04.05.2009

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PicornavirenHuman Rhinovirus

5.5.09 / Dagmar Kuhn

Human RhinovirusDagmar Kuhn

Inhalt

1 Einleitung2 A fb d F kti d H Rhi i2 Aufbau und Funktion des Human Rhinovirus3 Die Polyproteinsynthese4 Die 3C Protease und ihre Funktionen5 Zusammenfassung6 Glossar

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1. Einleitung

• Der Name Rhinovirus kommt vom griechischen (rhin) und bedeutet „Nase“.

• Die Gattung Rhinovirus mit insgesamt 117 bis heute beschriebenen Serotypen gehört zu der Familie der Picornaviren.

• Das weltweit vorkommende Human Rhinovirus HRV ist ein positives ssRNA Virus, welches beim Menschen Erkältungen verursacht.

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g

• Rhinoviren sind nackte (unbehüllte) Viren mit einem sehr kleinen Durchmesser von 28-30 nm und einer Genomgrösse von 7,2-8,4 kb.

http://www.wadsworth.org/divisions/infdis/virology/rhinovirus.htm

2. Aufbau und Funktion des Human Rhinovirus

• Kubische Symmetrie, ikosahedrale Struktur• Zelluläre Faktoren unterstützen den Zusammenbau des RhinovirusZelluläre Faktoren unterstützen den Zusammenbau des Rhinovirus• Selfassembly, das abhängig ist von der Konzentration der Komponenten• Das HRV besteht aus dem Capsid (VP1, VP2, VP3, VP4) und der ssRNA(+)• Das HRV gehört in die Gruppe IV (nach Baltimore)→ ssRNA(+),wirkt direkt als mRNA

5.5.09 / Dagmar Kuhn 4http://www.expasy.ch/viralzone/all_by_species/33.html

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• 1. HRV bindet an Wirtsprotein → Endozytose.

• 2. Uncoating und gleichzeitiges Freilassen der viralen

l i t i h RNA d hpolycistronischen RNA durch Porenbildung in Wirtsmembran.

• 3. Abschalten der Wirtstranslation durch Spaltung des translation initiation factors: eIF4G.

• 4. Replikation der viralen RNA im ER→ ssRNA(-) → ssRNA(+).

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• 5. Synthetisierte RNA(+) gelangt ins leere hergestellte Capsid.

• 6. Die Wirtszelle lysiert und die Viren gelangen heraus.

Allgemeine Virologie, Virologiekurs, M. Wegmüller

3. Die Polyproteinsynthese• Das HRV Genom (nur ein ORF) wird als Polyprotein translatiert und durch

enzymatische Spaltung entstehen drei Fragmente (P1, P2, P3).• Vorläufer-Proteine bilden stabilere Aggregate als gespaltene Proteine.

Anstelle eines 5‘

Internal ribosome entry site: erlaubt direkte Translation

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Anstelle eines 5 CAP

http://www.expasy.ch/viralzone/all_by_species/33.html

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4. Die 3C Protease und ihre Funktionen

• Die 3C Protease schneidet virale Proteine an der Gln/Gly Stelle (Vorläufer Polyprotein=243kDa) und aktiviert diese so.

• Nachdem das Polyprotein hergestellt ist, wird es von der 2A Protease in P1(Capsid), P2 und P3 (Replication) Fragmente geschnitten. Die 2A Protease schneidet ihren eigenen Aminoterminus.

• Proteasen 3C und 3D (RNA Polymerase) bilden

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(RNA Polymerase) bilden einen Komplex, was die Reaktion schneller ablaufen lässt und schneiden die Fragmente endogen in weitere Peptide.→ hochspezifischer Prozess! (drug target)

Gln/Gly-Schnittstellen

http://www.microbiologybytes.com/virology/Picornaviruses.html

Protease 2A

• Die hergestellten Proteine werden schon während der Translation der anderen mRNAs von der 2A und 3C Protease gespalten.

• Diese Spaltung der 3C Protease erfolgt überall dort, wo sich eine Gln/Gly-Stelle befindet.

HRV14

Reifung des Provirions durch eine noch unbekannte Wirtsprotease

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• Auch an der Herstellung des Capsids ist die 3C Protease beteiligt und erst zuletzt wird das leere Capsid mit +ssRNA gefüllt.

http://www.microbiologybytes.com/virology/Picornaviruses.html

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• HRV 3C Protease hemmt die Transkription und Translation der Wirtszelle durch:

- Inaktivierung der Polymerase I, II oder III.- Schneiden des an die TATA-Box bindende Protein TBP (Untereinheit des Transkriptionsfaktors IID).

• HRV führt beim Wirt zum Zelltod / Lyse:

- Die 3C Protease prozessiert virale Proteine die die Wirtszelle so verändern dass sie in den- Die 3C Protease prozessiert virale Proteine, die die Wirtszelle so verändern, dass sie in den Zelltod geht.

• Zudem wird virale mRNA von der 3C Protease gebunden und die Replikation dadurch reguliert:

- Die 3C Protease bindet als Komplex mit RNP (Ribonukleoprotein) und p36 (Ribosom-Zellprotein) an das 5‘ Ende der positiv-strängigen RNA. Die Bindungsstelle ist 126 Nukleotide lang und hat die Form einer Kleeblattstruktur. Durch die Bindung des Komplexes wird die Replikation aktiviert und es werden positiv-strängige RNAs hergestellt.

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5. Zusammenfassung• Rhinoviren sind kleine, unbehüllte ssRNA(+) Viren, die beim Menschen

Erkältungen verursachen.

• Das Genom der Rhinoviren ist polycistronisch und wird als riesiges Polyprotein translatiert.

• Bei der enzymatischen Prozessierung, die noch während der Translation erfolgt, hat die 3C Protease wichtige Funktionen.

• Die 3C Protease schneidet überall dort wo sich eine Gln/Gly Stelle befindet

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• Die 3C Protease schneidet überall dort, wo sich eine Gln/Gly Stelle befindet und aktiviert so die viralen Proteine.

• Die wichtigen Funktionen der translatierten 3C Protease zeigt ihre zentrale Bedeutung für das Virus.

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6.Glossar• Cordingley M.G. et al. Substrate Requirements of Human Rhinovirus 3C Protease for Peptide

Cleavage in Vitro* (1990) J.Biol. Chem. 265, 9062

Walker P A et al Sequence and Structural Determinants of the Interaction between the 5‘• Walker P.A. et al. Sequence and Structural Determinants of the Interaction between the 5 -Noncoding Region of Picornavirus and Rhinovirus Protease 3C* (1995) Biotech. 24, 14510

• Walker P.A. et al. Human Rhinovirus-14 Protease 3C Binds Specifically to the 5‘- Noncoding Region of the Viral RNA (1993) Biotech. 34, 25735

• Prof. Dr. E. Peterhans, Allgemeine Virologie-Vorlesungsunterlagen

• http://www.infektionsnetz.de/VirenRhinovirus.phtml

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Vaccinia VirusE3L (ds-RNA binding protein)E3L (ds RNA binding protein)

Björn Hagmann 2009

InhaltTaxonomie

Virus Aufbau

Replikation

E3L

Björn Hagmann 2009

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Familie:Poxiviridae

Unterfamilie:Entomopoxvirinae

Unterfamilie:Chordopoxvirinae

Genus: Genus:

Ortopoxvirus

Parapoxvirus

Avipoxvirus

Capripoxviren

VariolaVacciniaEntomopoxvirus A - C

Pockenviren der:Käfer, Schmetterlinge,

Fliegen, Mücken ....

Lepripoxvirus

Suipoxvirus

Yatapoxvirus

Björn Hagmann 2009

300 nm × 200 nm × 100 nm

Vacciniavirus:189‘122 bp dsDNAKeine bekanten „origins“Geschlossene EndenGeschlossene Enden

Björn Hagmann 2009

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HinDIII

Björn Hagmann 2009

1. uncoating

2. uncoating

50%Golgi

Actin Fusion

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E3L – dsRNA binding protein25 kDa

Frühe Phase

Bindet an dsRNA-Strukturen und verhindert dieAssoziation mit zellulären Enzymen

Björn Hagmann 2009

2‘,5‘ OligoadenylatsynthetaseAktivierung durch dsRNA

ProteinkinaseAutophosphorylierungnach Bindung von dsRNA

Degradation viraler und zellulärer RNA

Translationsinitationsfaktorinhibiert Translation

Björn Hagmann 2009

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E3L-siRNA:Replikation der Vaccinia Viren wird ≈90% inhibiert

Björn Hagmann 2009

Fragen?

Björn Hagmann 2009

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LiteraturHarrison S. C. et al., 2004, Discovery of antivirals against smallpox, PNAS;101:11178-11192

Dave R. S. et al. 2006, siRNA targeting Vaccinia virus double-stranded RNA binding protein (E3L) exerts antiviral effects, Virology; 348(2006) 489-497

Romano P. R. et al., 1998, Inhibition of double-stranded RNA-Dependent Protein Kinase PKR by Vaccinia Virus E3: Role of Complex Formation and the E3 N-Terminal Domain, Molecular and Cellular Biology; 18,12 7304-7316

Hruby D. E. et al., 1978, Vaccinia Virus Replication, J. o. Virology; 29,2 705-715

Smith G. L., 1999, Vaccinia virus immune evasion, Immunology Letters; 65 55-62gy

Modrow S. et al., 2003, Molekulare Virologie, Spektrum; Akademischer Verlag

Björn Hagmann 2009