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Die Universität Hohenheim
Die Mikrobiota im Verdauungstrakt landwirtschaftlicher Nutztiere –ein wichtiger Organismus zur Stoffumsetzung im Tier
Jana SeifertUniversität Hohenheim, Institut für NutztierwissenschaftenJunior-Stiftungsprofessur ‘Feed-Gut Microbiota Interaction’
Hans-Eisenmann-Zentrum, Weihenstephan 17.06.2015
Übersicht
- Was verstehen wir unter ‚Mikrobiota‘?
- Methoden zur Untersuchung der Mikrobiota
- Veränderung der Mikrobiota im Lebenszyklus (Schwein, Wiederkäuer)
- Unterschiede entlang des Gastrointestinal Traktes
- Funktionen der Bakterien:
Polysaccharid Abbau durch die Bakterien des Pansens
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3
Definitionen
Die Gesamtheit aller nicht-menschlichen (tierischen) DNA (Mikrobiom) bzw. allen nicht-menschlichen (tierischen) Lebens (Mikrobiota / Mikroflora) am menschlichen (tierischen) Körper.
Was und wo?• Bakterien, Archaeen, Viren/Phagen,
Hefen/Pilze, Protisten, Würmer, Parasiten etc...• am ganzen Körper: wo man auch sucht, findet
man Mikroorganismen...
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Genom vs. Mikrobiom
Komplexität
1014 Bakterien
10 x mehr mikrobielleZellen
1-2 kg mikrobielleBiomasse (Mensch)
Stammbaum der bedeutendsten mikrobiellen Taxa im humanen Gastrointestinal Trakt und ihrer relativen Anteile (De Vos & de Vos 2012)
Phylogenie der Bakterien im Verdauungstrakt
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Mikrobiota des Verdauungstraktes
Lumen Mukosa
MIKROBIOTA
Epithelium
Futter‐reste
Kurzkettige Fettsäuren
Vitamine
Immunomoduline
Metabolite
Vorteile für den Wirt- Aktivierung des
Immunsystems- Nährstoffaufnahme- Detoxifizierung- Vitamine- Unterstützung der
Darmmotilität
- UnterdrückungpathogenerSpezies
MetabolischesInventar der Mikrobiota
Aktive Phyla und exprimierte Proteine
PhylogenetischeStruktur und
mögliche Funktionen
DNA Protein
Metagenomics
Sequenzdatenbank
Metaboliten
Proteinfunktion
Wer ist da? Wer ist aktiv? Was wird gemacht?
RNA
Meta-proteomics Meta-
metabolomics
Meta-transcriptomics
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Nukleinsäure ExtraktionVerschiedene Protokolle:
Lyse der Zellen (mechanisch, chemisch)DNA/RNA Aufreinigung
In Mikrobiota Forschung des Nutztieres gibt es kein einheitliches Protokoll!Vergleichbarkeit der Ergebnisse !?
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16S rRNA –universelles Gen für phylogenetische Analysen
- Ribosome sind in allen Zellen, Proteinsynthese
- 16S rRNA ist eine Untereinheit der bakteriellen Ribosomen
- In mikrobieller Ökologie: Nutzung der variablen Regionen zum Nachweis der phylogenetischen Diversität
Welche variable Region ist für die Untersuchung der Mikrobiota geeignet?
Yarza et al. Nat. Rev. Microbiol 2014
V1
V2
V3
V4
V5
V6V7
V8
V9
Entwicklung der MikrobiotaDie Zusammensetzung der Mikrobiota variiert mit der Zeit (dynamisch)‘Klimax’ Gemeinschaft, welche relativ stabil ist
Beeinflussung der mikrobiellen Sukzession durch:- Geburt (Mikrobiota im Vaginaltrakt, Speichel; Mikrobiota der Umwelt)- Ernährung (Muttermilch, Pro- und Präbiotika etc.)- Umwelt (Hygiene im Stall, Weidehaltung)- Medizinische Behandlung (Antibiotika)
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Entwicklung der Mikrobiota – Wiederkäuer (Kuh)Hauptphyla der Bakterien im Pansen: Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria(13 weitere Phyla)
Große Variation der Anteile im zeitlichenVerlauf!
Jami et al. ISME J. 2013
Tag 1 Dominanz von Streptococcus (Firmicutes)
Wechsel der Zusammensetzunginnerhalb der Phylaz.B. Bacteroidetes: Bacteroides (Tag 1-3) zu Prevotella (ältere Tiere)
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Entwicklung der Mikrobiota – Wiederkäuer (Kuh)Umstellung der Mikrobiota auf anaerobe Verhältnisse
Tag 1
Tag 3
12Jami et al. ISME J. 2013
Entwicklung der Mikrobiota – Wiederkäuer (Kuh)Gezielter quantitativer Nachweis
13Jami et al. ISME J. 2013
Kim et al. Vet. Microbiol. 2015
Entwicklung der Mikrobiota - Schwein
Veränderung während und nach der Absetzphase (Futterumstellung, Stress, and. physiologische Faktoren)
4 Wo.: Bacteroides (Nutzung von Mono- und Oligosacchariden), Blautia, Dorea, Escherichia, Eubacterium
6 Wo: Prevotella (Nutzung von Hemicellulosen, Xylan), Clostridium
Hauptphyla der Bakterien im Schwein: Firmicutes, Bacteroidetes (ca. 90%)
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Lokalisation der Mikrobiota – Schwein
Looft et al. ISME J. 2014
Unterschiede der Zusammensetzung der Mikrobiota-> entlang des Gastrointestinal Traktes-> zwischen Lumen und Mukosaschicht
Aufgrund unterschiedlicher Nährstoffangebote, physikochemischer Bedingungen(pH, O2, Darmbewegung)
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Lokalisation der Mikrobiota – Schwein
Verdauung und Absorption:- Proteine- Fette- Kohlenhydrate
Umsetzung bisher noch nicht verdauterund absorbierter Nährstoffe:- Fermentierbare Kohlenhydrate- Proteine
Analyse von Kotproben spiegeln nur sehr begrenzt die intestinalen Vorgänge ab!
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Funktionen der Mikrobiota – Einblicke in den GIT
Praecaecale VerdaulichkeitKanülen am terminalen Ileum zur Bestimmungder praecaecalen Aminosäureverdaulichkeit von Futtermitteln
Analyse von Kotproben spiegeln nur sehr begrenzt die intestinalen Vorgänge ab!
Praecaecale Verdaulichkeit im Pansen und DuodenumEffizienz der ruminalen Fermentation der Rohnährstoffe
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Funktionen der Mikrobiota – Pansen
BedingungenPANSEN
• kontinuierliche Futteraufnahme• 38-40°C• dunkel• anaerob (-250-450 mV)• konstante Pufferung (pH 5,5-7,0)• Abtransport von Metaboliten (Absorption,
Eruktation, Passage)• Zerlegung, Zerkleinerung und Mischung
des Futters
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Flint et al. 2008McCann et al 2014
Funktionen der Mikrobiota – PansenMikrobiota
Bacteroidetes (Prevotella)Firmicutes, Archaeen
Funktionelle Nischen
FibriolytischProteolytischLipolytischAmylolytisch
Enzyme‚Carbohydrateactive enzymes(CAZy)‘
FutterAbbau
CH4 und CO2
SCFAEssigsäure, Propionsäure, Buttersäure
NH3Harnstoff
mikrobielles Protein FettsäurenPassagerate
Leber
Harnstoff NH3
Emissionen
Muskulatur / FettgewebeMilchproduktion Aminosäuren
FettsäurenZucker
Dünn-darm
Unverdautes Material
Amino- und Fettsäuren
PANSEN
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http://www.rmgnetwork.org.nz/hungate1000.html
http://www.ruminomics.eu/
Funktionen der Mikrobiota – Pansen
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Leahy et al. Animal 2013
Funktionen der Mikrobiota – Pansen
Genomsequenzierungen von Bakterien im Pansen
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Flint et al. Nat. Rev. Microbiol. 2008
Polysaccharid-abbauende BakterienX: Xylan; S: Stärke; C: Zellulose
Funktionen der Mikrobiota – Pansen
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Funktionen der Mikrobiota – PansenAbbau pflanzlicher Zellen:
1. Abbau der Hemizellulose und Pektine
2. Abbau von Zellulose
Zellulolytische Bakterien besitzen extrazelluläre Enzyme (Cellulosome) zum Abbau von Polysacchariden.
‘Carbohydrate active enzymes‘ (CAZY): z.B Glykosyl-Hydrolasen (GH; 96 Enzymfamilien).
In zellulolytischen Bakterien vorwiegend GH44, GH45 und GH48 (Endoglucanasen mit verschiedenen Substratspezifitäten):
•(Lachno)clostridium cellobioparum•Eubacterium cellulosolvens•Fibrobacter succinogenes•Ruminococcus albus•Ruminococcus flavefaciens
Funktionen der Mikrobiota – Pansen
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Ruminococcus flavefaciensStruktur des Cellulosome’s
- strukturelle Proteine ScaA, ScaB, ScaC und ScaE bilden ein Gerüst; Zusammenhalt durch verschiedene Interaktionsmoleküle (‘dockerin–cohesion’); Bindungsstellen für katalytische Enzyme
- Oligosaccharide werden durch Membran-assozierteTransportproteine aufgenommen
Funktionen der Mikrobiota – Pansen
Flint et al. Nat. Rev. Microbiol. 2008
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Fibrolytische Bakterien
Butyrivibrio proteoclasticus, Prevotella ruminicola, Prevotella bryantiisind xylanolytische Bakterien - > Abbau der Hemizellulose Fraktion
Genomsequenzen zeigen Präferenzen für Abbau von Hemizellulose und
Pektin, und wenig für kristalliner Zellulose
Funktionen der Mikrobiota – Pansen
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Prevotella spp. – Genom-Vergleiche
Purushe et al. Microb. Ecol. 2010
Funktionen der Mikrobiota – Pansen
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P. ruminicola hat die genetische Kapazität Glykane des Wirtes zu nutzen, ähnlich wie Bacteroides thetaiotaomicron
Funktionen der Mikrobiota – PansenPrevotella spp. – Genom-Vergleiche
P. bryantii hat mehrpotentielle Fähigkeitenzum Pektin Abbau alsP. ruminicola:erhöhte Zahl an PektatLyasen, Poly-galacturonasen, PektinMethylesterasen und α-Rhamnosidasen
Purushe et al. Microb. Ecol. 2010
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Anza
hlan
Enz
ymen
Bacteroides thetaiotaomicron : nutzt ein breites Spektrum von Polysacchariden und hat einzigartige Gene für den Abbau von Stärke
Stärke Abbau Systeme:
SusC und SusD: Bindung der StärkeMoleküleSusG: begrenzte Hydrolyse von Stärke
Verstärkte Hydrolyse im Periplasma(SusA, Neopullulanase) und Aufnahmeüber die zytoplasmatische Membran
Funktionen der Mikrobiota – Pansen
Flint et al. Nat. Rev. Microbiol. 2008
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Polysaccharid-abbauende Pilze
Piromyces sp. E2: Xylose Isomerase, GH
Orpiomyces sp. CA1: - Verschiedene Enzyme: 357 GH, 24 PL, 92 CE - Mehrheit ist bakteriellen Ursprungs und wurde durch horizontalen
Gentransfer erworben: viele GH48 (Abbau kristalliner Zellulose) und GH6 (Cellobiohydrolasen)
-> dieses System fehlt bzw. ist kaum in Fibrobacter and Ruminococcusvorhanden
Kein System für den Abbau von Stärke und Pektin -> Pilze ausschließlich für Zellulose Abbau durch Multienzym Komplexe
Funktionen der Mikrobiota – Pansen
30Interaktion und Symbiose zwischen Bakterien und Pilzen!
Verteilungen der Genfunktionen variiertzwischen den verschiedenen Studien!
Funktionen der Mikrobiota – Pansen
Deusch et al. Comp. Stru. Biotechnol. J. 201531
Interaktionen
Funktionen der Mikrobiota – Pansen
Flint et al. Nat. Rev. Microbiol. 2008
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MetabolischesInventar der Mikrobiota
Aktive Phyla und exprimierte Proteine
PhylogenetischeStruktur und
mögliche Funktionen
DNA Protein
Metagenomics
Sequenzdatenbank
Metaboliten
Proteinfunktion
Wer ist da? Wer ist aktiv? Was wird gemacht?
RNA
Meta-proteomics Meta-
metabolomics
Meta-transcriptomics
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Metaproteomics - Arbeitsschema
Proben-vorbereitung
ProteinExtraktion
In gel TrypsinVerdau
Peptid Elutionund Reinigung
LC-MS/MS AnalyseBioinformatische Datenanalyse
Pansenproben
Deusch & Seifert Proteomics (im Druck)
Funktionen der Mikrobiota – Pansen
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Probenvorbereitung
Funktionen der Mikrobiota – Pansen
Deusch & Seifert Proteomics (im Druck) 35
Protein und Peptid Identifikationen
Funktionen der Mikrobiota – Pansen
Deusch & Seifert Proteomics (im Druck) 36
Pansenmaterial(Faser)HistodenzProtokoll
Pansenmaterial(Faser)KäsetuchProtokoll
Pansensaft
Phylogenetische Verteilung der ProteineFunktionen der Mikrobiota – Pansen
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Prevotellaceae sindhäufiger im Pansensaft zufinden
Fibrobacter succinogenes, Ruminococcaceae und Lachnospiraceae häufigerin fester Pansenprobe
VerstärkteHäufung von Methano-microbiaceae imPansensaft
Deusch & Seifert Proteomics (im Druck)
Verteilung der Glykosyl-Hydrolasen
Rot: Enzyme in allen Probenidentifiziert
Gelb: Enzyme in RS-H and RS-Cidentifiziert
Blau: Enzyme in RS-C and RF identifiziert
Grün: Enzyme identifiziert in RF
Proteine der GH-Familien vorwiegend von Prevotellaceae und Ruminococcaceae
Funktionen der Mikrobiota – Pansen
Deusch & Seifert Proteomics (im Druck) 38
Mikrobiota Forschung in der Zukunft
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Verständniss zur Interaktion -> innerhalb der Mikrobiota-> zwischen Mikrobiota und Wirt-> zwischen Mikrobiota undFutter
zur Unterstützung des Tierwohls, Ressourcenschonung (Futtermitteleinsatz), Klimaschutz
Identifizierung neuer Enzymfunktionen für biotechnologische Anwendungen
Vielen Dank für ihre Aufmerksamkeit!