3 7,7

14,5 3,7

Das verabreichte INH wird nur zu einem geringen Prozentsatz in unveri~nderter Form, also als freies, tuberkulostatiseh wirksames INH mit dem Urin ausgeschieden. Bei 86 VP unter Verwendung des mikro- biologischen INH-Nachweises durchgeffihrte Messungen ergaben im Mittel eine prozentuale Wiederausscheidung von 12,4% der applizierten Dosis. Der niedrigste gemessene Wert betrug 1,5~o, der hSchste 370/o . Die gleiehen Ergebnisse wurden erhalten, wenn der INH-Nachweis mit der von uns modifizierten, vereinfachten ehemischen Methode naeh KELLY und POET durchgeffihrt wurde, die infolge des Verzichts auf die Hydrolyse nur freies INH erfaBt (s. method. Teil unter 2b). In Tab. 1 sind die mikrobiologisehen Mei3ergebnisse fiber die Wiederausscheidung

Enzymatische Inaktivierung yon Isonicotinsi~urehydrazid. 327

yon freiem INH bei 20 Patienten des Tuberkulose-Krankenhauses Bor- stel zusammengestellt. 8 der Patienten erhielten t£glich ei~e INH-Dosis yon 10 mg/kg KSrpergewicht, die anderen 12 Patienten eine t~gliche Dosis yon 4 mg/kg K6rpergewicht. Gemessen wurde die Menge des in 24 Std mit dem Urin ausgeschiedenen freien INH. Die Werte streuten zwischen 3 und 3 0 o der applizierten Tagesdosis. Im Mittel fanden wir bei der Gruppe mit der hohen Dosierung eine etwas h6here prozentuale Ausscheidung, n~mlich 14 ,2° , als bei der Gruppe mit der geringeren Tagesdosis, bei der etwa 11,9% als freies, tuberkulostatisch wirksames I NH ausgeschieden wurde.

Tabelle 2. INH-Ausscheidung durch die Niere beim Menschen nach einmaliffer oraler Applikation yon 200 rag. Messung yon M~trz bib Dezember 1952.

INH-Naehweis: mikrobiologisch.

INtt -Gehal t des 24 Std-Urins in Monat Prozent der appliziertcn Dosis

B5 3 Kr5 ~ Wo

Mi~rz . . . . . . . April . . . . . . . . Mai . . . . . . . Juni . . . . . . Juli . . . . . . August . . . . . September . . . Oktober . . . . . N o v e m b e r . . . . i l Dezember . . . . . ~1

2,4 2,9 3,1 2,4 2,6 2,4 2,4 2,8 1,7" 2,7

3,6 3,8 3,9 4,8

4,7 4,5

29,4 30,8 30,0

28,9 30,1 28,7 14,1" 30,5

* Es besteht die MSglichkeit, dall den VP statt 200 mg nur 100 mg INH ver- abreieht worden ist, da bei beiden die I-I~lfte der sonst gefundenen prozentualen Ausseheidungswerte gemessen wurde.

Die Ausscheidung von freiem INH scheint eine aul~erordentlich kon- stante, ffir jeden Einzelnen charakteristische GrSl~e zu sein, wie wir an einer kleineren Zahl yon VP, bei denen wir die Ausscheidung in monat- lichen Abst~nden fiber einen Zeitraum yon 10 Monaten gemessen haben, nachweisen konnten. Das Ergebnis eines solchen Vcrsuchs ist fiir drei m~nnliche VP in Tab. 2 zusammengestellt. 2 yon ihnen scheiden yon der applizierten Gesamtmenge in 24 Std nur einen geringen Prozent- satz, ni~mlich 2,7 bzw. 4,2%, als freies, tuberkulostatisch wirksames INH aus. Man kSnnte sie als ,,schlechte" INH-Ausscheider bezeichnen, wi~h- rend die dritte VP, die nahezu die 10fache Menge an freiem INH aus- scheidet, als ,,guter" Ausscheider bezeichnet werden miiBte. Diese quantitative Besonderheit der Exkretion blieb bei den drei VP in dem gemessenen Zeitraum bestehen. Auch bei anderen VP, gesunden und kranken, konnte der gleiche Befund erhoben werden.

328 I4. : B 6 ~ C K E u n d W . I~E]~F:

Ein betr~chtlicher Tell des ~pplizierten I~¢H wird in gebundener, tuberkulostatiseh unwirksamer Form ausgeschieden. Ffir die Bestim- mung dieser Form eignet sich die ~llgemein gebr~uchliche, chemische lNH-Bestimmungsmethode nach KELZV und PO~T, da sie neben freiem INH ~lle an der NH~-Gruppe substituierten Umwandlungsprodukte, so- weir diese durch Kochen im sauren Milieu hydrolysierb~r sind, erfal~t.

70,0

\ . ~ \ \

. . . . ~

c/zem.Al~,chweis chem.Nachwe/s mge'ob/olo~. Hel/y u. Poet unhydzol, n. B5:

Abb. 4a. TS~H-Ausschei,lung dutch die ]~ierc beim ~Ienschen nach oraler Applikation yon

200 rag. Sammelurin yon 24 Std,

~0

))))

. . \ \

. \ \ \

??)? ~ q 2.7%

~oc? 8a'c~ ~¢o~ s~d wod 85c~ chem.Nachwe/s chem.Nachwgi~ mikfobio/o.¢. lie/t) " u- Poet unhydrol n. L?5"

Abb. 4b. IN]~-Ausscheidung durch die Niere beim ~lenschen nach oraler Applikation yon

200 mg in Kapseln.

0 5&

/ / H . . . .

i / / / ~ \ \ \ \

WoC~ B~c5 ~¢ocf 85"C~ them, Nuchwe/~ them, Nachwe/~ Hell 3" ~ Poe/ unhydPoL

3,0%

w.d s,~o" m/hrobMo~

n.L?6"

Abb. 4c. INH-Ausscheidung durch die Niere beim Menschen nach intravenSser Applikation yon 200 rag.

Die mit Hilfe dieser Methode durchgeffihrten Messungen fiber den Gehalt des 24 Std-Urins an freiem und gebundenem INH ergaben Werte yon 58--70% der applizierten D~sis. Zieht man davon die mit ttflfe der mikrobiologischen oder chemisehen, unhydrolysierten Methode gefun- denen Betr~ge ffir freies INH ab, so erhalt man die im 24 Std-Urin ent- haltene Menge an gebundenem, tuberkulostatisch unwirksamen INH. Bei ,,schlechten" INH-Ausscheidern ist diese Menge verhgltnism~t0ig grol3 und kann bis zu 68% der applizierten Gesamtdosis ausmachen, wKhrend sie bei ,,guten" INH-Ausscheidern entsprechend geringer ist,

Enzymatische Inaktivierung von Isonicotinsaurehydrazid. 329

immerhin aber den Betrag yon 30% iibersteigt. Die Umwandlung erfolgt wahrscheinlich im menschlichen Organismus auf enzymatischem Wege. Ob die freie NH2-Gruppe wie bei den Sulfonamiden mit Essigsaure ver- estert wird, konnte bisher noch nicht geklart werden. Auch konnte noch nicht festgestellt werden, in welchem Organ die Umwandlung erfolgt. Es kann jedoch als gesichert gelten, dab die enzymatische Umwandlnng zum gebundenen I N H nicht im Magen-Darmkanal erfolgt. Wir untersuchten den 24 Std-Urin auf seinen Gehalt an freiem und gebundenem INH, und zwar einmal nach oraler Medikation yon 200 mg INH, das in Form yon Tablet ten oder in Kapseln, die sich nach Passage des Magens im Diinndarm 15sen, gegeben wurde, und zum anderen nach intravenSser Applikation der gleichen Menge. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Abb. 4 a - - c fiir 2 VP dargestellt. Aus ihnen ist zu entnehmen, dal3 die gemessenen Betrage fiir freies und gebundenes I N H bei den verschiedenen Applikationsarten wesentliche Unterschiede nicht zeigen, dal3 also das applizierte II~H auch dann in dem gleichen Mal3e inaktiviert wird, wenn eine Passage durch den Magen-Darmkanal umgangen wird.

Tabelle 3. Abbau yon Isonicotinsaurehydrazid ( I N H ) zu Isonicotinsdure ( INS) durch tierische Leber.

Zugesctztes IIerkunft der Leber :~[engc g INH in mg

Hund . . . . . . . . 12 tIund . . . . . . . . 12 Kalb . . . . . . . . 12

I 12 Kaninchen . . . . . . I Kaninchen . . . . . . : 12

2,4 2,4 1,2 1,2 1,2

INS- Oehalt nach 2 stiindiger Lcbereinwirkung

in mg in %

0,35 14,6 0,46 19,3 0,15 12,1 0,39 32,3 0,46 38,7

Etwa 20- -25% des oral verabreichten I N H we~'den im menschlichen 0rganismus zu Isonicotinsgure abgebaut und als solche mit dem Harn aus- geschieden. Die quanti tat ive Bestimmung der Isonicotins~ure erfolgte nach der von I~UBIN, ~ ) R E K T E R , SCHEINER und DE RITTER angegebenen Methode (s. method. Tell 2c). Nach unserenUntersuchungen besitzt die tierische Leber die Fahigkeit, I N H partiell zu Isonicotinsaure abzubauen. In Tab. 3 ist ein Ausschnitt der Ergebnisse unserer diesbeziiglichen Ver- suche zusammengestellt. Die Kaninchenleber zeigt diese Fahigkeit in besonders s tarkem Mal3e, wi~hrend Kalbs- und Hundeleber nur einen verhaltnisma~ig geringen Teil des zugesetzten I N H zur Saure abzu- bauen vermSgen. Alle anderen Organe und Gewebe dieser Tiere (Lunge, Milz, l~iere und Muskulatur) waren dazu nicht imstande. ~¥ir glauben auf Grund dieser Versuchsergebnisse zu der Annahme berechtigt zu sein, dal3 auch im menschlichen Organismus der teilweise Abbau des I N t t zur Saure in der Leber erfolgt.

330 R. BSNm~E und W. RnEF:

Ffir 2 charakteristische F~lle (Gegenfiberstellung eines ,,guten" und eines ,,schlechten" Ausscheiders) sind in der Abb. 5 die quantitativen Wiederausscheidungsverh~ltnisse der Gesamtausscheidung in Form eines Diagramms dargestellt. Wi~hrend die im 24 Std-Urin enthaltene Menge von Isonicotins~ure bei beiden VP etwa gleich ist, ni~mlich 20,0 bzw. 21,5°/o, zeigen die gefundenen Werte fiir freies und gebundenes INH be- tr~chtliche Differenzen. VP BS. scheidet freies INH nur zu 2,9~o aus; der grS~te Teil des INH wird zu gebundenem INH enzymatisch inakti- viert. Dieser Anteil betr~gt etwa 67,1% der applizierten Dosis. Bei

Vers.-Pepson ." Bb" ~rX,1

~,~ ~,,

~% b c a

a+b+e~o~,5 %

Pens.- Pep.~on ." 14/o C~

qDN , a b c,

a+b+c=8~0% Abb. 5. IN~-Ausscheidung durch die Niere bcim Menschen in 24 Std.

INH-Dosierung: 200 mg per oral. a freies INH; b gebundenes INH; c Isonicotins~iure.

VP Wo. ist der Anteil des freien INH im 24 Std-Urin erheblich h6her und erreicht mit 29,3~o etwa den 10fachen Betrag. Gebundenes INH ist dagegen in entsprechend geringerer Menge, n~mlich 36,7~o enthalten. Addiert man die gefundenen Werte ffir freies, gebundenes und das zur S~ure abgebaute INH, so erhi~lt man als Gesamtausscheidung bei beiden etwa dell gleichen Betrag, der bei VP B6. 91,5%, bei VP Wo. 86% der applizierten Dosis ausmacht. Der iibrige Tell ist entweder noch nicht zur Ausscheidung gelangt oder hat den Organismus mit Stuhl oder Schweil~ verlassen. Diese Prozentzahlen wurden mit unwesentlichen Differenzen sowohl bei eincr einmaligen Dosis yon 200 mg INt t als auch bei einer Dosis yon 300 mg erhalten. Die applizierte INH-Dosis scheint demnach zumindest in dem gepriiften Bereich keinen Einflul~ auf die prozentualen Ausscheidungsbetr~ge zu haben.

Parallel mit den Exkretionsversuchen durchgefiihrte Messungen fiber den INH-Blutspiegel ffihrten zu korrespondierenden Ergebnissen. Bei ,,schlechten" INH-Ausscheidern konnte freies, tuberkulostatisch wirk- sames INH im Blut nur in geringer Menge nachgewiesen werden, w~hrend ,,gute" Ausscheider einen entsprechend hohen INH-Blutspiegel auf- wiesen. Fiir gebundenes, tuberkulostatisch unwirksames INH lagen die

Enzymatisehe Inaktivierung yon Isonicotins~urehydrazid. 331

Konzentrationsverh~ltnisse umgekehrt. Davon abweichende Resultate wurden bisher nicht erhalten. Die Kenntnis der YNII-Ausscheidung er- mSglicht also Rfickschlfisse fiber das AusmaB der tuberkulostatischen Aktivitiit des Blutes nach Verabreichung des INH. Als Beispiel seien die mit den verschiedenen INH-Best immungsmethoden gemessenen INH- Konzentrationen im Blutserum der beiden VP Wo. und BS., deren INH- Ausscheidung so stark differiert, wiedergegeben (Tab. 4 u. 5). Beiden VP

Tabelle 4. Tuberkulostatische Aktivitdt des Blutserums nach einmaliger oraler Applikation yon 300 mg INH.

Testkeim: Myobact. tuberculosis Typus humanus (Greifswald) N~hrsubstrat: DuBos-Medium.

Blu ten tnahme in S tunden nach I

IN'H-Appli - ka t ion

Serum-Verdi innung I

.. ¢¢

Vor Appl. Std

1 Std 11~ Std

2 Std 3 Std 4 Std 6 Std

Vor hppl. 1~ Std 1 Std

1 ~ Std 2 Std 3 Std 4 Std 6 Std

+ 3 + + + +

+ - - 5 -

+ + +

÷ + +

I. ~muchs~mon B6. + + + + + + ~ + + + + + + I f + +

3 + + + + + + + + ÷ + + i + + ÷ + 3 + + + + + + ~ ÷ + + + 5 - +

- - 3 + + ~ + ~ + + + + + +

- - ! 5 + + + + ~ + + +

+ + + 3 + + i + + + + + + + + + 3 + + 3 + + + ÷ + ~ - + + + + +

+ + + 3 3 + ~ 5 + + + I + ~ +

II. Vemuchs~mon Wo.

I

+ 3 + + 3 3 + 3 I 5 - + 3 + + +

_ _ _ _ ] - -

. . . . i - -

I

- - i + + + + + + + ] + + +

3 + + ] + + +

+ + + ] + + +

+ 3 + + + + + + + + + +

+ + + + + +

+ + + ~ + 3 T + + + + + +

+ + + + + +

+ + + 1 + 3 +

+ + + + + +

+ + + + + +

+ + + + + + - - + + W

+ 3 ÷ + ÷ + + + + + +

+ + + T 3 +

3 + ÷ + + +

+ + +

+ T - -

+ T + + + +

+ + +

3 + 3

+ t - t - + + +

+ + +

T + + + + +

+ T + + + +

+ + +

+ 3 + + + +

wurde einmalig 300 mg I N H peroral gegeben. Trotz der gleichen INH- Dosis zeigen die INH-Konzen t ra t ionen im Blutserum betr~chtliche Unterschiede. Bei VP B6. ist freies, tuberkulostatisch wirksames I N H selbst mit dem hochempfindlichen mikrobiologischen Nachweis kaum meBbar. Das Konzentra t ionsmaximum yon 0,4 7 INH/ml wird 1 !~ Std nach der INH-Medikation erreicht. INH-Konzentra t ionen yon 0,1 ~/ml, der ~¢[el3grenze der mikrobiologischen INH-Best immung, und darfiber sind nur im Zeitraum yon 11~__3 Std nach der Medikation vorhanden. Bei VP Wo. sind die INH-Konzentra t ionen im Blutserum um ein Vielfaches hSher. Noch 6 Std nach der INH-Medikat ion ist die INH-Konzent ra t ion

Arch. expcr. Pa th . u. Pharmakol . , Bd. 220. 22

332 R. B6NICKE und W. REIF:

hSher als die yon V P BS. im K o n z e n t r a t i o n s m a x i m u m . ] )as K o n z e n t r a - t i o n s m a x i m u m bei V P Wo. betr/~gt 6,4 7 /ml und ist 16mal so hoch wie bei V P BS. Gleichzei t ig mi t der chemisehen, u n h y d r o l y s i e r t e n I N I I - Bes t immungsme thode durchgeff ihr te Messungen bes t~ t igen diese Diffe- renzen (s. Tab. 5, 2 S td -Wer te ) . Die chemische Methode nach KELLY und POET, die zus/~tzlich die gebundenen , t ube rku los t a t i s ch unwirk- samen I N H - A n t e i l e erfal~t, d a m i t also zu hohe W e r t e l iefert , k a n n diese

Tabelle 5. INH-Konzentration im Blutserum beim Menschen nach einmaliger oraler Applikation yon 300 rag.

B l u t e n t n a h m e i n I N H - K o n z e n t r a t i o n i n y / m l

S t u n d e n n a c h I N H - W o ~ B 6 (~

A p p l i k a t i o n a b c a b c

Vor Appl. - - - - 0 - - Std - - - - 3,2 - -

1 Std - - - - 3,2 - - 11~ Std - - - - 6,4 - -

2 Std 8,6 4,8 3,2 6,1 3 Std - - - - 1,6 - - 4 Std - - - - 0,4 - - 6 Std - - - - 0,8 - -

a Gesamt-INH (KELLY u. POET); b freies INH (chem.); (mikrobiologisch).

m

w

<2,0

0 <0,1 < 0,1

0,2 0,4 0,1

< 0,1 <0,1

c freies INH

Konzent ra t ionsd i f fe renzen n ich t s i ch tbar werden lassen. Bei be iden V P ffihrt die I N H - B e s t i m m u n g nach dieser Methode zu den gleichen Kon- zent ra t ionen . Aus diesen Befunden wird deut l ich, dal~ diese Methode, die le ider in den meis ten K l in iken Verwendung finder, ffir den quan t i t a - t iven Nachweis yon I N H in KSrperf l f iss igkei ten und Geweben unge- e ignet ist.

Zusammenfassung .

A n einer grS•eren Zahl yon k r a n k e n und gesunden Versuehspersonen wurden Messungen fiber die Wiederaussche idung yon I N H durchgef i ihr t . Die I N H - B e s t i m m u n g erfolgte mi t mikrobiologischen und verschiedenen chemisehen Methoden. Die a l lgemein gebr~uchl iche chemisehe Methode naeh KELLY und POET ist n ieh t spezifisch fiir I N H und erfaBt neben freiem, t ube rku los t a t i s eh wi rksamen I N H auch die an der freien NH~- Gruppe subs t i tu ie r ten , t ube rku los t a t i s ch unwi rksamen Umwand lungs - p roduk te , soweit diese durch Kochen im sauren Milieu hyd ro ly s i e rba r sind. Sie gewinnt an Spezif i ta t , wenn au f die H y d r o l y s e ve rz ich te t wird. Die so abgewande l t e Methode nach KELLY und POET ist zwar weniger empfindlich, erfal~t aber nur freies I N H . I m einzelnen wurden folgende Versuchsergebnisse erziel t :

Enzymatische Inaktivierung yon Isonicotins~urehydrazid. 333

1. Das verabreichte I N H wird nur zu einem geringen Prozentsatz in unver~nderter Form, als freies tuberkulostatisch wirksames I • H mR dem Urin ausgeschieden. Bei 86 VP, unter Verwendung des mikrobio- logischen und chemischen, unhydrolysierten INH-Nachweises durch- geffihrte Messungen ergaben im Mittel eine prozentuale Wiederaus- scheidung yon 12,4~o der applizierten Dosis. Der niedrigste gemessene Wert betrug 1,5~o, der hSchste 37%.

Die Ausscheidung yon freiem I N H scheint eine au~erordentlich kon- stante, ffir jeden Einzelnen charakteristische GrSl~e zu sein.

2. Ein betr~chtlicher Teil des applizierten I N H wird in gebundener, tuberkulostatisch unwirksamer Form ausgeschieden. Bei ,,schlechten" INH-Ausscheidern ist diese gebundene Form im 24 Std-Urin bis zu 68% der ordinierten Gesamtdosis nachweisbar, bei , ,guten" Ausscheidern entspreehend geringer.

In welchem Organ diese Umwandlung erfolgt, konnte bisher nicht gekl~rt werden. Als gesichert kann jedoch gelten, da~ sie nicht im Magen-Darmkanal erfolgt.

3. Etwa 20--30% des oral verabreichten I N H wird im menschlichen Organismus zu Isonicotins~ure abgebaut. Nach unseren Untersuchungen besitzt die tierische Leber, insbesondere die des Kaninchens, die F~hig- keit, I N H partiell zu Isonicotins~ure abzubauen. Alle anderen geprfiften 0rgane und Gewebe dieser Tiere (Lunge, Milz, Niere, Muskulatur) sind dazu nicht imstande.

4. Parallel mit den Ausscheidungsversuchen durchgeffihrte Messun- gen fiber den INH-Blutspiegel ffihrten zu korrespondierenden Ergeb- nissen. Bei ,,schlechten" ]NH-Ausscheidern ist freies, tuberkulostatisch wirksames I N H nur in geringer Menge nachweisbar, w~hrend ,,gute" INH-Ausscheider einen entsprechend hohen INH-Blutspiegel aufweisen. Ffir gebundenes, tuberkulostatisch unwirksames I N H liegen die Kon- zentrationsverh~ltnisse im Blur gerade umgekehrt. Die Kenntnis der INH-Ausscheidung ermSglicht also Riickschlfisse fiber die INH-Konzen- tion im Blut.

Be~onderen Dank schulden wir der med. techn. Assistentin Frau ELFRIEDE HONm~ANN ffir ihre sorgf~ltige Mitarbeit bei diesen Untersuchungen.

Literatur. BS~IC~E, R. : [1] Arch. exper Path. u. Pharmakol. 216, 490 (1952). - - BSNICKE,

R.: [2] Tagungsbericht des Wiss. Beirats des Tuberkulose-Forschungsinst. Borstel v. 3.5. 1952. - - BS~ICKE, R.: [3] Med. Ges. Kiel, 10. 7. 1952. - - Klin. Wschr. 30, 959 (1952). - - KELLY, J. M., and R. B. POET: Amer. Rev. Tbc. 65, 484 (1952). - - RUBIN, S° H., L° DREKTER, J° SCHEINER and E. DE RITTER" Diss. of the Chest 2], 439 (1952).

Dr. RUDOLF B~NICKE, Dipl.-Chem. WALTRAUD REIF, Tuberkulose-Forschungsinstitut Borstel fib. Bad Oldesloe.

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