Genetik Praktikum

Dienstag

Genetisches Praktikum 2010 (20160)

Genetik Praktikum

Dienstag

Genetisches Praktikum 2010 (20160)

Genetik Praktikum

Praktikumsversuche I. Allgemeines

A. Plasmid-Curing B. F-Plasmid-Nachweis C. Komplementations-Test mit rII-Mutanten des Phagen T4 D. PCR-Fingerprint mittels STR-Analyse

II. Methoden

A. Titerbestimmung bei Bakterienkulturen B. !-Galaktosidase-Test

III. Mutagenese und DNA-Reparatur A. Isolierung und Identifizierung von Auxotrophie-Mutanten B. Nachweis der Transposon-Mutagenese des Plasmids pTS115 C. Ames-Test

IV. Projekt: Klonierung eines Genfragments

A. PCR B. Gelelektrophorese C. Ligation D. Elektrotransformation E. Plasmid-Präparation

Plasmide

•! Fertilitäts(F)-Plasmide: enthalten nur tra-Gene. Einleitung der Konjugation.

•! Resistenz(R)-Plasmide: enthalten Resistenzgene gegen Antibiotika oder Gifte

•! Col-Plasmide: enthalten Gene für Colicine (Proteine, die für andere Bakterien toxisch sind)

•! Degradationsplasmide: ermöglichen den Abbau von ungewöhnlichen Substanzen, (z.B. Toluol oder Salicylsäure).

•! Virulenz-Plasmide: machen ein Bakterium zu einem Krankheitserreger (Yersinia pestis)

•! Ti-Plasmide (Tumor inducing): werden von bestimmten Bakterien (Agrobacterium tumefaciens) auf Pflanzen übertragen. Dort verursachen sie die einzige bekannte Krebserkrankung in Pflanzen.

I.A Plasmid curing

Plasmide müssen repliziert werden. Ohne Replikation gehen sie verloren.

Multi-copy Plasmide: können mehr als einmal pro Zellzyklus repliziert werden. Spezielle Segregationsfunktionen für Verteilung während der Zellteilung nicht unbedingt nötig.

Single-copy Plasmide: nur einmal repliziert pro Zellzyklus. Segregationsfunktionen wichtig

Plasmide

Konjugation

tra Gene: (transfer), z.B. Pilin-Gen » Ausbildung eines Sex-Pilus (F-Pilus)

Übertragung von Teilen des Genoms von einer Donor- in eine Rezipientenzelle

Fertilitäts Faktor F: F-: Rezipient, F+: Donor

I.A Plasmid curing

Übertragung des F-Plasmids bei der Konjugation

Donor (F+)

Rezipient (F-)

oriT: Replikationsursprung, Kopie eines Einzelstrangs nach dem ‚rolling circle‘ Mechanismus

Cytoplasmabrücke

Kopie gelangt über Pore in den Rezipienten, wo der Einzelstrang zur Doppelhelix ergänzt wird

» F- Stamm wird zu F+

I.A Plasmid curing

in seltenen Fällen kann ein F+ Stamm sich verändern:

•! ca. 1000 x höhere Rekombinationsrate nach Konjugation mit F-

» Hfr-Stamm: high frequency of recombination

•! nach Konjugation wird F- i.d.R. nicht zu F+

» F-Plasmid im Hfr-Stamm über cross over ins Chromosom integriert (Campbell-Integration)

» ausgehend vom oriT wird bei der Konjuagtion das gesamte Chromosom übertragen

Übertragung des F-Plasmids bei der Konjugation

I.A Plasmid curing

Warum high frequency of recombination?

! F-Plasmid und Genom haben keine Gene/Marker gemeinsam, die ausge- tauscht werden könnten (Ausnahme: F'-Plasmid, s.u.)

! Transfer von genomischer DNA zusätzlich zu F+-Plasmid DNA sehr selten; nur nach zufälliger Integration des Plasmids ins Genom

! Hfr Zellen transferieren bei Konjugation immer genomische DNA » Empfängerzelle wird dadurch teilweise diploid = merozygot

! durch Doppelcrossover zwischen Donor- und Empfänger-DNA kann es zu Rekombination kommen

I.A Plasmid curing

Vergleich Konjugation F+ bzw. Hfr mit F- I.A Plasmid curing

Hfr und F- Stamm werden gemischt, Konjugation wird nach verschiedenen Zeiten durch

intensives Mixen physikalisch aufgehoben.

Ausplattierung auf verschiedenen Testmedien (z.B. Auxotrophietest)

Welche Auxotrophie wird nach

welcher Zeit aufgehoben?

» Bestimmung der Reihenfolge

der Gene auf dem Chromosom

(Abstand in Minuten)

Genkartierung durch Paarungsunterbrechung

I.A Plasmid curing

Das F-Plasmid integriert an verschiedenen Stellen des E. coli Chromosoms über homologe Rekombination

! oriT wird als erstes übertragen, die Fertilitätsfaktoren (tra-Gene) als letzte

I.A Plasmid curing

•! Fluoreszenzfarbstoff

•! Wieso zum plasmid curing geeignet?

» interkaliert mit seinem planaren Ringsystemen zwischen Basen von DNA

» stört Replikation der Plasmid-DNA

Acridinorange

•! Wieso wird Replikation des Bakterienchromosoms nicht verhindert?

» Plasmid-DNA stärker superspiralisiert

» Acridinorange bindet bevorzugt an Plasmid DNA

I.A Plasmid curing

Punktmutationen: Substitution von Basen

Purin Pyrimidin

Transition: Austausch von Basen gleicher chemischer Kategorie (A ! G / G ! A)

Transversion: Austausch von Basen unter- schiedlicher chemischer Kategorie (C ! A / C ! G / T ! A / T ! G und umgekehrt)

Konsequenz: neutrale Mutation missense Mutation nonsense Mutation

III.C Ames Test

Art der Mutation

Wildtyp Codons bestimmen Wildtyp Protein

keine Mutation

Auswirkung der Mutation

Transition oder

Transversion

Insertion oder

Deletion ‚Indel‘

neutrale (stille)

Mutation

geändertes Codon bestimmt gleiche Aminosäure

missense Mutation

(konservativ)

geändertes Codon bestimmt chemisch ähnliche Aminosäure

missense Mutation

(nicht konservativ)

geändertes Codon bestimmt chemisch unähnliche Aminosäure

nonsense Mutation

geändertes Codon führt zur Termination der Translation

frameshift Mutation

frameshift Mutation

Punktmutationen in codierenden DNA Bereichen

III.C Ames Test

Mutation ist in allen Fällen eine Transition

Mechanismen der Entstehung spontaner Mutationen

Keton – Enol Tautomerie

•! tautomere Umlagerungen der Basen führt zu Fehlpaarungen

III.C Ames Test

Mechanismen der Entstehung spontaner Mutationen

! Indel Mutation

•! ‚Weitergleiten‘ der Replikation (replication slippage)

III.C Ames Test

Depurinierung:

•! spontane Schäden der Basen: Depurinierung und Desaminierung

Desaminierung: Amino- zu Ketofunktion C zu U (paart mit A, C ! T Transition); A zu Hypoxanthin (paart mit C, A ! G Transition)

(paart mit A, G ! T Transversion)

oxidative Schäden z.B. durch Sauerstoff Radikale

blockiert DNA Replikation

III.C Ames Test

Mechanismen der Entstehung spontaner Mutationen

Molekulare Ursachen induzierter Mutationen

induzierte Mutationen: werden durch mutagene Substanzen ausgelöst

•! Einbau von Basenanaloga in die DNA (z.B. 5-Bromuracil / 2-Aminopurin)

III.C Ames Test

•! alkylierende Agenzien (addieren Methyl- bzw. Ethylgruppen an verschiedene Positionen der Basen)

Ethylmethansulfonat (EMS)

Nitrosoguanidin (NG)

III.C Ames Test

Molekulare Ursachen induzierter Mutationen

! Strahlung:

UV-Strahlung generiert Photoprodukte » Verknüpfung benachbarter Pyrimidine (v.a. Thymindimere)

CPD: Cyclobutan Pyrimidin Dimer

Ionisierende-Strahlung produziert reaktive Sauerstoffspezies (ROS); verursacht auch Aufbrechen der N-glykosidischen Bindung und Strangbrüche

III.C Ames Test

Molekulare Ursachen induzierter Mutationen

•! Agenzien, welche mit Basen Reaktion eingehen: ‚bulky addition‘

Bsp: Aflatoxine in Schimmelpilz- befallenen Lebensmitteln

Bsp: Nitrosamine in gepökeltem Fleisch und Käse

- entstehen aus Nitriten und Aminen - Präkanzerogen: - Cytochrom-P450-katalysierte Reaktionen » Formaldehyd und Carbeniumionen

III.C Ames Test

Molekulare Ursachen induzierter Mutationen

Ames Test zur Identifikation mutagener Substanzen

Reversion von Mutationen im his Gen verschiedener Salmonella typhimurium

Stämme durch Behandlung mit mutagenen Substanzen

Zugabe von Rattenleber- extrakt: viele Carcinogene werden erst mutagen durch Metabolisierung in der Leber

III.C Ames Test

Welche Kontrollen fehlen hier?

Mutation

Reversion von Mutationen im his Gen verschiedener Salmonella typhimurium Stämme durch Behandlung mit mutagenen Substanzen

Salmonella typhimurium TA98: Rasterschubmutation

Salmonella typhimurium TA100: Basensubstitution

Im Praktikum verwendete Gifte:

2-Aminofluoren

Hydroxylierung durch Leberenzyme

» Addition an C8 von Desoxyguanosin (bulky addition)

Ames Test zur Identifikation mutagener Substanzen

4-Nitro-o-phenylendiamin (NPD) Wirkung?

III.B Transposon-Mutagenese

Transponierbare Elemente in Prokaryonten

Insertionssequenzen (IS-Elemente) inverted repeats an den Enden kodieren für Transposase

Transposons besitzen neben der Transposase zusätzliche Gene (z.B. Antibiotika Resistenzgene)

zusammengesetzte Transposons (Klasse I Transposons) Gene, welche von IS-Elementen in entgegengesetzter Orientierung flankiert sind

einfache Transposons (Klasse II Transposons) flankiert von kurzen (<50 bp) inverted repeats

Tn1725

Zwei Mechanismen der Transposition

replikative Transposition: neue Kopie des Transposons

konservative Transposition: ‚cut and paste‘ Mechanismus

III.B Transposon-Mutagenese

Nachweis der Transposon-Mutagenese des Plasmids pTS115

III.B Transposon-Mutagenese

Kultivierung unter Bedingungen, bei denen Transposition statt findet

» gelegentlich wird Tn1725 auch ins Plasmid pTS115 springen;

egal wohin Tn1725 springt, Zellen bleiben Cam-R und Amp-R (Ausnahmen?)

» daher: Plasmidisolation aus Ru4404 und Transformation in E. coli DH5!

» Selektion auf LB/Cam/Amp-Agarplatten

Transposon mit CamR

chromosomale DNA

xylE

AmpR ori

pTS115

E. coli Ru4404:

farbloses Catechol gelbes "-Muconsäuresemialdehyd XylE

Catecholsprühtest zur Identifikation von xylE::Tn1725 Insertionsmutanten

Ermitteln Sie den Anteil der weißen Klone und berechnen Sie hieraus die Größe des xylE-Gens!

hierfür nötige Zusatzinformation: pTS115: 6 kb #-Lactamase-Gen: 0,9 kb ORI: 0,4 kb

III.B Transposon-Mutagenese

Elektrophorese von Nukleinsäuren

dsDNA: keine/kaum Sekundärstruktur

konstante Ladungsdichte » Wanderungsstrecke ! 1 ⁄ Größe

5 x 106 – 1 x 105 bp » pulsed field Gelelektrophorese (PFGE) 1 x 105 – 50 bp » normale Agarose-Gelelektrophorese (i.d.R. horizontal)

500 – 5 bp » Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE; i.d.R. vertikal)

Probenpuffer enthält typischerweise: Glyzerin » macht Probe schwer, so dass sie in die Taschen sinkt

Farbstoff » erlaubt einfaches optisches (d.h. ohne UV-Licht) Verfolgen der Elektrophorese; Orange G läuft bei ca. 50 bp

Bromphenolblau - bei ca. 300 bp

Xylencyanol - bei ca. 4 kbp EDTA » hemmt Nukleasen

ssDNA & RNA: wegen Sekundärstruktur gilt nur unter denaturierenden Bedingungen Wanderungsstrecke ! 1 ⁄ Größe

» Formamid, Formaldehyd, Harnstoff, Hitze

IV.B Elektrophorese

29

DNA-Ligase Mechanismus

NAD+

ATP E. coli: NAD+ Eukaryonten, T4-Phage: ATP

im Labor wird meist T4-Ligase benutzt, weil sie auch "stumpfe" DNA-Enden miteinander verknüpfen kann

IV.C Ligation

30

Woran erinnert Sie dieser Reaktionsmechanismus mit einem DNA-AMP-Intermediat?

» z.B. Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Reaktion

IV.C Ligation

Das Griffith Experiment (1928)

Avirulente R-Zellen von Streptococcus pneumoniae werden durch hitzegetötete, virulente S-Zellen zu S-Zellen transformiert

IV.D Transformation

IV.D Transformation

Transformation

•! Aufnahme von DNA-Fragmenten oder Plasmiden aus dem externen Medium

•! natürliche Kompetenz (z.B. Bacillus subtilis)

•! Kompetenz durch chemische Behandlung (z.B. CaCl2)

Elektroporation

Durch ein elektrisches Feld, das in der Regel durch einen sich schnell

entladenden Kondensator erzeugt wird, werden in der behandelten

Zellmembran mikroskopisch kleine Löcher erzeugt, die sich innerhalb

von Millisekunden wieder schließen.

Vorteil: hohe Transformationsraten; Nachteil: Küvetten sind teuer

IV.D Transformation