Ringvorlesung BFluoreszenz und Anwendung in Molekularer Biotechnologie

Ruprecht-Karls-Universität HeidelbergInstitut für Pharmazie and Molekular Biotechnologie

Abteilung: Chemie - Nachwuchsgruppe Chemische Biologie AK Wombacher

• Technologien zur Proteinmarkierung• Fluoreszenzmikroskopie• Mikroskopietechniken

Inhalt:

Selektive Markierung von Proteinen mit Fluorophoren

R.Y. Tsien Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 509

Fluoreszenzmikroskopie mit Fluoreszierenden Proteinen

Nobelpreis 2008:Osamu ShimomuraMartin ChalfieRoger Tsien

N.C. Shaner, G.H. Patterson, M.W. Davidson. J. Cell Sci. 2007, 120, 4247G.H. Patterson, R.N. Day, D. Piston. J. Cell Sci. 2001, 114, 837

Farbspektrum der Fluoreszenzeproteine

Farbspektrum der Fluoreszenzeproteine

Nachteile der FPs:• Groesse• Oligomerization• Breite Emissions Spektren• Geringe Anzahl von Photonen

N.C. Shaner, G.H. Patterson, M.W. Davidson. J. Cell Sci. 2007, 120, 4247G.H. Patterson, R.N. Day, D. Piston. J. Cell Sci. 2001, 114, 837

Selektive Markierung von Proteinen mit Fluorophoren

Chemical Tags – SNAP-tag

• O-6-Alkylguanin-alkyltransferase (AGT)• Aufgabe: DNA Defekte an Guanosin reparieren • Überträgt dabei Alkylrest auf ein Cystein Rest im aktiven Zentrum • Mutante des WT akzeptiert auch andere Substrate

Keppler, A. et al. (2004) PNAS, 101, 9955-9959

1) Grow cells/Transfectw/plasmid DNA

2) Incubate w/ligand-dyeconjugate, wash cells

3) Fluorescent microscopic imaging

FPOI-

eDHFR

B C DAMLCK Protein Nukleus (NLS) Zellmembran MRLC Protein Mitochondrien

E

Proteinmarkierung unter Verwendung von E.coli Dihydrofolatreduktase

L. W. Miller, Y. Cai, M.P. Sheetz, V.W. Cornish. Nat. Methods 2005, 2, 255

1. Generation: Methotrexat 2. Generation: Trimethoprim

Selektive Markierung von Proteinen mit Fluorophoren

Griffin, Tsien (1998) Science 281:269 Specific Covalent Labeling of Recombinant Protein Molecules Inside Live Cells

Chemical Tags – FlAsH-tagFluorescein Arsenical Helix binder, bis-EDT adduct FlAsH-EDT

ReAsH(„rote variante“)

2

Nachteile: unspezifisches Binden an Cysteine

Fluoreszenzmikroskopie

Charge-coupled device (Nobelpreis Physik 2009)

• Auflichtfluoreszenzmikroskopie(Epifluoreszenzmikroskopie)

• Durchlichtmikroskopie

Fluoreszenzmikroskopie – konfokale Fluoreszenzmikroskopie CLSM (confocal laser scanning microscopie)

Probe muss rasterartig „Punkt für Punkt“„abgescannt“ werden – benötigt Zeit

Pinhole ist konfokal zum Fokuspunkt

Hohe Lichtintensität

Fokuspunkt ist konfokal zum Pinhole

Z-scan-movie z

Fluoreszenzmikroskopie – Spinning Disc MicroskopieSD-CLSM (confocal laser scanning microscopie)

Konfokales Prinzip:

Lichtquelle:

Detektor:

Vorteile:

Nachteile:

Vergleich der Fluoreszenzmikroskopieverfahren

TIRF Mikroskopie – Total internal reflection microscopy

Prism TIRF: Objektiv TIRF:

Axelrod D., Total internal reflection fluorescence at biological surfaces, in Noninvasive techniques in cell biology, Wiley-Liss, New York, New York (1990).Steyer J. and Almers, W., Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells, Nature: 388, 474 (1997).

FRAP- Fluorescence recovery after photobleaching

Methode aus der Mikrobiologie und Biophysik, die zur Messung derDiffusionsgeschwindigkeiten in Zellen und dünnen Flüssigkeitsfilmen dient. Sie kann z. B. zum Nachweis der Fluidität von Biomembranen verwendet werden

One-Photon Absorption

Fluorescence Two-Photon Absorption

UV IR

2-Photonen Fluoreszenz

Wann verwende ich welche Mikroskopiemethode?