1962 4. Analyse yon biologischem Material 273

Sehwefels~ure un4 ansehlieBend mit 1 Teil 10~ NatriumwofframatlSsung ver- setzt, 10 mill stehen gelassen und filtriert. Eia aliquoter Teil des Ffltrats wird in einem Reagensglas mit Glasstopfen mit einer 0,2~ LSsung yon 2,4-Dinitro- phenylhydrazin in 2nSalzs~ure im Verh~ltnis 20:1 vermischt. Nach 30min Stehen in der Dunkelheit bei 20 ~ C wird das tibersehiissige t tydrazin dutch 2 Tr. Formaldehyd gebunden. Dann werden die ttydrazone so lange mit ~ ther ex?~rahiert, bis dieser nicht mehr gelb gef/irbt ist. Die -A~herextrakte werden bei maximal 35~ zur Trockne eingedampft and die Rfickst~nde in 1 ml 0,2 m Natriumhydrogen- carbonatlSsung aufgenommen. Iqach Zugabe yon 1 ml Chloroform und Umrfihren wird zentrffugiert, lqeutrale Hydrazone u~d eventuell Hydrazinreste gehen in die Chloroformsehieht, wi~hrend die HydrogencarbonatlSsung die t tydrazone der ~-Ketos~uren enth~lt. Zur Papierehroma~ographie werder~ Keilstreifen naeh W. M~TmAS ~ aUS Whatman-Papier Iqr. 3 ~ verwendet, die vorher in Veronal- natrinmpuffer p~ 8,6 getaucht u~d an der Luf~ ge~roclmet werden. Die Hydrazone werden absteigen4 in den Flie~mitteln Isoamylalkohol-~thanol-Wasser (4:1:5) in 40 Std oder besser Amylalkohol-_~-thanol-Wasser (4:1:5) in 64 Std getrennt. Nach Trocknung an der Luft werden die schwach gelben, im UV-Licht deutlich rot- braanen Flecke der Hydrazone ausgesehnit~en und in einem Zentrffugenglas mit 4 ml 10~ NatrinmearbonatlSsung zerrieben. Der Brei wird seharf zentrffugiert und die Extinktion des ~bers~andes innerhalb yon 2 Std Spek~rophotometrisch bei 380 nm gegen einen Blindansatz gemessen, der in gleicher Weise ohne Zusatz yon Blu~filtrat gewonnen wird.

Biochim. biophysica Ac~a 13, 439 (1954). -- ~ Clin. ehim. Acta (Amsterdam) 6, 337--346 (1961). Univ.-Kinderklinik, Bern (Sehweiz). - - a Naturwissensehaften 41, 17 (1954); vgl. diese Z. 156, 120 (1957). A. N I V . ~

Fiir die Bestimmung yon Harnstoff in Blur modifiziert V. S. M ~ A R ~ : O ~ die )~ealction mit Natriumhypochlorit und Phenol in SalzsSure, die sehon yon ]3. A. RA~- KOVA~ 2 beniitzt wurde. -- Aus/i~hrung. 0,1 ml Blur wird mit 1--2 ml J~thanol nach 5 rain deproteinisiert, das Fil trat wird mit 96~ Athanol auf 10 ml verdiinnt, man gibt 0,5 ml 0,07 n Salzsi~ure, 0,5 ml 2,4~ 1Natriumhypochlorit- 15sung und 0,5 ml 10o/0ige PhenollSsung zu und erw~rmt 25 mm (nieht l~nger) auf 55--60 ~ C. Die entstandene griine F~rbung wird colorimetriseh mit einem photo- elektrischen Colorimeter mit blauem Filter ausgewertet. Werden Proteine nicht quantit~tiv ent~fernt, sind die L6sungen trfib und die F~rbung hat eine blaue TSnung. Diese StSrung bleibt aber bei dem Konzentrationsverh~ltnis Wasser- J~thanol = 3:20 in der LSsung vSllig aus.

1 Lab. Delo 7, l~r. 8, 6--8 (1961) [Russisch]. Medizin. Inst., Vitebsk (UdSSR). - - Sbornik n~uS. rabot Vitebsk. reed. inst. 1957, l~r. 8, 108. L. SOMMER

Die Bestimmung von Harnsto/] in Blur nach B.A. RA~KOVA~ 1 wird yon S. G. GAsA~ov 2 fiberpriift und modifizier~. (Siehe auch 3.) Bei Zimmertemperatur ist die Farbentwickhmg naeh 40--60 rain beendeb und die Reproduzierbarkeit~ der Resultate ist besser als in der WErme. Es werden zwei Varianten der l~ethode naeh I~A~KOVAlq angegeben. I . In 0,1 ml Blur werden die Froteine durch krEftiges Sehiitteln mit 2 ml 96~ Athanol ausgefi~llt, die LSsung wird dureh Filter- papier filtriert, das Probierglas mit 2 ml ~thanol ausgespiilt und zu dem Fil~rat werden 3 Tr. 0,1 n Salzs~ure, 0,5 ml 4~ IqatriumhypochloritlSsung und 0,5 ml 5~ PhenollSsung in der angegebenen Reihenfolge zugegeben, l~ach 40--60 mill eolorimetriert man die grfine L6sung hinter einem roten Filter. In der II. Variante geht man yon 0,2 ml mit 8 ml 96~ verd. Blur aus und verwendet

274 Bericht: Spezielle analytische Methoden Bd. 190

nach der Deproteinisierung 4 ml Filtrat. Auf die Ausspiilung des Probierglases wird so verzichtet. Ammoniak, der dieselbe l%eaktion bietet, st6r~ bei der Harn- stoffbestimmung erheblich. Die Natriumhypochloritl6sung wird aus Chlorkalk und Na~CO~ stets friseh hergestellt.

Sbornik nau6. rabot Vitebsk. reed. Inst. 1957, Nr. 8, 108. -- e Lab. Delo 7, Nr. 8, 8--11 (1961) [Russiseh]. Allunioninst. f. experimentelle Endokrinolog. (UdSSR). - - a M ~ : ~ E ~ K o , V. S. : Lab. Delo 7, Nr. 8, 6 (1961). L. S o ~ n ~

Aminos~uren. ~ . SA~CKA-OBAcZ ~ verwendet zur Trennung und nach- ]olgenden Identi/izierung ~omplizierter Aminos~iuregemische das Verfahren yon E. D. ~OFFAT und R. I. LYTL~ 2, bei dem die Trennung yon fiber 20 Aminos~uren gelingt. Als Entwicldungsreagens dien~ an Stelle yon ~Tinhydrin ein Reagens aus Ninhydrin und Kupfernitrat folgender Zusammensetzung: a) 50ml 0,2~ LSsung yon Ninhydrin in absol. Alkohol -~ 10 ml Essigs~ure ~- 2 ml 2,4,6-Colli- din. b) l~ LSsung yon Cu(NOa)2 �9 3H20 in absol. Alkohol. Die beiden LSsungen werden vor Verwendung im Verh~ltnis 25:1,5 gemischt. Der Vergleich der F~r- bungen und Intensit~ten erfolgt darm visuell. Die Entwieklung der Chromato- gramme erfolgt bei Raumtemperatur langsam (in 24--28 Std), bei einer Tempera- fur yon 100--110 ~ C kann die Entstehung der Farben in 1--2 min beendet sein. Die F~rbung ist am Lieht etwa 30 rain, im Dunkeln monatelang best~ndig. - - Eine Tabelle en%h~lt die ~arbreaktionen yon 26 Aminos~uren mit dem Reagens, die versehiedene Abstufungen der Farben yon Rot nach Blau darstellen. Das Reagens ist zwar 10mal unempfindlicher als das iibliehe ~inhydrinreagens, nach ehromatographiseher Trennung ist aber dutch die Farbversehiedenheiten eine bessere Un%erscheidung mSglich, wenn grSl~ere Meagen Ausgangsmaterial ver- wendet werden. Unter den Bedingungen der Chromatographie ist claim die Er- kennung aller Aminosguren m6glich, ws andere ninhydrinpositive Stoffe nich~ mitreagieren. -- Chromatographische Trennung. Zur p~pierehroma~ographi- sehen Trennung dienten 6 verschiedene L6sungsmittelsysteme, n~mlich: 1. n-Bu- ~anol-Essigs~ure-Wasser (4:1:5), 2. n-Butanol-Essigs~ure-Wasser (4:1:1), 3. see- Butanol- 3~ Ammoniak (150:60), 4. sek-Butanol-Ameisens~ure-Wasser (150: 30:20), 5. Phenol-Wasser (7:3) und 6. Propanol-Wasser (7:3). - - Im Harn, der an einem Ionenaustauscherharz entsalzt worden ist, lassen sich durch zweidimen- sionale Chromatographie mit L6sungsmittel 5 oder 6 auf Schl. &. Seh.-Papier 2043 b gute Trennungen durob_fiihren. Eine bessere Auftrennung aller Amins~uren ist aber mi~ den Systemen 3 und 4 (zweidimensional) m6glieh. Die M6glichkeiten der Trennung uncl Bes~immva-~g tier Aminos~ttren in biologischen fflii~igkeiter~ sind in einigen Abbildungen dargestellt.

1 Chem. analit. (Warszawa) 6, 419--428 (1961) [Polniseh]. (Mit engl. Zus.fass.) Lehrk. physiol. Chem., Mediz. Akad., Lublin (Polen). -- 2 Analyt. Chemistry 81, 926 (1959); vgl. diese Z. 178, 346 (1960). M. H ~ - ~ s

Die papierchromatographische Trennung und nachherige colorimetrische Bestim- mung von AmlnosSuren wird erneut yon ~ . N. ~EDVED:EVA, P. V. ~%7G]E~EV lllld V. P. SVKA 1 studiert, wobei die Eiwefl~stoffe vorher abgetrennt werden 2. 0,003 ml der Probel5stmg werden naeh dem Eintrocknen abs~eigencI ehromatographiert dureh mehrmaliges Laufenlassen eines Gemisches yon n-Butanol-Essigs~ure-Wa~ser (4:1:1) bei 20~ nach jeweiligem erneutem Troeknen des Papierstreffens. Die einzelnen DureM~ufe benStigen 5, 6, 12, 17, 19, 20, 24 Std, beim sechsten ~md siebenten Passieren l~uft die Flfissigkei~ aus dem Streifen heraus. Die Amino. s~uren werden in der folgenden Reihe getrenvLt: Cystin, Lysin, Histidin, Arginin, Asparagins&u~e, Serin, Glycin, Methionin, Glutaminsdure, Threonin, Alanin, 1Jrolin