131 IR (KBr): S = 3040(w), 2950(s). 2880(w). 2840(s). 281qsh). 27Ww). 2670(w), 1450(s). 1390(m), 1360(vw), 1290(m), 1270(s), 12lO(w). llZO(s). 1070(w), 1010(s), 91O(w), 870(m), 730(m), 550(m), 520(m) cm-' .

(41 Vergleiche z. B. N-Methylmorpholin in C. J. Pouchert: Thp Aldrich Lihrurj, of FT-IR Sperm, Vol. 1, 1. Aufl. 1985, S . 382.

[5] Hierfiir hatte man prinzipiell auch den Ausdruck ,,ring whizzing" verwen- den konnen. Dieser bezieht sich jedoch auf ein rweidimensiond!es Phlno- men, wahrend es sich im hier beschriebenen Fall um ein dreidimensionales Phanomen auf einem spharischen Molekiil handelt.

[6] a)A. P. ter Borg, H. Kloosterziel, Reel. Trav. Chim. Pays-BusX2(1963) 741 : b) D. S. Glass, R. S. Boikess, S. Winstein. Tetrahedron Lerr. 1966. 999: c) R. W. Roth, J u s m Liebigs Ann. Chem. 671 (1964) 25.

[7] Aufgrund dieser Experimente konnten wir eindeutig die C,,,-H- und C,,,-D- Streckschwingungen bei 3040 bzw. 2240 cm- zuordnen.

[8l P.-M. Allemand, A. Koch, F. Wudl, Y. Rubin, F. Diederich. M. M. AlVdreL. S. J. Anz, R. L. Whetten, J. Am. Chem. Soc. 113 (1991) 1050.

HETLOC, eine effiziente Methode zur Bestimmung heteronuclearer Weitbereichskopplungen rnit dem Heterokern in natiirlicher Haufigkeit ** Von Michael Kurz, Peter Schmieder und Horsr Kessler *

Heteronucleare Weitbereichskopplungen wie 3J(C,H) und 3J(N,H) gehoren zu den wichtigsten NMR-Parametern bei der Konformations- und Konfigurationsbestimmungl']. Ihrer intensiven Nutzung stand bisher jedoch ihre schwere Zugang- lichkeit entgegen. Die existierenden Bestimmungsmethoden haben entweder den Nachteil zu geringer Empfindlichkeit oder der Beschrankung auf gut aufgeloste Protonenspektren. Wir schlagen hier ein Verfahren vor, das fur Kopplungen zu protonentragenden Heteroatomen beide Nachteile umgeht und ohne miihsame Anreicherung des Heterokerns (' 3C, "N) auskommt.

Eine effiziente Methode zur Bestimmung dieser Weitbe- reichskopplungen sollte folgenden Anforderungen geniigen : hochste Empfindlichkeit, Anwendbarkeit auch bei iiberla- gerten Protonen- oder Kohlenstoffsignalen und Messung der Kopplungskonstante in der Detektionszeit (Dimension rnit der besseren Auflosung). Diese Bedingungen werden alle durch die Methode von Montelione et a1.L31 erfiillt, bei der herkommliche TOCSY- oder NOESY-Spektren isofopen- angereicherter Proteine ein E.COSY-Mustert41 erhalten. Die Kreuzsignale zeigen in der inkrementierten Dimension (Fl in 2D-, F2 in 3D-Spektren) die direkte, groRe Kopplung zum Heterokern ('J(C,H), 'J(N,H)) und in der detektierten Di- mension (F2 in 2D-, F3 in 3D-Spektren) die gewiinschte heteronucleare Weitbereichskopplung zum gleichen Hetero- kern durch die Verschiebung der Multipletts. Damit lassen sich Kopplungskonstanten bestimmen, die kleiner als die Li- nienbreite sind.

Um Kopplungen zu Kernen in naturlicher Haufigkeit be- stimmbar zu machen, miissen die Signale der Protonen, die an keinen magnetisch aktiven Heterokern gebunden sind, unterdriickt werden. Wir schlagen hierfiir die Verwendung eines o,-Heter~halbfil ters~~~ vor, der uber den Phasencyclus solche Kerne in F1 selektiert, die direkt an den Heterokern gebunden sind. Die Pulssequenzen sind in Abbildung 1 dar- gestellt. Durch BIRD-Vorsattigungt61 der an I2C gebunde- nen Protonen erreicht man eine schnelle P~ls fo lge~ '~ (ca. 2 Scans pro Sekunde). Die erhaltenen 2D-Spektren sind

TOCSY-Spektren, in denen die Kreuzsignale das gewiinsch- te ,,E.COSY"-Muster zeigen. Die Pulssequenz von Abbil- dung 1 b ist die dreidimensionale VariantelE1, in der die che- mische Verschiebung zusatzlich evolviert wird. Diese Technik ist besonders bei Uberlagerungen anzuwenden.

a)

111 I BIRD, 90" 1800

A A, I A , A j t, 1 M L E V ~ ~ J J

1800 I

900 I vl

900 I"*

I 1

Abb. I . Pulssequenzen der im Text angesprochenen NMR-Verfahren. a) 0,-

Heterohalbgefiltertes TOCSY ohne heteronucleare Entkopplung (HETLOC. Determination of Hereronuclear Long Range Couplings). b) 3D-HMQC-TOC- SY ohne heteronucleare Entkopplung. c) cu,-Gefiltertes NOESY ohne hetero- nculeare Entkopplung. Der BIRD-Puls dient in allen Sequenzen zur Unter- driickung der Signale an I 'C gebundener Protonen und ermoglicht eine schnelle Ausfuhrung des Experiments mit zwei Wiederholungen pro Sekunde. Die War- tezeiten sind A = 3.57 ms, A , = 3 ps; T mu0 furjede Verbindung extra optimierl werden. Der Phasencyclus ist 'p, = s. - x. x, - .Y, q2 = x, s. --x. - 1, Emp- finger = + , - , - . + . Bei (c) entspricht der Phasencyclus der Phasen q3 und 'p4 dem im herkommlichen NOESY-Experiment. Im Falle des TOCSY-Trdns- fers wird MLEV-17 als Mischsequenz verwendet.

Das hier vorgeschlagene Verfahren ist aber auf Systeme beschrankt, in denen der Heterokern an ein Proton gebun- den ist, das dem gleichen Spinsystem angehort wie das mit "J(H,X) koppelnde Proton. 1st das nicht der Fall, so kann man NOE-Kreuzsignale rnit der Pulssequenz von Abbil- dung 1 c nutzen, z. B. zwischen dem Amidproton einer Ami- nosaure und dem H a der vorhergehenden Aminosiiure. Al- lerdings ist bei kleinen Molekiilen die Empfindlichkeit durch die geringe Effizienz des NOE-Mischprozesses eingeschrankt.

Im folgenden sol1 gezeigt werden, wie mit diesem Verfah- ren der Winkel d, in Peptiden, der Diedenvinkel zwischen den beiden Carbonyl-C-Atomen entlang der Peptidkette, er- mittelt werden kann. Abbildung 2 zeigt, daR die 3J(HN,CP)-

TOCSY

L534cKl C' - N - C - C'

I C'

Abb. 2. Schemdlische Darstellung der Situation bei der Bestimmung von IJ(H".C@) in einem Peptid. HN is1 mit HB durch den TOCSY-Transfer verbun- den. Werden fiir das Experiment an I3C gebundene HB selektiert. zeigt HN die Weitbereichskopplung zu CB.

[*] Prof. Dr. H. Kessler, Dip].-Chem. M. Kurz, Dip1.-Chem. P. Schmieder Organisch-chemisches lnstitut der Technischen Universitat M iinchen Lichtenbergstrak 4, W-8046 Garching

[**I Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft und dem Fonds der Chemischen lndustrie gefordert. Perer dhrniedcr dankt dem Fonds der Chemischen Industrie fiir ein Stipendium.

Kopplung ebenso wie die homonucleare 3J(HN,Ha)-Kopp- lung iiber eine Karplus-Beziehung mit dem Winkel q5 korreliert ist. Die relevanten Karplus-Bystrov-Beziehungen sind die Gleichungen (a) und (b)19]. Eine graphische Darstel- lung ist in Abbildung 3 gezeigt.

Angew. Chem. 103 (1991) Nr. 10 0 VCH Verlag.sgrsell.s~/ia/ljr mbH. W-6940 Weinheim. 1991 0044-8249~9l~lOlO-l341 R 3S0+ .2S10 1341

Tabelle 1. Kopplungskonstanten [Hz] und korrespondierende Winkel [ '1 fiirdie drei Alanine in c:vclr~-(-Ala'-Alaz-Ala'-Pro4-ProS-) in der starker und der schwicher populierten Konfonnation (Ala bzw. ala).

J [Hzl

I . . . . . . . . . . . . -180 -120 -60 0 60 120 180

@tO1 - Abb. 3. Graphische Darstellungder Karplus-Bystrov-Beziehungen (a) und (b). Die gezeigten Kurven sind jeweils als Mitte eines erlaubten Bereichb zu verste- hen.

'J(HN,HM) = 9.4 ~os'(r#I - 60) - 1.1 COS($ - 60) + 0.4

'J(HN,CB) = 4.7 cos'(r#I + 60) - 1.5 COS(@ + 60) - 0.2

(a)

(b)

Am Beispiel des cyclischen Pentapeptids cyclo-(-Ala'- Ala2-Ala3-Pro4-ProS-), das in zwei Konformationen vorliegt (53 und 47 %), sol1 die Vorgehensweise verdeutlicht werden. Abbildung 4 a zeigt die HN,HB-Region des wl-heterohalbge- filterten TOCSY- oder HETLOC-Spektrums. Das Kreuzsi-

. 1

1 , . . . , . , , , , . . , , , . , 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0

, . - , .-!

- 6

\

1 \ i

:200 I

_____._ -.-..r. LO 30 20

.I 61Hzl -6lHzl

Abb. 4. Anwendung der in Abbildung 1 a gezeigten Pulssequenz auf das cycli- sche Pentapeptid cyclo-(-Ala'-Ala2-Ala3-Pro4-Pro~-). Die Probe enthielt 10 mg Peptid in 0.5 mL [DJDMSO (ca. 25 mM pro Konformation), gemessen wurde bei 300 K mit einem Bruker-AMX-500-Spektrometer. Es wurden 512 (,-Inkre- mente mit je 128 Wiederholungen durchgefuhrt ( r = 198 ms, 'p, = s); die ge- samte MeDzeit betrug 9.5 Stunden. 4096 Punkte wurden in der Acquisitionsdi- mension aufgenommen; das Spektrum wurde in beiden Dimensionen mit einer um 90" verschobenen quadratischen Sinusfunktion apodisiert und hatte nach der Rechnung die Grok von 8192 x 1024 reellen Punkten. a) Bereich der HN,HP-Kreuzsignale des "C-w,-gefilterten TOCSY-Spektrums. b) Kreuzsi- gnal von Alaz; das E.COSY-Muster ist deutlich zu erkennen. c) Zwei Reihen durch das Kreuzsignal von (b); die extrahierten Reihen wurden invers Fourier- transfonniert. mit Nullen aufgefullt und wieder Fourier-transformiert. Die Ver- schiebung der Signale gegeneinander ergibt die heteronucleare Weitbereichs- kopplung.

I

M D- 'J(HN.C@) + Winkel 'J(HN.H') -t Winkel Winkel [a]

Alal 8.0 -153. -87, 44, 76 2.0 -90. -30. 63. 177 [b] 63

Ala3 6.6 -161, -79. 31. 89 2.5 -81, -39. 68, 172 [c] -67

a h 2 5.6 -167. -73. 24.96 2.6 -79. -41. 69, 171 [c], -51 a h 3 10.0 -137. -103 [d] 0.4 -163. -117, -3. 43 -100

A h 2 6.7 -160. -80. 32, 8X 3.0 -60. 73. 167 [c] - 99

a h ' 9.6 - - 141. -99 [d] 0.2 - 160, - 120, 0, 40 - 95

[a] Aus einer eingeschrinkten (restrained) MD-Simulation mit GROMOS 1121 uber 100 ps im VdkUUm. Zur Anwendung kamen 18 und I7 Abstande fur die stirker bzw. die schwicher populierte Konformation. [b] Die Alternative ( - 87"/-90") kann wegen eines sehr intensiven Kreuzsignals zwischen dem Carbonyl-C-Atom der vor- hergehenden Aminosiure und dem Ala'-H" ausgeschlossen werden. [c] Die Alter- native mit positivem p (88"/73". X9"/6e" bzw. 96"/69") kann wegen des schwachen bzw. nicht vorhandenen Kreuzsignals zwischen dem Carbonyl-C-Atom der vorher- gehenden Aminosiure und dem H" der betrachteten Aminosiure ausgeschlossen werden. [d] Beide Winkel aus der Kopplungskonstante 'J(HN,H") lassen sich mit dem halbfett hervorgehobenen Winkel aus der 'J(HN.C@)-Beziehung vereinbaren. Eine genauere Unterscheidung ist auch iiber die beiden anderen Weitbereichskopp- lungen ['J(HNC;,,) und 3J(Ha,C;j ,,)I nicht moglich.

gnal von Ala2-HN ist in Abbildung 4 b zu sehen, wobei das E .C0SY-M~ster [~ l deutlich zu erkennen ist. Kopplungskon- stanten konnen entweder direkt am Kreuzsignal oder analog zur DISCO-Prozedur["] an herausgelesenen Reihen (Abb. 4c) bestimmt werden.

In Tabelle 1 sind die aus beiden Kopplungen gewonnenen Winkel gegenubergestellt. Durch Kombination beider Bezie- hungen IaDt sich die Zahl der moglichen Winkel auf eins oder zwei reduzieren. Zur endgiiltigen Unterscheidung konnen zwei zusatzliche Weitbereichskopplungen, 3J(HN,C',i,) und 'J(H",C;,_ ,,), herangezogen werden, die aus einem selektiven HMBC-Experiment1"I nur noch qualitativ bestimmt wer- den miissen. Die so ermittelten moglichen Winkel sind in Tabelle 1 halbfett hervorgehoben; sie stimmen mit den aus MD-Simulationen gewonnenen gut iiberein.

AbschlieDend sei gesagt, daD das hier vorgestellte Experi- ment eine einfache Methode zur Bestimmung heteronucle- arer Kopplungskonstanten ist. Diese Kopplungskonstanten sind fur die NMR-spektroskopische Bestimmung der Struk- tur in Losung eine wertvolle Erganzung zu den aus NOESY- Spektren gewonnenen Abstanden.

'

Eingegangen am 7. Juni 1991 [Z 46821

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