For Future Bio-Industry

新しいバイオリアクターによるシステムの提案

新しいバイオ物質生産の提案

インフルエンザワクチン，抗体医薬の生産、インシュリンなどの生

体内有用タンパク質、酵素の大量生産にバイオリアクターは使われて

おります。

しかし、バイオリアクターは、浮遊培養が多く、装置が巨大で、使用

する培地量も多く、前もって実験条件をスクリーニングするのは難しい

欠点がありました。

スクリーニングする条件とバイオリアクターの条件が同じであること。

そして、スクリーニングする手間があまりかからないこと、コストが安い

ことが求められます。 しかし、今までこのようなシステムはありません

でした。

ベセル(株)は、バイオリアクターとして不織布を用いた細胞固定ラ

ジアルフロー型バイオリアクター。 そして、スクリーニングとして、同じ

材料、同じ表面修飾の多孔質膜を用いた3次元細胞培養ディッシュ

ー Vecell®の組み合わせを提案いたします。

１． まず、3次元細胞培養ディッシュ ー Vecell®でスクリーニ

ングすることによりバイオリアクターの条件設定をします。

２． １．により設定した条件によるラジアルフロー型バイオリアクターでバイオ物質生産をします。

この２段階のステップにより、大きなリスク回避と、効率のよいバイ

オリアクターによるバイオ物質生産が出来るというのがベセル(株)の提案です。

ベセル（株）のラジアルフロー型バイオリアクターはコンパクトで効率のいい生産が出来ます。

１） 一般のバイオリアクター（バッチタイプ） ウィキペディアから引用

内部のモデル 外観

内部のモデル 外観

２） ベセル（株）のラジアルフロー型バイオリアクター

接着細胞の培養の場合は１）のバイオリアクターと比較して、約１／１０以下のスケールで，同じ量の細胞を培養できる特長があります。

１． まず、3次元細胞培養ディッシューVecell ®でスリーニング

することによりバイオリアクターの条件設定をします。

３０㎜φ１２㎜φ

ベセル（株）のＶｅｃｅｌｌ® は他のインサートと比較して、膜の構造が違います。 とくに、

膜の、繊維長が非常に長く（大体 １０～５０ミクロン）、また、繊維間もずいぶん開いています（大体、２～５ミクロン）。 細胞が、すこし繊維間に足を伸ばせる、あるいは入り込むことができるほどです。

この構造の上に細胞が入り込み、増殖する様子を模式的に示したのが下図です。これにより、細胞が延伸する力を受けることなく、安定して、静着しているのだと考えています。

この構造により、バイオリアクターへの近似、スクリーニングが可能になるのです。

３次元細胞培ディッシュ ー インサートVecell®の外観

膜繊維 細胞

ECM コーティング

さらに、お求めやすいさらに、お求めやすい プリセットベセル（プリセットベセル（Preset VECELLPreset VECELL®® ））も発売しても発売して

おります。おります。

Preset Preset VecellVecell®®プリセットベセル

プリセットベセルプリセットベセルは特に創薬スクリーニングのためにつくられましたは特に創薬スクリーニングのためにつくられました

マイクロプレートリーダー測定

Basolateral Apical Basolateral Apical

No. 1外 No. 1内 No. 2外 No. 2内

No. 1 No. 2

この製品は、すでにVecell®が細胞培養プレートに入っています。従来品に比べ、使い勝手も向上し、価格もお求めやすくなっております。製薬のスクリーニングテストなどの新しい応用が期待されます。

Vecell 3D-Insert®®

ベセル 3D-インサート

ベセルは膜培養ですので、内側と外側の液を採取することで、薬剤等の細胞の代謝機能を調べることが可能です。 これはＨＴＳ（ハイスループットシステム）法を用いることで、より迅速、確実に投与薬剤の機能を調べることが出来ます。

１．で提案した3次元細胞培養ディッシュー Vecell®と同じような、多孔質膜を用いた、バイオリアクターを紹介します。

このバイオリアクターで用いる多孔質膜の表面膜は、ほとんど同じ表面修飾をしています。 ただ、孔径が200～300ミクロンあります。 例えば肝細胞のマイルドな固定に威力を発揮し、狭い領域にたくさんの肝細胞を固定でき、しかも培地の循環を損ねない特長があります。

+肝細胞

（血漿）

（血漿）

肝細胞

縦断面横断面

２． １．により設定した条件によるラジアル

フロー型バイオリアクターでバイオ物

質生産をします。

上からみたバイオ

リアクターーその１

肝細胞を固定したバイオリアクターの例

上から見たバイオリアクターーその２

ラジアルフロー型

この多孔質膜は、コンパクトでしかも、多くの細胞を固定することが

できます。 直径５ｃｍ、長さ２５ｃｍのバイオリアクターで2x109

~5x109個の細胞を固定でき、しかも目詰まりを起こし難い特長があ

ります。

ベセル(株)のラジアルフロー型バイオリアクター

矢印で示したのが上図のベセル(株)ラジアルフロー型バイオアク

ターです。

バイオリアクター装置

クラレメディカル(株)のプラズ

マフェレーシスの装置とエイブル(株)のガス供給を含

むコントローラーを組み合わせています。

➾

特長

１） 細胞接着性不織布を用いているので、ひじょうにコンパクトに、多量の細胞を安定して培養できる。 一本当たり2x109 ~5x109 個の細胞レベル （直径５ｃｍ、長さ２５ｃｍのカラム）

２） 温度コントロールも容易。

３） 細胞から分泌されるタンパク質（ワクチン）を容易に細胞と分離して回収、濃縮出来る。

４） 全体のシステムもコンパクトになる。

５） バイオリアクターは、使い捨てになるが、量産体制は取れるので、大幅なコスト削減が可能。

下の図に、ラジアルフロー型バイオリアクターの模式図を示しました。 ここでは、培地、循環液がしたから入って、上から出ています。

しかし、充填しているビーズ（この場合はガラスビーズ）には、横から、つまり上から見ると（下の左図）周りから液が入り込み、中心に集まり、それが、出て行くことになります。

一般のカラムのように、下（あるいは上）から入って、ビーズを通って，上（あるいは下）から出る系とは異なります。

ラジアルフロー型とは？

上のラジアルフロー型バイオリアクターはエイブル株式会社の製品です。

B: 細胞親和性の両親媒性ポリマーをコーティングしたPTFE不織布

A: 孔径２mm穴のあいたポリエチレン製チューブ

ベセル（株）のラジアルフロー型細胞培養バイオリアクターは従来、使用されてきたビーズのかわりに多孔質の不織布をバウムクーヘン状に巻いたものを用いるところが違います。

A

B

→

↑

→ 細胞と培地の流れ

● 細胞

細胞接着性のよい不織布をバウムクーヘン状に巻いてあり、培地の流路は、横の入り口から入り、不織布を通って、真ん中の流路出口からでていきます。

バイオリアクター（細胞培養モジュール）のアセンブリー

３次元細胞培養ディッシューVecell®の表面

2 0 u m2 0 u m

バイオリアクターの不織布の表面

ここで、最初に，バイオリアクターと同じ材料と系でスクリーニングする必要があることを説明させていただきましｔが、ベセル（株）のVecell®の表面構造を上に示しました。 親水性で、しかも細胞親和性のある多孔質材料（ePTFE)から出来ています。バイオリアクターも同じ材料（PTFE)の不織布で出来ており、

表面修飾方法は全く同じです。 しかし、穴径が違います。 バイオリアクターの方が、培地を通過させたりする必要のためかなり開いています。

Vecell® と バイオリアクターの表面構造

バイオリアクター不織布表面のブタ肝細胞

100μm 100μm

プラスチックディッシュ（左）とVecell® （右）のラット肝細胞（培養３日目）

この同じような材料で出来たVecell®とラジアルフロー型バイオリアクターでの細胞培養の結果を下に示しました。 Vecell®の場合はラット

肝細胞、バイオリアクターの場合はブタ肝細胞の違いはありますが、どちらも、肝細胞特有の球形の形を保ったまま、増殖し、機能発現をしています。 大きさもほとんど変わりません。

細胞の接着と形態

ベセル（株）ラジアルフロー型バイオリアクターの実績

Glucose Consumption Rate

Beforepreservation

Afterpreservation

Duringpreservation

-0.5

0

0.5

1

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Culture Time (day)

Glu

cose

Con

sum

ptio

n R

ate

(mg/

day) 2.0x10^9

cells/reactor1.0x10^9

ブタ肝細胞培養結果培地の酸素分圧を上げる（DO=１０ｍｇ/L) とアンモニア代謝能と酸素消費量が増大することを示しております。

Albumin Secretion Rate

-5.0

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Culture Day

Alb

umin

Sec

retion

Rat

e

[mｇ/re

acto

r/day]

1.0x10^9cells/reactor

2.0x10^9cells/reactor

Beforepreservation

Duringpreservation

Afterpreservation

ブタ肝細胞培養結果培養５日目にカテキンを加えて，培地供給を停止させ、９日目に回復させて、細胞の常温保存を試みた結果です。

細胞数を1.0x 109と 2.0x 109

の場合を

試していますが、あまり大きな差はありません。

しかし、停止させてから４日目で、ほとんどアンモニア代謝、グルコース消費機能を回復していることが分かります。

これは、ラジアルフロー型バイオリアクターの特長である、添加物の除去が非常に効率よく出来ること。 細胞が生体内と同じ状態で長期間保たれていたことによると考えております。

Preservation of Porcine Hepatocytesin Three-Dimensional Bioreator at Room Temperature using Epigallocatechin-3-Gallate

Azizi Miskon et al

Tissue Engineering Part C:Methods

2009,15(3):345-353

その１

その２

(1)培地の入り口(2)培地の出口(3)細胞接着性不織布(4)ホローファイバーでなく不織布の為の

スペーサー(5)処理液入り口（例えば血液入り口）(6)処理液出口(7)培地回収用多孔質チューブ(8)培地外循環用スペース

ここで、次に説明するインフルエンザワクチン生産用のラジアルフローシステムの内部構造（上）とシステム（下）を紹介します。

(1)二酸化炭素ボンベ；(2)酸素ボンベ；(3)空気ボンベ；(4)コントローラー(5)コンピューター；（6)フィルター；(7)培地調整槽；(8)スターラー；(9)ポンプ(10)ハイブリット型ホ

ローファイバーバイオリアクター；

(11)酸素付加膜(12)培地ボトル；(13)廃液ボトル

1.First Step : Screening Cell Culture Condition in Bioreactor using 24 well 3 Dimensional Cell Culture Insert with porous membrane

Successful early stage development of processes with cells and that will meet the demands of a commercial launch is a key factor for reducing timeline and resource demands for bioindustrial organizations. Bioprocesses with cells in the past were initially developed in uncontrolled environments that poorly modeled bioreactors (commercial method of production) and not until late in development were cells placed in controlled bioreactor environments. Developing process uncontrolled has risks associated with it; for instance, selecting cell culture conditions that respond to feeds in uncontrolled environments. Vecell ®–3 D cell culture dish (or Preset Vecell®) is a 24 well system which allows users to maximize the likelihood of obtaining a defined cell culture condition prior to commercialization. Data will presented showing the Preset Vecell® being utilized successfully in cell culture condition selection activities and its scalability to larger bioreactors, which can contribute to shorter development timelines and lower development costs. Vecell membrane is surface-modified ePTFE, which is almost same as the following radial flow bioreactor.

2. Second Step : Scale up to Radial Flow Type Bioreactor of the porous membrane coated with the same surface modification based on the Data obtained by cell culture dish- Vecell ®

Effective Radial Flow Bioreactor allows many cell immobilization and good medium flow. This bioreactor consists of a vertically extended cylindrical PTFE non-woven fabric coated with cell compatible scaffold through which the culture medium flows continuously from periphery towards the central axis. The radial flow will generate a beneficial concentration gradient of oxygen and nutrients, while preventing excessive stresses and buildup of waste products. In addition, the surface is coated with cell compatible amphiphilic polymer which can also immobilize collagen on the surface. Thus, the radial flow bioreactor system with PTFE non-woven fabric coated with PAU is good for high density and large-scale cell cultured with long-term viability. The bioreactor of 5 cm diameter and 25cm length can load 2x109 ~5x109 cells.

Next generation of Process Optimization using Two Steps System for Scale up to Bioreactor.

知的財産ー特許

ベセル(株)は、国立大学学校法人九州工業大学ならびに財団法人

産業技術総合研究所の特許(発明者 児玉 亮）の専有実施権を持っ

ております。 下記に本件に関する特許を記載しました。

（国）九州工業大学

（国）九州工業大学

児玉 亮外１名

児玉 亮外２名

細胞培養用多孔性シート状物とそれを用いたバイオリアクター及び培養方法

細胞培養用多孔性シート状物とそれを用いたバイオリアクター及び培養方法

特願２００６－５３１７５３

PCT/JP2005/014811

日本

（国）九州工業大学

（国）九州工業大学

児玉 亮外２名

児玉 亮外１名

人工血管

人工血管

特開２００６ー６８４０１

PCT/JP2005/015622

日本

（国）九州工業大学児玉 亮外２名培養細胞の調整方法特願２００６－２４０３５０日本

（独）産業技術総合研究所児玉 亮高効率バイオリアクターシステム

特許出願２００３－４４７１９日本

産業技術総合研究所長外１名

児玉 亮外１名細胞培養膜特許出願平１１－３２８５００日本

工業技術院長外１名児玉 亮外３名動物細胞固定化材特許出願平８－２３０７５８日本

出願人発明者名称出願番号出願国

インフルエンザワクチン製造への提案

ベセル株式会社は、ラジアルフロー型バイオリアクターを開発し、人工肝臓、あるいは、物質生産のバイオリアクターの展開を図ってきました。

今回、このシステムが、インフルエンザワクチン製造に展開できないかと考え、提案させて頂きました。

細胞培養法は鶏卵を使用しないで、細胞を用いて、インフルエンザワクチンを製造する新規技術です。

ワクチンは選択したインフルエンザウイルス株を培地で増殖させる生物製剤です。

細胞培養では、これまでの鶏卵に代わり、特別に選択された細胞上でウイルスを増殖させます。細胞培養法では、鶏卵を必要としないことに加え、いったんウイルス株が同定されると、製造のための準備期間を4週間から2～3週間に短縮することもできます。このため、供給時期がより予測しやすくなります。

インフルエンザパンデミックは、甚大な罹患率、死亡率をもたらす可能性のある極めて強毒なウイルスの世界的な流行です。

細胞培養によるインフルエンザワクチン製造は、このためにも大きな期待がかけられている技術分野と考えております。

細胞培養を用いたインフルエンザワクチンの製造

一例

インフルエンザウィルス（Wikipediaからの引用）

（Wikipediaからの引用）

危険な遺伝子を除いた遺伝子をプラスミドに組み込み、細胞に新しいウィルスを感染させて増殖し、感染力の弱めた、ウィルスでワクチンとして用いる。

この例の右図では、シャーレで細胞を培養していますが、本法では、これをバイオリアクターで大量に生産するところが違います。

インフルエンザワクチン製造のための現在の細胞培養法の課題

現在の細胞培養法には下記の欠点があります。

１） 細胞にベクターを入れて、安定に増殖し、機能発現（タンパク質（ワクチン）の産生）させる必要があるが、浮遊培養では、安定した細胞増殖が難しい。

２） タンパク質（ワクチン）の回収は、細胞を除去するプロセスが必要。

そのために，次の提案をさせていただきます。

１） インフルエンザワクチン製造に用いられている細胞は、接着細胞が多い（MDCK細胞など）のですが、このために接着させた状態で培養するバイオリ

アクターが適しています。

浮遊培養では、増殖、細胞の活性が落ちる恐れがあります。

２） バイオリアクターで細胞増殖し、その状態で、感染させ、そして、ワクチンタンパク質（弱毒化したインフルエンザウィルス）を製造させて、これを同じ培養ラインで回収できたら、ひじょうに効率的です。

細胞からのワクチンタンパク質の回収には下記の２つの方法が適応可能です。

細胞外に放出される場合は，問題ありませんが、そうでない場合は

１） 細胞に固定したまま、細胞を溶解して、ワクチンタンパク質を回収する。

２） 下記の方法のように、熱感受性ポリマーにより、３６度から２０度への温度変化により、細胞を剥離し、同じ経路から細胞を回収する。 フィルターを使用すれば遠心分離の必要がありません。

細胞がマイルドに剥離する

Ａ PTFE繊維Ｂ 両親媒性ポリマーＣ 熱感受性ポリマー＋ゼラチン等を含む成分Ｄ 細胞の三次元の培養

D C B A B C D B A B 36oC 20oC

ベセルの提案の応用

１） まず、現在、問題になっているインフルエンザワクチン製造で、細胞培養による大量生産に移ってきており、これに適応出来ます。

２） これからの医薬は抗体医薬の展開が成長すると考えられております。 バイオリアクターによる大量生産が一番、期待される分野でしょう。

３） まだまだ、ヒト由来の有用タンパク質、例えばインシュリン、成長ホルモン等の生産は、難しく、その生産系の確立とバイオリアクターの応用が期待されています。

容易に、実験室レベルから工場生産へ。

そして、人類のQOLの向上に貢献すること。

これが，私どもの夢であり、ビジョンです。

このバイオリアクターシステムのお問い合わせは、ベセル（株）か、株式会社バイオットまでお願いいたします。

株式会社バイオット Tel 03-3260-0415, Fax 03-3260-0407

URL : http://www.able-biott.co.jp

〒808-0135福岡県北九州市若松区ひびきの1-8北九州学術研究都市事業化支援センター４０６ベセル株式会社電話・FAX 093-695-3486IP電話 050-3385-8217 内線4064

住所・連絡先

kodama@vessels.co.jphttp://www.vessels.co.jp

メールホームページ

児玉 亮代表取締役