Acta histochem. 89, 113-119 (1990)Gustav Fischer Verlag lena

Laboratorium fiir experimentelle Neurologie der Abteilung Neurologie1), Akademisch-Medizinisches Zentrum derUniversitat Amsterdam, Amsterdam, Niederlande, und Duphar B. V. Animal Health Division2

), Weesp, Nieder­lande

Histochemische und biochemische Anderungen in Skeletmuskeln vonrhabdomyolyse-empfindlichen Trabrennpferden nach Grenzbelastung.

III: Vermehrte Aktivitat einiger antoxidanter Enzyme

Histochemical and biochemical changes in skeletal muscles of racehorses susceptible toexertional rhabdomyolyses.

III: Elevated activity of some antioxidant enzymes

Von ALBERT EDUARD FRIEDRICH HUGO MEIJERl ), und RENE VAN DEN HOVEN2)

Mit 2 Abbildungen

(Eingegangen am 7. Marz 1990)

Summary

In this communication, the results of a histochemical and biochemical enzyme study on gluteus medius muscleof horses, sensitive to exertional myopathy, during attacks of rhabdomyolysis are presented. For the biochemicalstudy the biopsy specimens investigated were selected by means of histological and enzyme histochemical stainingmethods. Dissected specimens were used which contained groups of muscle fibres with a high or low activity ofglucose-6-phosphate dehydrogenase. The activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase, phosphogluconate dehy­drogenase, glutathione reductase, glutathione peroxidase, superoxide dismutase, and catalase was measuredmicrobiochemically in these dissected specimens.

A rise in activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase in pathologically changed muscle fibres was alwaysfound to be coupled with a significant rise in activity of phosphogluconate dehydrogenase, glutathione reductase,and glutathione peroxidase. In these muscle fibres, the activity of superoxide dismutase and catalase was notsignificantly increased. On the basis of the combined histochemical and biochemical findings it is concluded that theapplication of the histochemical method for the demonstration of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity can behighly recommended for the study of antioxidant enzymes in skeletal muscles with neuromuscular defects.

1. Einfiihrung

In zwei friiheren VerOffentlichungen sind bereits die histochemischen Anderungen in Skelet­muskeln von rhabdomyolyse-empfindlichen Trabrennpferden nach Grenzbelastung erortert wor­den (MEIJER et al. 1989a, b). Die Aktivitat und die Lokalisation von 25 Enzymen wurdenuntersucht.

AuBerordentlich interessant ist die enorme Aktivitlitssteigerung der 2 oxidativen Enzyme desPentosephosphat-Cyklus, der Glucose-6-phosphatdehydrogenase und der 6-Phosphogluconat­dehydrogenase in Muskelfasem 16 h bis einige Tage nach einem Muskelverschlag (Abb. 1).Beide Enzyme haben als Lieferant von NADPH im Stoffwechsel eine besondere Bedeutung. Dasreduzierte Coferment wird flir viele synthetische Prozesse wie die Synthese von Fettsauren undSteroiden aus Acetyl-CoA benotigt (EGGLETON und KREBS 1974; HORECKER 1968). Bine anderewichtige Rolle des Cofermentes ist die Reduzierung der Disulfidform des Tripeptides Glutathion

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(KOSOWER und KOSOWER 1978, 1983). Diese Reduzierung durch die Glutathionreductase dientzur Entfernung schadlicher Peroxide (COHEN und HOCHSTEIN 1963; HOCHSTEIN und UTLEY1968; Abb. 2), freier Radikale (AUTOR 1982; FREEMAN und CRAPO 1982) und des Singlet­Sauerstoffs (BODANESS 1982). Dariiber hinaus spielen die Enzyme Glutathionperoxidase,Superoxiddismutase und Katalase bei der Beseitigung dieser toxischen Substanzen eine wichtigeRolle (DEL MAESTRO 1980). Eine positive Korrelation hat sich herausgestellt zwischen dem Ernstder pathologischen Anderungen in erkrankten Skeletmuskeln und der Zunahme der Konzentrationdieser schadlichen Molekiile (JACKSON et al. 1984; KAR und PEARSON 1979; MATKOVICS et al.1982; MECHLER et al. 1984; MURPHY und KEHRER 1986; OMAYE und TAPPEL 1974). Die erh6hteKonzentration wird im allgemeinen von einer Aktivitatssteigerung der obengenannten antoxidan­ten Enzyme begleitet (JACKSON et al. 1984; KAR und PEARSON 1979; OMAYE und TAPPEL 1974).

Leider sind die biochemischen Befunde nicht immer miteinander in Ubereinstimmung. DieAktivitat der Superoxiddismutase ist z. B. manchmal erh6ht (MIZUNO 1984a, b; MURPHY undKEHRER 1986), manchmal unverandert (MECHLER et al. 1984), und manchmal sogar verringert(BURR et al. 1987; VARADKAR et al. 1987). Die Aktivitat der Katalase ist manchmal angestiegen(KAR und PEARSON 1979; MIZUNO 1984a; MURPHY und KEHRER 1986), und manchmal nicht(BURR et al. 1987).

Bei biochemischen Verfahren werden im allgemeinen Mittelwerte eines Homogenates erhal­ten. Weil histochemische Befunde eindeutig gezeigt haben, daB die pathologischen Vorgange inerkrankten Skeletmuskeln immer inhomogen anwesend sind, ergeben Mittelwerte ungeniigendInformation. Uberdies haben Entziindungszellen eine hohe Aktivitiit dieser Antioxidans-Enzyme(BABIOR 1982, BADWAY 1980, BOEKSTEGER und GRUNDMANN 1985, BURRI et al. 1980, HUNTERet al. 1981). Infolgedessen war es nicht m6glich, mit den angewendeten makrobiochemischenMethoden einen Unterschied zwischen Aktivitat in Muskelfasern und in Entziindungszellenfestzustellen.

In der vorliegenden Ver6ffentlichung sind die Aktivitaten der Antioxidans-Enzyme mitmikrobiochemischen Verfahren in selektierten Muskelproben ermittelt worden. Enzymhis­tochemisch wurde nachgepriift, ob die selektierten Proben zusammengesetzt waren aus Muskel­fasern mit einer erheblichen Aktivitat der Glucose-6-Phosphatdehydrogenase und frei waren vonEntziindungsinfiltrat, Fett und Bindegewebe. Uberdies wurden fUr Kontrollversuche Muskel­fasern mit niedriger Aktivitat der Glucose-6-Phosphatdehydrogenase untersucht.

2. Material ond Methoden

Das vorhandene Biopsiematerial entstammte dem M. gluteus medius von 22 Trabrennpferden mit einerVorgeschichte wiederholter Anfalle akuter Rhabdomyolyse nach schwerem Training (MEIJER et al. 1989a, b).Damals wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach einem Anfall nach der Nadelmethode von SNOW und GUY (1976)bioptiert. Die Zeitpunkte fiir die Entnahme der Biopsien variierten von sofort (innerhalb von 6 min nach einemRhabdomyolyse-Anfall) bis 32 Monate nach einem Anfall und waren fiir die Tiere unterschiedlich.

In der vorhergehenden Untersuchung (MEIJER et al. 1989a, b) wurde histochemisch die Aktivitat und dieLokalisierung von etwa 25 Enzymen und die Lokalisierung von Glykogen und Lipiden dargestellt. Fiir mor­phologische Zwecke wurden die Farbungsmethoden mit Hamatoxylin-Eosin und die Trichrom-Methode nachGomori durchgefiihrt.

Fiir die vorliegende Untersuchung wurde Biopsiematerial aus der vorhergehenden Untersuchung verwendet.Das ausgewahlte Biopsiematerial enthielt viele Muskelfasem mit einer stark vermehrten Aktivitat von Glucose-6­Phosphatdehydrogenase. Die Fasem mit vermehrter Aktivitat waren in Muskelgewebe anwesend, bioptiert 16 h biseinige Tage nach einem Rhabdomyolyse-Anfall; die Enzymaktivitat war nach der histochemischen Methode vonMEIJER und DE VRIES (1974) dargestellt worden. Danach wurden aus dem ausgewahlten Biopsiematerial dieGruppen von Muskelfasem mit erheblicher Aktivitat isoliert. Beriicksichtigt wurde, ob die Muskelfasem vonKontaminierung mit Felt, Bindegewebe und Entziindungsinfiltrat frei waren. Die Isoliertechnik ist ausfiihrlich vonGLICK (1961, 1963, 1981), LOWRY (1957) sowie LOWRY und PASSONNEAU (1972) beschrieben worden. DasGewicht der Muskelproben wurde mit einer Quarzfaser-Waage nach BONTING und MAYRON (1964) ermittelt. Fiirdie Aktivitatsbestimmung von Glucose-6-Phosphatdehydrogenase (EC 1.1.1.49) und 6-Phosphogluconatdehydro-

Biochemische Anderungen in Skeletmuskeln von Trabrennpferden 115

genase (EC 1.1.1.44) wurden die Proben homogenisiert in 2 x 10-2 mo!!1 Tris-HCI-Puffer, pH = 7,3. Die Aktivitatder anderen Antioxidant-Enzyme wurde in Proben bestimmt, homogenisiert mit 1 X 10-2 mo!!1 Phosphat-Puffer,pH = 7,6. Die Aktivitat der Glucose-6-Phosphatdehydrogenase und der 6-Phosphogluconatdehydrogenase wurdenach LOHR und WALLER (1965) oder nach HOHORST (1965) bestimmt. Die Aktivitat der Superoxiddismutase (EC1.15.1.1.) und der Katalase (EC 1.11.1.6) wurde nach MIZUNO (1984a, b) oder AEBI (1983) bestimmt. DieAktivitat der Glutathionreductase (EC 1.6.4.2) und der Glutathionperoxidase (EC 1.11.1.9) wurde nach RACKER(1955) oder BURR et al. (1987) bestimmt. Fiir Kontrollversuche wurden Gruppen von Muskelfasem ohne eineAktivitatszunahme der 2 Pentosephosphat-Cyclus-Enzyme verwendet und histochemisch gepriift. Fiir die statisti­schen Berechnungen wurde der Trend-Test von TERPSTRA (1956) angewendet.

3. Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die Aktivitiit der GPDH einer Muskelprobe, die 16 h nach einemRhabdomyolyse-Anfall bioptiert wurde. Pathologisch veriinderte Muskelfasem sind durch eineerhebliche Enzymaktivitiit gekennzeichnet. Die dargestellten pathologischen Fasem sind frei von

Abb. 1. Die Aktivitiit der GPDH ist 16 h nach einem Rhabdomyolyse-Anfall in vereinzelten befallenen Muskel­fasem erheblich vermehrt.

Fett, Bindegewebe und Entzundungszellen. Fur die mikrobiochemischen Bestimmungen derEnzymaktivitiiten wurden diese befallenen Fasem isoliert. In Tabelle 1 sind die Enzymaktivitiitendargestellt. Aus den Daten ist ersichtlich, daB die Aktivitiit der Glucose-6-Phosphatdehydro­genase in diesen pathologischen Fasem 8- bis lOfach und die der 6-Phosphogluconatdehydro­genase 4- bis 6fach angestiegen war. Die Aktivitiit der Glutathionreductase und der Glutathion­peroxidase war respektive auf das 2- bis 3fache und 1,5- bis 4fache gestiegen. Diese Aktivitiits­zunahme ist signifikant, hingegen die Aktivitiit der Superoxiddismutase und der Katalase nichtsignifikant veriindert.

AIle untersuchten Muskelfasem fur den Kontrollversuch waren frei von Entzundungszellen,Fett und Bindegewebe.

s*

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Tabelle 1. Aktivitiit*) einiger antoxidanter Enzyme in normalen und pathologisch verlinderten Muskelfasern.

Enzyme Normale Fasern Pathologische FasernN=12 N=IO

OPDH 1,6±0,4 15,2± 6,7 (12,4 bis 16,6)PODH 2,7±0,7 14,9± 6,9 (10,4 bis 16,1)OR 2,1±0,4 5,6± 1,9 ( 4,4 bis 6,1)OP 1O,5±2,6 33,8 ± 15,2 (16,4 bis 40,7)SOD 4,3± 1,9 5,9 ± 3,1 ( 4,1 bis 7,2)KAT 0,31 ±0,04 0,37 ± 0,09 ( 0,28 bis 0,44)

*) Mittelwerte mit S. D. und Streubreite in Klammern. GPDH Olucose-6-Phosphatdehydrogenase, PGDH 6­Phosphogluconatdehydrogenase, GR Olutathionreductase, GP Glutathionperoxidase, SOD Superoxiddismutase,KAT Katalase. Aktivitiitswerte GPDH und PGDH: nmol NADPH X min- 1 mg- 1 Protein; GR und GP: nmolNADPH x min-1mg- 1 Protein; SOD: U X mg- 1 Protein. U die Einheit der Enzymmenge, welche eine 50%Hemmung der Oxidation von Adrenalin erzeugt (MIZUNO 1984a); KAT: U X mg- 1 Protein; U die Einheit derEnzymmenge, welche bei 25 °C/min jeweils 1 f.lmol H20 Z spaltet (AEBI 1983).

4. Diskussion

Wlihrend der Oxidationsvorglinge im Intermedilirstoffwechsel werden normalerweise bei einer Dehydrierungaus 2 Paaren von Valenzelektronen je ein Elektron, in der Regel zusammen mit einem Proton, entfernt. Die beidenzuriickgelassenen Elektronen gruppieren sich wieder zu einem Paar, und es bildet sich eine Doppelbindung. InWirklichkeit verlaufen - wie das Studium der Reaktionsmechanismen im Intermedilirstoffwechsel gezeigt hat - dieoxidativen Reaktionen hliufig fUr ein gewissen Bruchteil tiber freie Radikale. Die freien Radikale entstehen nachEntfernung eines einzelnen Elektrons und haben folglich ein unpaares Elektron, d. h. eine nieht abgesiittigte Valenz.Es sind dadurch instabile, iiuBerst reaktive und kurzlebige Substanzen und setzen sich augenblicklich mit anderenStoffen urn. Diese Eigenschaft ist fUr den Organismus sehr schiidlich. Besonders gefahrdet sind die yom Oxygenabgeleiteten Superoxid- (Oz~), Hydroxyl- (HO'), Perhydroxy- (HOz'), Alkoxy- (RO·) und Peroxy- (ROO·)Radikale. Zwischenprodukte wie z. B. H20 Z sind ebenso fUr den Organismus nachteilig (DEL MAESTRO 1980).

g:~~:n J----- Glucose 6-P

Ribulose 5-P xNADP+

NADPH

II

x2GSH

GSSG

III

x2H:zO

Abb. 2. Kopplung der oxidativen Enzyme des Pentosephosphat-Cyklus mit dem Glutation-System. Es dient zurZerstorung von HzOz. I: Olucose-6-Phosphatdehydrogenyse und 6-Phosphogluconatdehydrogenase II: Olutathion­reductase. III: Glutathionperoxidase.

Olticklicherweise gibt es verschiedene Schutzmechanismen. Das Glutathionsystem dient zur Entfernung vonHzOz (Abb. 2) und von freien Radikalen (R·) nach folgenden Vorglingen (WEFERS und SIES 1983, HARMAN et al.1986):

OSH+R· -+ OS'+RHOSH + HOz' -+ OS· + HzOz.

Durch Assoziation der 2 Thiyl-Radikale des Olutathions bildet sich das oxidierte Olutathion:

OS· + OS· -+ OSSO.

Die Aktivitiit der Superoxiddismutase dient zur Entfernung von Oz~:

20z~ + 2H+ -+ Oz + HzOz.

Die Aktivitiit der Katalase dient zur Entfernung von HzO:!:

2HzOz -+ 2HzO + Oz.

Biochemische Anderungen in Skeletmuskeln von Trabrennpferden 117

1m Metabolismus erkrankter Skeletmuskeln hat die Erzeugung freier Radikale stark zugenommen, und alsReaktion darauf ebenso die Aktivitiit der Schutzenzyme (KAR und PEARSON 1979, MATKOVICS et al. 1982,MECHLER et al. 1984, OMAYE und TAPPEL 1974). Da die Trennungsmethoden der angewendeten Homogenatun­tersuchungen nicht einwandfrei sind, konnte die Aktivitiitsvermehrung der Enzyme auf Kontaminierung desMuskelhomogenates mit Entziindungsinfiltrat zuriickzufiihren sein. Mittels der Anwendung von Dissektions- undmikrobiochemischen Techniken hat MEIJER (1989) dennoch gefunden, daB die erkrankten Skeletmuskelfasern vonPatienten tatsiichlich oft eine deutliche Aktivitiitsvermehrung der Schutzenzyme haben (MEIJER 1989).

Untersuchungen von DAVIES et al. (1982) machen deutiich, daB auch in iiberforderten Skeletrnuskeln einevermehrte Erzeugung freier Radikale vorhanden ist. Die in vorliegender Veroffentiichung dargestellten Befundezeigen unverkennbar eine erhebliche Aktivitiitszunahme der Schutzenzyme Glucose-6-Phosphatdehydrogenase,Phosphogluconatdehydrogenase, Glutathionreductase und Glutathionperoxidase in der Muskulatur von rhabdo­myolyse-empfindlichen Trabrennpferden nach Uberforderung. Uberdies lassen unsere Ergebnisse der kombinier­ten histochemischen und mikrobiochemischen Untersuchung eindeutig erkennen, daB die Herkunft der Aktivitiits­zunahme in den Muskelfasern seiber liegt. Die gefundene Aktivitiitszunahme in den iiberforderten Muskelfasernder Trabrennpferde ist ungefiihr von derselben GroBe wie in den befallenen Muskelfasern von Patienten mitneuromuskuliiren Erkrankungen (MEIJER 1989). Uberdies waren in beiden Typen von Myopathologie keinesignifikante Aktivitiitsveriinderungen von Superoxiddismutase und Katalase zu erkennen. Dies bedeutet, daBunsere morphologischen, histochemischen und mikrobiochemischen Befunde der iiberforderten Skeletmuskeln vonTrabrennpferden, erortert in der vorhergehenden Untersuchung und in der vorliegenden Untersuchung, eineMyopathologie zeigen, die iihnlich der Pathologie in mehreren Typen von neuromuskuliiren Krankheiten ist. UnterBeriicksichtigung dieser Ahnlichkeit ist es ein bemerkenswertes Phiinomen, daB die Myopathologie der Trabrenn­pferde von einer voriibergehenden Art ist, dagegen die Myopathologie bei den Patienten leider nicht.

Aus den Befunden der vorliegenden Untersuchung kann der SchluB gezogen werden, daB die Beziehungzwischen topohistochemischem und mikrobiochemischem Nachweis von Enzymaktivitiiten fiir die Erforschungdes Intermediiirstoffwechseis von groBem Nutzen ist.

Zusammenfassung

Es wird iiber enzymhistochemische und mikro-biochemische Befunde im M. gluteus medius von rhabdomyo­Iyse-empfindlichen Trabrennpferden nach Uberforderung der Muskulatur berichtet. Mittels Dissektions-Technikenwurden Gruppen von Muskelfasern selektiert, die histochemisch eine erhebliche oder niedrige Aktivitiit derGlucose-6-Phosphatdehydrogenase zeigten. In diesen selektierten Muskelfasern wurden die Aktivitiit von Glucose­6-Phosphatdehydrogenase, 6-Phosphogluconatdehydrogenase, Glutathionreductase, Glutathionperoxidase,Superoxiddismutase und Katalase mikrobiochemisch ermittelt. Eine signifikante Aktivitiitszunahme der Glucose­6-Phosphatdehydrogenase in pathologisch veriinderten Muskelfasern war immer von einer signifikanten Aktivitiits­zunahme von 6-Phosphogluconatdehydrogenase, Glutathionreductase und Glutathionperoxidase begleitet. DieAktivitiitszunahme der Superoxiddismutase und der Katalase war nicht signifikant. Aus den Befunden derkombinierten histochemischen und mikrobiochemischen Untersuchung hat sich herausgestellt, daB die his­tochemische Bestimmung von Glucose-6-Phosphatdehydrogenase zur Untersuchung von antoxidanten Enzymen inSkeletmuskeln mit neuromuskuHiren Defekten empfehlenswert ist.

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Anschrift des Verfassers: Prof. Dr. A. E. F. H.. MEIJER, Krakeling, 14, NL-2121 BM Bennebroek,Niederlande.