Esther Osterwalder Farben, - Histologie

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2010 1

Farbstoffe

und

Färbungen

Farben,

BiologischesMaterial

Esther Osterwalder

Esther Osterwalder / 2010 2

Mögliche Darstellung von Strukturen, Krankheiten

Braune Käppchen bei den Zellkernen (Virusproteine)

OrceinHepatitis-B-Antigen

Blaue, kurze, kommaförmige Stäbchen

Giemsa CHelicobacter pylori

Rostrot bis grünbraunRhodaninKupfer

LM: lachsfarbigPolar.: apfelgrün

KongorotAmyloidose

Fuchsinfarbige StäbchenZiehl NeelsenSäurefeste Stäbchen bei Verdacht auf Tuberkulose

Diastase verdaut allfällige Glykogenschollen: die Differenz der beiden Nachweise (pink) zeigt auf, ob Glykogen vorhanden war oder nicht

Immer 2 Färbungen:PAS + D-PAS

Chemisches Färbeprinzip

Glykogen

Kalk schwarzvon Kossa = eine Silberimprägnation

Kalk, Mikroverkalkungen z:B. in der Mamma

Proteindepots rotSFOG = eine Trichromfärbung

Proteinablagerungen in der Niere bei Kimmelstiel-Wilson

dargestelltNachweisBezeichnung

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Gewebespezifische Färbungen an Kleinbiopsien

HE, EVG,Ab-PASDarmbiopsien

HE, EVG,Ab-PAS, Gic (Giemsa C)Magenbiopsien

HE, EVGGefässe (Blut-)

HE, EVGHerzbiopsien

HE, EVG, Ab-PAS, EisenLungenbiopsien

HE, Giemsa, GomöriLymphknoten

HE, EVG, PAS, D-PAS, CAB, Eisen,

Gomöri, Orcein

Leberbiopsie

HE, PAS, Silbermethenamin SFOG,Nierenbiopsie

Färbungen, NachweiseOrgan/Gewebe


Voraussetzungen für Färbungen in allen Fachgebieten

Licht, Auge, Farbe

Vorhandensein von biologischem Material

Brauchbare Farbstoffe und richtige Farbstoffwahl

Korrekte Ausführung des Färbevorganges

Qualitätskontrolle am Mikroskop

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Farben


Farben

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Farben


Farben

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BiologischesMaterial Herpes-simplex-Virus infizierte Verozellen

mit Phasenkontrast, links ungefärbt 200x, rechts ungefärbt, 100x

links: TUNEL-Reaktion (Rotfärbung), ca 300x, rechts: gleiches Präparat ohne Phasenkontrast


Blutaustrich normal, nach Pappenheim gefärbtBiologischesMaterial

Blutaustrich normal, ungefärbt

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FarbenBiologischesMaterial

+

Mikroskop:Spongiosa, KM / Goldner /Kallus am Knochenbälckchen /Osteoporose


BiologischeBausteine

ProteineKohlenhydrateLipideMineralien

Zusammenfassung:

sind die Partner der Farbstoffe und Reaktionslösungen.

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Woher stammen die Farbstoffe?

Was sind Farbstoffe?

Welche Farbstoffe werden für diemikroskopischen Färbungen

gebraucht?

Farbstoffe


Färbende Mittel

Farbstoffe Pigmente

werden mit einem Bindemittel aufgestrichen

anorganischeRussorganische

gehen mit dem biologischen Material

eine feste Bindung ein

TierePflanzenTeerderivate

Woher stammen die Farbstoffe?Farbstoffe

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Anorganische Pigmente stammen aus dem

Mineralreich:

Umbra-Braun

Farbstoffe


Rötel

Ocker

Farbstoffe

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Eisen- und ManganhaltigeTonarten

Zinnober

Farbstoffe


Lapislazuli

Farbstoffe

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TuscheFarb-Russe

Russ besteht zu 80 - 99.5% aus Kohlenstoff und ist ein schwarzer, pulverförmigerFeststoff.

Darstellung von Gang-systemen

Farbstoffe


Organische Pigmente

Melanin

Hämosiderin

Farbstoffe

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Tierreich

Sekrete und Extrakte

Farbstoffe


Purpur

6,6 -Dibromindigo

Farbstoffe

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Karmin

Cochenille

Farbstoffe


Pflanzenreich

Textilfärberei

aller Kulturen

Farbstoffe

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Indigo

Farbstoffe


Farbstoffe

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Hämatoxylin

Blauholzbaum

Hämalaun nach P. Mayer

**PflanzenFarbstoffe


· Bleihämatoxylin nach McConaill· Chrom-Hämatein nach Hansen· Eisenhämatoxylin nach Faure· Eisenhämatoxylin nach Hansen· Eisenhämatoxylin nach Häggqvist· Eisenhämatoxylin nach Heidenhain· Eisenhämatoxylin nach Weigert· Hämalaun-Erythrosin-Safran nach Masson

Hämatoxylin nach Gill· Hämatoxylin nach Delafield· Hämatoxylin nach Harris· Hämatoxylin-Chrysoidin-Färbung· Hämatoxylin-Eosin (HE-Färbung)· Hämatoxylin-Safranin-Färbung· Molybdänhämatoxylin nach Held· Saures Hämalaun nach Mayer

· Saures Hämatoxylin nach Ehrlich

**Pflanzen

Farbstoffe

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Teerderivate

Synthetische Farbstoffe

Erster synthetischer Farbstoff:

die Pikrinsäure

1777

Farbstoffe


Muskulatur durch Pikrinsäure gelbVG - Färbung

***TeerderivateFarbstoffe

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Was sind Farbstoffe?

oder

Wann ist ein Stoff ein Farbstoff?

Farbstoffe


Merkmale der Farbstoffe

a) Sie besitzen ganz bestimmte Absorptionsmaxima

b) Farb Kationen+ oder Farb Anionen-

können an Gegen Ionen gebunden sein

c) Farbstoffe können echt färben

Wann ist ein Stoff ein Farbstoff?Farbstoffe

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Farbstofflösungen absorbieren bestimmteWellenlängen des sichtbaren Lichtes.

a)Sie besitzen ganz bestimmte Absorptions-maxima:

Farbstoffe


Der Farbstoff erscheint in der Farbe desdurchgelassenen Restlichtes (Mischfarbe)

Mischfarbe

Farbstoffe

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Jeder Farbstoff besitzt seine typischeAbsorptionskurve.

Farbstoffe


Jeder Farbstoff hat weltweit seine

C.I.-Nummer

(Color Index)

Farbstoffe

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Nicht jeder farbige Stoff ist ein Farbstoff.

Ein Farbstoff enthält:

Chromophore Gruppen

und

Auxochrome Gruppen

Farbstoffe


Chromophore

Azo Gruppe - N = N

Nitro Gruppe - NO2

Karbonyl Gruppe - C = O

Farbstoffe

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Die Gruppen wirken nur farbig in Verbindung miteinem oder mehreren Benzolringen.

Chromophor

Chromophor

Farbstoffe


Auxochrome

Hydroxyl Gruppe - OH

Amino Gruppe - NH2

Sulfonsäure Gruppe - SO3H

Karboxyl Gruppe - COOH

Farbstoffe

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Chromophor

Chromophor

(Aminoazobenzol)

Farbstoffe


Die auxochromen Gruppen wirken nicht nur Farbvertiefend, sie stellen vielmehr die Ver-bindung zwischen Farbstoff und färbendemMaterial her.

Der Farbstoff wird salzartig an dasbiologische Material gebunden.

ProteineKohlenhydrateLipideMineralien

Na+ Cl-

Farbstoffe

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b) Farb Kationen+ oder Farb Anionen-können an Gegen ionen gebunden sein

Giemsa

Farbstoffe

neutraler Farbstoff


c) Farbstoffe können echt färben

Rep.: Coulomb / van der Waal

Farbstoffe

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Einteilung der Farbstoffe:

positive Ladung negative Ladung

Kationische Farbstoffe Anionische Farbstoffe

AlcianblauAzur A + B (Giemsa)BismarckbraunFuchsin bas.GentianaviolettKarbolfuchsinKristallviolettMethylenblauParafuchsinKernechtrot (Lack)Hämalaune (Lacke)Harris Hämatoxylin (Lack)

Lichtgrün SFSäurefuchsinHämatoxylin resp. HämateinPikrinsäureEosin YOrange GKernechtrot

Farbstoffe


Buchstaben interpretieren

X = indifferent (in Lösung pH un-abhänig)

M = Mischung

Y = yellowish = gelblichL = lichtecht

W = wasserlöslichH = hitzebeständig

T = tiefer FarbtonG = grünstichig

S = besser löslich (solubel)F = klare Töne

R = rotstichigD = zum Drucken

P = PigmentC = chlorecht

O = orangeB = blaustichig

N = neuA = Acetatseide

Anzahl vor dem Buchstaben deutet auf die Farbintensität hin.

Luxol Fast Blue MBSN: Mischung, blaustichig, besser löslich, neuAlcianblau 8GX: 8x grünstichig, indifferentChromotrop 2R: 2x rotstichigToluidinblau O: orangeSiriusrot F3B: klare Töne, 3x blaustichigOrange G: grünstichig

Farbstoffe

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HE - PAS - VG EVG Alcianblau-PASGic - CAB Berlinerblau -

Gomöri von Kossa -Fettnachweis - Kongo

Färbungenin der

Histologie


Färbungen zuordnen nach:

Übersichtsfärbungen (HE, Giemsa)NachweisenReaktionsprinzipien (3)Trichromfärbungen (VG, CAB, Goldner, SFOG)Spezialfärbungen (ZN, Versilberung)Routinefärbungen

HE - PAS - VG EVG Alcianblau-PAS - Gic - CAB Berlinerblau -Gomöri von Kossa Fettnachweis - Kongo

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Färbungen zuordnen: Übersichtsfärbung

Die Übersichtsfärbung verschafft einen Überblick über das Gewebe, die Strukturen, die Zellverteilung, Anfärbbarkeitund Kern-Plasma-Relationen.Sie besteht aus Kernfärbung und Zytoplasmafärbung.

zB: Hämatoxylin-EosinGiemsa


Zellen/Zellkernanfärben:

Für alle Färbungen gültig:

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+

---

-



Schematischer Aufbau eines Zellkernes:

Nukleoproteid

Protein:

Histon+

Nukleotidkette:diese besteht aus

Nukleinsäuremolekülen,von denen jedes aus

- Phosphorsäure-

- Pentose- N-haltige Base

besteht

Hämalaunv. HE

Übersichtsfärbung


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Die Kernfarbstoffe sind meist Farblacke

das Eisen III Hämatoxylin nach Weigert

Hämalaun : Hämatein + Alaun

Hämalaun nach P. Mayer besteht aus Kalium-Aluminiumsulfat plus Hämatein. Alaune sind so genannte Doppelsalze.

Kernechtrot : Kernechtrot + AluminiumsulfatÜbersichtsfärbung

GewebeMetallsalz

FeIII-chlorid

Farbstoff

Hämatein

Farblack+

Farblack+



Zellen/Zyto-

plasmaanfärben:

z.B.Eosin Y v. HE

Übersichtsfärbung


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Wasser 80,5 85 % Proteine 10 15 %

Lipide 2 4 % Polysaccharide 0,1 1,5 %

DNA 0,4 % RNA 0,7 %

kleine organische Moleküle 0,4 % anorganische Moleküle und Ionen 1,5 %

Zusammensetzung des Zytoplasmas



Zu den basischen Aminosäuren gehören:Lysin

ArgininHistidin

Zu den sauren Aminosäuren gehören:Asparaginsäure (Aspartat) Glutaminsäure (Glutamat)

Weitere Aminosäuren mit ionisierbaren Resten:CysteinTyrosin


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12,48 basischArg

9,3 9,510,53basischLys

9,7 10,110,07 semisauerTyr

8,8 9,18,33semisauerCys

6,7 7,16,0basischHis

4,2 4,54,25sauerGlu

3,7 4,03,68sauerAsp

im ProteinfreiBezeichnungAminosäure



Eosin Y

Orange G

Pikrinsäure

Anilinblau

Säurefuchsin

Chromtrop 2R

Lichtgrün

Wichtige Zytoplasma-Farbstoffeneg

Wichtige Zellkern-farbstoffepos

Hämalaun

Kernechtrot

Weigert s Eisenhämatoxylin

Methylenblau

Färbungen

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Jeder der basischen Teerfarbstoffe ist in der Lage mit Eosin ein Salz zu bilden (Methylenblau-Eosinat, Azur-Eosinat).

Mischungen dieser Farbstoffe und ihrer Eosinate färben das Zytoplasma und die Zellkerne je nach pH Wert der Lösung.

Giemsa

Der neutrale Farbstoff färbt das Chromatinvon Leukozyten rötlich-violett/marron (Eosin, Methylenblau).

Das kationische Azur bindet an DNA unddie Eosin-Anionen an das bereits gebundene Azur.

pH-Wert ist massgeblich(um pH 4)

: ein zu blaues Ergebnis wird durch Differenzieren in0.01% Eisessiglösung in Richtung Rosa verändert

Übersichtsfärbung


Nachweise

EVG/VG-El, OrceinElastisches Bindegewebe

Gomöri, NovotnyRetikuläres Bindegewebe

Van Gieson, CAB, Sirius, SFOGKollagenes Bindegewebe

KongorotAmyloid

Berlinerblau-ReaktionEisen

Alcianblau - PASNeutrale + saureGlycosaminglycane = GAG

PASNeutrale Glycosaminglycane = GAG, Kohlenhydrate, Glykogen

Giemsa C / GicHelicobacter pylori

Sudan III, Sudan schwarz, ÖlrotFettnachweis

Ziehl NeelsenSäurefeste Bakterien (Tb)

von Kossa, Alizarinrot SKalk

FärbungSubstanz

Färbungen zuordnen:

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GoldnerKnochengewebe

GallyasAlzheimer Plaque Neurohistologie

Bodian, BielschowskyNeurofibrillen Neurohistologie

Klüver Barrera, Luxol Fast BlueMarkscheiden Neurohistologie

GiemsaParasiten

Rubeansäure-Färbung, RhodaninKupfer

Orcein, ViktoriablauHepatitis B-Antigen

ToluidinblauMastzellen

Warthin StarrySpirochäten

Gram, Brown BrennBakterien

GrocottPilze (Soor, Candida sp.)

Diastase-PAS: immer im Vergleich mit PAS!

Glycogen

SFOGProteinablagerungen

FärbungSubstanz

Weitere wichtige Nachweise


Färbungen zuordnen: Reaktionsprinzipien (3)

1.Chemisches Färbeprinzip: Die Reaktion zwischen Farbstoff und Substratverläuft nach den Gesetzmässigkeiten der chemischen Bindung. Die Färbe-ergebnisse lassen sich durch eine chemische Reaktionsgleichungcharakterisieren = Histochemie.z.B. PAS, Berlinerblau, (Enzymnachweise = Enzymhistochemie)

z.B Nachweis von dreiwertigem Eisen mit der Berlinerblau-Reaktion:

3 K4 [Fe(CN)6] + 4 FeCl3 4 Fe [Fe(CN6)] 3 + 12 KClBerlinerblau

Gelbes Blutlaugensalz = Ferro-zyankalium = Kaliumhexazyanoferrat II (Fe II)

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PAS Reaktion periodic acid Schiff s reaction

1. Hydrolyse mit Perjodsäure HJO4 :das Zuckermolekül öffnet sich unter Bildung zweier dichtgelagerter Aldehydgruppen und H2O

2. Anlagerung des Schiff schen Reagens (Fuchsinsulfit) an diese Aldehyd-Gruppen

+ F (SO2H)2

FFuchsinsulfit

kationischer Farbstoff

Aldehydfuchsin

Reaktionsprinzipien


PAS positive Substanzen/StrukturenChitinStärkeZellulose (Pollen)DextraneGlycogen (PAS + D-PAS zusammen)GlycoproteineSialomuzine (Sialo- = Speichel )BasalmembranSchleimbildende Drüsen, bzw. deren SekreteLeukozyten, Plasmazellen

Reaktionsprinzipien

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Chemische Färbeprinzipien nennt man in der Histologie meist Histochemie .

Histochemische Nachweise lassen sich nicht mehr entfärben, da das Produkt auf einer chemischer Reaktion beruht.

Verunreinigungen können bei histochemischenNachweisen zu Fehlreaktionen führen, besondersbei den Enzymnachweisen.

Merke

Reaktionsprinzipien


2. Physikalisches Färbeprinzip

Löslichkeit eines Farbstoffes in verschiedenen Medien (z.B. Ethanol / Fett)

z.B. Fettnachweis mit Sudan III, Ölrot

Reaktionsprinzipien

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3. Physikalisch-chemisches oder physiko-chemisches Färbeprinzip

Elektroabsorption: Coulomb

Dispersität: Farbstoffgrösse + Zeit spielen eine grosse Rollez.B. bei den Trichromfärbungen

Grenzflächenadsorption: Adsorption ist ein physikalischer Prozess Aktivkohle hält Farbstoff aufgrundder aufgerauten Oberfläche fest. Meist van der Waal involviert.

z.B. HE, VG, EVG, AP, Gic, CAB, Kongo

Reaktionsprinzipien


Als Adsorption (lat.: adsorptio bzw. adsorbere = (an-)saugen) bezeichnet man die Anreicherung von Stoffen aus Gasen oder Flüssigkeiten an der Oberfläche eines Festkörpers, allgemeiner an der Grenzfläche zwischen zwei Phasen.Adsorption unterscheidet sich von der Absorption, bei der die Stoffe in das Innere eines Festkörpers oder einer Flüssigkeit eindringen. Der Oberbegriff für diese Anreicherungsvorgänge lautet Sorption.Adsorbieren zwei oder mehr Spezies an eine Oberfläche, nennt man dies Koadsorption. Dies spielt vor allem bei Katalysatoreneine wichtige Rolle, bei denen die verschiedenen Atomsorten auf einer Oberfläche adsorbiert werden und dort reagieren.

Abb. a) Adsorbens, b) Adsorbat an der Grenzfläche, c) Gasphase bzw. Lösung mit Adsorptiv

Im allgemeinen Sinn ist Adsorption ein physikalischer Prozess.

Für Interessierte

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Färbungen zuordnen: Trichromfärbungen


VG CAB - Goldner - SFOG

Trichromfärbungen

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Alle Variationen haben gemeinsam:

1 Farblack für die Kernfärbung

mindestens 2 anionische Farbstoffe (oft simultan angeboten)

davon

Trichromfärbungen


1x feindispers

zB. Ponceau de Xylidine, Pikrinsäure, Orange G, Chromotrop

davon:

1x grobdispers

zB. Säurefuchsin, Methylblau, Lichtgrün, Anilinblau

Trichromfärbungen

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Proteindepots rotSFOGNierenerkrankung

gelbVG / EVGMuskulatur; glatte, Herzund Skelett

Blau-,Rot- und Violetttöne

GiemsaKnochenmark

orange + grünGoldnerKnochen

grünGoldnerFaserknorpel

dunkelviolettEl / EVGKnorpel elastisch

dunkelviolettEl / EVGBindegewebe elastisch

blaurot

CABVG / EVG

Bindegewebe kollagen


Welche Strukturen werden angefärbt ausser den Zellkernen?

VG CAB - Goldner - SFOGTrichromfärbungen

keine Trichrom-färbung!


Aussagen zu den Fasern im Bindegewebe:

Kollagene Fasern: Anfärbung mit grobdispersen anionischen Farbstoffen wegen der basischen Aminosäuren des Kollagens.

Retikuläre Fasern: Schwach anfärbbar mit anionischen Farbstoffen.

Elastische FasernDas Protein Elastin weist zum Kollagen eindeutig weniger basische Aminosäuren auf, dagegen die seltene saure AS Desmosin. Der saure Charakter der elastischen Fasern erlaubt die Anfärbung mit kationischen Farbstoffen zB. Orcein, Resorcin-Fuchsin

Trichromfärbungen

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Spezialfärbungen werden zur Darstellung bestimmter Strukturen durchgeführt. Sie bestehen aus einer geeigneten Farbstoff- oder Reaktionslösung und einer Gegenfärbung.(Kernfärbung oder Hintergrundfärbung erhöhen den Farb-kontrast)

SpezialfärbungenFärbungen zuordnen:

zB: Ziehl NeelsenSilberimprägnationen


Schematische Darstellung der Zellwand von Mykobakterienohne Berücksichtigung Speziesspezifischer Unterschiede.

Beachte: M tuberculosis hat keine Kapsel

Zellwandaufbau der Mykobakterien

Ziehl NeelsenZN

Spezialfärbungen

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Mykolsäuren sind Bestandteile der säurefesten Zellwand. Durch ihre Einlagerung werden die Zellen stark hydrophob. Sie besitzen lange Alkylketten und sind über Arabinogalaktanan das Murein gebunden, das ein Peptidoglykan ist.

Ziehl NeelsenZN

Spezialfärbungen

basisches Fuchsin


Versilberung/Silberimprägnation

meist zur Darstellung von Aldehyden

Argentaffine oder argyrophile Stoffe lassen sich mit Silber imprägnieren .

- Argentaffine Strukturen können ohneVorbehandlung metallisches Silber ausSilbernitatlösungen reduzieren. Diese lagern sich dann dort ab. (Kalk)

- Argyrophile Strukturen benötigen eineoxidierende Vorbehandlung, um dieselbeWirkung zu erzielen. (retikuläre Fasern)

z.B. von Kossa Gomöri

Spezialfärbungen

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Versilberung/Silberimprägnation

Silbersalze werden durch starke Laugen in Silberoxyd umgewandelt, das dann als schwarzer Niederschlag ausfällt.

2 AgNO3 + 2 NaOH Ag2O + 2 NaNO3 + H2OSilbernitrat Silberoxid

Durch Zugabe von Ammoniak entsteht Diaminsilberoxid, das sich durch Formalin reduzieren lässt.

AgO + 4 NH3 (Ag[NH3]2)2ODiaminsilberoxid

Dabei entsteht metallisches Silber als Niederschlag,Ammoniak und Ameisensäure.

(Ag[NH3]2)2O + HCHO Ag + 4 NH3 + HCOOH

Formaldehyd Ammoniakmetallisches Silber

Ameisensäure

Spezialfärbungen


1. Kaliumpermanganat (Oxidationsmittel) oxidiertEthanolgruppen der Glykoproteine zu Aldehyden

2. Eisenalaun imprägniert die Strukturen

3. Silberionen lagern sich an Aldehydgruppen

4. Formalin wirkt als Entwickler

(5. Mit Goldchlorid wird das Silber schwarz getönt)

6. Mit Na-thiosulfat wird fixiert (entfernen des noch ionisierten Ag)

Prinzip von GomöriSpezialfärbungen Versilberung/Silberimprägnation

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Färbungen zuordnen:

meist maschinell gefärbt

HE Übersichtsfärbung für Kerne + Zytoplasma

VG Übersichtsfärbung für kollagenes Bindegewebe + Muskulatur; oft durch EVG ersetzt

PAS neutrale Zucker sind PAS-positiv (ungenaue Aussage)inkl. *D-PAS beim indirekten Glykogennachweis

Alcianblau (Ab) saure Muzine der Becherzellen

Ab-PAS saure + neutrale Muzine der Becherzellenunterscheiden

Routinefärbungen


1. Schnitt: normaler PAS-Nachweis + werden positiv pink2. Schnitt: zuerst mit Diastase das Glykogen verdauen, dann PAS ausführen

Glykogen ist verdaut; nur noch wird positiv pink

Diastase-behandlung

PAS nach Diastase-behandlung = D-PAS

= hier war Glycogenvorhanden

*D-PAS indirekter Glykogennachweis beim z.B. primären Leberzellkarzinom

Routinefärbungen

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D-PASPAS

Parotistumor

Routinefärbungen


Routinefärbungen Alcianblau ist ein kationischer Kupferphthalocyanin-farbstoff und verbindet sich mit negativ geladenen Zellbestandteilen wie z.B. saure GAG.

Meist in Kombination mit PAS als Ab-PAS.

Ab-PAS

Ab-PAS

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Mögliche Darstellung von Geweben

blauLFBMyelin

dunkelviolettblauNisslNissl-Schollen

schwarzSilberimprägnationNervenzellen

gelbVG / EVGMuskulatur

Blau-,Rot- und VioletttöneGiemsaKnochenmark

orange + grünGoldnerKnochen

grünGoldnerFaserknorpel

dunkelviolettEVGKnorpel elastisch

violettblauHEKnorpel hyalin

orangerotSudan III /OelrotFettgewebe

schwarzGomöriBindegewebe retikulär

dunkelviolettEl / EVGBindegewebe elastisch

blaurotrot

CABVG / EVGSirius

Bindegewebe kollagen

pinkschwarz

PASSilberimprägnation

Basalmembran

pink/violettblauPAS / AB-PASBecherzellen/Drüsensekret

blaurot

HEHE

ZellkerneZytoplasma


Histologie

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