Folien 5 Grundlagen5 MP - ETH Z€¦ · • Interner Standard hat nicht exakt die gleichen Eigenschaften wie der Analyt • Matrixeffekte werden nicht kompensiert • Kalibrierung

Herbstsemester 2013

Analytische Chemie(für Biol. / Pharm. Wiss.)

Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophore se)

Dr. Martin Pabst

ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | [email protected]. ch

HCI D323

[email protected]

http://www.analytik.ethz.ch/

Herbstsemester 2013 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid, Dr. Martin Pabst | [email protected]

Wiederholung der letzten Einheit: Auflösung

2

RS =α−1

α

k2

1+ k2

N

4

α: Trennfaktork: RetentionsfaktorN: Anzahl theoretischer Böden

Wie Selektiv?Wie unterschiedlich

sind die Gleichgewichts-einstellungen beiderAnalyten? (Kc1/Kc2)

Wie lange ist der Analyt in der Säule?Wie viel mehr Zeit braucht der

Analyt durch die Säule alsdie mobile Phase? (tr/tm)

Wie viele Gleichgewichts-einstellungen?

Wie breit sind meine Peaks?Höhe der theoretischen Böden

und Länge der Säule


3

+

−=41

1

2

2 N

k

kRS α

α

k

k

1 + k

Nαααα

N

4

Erhöhung von k:

bessere Auflösung, aber höhere Retentionszeiten

� längere Analysenzeiten� breitere Peaks

Erhöhung von N:

geringere Peakbreite(Standardabweichung σσσσ)

� Bei Optimieung durch L/u: Veränderung tR

Erhöhung von α:

Grösserer Abstand der Peaks im Chromatogramm

�� Veränderung von tR von zumindest einem Peak

Auflösung

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MR ttk /'=

HLN /=längere Säule L

geringeres [u]

höheres [u]

WechselStationäre/Mobile

Phase

α = tR2 − tM

tR1− tM

= ′ t R2

′ t R1

= k2

k1

= KC 2

KC1

Peakbreiteverändert sich nicht


Beschreibung der Effizienz der Chromatographie = Van Deemter Gleichung

H �� wie breit werden die Peaks?U �� proportional zur Retentionszeit

H = A + B

u+C u

A: Eddy-DiffusionB: LongitudinaldiffusionC: Massentransport-Effekteu: Lineare Flussgeschwindigkeit

Lineare Flussgeschwindigkeitder mobilen Phase ��

H

+

-

--

+

HLN /=

+ Optimum- Schlechter Bereich


Quantitative Analyse mittels Chromatographie

Statistik und Kalibrierung

„Allein die Dosis macht das Gift“

Meist ist das „WIEVIEL?“ genauso wichtig wie das „WAS? “!


Quantitative Analyse

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WAS? WIEVIEL?


Ein kleiner Ausflug in die Statistik


Statistische und systematische Fehler

9

Genauigkeit =

Präzision + Richtigkeit


Statistische und systematische Fehler

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Schüsse 1–3

Schuss 4 nach Korrektur der Zieloptik


Mittelwert und Standardabweichung

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Häu

figke

it ei

nes

Mes

swer

tes

x

Mittelwert :

Standardabweichung σσσσ

relative Standardabweichung σσσσrel,x :

x

x = 1

nxi

i =1

n

∑

Messwerte xi

σx = 1

n −1xi − x ( )2

i =1

n

∑

σrel, x = σx

x


Angabe eines Analysenergebnisses

12

Häu

figke

it ei

nes

Mes

swer

tes

x

Messwerte xi

In einem Analysenbericht muss ein Messergebnisimmer mit einer Fehlerangabe versehen werden.

Messergebnis mit absolutem Fehler:

± σx z.B. 12.3 µg/L± 0.8 µg/L

Messergebnis mit relativem Fehler:

± σrel,x z.B. 12.3 µg/L± 7%x

x


Kalibrierung

Das Detektorsignal ist im Idealfall proportional zur Analytenmenge

grössere Analytenmenge � mehr Peakfläche

Um das Detektorsignal in Mengenangaben umrechnen zu können (mg, mol, oder mg/ml….)

muss man eine Kalibrierung vornehmen


Kalibrierung

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y-Achse: Detektorsignal z.B. in Volt oder Ampere(Peakfläche oder –höhe)AAnalyt

x-Achse: Probenkonzentration z.B. in mg/l, µg/l, mol/l, ...cAnalyt

AAnalyt = a + b cAnalyt


Empfindlichkeit und Nachweisgrenze

Was gilt noch als Peak?


Empfindlichkeit und Nachweisgrenze

16

Empfindlichkeit:

b = Steigung der Kalibriergeraden = Empfindlichkeit = Responsefaktor

Nachweisgrenze NG (limit of detection = LOD):

Minimale Konzentration deren Signal sich gerade noch also solches erkennen lässt bzw. welches sich signifikant vom Grundrauschenunterscheidet.

σA0= Standardabweichung des Blindwerts

3σσσσ-Kriterium: Die NG ist die Konzentration, bei der eine Signalintensität erhalten wird, die 3 σA0

über dem Grundrauschen liegt.

Bestimmungsgrenze BG (limit of quantification = LOQ):

Minimale Konzentration, die sicher bestimmt (quantifiziert) werden kann.

Die BG lässt sich nach dem 6 σσσσ-Kriterium ermitteln. Das Signal bei der BGliegt also 6 σA0

über dem Grundrauschen.

Ab der BG überlappen die Gauss-Verteilungen von Signal und Rauschennicht mehr.


NG =A0 + 3σA0( ) − a

b

BG =A0 + 6σA0

( ) − a

b


Linearität des Detektors

b = Steigung der Kalibriergeraden = Empfindlichkeit

„unterer“ Bereich: LOD / LOQ , das Signal lässt sich vom Grundrauschen des Detektors nicht mehr unterscheiden

„oberer“ Bereich: Durch Überladung des Detektors kommt es zu keiner Signalzunahme mehr!


http://www.chemgapedia.de


Kalibrierung

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• Kalibrierung ohne internen Standard

• Kalibrierung mit internem Standard

• Kalibrierung mittels Standardaddition


Kalibrierung ohne internem Standard (extern)

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cAnalyt =AAnalyt − a

b

Bevorzugt eingesetzt, wenn:

• viele Proben mit ähnlicher Matrix gemessen werden sollen,• systematische Fehler wie Verflüchtigung, Filtrationsverluste, Eintrag,

Volumenfehler etc. vernachlässigbar klein sind.

Limitierungen:• Matrixeffekte und systematische Fehler


Kalibrierung mit internem Standard

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Bei der Kalibrierung werden Standardlösungen bekannter Analytkonzentration hergestellt, denen eine bekannte Konzentration an internem Standard zugesetzt wird.

Allen Proben wird dieselbe Menge eines internen Standards hinzugefügt

Wird eingesetzt, wenn systematische Fehler z.B. während derProbenaufarbeitung nicht zu vernachlässigen sind (z.B. Aufkonzentrieren derProbe durch Verdunstung des Lösungsmittels, Verluste an Analytenmolekülen beider Filtration, ...).

internerStandard



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Ein interner Standard soll:

• dem Analyten ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften haben• nicht in der Probe vorkommen• neben dem Analyten in der Probe bestimmbar sein

Beispiel:

Analyt Interner Standard

Coffein Theophyllin

Ideal:

Stabilisotopen-markierte (z.B. D, 13C) Analytenmoleküle als interner Standard undMS-Detektion.



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AAnalyt

Ainterner Standard

= a + bcAnalyt

cinternerStandard

cAnalyt = cinterner Standard

AAnalyt

Ainterner Standard

− a

b

Bei der eigentlichen Analyse wird der Probe vor der Aufarbeitung eine bekannteKonzentration an internem Standard zugesetzt und bei der Messung das Verhältnis derPeakflächen bestimmt.

Vorteil: Der interne Standard durchläuft die gleiche Probe naufarbeitung wie der Analyt� Systematische Fehler können ausgeglichen werden.

Limitierung: Der interne Standard hat nicht die exakt gleichen Eigenschaften wie der Analyt.


Kalibrierung mittels Standardaddition

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Für die Kalibrierung werden keine Standardlösungen hergestellt, die Kalibrierung erfolgt in der Probe selbst.

1) Messung der Probe

2) Messung der Probe nach Zugabe bekannter Analytenkonzentration (Standard)

cAnalyt

cStandard

=AAnalyt

AAnalyt+ Standard − AAnalyt


Kalibrierung mittels Standardaddition

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AAnalyt+ Standard = a + b cStandard


Zusammenfassung Kalibrierung:

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• Kalibrierung ohne internen Standard:• einfachstes Kalibrierverfahren• Fehler in der Aufarbeitung werden nicht berücksichtigt• Matrixeffekte werden nicht kompensiert

• Kalibrierung mit internem Standard:• Kompensation systematischer Fehler• Interner Standard hat nicht exakt die gleichen

Eigenschaften wie der Analyt• Matrixeffekte werden nicht kompensiert

• Kalibrierung mittels Standardaddition• Kalibrierung in der Probe mit dem Analyten als „Standard“• Matrixeffekte können kompensiert werden

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