Gefährden Botox Bakterien niedersächsische Biogasanlagen? · unbedingt pathogen sein, ihre Gene könnten fehlen oder inaktiv bleiben. Prof. Dr. Christoph Tebbe * – Thünen Institut

Prof. Dr. Christoph Tebbe* – Thünen Institut für BiodiversitätVortrag an der TiHo H, Nds. Biogasforum

12.11.2014

*Email:[email protected] 1

Gefährden Botox‐Bakterien niedersächsische Biogasanlagen?Biogasanlagen?

Thünen Institut für Biodiversität, Braunschweig

12.11.2014Seite 0 Clostridium botulinum in Biogasanlagen?

Tierärztliche Hochschule Hannover

Hannover, den 12.11.2014

Verbundprojekt

„Abundanz und Vielfalt von Clostridien in landwirtschaftlichen Biogasanlagen unter besonderer Berücksichtigung von Clostridium botulinum“

• gefördert durch Niedersächsische Ministerium für Ernährung, Landwirtschaft, Verbraucherschutz und Landesentwicklung

• Partner:Thünen Institut für Biodiversität, Braunschweig, Dr. Anja Dohrmann, Prof. Dr. Christoph TebbeHAWK Fakultät Ressourcenmanagement, Göttingen, Ing. Meike Waltz, Prof. Dr. Löwen

• Dr. Anja Dohrmann, M. Eng. Meike Walz



• Zeitraum: 1.09.2011 – 31.12.2014

• Verbesserte Nachweisgrenzen – erhöhte Sicherheit!


12.11.2014


Warum Clostridien?

anaerobe Bakterien

bilden Sporen – überall verbreitet

häufig dominante Bakterien in Biogasanlagen

zersetzen Proteine und Kohlenhydrate (Hydrolyse & Säurebildung)

bilden Acetat als Gärungsprodukt



Acetat: wichtige Vorstufe für Methanbildung

einige Clostridien bilden Gifte, andere sind pathogen

Vielfalt der Clostridien

Sammelbegriff für viele Bakterien

ca. 152 gültige Arten

ca. 72 Arten fallen in das sog. Cluster I, d.h. Clostridium sensu stricto

Cluster I beinhaltet die pathogenen Clostridien


Tierärztliche Hochschule HannoverAlle Clostridien


12.11.2014


Vielfalt der Clostridien

Sammelbegriff für viele Bakterien

ca. 152 gültige Arten

Cluster I

ca. 72 Arten fallen in das sog. Cluster I, d.h. Clostridium sensu stricto

Cluster I beinhaltet die pathogenen Clostridien

Wie hoch ist ihr Anteil in Biogasanlagen?


Tierärztliche Hochschule HannoverAlle Clostridien

Clostridien Abundanz in einer Praxis‐Anlage

Neue Erkenntnisse dank Metagenomik

0,3%g

75,0%

24,7% Bacteria

Clostridia

Cluster I

Direkt extrahierte DNA aus Biogas‐

Reaktoren

DNA direkt sequenziert (alle Gene)

DNA‐Sequenzen mit Bioinformatik

identifiziert und nach Verwandtschaft



Jaenicke et al., 2011, PLoS One

identifiziert und nach Verwandtschaft

geordnet …

Ein Viertel aller Gene kamen von Clostridien,

aber nur 0,3% aus Cluster I


12.11.2014


Clostridium botulinum

verursacht Botulismus durch Neurotoxine

kann als Sporenbildner fast überall vorkommen:

In Böden, Sedimenten, Pflanzenresten, …

… in Tierexkrementen, Rinder‐ oder Schweinegülle

Sporen sind inaktiv – Auskeimung bei „guten“ Bedingungen



C. botulinum ist nicht eine Art, sondern ein Sammelbegriff für Neurotoxin‐bildende „Arten“ im Cluster I

Clostridium botulinum

BoNT‐Symptome (Einzelfälle)

Clostridium butryricumClostridum baratii

Gruppe IINicht proteolytischTyp B, E und F

Cluster I

Gruppe IIINicht proteolytischTyp C und D

Gruppe IV Sieben BoNT Typen



Typ G

Gruppe IProteolytischTyp A, B und F

Sieben BoNT TypenA, B, C, D, E, F, G


12.11.2014


Nachweis von Clostridium botulinum

Nachweis über Mause‐Toxizitätstests, z.B. durch RIPAC Labor, Potsdam

Für die umfangreiche Untersuchungen von Umweltproben ethisch nicht vertretbar

Kulturelle Verfahren in Nährmedien technisch aufwendig und teuer: Anaeroben‐Kammer, Sicherheitslabor, etc.



Alternative: Molekulare Verfahren – kein Risiko, Hochdurchsatz, Identifizierung verdächtiger Proben …

Clostridium botulinumEinbindung molekularer Nachweisverfahren

Extraktion von DNA aus Substraten und Gärresten ‐ PCRdann PCR, d.h. Vervielfältigung von Genen

Analyse von Clostridium Cluster I

16S rRNA Gene Cluster I vgl. m. XIVa Nachweis von Toxin‐Genen (A, E, B, F – nicht C, D, G)



Bei Verdacht auf C. botulinum: BoNT Nachweis im Mäuse‐Tests


12.11.2014


Projektaufbau

SubstrateRinder und Schweinegülle, Hühner‐T k k t M i d G fl Sil

Cluster I, Cluster XIVa,

pathogene Clostridien

Trockenkot; Mais oder Ganzpflanzen‐Silage

Fermentation7 Batch‐Versuche, 3 Versuchen mit Quasi‐kontinuierliche Anlagen im Technikum9 Praxis‐Anlagen in Niedersachsen

Was geht rein?

16S rRNA Gene

qPCR,

DNA Sequenzierung

BoNT‐Gene



Nachgärungbei 4 Praxis‐Anlagen

g

Was ist drin?

Was geht raus?

Substrate

Substrat Wdh. Anteil an den Gesamten Bakterien

(16S rRNA Gene, qPCR)

Cluster XIVa Cluster I

Rindergülle (RG) 16 7 1Rindergülle (RG) 16 7 1

Schweinegülle (SG) 12 4 14

Maissilage (MS) 19 2 1

Ganzpfl.silage (GPS) 5 2 2

Zuckerrüben Silage (ZR) 2 0,005 0,03

Hühnertrockenkot (HTK) 6 0,05 0,05

Clostridium Cluster XIVa und I sind überall

weniger in ZR und HTK



weniger in ZR und HTK

zwischen beiden Clustern gibt es keine

quantitative Beziehung


12.11.2014


BatchversucheWichtige Ergebnisse

Fermentation unter standardisierten

Bedingungen

Gleiche Substrate unterschiedlicher Herkunft,

verschiedene Mischungen nach EEG2012,

Hühnertrockenkot

Cluster I niemals mehr als 10% der Bakterien

Abundanz variiert in Abhängigkeit der

Substrate

Batch‐Fermentationen bei der HAWK Göttingen



Substrate

Im Vergleich zu den Ausgangsmischungen keine

Zunahme von Cluster I in der Fermentation

Mit Zuckerrübe signifikant mehr Cluster I

als beim Einsatz von Rindergülle

Quasi‐Kontinuierliche Anlagewichtige Ergebnisse

kontrollierte Variation der Prozessbedingungen

3 Parallelen

Mischungen: MS+HTK, MS+ZR, RG+MS

Überlastungstest

Cluster I: Abundanz variiert nach Substraten

MS+HTK mit Störung*: Zunahme von Cluster IDNA Sequenzierungen in Vorbereitung



DNA‐Sequenzierungen in Vorbereitung

MS+ZR: Abnahme von Cluster I

MS+RG: Cluster I konstant bei ca. 20%


12.11.2014


Praxis‐Anlagen aus NiedersachsenVorstellung der Anlagen (anonym), Substratvielfalt, Umfang der analysierten Proben

BiogasanlageSubstrate

Nachwachsende Rohstoffe Exkremente Säuger Exkremente Geflügel Segment

Anlage

Maissilage

Ganzpflanzenlilage

Futterreste

Zuckerrübe

Rindergülle

Rinderm

ist

Schweinegülle

Sweinemist

Rindergülle,

Schweinegülle

Schweinemist,

Rinderm

ist

Hühnertrocken

kot

Legehennenkot

Hühnertrocken

mist

Ferm

enter

Nachgärer

Gärrestlager

P1 1 5 1 2 0

P2 1 5 5 1

P3 1 0 4 0 33

P4 0 4 1 0 0 74 21



P5 0 1 0 1 13 7 19

P6 0 3 6 25 6 4

P7 0 0 3 8 6 1

P8 0 5 2 100 62 18

P9 1 0 3 11 3 2

Auswirkung von Rindergülle?Praxis‐Anlagen P1 und P2

Baugleiche Anlagen mit zwei Fermentern in Reihe (A und B)

Anlage 1: Pflanzen‐Silage (MS + WPS) plus Ringergülle (cattle manure; CM) A l 2 MS WPSAnlage 2: nur MS + WPS

A A BB Clostridium Cluster XIVa und I immer dabei

Cluster XIVa besonders hoch in Rindergülle

Immer Abnahme von A zu B

In B: Cluster I > 1 % der gesamten Bakterien



Anlage 1 Anlage 2


12.11.2014


Clostridien Vielfalt mit BioinformatikPraxis‐Anlagen P1 und P2: Hochdurchsatz DNA Sequenzierung

Spezifischer Nachweis für Clostridien (PCR)

ca. 500.000 rRNA Gene von Clostridium Cluster I sequenziert

Diese teilen sich auf ca. 2.500 „Arten“ (OTU) auf

300 Arten so dominant, dass sie > 98 % der gesamten Clostridien repräsentierten

keine eng verwandt mit C. prefringens, C. tetani oder C.chauvoei – aber …

einige OTU mit enger Verwandtschaft zu C. botulinum



C. botulinum aus P1 und P2?

insgesamt 174 Sequenzen

entspricht 0,04 % aller Cluster I Sequenzen

150 in Maissilage (Gruppe III)*

4 Sequenzen in Rindergülle (Gruppe II)*

17 Sequenzen aus Fermentern (Gruppe I)*

2 Sequenzen (MS, Ferm.) aus Gruppe IV

3 Proben mit C. botulinum Sequenzen zum



3 Proben mit C. botulinum Sequenzen zum

BoNT Test (Ripac Labor)

direkt und nach Anreicherung

keine Toxizität ‐ kein C. botulinum!


12.11.2014


Clostridium botulinum (16S rRNA Gene)

In Praxisanlagen – Analysen noch nicht abgeschlossen



Direkter Nachweis von Botulinum‐Toxin‐Genen


Praxisanlagen: hier BoNT A und EImmer negativ (< 0,3 Genkopien ng DNA)

Anlage

Maissilage

Ganzpflanzenlilage

Futterreste

Zuckerrübe

Rindergülle

Rinderm

ist

Schweinegülle

Sweinemist

Rindergülle,

Schweinegülle

Schweinemist,

Rinderm

ist

Hühnertrockenkot

Legehennenkot

Hühnertrockenmist

Ferm

enter

Nachgärer

Gärrestlager

P1 1 5 1 2 0

P2 1 5 5 1

P3 1 0 4 0 33




P3 1 0 4 0 33

P4 0 4 1 0 0 74 21

P5 0 1 0 1 13 7 19

P6 0 3 6 25 6 4

P7 0 0 3 8 6 1

P8 0 5 2 100 62 18

P9 1 0 3 11 3 2


12.11.2014



Praxisanlagen: hier BoNT FImmer negativ (< 3 Genkopien ng DNA)

Direkter Nachweis von Botulinum‐Toxin‐GenenAnlage

Maissilage

Ganzpflanzenlilage

Futterreste

Zuckerrübe

Rindergülle

Rinderm

ist

Schweinegülle

Sweinemist

Rindergülle,

Schweinegülle

Schweinemist,

Rinderm

ist

Hühnertrockenkot

Legehennenkot

Hühnertrockenmist

Ferm

enter

Nachgärer

Gärrestlager

P1 1 5 1 2 0

P2 1 5 5 1

P3 1 0 4 0 33




P3 1 0 4 0 33

P4 0 4 1 0 0 74 21

P5 0 1 0 1 13 7 19

P6 0 3 6 25 6 4

P7 0 0 3 8 6 1

P8 0 5 2 100 62 18

P9 1 0 3 11 3 2

Zusammenfassung

Clostridien aus Cluster I in allen Substraten und Biogas‐Anlagen

Rindergülle hat keinen besonders hohen Beitrag zur Cluster I Abundanz Rindergülle hat keinen besonders hohen Beitrag zur Cluster I Abundanz

Im Vergleich zu anderen Clostridien, hat Cluster I eher eine untergeordnete Rolle

Mit molekularen Nachweisverfahren können Proben zum definitiven Nachweis von C. botulinum effektiv ausgewählt werden (und Mäuse geschont werden)

Einige Proben im Projekt wiesen Sequenzen von C. botulinum auf – im Mäusetoxizitätstest zeigten dies bisher analysierten Proben aber keine Symptome

Das heißt: Bakterien mit identischen 16S rRNA Genen von C botulinummüssen nicht



Das heißt: Bakterien mit identischen 16S rRNA Genen von C. botulinummüssen nicht unbedingt pathogen sein, ihre Gene könnten fehlen oder inaktiv bleiben.


12.11.2014


Schlussfolgerungen

Insgesamt weist kein Ergebnis des Projektes auf Risiken durch eine mögliche Anreicherung und damit Gefährdung von Biogas‐Anlagen oder deren Substrate und Gärungsprodukte durch C. botulinum

Störungen des Biogasprozesses können die Abundanz von Cluster I erhöhen

Ob damit auch eine Zunahme von C. botulinum verknüpft ist, wird zur Zeit untersucht

Dank an Anja Dohrmann, Meike Walz, Astrid Näther, Karin Trescher, BrittaMüller nd Jana Usarek



Britta Müller und Jana Usareksowie an das Niedersächsische Ministerium für Landwirtschaft

für die finanzielle Unterstützung

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Gefährden Botox Bakterien niedersächsische Biogasanlagen? · unbedingt pathogen sein, ihre Gene könnten fehlen oder inaktiv bleiben. Prof. Dr. Christoph Tebbe * – Thünen Institut