Bestimmung von HbA1c im Blut INSTAND e.V. Referenzlabor Dr. Patricia Kaiser Universität Szeged Medizinische Fakultät 2009

Bestimmung Bestimmung von HbA1c im Blutvon HbA1c im Blut

INSTAND e.V. Referenzlabor

Dr. Patricia Kaiser

Universität Szeged Medizinische Fakultät

2009

HbA1cHbA1cINSTAND e. V.

Bedeutender Parameter im

• eine glykierte Form des Hämoglobins• spiegelt die mittlere Blutzuckerlage des letzten 4-6

Wochen wider

→ Therapieüberwachung→ Indikator für Therapieerfolg von Patient und

Diabetesklinik

Qualitätsmanagement des DiabetesQualitätsmanagement des Diabetes

Medizinische Analytik SS 2009

HämoglobinHämoglobinINSTAND e. V.


INSTAND e. V.

Amadori - UmlagerungAmadori - Umlagerung


HbA0 Val – His – Leu – Thr – Pro – Glu – Glu – Lys –

HbA1c Val – His – Leu – Thr – Pro – Glu – Glu – Lys –Gluc –

ß-Kette des Hämoglobinsß-Kette des HämoglobinsINSTAND e. V.


INSTAND e. V. Analyseverfahren für die glykierten HämoglobineAnalyseverfahren für die glykierten Hämoglobine

Verfahren Prinzip erfasste Fraktionen Markenname

Säulenchromatographie Ionenaustausch- HbA1a, HbA1b

(Makrosäule) chromatographie HbA1c

Mikrosäule Ionenaustausch- HbA1

chromatographie

HPLC Ionenaustausch- HbA1a, HbA1b, Variant II, Diamatchromatographie HbA1c HA8160, L-9100

FPLC Ionenaustausch- HbA1a, HbA1b,chromatographie HbA1c, Aldimin-Form

Affinitätschromatogrphie Phenylboratsäule Gesamt-Glyko GHb, IMx IIhämoglobin

Immunologische z.B. Immun- HbA1c TinaQuantVerfahren turbidimetrie HA1c Dimension

Referenzmethode HPLC-ESI-MS HbA1c

bzw. HPLC-CE


HbA1c Routine-MethodenINSTAND e. V.


HbA1cHbA1cMicrosäulenmethodeMicrosäulenmethodeINSTAND e. V.

In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut

Testprinzip:

• Herstellung eines Hämolysats aus der Blutprobe• Auftragen des Hämolysats auf Ionenaustauschersäule• Elution der HbA1c-Fraktion• Quantifizierung der HbA1c-Fraktion mittels Photometer bei 415 nm










Diagnostische Bedeutung:

HbA1c spiegelt die mittlere Blutzucker-Konzentration der letzten 6-8 Wochen widerund ist hiermit wertvoll für die Verlaufskontrolle von Patienten mit Diabetes Mellitus.Die HbA1c-Konzentration kann nach folgender Formel in die mittlere Blutglucose Konzentration (MBG) umgerechnet werden:

MBG (mg/dL) = 31,7 x %HbA1c – 66,1MBG (mmol/L) = 1,76 x %HbA1c – 3,67




Referenzbereiche: NGSP IFCC Microsäule (Biocon)

Stoffwechselgesunde 4.0 – 6.0 % 2.0 – 4.2 % 4.4 – 6.7 %Diab. Zieleinstellung 6.0 – 6.5 % 4.2 – 4.8 % 6.7 – 7.3 %Überwachungsbereich 6.5 – 8.0 % 4.8 – 6.4 % 7.3 – 9.1 %Therapiebedarf > 8 % > 6.4 % > 9.1 %

Für diagnostische Zwecke sind die HbA1c-Ergebnisse stets im Zusammenhang mit derAnamnese, der klinischen Untersuchung und anderen Untersuchungsergebnissen zu werten.


Einführung in dieEinführung in dieHPLC-MS AnalytikHPLC-MS Analytik

HPLC: High Pressure Liquid Chromatography= chromatographisches Trennverfahren

MS: Mass Spectrometry

= analytisches Detektionsverfahren

HPLC-MSHPLC-MS

Die HPLC-MS Technik ist ein Messverfahren, dass in den letzten Jahren in der Medizinischen Analytik zunehmend an Bedeutung gewonnen hat.Im Bereich der Laboratoriumsmedizin ermöglicht es mit höchster Präzision und Richtigkeit die Bestimmung von endogenen und exogenen Substanzen z.B aus Blut oderUrin. Durch seine gute Automatisierbarkeit wird es besonders bei hohem Probenaufkommen( „high throughput“) für die Therapieüberwachung (therapeutic drug monitoring) und z.B. fürdas Neugeborenen-Screening in Routinelabors eingesetzt.


“Farben schreiben” oder “zeichnen” (griech.)

• auf Filterpapier : Papierchromatographie • auf Kieselgel- beschichteten Glas: Dünnschichtchromatographie• über mit Kieselgel-gefüllte Säulen: Säulenchromatographie

ChromatographieChromatographie


Blattfarbstoffe in Lösung –

1. Grüne Blätter werden im Mörser zerrieben und danach in Alkohol aufgelöst – grüne Lösung

2. Grüne Lösung wird in eine Säule (gefüllt mit feinem Seesand) oder auf ein rundes Kreidestück gegeben

3. Einzelne Farbanteile verlassen wieder die Säule getrennt : gelbe, gelbgrüne, grüne, blaugrüne


Ein einfacher Versuch zur Darstellung des Prinzips der chromatographischen Säulen-Trennung:


Detektion:z.B.UV-, Fluoreszenz-, ECD-, oder MS- Detektor


Signal = „Peak“


Hochdruck-Flüssigkeits-ChromatographieHochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie

HPLC =High Pressure Liquid Chromatography

Medizinische Analytik SS 2009Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

Lösungsmittelflaschen

Pumpen

Probeninjektor

Detektor

Säule / Säulenofen

Abfall

Entgaser



Schritt 1:

Lösungsmittel wird von den Pumpen angesaugt (blaue und orange Linien) und zum Mischer gepumpt.



Schritt 2:

Gemisch wird zum Probengeber gepumpt (Ventil)



Schritt 3:

Probenschleife wird mit Lösungsmittelgemisch gefüllt


Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. ShimadzuMedizinische Analytik SS 2009

Schritt 4 a:

Nach Probennahme aus dem Gläschen wird die Probe in das Lösungsmittelgemisch injiziert (Ventil schaltet)



Schritt 4b:

Nach Probennahme aus dem Gläschen wird die Probe in das Lösungsmittelgemisch injiziert (Ventil schaltet)



Schritt 5:

Probe wird zur Säule transportiert



Schritt 6:

Probenbestandteile verlassen die Säule nacheinander und werden im Detektor angezeigt



MassenspektrometrieMassenspektrometrie

Mit Hilfe der Massenspektrometrie ist es möglicht, Komponentenin komplexen Mischungen zu identifizienen und quantifizieren. Zu diesem Zweck werden die Analyte ionisiert in die Gasphase überführt und nach ihrem Masse-zu-Ladungsverhältnis (m/z) sortiert detektiert.


Ionenquelle Massenanalysator

GC/MS: EI, CI QuadrupoleLC/MS: ESI, APCI, APPI Ion trapBiomolecules: MALDI Time of Flight

Triple Quadrupole

Aufbau eines Massenspektrometers

Medizinische Analytik SS 2009Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

Triple Quadrupole System

Ion detection

Ion filtering

Ion transport

Ion production

Ion filtering

Fragmentation



Ion production

Schritt 1: Ionen-Erzeugung im ESI-Interface


Electrospray Ionization (ESI)

Verbindet HPLC mit MS: Überführung des Analyten flüssig → gasförmig


Ion transport

Schritt 2: Ionen-Transport vom ESI-Interface ins MS



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Ionen-Bewegung zwischen den Quadrupol-Stäben


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+

Ionen-Bewegung zwischen den Quadrupol-Stäben



Selected Ion Monitoring (SIM)

Filter ionsScan ions

Quadrupole full scan

Verschiedene Scan-Verfahren (Modi)



TIC of +Q1: from Sample 3 (Soil 10) of Full scan in soil.wiff (Turbo Spray), Smoothed,... Max. 1.5e8 cps.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15Time, min

0.0

5.0e7

1.0e8

1.5e8

In

te

ns

it

y,

.

..

10.2

11.20.6 12.4

13.3 14.09.98.2 9.49.27.66.86.5

+Q1: 6.886 to 7.071 min from Sample 3 (Soil 10) of Full scan in soil.wiff (Turbo Spray... Max. 3.9e5 cps.

80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260m/z, amu

0.00

2.00e4

4.00e4

6.00e4

8.00e4

1.00e5

1.15e5

In

te

ns

it

y,

.

..

253

171 20210288

TIC of +Q1: from Sample 3 (Soil 10) of Full scan in soil.wiff (Turbo Spray), Smoothed,... Max. 1.5e8 cps.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15Time, min

0.0

5.0e7

1.0e8

1.5e8

In

te

ns

it

y,

.

..

10.2

11.20.6 12.4

13.3 14.09.98.2 9.49.27.66.86.5

+Q1: 6.886 to 7.071 min from Sample 3 (Soil 10) of Full scan in soil.wiff (Turbo Spray... Max. 3.9e5 cps.

80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260m/z, amu

0.00

2.00e4

4.00e4

6.00e4

8.00e4

1.00e5

1.15e5

In

te

ns

it

y,

.

..

253

171 20210288

XIC of +Q1 MI (68 ions): 253.2 amu from Sample 13 (1ng/ml Q in soil) of comparison ... Max. 6.7e4 cps.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Time, min

0.0

1.0e4

2.0e4

3.0e4

4.0e4

5.0e4

6.0e4

7.0e4

8.0e4

9.0e4

1.0e5

1.1e5

1.2e5

1.3e5

1.4e5

1.5e5

1.6e5

Inte

ns

ity, c

ps

11.1

7.1

9.6

0.6

Selected Ion Monitoring (SIM)

Quantifizierung einer bekannten Komponente über das Molekül-Ion und Frakmentierung

Identifizierung von unbekannten Komponenten(Information über Molekular-Gewicht)

Quadrupole full scan

Beispiel-Chromatogramme


Fragmentation


Schritt 4: Frakmentierung des Analyten (precursor ion) zu substanzspezifischen Bruchstücken (product ions)



Ion filtering

Schritt 5: Ionen-Filter nach Frakmentierung


Ion detection


Schritt 6: Detektion der heraus gefilterten Ionen


INSTAND e. V.


Referenzmethode nach IFCC

DCCT-Studie DDiabetes CControl and CComplication TTrial

Standardisierungder Vergleichsmessungen

NGSP - Goldstein NNational GGlycohemoglobin SStandardization PProgram

DCCT-Studie


NGSP - Goldstein

Internationale Vergleichbarkeit auf höchster Ebene der Richtigkeit

NGSP Kalibration nach Goldstein et al.

HPLC Methode mit

Kationenaustauscher- Säule

(BioRex 70)

• keine Trennung von HbA1c, HbF und carbamylierten Hämoglobinen

• Interferenz von HbA0 mit glykierten Hämoglobinen

• Interferenzen mit abnormen Hämoglobinen

→ 2.1 % Bias (abs.)


INSTAND e. V.




DCCT-Studie DDiabetes CControl and CComplication TTrial


NGSP - Goldstein NNational GGlycohemoglobin SStandardization PProgram

DCCT-Studie


NGSP - Goldstein



1. Hämolyse der Vollblut-Probe

2. Proteolyse des Hämolysats

3. HPLC-ESI-MS-Analyse

Meßprinzip:

Bestimmung der Ratio des glykierten zum nicht-glykierten ß-N- terminalen Hexapeptids vom Hämoglobin

ReferenzmethodeReferenzmethodeBestimmung von HbA1c im BlutBestimmung von HbA1c im Blut

mittels HPLC-ESI-MSmittels HPLC-ESI-MSnach IFCCnach IFCC

INSTAND e. V.




Proteolyse des HämolysatsProteolyse des Hämolysats

HbA0 Val – His – Leu – Thr – Pro – Glu – Glu – Lys –

HbA1c Val – His – Leu – Thr – Pro – Glu – Glu – Lys –Gluc –

INSTAND e. V.

Glu – Lys –Glu – Lys –

Glu-C




Meßprinzip:

Bestimmung der Ratio des glykierten zum nicht-glykierten ß-N- terminalen Hexapeptids vom Hämoglobin

ReferenzmethodeReferenzmethodeBestimmung von HbA1c im BlutBestimmung von HbA1c im Blut

mittels HPLC-ESI-MSmittels HPLC-ESI-MSnach IFCCnach IFCC

INSTAND e. V.


HPLC-ESI-MS-AnalyseHPLC-ESI-MS-Analyse

HPLC (Shimadzu)

Pumpe APumpe BMischkammer

AutosamplerSäulenovenDegasser Schaltventil

Controller

MS (Applied Biosystems)

API 4000 Triplequadrupol Massenspektrometer

ESI-Quelle: TurboVTM source mit TurboIon SprayTM probe

Software: AnalystTM

INSTAND e. V.


HPLC-ESI-MS-AnalyseHPLC-ESI-MS-Analyse

HPLC-Bedingungen:

Zorbax SB-CN, 5 µ 2.1 mm x 150 mm 50 °C, 2 µl

Eluent A: 0.025 % TFA in Wasser

Eluent B: 0.023 % TFA in Acetonitril

Gradient: 300 µl/min

Scan type: Q1 Multiple Ions

Masse: 348.3 amu (nicht-glykiertes Hexapeptid)

429.3 amu (glykiertes Hexapeptid)

Dwell time: 1 s

Temperatur: 500 °C

MS-Bedingungen:

INSTAND e. V.

Zeit [min] 0 3 9 13.5 13.6 17 17.1 23

% B 0 0 5 5 100 100 0 stop


HPLC-ESI-MS-AnalyseHPLC-ESI-MS-AnalyseINSTAND e. V.

ß-N-terminales Hexapeptid von HbA1c

m/z 429 amu

ß-N-terminales Hexapeptid

von HbA0

m/z 348 amu

LC-ESI-MS Chromatogramm einer Hämolysat-ProbeLC-ESI-MS Chromatogramm einer Hämolysat-Probe

ReferenzmethodenReferenzmethoden

• Rückführbarkeit auf primären StandardRückführbarkeit auf primären Standard

-- SI EinheitenSI Einheiten

-- definierte Reinheitdefinierte Reinheit

-- definierte Messunsicherheitdefinierte Messunsicherheit

• Vergleichbarkeit auf internationaler EbeneVergleichbarkeit auf internationaler Ebene

-- Netzwerk (JCTLM, IFCC HbANetzwerk (JCTLM, IFCC HbA1c1c))


y = 1,0289x + 0,0003

R2 = 0,9999

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18

Ratio Konz. [HbA1c/HbA0]

Rat

io a

rea

Hb

A1c

/Hb

A0

HPLC-ESI-MS-AnalyseHPLC-ESI-MS-AnalyseINSTAND e. V.

HbAHbA1c1c Kalibrationskurve nach IFCC Kalibrationskurve nach IFCC


INSTAND e. V.

Internationale Vergleichsmessung derInternationale Vergleichsmessung der

IFCC Working Group on HbA1c StandardisationIFCC Working Group on HbA1c Standardisation

HbA1c-Referenzlabor

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

HbA

1c [

%]

2

4

6

8

10

12

14

Probe 1Probe 2Probe 3Probe 4Probe 5raw meanraw mean +/- 4 %


Internationale Vergleichsmessung derInternationale Vergleichsmessung der IFCC Working Group on HbA1c StandardisationIFCC Working Group on HbA1c Standardisation

HbA1c-Referenzlabor

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

HbA

1c [

%]

7,0

7,2

7,4

7,6

7,8

8,0

mean P1-P5overall meanoverall mean +/- 2.5 %


sam

ple

B [%

]

sample A [%]

HbA1c

INSTAND e. V.

Ringversuch 2005 HbARingversuch 2005 HbA1c1c

INSTAND e. V.INSTAND e. V.

ProbeProbe Zielwert Zielwert [µg/L][µg/L] VK [%]VK [%] Bewertungs- Bewertungs-

grenzen [µg/L]grenzen [µg/L]Mittelwert Mittelwert

[µg/L][µg/L] VK [%]VK [%] Bestehensquote Bestehensquote [%][%]

AA 5.525.52 2.072.07 4.41 - 6.634.41 - 6.63 5.595.59 8.28.2 97.297.2

BB 10.510.5 2.192.19 8.39 -12.708.39 -12.70 10.510.5 6.56.5 98.898.8

Referenzmethode Routinemethoden

HbA1c Messergebnisse nachHbA1c Messergebnisse nach

IFCC Referenzmethode und NGSP-GoldsteinIFCC Referenzmethode und NGSP-GoldsteinINSTAND e. V.

IFCC (%HbA1c)

NG

SP

(%

HbA

1c)

2 4 6 8 10 12

12

10

8

6

4

2

NGSP = (0.915 * IFCC) + 2.15


INSTAND e. V.

HbA1c Einheit

NGSPNGSP abgeleitet: %%

IFCC abgeleitet: ab 2009 mmol/mol

Darstellung von HbA1c - Werten

bis 2008 %


INSTAND e. V.

Umrechnung

NGSP Werte [%][%] in IFCC Werte [mmol/mol]

IFCC [mmol/mol] = (NGSP [%][%] - 2.15) / 0.0915

“Master Equation”


INSTAND e. V.

HbA1c NGSP [%] HbA1c IFCC [mmol/mol]new

4.0 205.0 316.0 427.0 538.0 649.0 7510.0 86

Referenz-Bereich:

4.0 – 6.0 % 20 – 42 mmol/mol

Darstellung von HbA1c - Werten


Vielen Dank

für Ihre Aufmerksamkeit

INSTAND e. V.

ß-Kette von verschiedenen ß-Kette von verschiedenen Hämoglobinen (N-Term. AA 1-9)Hämoglobinen (N-Term. AA 1-9)

• Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Ser HbA

• Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys-Ser HbS

• Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys-Ser HbC

• Gly-His-Phe-Thr-Glu-Glu-Asp-Lys-Ala HbF

1 3 6 9 AA

INSTAND e. V.

INSTAND e. V.

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