Expression of CD44 and its isoforms v4, v5, v6, v7, andv10 ± new prognostic parameters in ductal pancreaticcarcinoma?

Summary. Prognostically relevant factors based on thehistological assessment of the resected pancreas areknown. However, additional parameters, such as biolog-ical staging of the intrinsic malignant potentiality of thetumor, would be useful. There has been no uniform find-ing of a relationship between CD44 variant expressionand tumor progression. Method: We assessed the ex-pression pattern and prognostic impact of CD44 stan-dard and CD44 isoforms v4, v5, v6, v7 and v10 in 40 duc-tal pancreatic carcinomas by immunochemistry on par-affin-embedded tumor material in patients after tumorresection. At the time of the investigation neither histo-morphological parameters nor the survival time wereknown. Results: There was no correlation between thehistomorphological parameter and the expression ofCD44 splice variants. CD44 splice variants v4±v10 werealmost only expressed in tumor tissue. In ductal pancre-atic carcinoma, patients with an overexpression ofCD44 splice variants had a worse prognosis. However,because of the small number of cases this was statistical-ly not significant. Conclusion: CD44 splice variants mayhave an influence on prognosis in ductal pancreatic car-cinoma. However, further investigation on a larger num-ber of patients is necessary to confirm these results.

Key words: Periampullary and ductal pancreatic carci-noma ± CD44 splice variants ± Prognosis.

Zusammenfassung. Einleitung: Prognostisch relevanteFaktoren sind beim Pankreascarcinom, basierend aufklinischen, laborchemischen und histopathomorpholo-gischen Parametern bekannt. Aufgrund der groûen Va-riabilität des biologischen Tumorverhaltens sind für dieBeurteilung der individuellen Prognose weitere Para-meter notwendig. Ein Zusammenhang zwischen der Ex-pression von CD44v6 und Tumorprogression bzw. Me-tastasierung konnte bei bestimmten Tumorentitäten

nachgewiesen werden. Zum Pankreascarcinom liegennur einzelne Untersuchungen vor. Methode: Immunhi-stochemisch wurden an archiviertem paraffineingebet-teten Tumormaterial von 40 Patienten, bei welchen we-gen eines duktalen Pankreascarcinoms eine partielleDuodenopankreatektomie durchgeführt worden war,CD44 sowie die Varianten 4, 5, 6, 7 und 10 untersucht.Zum Zeitpunkt der Analyse waren dem Untersucherweder die histomorphologischen Parameter noch dieÜberlebenszeit der Patienten bekannt. Ergebnisse: Kei-ne Korrelation konnte zwischen der Expression vonCD44 und seinen Varianten im Tumorgewebe undnichttumorösen Pankreasgewebe des gleichen Patien-ten festgestellt werden. Es fand sich keine Korrelationzwischen den histomorphologischen Parametern undCD44. Die Expression von CD44v6 hatte einen tenden-ziellen, jedoch nicht signifikanten Einfluû auf die Pro-gnose. Schluûfolgerung: Weitere Untersuchungen an ei-nem gröûeren Krankengut sind notwendig, um zu prü-fen, ob CD44 ein unabhängiger prognostischer Faktoroder lediglich ein Epiphänomen anderer, die Prognosebeeinflussender Parameter darstellt.

Schlüsselwörter: Duktales Pankreascarcinom ± CD44 ±Prognose.

Im Gegensatz zu einer deutlichen Senkung der Letalitätder Pankreaskopfresektion auf unter 5 % ist die Progno-se der Patienten mit einem duktalen Pankreascarcinom,mit einer medianen Überlebenszeit von 16 Monatennach wie vor ungünstig [2]. Prognose assoziierende Fak-toren beeinflussen daher die Therapieentscheidung.Prognostisch relevante Faktoren, basierend auf klini-schen und laborchemischen Parametern sowie aufgrundder histopathologischen Aufarbeitung der Operations-präparate, sind bekannt [2]. Aufgrund der groûen Varia-bilität des biologischen Tumorverhaltens sind für dieBeurteilung der individuellen Prognose weitere Para-meter notwendig. Ein Zusammenhang zwischen der Ex-pression von CD44, speziell der Variante v6, und Tu-

Chirurg (1998) 69: 1089±1092

Expression von CD44 und seiner Isoformen v4, v5, v6, v7, v10 ±neue prognostische Parameter beim duktalen Pankreascarcinom?Th. Böttger, H. Maschek, W. Gottwald, M. Lobo, W. Brenner und Th. Junginger

Klinik und Poliklinik für Allgemein- und Abdominalchirurgie (Direktor: Prof. Dr. Th. Junginger), Johannes Gutenberg Universität Mainz

Ó Springer-Verlag 1998

morprogression bzw. Metastasierung konnte in einigenStudien bei bestimmten Tumorentitäten nachgewiesenwerden [3, 7, 9, 14]. Zum Pankreascarcinom liegen nureinzelne Untersuchungen vor [4, 5, 8]. Ziel dieser Un-tersuchung war es, die Expression von CD44 und seinerIsoformen in Pankreascarcinomen zu untersuchen undihre prognostische Relevanz zu evaluieren.

Patienten und Methodik

Die Untersuchung wurde vorgenommen am archivierten paraffin-eingebetteten Tumormaterial von 40 Patienten (19 Männer, 21Frauen, Altersmedian: 61,5 Jahre, Spanne: 41±79 Jahre), bei de-nen wegen eines duktalen Pankreascarcinoms eine partielle Duo-denopankreatektomie durchgeführt worden war. Zum Zeitpunktder Analyse waren dem Untersucher weder die histomorphologi-schen Parameter noch die Überlebenszeit der Patienten bekannt.

Histopathologische Untersuchung

Die histopathologische Untersuchung mit der Beurteilung des Tu-morstadiums sowie der R-Kategorie erfolgte nach der TNM-Klas-sifikation der UICC von 1992. Die Beurteilung des Differenzie-rungsgrads wurde in Anlehnung an die Empfehlung der WHO vor-genommen.

Nachweis von CD44 und seiner Varianten v4, v5, v6, v7und v10

Anhand von HE-gefärbten Referenzschnitten wurde der Tumorinnerhalb der Paraffinblöcke identifiziert. Von diesem wurde ein3±5 mm dicker Schnitt entnommen [11]. Die Schnitte wurden aufSuper-frost-Objektträger (Menzel Germany) aufgezogen und bei37� C für mindestens 24 Std im Brutschrank gelagert. Anschlie-ûend wurden sie in Xylol entparaffiniert und durch eine absteigen-de Ethanolreihe rehydriert. Die mit destilliertem Wasser gewa-schenen Schnitte wurden, um eine Epitopfreisetzung zu gewährlei-sten, im Citratpuffer für mindestens 15 min mikrowellenbehandelt.Anschlieûend wurden die Schnitte mit dem monoklonalen Primär-antikörper Anti-CD44 (Standard, v4, v5, v6, v7, v10) (Bender-MedSystem) für mindestens 60 min bei Raumtemperatur inku-biert. Danach erfolgte eine Inkubation von 20 min mit dem Bio-tin-konjugierten Sekundärantikörper (BioGenex). Um die Fär-bung zu verstärken, wurden die Schnitte mit einer Peroxidase-kon-jugierten Streptavidinlösung (BioGenex) für mindestens 20 mininkubiert. Danach wurden die Schnitte mit DAB gefärbt und mit50%igem Hämatoxylin gegengefärbt. Anschlieûend wurden siedurch eine aufsteigende Ethanolreihe dehydriert und mit Entallanund Deckgläschen eingedeckt. Zwischen den einzelnen Schrittenwurden die Schnitte mit PBS-Puffer gewaschen.

Mehr als 20% der duktalen Zellen muûten sich mit dem Pri-märantikörper anfärben, um als positiv gewertet zu werden. AlsNegativkontrolle wurden bei jedem Präparat die gleichen Färbun-gen ohne Antikörper durchgeführt (Abb. 1). Als Positivkontrollewurde gleichermaûen aufgearbeitete Haut genommen.

Statistik

Die univariate Analyse wurde mit dem c2-Test und Fisher-exact-Test vorgenommen. Eine multivariate Analyse war aufgrund derkleinen Fallzahl nicht möglich. Die Berechnung der Überlebens-kurven erfolgte nach Kaplan-Meier. Kein Patient ist infolge derOperation verstorben. Die statistische Evaluierung prognostischer

Faktoren wurde univariat mit dem Logrank-Verfahren vorgenom-men. Alle statistischen Untersuchungen erfolgten unter Benut-zung des Statistikprogramms SPSS für Windows (Version 6.01).

Ergebnisse

Vergleich der Expression von CD44 und seiner Variantenin tumorösem und nichttumorösem Pankreasgewebe

Nur bei 32 Patienten war nichttumoröses Pankreasge-webe vorhanden. Eine Überexpression von CD44 wur-de im nichttumorösen Gewebe in 4 Fällen und im Tu-morgewebe in 11 Fällen nachgewiesen, ohne daû eineKorrelation bestand (nicht signifikant). Isoformen v4,v7 und v10 wurden sowohl im Tumor als auch im nicht-tumorösen Pankreasgewebe derselben Patienten nur inAusnahmefällen beobachtet. Eine Überexpression vonv5 fand sich in 26 der 32 duktalen Carcinome, jedoch inkeinem nichttumorösen Pankreasgewebe derselben Pa-tienten.

Th. Böttger et al.: Expression von CD44 und seiner Isoformen ± neue prognostische Parameter beim duktalen Pankreascarcinom?1090

a

b

Abb. 1. a Duktales Pankreascarcinom, CD44v5, AntikörperBMS 115, BSA-Verfahren, DAB-Färbung, Vergr. 160 : 1, Tumor-zellen sind deutlich positiv für CD44v5, erkennbar an der braunenVerfärbung b duktales Pankreascarcinom, Negativkontrolle, glei-che Vorgehensweise wie oben, jedoch ohne Zusatz des Antikör-pers BMS 115, Tumorzellen färben sich nicht an

Korrelation zwischen histomorphologischen Parameternund CD44 sowie seiner Isoformen

Keine Korrelation konnte zwischen der Expression vonCD44 oder einem seiner Isoformen und dem Patienten-alter, Geschlecht, pT-Kategorie, pN-Kategorie, pM,Grading und der Radikalität des chirurgischen Eingriffsfestgestellt werden.

Prognose

Nur bei wenigen Patienten konnte eine Überexpressionvon CD44 oder einem seiner Isoformen nachgewiesenwerden. Hierdurch war die Beurteilung der prognosti-schen Relevanz von CD44 erschwert. Nach einer Beob-achtungszeit von im Median 9 Monaten waren 4 Patien-ten tumorfrei. Alle anderen Patienten verstarben an ei-

nem Rezidiv. Die mediane Überlebenszeit betrug9,8 Monate. Patienten mit einer Überexpression vonCD44v4, v5, v6, und v10 hatten eine tendenzielle, je-doch aufgrund der kleinen Fallzahl nicht signifikantschlechtere Prognose als die anderen Patienten. Die be-kannten prognostisch relevanten Faktoren, wie pT- undpM-Kategorie, sowie die Radikalität des chirurgischenEingriffs hatten einen signifikanten Einfluû auf dieÜberlebenszeit (Tabelle 1).

Diskussion

CD44 ist ein Transmembranreceptormolekül, welchesubiquitär in epithelialen Tumoren [1, 3, 7, 9, 14] undLymphomen [13] vorkommt. Die genomische Strukturvon CD44 besteht aus 20 Exons, welche auf dem kurzenArm von Chromosom 11 lokalisiert sind. Zehn der 20Exons werden immer exprimiert, durch Einfügen einesoder mehrerer der 10 Variantenexons (v1±v10) kanneine Vielzahl von Isoformen gebildet werden (Abb. 2).

Adhäsionsmoleküle steuern intercelluläre Wechsel-wirkungen, dienen als Zellkontaktmoleküle dem Auf-bau komplexer Strukturen und Gewebeverbände undsind als Substratadhäsionsmoleküle auch für den Auf-bau des Zwischenzellgerüsts notwendig [10, 12]. Gün-thert et al. konnten zeigen, daû CD44v6 wahrscheinlicheine Schlüsselrolle in der Metastasierung einnimmt [6].In Untersuchungen an Ratten, die einen CD44v6 positi-ven metastasierenden Tumor aufwiesen, konnte durchTransfektion in nichtmetastasierende CD44v6 negativeZellinien ein metastasierender Phänotyp erzeugt wer-den [6]. Dieser Effekt konnte durch die gleichzeitigeGabe eines monoklonalen Antikörpers gegen CD44 ge-hemmt werden.

In den nachfolgenden klinischen Untersuchungenkonnte CD44v6 bei Non-Hodgkin-Lymphomen, Oeso-phaguscarcinomen, Coloncarcinomen und Mammacar-cinomen als ein unabhängiger Prognosefaktor identifi-ziert werden [1, 3, 7, 9, 14]. Beim Pankreascarcinom lie-gen bislang wenige Erfahrungen vor [4, 5, 8]. Die bishe-rigen Untersuchungen erfolgten an einem kleinenKrankengut von maximal 24 Tumorpatienten [4, 5, 8].Darüber hinaus wurde nicht zwischen duktalen undnichtduktalen Pankreascarcinomen [4, 5, 8], metastasie-renden und nichtmetastasierenden Tumoren [8] sowieder Radikalität des chirurgischen Vorgehens [4, 5, 8] dif-

Th. Böttger et al.: Expression von CD44 und seiner Isoformen ± neue prognostische Parameter beim duktalen Pankreascarcinom? 1091

Tabelle 1. Prognose der Patienten mit einem duktalen Pankreas-carcinom in Abhängigkeit von der Expression von CD44 und sei-ner Isoformen sowie von histomorphologischen Parametern

Variable n ¹med. survalª[Monate]

¹log rankªp -Werte

CD44 < 20 %> 20 %

2218

8,111,2

n. s.

v10 < 20 %> 20 %

373

10,27,3

n. s.

v7 < 20 %> 20 %

40 8,1

v6 < 20 %> 20 %

2713

10,24,3

n. s.

v5 < 20 %> 20 %

1129

10,37,5

n. s.

v4 < 20 %> 20 %

364

9,24,2

n. s.

Grading IIIIII

31324

12,710,67,4

n. s.

pN positivnegativ

931

7,510,0

n. s.

pT IIIIII

8275

10,210,55,2

0,05

Radikalität R0R1/2

3010

10,24,5

0,05

pM 01

319

10,25,2

0,05

Abb. 2. Schematische Darstellung der CD44-und Variantenregionen (modifiziert nach [13])

ferenziert . In der hier vorliegenden Untersuchung wur-de die Expression von CD44 und seiner Isoformen v4,v5, v6, v7 und v10 immunhistochemisch anhand von pa-raffineingebettetem Tumormaterial von 40 Patientennach Resektion eines duktalen Pankreascarcinoms un-tersucht. Zum Zeitpunkt der Analyse waren die histo-morphologischen Parameter der einzelnen Patientensowie die Überlebenszeit nicht bekannt.

In Übereinstimmung mit Castella et al. [4] sowie Rallund Rustgi [8] konnten wir keinen Unterschied in derExpression von CD44 zwischen tumorösem und nichttu-morrösem Gewebe sehen. Im Gegensatz hierzu warendie Isoformen v4, v5, v6, v7 und v10 im nichttumorösenPankreasgewebe nur in Einzelfällen positiv. Gansaugeet al. konnten ebenfalls im normalen Pankreasgewebemit Ausnahme von CD44v6 keine weiteren Isoformennachweisen [5]. Castella et al. fanden demgegenüberkeine Expression von CD44v6 im nichttumorösen Pan-kreasgewebe von 10 Patienten [4]. Gansauge et al.konnten immunhistochemisch in 4 % und wir in keinemFall eine Expression von CD44v7 im Tumorgewebe fin-den [5]. Darüber hinaus konnten wir die Isoformen v4und v10 im Tumorgewebe ebenfalls nur in Einzelfällennachweisen. CD44v6 war demgegenüber in Überein-stimmung mit anderen [4, 5] in jedem 3. Tumorgewebeüberexpremiert. Castella et al. vermuteten, daû eineÜberexpression von CD44v6 für das invasive Wachstumund das Metastasierungsverhalten dieses Tumortypsverantwortlich ist [4]. Diese Patienten hatten im eige-nen Krankengut tendenziell eine schlechtere Prognose,die allerdings aufgrund der kleinen Fallzahl statistischnicht signifikant war. Im Gegensatz zu anderen konntenwir keine Korrelation zwischen CD44v6 und den histo-morphologischen Parametern nachweisen [5].

Zusammenfassend konnten wir am Tumormaterialvon 40 Patienten nicht zeigen, daû die Expression vonCD44 oder einer seiner Isoformen eine prognostischeRelevanz beim duktalen Pankreascarcinom hat. Hinge-gen konnten andere Parameter, wie Tumorinfiltrations-tiefe, Radikalität des Eingriffs und der Nachweis einerFernmetastasierung, in ihrer prognostischen Relevanzbestätigt werden. Dies läût darauf schlieûen, daû auchbei einer gröûeren Fallzahl die Expression von CD44oder einer seiner Varianten kein entscheidender Pro-gnosefaktor beim duktalen Pankreascarcinom seinwird. Dennoch sind weitere Untersuchungen an einemgröûeren Krankengut unter Einschluû einer multivaria-ten Analyse notwendig, um diese These zu überprüfen.

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Prof. Dr. Th. BöttgerKlinik und Poliklinik für Allgemein und AbdominalchirurgieJohannes Gutenberg Universität MainzLangenbeckstraûe 1D-55101 Mainz

Th. Böttger et al.: Expression von CD44 und seiner Isoformen ± neue prognostische Parameter beim duktalen Pankreascarcinom?1092