Heterologe Expression und biochemische Charakterisierung ...elib.suub.uni-bremen.de/diss/docs/00010962.pdf · dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat Phenanthrolin 1,10-Phenanthrolin

Heterologe Expression und biochemische Charakterisierung von extrazellulären halotoleranten

bzw. halophilen Peptidasen in Hinblick auf ihre biotechnologische Nutzung

Dissertationzur Erlangung des Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

Dem Fachbereich Biologie und Chemie (FB2)

der Universität Bremen vorgelegt von

Helge Mühl

Januar 2007

1. Gutachter: Prof. Dr. Ulrich Fischer 2. Gutachter: Prof. Dr. Michael G. Lorenz

Danksagung

DDaannkkssaagguunnggDie vorliegende Arbeit wurde in der Firma Molzym GmbH & Co. KG durchgeführt. Ich

möchte mich an dieser Stelle bei Prof. Dr. Ulrich Fischer und Prof. Dr. Michael

Lorenz für die Bereitstellung des Themas bedanken. Bei Prof. Dr. Lorenz bedanke

ich mich besonders für die Betreuung, Diskussionsbereitschaft und die hilfreichen

Hinweise beim Verfassen dieser Arbeit. Der Firma Molzym GmbH & Co. KG gilt mein

Dank für die Möglichkeit einen hervorragend ausgestatteten Arbeitsplatz zu nutzen.

Den Mitarbeitern, besonders Dr. Claudia Disqué, Katja Bergholz und Silke

Bohnacker, möchte ich für die gute Arbeitsatmosphäre und den fruchtbaren Ideen-

austausch danken. Für die zeitweise Nutzung von Arbeitsplatz, Laborausstattung

und Labormaterialien spreche ich der Arbeitsgruppe Marine Mikrobiologie der

Universität Bremen, im Besonderen Prof. Dr. U. Fischer, meinen Dank aus. Ein

herzliches Dankeschön gilt Petra Herzog und Kristina Schmanke für das Korrektur-

lesen der vorliegenden Arbeit.

Meiner Familie und meinen Freunden bin ich für die bedingungslose Unterstützung in

allen Lebenslagen sehr verbunden. Ganz besonders möchte ich mich an dieser

Stelle auch bei meiner Freundin Madeleine bedanken, die mich immer unterstützt hat

und mein Leben stets bereichert.

Inhaltsverzeichnis

IInnhhaallttssvveerrzzeeiicchhnniiss 1 1Einleitung

1.1 Peptidasen 11.1.1 Terminologie und Klassifizierung der Peptidasen 21.1.1.1 Serinpeptidasen 61.1.1.2 Metallopeptidasen 71.2 Halophile Bakterien, Adaption an hohe Salzkonzentrationen 81.2.1 Halophile Enzyme 91.2.1.1 Halophile Peptidasen 101.2.2 Halophile Peptidasen in der Biotechnologie 11

2 16Material und Methoden2.1 Mikroorganismen 162.1.1 Halotolerante und halophile Bakterienstämme 162.1.2 Klonier- & Expressionsstämme 162.1.3 Sonstige Stämme 172.2 Plasmide 172.3 Synthetische Oligonukleotide (Primer) 182.4 Medien, Lösungen & Puffer 202.4.1 Luria-Bertani (LB) Medium (Sambrook & Russell, 2001) 202.4.2 Salinenmedium-Lanzarote (SML) (Sinn-Meyer, 2003) 202.4.3 M9 Minimal Medium (Sambrook & Russell, 2001) 202.4.4 M9-Salzlösung (5x) (Sambrook & Russell, 2001) 212.4.5 RM-Medium (Sambrook & Russell, 2001) 212.4.6 Feste Medien für den Nachweis extrazellulärer Peptidasen 212.4.6.1 Skimmilk-Agarose für den Peptidasenachweis in PA-Gelen 212.4.7 Antibiotika und Medien-Zusätze 212.4.8 Puffer und Lösungen 222.4.9 Chemikalien 232.5 Mikrobiologische Methoden 232.5.1 Anzucht der halophilen Isolate 232.5.2 Anzucht der Klonier- und Expressionsstämme 232.6 Proteinbiochemische Methoden 232.6.1 Gewinnung von zellfreien Kulturüberständen 232.6.2 Protein-Fällung der Kulturüberstände 232.6.3 Dialyse gegen Polyethylenglykol 3500 242.6.4 Proteinbestimmung mit BCA (Bicinchoninic Acid)-Methode 242.6.5 Heterologe Proteinexpression in E. coli 242.6.6 Zellernte und Zellaufschluss 252.6.7 Säulenchromatografie 252.6.7.1 Anionenaustauschchromatografie 252.6.7.2 Hydrophobe Interaktionschromatografie 262.6.7.3 Gelfiltrationschromatografie 262.6.8 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970,

modifiziert) 272.6.9 Detektion von Peptidase-Aktivität auf festen Medien 282.6.10 Peptidasenachweis im Polyacrylamid-Gel (Kontakt-Zymogramm) 282.6.11 Quantitative Peptidase-Aktivitätsbestimmung 292.6.11.1 Azocasein-Assay (Charney & Tomarelli, 1947, modifiziert) 292.6.11.2 EnzCheck Protease Assay Kit (Invitrogen) 292.6.11.3 Casein-Assay (Kunitz, 1947, modifiziert) 302.6.11.4 Bestimmung der pH-Abhängigkeit der Peptidase-Aktivität 312.6.11.5 Einfluss von chaotropen Salzen auf die Peptidase-Aktivität 31

Inhaltsverzeichnis

2.6.11.6 Einfluss von NaCl und Metallionen auf die Peptidase-Aktivität 312.6.11.7 Einfluss der Temperatur auf die Peptidase-Aktivität 322.7 Molekularbiologische Methoden 322.7.1 Nukleinsäure-Extraktion aus Bakterien 322.7.1.1 Extraktion chromosomaler DNA 322.7.1.2 Isolierung von RNA aus E. coli 322.7.1.3 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli 322.7.1.4 Isolierung von Fosmid-DNA aus E. coli 322.7.2 Agarose-Gelelektrophorese und Dokumentation 332.7.3 Southern-Blot 332.7.4 Northern-Blot 342.7.5 Kolonie-Blot 342.7.6 Hybridisierung 352.7.7 Herstellung von DNA-Sonden 352.7.8 Herstellung von Genbanken 352.7.9 Subklonierung 362.7.10 Ligation 362.7.11 Herstellung von elektrokompetenten E. coli-Zellen 362.7.12 Transformation 372.7.13 Replikaplattierung (Tatum & Lederberg, 1947) 382.7.14 Polymerasekettenreaktion (PCR) 382.7.15 Sequenzierung und Auswertung der Sequenzdaten 39

3 40Ergebnisse3.1 Extrazelluläre Peptidasen aus halotoleranten und halophilen Bakterien 403.1.1 Vorauswahl und Charakterisierung von Peptidase produzierenden Isolaten 403.1.2 Systematische Einordnung der ausgewählten Peptidase-Produzenten

mittels 16S-rRNA Analyse 433.1.3 Physiologie der Enzymbildung 453.1.4 In vitro Peptidase-Assays - Möglichkeiten und Grenzen der verwendeten

Assays 463.1.5 Anreicherung der Peptidasen aus Kulturüberständen der halophilen

Stämme 493.1.5.1 Säulenchromatografie 513.2 Biochemische Charakterisierung extrazellulärer Peptidasen 533.2.1 Einfluss des pH-Wertes auf die Peptidase-Aktivität 543.2.2 Einfluss der Temperatur auf die Peptidase-Aktivität 553.2.3 Salzabhängigkeit der Peptidasen 563.2.4 Einfluss von Metallionen auf die Peptidase-Aktivität 583.2.5 Einfluss chaotroper Agenzien auf die Peptidasen 603.2.6 Einfluss von Inhibitoren auf die Peptidasen 613.2.7 Gewebeauflösende Aktivität 633.2.8 Analyse der Peptidasen mittels PAGE 653.3 Molekularbiologische Identifizierung von Subtilisin-ähnlichen Peptidasen 673.3.1 Entwicklung der Sonde für Subtilisin-ähnliche Peptidasen 693.3.2 Identifizierung von Klonen und Subklonen mit homologen Sequenzen zu

Subtilisin-ähnlichen Peptidasen 703.3.3 Identifizierung und Sequenzanalyse der Peptidasegene 723.3.4 Identifizierung des Signalpeptids in ProAS(#748) 743.4 Heterologe Expression der Subtilisin-ähnlichen Peptidasen in E. coli 753.4.1 Peptidase-Überexpression mit Expressionsvektoren 763.4.1.1 Modellsystem: Expression von Subtilisin E in E. coli 763.4.1.1.1 Konstruktion der Expressionsvektoren 773.4.1.1.2 Expressionsanalyse 783.4.1.2 Heterologe Expression von ProAS(#748) 813.4.1.2.1 Analyse der Expression von ProAS(#748) durch pBAD 833.4.2 Heterologe Expression einer aktiven Peptidase durch den Fosmidklon F114 84

Inhaltsverzeichnis

3.4.3 Übereinstimmung der Peptidase F114 mit Peptidase B aus B3/1-2 (#418) 863.4.3.1 Reinigung der rekombinanten Peptidase F114 873.4.3.2 Biochemische Eigenschaften der Peptidase F114 im Vergleich zur Wildtyp-

Peptidase B 883.4.3.3 Bestimmung des Molekulargewichtes von Peptidase F114 91

4 95Diskussion4.1 Zugehörigkeit der Peptidase produzierenden moderat halophilen Stämme

zur Gattung Salinivibrio 974.2 Salinivibrio bildet zwei Typen von extrazellulären Peptidasen 994.2.1 Typ A: Metallopeptidase 1004.2.2 Typ B: Serinpeptidase 1024.2.2.1 Biochemische Charakteristika 1024.2.2.2 Molekularbiologische Charakteristika 1044.3 Heterologe Expression der Serinpeptidase ProAS in E. coli 1074.4 Einsatz der Metallopeptidase und der Serinpeptidase (ProAS) aus

Salinivibrio in der Biotechnologie 1165 121Zusammenfassung6 123Literaturverzeichnis7 140Anhang Abkürzungsverzeichnis: Abkürzung Bedeutung Abkürzung Bedeutung A. dest. Destilliertes Wasser Mr Relative molekulare Größe [kb] AzU Azocaseinunit MOPS 3-Morpholinopropansulfonsäure BLAST Basic Local Alignment Search

Tool n.b. Nicht bestimmt

Bp Basenpaare OD Optische Dichte BSA Rinderserumalbumin ORF Offenes Leseraster Cfu Kolonie bildende Einheiten PA Polyacrylamid DNA Desoxyribonukleinsäure PAGE Polyacrylamid Gel Elektrophorese dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat Phenanthrolin 1,10-Phenanthrolin E. coli Escherichia coli PMSF Phenylmethylsulphonylfluorid EDTA Ethylendiamintetraessigsäure RNA Ribonukleinsäure ERG Eppendorfreaktionsgefäß RT Raumtemperatur (18-25°C) FlU Fluoreszenzunit SDS Natriumdodecylsulfat GuHCl Guanidinhydrochlorid SML 12/8 Salinemedium Lanzarote (12%

NaCl; pH8) GuSCN Guanidinisothiocyanat TCA Trichloressigsäure IPTG Isopropyl-�-D-1-

thiogalactopyranosid TEMED N,N,N’,N’-

Tetramethylethylendiamin Kbp Kilobasenpaare Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan kFlU Kilo-Fluoreszenzunit v/v Volumen pro Volumen KuU Kunitz-Unit w/v Gewicht pro Volumen mAU Milli Absorption Units WT Wildtyp

Einleitung

11 Einleitung Einleitung

1.11.1 Peptidasen Peptidasen

Peptidasen katalysieren die Hydrolyse von Peptidbindungen und sind daher in der

Lage Proteine und Peptide zu spalten, wobei kürzere Peptidfragmente oder freie

Aminosäuren als Spaltprodukte entstehen können. Peptidasen sind für alle Pro- und

Eukaryoten essentiell und beeinflussen die Funktionalität sowohl einzelner Zellen als

auch ganzer Organe bzw. vielzelliger Organismen. Übereinstimmend mit ihrer hohen

biologischen Relevanz kodieren etwa 2% aller Gene für Peptidasen (Rawlings et al.,

2006).

Abhängig von der Sequenzspezifität der Peptidasen erfolgt eine schematische

Unterteilung in eine limitierte und eine unlimitierte Proteolyse (Hooper, 2002). Bei der

unlimitierten Proteolyse werden Proteine durch unspezifische Peptidasen zumeist im

Rahmen des Protein-Turnover in der Zelle oder digestorischer Vorgänge außerhalb

der Zelle zu Oligopeptiden oder Aminosäuren abgebaut. Katalysieren Peptidasen

dagegen eine spezifische Spaltung, spricht man von einer limitierten Proteolyse,

wobei es zumeist zur Spaltung einzelner Peptidbindungen kommt. Diese selektive

Modifikation wird von vielen Proteinen zur Entwicklung ihrer biologisch aktiven Form

benötigt. So sind Viren auf die proteolytische Segmentierung ihrer Polyproteine

angewiesen, während Peptidasen bei Pro- und Eukaryoten zur Abtrennung der

Signalpeptide sekretierter Proteine notwendig sind. Fernerhin katalysieren sie die

Prozessierung von inaktiven Enzymvorstufen (Proenzyme oder Zymogene) zu

aktiven Enzymen durch Abspaltung der Propeptide. Beispielsweise werden selbst

viele Peptidasen als Proenzym synthetisiert und bedürfen einer proteolytischen

Aktivierung (Khan & James, 1998). Ort und Zeitpunkt dieser Aktivierung stellen

hierbei einen wichtigen Mechanismus der biologischen Regulation dar. Dement-

sprechend besitzen Peptidasen eine entscheidende Funktion in Regulations-

prozessen, u.a. in komplexen Abläufen wie Sporulation, Zellvermehrung, Zell-

differenzierung, Blutgerinnung, Blutdruck- und Immunregulation (Mann & Lorand,

1993; Rao et al., 1998). Ebenso können Peptidasen als integrale Membranproteine

auch Rezeptorfunktionen übernehmen und eine interzelluläre Kommunikation sowohl

über ihre Substrate als auch über den direkten Zell-Zell-Kontakt gewährleisten

(Albiston et al., 2001). Gleichbedeutend mit der Aktivierung ist für die Regulation aber

1

Einleitung

ebenso die Inaktivierung der Enzyme, welche wiederum durch eine proteolytische

Spaltung erfolgen kann (Barrett, 2000).

Eine Vielzahl von Peptidasen aus Bakterien wurde bereits beschrieben und näher

charakterisiert. Neben den ubiquitären intrazellulären Peptidasen synthetisieren viele

Bakterien proteolytische Enzyme zur Sekretion in das umgebende Medium (Rao et

al., 1998). Einige dieser extrazellulären Peptidasen sind Toxine oder virulenz-

vermittelnde Faktoren (Matsumoto, 2004). Ausgehend von ihrer medizinischen

Bedeutung bei bakteriellen Infektionen sind sie Gegenstand intensiver Forschung.

Ein Beispiel für extrazelluläre Peptidasen, die eine Invasion von bakteriellen Krank-

heitserregern in ihre Wirte ermöglichen, sind die IgA-Peptidasen. Meningitis-Erreger,

wie Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis und Haemophilus influenzae,

können durch spezifische Proteolyse der IgA-Antikörper des Wirtes die Immun-

barriere der Mukosa überwinden (Poulsen et al., 1996). Weit verbreitet ist die

Fähigkeit der Bakterien durch sekretierte Peptidasen proteinhaltige Substrate, die

außerhalb der Zelle lokalisiert sind, für ihren zentralen Metabolismus zu nutzen. Die

unlimitierte Hydrolyse extrazellulärer Proteine durch unspezifisch wirkende

Peptidasen stellt den Bakterien dabei leicht aufnehmbare Oligopeptide und Amino-

säuren zu Verfügung (Kalisz, 1988). Im Hinblick auf ihr breites Substratspektrum sind

diese extrazellulären Peptidasen aus Bakterien von herausragendem Interesse für

den Proteinabbau in diversen industriellen Prozessen. In Zusammenhang mit ihrer

hohen Toleranz gegenüber extremen Bedingungen haben sich dabei besonders

Enzyme von extremophilen Mikroorganismen in biotechnologischen Anwendungen

durchgesetzt (Hough & Danson, 1999).

1.1.11.1.1 Terminologie und Klassifizierung der Peptidasen Terminologie und Klassifizierung der Peptidasen

Die Bezeichnung für die Peptidbindungshydrolasen ist in der Literatur nicht

einheitlich. Es werden Bezeichnungen wie Proteasen, Proteinasen oder Peptidasen

häufig nach Belieben eingesetzt. Obwohl schon Bergmann und Ross (1936) eine

klare Definition erstellten und diese auch seit 1992 von der IUBMB (International

Union of Biochemistry and Molecular Biology - Nomenclature Committee, 1992)

vertreten wird, ist von einer Umsetzung in der aktuellen Literatur nur wenig zu

erkennen (vergleiche hierzu z.B.: Arnorsdottir et al., 2005; Hiraga et al., 2005; Lama

et al., 2005; Venugopal & Saramma, 2006). Nach der geltenden Definition der

IUBMB werden alle proteolytisch aktiven Enzyme (= Peptidbindung spaltende

2

Einleitung

Hydrolasen) als Peptidasen bezeichnet. Protease ist nunmehr ein Synonym für

Peptidase. Der Definition folgend können die Peptidasen aufgrund ihrer katalytischen

Eigenschaften in Exopeptidasen (Synonyme: Exoprotease) und Endopeptidasen

(Synonyme: Proteinase, Endoprotease) unterteilt werden (siehe Abb. 1). Ist die

Aktivität der Exopeptidasen an die Nähe der N- und C-Termini des Substrates

gebunden, sind die Endopeptidasen in der Regel entfernt von diesen Termini aktiv.

Diese Gruppierung ist gleichzeitig die Grundlage zur Klassifizierung der Peptidasen

nach dem System der Enzyme Commission (EC) der IUBMB.

Aktivität entfernt von den Termini: Endopeptidase

(Syn: Proteinase, Endoprotease)

Abspaltung endständiger Aminosäuren: Exopeptidase

(Syn: Exoprotease)

Proteolytische Enzyme: Peptidase

(Syn: Protease)

Aminopeptidasen (EC 3.4.11) Dipeptidasen (EC 3.4.13) Dipeptidyl- & Tripeptidylpeptidasen (EC 3.4.14) Peptidyldipeptidasen (EC 3.4.15) Serincarboxypeptidasen (EC 3.4.16) Metallocarboxypeptidasen (EC 3.4.17) Cysteincarboxypeptidasen (EC 3.4.18) Omegapeptidasen (EC 3.4.19)

Serin-Endopeptidasen (EC 3.4.21) Cystein-Endopeptidasen (EC 3.4.22) Aspartat-Endopeptidasen (EC 3.4.23) Metallo-Endopeptidasen (EC 3.4.24) Threonin-Endopeptidasen (EC 3.4.25) Endopeptidasen, unbekannt (EC 3.4.99)

Abb. 1: Terminologie und Klassifizierung der proteolytischen Enzyme nach der IUBMB (verändert nach: Barrett, 2001 und http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/). Die weitere Untergliederung (siehe Abb. 1) der Peptidasen im EC-System erfolgt

nach der Reaktionsart des Substratumsatzes (in Amino-, Dipeptidyl-, Tripeptidyl-,

Peptidyldi-, Carboxy- und Omegapeptidasen) und anhand der Merkmale der

katalytischen Domänen (in Serin-, Aspartat-, Cystein-, Threonin- und Metallo-

peptidasen).

Die Klassifizierung der Peptidasen nach dem EC-System weist allerdings für den

wissenschaftlichen Gebrauch Schwächen auf. So werden genealogisch

verschiedenartige Peptidasen in der gleichen Gruppe zusammengefasst und die

überaus zahlreichen Endopeptidasen durch nur fünf Untergruppen repräsentiert.

Zudem finden im EC-System strukturelle und evolutionäre Gemeinsamkeiten

zwischen den einzelnen Enzymen keine Beachtung (Barrett, 2001). Infolgedessen

wurde von Rawlings und Barrett (1993) das MEROPS-System aufgestellt, welches

aus den grundlegenden Enzymstrukturen und den evolutionären Verwandtschafts-

3

Einleitung

verhältnissen der Peptidasen auf Basis ihrer Aminosäuresequenzen hervorgeht. In

diesem hierarchischen System kommt es zur Einteilung der Peptidasen in Clans und

Familien. Ein Clan fasst dabei verschiedene Familien zusammen, deren Vertreter

sich jeweils von einem gemeinsamen „Vorfahren“ ableiten lassen. Die Bezeichnung

der zurzeit 49 verschiedenen Clans wird durch zwei Großbuchstaben vorgenommen,

wobei der jeweils erste Buchstabe auf den Aminosäurerest der katalytischen Gruppe

hinweist: Aspartat (A), Cystein (C), Glutamin (G), Metallo (M), Serin (S), Threonin (T).

Unterscheiden sich diese Aminosäurereste innerhalb der Familien eines Clans, wird

dieser zur Gemischt-Gruppe (P) eingeordnet. Der zweite Buchstabe der Clan-

bezeichnung ist dagegen frei wählbar. Proteolytische Enzyme, die sich bisher nicht in

die bestehenden Gruppen einordnen lassen, werden hingegen in einer Unbekannt-

Gruppe (U) zusammengefasst. Die einzelnen Familien sind ebenfalls durch den

Großbuchstaben der katalytischen Gruppe (A, C, G, M, S, T und U) und eine

fortlaufende Nummer gekennzeichnet. Jede Familie ist dabei um ein Typenenzym

herum aufgestellt. Weitere Vertreter dieser Familie müssen signifikante Überein-

stimmungen mit der Primärstruktur des Typenenzyms oder der schon in der Familie

vorhandenen Peptidasen aufweisen. Dabei ist im Gegensatz zu dem EC-System zu

beachten, dass sowohl Exopeptidasen als auch Endopeptidasen in der gleichen

Familie vertreten sein können.

Eine treffende Benennung der jeweiligen Clans und Familien hat sich aufgrund der

dynamischen Entwicklung ihrer Klassifizierung erst in wenigen Fällen durchgesetzt.

Eine zahlenmäßige Übersicht der bislang (Stand: November 2006) bekannten Clans,

Familien und Peptidasen nach MEROPS ist in Tab. 1 zusammengefasst. Auf eine

komplette Darstellung aller Clans wurde aus Gründen der Übersichtlichkeit

verzichtet. Eine ständig aktualisierte Übersicht der momentan 49 Clans und 185

Familien, in denen die über 48.000 bekannten Peptidasen zusammengefasst

werden, ist unter http://merops.sanger.ac.uk/ einzusehen.

4

Einleitung

Tab. 1: Übersicht über die Anzahl der Clans, Familien und Enzyme der bislang bekannten Peptidasen nach MEROPS (Rawlings et al., 2006). Zu den jeweiligen katalytischen Gruppen wurden wenige Beispiele zur Verdeutlichung der MEROPS-Klassifizierung eingestellt.

Katalytische Gruppe (Kürzel)

Clan

Beispiele

Familie Enzyme

Typenenzym (Herkunft) 7 14 2.915

A1 Pepsin A (Homo sapiens) A2 Retropesin (HIV 1) AA

A11 Copia Transposon Peptidase (Drosophila melanogaster)

Aspartat (A)

AC A8 Signal-Peptidase II (Escherichia coli) 9 47 4.636

C1 Papain (Carica papaya) CA C2 Calpain 2 (Homo sapiens) C11 Clostripain (Clostridium histolyticum)

Cystein (C) CD C25 Gingipain R (Porphyromonas gingivalis) 1 1 12Glutamin (G)

GA G1 Scytalidoglutamin-Peptidase (Scytalidium lignicolum) 15 53 15.611

M1 Aminopeptidase N (Homo sapiens) M4 Thermolysin (Bacillus thermoproteolyticus) M10 Matrix-Metallopeptidase-1 (Homo sapiens) M12 Astacin (Astacus astacus) M26 IgA1-spez. Metallopeptidase (Streptococcus sanguinis) M41 FtsH Peptidase (Escherichia coli)

MA

M64 IgA Peptidase (Clostridium ramosum) MC M14 Carboxypeptidase A1 (Homo sapiens)

Metallo (M)

ME M16 Pitrilysin (Saccharomyces cerevisiae) 12 28 14.169

S8 Subtilisin Carlsberg (Bacillus licheniformis) SB S53 Sedolisin (Pseudomonas sp. 101) S9 Prolyl-Oligopeptidase (Sus scrofa) SC

S33 Prolyl-Aminopeptidase (Neisseria gonorrhoeae)

Serin (S)

SJ S16 Lon-A Peptidase (Escherichia coli) 1 1 155Threonin (T) T- T5 Ornithin-Acetyltransferase (Saccharomyces cerevisiae) 3 30 9.389

PA S1 Chymotrypsin A (Bos taurus) C3 Picornain 3C (menschl. Poliovirus 1)

PB C44 Amidophosphoribosyltransferase (Homo sapiens) T1 Archaeen Proteasom, Beta Komponente (Thermoplasma

acidophilum) PC C26 Gamma-Glutamylhydrolase (Rattus norvegicus)

Gemischt (P)

C56 PfpI Peptidase (Pyrococcus furiosus) 1 9 1.560Unbekannt (U) U- U4 Sporulations-Faktor SpoIIGA (Bacillus subtilis)

Gesamt: 49 185 48.970 Die Verbreitung von bakteriellen Peptidasen erstreckt sich mit Ausnahme der

Glutamin-Gruppe, deren Vertreter bislang nur in Pilzen gefunden wurden, über alle

katalytischen Gruppen. Soweit bekannt, sind Peptidasen aus Bakterien in 40 der 49

Peptidase-Clans vertreten. Extrazelluläre Peptidasen aus halophilen Bakterien, die

Gegenstand dieser Arbeit sind, sind bisher nur aus zwei katalytischen Gruppen

bekannt: den Serinpeptidasen und den Metallopeptidasen (Vergleiche hierzu Tab. 2

& De Castro et al., 2006). Zu einer übereinstimmenden Zuordnung kam Gupta et al.

5

Einleitung

(2002b) ebenfalls für extrazelluläre Peptidasen aus einer anderen Gruppe von

extremophilen Bakterien, den Alkaliphilen.

1.1.1.11.1.1.1 Serinpeptidasen Serinpeptidasen

Über ein Drittel aller Peptidasen wird zu den Serinpeptidasen gerechnet, basierend

auf einem reaktiven Serinrest in ihrem aktiven Zentrum. In den meisten Fällen bildet

dieser Serinrest mit einem Histidin- und einem Aspartatrest eine sog. katalytische

Triade. Zurzeit werden nach MEROPS 12 Clans der Serinpeptidasen unterschieden,

sowie ein Clan (PA) aus der Gemischt Gruppe (P), der neben Vertretern der Serin-

peptidasen ebenso Cysteinpeptidasen enthält (Rawlings et al., 2006). Zwischen den

einzelnen Clans der Serinpeptidasen bestehen keine verwandtschaftlichen

Beziehungen, so dass vermutlich die funktionelle Ähnlichkeit dieser Enzyme auf eine

unabhängige, konvergierende Evolution zurückzuführen ist (Rawlings & Barrett,

1994; Siezen et al., 1991).

Die Spaltung der Peptidbindung erfolgt in einer zweistufigen Reaktion. Bei der

Acylierung wird die Carbonylgruppe des zu spaltenden Peptides durch die Hydroxy-

gruppe des Serinrestes nukleophil angegriffen und bildet ein kovalent gebundenes

Enzym-Peptid-Intermediat. Das benachbarte Histidin übernimmt bei der Reaktion das

freie Proton, während Aspartat zum einen den Imidazolring des Histidins positioniert

und zum anderen die positive Ladung partiell neutralisiert. Nach Freisetzung des

C-terminalen Fragmentes erfolgt die Esterspaltung der Zwischenstufe durch den

nukleophilen Angriff eines Wassermoleküls (Rawlings & Barrett, 1994).

Die am weitesten verbreiteten Clans der bakteriellen Serinpeptidasen stellen die

Chymotrypsin-ähnlichen (PA(S)), Subtilisin-ähnlichen (SB), und Clp-ähnlichen (SK)

Peptidasen, sowie die �/�-Hydrolasen (SC) dar (Lesk & Fordham, 1996; Ollis et al.,

1992; Siezen & Leunissen, 1997; Wang et al., 1997).

Der Clan der Subtilisin-ähnlichen Peptidasen beinhaltet dabei die wohl bestunter-

suchten Peptidasen, wie etwa das Subtilisin E aus Bacillus subtilis. Die biologische

Funktion der vielen bekannten extrazellulären Peptidasen dieses Clans steht haupt-

sächlich im Zusammenhang mit der Hydrolyse komplexer Nährstoffe. Eine

Aufgliederung der Subtilisin-ähnlichen Peptidasen erfolgt nach MEROPS in eine

gleichnamige Familie (S8) mit über 1400 Enzymen, charakterisiert durch die

Reihenfolge ihrer katalytischen Triade (Asp, His, Ser) und in die Familie der

Sedolisine (S53) mit einer katalytischen Tetrade (Glu, Asp, Asp, Ser) und etwa 120

6

Einleitung

bekannten Vertretern. Die auch als

Subtilasen bezeichnete Familie S8 wird

von Siezen & Leunissen (1997)

abweichend zum MEROPS-System als

Superfamilie angesehen und aufgrund

von Sequenzhomologien der

katalytischen Domänen in 6 Familien

(Subtilisin, Thermitase, Kexin, Pyrolysin,

Proteinase K und Lantibiotische Peptidasen) eingeteilt (Abb. 2).

Abb. 2: Dendrogramm der Superfamilie derSubtilasen (aus Siezen & Leunissen, 1997).

1.1.1.21.1.1.2 Metallopeptidasen Metallopeptidasen

Die Metallopeptidasen bilden nach den Serinpeptidasen die zweitgrößte Gruppe an

proteolytischen Enzymen. Charakteristisch sind ein, seltener zwei gebundene

Zinkionen, die direkt in die hydrolytische Aktivität des Enzyms eingebunden sind.

Anstatt Zinkionen können ebenfalls andere Metallionen wie Mangan, Nickel und

Kobalt in einigen Metallopeptidasen gefunden werden (Auld, 1995). Die Funktion der

divalenten Kationen ist die Aktivierung eines Wassermoleküls, welches die zu

hydrolysierende Peptidbindung an der Carbonylgruppe angreift (Häse & Finkelstein,

1993). Im Gegensatz zu den Serin- und Cysteinpeptidasen werden dabei keine

kovalent gebundenen Intermediate ausgebildet, ähnlich dem Reaktionsmechanismus

der Aspartatpeptidasen.

Die Metallopeptidasen werden aktuell in 15 Clans eingeteilt, wobei die ubiquitär

verbreiteten Zinkine (Clan MA) mit zwei Untergruppen (Gluzinkine (MA(E)) und

Metzinkine (MA(M)) und über 31 Familien den wichtigsten Clan darstellen (Hooper,

1994; Rawlings et al., 2006). Allen Zinkinen ist das Zn-bindende Motiv HEXXH*

zueigen, wobei die Gluzinkine die Zinkionen über zwei Histidin-Reste aus dem

HEXXH-Motiv und einem Glutamat, das außerhalb des Motivs verfügbar ist, binden.

Die Metzinkine besitzen hingegen statt des Glutamats einen weiteren Histidin- oder

Asparaginsäurerest.

Unter den Zinkinen befinden sich viele bakterielle extrazelluläre Metallopeptidasen,

u.a. in den Familien der Thermolysine (M4), mikrobiellen Collagenasen (M9) und

Matrix-Metallopeptidasen (M10) (Häse & Finkelstein, 1993; Hooper, 1994; Turner,

2003). Bei den Thermolysinen handelt es sich häufig um unspezifische Peptidasen,

*HEXXH= Histidin-Glutamat-X-X-Histidin; X steht für diverse ungeladene Aminosäuren.

7

Einleitung

die zumeist zur bakteriellen Ernährung durch Degradation extrazellulärer Proteine

beitragen (de Kreij et al., 2000). Die mikrobiellen Collagenasen (Harrington, 1996)

und die Matrix-Metallopeptidasen spielen durch Hydrolyse der Matrixproteine im

tierischen Gewebe eine wesentliche Rolle bei der Pathogenese bakterieller

Infektionen (Lee & Murphy, 2004).

1.21.2 Halophile Bakterien, Adaption an hohe Salzkonzentrationen Halophile Bakterien, Adaption an hohe Salzkonzentrationen

Als Peptidase-Produzenten lag für diese Arbeit eine Stammsammlung von halophilen

und halotoleranten Bakterien aus Salinen vor. Während geringe Mengen an Salz für

alle Lebewesen essentiell sind, zeichnen sich halophile Organismen durch ihre

Abhängigkeit von hohen Konzentrationen verschiedener Salze aus. Halotolerante

Bakterien besitzen demgegenüber ihr Wachstumsoptimum unter mesophilen

Bedingungen, sind aber dennoch in der Lage höhere Salzkonzentrationen zu

tolerieren. Typische Lebensräume für halophile Bakterien sind neben Salinen u.a.

Salzseen, Salzwüsten und Steinsalzlager. Diese Habitate setzen spezielle

Mechanismen voraus, um den osmotischen Druck ihrer hypersalinen Umwelt im

Cytoplasma auszugleichen und sich vor dem denaturierenden Effekt des Salzes zu

schützen (DasSarma & Arora, 2001). Die Klassifizierung der einzelnen Spezies

anhand ihrer physiologischen Eigenschaften gestaltet sich bei den halophilen

Bakterien schwierig und ist bisher in der Literatur nicht einheitlich definiert (Kushner,

1988; Ramos-Cormenzana, 1988; Ventosa et al., 1998). So zeigen viele moderat

halophile Arten als Adaption an die stark schwankenden Umweltbedingungen ihrer

Biotope eine Anpassung an weite Bereiche von Salzkonzentrationen (siehe Abb. 3)

mesophil marin moderat halophil extrem halophil

% NaCl (w/v): 0 0,5 2 15 32

Süßwasser Brackwasser Hypersalin Extrem Hypersalin

Seen/FlüsseÄstuare

MeereSalinen, Salzseen

SteinsalzMeerwasser

Klassifizierung:

Biotope:

Organismen*:

3Halobacterium salinarum (5-30%)

Ectothiorhodospira halochloris (10-32%)Vibrio alginolyticus (0-7,5%)

Halobacteroides halobius (8-16%)

Paracoccus halodenitrificans (0-30%)

Abb. 3: Einige halotolerante und halophile Bakterien, ihre Klassifizierung und mögliche Biotope (aus Mühl, 2002). *Prozentbereich in Klammern hinter den Organismen gibt ihre Salztoleranz in % NaCl (w/v) an.

8

Einleitung

Halotolerante und halophile Bakterien finden sich in diversen Ordnungen der

Bacteria und Archaea, wobei halotolerante und moderat halophile Vertreter vermehrt

unter den Bacteria und extrem halophile häufig unter den Archaea zu finden sind.

Diese Verteilung basiert vermutlich auf den unterschiedlichen resistenzvermittelnden

Strategien der Organismen. Extrem halophile Archaea besitzen ein Cytoplasma,

welches isoton mit dem umgebenden Medium ist. Durch Akkumulation von Kalium-

ionen und gleichzeitiger Ausschleusung von Natriumionen wird ein osmotisches

Gleichgewicht zwischen Cytoplasma und umgebendem Medium hergestellt. Da

Kaliumionen weniger Wasser in ihrer Hydrathülle binden als Natriumionen, steht der

Zelle damit mehr freies Wasser zur Verfügung. Im Gegensatz dazu halten die

Vertreter der halotoleranten und halophilen Bacteria mit Ionen-Pumpen die cyto-

plasmatische Salzkonzentration verhältnismäßig niedrig. Mit der Anreicherung so

genannter kompatibler Solute in der Zelle werden die Wasseraktivitätsunterschiede

zum Außenmedium ausgeglichen. Diese kompatiblen Solute, wie beispielsweise

Trehalose, Ectoin und Betain, funktionieren dabei als organische Osmotika, ohne die

biochemischen Prozesse der Zelle zu hemmen (Galinski, 1993). Diese

verschiedenen Strategien führen dazu, dass bei halophilen Bacteria nur Enzyme mit

Kontakt zum Außenmedium (extrazelluläre und membranassoziierte Enzyme) einen

halophilen Charakter aufweisen. Im Gegensatz dazu besteht bei den extrem

halophilen Archaea die Notwendigkeit sowohl bei intra- als auch bei extrazellulären

Enzymen speziell an hohe Salzkonzentrationen angepasst zu sein (Kushner, 1988).

1.2.11.2.1 Halophile Enzyme Halophile Enzyme

Aufklärung über die Adaption an höhere Salzkonzentrationen bei halophilen

Enzymen konnten Untersuchungen an einigen extrem halophilen Enzymen aus

Archaeen geben (Madern et al., 2000). Diese Enzyme sind übereinstimmend durch

eine erhöhte Anzahl von sauren Aminosäureresten auf ihrer Oberfläche und somit

durch ein negatives Oberflächenpotential charakterisiert (Bieger et al., 2003; Madern

et al., 2000; Mevarech et al., 2000). Die daraus abzuleitende Halophilie ist am besten

über das Solvatisierungs-Stabilisations-Modell zu erklären (Premkumar et al., 2005).

Hydratisierte Ionen binden an der negativen Enzymoberfläche und bilden eine so

genannte Solvatisierungs-Hülle aus. Diese Hülle verhindert eine Anreicherung von

Wasser oder Salzen auf der Proteinoberfläche, was einen Zusammenbruch der

Enzymstruktur oder ein Aussalzen durch Aggregation der Enzyme verhindert

9

Einleitung

(Costenaro et al., 2002; Ebel et al., 2002). Bei salzarmer bzw. salzfreier Umgebung

kommt es hingegen zur gegenseitigen Abstoßung der negativen Ladungen auf der

Enzymoberfläche und damit zur Entfaltung des Enzyms. Einhergehend mit der

Entfaltung ist die zumeist irreversible Inaktivierung der extrem halophilen Enzyme

(Adams & Kelly, 1995).

Demgegenüber müssen die strukturellen Mechanismen von halotoleranten und

moderat halophilen Enzymen, die es ermöglichen sowohl bei niedrigen als auch bei

höheren Salzkonzentrationen stabil und katalytisch aktiv zu sein, noch aufgeklärt

werden (vergl. hierzu: Deutch, 2002; Polosina et al., 2002; Wejse et al., 2003;

Yoshimune et al., 2004).

1.2.1.11.2.1.1 Halophile Peptidasen Halophile Peptidasen

Im Gegensatz zu den extremophilen Peptidasen aus thermophilen und alkaliphilen

Prokaryoten, gibt es vergleichsweise wenige Untersuchungen an halophilen

Peptidasen. Eingehende biochemische Charakterisierungen erfolgten an einigen

Peptidasen aus extrem halophilen Archaeen (zusammengefasst in De Castro et al.,

2006), die im Folgenden als haloarchaeale Peptidasen bezeichnet werden. Allen

haloarchaealen Peptidasen gemeinsam ist ein Aktivitätsoptimum bei hohen Salz-

konzentrationen. So besitzen die Peptidasen aus Natronococcus und Natrialba ein

Optimum > 1 M NaCl, welches von den Peptidasen aus Haloferax und Halobacterium

mit > 3 M NaCl übertroffen wird. Sie gehören, soweit bekannt, alle zu den Serin-

peptidasen. Die Primärstrukturen von vier haloarchaealen Serinpeptidasen wurden

bestimmt und erlauben eine Einordnung der Enzyme in die Familie der Subtilisin-

ähnlichen Peptidasen (MEROPS: S8). Anhand von Sequenzvergleichen lassen sie

sich einer eigenen Gruppe, den Halolysinen, zuordnen, benannt nach der Peptidase

Halolysin I aus Haloferax mediterranei (Siezen & Leunissen, 1997; Stepanov et al.,

1992). Kristallografische und weitere Untersuchungen zur Struktur der extrazellulären

haloarchaealen Peptidasen liegen noch nicht vor.

Informationen über sekretierte halophile und halotolerante Peptidasen der Bacteria

wurden fast ausschließlich innerhalb der letzten 2-3 Jahre gewonnen. Es wurden

Peptidasen sowohl von gramnegativen als auch von grampositiven Bakterien isoliert

und biochemisch charakterisiert. Diese untersuchten Enzyme besitzen teilweise

einen extrem halophilen Charakter mit einem Aktivitätsoptimum bei hohen Salz-

konzentrationen (3 M und 4,2 M NaCl). Es sind aber auch Peptidasen mit einem

10

Einleitung

halotoleranten (0-1 M NaCl bzw. 0-0,5 M NaCl) bis moderat halophilen (0,34 M und

1,7 M NaCl) Charakter isoliert worden (vergleiche Tab. 2). Die Klassifizierung der

Peptidasen hinsichtlich ihres Verhaltens gegenüber verschiedenen Inhibitoren konnte

die Zugehörigkeit zu den Serinpeptidasen oder den Metallopeptidasen zeigen.

Sequenzinformationen der Peptidasegene aus halophilen Bacteria liegen bislang nur

für eine Metallopeptidase aus Pseudoalteromonas ruthenica (Sánchez-Porro Álvarez,

2005) vor. Ausgehend von einem Sequenzvergleich ist diese Peptidase in die

Familie der Thermolysine (MEROPS: M4) einzuordnen.

1.2.21.2.2 Halophile Peptidasen in der Biotechnologie Halophile Peptidasen in der Biotechnologie

Die Verwendung von Peptidasen erstreckt sich über ein weites Einsatzgebiet zur

Modifikation und Degradation von Proteinen in industriellen Prozessen. Proteo-

lytische Enzyme machten dabei im Jahr 2002 40% der weltweiten Umsätze mit

technischen Enzymen (Gesamtvolumen: ca. 1,2 Mrd. EUR) aus (Gupta et al.,

2002b). Mittlerweile ist der Umsatz mit Enzymen in der so genannten weißen

Biotechnologie auf 5 Mrd. EUR (2005) angestiegen, wobei der größte Teil mit

alkalischen und thermophilen Peptidasen erzielt wird (Bendlin, 2006; Maurer, 2004).

Peptidasen finden Anwendung bei der Entfernung von proteinhaltigen

Verschmutzungen als Zusatz in diversen Reinigungs- und Waschmitteln sowie in der

Abwasser- und Abfallbehandlungsindustrie. Darüber hinaus kommen proteolytische

Enzyme u.a. zur Haarentfernung und Gerbung in der lederverarbeitenden Industrie

sowie zur Modifikation von Nahrungs- und Futtermitteln und in diversen Bereichen in

der Pharmaindustrie zum Einsatz (Gupta et al., 2002b; Rao et al., 1998).

Die Verwendung von halophilen Peptidasen in der Biotechnologie ist dagegen

bislang auf wenige Anwendungen beschränkt (Eichler, 2001; Margesin & Schinner,

2001). Einen Einsatz von halophilen Peptidasen im hypersalinen Milieu beschreiben

Hiraga et al. (2005) und Namwong et al. (2006) für die beschleunigte Fermentation

von asiatischen Fischsoßen. Die traditionelle Methode für die Degradation der Fisch-

fleischproteine in den stark salzhaltigen Soßen durch Einsatz halophiler proteo-

lytischer Bakterien ist sehr zeitaufwändig und beträgt über ein Jahr. Durch

Verwendung von gereinigten Serinpeptidasen aus einem Filobacillus- und

Halobacillus-Stamm könnte gegenüber dem traditionellen Verfahren ein erheblicher

Zeitgewinn und damit einen wirtschaftlichen Vorteil entstehen.

11

Einleitung

Tab. 2: Peptidasen aus halophilen und halotoleranten Vertretern der Bacteria und Archaea und ihre Charakteristika.

Optimalbedingungen Organismus Peptidase NaCl

(M)Temp (°C) pH Mr

(kDa)Bemerkungen Referenz

Archaea Halobacterium halobium

Subtilisin-ähnliche Peptidase

4,0-5,0 37 8,0-9,0 41 -Kompletter irreversibler Aktivitätsverlust in < 2 M NaCl -Gensequenz bekannt

(Izotova et al., 1983)

Halobacterium halobium

Serinpeptidase 4,0 n.b. n.b. 66 (Ryu et al., 1994)

Halobacterium salinarum

n.b. 3,0-4,0 n.b. 8,0 n.b. (Norberg & von Hofsten, 1969)

Haloferax mediterranei R4


3,0-4,3 n.b. n.b. 41 Gensequenz bekannt

(Kamekura & Seno, 1993; Kamekura et al., 1996)

Haloferax mediterranei VKM-B 1538


4,5 55 8,0-8,5 41 -Autoproteolyse des Enzyms nach Entsalzung -Gensequenz bekannt

(Stepanov et al., 1992)

Halogeometricum borinquense TSS101

Serinpeptidase 3,4 60 10,0 86 (Vidyasagar et al., 2006a)

Natrialba asiatica Subtilisin-ähnliche Peptidase

2,0 75-80 10,7 46 Gensequenz bekannt

(Kamekura & Seno, 1990; Kamekura et al., 1992)

Natrialba magadii Subtilisin-ähnliche Peptidase

1,5 60 8,0-10,0 45 Gensequenz bekannt

(Gimenez et al., 2000; Ruiz & De Castro, 2006)

Natrococcus occultus Serinpeptidase 1,0-2,0 60 7,0-9,0 130 (Studdert et al., 2001)

BacteriaBacillus sp. 21-1 n.b. 0,5 n.b. 8,0 &

12,0 n.b. (Kamekura &

Onishi, 1974) Bacillus sp. Vel Serinpeptidase 0,03 37 10,0-11,0 29 (Gupta et al.,

2005) Serinpeptidase 0,0-0,5 60 7,5 29 Bacillus subtilis

FP-133 Metallo-peptidase

0,0-0,5 45 8,0 34 (Setyorini et al., 2006)

Chromohalobacter sp. TVSP101

n.b. 4,5 80 8,0 n.b. (Vidyasagar et al., 2006b)

Filobacillus sp. RF2-5 Serinpeptidase 1,7 60 10,0-11,0 49 (Hiraga et al., 2005)

Halobacillus sp. SR5-3

Serinpeptidase 4,2 50 10,0 43 (Namwong et al., 2006)

Pseudoalteromonas ruthenica

Metallo-peptidase

0,0-1,0 55 8,5 38 Gensequenz bekannt

(Sánchez-Porro Álvarez, 2005; Sánchez-Porro et al., 2003b)

Pseudomonas sp. A-14

n.b. 3,0 n.b. 8,0 120 (Duong Van Qua et al., 1981)

Salinivibrio costicola unsichere Zuordnung

0,34 60 8,0 38 (Lama et al., 2005)

Salinivibrio sp. AF-2004

Metallo-peptidase

0,0-0,5 65 8,5 38 (Karbalaei-Heidari et al., 2006)

n.b.= nicht bestimmt.

12

Einleitung

Das biotechnologische Potential der halophilen Enzyme liegt jedoch nicht explizit im

Einsatz im hypersalinen Milieu, sondern in ihrer Fähigkeit unter Bedingungen mit

geringer Wasseraktivität katalytisch aktiv zu sein (Rodriguez-Valera, 1992). Dabei

ermöglicht die Eigenschaft der extrem halophilen Enzyme zur Bildung einer

Solvatisierungs-Hülle (siehe 1.2.1) ihre Verwendung unter diesen extremen

Bedingungen. Ryu et al. (1994) setzten erfolgreich eine sekretierte Serinpeptidase

von Halobacterium halobium in 33% Dimethylformamid zur Synthese von glycin-

haltigen Oligopeptiden ein. So ist die zukünftige Anwendung von halophilen

Peptidasen als Biokatalysatoren in Flüssigkeiten mit hohen Konzentrationen an

organischen Lösungsmitteln sehr Erfolg versprechend (Fukushima et al., 2005;

Marhuenda-Egea & Bonete, 2002; Usami et al., 2005).

Während die extrem halophilen Enzyme aufgrund ihrer irreversiblen Inaktivierung

unter salzarmen oder salzfreien Bedingungen (Adams et al., 1995) für ein breites

Anwendungsspektrum ungeeignet erscheinen, bieten möglicherweise Enzyme aus

moderat halophilen oder halotoleranten Bakterien wegen ihrer Aktivität innerhalb

einer großen Spannbreite von Salzkonzentrationen ein hohes Potential (Sánchez-

Porro et al., 2003a; Ventosa et al., 1998). Ein gesteigertes Interesse an

verschiedenen Enzymen dieser Organismen für diverse biotechnologische

Anwendungen konnte in letzter Zeit verzeichnet werden (u.a. Makowski et al., 2006;

Redecke et al., 2006).

Zur industriellen Produktion bakterieller Peptidasen werden gewöhnlich verschiedene

Flüssigkultivierungsverfahren (z.B. Fed-Batch oder Chemostat) der Peptidase-

Produzenten in Fermentern genutzt (Gupta et al., 2002a). Um die Produktions-

leistung zu steigern, wird in über 50% der Fälle auf genetisch manipulierte Mikro-

organismen zurückgegriffen (Rao et al., 1998). Eine verbreitete Methode ist hierbei

die Produktion von rekombinanten Enzymen durch eine heterologe Expression in

bekannten mesophilen Laborstämmen, wie E. coli. Dieses Verfahren könnte für

halophile Peptidasen neben der möglichen Produktionssteigerung weitere

wirtschaftliche Vorteile bieten. So könnte u.a. auf die salzhaltigen Komplexmedien für

die halophilen Organismen verzichtet werden, einhergehend mit dem Wegfall von

kostenintensiven und stark korrosiven Medienbestandteilen. Eine erfolgreiche

heterologe Expression von halophilen Peptidasen in mesophilen Wirtsstämmen ist

aktuell jedoch nicht bekannt. Dagegen wurden andere halophile Enzyme schon

13

Einleitung

erfolgreich in E. coli exprimiert (Camacho et al., 2002; Diaz et al., 2006). So konnten

Mijts & Patel (2002) eine �-Amylase von Halothermothrix orenii in E. coli exprimieren.

Ein viel versprechendes Einsatzgebiet für halophile Peptidasen stellen Kits für die

Aufreinigung von Nukleinsäuren aus tierischen, pflanzlichen und bakteriellen Zellen

und Geweben dar. Der vollständige Zellaufschluss ist dabei ein entscheidender

Faktor für eine erfolgreiche Extraktion der Nukleinsäuren. Der hierfür in vielen Kits

eingesetzte enzymatische Aufschluss von Zellen und Geweben hat gegenüber

mechanischen Aufschlussverfahren den Vorteil, dass es keiner speziellen

technischen Ausstattung beim Anwender bedarf. Allerdings erfordert der Einsatz in

den Kits besondere Voraussetzungen an die zu verwendenden Peptidasen. So sind

zur Gewinnung von qualitativ hochwertigen Nukleinsäuren Bedingungen während

des Zellaufschlusses notwendig, die nukleolytische Enzyme sofort inaktivieren. Eine

bewährte Methode ist hierfür der Einsatz stark chaotroper Salze, wie Guanidin-

hydrochlorid (GuHCl) und Guanidinisothiocyanat (GuSCN) in hohen Konzentrationen

(Boom et al., 1990; Chirgwin et al., 1979; Chomczynski & Sacchi, 1987). Diese Salze

verhindern durch Denaturierung der freigesetzten DNasen und RNasen eine

Degradation der zu gewinnenden Nukleinsäuren. Zusätzlich zu den chaotropen

Salzen werden Detergenzien wie SDS und Tween20 zur Unterstützung der Zelllyse

eingesetzt. Überwiegend wird bislang in den Kits zur Nukleinsäurereinigung

Proteinase K zum Zellaufschluss eingesetzt. Diese Serinpeptidase aus einem

mesophilen Pilz (Tritirachium album) zeigt unter hohen Konzentrationen stark

chaotroper Salze (GuHCl: < 3 M; GuSCN: < 0,8 M) und Detergenzien (SDS:

Optimum 0,2-1%) eine erhöhte katalytische Aktivität (Hilz et al., 1975; QIAGEN,

1997). Eingehende Untersuchungen an anderen Peptidasen bezüglich ihrer Toleranz

gegenüber chaotropen Bedingungen sind nicht bekannt.

Aus technischen und wirtschaftlichen Gründen ist es von Interesse, dass weitere

Peptidasen für den enzymatischen Aufschluss von Zellen und Geweben zur

Verfügung stehen. Dabei sind die halophilen Peptidasen aufgrund ihrer zuvor

beschriebenen Eigenschaften sehr viel versprechend, um unter den harschen

Bedingungen im Lysepuffer proteolytische Aktivität zu zeigen. In dieser Arbeit sollten

daher erstmalig sekretierte Peptidasen aus halophilen Bakterien auf ihre Toleranz

gegenüber hochchaotropen Bedingungen untersucht werden. Die biochemische

Charakterisierung der angereicherten proteolytischen Enzyme sollte Hinweise

bezüglich ihres Einsatzes in Kits zur Nukleinsäurereinigung liefern. Des Weiteren

14

Einleitung

sollte die Klonierung und Identifizierung der Gene eine molekularbiologische

Charakterisierung der halophilen Peptidasen ermöglichen. Zusätzlich sollte die

rekombinante Produktion einer halophilen Peptidase anhand einer heterologen

Expression in E . coli untersucht werden.

15

Material und Methoden

22 Material und Methoden Material und Methoden

2.12.1 Mikroorganismen Mikroorganismen

2.1.12.1.1 Halotolerante und halophile Bakterienstämme Halotolerante und halophile Bakterienstämme

Die in dieser Arbeit verwendeten halotoleranten und halophilen Bakterienstämme

(Tab. 35 im Anhang) wurden aus Umweltproben isoliert und in einer über 1000

Stämme umfassenden Stammsammlung niedergelegt (Sinn-Meyer, 2003). Die

Umweltproben wurden 1998 auf Lanzarote (Kanarische Inseln, Spanien) gesammelt.

Die Probenstandorte waren zwei Salinen: Salinas de Janubio (SJ) und Salinas del

Rio (SR) sowie ein küstennaher See: El Golfo (EG). Weitere Probennahmen fanden

1999 an den Salinen zwischen La Baule (B) und Guéronde (Bretagne, Frankreich)

statt.

Ein Großteil der untersuchten Bakterien wurde bislang morphologisch und auf extra-

zelluläre Enzyme untersucht (Sinn-Meyer, 2003). Eine systematische Einordnung

erfolgte bisher an etwa ¼ der Stämme auf Basis einer „amplified ribosomal DNA-

restiction analysis (ARDRA)-Untersuchung“ (Vogt, 2000) und in wenigen Fällen durch

Bestimmung einer Teilsequenz des 16S rRNA-Gens (Neumann, 2005; Sinn-Meyer,

2003).

In dieser Arbeit wurde die Stammbezeichnung nach Sinn-Meyer (2003) verwendet,

der zwecks Übersichtlichkeit ihre Nummerierung in Klammern als Suffix hinzugefügt

wurde.

2.1.22.1.2 Klonier- & Expressionsstämme Klonier- & Expressionsstämme

Es wurden verschiedene Escherichia coli-Stämme für die Erstellung der Genbanken,

Klonierungen und Expressionsstudien verwendet, die in Tab. 3 zusammengefasst

sind.

16


Tab. 3: Verwendete Klonier- und Expressionsstämme, ihre Genotypen, Herkunft und Verwendung in dieser Arbeit.

Stamm Genotyp Referenz/Herkunft Verwendung E. coli BL21 (DE3)

F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB

-) �(DE3)

(Studier & Moffatt, 1986)

Expressionsstudien

E. coli C600 F- tonA21 thi-1 thr-1 leuB6 lacY1 glnV44 rfbC1 fhuA1

(Hanahan, 1983) Expressionsstudien

E. coli DH5� F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG �80d lacZ�M15 �(lacZYA-argF) U169, hsdR17(rK

- mK

+)

(Hanahan, 1985) Klonierung, Expressionsstudien

E. coli Epi300 F- mcrA �(mrr-hsdRMS-mcrBC) �80dlacZ�M15 �lacX74 recA1 endA1 araD139 �(ara, leu)7697 galU galK �- rpsL nupG trfA

Epicentre Fosmid-Klonierung, Expressionsstudien

E. coli HB101 F- mcrB mrr hsdS20(rB- mB

-) recA13 leuB6 ara-14 proA2 lacY1 galK2 xyl-5 mtl-1 rpsL20(SmR) glnV44

(Boyer & Roulland-Dussoix, 1969)

Expressionsstudien

E. coli LMG194

F´�lacX74 galE thi rpsL � phoA (Pvu II) �ara714 leu::Tn10.

(Guzman et al., 1995)

Expressionsstudien

E. coli O17 F- (Kauffmann, 1944) Expressionsstudien E. coli SF8 C600 thr-, leu-, thi-, r-, m-, recB-, recC-

, lop-11, lig+

(Bachmann, 1972) Expressionsstudien

E. coli Top10 F- mcrA �(mrr-hsdRMS-mcrBC) �80lacZ�M15 �lacX74 deoR nupG recA1 araD139 �(ara-leu)7697 galU galK rpsL(StrR) endA1 �-

Invitrogen Klonierung, Expressionsstudien

E. coli XL1-blue

F'[ ::Tn10 proAB+ lacIq �(lacZ)M15] hsdR17(rK

- mK+)endA1 gyrA96(NalR)

thi-1 recA1 relA1 lac glnV44

Stratagene Expressionsstudien

2.1.32.1.3 Sonstige Stämme Sonstige Stämme

Des Weiteren standen für diese Studie noch verschiedene andere Bakterienstämme

zur Verfügung (Tab. 4).

Tab. 4: Weitere verwendete Bakterienstämme und ihre Verwendung in dieser Arbeit.

Stamm Referenz/Herkunft Verwendung Bacillus subtilis Marburg 168 (Burkholder & Giles, 1947) / DSMZ Sondendesign Geobacillus stearothermophilus DSM# 2313

(Nazina et al., 2001) / DSMZ Sondendesign

Thermus aquaticus YT-1 (Brock & Freeze, 1969) / DSMZ Sondendesign

2.22.2 Plasmide Plasmide

In dieser Arbeit wurden für die Erstellung von Genbanken, zur Klonierung von Genen

und Sequenzabschnitten und für die Expression verschiedene Plasmide (siehe Tab.

5) verwendet.

17


Tab. 5: Verwendete Plasmide, ihre Herkunft und Verwendung.

Plasmid Mr [kbp] Relevante Charaktere Verwendung Referenz

pUC13 2,7 Apr, lacZ� Klonierung (Vieira & Messing, 1987)

pNOFMCS 7 Apr, Ptac, endA* Subklonierung MOLZYM, Bremen pBAD/gIII A 4,1 Apr, PBAD, gIII ss,

6xHis-tag, rrnB, araC

Expressionsstudien Invitrogen

pBAD/gIII B 4,1 Apr, PBAD, gIII ss, 6xHis-tag, rrnB, araC

Expressionsstudien Invitrogen

pASK-IBA44 3,3 Apr, Ptet, OmpA ss; Strep-tag, 6xHis-tag, Rtet

Expressionsstudien IBA, Göttingen

pJF118EH 5,3 Apr, Ptac Expressionsstudien (Fürste et al., 1986) pCC1FOS (Fosmid)

8,1 Cmr, ori, oriV Erstellen von Genbanken, Expressionsstudien

Epicentre

pJF-subE ca. 6,4 Apr, aprE Expression Subtilisin E

diese Arbeit

pASK-subE ca. 4,4 Apr, aprE Expression Subtilisin E

diese Arbeit

pBAD-subE ca. 5,2 Apr, aprE Expression Subtilisin E

diese Arbeit

pBAD-Calmodulin 4,6 Apr, Kontrolle Expressionsstudien

Invitrogen

pJF-proAS(#748) ca. 6,8 Apr, proAS(#748) Expression ProAS(#748)

diese Arbeit

pASK- proAS(#748)

ca. 4,8 Apr, proAS(#748) Expression ProAS(#748)

diese Arbeit

pASK-proAS-ol(#748)

ca. 4,8 Apr, proAS(#748) Expression ProAS(#748) ohne WT-Signalpeptid

diese Arbeit

pBAD- proAS(#748)

ca. 5,6 Apr, proAS(#748) Expression ProAS(#748)

diese Arbeit

pBAD-proAS-ol(#748)

ca. 5,6 Apr, proAS(#748) Expression ProAS(#748) ohne WT-Signalpeptid

diese Arbeit

Abkürzungen: Apr= Ampicillin-Resistenz; Cmr= Chloramphenicol-Resistenz; endA*= modifiziertes endA-Gen ohne Leader-peptid-Sequenz für den Transport ins Periplasma; Ptac= IPTG-induzierbarer tac-Promotor; Ptet= Tetracyclin-Promotor; Rtet= Tetracyclin-Repressor; PBAD= araBAD Promotor; gIII ss= Gene III Sekretionssignalgen; 6xHis-tag= C-terminales Polyhistidin; rrnB= Transkription Terminatorregion; OmpA ss= OmpA Sekretionssignalgen; ori=single-copy F-Faktor; oriV= induzierbarer multi-copy Replikationsursprung; aprE=Subtilisin E-Gen; proAS(#748)= Peptidasegen des Stammes B12/10-1 (#748).

2.32.3 Synthetische Oligonukleotide (Primer) Synthetische Oligonukleotide (Primer)

Die in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide wurden von der Firma biomers.net

GmbH (Ulm) synthetisiert und dienten als Primer in PCR-Reaktionen wie

beschrieben.

18


Tab. 6: Eingesetzte synthetische Oligonukleotide. Bezeichnung Sequenz

(5’-3’) Target Anwendung+

Annealing-temperatur Referenz

DG74r AGGAGGTGATCCAACCGCA

16s rDNA A, S 46°C (Greisen et al., 1994)

R1n GCTCAGATTGAACGCTGGCG

16s rDNA A, S 46°C (Tichy & Simon, 1994)

U2 ACATTTCACAACACGAGCTG

16s rDNA A, S 46°C (Tichy & Simon, 1994)

970r CCACATGCTCCACCGCTTG

16s rDNA A, S 46°C Disqué, pers. Mitteilung

SubSrev GYSGCCATCGAWGTACC*

Serinpeptidasen A, P Gradient: 49-66°C

diese Arbeit

SubHfor GACTGTAAYGGYCAYGG*

Serinpeptidasen A, P, S Gradient: 49-66°C

diese Arbeit

SubDfor TATGTTATYGATACBGG*


diese Arbeit

subtilisin_for AAYGGNCAYGGNACNCAY*


(Jang et al., 2002)

subtilisin_rev YGGYGTYGCCAT NGANGT*


(Jang et al., 2002)

SubHraus301 AGCTTCTCAAACTGGGGCAGC

Serinpeptidasen S Gradient: 49-66°C

diese Arbeit

SubHraus96 TAGCGTTTGCTGCTGAGAG


diese Arbeit

SubHraus61 CCCCGCCAATCACGCCGGACG


diese Arbeit

pASK_subE_ leadfor

ATGGTAGGTCTCAGCGCCATGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAG

aprE (Subtilisin E) K: pASK-subE 60°C diese Arbeit

pASK_subE_rev ATGGTAGGTCTCAGGCCTTGTGC AGCTGCTTGTACGTTGA

aprE (Subtilisin E) K: pASK-subE 60°C diese Arbeit

sube_for GAATTCATGAGAAGCAAAAAATTGTGG

aprE (Subtilisin E) K: pJF-subE 60°C diese Arbeit

sube_rev GTCGACTTATTGTGCAGCTGCTTGT

aprE (Subtilisin E) K: pJF-subE 60°C diese Arbeit

sroga_for ATAGCGCTAGCATGAGAAGCAAAAAATTGTGG

aprE (Subtilisin E) K: pBAD-subE 53°C (Sroga & Dordick, 2002)

sroga_rev TTGTTCTAGAATTCCTTGTGCAGCTGCTTGTACG

apr E (Subtilisin E) K: pBAD-subE 53°C (Sroga & Dordick, 2002)

pASK13_1 leadfor

ATGGTAGGTCTCAGCGCCATGTTAAAGCATGCTCTTAGCTGTT

aprE (Subtilisin E) K: pASK-slp(#748)

60°C diese Arbeit

pASK13_1rev

ATGGTAGGTCTCAGGCCGTAACGGGCGGTCACGCTGAC

aprE (Subtilisin E) K: pASK-proAS(#748)

60°C diese Arbeit

Bad13_1for

AAACCATGGAACAACATGAAGGTAAACAAGG

proAS(#748) K: pBAD-proAS-ol(#748)

60°C diese Arbeit

Bad13_1leadfor

AAAACCATGGAAATGTTAAAGCATGCTCTTAGC

proAS(#748) K: pBAD-proAS(#748)

60°C diese Arbeit

Bad13_1rev AAAGAATTCAGTAACGGGCGGTCACGC

proAS(#748) K: pBAD-proAS(#748) & pBAD-proAS-ol(#748)

60°C diese Arbeit

+Anwendungs-Kürzel: A= PCR-Amplifikation, S= Sequenzierung; K= Klonierung. *Basencode für sog. „Wobbles“ (Nukleotid-gemische in degenerierten Primern): Y= C+T; S= C+G; W= A+T; B= C+G+T; N= A+C+G+T. Gelbe Markierung: Erkennungs-stelle für eingefügte Restriktionsschnittstellen.

19


2.42.4 Medien, Lösungen & Puffer Medien, Lösungen & Puffer

Alle Nährmedien wurden nach Lösen der Bestandteile in A. dest. und dem Einstellen

des gewünschten pH-Werts mit NaOH oder HCl autoklaviert (20 min, 121°C). Feste

Medien wurden durch die Zugabe von 1,5% (w/v) Agar-agar (Merck) in die Medien-

zusammensetzung vor dem Autoklavieren hergestellt. Hitzesensible Bestandteile,

wie etwa Antibiotika und Vitamine, wurden sterilfiltriert und nach dem Autoklavieren

hinzugefügt.

2.4.12.4.1 Luria-Bertani (LB) Medium (Sambrook & Russell, 2001) Luria-Bertani (LB) Medium (Sambrook & Russell, 2001)

LB-Medium: Pepton (Difco) 10 g/l Hefeextrakt (Difco) 5 g/l

Speisesalz 10 g/l pH: 7,5

2.4.22.4.2 Salinenmedium-Lanzarote (SML) (Sinn-Meyer, 2003) Salinenmedium-Lanzarote (SML) (Sinn-Meyer, 2003)

SML 12/8 (12% NaCl, pH8): Casamino Acids (Difco) 7,5 g/l Hefeextrakt (Difco) 10 g/l Speisesalz 120 g/l pH: 8 Zugabe nach Autoklavieren (aus sterilen Stammlösungen): Tri-Natrium-Citrat 11,6 mM Magnesiumsulfat 0,13 mM Calciumchlorid 0,05 mM Kaliumchlorid 28 mM FeCl2 0,18 mM Na2HPO4 10 mM

Für entsprechende Experimente konnte der jeweilige Salzgehalt und pH-Wert des

SML-Mediums variieren (NaCl: 1%, 2%, 6%, 10%,12%, 20%; pH-Wert: 8; 9,5).

2.4.32.4.3 M9 Minimal Medium (Sambrook & Russell, 2001) M9 Minimal Medium (Sambrook & Russell, 2001)

Die getrennt autoklavierten Bestandteile wurden steril zum M9-Medium zusammen-

gefügt. Zur Anzucht von Vitamin-defizienten E. coli-Stämmen wurden entsprechende

Vitamine (siehe Tab. 8) aus sterilfiltrierten Lösungen hinzugefügt.

Bestandteile M9-Medium (1l): A. dest. 776 ml 5x M9 Salzlsg. 200 ml 1 M MgSO4 2 ml 20% Glucose-Lsg. 20 ml 50 mM CaCl2 2 ml

20


2.4.42.4.4 M9-Salzlösung (5x) (Sambrook & Russell, 2001) M9-Salzlösung (5x) (Sambrook & Russell, 2001)

Bestandteile M9-Salzlösung (5x): Na2HPO4*7H2O 64 g/l KH2PO4 15 g/l NaCl 2,5 g/l NH4Cl 5 g/l

2.4.52.4.5 RM-Medium (Sambrook & Russell, 2001) RM-Medium (Sambrook & Russell, 2001)

Bestandteile RM-Medium (1l): A. dest. 776 ml 5x M9 Salzlsg. 200 ml 20% Casamino

Acids 100 ml

20% Glucose-Lsg. 10 ml 1 M MgCl2 1 ml

2.4.62.4.6 Feste Medien für den Nachweis extrazellulärer Peptidasen Feste Medien für den Nachweis extrazellulärer Peptidasen

Als Grundlage für die Peptidase-Plattentests wurden je nach verwendetem Stamm

und Versuch die festen Medien aus 2.4.1; 2.4.2 und 2.4.3 verwendet und die

Substrate aus Tab. 7 hinzugefügt.

Tab. 7: Peptidase-Plattentests, ihre Substrate und Zusammensetzung.

Plattentest Substrat Menge [g/l] modifiziert nach Bemerkungen

Skimmilk-Agar

Magermilch-pulver (Sucofin)

20 (DeShazer et al., 1999)

Dem Medium wurde nach Autoklavieren 2% Magermilch aus einer 20% Mager-milch-Stammlösung unter Rühren hin-zugegeben und die Platten sofort gegossen. Schnelles Abkühlen verhindert die Ausflockung der Magermilch.

Gelatine-Hydrolyse

Gelatine (Merck)

10 (Klemme & Pfleiderer, 1977)

Die Gelatine wurde vor dem Autoklavieren zugegeben.

Casein-Agar

Casein (Carl Roth)

10 (Cowan & Daniel, 1982)

Das Casein wurde vor dem Auto-klavieren dem Medium zugegeben.

2.4.6.11 Skimmilk-Agarose für den Peptidasenachweis in PA-Gelen elen2.4.6. Skimmilk-Agarose für den Peptidasenachweis in PA-G

Zum Nachweis von Peptidase-Aktivität in Polyacrylamidgelen wurden dünne

Skimmilk-Agaroseplatten in Petrischalen gegossen. Agarose (2%) wurde in

Aktivitätspuffer (30 mM Tris-HCl, pH 9, 50 mM NaCl) durch Kochen gelöst und beim

Abkühlen unter Rühren mit 0,5-1% Magermilchlösung versetzt. Um eine Ausflockung

der Magermilch zu vermeiden, wurden die Platten sofort nach dem Gießen gekühlt.

2.4.72.4.7 Antibiotika und Medien-Zusätze Antibiotika und Medien-Zusätze

Zur Kultivierung von Trägern resistenzvermittelnder Plasmide wurden entsprechende

Antibiotika dem Medium, wie in Tab. 8 aufgeführt, zugegeben. Die sterilfiltrierten

21


Stammlösungen wurden dem Medium nach dem Autoklavieren bei etwa 55°C hinzu-

gefügt. Ebenso wurde mit den Medienzusätzen zur Induktion von plasmidlokalisierten

Promotoren (Tab. 8) verfahren.

Tab. 8: Antibiotika und andere Medien-Zusätze.

Substanz Stammlösung Endkonzentration Antibiotika:

Chloramphenicol 12,5 mg/ml 12,5 μg/mlAmpicillin 120 mg/ml 120 μg/ml

Induktoren: L-Arabinose 20% bzw. 133 mM 1,3-33 mM

IPTG 1 M 1 mMAnhydrotetracyclin* 400 μg/ml 0,05-0,2 μg/ml

Vitamine: Thiamin 100 mg/ml 0,1 mg/ml

*Anhydrotetracyclin wurde in dieser Arbeit als Induktor für den Expressionsvektor pASK-IBA44 verwendet und besitzt eine wesentlich schwächere antibiotische Wirkung als Tetracyclin (Degenkolb et al., 1991).

2.4.82.4.8 Puffer und Lösungen Puffer und Lösungen

- Denaturierungslösung (Kolonieblot): 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl

- FA-Elektrophoresepuffer (1x): 20 mM MOPS (free acid); 5 mM Na-Acetat;

1 mM EDTA; 0,74% Formaldehyd; pH 7,0

- Hybridisierungslösung: 1μl DIG-markierte Sonde pro 1 ml

Prähybridisierungslösung

- Magermilch (20%): 20% (w/v) Magermilchpulver (Sucofin) wurde in A. dest.

vollständig gelöst und kurz autoklaviert (max. 7 min, 121°C). Lagerung: 4°C.

- Neutralisierungslösung (Kolonieblot): 1 M Tris-HCl pH7,5; 1,5 M NaCl

- Osmotic Shock-Lösung 1 (OS1): 20 mM Tris-HCl, pH 8; 2,5 mM EDTA;

20% Saccharose

- Osmotic Shock-Lösung 2 (OS2): 20 mM Tris-HCl, pH 8; 2,5 mM EDTA

- PA-Gel-Waschpuffer: 0,1% Tween 20, 30 mM Tris-HCl pH 9

- Peptidase-Reaktionspuffer (1x): 30 mM Tris-HCl, pH 9; 5mM NaCl

- Prähybridisierungslösung: 5x SSC; 0,1% N-Laurolylsarkosin; 0,2% SDS;

2% Blocking Reagenz (Roche); 50% deionisiertes Formamid

- SDS-Probenpuffer, 4x (PAGE): 252 mM Tris-HCl, pH 6,8, 40% Glycerin,

8% SDS, 0,01% Bromphenolblau

- SSC (20x): 174 g/ l NaCl; 88,2 g/l Tri-Natrium-Citrat; pH 7

- Tris-Glycin-Puffer, 10x (PAGE): 0,25 M Tris-Base (Sigma), 1,92 M Glycin,

1% SDS

22


2.4.92.4.9 Chemikalien Chemikalien

Die in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien wurden, wenn nicht anders vermerkt,

von den Firmen Merck, Sigma, Fluka und Carl Roth (Deutschland) in p.a.-Qualität

bezogen.

2.52.5 Mikrobiologische Methoden Mikrobiologische Methoden

2.5.12.5.1 Anzucht der halophilen Isolate Anzucht der halophilen Isolate

Die für diese Arbeit ausgewählten Stämme (Tab. 35) wurden der bei -80°C hinter-

legten Stammsammlung entnommen. Die Reaktivierung der Stämme erfolgte auf

SML-Agarplatten bei den entsprechenden Isolationsbedingungen der jeweiligen

Stämme bei 30°C im Brutschrank. Zur Kultivierung in Flüssigkultur wurden die

Stämme 1:10 aus ÜNK angeimpft und, wenn nicht anders angegeben, bei 30°C und

200 rpm in max. ¼ gefüllten Erlenmeyerkolben in Schüttelinkubatoren inkubiert.

2.5.22.5.2 Anzucht der Klonier- und Expressionsstämme Anzucht der Klonier- und Expressionsstämme

Die E. coli-Stämme (Tab. 3) wurden auf LB-Medium ausgestrichen und bei 37°C im

Brutschrank (Heraeus) über Nacht inkubiert. Flüssigkulturen wurden in LB-Medium

mit einer Einzelkolonie angeimpft und bei 37°C mit 140-200 rpm im Schüttelinkubator

inkubiert. Wenn Stämme als Träger für resistenzvermittelnde Plasmide verwendet

wurden, enthielt das Medium das entsprechende Antibiotikum (Tab. 8).

2.62.6 Proteinbiochemische Methoden Proteinbiochemische Methoden

2.6.12.6.1 Gewinnung von zellfreien Kulturüberständen Gewinnung von zellfreien Kulturüberständen

Zur Gewinnung zellfreier enzymhaltiger Kulturüberstände wurden die Bakterienzellen

mittels Zentrifugation (Volumen <2ml: 1 min, 11.000 x g; >2ml: 30 min, 6000 x g)

abgetrennt und der Überstand sterilfiltriert (Porendurchmesser: 0,45 μm). Alle Proben

wurden bei +4°C gelagert.

2.6.22.6.2 Protein-Fällung der Kulturüberstände Protein-Fällung der Kulturüberstände

Die Fällung der Proteine in den Kulturüberständen (mit 12% NaCl-Gehalt) erfolgte mit

Ammoniumsulfat bzw. Ethanol (Coligan et al., 1998). Die Zugabe der Fällmittel wurde

sehr langsam unter Rühren mit anschließender Inkubation über Nacht auf Eis durch-

23


geführt. Ammoniumsulfat wurde bis zur Sättigung (ca. 490 g/l) und Ethanol zu

85% (v/v) den salzhaltigen Kulturüberständen zugegeben. Die Präzipitate wurden

durch Zentrifugation (20.000 x g, 30 min, 4°C) abgetrennt und anschließend in Tris-

HCl-Puffer (30 mM, pH 9) aufgenommen.

Eine anschließende Dialyse gegen das 50-fache Volumen Tris-HCl-Puffer (30 mM,

pH 9) in Dialyseschläuchen (Servapor, Serva; Ausschlussgrenze ca. 14 kDa) bei 4°C

entfernte noch vorhandene Salze.

2.6.32.6.3 Dialyse gegen Polyethylenglykol 3500 Dialyse gegen Polyethylenglykol 3500

Eine Aufkonzentrierung der Kulturüberstände erfolgte mittels Dialyse gegen 5 l 30-

40% Polyethylenglykol 3500 in 30 mM Tris-HCl, pH 9 in Dialyseschläuchen

(Servapor, Serva; Ausschlußgrenze ca. 14 kDa). Die Dialyse wurde bis zur

gewünschten Einengung der Proben auf Eis unter Rühren durchgeführt. Das PEG

3500 konnte mehrfach verwendet werden. Eine anschließende Dialyse der Probe

gegen das 50-fache Volumen Tris-HCl-Puffer (30 mM, pH 9) entfernte noch

vorhandene Salze.

2.6.42.6.4 Proteinbestimmung mit BCA (Bicinchoninic Acid)-Methode Proteinbestimmung mit BCA (Bicinchoninic Acid)-Methode

Die Proteinbestimmung erfolgte mit dem BCA-Assay-Kit QuantiPro (Sigma) nach

Anweisung. Für den Nachweis wurden 50 μl Probe mit 50 μl BCA-Lösung gemischt

und 1 h bei 60°C inkubiert. Die anschließende Absorptionsmessung und Bestimmung

des Proteingehaltes wurde mit einem BioPhotometer (Eppendorf) bei 562 nm durch-

geführt. Die Konzentrationsberechnung erfolgte anhand einer zuvor erfassten

Kalibration mit einer BSA-Verdünnungsreihe (5, 10, 20, 30 und 50 μg/ml). Die

Bestimmung des Proteingehaltes erfolgte für jede Probe über eine Dreifachmessung.

Inhibitorische Effekte bei der Bestimmung des Proteingehaltes durch den hohen

Salzgehalt im SML-Medium wurden mittels TCA-Fällung der Proteine (QuantiPro

BCA-Assay-Kit) und anschließender Lösung in A. dest. beseitigt.

2.6.52.6.5 Heterologe Proteinexpression in E. coli Heterologe Proteinexpression in E. coli

Die heterologe Proteinexpression wurde in verschiedenen E. coli-Stämmen (siehe

Tab. 3) untersucht. Dabei wurden alle Expressionsexperimente mit Kulturen von

frisch transformierten Zellen, bzw. mit deren bei -80°C hinterlegten Zellen durch-

geführt. Die Kulturen wurden, wenn nicht anders erwähnt, aus ÜNK 1:10 in 20 ml LB,

M9 oder RM mit den entsprechenden Antibiotika (Tab. 8) in 100 ml Erlenmeyer-

24


kolben inokuliert und bei 37°C und 200 rpm inkubiert. Die Induktion mit den

jeweiligen Substanzen und eine eventuelle Senkung der Inkubationstemperatur

erfolgten bei einer OD600nm von 0,5.

2.6.62.6.6 Zellernte und Zellaufschluss Zellernte und Zellaufschluss

Die Expressionsstudien machten es erforderlich neben der zellfreien Kultur die cyto-

plasmatische und periplasmatische Fraktion der E. coli-Zellen nach heterolog

exprimierten Peptidasen zu untersuchen. Nach Bestimmung der OD600nm wird die

extrazelluläre Fraktion durch Abtrennen der Überstände nach Zentrifugation von 1-5

ml Kultur (1 min, 11.0000 x g) im ERG separiert. Zur Gewinnung der peri-

plasmatischen Fraktion wird mit dem verbliebenen Zellpellet eine osmotische

Schockprozedur durchgeführt. Das Zellpellet wird dazu mit OS1-Lösung (siehe 2.4.8)

resuspendiert. Das Volumen der eingesetzten Puffer wird rechnerisch bestimmt, so

dass die Lösung einer OD600nm von 5,0 entspricht.

Der Ansatz wird 10 min auf Eis inkubiert und danach für 1 min (11.000 x g; 4°C)

zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Zellpellet wird mit der zuvor

ermittelten Menge an OS2-Lösung (siehe 2.4.8) resuspendiert und 10 min auf Eis

inkubiert. Der Überstand nach einer weiteren Zentrifugation (10 min, 11.000 x g; 4°C)

wird als periplasmatische Fraktion in ein ERG überführt. Für die cytoplasmatische

Fraktion wird das verbliebene Zellpellet mit 5μl Lysozym (100mg/ml) in

entsprechender Menge (s.o.) RS-Puffer (MOLZYM) bei 37°C für 30 min lysiert.

Die Aktivitätsbestimmung der Zell-Fraktionen erfolgte im Fluoreszenzassay (2.6.11.2)

unter Standardbedingungen.

2.6.72.6.7 Säulenchromatografie Säulenchromatografie

Bei den vorgenommenen Säulenchromatografien wurde eine FPLC (Äkta FPLC,

Amersham Biosciences) mit angeschlossenem Fraktionssammler (Frac 950,

Amersham Biosciences) eingesetzt. Alle Arbeitsschritte fanden bei RT statt.

2.6.7.12.6.7.1 Anionenaustauschchromatografie Anionenaustauschchromatografie

Eine Anreicherung des Enzyms aus zellfreier Kultur wurde mittels Q-Sepharose Fast

Flow (Amersham Biosciences) geprüft. Die 14 ml Säule wurde mit 10-fachem

Säulenvolumen 50 mM Tis-HCl, pH 8 äquilibriert. Als Probe diente 400 ml zellfreie

Kultur, der zuvor gegen 50x Volumen 50 mM Tris-HCl, pH 8 dialysiert wurde. Der

Auftrag auf die Säule erfolgte mit 1-2 ml/min und anschließender Wäsche mit 10x

25


Säulenvolumen 50 mM Tris-HCl, pH 8. Die Elution erfolgte über einen KCl-

Gradienten (Start: 50 mM Tris-HCl, pH 8, bis 1 M KCl in demselben Puffer) mit einer

Flussrate von 2 ml/min über 180 min (6,5 Säulenvolumen). Das Volumen der

einzelnen Fraktionen betrug 2 ml.

2.6.7.22.6.7.2 Hydrophobe Interaktionschromatografie Hydrophobe Interaktionschromatografie

Die Anreicherung von Peptidasen aus Kulturüberständen sollte mittels Phenyl-

sepharose 6 Fast Flow (Amersham Biosciences) geprüft werden. Die 25 ml Säule

wurde mit dem 10-fachen Säulenvolumen 1 M Ammoniumsulfat, 50 mM Tris-HCl,

pH 8, äquilibriert. Die zellfreie salzhaltige Kultur wurde vor dem Auftragen mit 1 M

Ammoniumsulfat versetzt und mit NaOH auf pH 8 eingestellt. Der Probenauftrag auf

die Säule erfolgte mit einer Flussrate von 1-1,5 ml/min. Die Säule wurde

anschließend mit dem 15-20-fachen Säulenvolumen mit 1 M Ammoniumsulfat,

50 mM Tris-HCl, pH 8 (Flussrate: 2 ml/min) gewaschen. Die Elution erfolgte über

einen Ammoniumsulfat-Gradienten (Start: 1 M in 50 mM Tris-HCl, pH 8; Ende: Puffer

ohne Ammoniumsulfat) mit einer Flussrate von 1-2 ml/min über 120 bzw. 180 min.

Nach Erreichen des Gradienten-Endes wurden noch weitere 50-100 min mit Puffer

gewaschen. Das Volumen der einzelnen Fraktionen betrug 2 ml. Zur Regeneration

der Säule wurde die bräunlich verfärbte Matrix mit 10x Säulenvolumen 1 M NaOH

und anschließender Wäsche mit 20 x Säulenvolumen A. dest. gewaschen.

Zur Messung der Peptidase-Aktivität in den Fraktionen wurden die Proben zuvor

gegen 30 mM Tris, pH 9 dialysiert.

2.6.7.32.6.7.3 Gelfiltrationschromatografie Gelfiltrationschromatografie

Zur Auftrennung der enzymhaltigen Fraktionen aus der hydrophoben Interaktions-

chromatografie standen zwei verschieden große Gelfiltrationssäulen zur Verfügung.

Die Fraktionspools wurden vor dem Auftrag mittels Dialyse gegen PEG (siehe 2.6.3)

20x-40x aufkonzentriert. Die beiden Superdex 200 HiLoad (Amersham Biosciences)

Säulen (30 cm mit V0=8,06 ml bzw. 60 cm mit V0= 44,4 ml) wurden mit 50 mM Tris-

HCl, pH 8, äquilibriert. Das Auftragen von 50-250 μl Probe und die Elution mit

Äquilibrierungspuffer erfolgten mit einer Fließrate von 0,2 ml/min. Die Fraktionsgröße

betrug 0,5-1 ml. Die Peptidase-Aktivität der Fraktionen wurde mit dem Fluoreszenz-

assay (2.6.11.2) bestimmt.

26


Zur Bestimmung des Molekulargewichts gereinigter Peptidasen wurden Standard-

proteine (Gel Filtration HMW Calibration Kit und Gel Filtration LMW Calibration Kit,

beide Amersham Biosciences) für die Gelfiltration herangezogen.

2.6.82.6.8 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970, SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970,modifiziert) modifiziert)

Zur Analyse der extrazellulären Proteine und Peptidasepräparationen wurden diese

mittels 1,5 mm dicken 10% oder 12% Tris-Glycin-SDS-Polyacrylamidgelen getrennt.

Die Herstellung der PA-Gele erfolgte mit den in Tab. 9 und Tab. 10 angegeben

Bestandteilen gemäß Anleitung (Sambrook & Russell, 2001) in Minigel-Kassetten mit

10-Taschen Kamm (Invitrogen). Die Auftrennung erfolgte in einer Minigelkammer

(XCell SureLock, Invitrogen) für vertikale Gele mit 125 V in Tris-Glycin-Puffer. Die

Proben wurden, wenn nicht anders angegeben, vor dem Auftragen mit SDS-Proben-

puffer versetzt und für 5 min bei 85°C denaturiert. Als Größenmarker dienten

entweder PageRuler-Prestained-Protein-Ladder (Fermentas) oder RotiMark Standard

(Carl Roth).

Tab. 9: Zusammensetzung von 25 ml Lösung zur Herstellung von ca. 3 Trenngelen für die Tris-Glycin SDS-Polyacrylamid Gel Elektrophorese (Sambrook & Russell, 2001). Substanz 10% 12% A. dest. 9,9 ml 8,2 ml30% Acrylamid-Mix (Sigma) 8,3 ml 10 ml1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) 6,3 ml 6,3 ml10% SDS 0,25 ml 0,25 ml10% Ammoniumpersulfat 0,25 ml 0,25 mlTEMED 0,01 ml 0,01 ml Tab. 10: Zusammensetzung von 8 ml Lösung zur Herstellung von ca. 3 Sammelgelen (5%) für die Tris-Glycin SDS-Polyacrylamid Gel Elektrophorese (Sambrook & Russell, 2001). Bestandteile A. dest. 5,5 ml30% Acrylamid-Mix (Sigma) 1,3 ml1,0 M Tris-HCl (pH 6,8) 1,0 ml10% SDS 0,08 ml10% Ammoniumpersulfat 0,08 mlTEMED 0,008 ml Die Proteinbanden wurden nach der Auftrennung mittels Silberfärbung (Roti-Black P,

Carl Roth) sichtbar gemacht.

Für die Herstellung von Zymogramm-Gelen wurden 1% (w/v) Gelatine oder Casein

dem Trenngel vor der Polymerisation hinzugegeben (Teo et al., 2003).

27


2.6.92.6.9 Detektion von Peptidase-Aktivität auf festen Medien Detektion von Peptidase-Aktivität auf festen Medien

Die extrazelluläre Peptidase-Aktivität der Isolate und Expressionsklone wurde mittels

verschiedener Plattenassays (2.4.6) detektiert (Tab. 11). Im Gegensatz zum

Gelatine-Hydrolyse-Assay konnte die Peptidase-Aktivität beim Skimmilk- und Casein-

Agar während des Wachstums der Stämme beobachtet werden. Als empfindlichste

Detektionsmethode erwies sich der Skimmilk-Agar, der hauptsächlich in dieser

Studie eingesetzt wurde.

Tab. 11: Peptidase-Plattenassays Plattentest Auswertung Skimmilk-Agar Klarzonen im milchigtrüben Skimmilk-Agar zeigen Peptidase-Aktivität an. Gelatine-Hydrolyse Nach Überschichten der Agarplatte mit gesättigter Pikrinsäure in Ethanol

(50%) sind hydrolysierte Bereiche als durchscheinende Klarzonen von dem gelblichtrüben Gelatineagar zu unterscheiden.

Casein-Agar Klarzonen im trüben Casein-Agar zeigen Peptidase-Aktivität an.

2.6.102.6.10 Peptidasenachweis im Polyacrylamid-Gel (Kontakt-Zymogramm) Peptidasenachweis im Polyacrylamid-Gel (Kontakt-Zymogramm)

In Vorversuchen erwies sich die Verwendung von SDS-PA-Gelen mit copoly-

merisierten Proteinen (Casein- oder Gelatine-Zymogramm-Gele) mit anschließender

Aktivitätsfärbung für die Zuordnung von Peptidase-Aktivität zu einzelnen Protein-

banden als ungeeignet. Große ungefärbte proteolytische Aktivitätsbereiche im hoch-

bis mittelmolekularen Bereich des Gels ließen auf Peptidase-Aktivität während der

Elektrophorese schließen.

Die Auftrennung der Proben musste demzufolge getrennt vom anschließend einge-

setzten Substrat für den Peptidasenachweis erfolgen.

So erfolgte die Auftrennung der Proben durch Tris-Glycin-PAGE (siehe Abschnitt

2.6.8). Allerdings wurden die Proben vor dem Auftragen nicht erhitzt und die Kammer

während des Gel-Laufes mit Eis gekühlt.

Nach dem Lauf wurde das im Gel enthaltene SDS mit 2 x 30 min Bädern in 0,1%

Tween 20 entfernt. Das Gel wurde nach der Wäsche mittig geteilt und die eine Hälfte

zur Detektion der Proteinbanden silbergefärbt (siehe 2.6.8), während mit der anderen

Hälfte der Aktivitätsnachweis erfolgte. Das Gelstück wurde auf Skimmilk-Agarose

(siehe 2.4.6.1) in einer Petrischale platziert und die Lage des Gels, der Taschen und

des vorgefärbten Proteinstandards markiert. Während der anschließenden Inkubation

bei 37°C erfolgte eine ständige Kontrolle der Peptidase-Aktivität. Enzymatische

Aktivität war durch das Aufklären des milchigen Skimmilk-Agars zu erkennen. Zur

Verdeutlichung der Klarzonen erfolgte eine abschließende Gegenfärbung der

28


unverdauten Proteine mittels Coomassie-Färbung (PageBlue, Fermentas). Ein

Vergleich mit der silbergefärbten Hälfte des Gels ermöglichte die Zuordnung der

Aktivitätsbereiche zu einzelnen Proteinbanden.

2.6.112.6.11 Quantitative Peptidase-Aktivitätsbestimmung Quantitative Peptidase-Aktivitätsbestimmung

In der vorliegenden Studie wurden für die quantitative Bestimmung der Peptidase-

Aktivität der zellfreien Kultur und angereicherten Fraktionen drei verschiedene in vitro

Peptidaseassays eingesetzt.

2.6.11.12.6.11.1 Azocasein-Assay (Charney & Tomarelli, 1947, modifiziert) Azocasein-Assay (Charney & Tomarelli, 1947, modifiziert)

Dieser spektrophotometrische Assay basiert auf der Detektion von Azofarbstoff, der

bei der enzymatischen Hydrolyse von Azocasein (Sigma) freigesetzt wird. Als Azo-

casein bezeichnet man Casein, dessen aromatische Aminosäuren mittels Diazo-

Gruppen markiert wurden; es stellt gleichbedeutend wie Casein ein Substrat für

diverse proteolytische Enzyme dar.

Es wurden 50 μl Peptidase-Reaktionspuffer (4x) mit 100 μl Azocasein (2% w/v) in

einem ERG auf Eis gemischt und zum Start der Reaktion 50 μl enzymhaltige Probe

oder Probenverdünnung hinzugegeben. Die Inkubation erfolgte, wenn nicht anders

angegeben, für 30 min bei 37°C in einem Wasserbad.

Die Reaktion wurde mit 1 ml 5% Trichloressigsäure gestoppt und nicht abgebautes

Azocasein durch Zentrifugation (15 min, 14.000 rpm, 4°C) sedimentiert. Der im

Überstand gelöste freigesetzte Azofarbstoff wurde bei 340 nm im Photometer

(Shimadzu) quantifiziert. Als Blindwert dient je Probe ein Ansatz, der vor Inkubation

mit 1 ml TCA inaktiviert wurde. Wenn nicht anders angegeben, erfolgte die

Bestimmung enzymatischer Aktivität der Proben im Dreifachansatz.

Die Aktivität wurde in Azocasein-Einheiten (AzU) angegeben, dabei entsprach eine

Azocaseinunit einer Absorptionsänderung von 0,1 nach 30 min bei 37°C unter den

angegebenen Reaktionsbedingungen.

2.6.11.22.6.11.2 EnzCheck Protease Assay Kit (Invitrogen) EnzCheck Protease Assay Kit (Invitrogen)

Der Fluoreszenzassay EnzCheck Protease Assay Kit (Invitrogen) basiert auf Casein,

welches mit einem Fluoreszenzfarbstoff (BODIPY) markiert wurde. Die Markierung

mit Fluoreszenzfarbstoff schließt dabei auch nicht aromatische Aminosäuren des

Caseins ein. Der im intakten Konjugat gequenchte Farbstoff entfaltet nach der

enzymatischen Degradation des Caseinkonjugates seine Fluoreszenz.

29


Der Assay wurde leicht modifiziert von der Vorschrift (EnzCheck Protease Assay Kit,

Invitrogen) angewendet.

Der Assay wurde in schwarzen 96-well Mikrotiterplatten auf Eis pipettiert, zu 50 μl

Substrat wurden 25 μl Peptidase-Reaktionspuffer (4x) und 25 μl enzymhaltige Probe

oder Verdünnung zugegeben, wobei mit Zugabe der Probe die Reaktion gestartet

wurde.

Die Fluoreszenzmessungen erfolgten in einem Bio-Tek, FL600 Fluoreszenzreader

(Excitation 485 nm/20, Emission 530 nm/25, sensitivity: 100 und 125, Temp: 37°C).

Die Fluoreszenzmessung erfolgte bis zu 4 h, wobei alle 30 min eine Messung

vorgenommen wurde.

Zur Auswertung der Aktivität wurde die Fluoreszenz des Startwertes (0 min) vom

jeweiligen Endwert (30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 oder 240 min) subtrahiert.

Die Aktivität wurde in Fluoreszenz-Einheiten (FlU) angegeben, dabei entsprach eine

Fluoreszenz-Unit einer Fluoreszenzsteigerung von 1000 in 30 min bei der

Fluorometer-Sensitivität von 100.

2.6.11.32.6.11.3 Casein-Assay (Kunitz, 1947, modifiziert) Casein-Assay (Kunitz, 1947, modifiziert)

Casein stellt ein Substrat für diverse proteolytische Enzyme dar. Dieser spektro-

photometrische Assay basiert auf der Detektion säurelöslicher aromatischer

Aminosäuren, welche bei der enzymatischen Hydrolyse von Casein freigesetzt

werden. Nicht umgesetztes Casein und Oligopeptide werden vor der Messung durch

eine Säurefällung mittels Trichloressigsäure entfernt. Zur Quantifizierung der

aromatischen Aminosäuren kann eine Kalibration mittels einer Tyrosin-Verdünnungs-

reihe erfolgen.

Der Assay wurde in ERGs auf Eis pipettiert, zu 50 μl alkalilöslichem Casein (2% w/v;

Carl Roth) wurden 25 μl Peptidase-Reaktionspuffer (4x) und 25 μl enzymhaltige

Probe oder Verdünnung zugegeben, wobei mit Zugabe der Probe die Reaktion

gestartet wurde. Die Inkubation erfolgte, wenn nicht anders angegeben, für 30 min in

einem Wasserbad bei 37°C.

Die Reaktion wurde mit 100 μl 20% Trichloressigsäure gestoppt und nicht

degradiertes Casein durch Zentrifugation (15 min, 11.000 x g, 4°C) sedimentiert. Die

Messung erfolgte bei 280 nm im Biophotometer (Eppendorf). Als Blindwert diente je

Probe ein Ansatz, der vor Inkubation mit 100 μl TCA inaktiviert wurde. Wenn nicht

30


anders angegeben, erfolgte die Bestimmung enzymatischer Aktivität der Proben im

Dreifachansatz.

Die Aktivität wurde in Kunitz-Einheiten (KuU) angegeben, dabei entsprach eine

Kunitz-Unit dem Äquivalent von 1 μmol Tyrosin pro min (Kunitz, 1947) unter den

dargestellten Reaktionsbedingungen.

2.6.11.42.6.11.4 Bestimmung der pH-Abhängigkeit der Peptidase-Aktivität Bestimmung der pH-Abhängigkeit der Peptidase-Aktivität

Für die Bestimmung der pH-Abhängigkeit der Peptidase-Aktivität wurden sowohl der

Casein-Assay als auch der Fluoreszenzassay verwendet. Für die unterschiedlichen

pH-Bereiche wurden 10-fach konzentrierte Puffer mit der Endkonzentration im Assay

von 50 mM eingesetzt: NaAc/Essigsäure (pH 3,6; pH 4; pH 5), Na2HPO4/KH2PO4

(pH 6), Tris/HCl (pH 7; pH 7,5; pH 8; pH 8,5; pH 9; pH 9,5; pH 10), Glycin/NaOH (pH

9,5; pH 10,3; pH 11,2; pH 12; pH 13). Die Herstellung der Puffer erfolgte durch

Mischen der Puffergrundsubstanzen in einem Verhältnis, bis sich der gewünschte

pH-Wert einstellte.

2.6.11.52.6.11.5 Einfluss von chaotropen Salzen auf die Peptidase-Aktivität Einfluss von chaotropen Salzen auf die Peptidase-Aktivität

Für die Untersuchungen zum Einfluss von Guanidinisothiocyanat (GuSCN) und

Guanidinhydrochlorid (GuHCl) auf die Peptidase-Aktivität wurden alle drei in vitro

Peptidase-Assays (Abschnitte 2.6.11.1, 2.6.11.2 und 2.6.11.3) verwendet.

Die chaotropen Salze wurden vornehmlich aus 5 M Stammlösungen in den Assays

eingesetzt, alle Stammlösungen waren mit 30 mM Tris-HCl versetzt und auf pH 9

eingestellt. Höhere GuHCl-Konzentrationen (Endkonzentration: 3-5 M) wurden im

Assay mit 10 M GuHCl-Lsg. eingestellt (diese wurde zur besseren Löslichkeit zuvor

auf 50°C erhitzt).

Aufgrund der Gefahr der Blausäure-Bildung wurden alle Proben, die GuSCN

enthielten, nach der Säurefällung unter dem Abzug weiterbehandelt. Bei Proben mit

höheren Konzentrationen von chaotropen Salzen (> 1 M) kam es teilweise nach

Säurefällung und Zentrifugation zur Kristallisation der Salze. Diese wurden vor der

Messung durch Zentrifugation sedimentiert.

2.6.11.62.6.11.6 Einfluss von NaCl und Metallionen auf die Peptidase-Aktivität Einfluss von NaCl und Metallionen auf die Peptidase-Aktivität

Zur Untersuchung des Einflusses von NaCl und anderen Salzen auf die Peptidase-

Aktivität wurden die jeweiligen Substanzen aus 0,5 und 5 M (NaCl) und 1 M (KCl,

MnCl2, MgCl2, FeCl2, CaCl2, CuSO4) Stammlösungen dem Reaktionspuffer

31


zugefügt. Der Einsatz der Metallionen erfolgte mit einer End-Konzentration von 2 mM

im Assay.

2.6.11.72.6.11.7 Einfluss der Temperatur auf die Peptidase-Aktivität Einfluss der Temperatur auf die Peptidase-Aktivität

Die Testansätze wurden auf Eis pipettiert und anschließend in verschieden

temperierten Wasserbädern inkubiert. Für den Fluoreszenzassay kamen auch

elektronisch geregelte Pelltierelemente zum Einsatz (Mastercycler gradient,

Eppendorf). Die Ansätze wurden in 96-well PCR-Platten im Mastercycler bei

entsprechend eingestellten Temperaturen (4°-96°C) für 30 min inkubiert und sofort in

schwarze Mikrotiterplatten transferiert und im Fluorometer gemessen (2.6.11.2).

2.72.7 Molekularbiologische Methoden Molekularbiologische Methoden

2.7.12.7.1 Nukleinsäure-Extraktion aus Bakterien Nukleinsäure-Extraktion aus Bakterien

2.7.1.12.7.1.1 Extraktion chromosomaler DNA Extraktion chromosomaler DNA

Die chromosomale DNA der untersuchten halophilen Stämme (Tab. 35 im Anhang)

wurde mittels PrestoSpin D Bug-Kit (MOLZYM, Bremen) aus 2-5 ml Kultur isoliert.

Die DNA wurde mit 100-250 μl EB-Puffer eluiert und bei + 4°C gelagert.

2.7.1.22.7.1.2 Isolierung von RNA aus E. coliIsolierung von RNA aus E. coli

Gesamt-RNA aus E. coli wurde aus 1 ml log-Kultur mit dem PrestoSpin R Bug-Kits

(MOLZYM, Bremen) gewonnen. Die RNA wurde in 100 μl EB-Puffer eluiert und bei

-20°C gelagert. Die Isolierung und weitere Arbeiten mit RNA wurden unter Beachtung

der Arbeitsanweisung (MOLZYM) für RNase-freies Arbeiten durchgeführt.

2.7.1.32.7.1.3 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coliIsolierung von Plasmid-DNA aus E. coli

Die Plasmid-DNA aus dem transformierten E. coli-Stämmen wurde aus 2-10 ml

Kultur (18h, 37°C, 200 rpm) mit Hilfe des Ultraprep Plasmid Mini oder PrestoSpin D

Plasmid Midi-Kits (beide MOLZYM, Bremen) extrahiert. Die Plasmid-DNA wurde in

100-500 μl EB-Puffer eluiert und bei -20°C gelagert.

2.7.1.42.7.1.4 Isolierung von Fosmid-DNA aus E. coliIsolierung von Fosmid-DNA aus E. coli

Zur Vorbereitung der Fosmid-Isolierungen wurde die Kopiezahl der Fosmide pro

Zelle durch Induktion der E. coli-Kulturen mit L-Arabinose (0,1% w/v) erhöht. Die

Fosmid-DNA wurde aus 20-100 ml induzierter Kultur (18h, 37°C, 200 rpm) mit Hilfe

32


des PrestoSpin D Plasmid Midi-Kits (MOLZYM, Bremen) isoliert. Die Fosmid-DNA

wurde in 200 μl EB-Puffer eluiert und bei -20°C gelagert.

2.7.22.7.2 Agarose-Gelelektrophorese und Dokumentation Agarose-Gelelektrophorese und Dokumentation

Die Auftrennung der DNA-Fragmente erfolgte gewöhnlich in einem horizontalen 0,8%

Agarosegel in TAE-Puffer. Als Gelkammer wurde das Gator Gelsystem (Peqlab) mit

Consort E835 (Carl Roth) als Spannungsgeber verwendet. Die Spannung und

Laufzeit richtete sich nach der Größe und Konzentration der Agarosegele und lag

zwischen 80-150 V und 45-180 min. Zur Auftrennung von PCR-Amplifikaten mit 200-

1000 bp Größe kamen 2% Agarosegele zur Anwendung. Als Größenmarker dienten

verschiedene DNA-Standards: �/HindIII-Marker, Small-ladder und 1 kb-ladder (alle

MOLZYM, Bremen).

Die elektrophoretische Auftrennung der RNA-Proben erfolgte in einem

denaturierenden Agarosegel (1,2%) mit Formaldehydanteil (0,74 %) bei 60 V für 80

min in einer Minigelkammer. Die Befüllung der Kammer und die Gelbereitung

erfolgten mit FA-Elektrophoresepuffer (siehe 2.4.8). Als Größenmarker diente

peqGOLD High range RNA Leiter (Peqlab).

Zur Anfärbung der DNA und RNA wurde das Gel für 15-30 min in einer Ethidium-

bromidlösung (0,5 mg/l) gefärbt. Das RNA-Gel wurde anschließend 30-60 min in

A. dest. entfärbt. Die Dokumentation und Auswertung erfolgte auf einem UV-Tisch

(Herolab UVT-28ME) mit installierter Digitalkamera und Personalcomputer (E.A.S.Y.

440K, Herolab) über die Software EasyWin32 (Herolab).

2.7.32.7.3 Southern-Blot Southern-Blot

Die Hybridisierung von DNA-Sonden mit chromosomaler oder Plasmid-DNA, die auf

einer Nylonmembran fixiert wurde, erfolgte im Southern-Blot. Die elektrophoretische

Auftrennung der DNA-Proben erfolgte wie in 2.7.2 beschrieben. Der Blotting-Vorgang

auf eine positiv geladene Nylonmembran (NYPlus; Macherey-Nagel, Düren) fand mit

Hilfe einer Vakuum-Blot-Kammer (VacuGene XL, Pharmacia) bei 50 mbar Unter-

druck statt. Die DNA im Gel wurde für 3-5 min mit 0,25 N HCl depuriniert und

anschließend mit 1,5 M NaCl, 0,5 N NaOH für 3-5 min denaturiert. Nach einer

Neutralisation mit 1 M Tris-HCL, pH 5, 2 M NaCl für 3-5 min wurde die DNA mit 20x

SSC für 1 h auf die Membran transferiert.

33


Die Fixierung der DNA auf der Membran durch UV-Crosslinking wurde mit 5 min UV-

Bestrahlung der Membran auf dem Transilluminator (Herolab UVT-28ME) erreicht.

Die Membran war nun für die Hybridisierung (2.7.6) mit der DNA-Sonde präpariert.

2.7.42.7.4 Northern-Blot Northern-Blot

Für die Hybridisierung von DNA-Sonden mit Gesamt-RNA, die auf einer Membran

fixiert wurden, erfolgte ein Northern-Blot. Die elektrophoretische Auftrennung der

RNA-Proben erfolgte wie in 2.7.2 beschrieben. Zur Vorbereitung des RNA-Transfers

wurde das Gel zweimal 15 min in 20x SSC gewaschen. Der Transfer mit 20x SSC

auf eine positiv geladene Nylonmembran (NYPlus; Macherey-Nagel, Düren) fand mit

Hilfe einer Vakuum-Blot-Kammer (VacuGene XL, Pharmacia) bei 50 mbar Unter-

druck für 2 h statt.

Die Fixierung der RNA auf der Membran durch UV-Crosslinking wurde mit 5 min UV-

Bestrahlung auf dem Transilluminator (Herolab UVT-28ME) erreicht. Die Membran

war nun für die Hybridisierung (2.7.6) mit der DNA-Sonde präpariert.

2.7.52.7.5 Kolonie-Blot Kolonie-Blot

Für die Hybridisierung von DNA-Sonden mit Plasmid-DNA wurden Kolonien von

einer Agarplatte auf eine Membran fixiert. Vor dem Kolonie-Blot wurde ein Duplikat

von der Agarplatte mittels Replikaplattierung (2.7.13) erstellt. Zellen, die Fosmide

enthielten, wurden vor dem Kolonie-Blot mit 33 mM L-Arabinose induziert, was zu

einer Erhöhung der Kopieanzahl der Fosmide pro Zelle führte.

Der Transfer der Bakterienkolonien erfolgte mittels Auflegen einer positiv geladenen

Nylonmembran (NYPlus; Macherey-Nagel, Düren) auf die gekühlte Agarplatte. Nach

1 min Inkubation bei RT wurde die Membran nach Markierung der Lage mittels 3

Einstichen entfernt und auf Filterpapier getrocknet. In den folgenden Schritten

wurden die jeweiligen Lösungen mittels Auflegen der Membran auf getränkte Filter-

papiere appliziert und nach der angegebenen Inkubationszeit auf Filterpapier

getrocknet. Die alkalische Lyse der Zellen erfolgte auf der Membran durch 15 min

Inkubation mit Denaturierungslösung. Eine anschließende Neutralisation erfolgte für

15 min in Neutralisierungslösung. Danach wurde die Membran noch zweimalig mit 2x

SSC äquilibriert. Die Fixierung der DNA auf der Membran erfolgte durch UV-

Crosslinking mit 5 min UV-Bestrahlung auf dem Transilluminator (Herolab UVT-

28ME).

34


Die Entfernung des Bakteriensacculus wurde durch 60 min Inkubation in 3x SSC,

0,1% SDS und anschließendem vorsichtigem Abtupfen der Membran mit Filterpapier

erreicht.

Die Membran war nun für die Hybridisierung (2.7.6) mit DNA-Sonden präpariert.

2.7.62.7.6 Hybridisierung Hybridisierung

Die geblottete Membran (siehe 2.7.3, 2.7.4 und 2.7.5) wurde bei den jeweiligen

Hybridisierungsschritten mit den entsprechenden Puffern luftblasenfrei in Plastik-

beutel eingeschweißt und unter Schütteln (150 rpm) bei den jeweils angegebenen

Temperaturen inkubiert.

1. Prähybridisierung: 1h bei 42°C in Prähybridisierungslösung

2. Hybridisierung: 18 h bei 42°C in Hybridisierungslösung

3. Stringenzwäsche: 2x 5 Minuten in 2x SSC, 0,1% SDS bei RT

2x für 15 min in 0,1x SSC, 0,1% SDS bei 42 °C

Die Detektion der Hybridisierungs-Signale auf der Membran erfolgte mit dem DIG

Nucleic Acid Detection Kit (Roche).

2.7.72.7.7 Herstellung von DNA-Sonden Herstellung von DNA-Sonden

In der vorliegenden Studie kamen Digoxigenin-markierte(DIG)-DNA-Abschnitte als

Sonde zum Einsatz. Es wurden die folgenden zwei Methoden zur Markierung der

DNA angewendet:

a. Random primed DIG-labeling

Die Sonde wird durch nachträgliche Markierung eines PCR-Amplifikates mit Hilfe des

DIG DNA labeling-Kits (Roche) hergestellt. Die DIG-Markierung erfolgte nach

Angaben des Herstellers.

b. PCR-DIG-labeling:

Die DIG-Markierung erfolgte mittels DIG-Probe synthesis-Kit (Roche) direkt in einer

PCR-Reaktion nach Angaben des Herstellers.

2.7.82.7.8 Herstellung von Genbanken Herstellung von Genbanken

Für die Erstellung von Genbanken wurde das CopyControl Fosmid Library

Production Kit (Epicentre) verwendet.

Bei Fosmiden handelt es sich um ein bakteriell-propagiertes Phagemid Vektor-

System, das die Klonierung von bis zu 40 kbp chromosomaler DNA erlaubt. So kann

eine Genbank mit dem kompletten Genom eines Bakteriums mit nur wenigen hundert

35


Klonen erstellt werden. Ein Vorteil dieses Systems ist die hohe Stabilität der Klone,

da das Fosmid nur in einfacher Kopie in der Zelle vorliegt. So können auch toxische

Gene aufgrund des niedrigen Gen-Dosis-Effektes mit höherer Wahrscheinlichkeit

kloniert werden. Zur Erhöhung der Fosmidausbeute kann die Plasmidanzahl über

einen induzierbaren Origin (ori V) bis auf 50 Kopien pro Zelle erhöht werden.

Die Herstellung der Fosmid-Genbanken erfolgte nach Anleitung des CopyControl

Fosmid Library Production Kit (Epicentre). Genbanken wurden aus den Stämmen

B3/1-2 (#418), B12/10-1 (#748) und B12/16 (#795) erstellt.

Für jede Genbank wurde der Transformantentiter (Transformanten/ml) bestimmt.

Masterplates mit 100-300 Kolonien pro Platte wurden 18-24 h bei 37°C im Brut-

schrank (Heraeus) inkubiert, bis ein Koloniedurchmesser von 1-2 mm erreicht war,

und auf Nährmedien, Testmedien bzw. Nylonmembranen nach der Replikaplating-

Methode (Tatum & Lederberg, 1947) übertragen.

2.7.92.7.9 Subklonierung Subklonierung

Die Subklonierung von Fosmid-Sequenzabschnitten erfolgte, wenn nicht anders

vermerkt, in den Vektor pNOFMCS. Das betreffende Fosmid wurde mit einem oder

mehreren Restriktionsenzymen zerschnitten. Es kamen die Restriktionsenzyme

BamHI und SalI (NEB) zum Einsatz. Das Fosmidfragment mit der gewünschten

Größe wurde über eine Gelextraktion (Ultraprep Gel-Ex-Kit, MOLZYM) isoliert. Das

Fragment wurde anschließend durch eine Ligationsreaktion (siehe 2.7.10) in den

entsprechend linearisierten Vektor eingefügt. Die Transformation erfolgte nach den

Angaben in Abschnitt 2.7.12.

2.7.102.7.10 Ligation Ligation

Die Ligation erfolgte nach Angaben des Herstellers mit 500 U T4-Ligase

(Eurogentec) pro Ansatz für 1,5 h bei 16°C. Nach der Ligation wurden die Ansätze

mit seeDNA (Amersham Biosciences) gefällt, in 10μl A. dest. aufgenommen und bis

zur Verwendung bei -20°C gelagert.

2.7.112.7.11 Herstellung von elektrokompetenten E. coli-Zellen Herstellung von elektrokompetenten -ZellenE. coli

Für die Transformation wurden elektrokompetente Zellen hergestellt. Dafür wurden

die in Tab. 3 gelisteten E. coli-Stämme verwendet. Eine 50 ml Vorkultur in LB-

Medium wurde mit einer Einzelkolonie von einer E. coli-Stammplatte angeimpft und

über Nacht bei 37°C und 140 rpm in einem Schüttelinkubator inkubiert. Mit der

36


Vorkultur wurde 1 l auf 37°C vorgewärmtes LB-Medium in einem 5 l Erlenmeyer-

kolben angeimpft und bis zu einer OD600nm � 0,8 bei 37°C und 140 rpm inkubiert. Um

Sauerstoffzehrung in der Kultur zu vermeiden, wurde der Schüttelvorgang für

höchstens 15 Sekunden unterbrochen. Die Kultur wurde unter Schwenken auf Eis

abgekühlt, in gekühlte 400 ml Zentrifugenbecher verteilt und für 10 min bei 4°C mit

6000 x g zentrifugiert. Das Pellet wurde zügig in 500 ml eiskaltem A. dest.

gewaschen und erneut 10 min bei 6000 x g zentrifugiert. Dieser Vorgang wurde mit

400 ml A. dest. wiederholt und der Überstand nach dem Zentrifugieren quantitativ

entfernt. Die Zellen wurden in 800 μl eiskaltem 20% Glycerin aufgenommen, in 50 μl

Aliquots in vorgekühlte ERGs überführt und sofort bei -80°C eingefroren. Zur Über-

prüfung der Transformationskompetenz der Zellen wurden 2 Aliquots je Charge mit

1 ng pUC13-Plasmid-DNA transformiert und auf Ampicillin-Selektivmedium

ausplattiert. Nach 18 h konnten die Transformanten bzw. koloniebildenden Einheiten

ermittelt werden. Die Zellen wurden für die Experimente eingesetzt, wenn die Trans-

formationseffizienz über 1x108 cfu/μg DNA lag.

2.7.122.7.12 Transformation Transformation

Die Transformation der E. coli-Zellen in dieser Studie erfolgte über Elektroporation.

Die elektrokompetenten Zellen (2.7.11) wurden vorsichtig auf Eis aufgetaut und mit

jeweils 1-2 μl Ligationsansatz bzw. Plasmid vermischt. Nach 1 min Inkubation auf Eis

wurde dieses Gemisch in vorgekühlte Elektroporations-Küvetten (0,2 cm, Biorad)

luftblasenfrei überführt und im Pulsgenerator (MicroPulser, Biorad) einem Puls von

12,5 kV/cm ausgesetzt (MicroPulser-Programm: EC2). Die Zellen wurden sofort nach

dem Puls mit 1 ml LB-Medium in ein ERG gespült und zur Expression der

Resistenzmarker für 1 h bei 37°C unter Schütteln inkubiert.

Die Transformationsansätze wurden auf ihre Transformationshäufigkeit überprüft,

indem je Ansatz 100 μl auf Selektivmedium ausplattiert und nach 18 h Inkubation bei

37°C im Brutschrank (Heraeus) die koloniebildenden Einheiten (cfu) pro Platte

bestimmt wurden. Eine eventuelle Lagerung der Transformationsansätze erfolgte

über 3 Tage bei 4°C oder für unbegrenzte Zeit unter Zusatz von 20% Glycerin bei

-80°C.

37


2.7.132.7.13 Replikaplattierung (Tatum & Lederberg, 1947) Replikaplattierung (Tatum & Lederberg, 1947)

Für das Überstempeln der Masterplates wurde jede Masterplate auf ein steriles

Baumwolltuch (Velveteen Squares, Replica Plating Tool, scienceware) durch leichtes

Aufdrücken übertragen, um im Anschluss vorgenannte Medien und Blotting-

membranen durch Aufdrücken auf das Baumwolltuch zu beimpfen. Die Position der

Platten wurde beim Beimpfen markiert. Bei Nähr- und Testmedien erfolgte eine

anschließende Inkubation bei 37°C im Brutschrank.

2.7.142.7.14 Polymerasekettenreaktion (PCR) Polymerasekettenreaktion (PCR)

Standardmäßig wurde Taq-DNA-Polymerase (Moltaq und Moltaq-MastermixRed,

beide MOLZYM) für die PCR-Reaktionen mit einer Magnesium-Endkonzentration von

1,5 mM in 25 μl Volumen eingesetzt. Die Amplifikation der PCR-Produkte erfolgte in

einem Mastercycler gradient (Eppendorf) nach dem Schema in Tab. 12. Für die

Amplifikation von Abschnitten des 16S rRNA-Gens wurde DNA-freie Taq-DNA-

Polymerase (Moltaq 16S, MOLZYM) verwendet. Als Template diente 0,2-2 μl DNA-

Probe.

Tab. 12: Zyklenschema für die Standard-Amplifikation von PCR-Produkten im Mastercycler gradient (Eppendorf).

PCR-Schritt Temperatur Dauer Zyklen Anfangsdenaturierung 94°C 4 min 1 Denaturierung 94°C 0,5 minAnnealing Primerabhängig, siehe Tab. 6 0,5 minElongation 72°C 1 min / 1 kb

35

Endelongation 72°C 10 min 1 PCR-Amplifikate für die Klonierung in Expressionsvektoren wurden mit Pfu-DNA-

Polymerase (Thermorase, MOLZYM) in 50 μl Volumen nach Zyklenschema (Tab. 13)

im Mastercycler gradient (Eppendorf) durchgeführt. Die hier verwendete Magnesium-

sulfat-Konzentration variierte je nach Reaktionsbedingung zwischen 2 und 6 mM.

Tab. 13: Zyklenschema für die Amplifikation von PCR-Produkten mit Pfu-DNA-Polymerase im Mastercycler gradient (Eppendorf).

PCR-Schritt Temperatur Dauer Zyklen Anfangsdenaturierung 94°C 4 min 1 Denaturierung 94°C 0,5 min Annealing Primerabhängig, siehe Tab. 6 0,5 min Elongation 72°C 1min / 0,5 kb

35

Endelongation 72°C 10 min 1

38


Wenn nötig erfolgte die Entfernung der Polymerase für folgende Anwendungen

mittels Ethanolfällung der Amplifikate oder mit dem QuickClean EnzymRemoval

Resin (Clontech).

2.7.152.7.15 Sequenzierung und Auswertung der Sequenzdaten Sequenzierung und Auswertung der Sequenzdaten

Die Sequenzierung von Plasmid-DNA und PCR-Produkten wurde von der Firma

GATC (Konstanz) durchgeführt. PCR-Produkte wurden zuvor mit dem QIAquick

PCR-Purification-Kit (QIAGEN, Hilden) von dNTPs und Primern gereinigt. Als Primer

der Sequenzierreaktion dienten die gekennzeichneten Oligonukleotide aus Tab. 6.

Die gelieferten Sequenzdaten wurden mittels Lasergene (DNASTAR 5.00)

ausgewertet und die Alignments mit öffentlichen Sequenzdatenbanken (NCBI) mittels

BLASTN (Version 2.2.14 Altschul et al., 1997) durchgeführt. Eine Analyse der

abgeleiteten Aminosäuresequenzen auf Signalpeptide wurde mit Hilfe des

Programms Signal P 3.0 Server (Bendtsen et al., 2004) durchgeführt.

39

Ergebnisse

33 Ergebnisse Ergebnisse

3.13.1 Extrazelluläre Peptidasen aus halotoleranten und halophilen Bakterien Extrazelluläre Peptidasen aus halotoleranten und halophilen Bakterien

In der vorliegenden Studie wurde nach extrazellulären Peptidasen aus halotoleranten

bzw. halophilen Bakterien gesucht, deren proteolytische Aktivität eine hohe Toleranz

gegenüber hochchaotropen Salzen aufweist. Dies geschah im Hinblick auf einen

möglichen Einsatz der neuen Enzyme zur Zelllyse in Puffern mit hoher Guanidin-

isothiocyanat- oder Guanidinhydrochlorid-Konzentration für ein Nukleinsäure-

Extraktionsverfahren.

Eine biochemische Charakterisierung sollte nähere Informationen über die noch

wenig bekannten Peptidasen aus halotoleranten und moderat halophilen Bakterien

erbringen. Bisher wurden nur wenige Peptidasen aus moderat halophilen Bacteria

(Hiraga et al., 2005; Kamekura & Onishi, 1974; Karbalaei-Heidari et al., 2006; Lama

et al., 2005; Sánchez-Porro et al., 2003b; Setyorini et al., 2006) isoliert und bio-

chemisch charakterisiert. Untersuchungen zur Toleranz gegenüber chaotropen

Reagenzien dieser Peptidasen fehlten bis zum jetzigen Zeitpunkt.

3.1.13.1.1 Vorauswahl und Charakterisierung von Peptidase produzierenden Vorauswahl und Charakterisierung von Peptidase produzierendenIsolaten Isolaten

Für das Auffinden von Peptidasen, deren Aktivität eine hohe Toleranz gegenüber

hochchaotropen Salzen aufweist, standen 355 halotolerante bzw. halophile Isolate

zur Verfügung, die auf Plattentests Peptidase-Aktivität gezeigten hatten (Sinn-Meyer,

2003). Weitere Daten über die Peptidasebildung oder deren biochemische

Eigenschaften lagen nicht vor. Eine Auswahl sollte daher die Anzahl der Stämme für

eine Vorcharakterisierung reduzieren und dabei möglichst verschiedene Peptidase-

Produzenten erfassen. Die Kriterien hierfür wurden in Bezug auf die Zielsetzung und

eine erleichterte Probengewinnung wie folgt getroffen:

- Wachstum: Für eine zügige Gewinnung von Probenmaterial wurden halophile

Stämme mit einem relativ schnellen Wachstum (mind. ~108 Zellen nach max.

5 Tagen) auf 12 % NaCl ausgewählt.

- Extremophilie: Die Isolate sollten möglichst unter haloalkaliphilen

Bedingungen isoliert worden sein. Extrazelluläre Enzyme von Bakterien, die

auf eine haloalkaliphile Umgebung angewiesen sind, besitzen möglicherweise

40

Ergebnisse

Aktivitäten mit hoher Toleranz gegenüber extremen Bedingungen, wie hohe

Salzkonzentrationen und alkalische pH-Werte.

- Peptidasebildung: Zur Vereinfachung der Probengewinnung sollten Isolate

bevorzugt werden, die in Voruntersuchungen auf Plattentests starke

Peptidase-Aktivität zeigten. Dabei kann es sich um Stämme handeln, die

große Mengen an Enzymen oder Enzyme mit hoher spezifischer Aktivität

ausschütten. Beide Eigenschaften waren in Hinblick auf den Einsatz des

Enzyms (s.o.) wünschenswert.

- Diversität: Um die Verschiedenartigkeit der untersuchten Peptidasen zu

gewährleisten und damit die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen ein hinsichtlich

der Fragestellung interessantes Enzym zu finden, sollten die ausgewählten

Stämme eine möglichst hohe Diversität aufweisen.

Insgesamt wurden so 27 Stämme ausgewählt (Tab. 35, im Anhang). Darunter

befanden sich 17 Stämme, die auf Medium mit 12% NaCl und pH 8 isoliert wurden,

7 Stämme, die bei einem pH-Wert von 9,5 und 3 Stämme, die bei einem NaCl-Gehalt

von 20% wuchsen. Mit 17 dieser Stämme waren systematische Untersuchungen

(ARDRA-Gruppen1)) durchgeführt worden (Vogt, 2000): Sechs Stämme gehörten zur

ARDRA-Gruppe 2, drei zur Gruppe 1 und jeweils ein Stamm zu den Gruppen 3, 6-9,

13 und 16.

Die Peptidasen der in Tab. 35 aufgeführten Stämme wurden nun hinsichtlich ihrer

Einsatzmöglichkeit in einem Verfahren zur RNA-Isolierung getestet. Da das

Verfahren zur RNA-Isolierung eine sehr große Enzym-Menge benötigte und sehr

hohen Arbeitsaufwand beanspruchte, wurde die Eignung der Peptidasen in der

Vorauswahl stellvertretend in einem vereinfachten Enzymassay getestet. Dieser

bestand aus der Messung der Peptidase-Aktivität in einem Puffer, der zur Zelllyse

zwecks anschließender RNA-Isolierung geeignet erschien. Der Lysepuffer bestand

aus 1 M GuSCN als essentieller Bestandteil zur RNA-Stabilisierung, 0,1% SDS,

einem Detergenz zur Unterstützung der Zelllyse und 5 mM CaCl2, einem Stabilisator

vieler bekannter Peptidasen. Der pH-Wert der Lösung wurde in Anbetracht der

alkalischen Umwelt der untersuchten Peptidase-Produzenten auf pH 8 (50 mM Tris-

HCl, pH 8) eingestellt. 1)Taxonomische Untersuchungen an etwa ¼ der Stämme aus der hier zugrunde liegenden Stamm-sammlung durch Vogt (2000). 232 Stämme wurden anhand von amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA), Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und Gram-Färbung in 26 ARDRA-Gruppen eingeteilt.

41

Ergebnisse

Da eine Sekretion der Peptidasen zu verschiedenen Wachstumsphasen (Gupta et

al., 2002b; Rao et al., 1998) bekannt war, wurde vor der Probengewinnung der Zeit-

punkt der höchsten Peptidase-Aktivität im Wachstumsverlauf der Stämme

(Inkubationsbedingungen: SML12/8 Medium, 200 rpm, 30°C) im Azocasein-Assay

bestimmt (Tab. 35, im Anhang). Dabei zeigte sich, dass 6 Stämme, im Gegensatz zu

der Kultivierung auf Agarplatten, keine und in 2 Fällen kaum messbare proteolytische

Aktivität in Flüssigkultur ausbildeten. Möglicherweise besteht hier ein Zusammen-

hang zwischen Kulturmethode (fest/flüssig) und der Enzymproduktion. Im Gegensatz

zur Flüssigkultur wachsen die Bakterien auf der Agarplatte zumeist auf der Ober-

fläche und sind dabei, nebst geringerer Luftfeuchtigkeit, heterogenen Umweltein-

flüssen ausgesetzt. Aufgrund der fehlenden Durchmischung auf festen Medien

kommt es lokal zu Substratmangel und zur Anreicherung von Stoffwechselprodukten.

Scherkräfte, wie in der Schüttelinkubation der Flüssigkulturen, fehlen als möglicher

Stressfaktor in der Plattenkultur. So wurden die differierenden Enzymproduktionen in

Fest- und Flüssigkultur bei diversen Organismen auf die Unterschiede zwischen den

Kulturmethoden zurückgeführt (Sato & Sudo, 1999). Die Zugabe von Protein (hier:

5% Gelatine) als möglicher Induktor für die Peptidaseproduktion, wie bei Lama et al.

(2005) beschrieben, führte bei den 8 oben genannten Stämmen zu keiner Erhöhung

der Peptidaseproduktion in Flüssigkultur.

Die übrigen 19 Stämme zeigten mit Wachstumsraten von 0,8 bis 1,3 ein für die

Kriterien entsprechendes Wachstum und im Azocasein-Assay gemessene extra-

zelluläre Peptidase-Aktivität von 68 bis 236 AzU/ml (siehe Tab. 35, im Anhang).

Im RNA-Lysepuffer zeigten 17 der 19 Kulturüberstände proteolytische Aktivität (Tab.

35), wovon 10 noch über 1/3 Restaktivität besaßen, verglichen zu Puffern ohne SDS

und GuSCN-Zusatz. Zwei Stämme (B3/1-2 (#418) und SJ5Ü/12 (#140)) wiesen

sogar über 70% (72 bzw. 76%) Peptidase-Aktivität im Lysepuffer auf. Letztlich

verblieben 9 Stämme mit einer Restaktivität im Lysepuffer von mehr als 33%, die für

die weiterführenden Untersuchungen verwendet wurden (Tab. 35 im Anhang, türkis

markiert).

42

Ergebnisse

3.1.23.1.2 Systematische Einordnung der ausgewählten Peptidase-Produzenten Systematische Einordnung der ausgewählten Peptidase-Produzentenmittels 16S-rRNA Analyse mittels 16S-rRNA Analyse

Phylogenetische Untersuchungen der 9 ausgewählten Stämme wurden anhand von

Sequenzanalysen von Teilen des 16S-rRNA-Gens vorgenommen. Bei 7 Stämmen

wurden über 600 bp der 16S-rDNA Sequenz ermittelt, bei 2 Stämmen (B3/1-2 (#418)

und B12/10-1 (#748)) lag mit über 1400 bp die Sequenz des beinahe gesamten

Gens vor. Die Sequenzierung des Gens der Stämme B3/14 (#430) und B12/16

(#795) brach wiederholt nach 130 bp ab; die vorliegenden Daten wurden dennoch für

die Analyse verwendet.

Ein Vergleich der Sequenzen mit 16S-rRNA-Genen aus öffentlichen Datenbanken

(BLAST) zeigte hohe Sequenzhomologien aller Stämme untereinander. Die nächsten

Verwandten waren ein unidentifiziertes Bakterium mit der Bezeichnung K2-30-15 (96-

99% Sequenzidentität) und Vertreter der Gattung Salinivibrio (95-100% Sequenz-

identität; siehe Tab. 14).

Tab. 14: Nächstverwandte Arten der halophilen Stämme (NCBI-BLAST Datenbankanalyse der 16S rRNA-Teilsequenzbestimmungen).

Stamm Größte Übereinstimmung Basen

identisch / Basen im Alignment

NCBI-Acession-#

Sequenz-identität

[%]

SJ2/3-1 (#073)

Unidentif. Bakt. Klon K2-30-15 Salinivibrio costicola H-178

726/731

718/729

AY344372.1

X95532.1

99

98

SJ5Ü/8 (#098)

Unidentif. Bakt. Klon K2-30-15 Salinivibrio aegyptiaca sharmensis BbAGT

709/717

688/693

AY344372.1

AM279735.1

98

99

SJ5Ü/12 (#140)

Unidentif. Bakt. Klon K2-30-15 Salinivibrio costicola H-178

682/686

674/685

AY344372.1

X95532.1

99

98

SJ6S/14 (#148)

Unidentif. Bakt. Klon K2-30-15 Salinivibrio aegyptiaca sharmensis BbAGT

718/722

695/698

AY344372.1

AM279735.1

99

99

B3/1-2 (#418)

Vibrionaceae Bakterium LA18t Salinivibrio costicola (ATCC 35508T)

1369/1382

1355/1381

AF513449.1

X74699.1

99

98

B3/14 (#430)

Salinivibrio costicola AV3 Unidentif. Bakt. Klon K2-30-15

112/112

120/123

X95528.1

AY344372.1

100

97

B8/26-2 (#504)

Salinivibrio sp. 18AG Salinivibrio costicola cepa 6

617/618

613/618

AJ640132.1

X95531.1

99

99

B12/10-1 (#748)

Salinivibrio sp. 18AG Salinivibrio costicola cepa 6

1406/1408

1402/1408

AJ640132.1

X95531.1

99

99

B12/16 (#795)

Unidentif. Bakt. Klon K2-30-15 Salinivibrio costicola (ATCC 35508T)

165/171

165/172

AY344372.1

X74699.1

96

95

43

Ergebnisse

Beim Alignment des ersten Drittels (590 bp) der 16S-rRNA-Sequenzen (bzw. 130 bp

der Stämme B3/14 (#430) und B12/16 (#795)) stellte sich heraus, dass eine hohe

Übereinstimmung von min. 96,1% der untersuchten Sequenzabschnitte unter-

einander und zu den beiden nächst verwandten Organismen Salinivibrio costicola

alcaliphilus (Romano et al., 2005) und Salinivibrio aegyptiaca sharmensis bestand

(siehe Distanzmatrix Tab. 15). Die Sequenz (590 bp) von Stamm SJ2/3-1 (#073),

SJ5Ü/12 (#140) und SJ6S/14 (#148) war identisch, ebenso die Sequenz (590 bp)

von B8/26-2 (#504) und vom Referenzorganismus Salinivibrio costicola alcaliphilus

(siehe Tab. 15).

Tab. 15: Ähnlichkeits- bzw. Distanztabelle der 9 untersuchten Stämme und den beiden nächst verwandten Vertretern der Gattung Salinivibrio, basierend auf dem Alignment von je 590 bp der 16S-rDNA-Teilsequenzen (Ausnahme 5 & 9: hier nur 130 bp). Alignment-Methode: CLUSTALV (weighted).

Übereinstimmung [%] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 *** 99.8 100 100 99.2 98.1 97.4 96.9 99.1 97.5 98.5 1 2 0.2 *** 99.8 99.8 99.0 99.1 97.3 96.8 98.1 97.3 98.6 2 3 0.0 0.2 *** 100 99.2 98.1 97.4 96.9 99.1 97.5 98.5 3 4 0.0 0.2 0.0 *** 99.2 98.1 97.4 96.9 99.1 97.5 98.5 4 5 0.9 1.0 0.9 0.9 *** 98.1 97.1 96.6 99.1 97.1 97.6 5 6 1.9 0.9 1.9 1.9 1.9 *** 97.2 96.3 97.2 97.2 97.1 6 7 1.7 1.9 1.7 1.7 2.1 2.9 *** 99.7 98.1 100 96.1 7 8 1.9 2.1 1.9 1.9 2.3 2.9 0.2 *** 97.2 99.8 95.7 8 9 0.9 1.9 0.9 0.9 0.9 2.9 1.9 1.9 *** 98.1 96.1 9

10 1.7 1.9 1.7 1.7 2.1 2.9 0.0 0.2 1.9 *** 96.1 10 11 0.2 0.0 0.2 0.2 1.0 1.0 1.7 1.9 2.0 1.7 *** 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Divergenz [%] Zuordnung der Nummerierung: 1: SJ2/3-1 (#073); 2: SJ5Ü/8 (#098); 3: SJ5Ü/12 (#140); 4: SJ6S/14 (#148); 5: B3/1-2 (#418); 6: B3/14 (#430); 7: B8/26-2 (#504); 8: B12/10-1 (#748); 9: B12/16 (#795); 10: Salinivibrio costicola alcaliphilus; 11: Salinivibrio aegyptiaca sharmensis Ausgehend von der Analyse der 16S-rRNA-Teilsequenzabschnitte ist zu vermuten,

dass die untersuchten 9 Stämme zur Gattung Salinivibrio gehören. Anhand des

phylogenetischen Stammbaums (Abb. 4) und ausgehend von 97% Sequenzidentität

als allgemein angesehenem Grenzwert (Ludwig et al., 1998) für die Einordnung zu

einer Spezies, lässt sich des Weiteren die Artzugehörigkeit einiger Stämme festlegen

(siehe Tab. 15 und Abb. 4). Mit �98,5% Sequenzidentität können 4 Stämme (SJ2/3-1

(#073), SJ5Ü/8 (#098), SJ5Ü/12 (#140) und SJ6S/14 (#148)) der Art Salinivibrio

aegyptiaca zugeordnet werden. Drei weitere Stämme (B8/26-2 (#504), B12/10-1

(#748) und B12/16 (#795)) gehören der Spezies Salinivibrio costicola an (98,1-100%

Sequenzidentität). Mit einer Sequenzidentität von über 97% zu zwei verschiedenen

44

Ergebnisse

Arten (S. costicola: 97,1% bzw. S. aegyptiaca: 97,6%) bildet der Stamm B3/1-2

(#418) im Phylogramm einen eigenen Zweig aus, ohne einer der beschriebenen

Arten eindeutig zuzugehören. Ob er einer der beiden Salinivibrio-Spezies zugeordnet

werden kann oder eine eigene neue Art darstellt, müssten weitere systematische

Untersuchungen zeigen. Ebenso konnte keine eindeutige Zuordnung des Stammes

B3/14 (#430) erfolgen, vermutlich aufgrund des zur Verfügung stehenden kurzen

Sequenzabschnittes (130 bp). Eine Zuordnung dieses Stammes und weitere

Aussagen über die Verwandtschaft der hier untersuchten Bakterien könnten nur

Bestimmungen der kompletten 16S rRNA-Sequenzen und weitere systematische

Untersuchungen zeigen. Diese Fragestellung lag allerdings außerhalb des Fokus

dieser Arbeit.

Abb. 4: Phylogenetischer Stammbaum der untersuchten Stämme* und der beiden nächst verwandten Vertreter der Gattung Salinivibrio, basierend auf 16S-rDNA-Teilsequenzen (590 bp). Die Verwandtschaftsverhältnisse wurden mit CLUSTALW untersucht und der Stammbaum mit der Bootstrap-Methode auf seine Konsistenz und Robustheit überprüft (Felsenstein, 1988). Die Länge der Verzweigungen repräsentiert die Divergenz zwischen zwei Sequenzen, die Zahlen bezeichnen die Anzahl der Substitutionsereignisse. * Aufgrund der abweichenden Sequenzlänge von 130 bp konnten die Stämme B3/14 (#430) und B12/16 (#795) nicht in die Bootstrap-Analyse einbezogen werden.

3.1.33.1.3 Physiologie der Enzymbildung Physiologie der Enzymbildung

Die enzymatische Aktivität, gemessen als spezifische Aktivität im Azocasein-Assay

(Units pro μg extrazellulärem Protein), in Abhängigkeit des Zellwachstums wurde

bestimmt. Abb. 5 zeigt ein typisches Beispiel anhand des Stammes B12/10-1 (#748).

Proteolytische Aktivität war bereits in der frühen logarithmischen Wachstumsphase

nachweisbar und stieg im weiteren Wachstumsverlauf stetig an. Die höchste

spezifische Aktivität trat am Ende der stationären Phase auf. Dies lässt eine

konstitutive Enzymexpression vermuten. Die anderen Stämme zeigten ähnliche

Enzymbildung (Daten nicht gezeigt). Damit ist der beste Erntezeitpunkt für

Peptidasen aus diesen Stämmen die späte stationäre Phase. Die maximalen

45

Ergebnisse

Enzymaktivitäten im Azocasein-Assay (AzU/ml) und der Zeitpunkt ihres Auftretens

sind in Tab. 35 (im Anhang) angegeben.

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20 25 30 35 40Inkubationszeit [h]

Zellw

achs

tum

OD

600n

m, S

pezi

fisch

e Pe

ptid

asea

ktiv

ität [

AzU

/µg]

0

5

10

15

20

25

Prot

eing

ehal

t im

Kul

turü

bers

tand

[µ

g/m

l]

OD600nm Spezifische Aktivität [AzU/μg] Proteingehalt [μg/ml]

Abb. 5: Bildung extrazellulärer Peptidase während des Wachstums des halophilen Stammes B12/10-1 (#748) (SML-Medium 12/8; bei 30°C, 200 rpm). Spezifische Aktivität: Aktivität im Azocasein-Assay pro μg extrazellulären Proteins.

Es wurde anhand von Stamm B12/10-1 (#748) geprüft, ob eine Steigerung der

Enzymausbeute durch Veränderung der Kulturbedingungen möglich war. Die

Senkung des NaCl-Gehaltes im SML-Medium von 12% auf 10%, welche in einer

Erhöhung der Wachstumsrate resultierte, führte zu keiner Änderung der

proteolytischen Aktivität und ließ bei weiterer Senkung der NaCl-Konzentration auf

6% sogar die Gesamtaktivität auf 45% absinken. Bei 2% NaCl im Medium erfolgte

zwar ein gutes Wachstum des Stammes, aber es war keine proteolytische Aktivität in

der zellfreien Kultur nachzuweisen. Für die maximale Peptidaseproduktion bedarf

dieser Stamm demnach eines erhöhten Salzgehaltes von 10-12% im Medium. Ein

Vergleich der Peptidaseproduktion der restlichen Stämme bei 6% und 12% NaCl im

Medium bestätigte das Produktionsoptimum bei 12% NaCl.

Zur Gewinnung der peptidasehaltigen Kulturüberstände der 9 Stämme erfolgte die

optimierte Produktion in SML 12/8 Medium bis zur späten stationären Phase.

3.1.43.1.4 In vitro Peptidase-Assays - Möglichkeiten und Grenzen der verwendeten Peptidase-Assays - Möglichkeiten und Grenzen der verwendeteIn vitro nAssays Assays

Zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität standen eine Reihe von in vitro

Peptidase-Assays zu Verfügung (Appel, 1981; Sarath et al., 2001). In dieser Studie

46

Ergebnisse

wurden zwei der gebräuchlichsten spektrophotometrischen Assays verwendet, der

Azocasein-Assay (2.6.11.1) und der Casein-Assay nach Kunitz (1947) (2.6.11.3).

Hinzu kam noch ein gewerblich vertriebener Fluoreszenzassay, das EnzCheck

Protease Assay Kit (Invitrogen) (2.6.11.2).

Der anfänglich ausschließlich benutzte Azocasein-Assay wurde nach der Vorauswahl

der Stämme (3.1.1) im Vergleich zu weiteren Assays (Casein-Assay und EnzCheck

Protease Assay Kit) getestet. Die drei Assays basierten auf verschiedenen Mess-

verfahren, die teilweise unterschiedliche Substratumsätze detektierten. Im Azo-

casein- und Casein-Assay erfolgte eine Endpunktbestimmung durch eine

Säurefällung des Ansatzes. Erfasst wurden bei der anschließenden spektrophoto-

metrischen Messung nur säurelösliche aromatische Peptide und säurelösliche Oligo-

peptide, die aromatische Pepitdreste enthielten. Während im Casein-Assay die

aromatischen Aminosäuren direkt über eine Absorptionsmessung bei 280 nm

ermittelt wurden, erfolgte im Azocasein-Assay eine Detektion des an die aroma-

tischen Aminosäuren gekoppelten Azofarbstoffes bei 340 nm. Beide Assays konnten

aufgrund des Verfahrens keine Aktivität erfassen, wenn mögliche Abbauprodukte aus

fällbaren Oligopeptiden oder aus nicht-aromatischen Aminosäuren bestanden. Beim

EnzCheck Protease Assay erfolgte die Bestimmung der Peptidase-Aktivität über eine

Fluoreszenzmessung, ohne zuvor die enzymatische Reaktion zu stoppen. Durch eine

starke Markierung des Caseins mit dem Fluoreszenzfarbstoffes BODYPY FL wurde

die Fluoreszenz im intakten Konjugat durch einen Quench-Effekt unterdrückt. Sowohl

die Abspaltung von einzelnen markierten Peptiden als auch die Abspaltung größerer

Oligopeptide erzeugte eine Fluoreszenzsteigerung im Assay (Welder et al., 2002).

Die Fluoreszenzentwicklung im EnzCheck Protease Assay Kit ist daher relativ unab-

hängig von der Spezifität der Peptidasen (Molecular Probes, 2003).

Bei späteren Untersuchungen zur GuSCN-Abhängigkeit der Peptidase-Aktivität

zeigten sich große Diskrepanzen der mit dem Fluoreszenz- und Casein-Assay auf

der einen Seite erhaltenen Daten und denen aus dem Azocasein-Assay auf der

anderen Seite. Im direkten Vergleich (Abb. 6) der drei Assays zeigte der Azocasein-

Assay bei Zugabe von GuSCN in steigender Konzentration eine abweichende

Tendenz zu den anderen beiden Testverfahren. So schien die Peptidase-Aktivität im

Azocasein-Assay eine Aktivierung mit 0,2 und 0,5 M GuSCN (115% bzw. 132%

relative Aktivität) zu erfahren, während die beiden anderen Testverfahren hier eine

Inhibition (50-78% relative Aktivität) anzeigten. Tatsächlich handelte es sich hier um

47

Ergebnisse

ein Artefakt: Wurde eine hydrolysierte Probe Azocasein mit 0,5 M bzw. 1 M GuSCN

versetzt, erhöhte sich die Absorption um das 1,3-1,8-fache, während Kontrollen mit

unverdautem Azocasein keine Änderung zeigten. Messungen mit dem Azocasein-

Assay über den Einfluss von chaotropen Salzen auf die Peptidase-Aktivität lieferten

somit verfälschte und in der Tendenz irreführende Ergebnisse (Abb. 6). Dies konnte

mit peptidasehaltigen Überständen von drei weiteren Stämmen (SJ2/3-1 (#073),

B3/1-2 (#418) und SJ6S/14 (#148)) bestätigt werden. Der Azocasein-Assay wurde

daraufhin für die weiterführenden Untersuchungen nicht mehr eingesetzt.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

140%

0 0,5 1 1,5

GuSCN [M]

Rel

ativ

e Pe

ptid

asea

ktiv

itä

2

t

Azocasein (100% = 0,65 AzU) Casein (100% = 2,1 KuU)Fluoreszenz (100% = 2,7 FlU)

Assays:

Abb. 6: Vergleich der relativen Peptidase-Aktivität* in den drei zur Verfügung stehenden Assays (Azocasein-, Casein-, Fluoreszenz-Assay) unter Einfluss von Guanidinisothiocyanat (GuSCN). Als Probe wurden 5μl der zellfreien Kultur von Stamm B12/10-1 (#748) verwendet. *Die Peptidase-Aktivität im Ansatz ohne GuSCN wurde für jeden Assay gleich 100% gesetzt.

Des Weiteren führte der Einsatz von GuSCN und GuHCl im Fluoreszenzassay

regelmäßig zu Ausfällen der Aktivitätsmessungen, oft in Zusammenhang mit höheren

Salzkonzentrationen. Der Casein-Assay zeigte sich hierbei viel verlässlicher, daher

wurden die Tests zur Toleranz gegenüber chaotropen Salzen mit diesem durch-

geführt. Ebenso ungeeignet erwies sich der Fluoreszenzassay bei Verwendung von

SDS. Hier konnten in der Kontrolle nicht reproduzierbare starke Anstiege der

Fluoreszenz über die Inkubationszeit ohne Zusatz von Peptidasen festgestellt

werden. Daher kam zur Messung der SDS-Toleranz der Peptidasen auch hier der

Casein-Assay zum Einsatz. Allerdings wiesen die Messergebnisse, trotz mehrfacher

Wiederholungen der Tests, sehr hohe Schwankungsbreiten auf.

Bei Untersuchungen der proteolytischen Aktivität von zwei über hydrophobe Inter-

aktionschromatografie aufgereinigten enzymhaltigen Fraktionen A und B (siehe

48

Ergebnisse

3.1.5.1) zeigten sich sehr deutliche Unterschiede zwischen dem Casein-Assay und

dem Fluoreszenzassay (siehe Tab. 16 als Beispiel).

Tab. 16: Vergleich der Peptidase-Aktivität der aufkonzentrierten enzymhaltigen Phenylsepharose-Fraktionen A und B im Fluoreszenz- und Casein-Assay der Stämme SJ5Ü/8 (#098) und SJ2/3-1 (#073) unter Standardbedingungen.

Peptidase-Aktivität Stamm Fraktion FlU/µl KuU/µlSJ5Ü/8 (#098) A 3,1 1,10SJ5Ü/8 (#098) B 25,5 0,19Faktor A/B 0,12 5,79SJ2/3-1 (#073) A 2,97 1,74SJ2/3-1 (#073) B 18,03 0,28Faktor A/B 0,16 6,21 Während im Fluoreszenzassay die Aktivität der Fraktion A etwa 1/6 bis 1/8 der

Aktivität von Fraktion B entsprach, verhielt es sich im Casein-Assay genau

umgekehrt, die Aktivität der Fraktion A entsprach etwa dem 5-8-fachen der sehr

schwachen Aktivität der Fraktion B. Es ist anzunehmen, dass mögliche

unterschiedliche Substratspezifitäten der Peptidasefraktionen aufgrund der

verschiedenen Funktionsweisen der Assays (s.o.) für diese Unterschiede ursächlich

waren. Dies sollte beim direkten Vergleich der beiden Assays beachtet werden.

Aus Gründen der Handhabbarkeit einer großen Anzahl von Proben, einer hohen

Sensitivität und der relativen Unabhängigkeit gegenüber der Spezifität der

Peptidasen wurden die biochemischen Charakterisierungen der Enzyme der 9

Stämme (siehe 3.2) mit dem Fluoreszenzassay durchgeführt (mit Ausnahme der

Messungen in 3.2.5). Ein Abgleich der Ergebnisse des Fluoreszenz-Assays mit

denen des Casein-Assays von einigen exemplarisch ausgewählten Proben zeigte

eine sehr gute Übereinstimmung in der Tendenz und überwiegend auch eine gute

Übereinstimmung der relativen Aktivitäten.

3.1.53.1.5 Anreicherung der Peptidasen aus Kulturüberständen der halophilen Anreicherung der Peptidasen aus Kulturüberständen der halophilenStämme Stämme

Um Peptidasen aus salzhaltigen Kulturüberständen anzureichern, wurden

verschiedene in der Proteinbiochemie gängige Verfahren (siehe Abschnitte 2.6.2 und

2.6.3) verwendet und auf ihre Eignung untersucht: 1. Ammoniumsulfat-Fällung,

2. Ethanolfällung und 3. Dialyse gegen Polyethylenglykol.

Für die Vorversuche wurde die zellfreie Kultur des Stammes B12/10-1 (#748)

verwendet. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tab. 17 zusammengefasst.

49

Ergebnisse

Früh wurde deutlich, dass die angewendeten Verfahren aufgrund des hohen Salz-

gehaltes (12% NaCl) in der zellfreien Kultur modifiziert werden mussten. Für die

Fällung mit gesättigtem Ammoniumsulfat musste zunächst die Sättigungsgrenze bei

0°C experimentell ermittelt werden, sie lag bei ca. 490 g/l Ammoniumsulfat

(Sättigungsgrenze ohne Salz im Medium: ca. 650 g/l Ammoniumsulfat). Nach der

Fällung konnten nur ca. 6% Restaktivität im gelösten Fällungspellet nachgewiesen

werden, während 54 % der Aktivität im Fällungsüberstand messbar waren. Neben

dem Verlust von 40% der Gesamtaktivität nach der Fällung konnte gleichfalls eine

Reduzierung der spezifischen Aktivität um 18 bzw. 38% in den beiden Fällungs-

fraktionen beobachtet werden (vergleiche Tab. 17). Auch die vorhergehende

Entsalzung der zellfreien Kultur mittels Dialyse und anschließender Ammoniumsulfat-

Fällung erbrachte ähnlich geringe Ausbeuten (Daten nicht gezeigt). Offensichtlich

konnte mit der Ammoniumsulfat-Fällung keine nennenswerte Präzipitation von

aktiven extrazellulären Peptidasen erfolgen.

Tab. 17: Anreicherung von Peptidase aus der zellfreien Kultur von B12/10-1 (#748)a).Anreicherungs-

methode Probe Volumen[ml]

Gesamt-protein

[mg]Aktivität [kFlU/ml]

Gesamt-aktivität [kFlU]b)

Spezifische Aktivität

[kFlU/mg]

Ausbeute [%] an

Aktivität Keine (Kontrolle) zellfreie Kultur 900 60,1 0,55 495,4 8,2 (100%) 100

Fällungsüberstand 1150 39,9 0,23 267,8 6,7 (81,7%) 54 Ammonium-sulfatfällung c)

Fällungspellet, resuspendiert 9,7 5,8 3,0 29,3 5,1 (62,2%) 5,9

Fällungsüberstand 10900 < 0,5 <1x10-7 < 0,001 - 0 Ethanolfällung

(85% Endkon-zentration) d)

Fällungspellet, resuspendiert 170 56 2,21 376,5 6,7 (81,7%) 76

Dialyse gegen PEG 3500 Dialysat 45 34 10,31 464,3 13,7

(167%) 94 a) Der Proteingehalt und die Peptidase-Aktivität (Fluoreszenzassay) einer stationären Kultur (72h bei 30°C und 200 rpm

Schüttelfrequenz) wurden bestimmt. Alle Proben wurden nach der Anreicherung gegen 30 mM Tris-HCl, pH 9, dialysiert. b) kFlU = Kilo-Fluoreszenzunits C) 0°C, gesättigt d) 0°C, 85% v/v Die Ethanolfällung (85% EtOH Endkonzentration; siehe 2.6.2) der zellfreien Kultur

(900 ml) erbrachte eine nahezu quantitative Protein-Fällung (90-94%). Die

Peptidase-Aktivität des gelösten Sedimentes wies 76% der Aktivität der zellfreien

Kultur auf (Tab. 17). Im Überstand war keine Aktivität mehr vorhanden. Das Volumen

des dialysierten und gelösten Fällungspellets war allerdings mit 170 ml sehr groß.

Das durch das Ethanol mitgefällte Salz aus dem Medium (12% NaCl) verhinderte

eine Verringerung des Resuspensionsvolumens des Protein/Salzpellets. Aufgrund

des großen Materialaufwandes und der geringen Aufkonzentration der Probe wurde

diese Methode nicht weiter verwendet.

50

Ergebnisse

Mit Hilfe der Dialyse gegen Polyethylenglykol 3500 (2.6.3) konnte eine starke

Aufkonzentrierung um den Faktor 18,7 und leichte Anreicherung (1,67-fach) der

Enzyme aus der zellfreien Kultur von Stamm B12/10-1 (#748) bei gleichzeitig hoher

Ausbeute (94%) erzielt werden. Durch Variation der Dialysezeit konnte die zellfreie

Kultur beliebig stark aufkonzentriert werden. Aufgrund der sehr geringen Verluste an

der Gesamtaktivität der Peptidasen wurde diese Methode für weitere Versuche

verwendet.

3.1.5.13.1.5.1 Säulenchromatografie Säulenchromatografie

Durch eine säulenchromatografische Auftrennung der Kulturüberstände sollte eine

weitere Anreicherung und eine Aufreinigung der Peptidasen erfolgen. Als Verfahren

wurden eine Anionenaustauschchromatografie über Q-Sepahorse und eine hydro-

phobe Interaktionschromatografie über Phenylsepharose angewendet.

Es konnte keine zufrieden stellende Bindung der Peptidasen aus der dialysierten

zellfreien Kultur des Stammes B12/10-1 (#748) an Q-Sepharose (vergl. 2.6.7.1)

erzielt werden. So befanden sich ca. 83% der Gesamtaktivität im Durchlauf und in

den Waschpufferfraktionen. Bei der Elution der Säule konnte in den Fraktionen, die

einer KCl-Konzentration von 0,1-0,4 M KCl entsprachen, geringe Peptidase-Aktivität

(3,6% der Gesamtaktivität) beobachtet werden. Die maximale Aktivität mit 1,1 % der

Gesamtaktivität konnte bei 0,12-0,18 M KCl im Eluat nachgewiesen werden.

Alternativ hierzu wurde eine Anreicherung der Peptidasen über Phenylsepharose

erprobt (vergl. 2.6.7.2). Die zellfreie Kultur von Isolat B12/10-1 (#748) wurde mit

Ammoniumsulfat auf 1 M eingestellt und direkt über die Säule geleitet. Messungen

der Proteinkonzentration zeigten, dass über 81% der Proteine die Säule ungebunden

passierten. Im Durchlauf befand sich keine messbare Peptidase-Aktivität.

Abb. 7 zeigt eine hydrophobe Interaktionschromatografie der Kultur. Die Absorptions-

messungen bei 280 nm zeigten eine Zunahme des Gesamtproteins mit Abnahme

des Ammoniumsulfatgradienten mit einem Maximum kurz nach Ende des

Gradienten. Aktivitätsmessungen im Fluoreszenzassay wiesen auf zwei deutlich

getrennte Aktivitätsbereiche. Der erste Bereich (A) erschien mit einem Peak bei ca.

0,3 M Ammoniumsulfat. Der zweite Bereich (B) mit wesentlich höherer Aktivität trat

kurz nach Beendigung des Ammoniumsulfatgradienten auf, co-eluierte also ungefähr

mit der Hauptmenge an Gesamtprotein. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass

mindestens 2 Peptidasen von Stamm B12/10-1 (#748) ausgeschieden wurden.

51

Ergebnisse

0

50

100

150

200

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280Retentionsvolumen [ml]

E280

nm [m

AU

]

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Am

mon

ium

sulfa

tgra

dien

tR

el. P

eptid

asea

ktiv

ität

Extinktionsmessung bei 280 nmrelative PeptidaseaktivitätAmmoniumsulfatgradient (100% = 1 M Ammoniumsulfat)

A B

Abb. 7: Phenylsepharose-Chromatografie von zellfreier Kultur des Stammes B12/10-1 (#748). �� Fraktionsbereiche mit Haupt-Peptidase-Aktivität (A bzw. B). Die relative Peptidase-Aktivität entspricht der prozentualen Aktivität in einer Fraktion im Vergleich zur maximalen Peptidase-Aktivität im Peak. Die Fraktionen des Bereichs A wurden vereint (Pool A), genauso wie die des

Bereichs B (Pool B). Tab. 18 zeigt die Charakteristika dieser Pools. Die Summe der

proteolytischen Aktivität beider Pools ergab mit 22,9 kFlU (1,7 kFlU plus 21,2 kFlU)

eine Ausbeute von 19,4 % der Aktivität der zellfreien Kultur.

Tab. 18: Proteingehalt und Peptidase-Aktivitäta) der zellfreien Kultur B12/10-1 (#748) (42h, 30°C, 200 rpm) und der vereinigten aktiven Fraktionen A und B aus der hydrophoben Interaktions-chromatografie.

Fraktionen Volumen[ml]

Gesamt-protein

[mg]

Gesamt-aktivität [kFlU]b)


[kFlU/mg]

Ausbeute [%] an

Aktivität

Enzym-Anreicherungs-

faktor zellfreie Kultur 350 36 118,6 3,3 100 1

Fraktionspool A 24 0,4 1,7 4,25 1,5 1,3 Fraktionspool B 52 1,5 21,2 14,1 17,9 4,3

a) Aktivitätsmessung im Fluoreszenzassay. b) kFlU= Kilo-Fluoreszenz-Units Während die frühere Fraktion (A) eine schwächere Bindung zur Phenylsepharose

aufweist, ist die Bindung zur zweiten eluierten Enzymfraktion so stark, dass diese

erst mit Erreichen des Gradienten-Endes eluiert. Es wird vermutet, dass wegen der

starken Bindung der Peptidase an die Matrix die zweite enzymhaltige Fraktion nur

unvollständig eluiert wird und dies den Verlust von über 75% der Gesamtaktivität der

Peptidasen begründet. Hinweise für eine mögliche Inaktivierung von Enzymen durch

eine vorübergehende Bindung an Phenylsepharose konnten in der Literatur nicht

gefunden werden.

52

Ergebnisse

Wegen der Möglichkeit mit dieser Methode Peptidasen anzureichern und Gemische

aus Peptidasen zu trennen, wurde dieses Verfahren im Verlauf der Studie auf

zellfreie Kulturen von weiteren Stämmen angewendet.

Bei der chromatografischen Auftrennung der Kulturüberstände von 8 weiteren

Stämmen (SJ2/3-1 (#073), SJ5Ü/8 (#098), SJ5Ü/12 (#140), SJ6S/14 (#148), B3/1-2

(#418), B3/14 (#430), B8/26-2 (#504) und B12/16 (#795)) wurden bei allen ähnliche

Retentionsprofile (Daten nicht gezeigt) mit einem Proteinmaximum nach Ende des

Gradienten beobachtet. Bei der Aktivitätsbestimmung der Fraktionen zeigten 6

Stämme Ähnlichkeiten zu den oben beschriebenen zwei Aktivitätsbereichen (Stamm

B12/10-1 (#748), Abb. 7) und es konnten jeweils zwei Fraktionspools A und B

gebildet werden (Tab. 36, im Anhang). Davon abweichend besaßen die Stämme

B12/16 (#795) und B8/26-2 (#504) nur einen Aktivitätsbereich zum Ende des

Elutionsgradienten (Tab. 36, im Anhang). Die Fraktionen nach Ende des Ammonium-

sulfat-Gradienten mit Enzymaktivität wurden entsprechend der obigen Definition als

Fraktionspool B bezeichnet.

3.23.2 Biochemische Charakterisierung extrazellulärer Peptidasen Biochemische Charakterisierung extrazellulärer Peptidasen

Für die Untersuchungen wurden Peptidasen aus den zellfreien Kulturen durch

hydrophobe Interaktionschromatografie (siehe Abschnitt 3.1.5.1) angereichert. Die

Ergebnisse deuteten an, dass 7 der 9 Stämme mindestens 2 verschiedene

Peptidasen besitzen. So wurden bei 7 Stämmen (Tab. 36, im Anhang) jeweils zwei

aktive Fraktionspools erhalten, Fraktion A und B. Bei den Stämmen B8/26-2 (#504)

und B12/16 (#795) trat nur eine Fraktion auf (B). Um die Eigenschaften der einzelnen

Fraktionen zu bestimmen, wurden die nachfolgenden biochemischen

Untersuchungen daher an den beiden Fraktionen eines jeden Stammes

vorgenommen. Zur Vereinfachung und in Vorgriff auf weitere Ergebnisse wird im

Folgenden von Peptidase A (Fraktion A) und Peptidase B (Fraktion B) gesprochen.

Die eingesetzten Enzymmengen im Fluoreszenzassay betrugen 1-5 FlU (unter

Standardbedingungen).

53

Ergebnisse

3.2.13.2.1 Einfluss des pH-Wertes auf die Peptidase-Aktivität Einfluss des pH-Wertes auf die Peptidase-Aktivität

Bei Untersuchungen zum Einfluss des pH-Wertes auf die Peptidasen zeigten sich

Unterschiede zwischen Peptidase A und B. Interessanterweise glichen sich die

pH-Profile von Peptidase A der verschiedenen Stämme hinsichtlich des Optimums

(siehe Tab. 19).

Für Peptidase A lagen die Aktivitätsoptima aller Stämme zwischen pH 8 und 8,5.

Hohe Aktivität (90% des Optimums) besaßen die Enzyme zwischen pH 7,5 und 8,5

(Abb. 8a). Der pH-Bereich, in dem Peptidase A Aktivität besaß (mind. 10% Rest-

aktivität vom Optimum), lag zwischen pH 6 und 11 (siehe Tab. 19 und Abb. 8a, bzw.

Abb. 33 bis Abb. 36 im Anhang).

Anders verhielt es sich mit dem Aktivitätsoptimum der Peptidase B der 9

untersuchten Stämme. So wurde bei allen Proben höchste Aktivität zwischen pH 8

und pH 9,5 festgestellt (siehe Tab. 19). Bei 4 Stämmen bildete sich ein breites

Plateau mit einer relativen Peptidase-Aktivität von 91-100% aus, bei 5 Stämmen lag

das Optimum bei pH 9 bzw. 9,5 (siehe Tab. 19). Der pH-Bereich, in dem Peptidase B

noch Aktivität zeigte, lag zwischen pH 6,0 und 12,0 (siehe Tab. 19 und Abb.8b, bzw.

Abb. 33 bis Abb. 36 im Anhang).

Tab. 19: pH-Optimum und Aktivitätsbereich (mind. 10% Restaktivität vom Optimum) der Peptidasen A und B (Fraktionen der hydrophoben Interaktionschromatografie). Stamm:/Peptidase:

SJ2/3-1(#073)

SJ5Ü/8(#098)

SJ5Ü/12 (#140)

SJ6S/14(#148)

B3/1-2(#418)

B3/14(#430)

B8/26-2 (#504)

B12/10-1 (#748)

B12/16 (#795)

pH-Optimum: A 8,0 8,0 8,5 8,0 8,0 8,5 - 8,0 - B 9,0 9,5 8-9,5 9,5 8-9,5 9,5 8-9,5 8-9,5 9,0

pH-Aktivitätsbereich: A 6-11 6-11 6-11 6-11 6-11 6-11 - 6-11 - B 6-12 6-12 6-12 6-12 6-12 6-12 6-12 6-12 6-12

Bei beiden Peptidasen handelt es sich um moderat alkaliphile Peptidasen mit einem

Aktivitätsoptimum von pH 8-8,5 (Peptidase A) und pH 9-9,5 bzw. pH 8-9,5 (Peptidase

B).

Aufgrund dieser Untersuchungsergebnisse erfolgte eine Anpassung des pH-Wertes

der Assaybedingungen für die weiteren biochemischen Untersuchungen auf pH 9,0.

54

Ergebnisse

0%

20%

40%

60%

80%

100%

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13pH

Rel

ativ

e Pe

ptid

ase-

Akt

ivitä

t

B12/10-1 (#748) B3/1-2 (#418)

0%

20%

40%

60%

80%

100%

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13pH

Rel

ativ

e Pe

ptid

ase-

Akt

ivitä

t

B12/10-1 (#748) B3/1-2 (#418)

a.

b.

Abb. 8: Einfluss des pH-Wertes auf die proteolytische Aktivität* der Peptidase A (a.) und B (b.) der Stämme B3/1-2 (#418) und B12/10-1 (#748). *Die relative Peptidase-Aktivität entspricht der prozentualen Aktivität des Optimums.

3.2.22 Einfluss der Temperatur auf die Peptidase-Aktivität 3.2. Einfluss der Temperatur auf die Peptidase-Aktivität

Die Temperaturabhängigkeit der Peptidase A und B wurde an drei ausgewählten

Stämmen getestet. Als Stämme kamen SJ6S/14 (#148), B3/1-2 (#418) und B12/10-1

(#748) zum Einsatz, die zueinander aufgrund von 16S-rRNA-Sequenzvergleichen

(siehe 3.1.2) die meisten Unterschiede aufwiesen. In Abb. 9 sind die Ergebnisse der

Versuche zusammengefasst.

Die getesteten Enzyme zeigten bei gemäßigten und erhöhten Temperaturen

proteolytische Aktivität. Sie tolerierten ein breites Temperaturspektrum und besaßen

noch bei 15°C 2-15,2% und bei 70°C 8-21% relative Aktivität.

Bezüglich ihres Optimums und Temperaturverlaufs zeigte die Peptidase B der 3

Stämme ein sehr einheitliches Bild. Das Optimum der Stämme SJ6S/14 (#148) und

B3/1-2 (#418) lag bei ca. 50°C bzw. 55°C für Stamm B12/10-1 (#748).

55

Ergebnisse

Ebenso besaß die Peptidase A der Stämme B3/1-2 (#418) und B12/10-1 (#748) ihr

Aktivitäts-Optimum bei ca. 50°C. Im Gegensatz dazu zeigte die Peptidase A des

Stammes SJ6S/14 (#148) bei 50°C nur ca. 76% relative Aktivität, ihr Optimum lag bei

einer Temperatur von 40°C.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 10 20 30 40 50 60 70Temperatur [°C]

rela

tive

Pept

idas

e-A

ktiv

ität

SJ6/14 (#148)B3/1-2 (#418)B12/10-1 (#748)

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 10 20 30 40 50 60 70 80Temperatur [°C]

rela

tive

Pept

idas

e-A

ktiv

ität

SJ6/14 (#148)B3/1-2 (#418)B12/10-1 (#748)

a.

b.

Abb. 9: Einfluss der Temperatur auf die proteolytische Aktivität* der Peptidase A (a.) und B (b.) der Stämme SJ6S/14 (#148), B3/1-2 (#418) und B12/10-1 (#748). *Die relative Peptidase-Aktivität entspricht der prozentualen Aktivität des Optimums.

3.2.33.2.3 Salzabhängigkeit der Peptidasen Salzabhängigkeit der Peptidasen

Bei der Bestimmung der NaCl-Toleranz zeigte sich überraschenderweise, dass

sowohl Peptidase A als auch Peptidase B salzempfindlich war. Mit steigender Salz-

konzentration ging ihre Aktivität zurück (siehe Abb. 10 mit Stamm SJ5Ü/8 (#098) als

Beispiel), und bei 2 M NaCl waren noch 2-33% der Aktivität, abhängig vom Stamm,

nachweisbar (Tab. 20). Dennoch brauchten, abhängig vom Stamm, beide

Peptidasen geringe Mengen an Salz. Zum Beispiel besaß Peptidase A von Stamm

SJ2/3-1 (#073) ohne Salz nur noch 31% ihrer Aktivität, während bei 10 mM NaCl

volle Aktivität vorhanden war. Peptidase B desselben Stammes war eher salz-

unabhängig. Demgegenüber benötigten beide Peptidasen des Stammes SJ5Ü/8

56

Ergebnisse

(#098) Salz, allerdings in unterschiedlicher Konzentration, um höchste Aktivität zu

erringen: Peptidase A 200 mM NaCl und Peptidase B 1 mM NaCl. Diese Ergebnisse

zeigen im Allgemeinen einen Trend zur Übereinstimmung des Einflusses von Salz

auf die Peptidasen der untersuchten Stämme. Allerdings bilden sich auf dieser

Ebene auch Unterschiede zwischen den Peptidasen verschiedener Stämme heraus

(Tab. 20; vergleiche Peptidase A des Stammes SJ5Ü/8 (#098) mit denen von den

Stämmen SJ2/3-1 (#073), SJ5Ü/12 (#140), SJ6S/14 (#148) und B3/1-2 (#418)). Wie

schon vorher in der pH-Abhängigkeit verdeutlichen diese Untersuchungen fernerhin,

dass es sich bei Peptidase A und B um unterschiedliche Enzyme handelt.

Tab. 20: Einfluss der NaCl-Konzentration auf die Aktivität* von Peptidase A und B im Fluoreszenzassay.

Stamm Peptidase Optimale NaCl-Konzentration [mM]

Aktivität ohne Salz

Aktivität bei 2 M NaCl

A 10 31 % 21 %SJ2/3-1 (#073) B 1 95 % 2 %A 200 61 % 33 %SJ5Ü/8 (#098) B 1 65 % 2 %A 10 68 % 19 %SJ5Ü/12 (#140) B 5 94 % 2 %A 10 85 % 21 %SJ6S/14 (#148) B 10 95 % 4 %A 10 69 % 4 %B3/1-2 (#418) B 1 93 % 19 %A 5 97 % 2 %B3/14 (#430) B 100 89 % 20 %

B8/26-2 (#504) B 5 89 % 7 %A 100 95 % 9 %B12/10-1 (#748) B 1 97 % 12 %

B12/16 (#795) B 5 88 % 7 %*Die Probe mit maximaler Peptidase-Aktivität wurde gleich 100% gesetzt (entspricht etwa 1-5 FlU pro Ansatz).

57

Ergebnisse

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

NaCl [mM]

Rel

ativ

e A

ktiv

ität

Kulturüberstand Peptidase A Peptidase B

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

NaCl [mM]

Rel

ativ

e A

ktiv

ität

Kulturüberstand Peptidase A Peptidase B

a.

b.

Abb. 10: Einfluss der NaCl-Konzentration auf die relative Aktivität* der Peptidasen aus Stamm SJ5Ü/8 (#098). a.) Gesamtansicht; b.) Ausschnittsvergrößerung im Bereich von 0-50 mM NaCl. *Die relative Peptidase-Aktivität entspricht der prozentualen Aktivität des Optimums.

3.2.43.2.4 Einfluss von Metallionen auf die Peptidase-Aktivität Einfluss von Metallionen auf die Peptidase-Aktivität

Der Einfluss monovalenter und divalenter Kationen (KCl, MnCl2, MgCl2, FeCl2,

CaCl2, CuSO4) auf die Aktivität der Peptidasen wurde untersucht. Die Ergebnisse

sind in Tab. 21 zusammengefasst. Es konnte keine augenfällige Aktivierung (>1,5-

fache Aktivitäts-Steigerung) der Peptidasen durch die untersuchten Kationen

festgestellt werden. Der Einsatz von KCl (2 mM) im Assay beeinflusste die Aktivität

der untersuchten Peptidasen nur gering (88-123% relative Aktivität). Dabei zeigte die

KCl-Zugabe auf die Aktivität der Peptidase A aller Stämme (Ausnahme: SJ2/3-1

(#073): 96% rel. Aktivität) einen positiven Effekt, wahrscheinlich aufgrund der

Steigerung der Salinität (vergl. 3.2.3). Der Zusatz von MnCl2 zeigte auf die Aktivität

der untersuchten Peptidasen eine hemmende Wirkung (44-83% relative Aktivität).

Die Peptidase B der Stämme SJ2/3-1 (#073), SJ5Ü/8 (#098) und SJ6S/14 (#148)

zeigten allerdings mit MnCl2 eine schwach erhöhte Aktivität (mit 117-128% relativer

58

Ergebnisse

Aktivität). Keine oder eine schwach aktivierende Wirkung auf die Peptidase A-

Aktivität (99-147%) war auch bei Zusatz von MgCl2 und CaCl2 messbar. Die

Peptidase B der Stämme SJ2/3-1 (#073), SJ5Ü/8 (#098), SJ6S/14 (#148), B3/14

(#430) und B12/10-1 (#748) zeigten allerdings bei MgCl2-Zugabe gehemmte Aktivität

(mit 74-90% rel. Aktivität), ebenso die Peptidase B der Stämme SJ5Ü/8 (#098), B3/1-

2 (#418), B8/26-2 (#504) und B12/10-1 (#748) und Peptidase A von Stamm B3/14

FeCl2 die

s-

ngen wurde daher auf den

insatz der untersuchten Kationen im Assay verzichtet.

w Peptid

(#430) bei Zusatz von CaCl2.

Eine hemmende Wirkung von Kupfersulfat konnte bei allen untersuchten Peptidasen

nachgewiesen werden. Der Einsatz von 2 mM FeCl2 führte sowohl im Fluoreszenz-

test als auch im spektrophotometrischen Test zu einem totalen Ausfall der Aktivität

bei allen Proben, es konnte nicht geklärt werden, ob das verwendete

Assays inhibierte oder eine komplette Inhibition der Enzymaktivität vorlag.

Eine stichprobenartige Wiederholung der Versuche ergab eine hohe Schwankung

breite der Ergebnisse, jedoch mit gleich bleibender Tendenz (Daten nicht gezeigt).

Da die untersuchten Peptidasen keine eindeutige Aktivierung durch die untersuchten

Kationen zeigten, konnte eine Abhängigkeit oder mögliche Co-Faktoren der Enzyme

nicht identifiziert werden. Bei den weiteren Untersuchu

E

Tab. 21: Abhängi tä hgkeit der re

und Blativen Pe der

ptidase-Aktiviwählten S

t* von versce unter

iedenen Metallionen. Es urden die ase A ausge tämm sucht.

Stamm Peptidase 2 mM KCl 2 mM MnCl2 2 mM MgCl2 2 mM CaCl2 2 mM CuSO4A 96 % 63 % 109 % 147% 76 %SJ2/3-1 (#073) B 105 % 118 % 89% 126% 56 %A 1 111 % 57 % 09 % 139 % 68 %SJ5Ü/8 (#098) B 9 11 77 % 7 % 74 % 54 % 8 %A n.b. n.b. 99 % 103 % n.b.SJ5Ü/12 (#140) B n.b. n.b. 102 % 102 % n.b.A 123 % 52 % 107 % 126% 21%S

1J6S/14 (#148) B 88 % 28 % 77 % 104% 67 %

A 112 % 5 1 18 % 37 % 02 % 12 %B3/1-2 (#418) B 11 55 % 44% 104% 67% 4 %A n.b. n.b. 99 % 89 % n.b.B3/14 (#430) B n.b. n.b. 88 % 116 % n.b.

B8/26-2 (#504) B 102% 51% 108% 94% 49%A 102 % 63 % 90 % 102 % 34 %B12/10-1 (#748) B 105% 83% 101% 94% 63 %B 97% 91% 101% 113% 68%B12/16 (#795)

* Die Peptidase-Aktivität einer Probe ohne den Zusatz von Kationen wurde gleich 100% gesetzt. n.b.= nicht bestimmt.

59

Ergebnisse

33..22..55 EEiinnfflluussss cchhaaoottrrooppeerr AAggeennzziieenn aauuff ddiiee PPeeppttiiddaasseenn

Salze, wie Guanidinhydrochlorid (GuHCl) und Guanidinisothiocyanat (GuSCN),

wirken stark chaotrop denaturierend auf Proteine. In der Nukleinsäurereinigung

werden sie u.a. als Stabilisatoren gegen nukleolytischen Abbau im Zelllysat

eingesetzt. Weitere Bestandteile sind Detergenzien, wie das anionische Tensid

Natriumdodecylsulfat (SDS). Im Hinblick auf den möglichen biotechnologischen

Einsatz wurde die Toleranz der Peptidasen gegenüber chaotropen Agenzien

zien wäre für den Einsatz als zelllytisches Enzym zur Nuklein-

bnisse der Untersuchung mit GuHCl und GuSCN sind in Tab. 22

zusammengefasst.

T s n chaotro lze f die tida tiv r Pep d B der St

untersucht. Eine Aktivität der untersuchten Peptidasen in Gegenwart von chaotropen

Salzen und Detergen

säurereinigung wünschenswert.

Die Erge

ab. 22: Einflusämme.

vo pen Sa n au Pep se-Ak ität* de tidase A un

Relative idas vität* Pept e-AktiG inh chlo GuHuanid ydro rid ( Cl) Guanidinisoth uSiocyanat (G CN)

Stamm Peptidase 0,5 M 1,0 M 2,0 M 3,0 M 0,2 M 0,6 M 0,8 MA 106% 90% 24% 9% 118% 42% 15%SJ2/3-1 (#073) B 70% 43% 16% 7% 73% 13% 9%A 77% 69% 24% 11% 112% 53% 23%SJ5Ü/8 (#098) B 39% 13% 0% 0% 102% 71% 31%A n.b. 63% n.b. 8% n.b. n.b. 18%

SJ5Ü/12 (#140) B n.b. 23% n.b. 0% n.b. n.b. 9%A 104% 100% 34% 17% 119% 51% 22%SJ6S/14 (#148) B 38% 36% 4% 0% 64% 23% 10%A 82% 77% 34% 15% 84% 63% 26%B3/1-2 (#418) B 75% 61% 37% 21% 78% 44% 31%A n.b. 61% n.b. 6% n.b. n.b. 14%B3/14 (#430) B n.b. 40% n.b. 2% n.b. n.b. 7%

B8/26-2 (#504) B 86% 64% 31% 14% 89% 45% 15%A 82% 49% 46% 10% 95% 21% 12%B12/10-1 (#748) B 60% 22% 27% 37% 89% 18% 11%

B12/16 (#795) B 55% 40% 24% 8% 88% 13% 10%* Die Peptidase-Aktivität einer Probe ohne den Zusatz von chaotropen Salzen wurde gleich 100% gesetzt. n.b.= nicht bestimmt. Ein Großteil der Proben zeigte unter Einfluss von 3M GuHCl oder 0,8 M GuSCN

noch Peptidase-Aktivität. So zeigte die Peptidase A der Stämme B3/1-2 (#418) und

B12/10-1 (#748) bei der höchsten getesteten GuHCl-Konzentration von 3 M noch

eine Restaktivität von 21% bzw. 37%. Bei 0,8 M GuSCN zeigten die Peptidase A der

Stämme SJ5Ü/8 (#098), SJ6S/14 (#148) und B3/1-2 (#418) Restaktivitäten von 22%

bis 26%, bzw. die Peptidase B von Stamm SJ5Ü/8 (#098) und B3/1-2 (#418) je 31%.

60

Ergebnisse

Auffällig war die höhere GuSCN und GuHCl-Resistenz der Peptidase A gegenüber

der Peptidase B, mit Ausnahme von Stamm B3/1-2 (#418) und B12/10-1 (#748).

Die Toleranz der Peptidase A und B gegenüber SDS wurde exemplarisch an drei

Stämmen gezeigt (Abb. 11). Die Stämme SJ2/3-1 (#073), B3/1-2 (#418) und

B12/10-1 (#748) stellten eine repräsentative Auswahl aus jeweils einer der 3

Verwandtschaftsgruppen (vergl. 3.1.2) der 9 bearbeiteten Stämme dar. Waren die

einzelnen Messergebnisse einer hohen Schwankungsbreite unterworfen (siehe

3.1.4), wiesen die Mittelwerte jedoch eine Tendenz in der SDS-Toleranz der

Peptidasen auf (Abb. 11). So zeigte eine Konzentration von 0,1% SDS nur wenig

Einfluss auf die Aktivität der Peptidase A der hier untersuchten Stämme, wobei bei

steigender SDS-Konzentration (0,5% und 1% SDS) ein Absinken der relativen

Aktivität z.T. bis auf 15% zu beobachten war. Die Peptidase B hingegen zeigte mit

0,1% SDS eine Steigerung der Aktivität von 143%-187%, wohingegen sie bei den

öheren Konzentrationen einen Rückgang der Aktivität bis auf 27% (bei 1% SDS)

aufwies. Beide Peptidasen (A und B) besaßen also eine Toleranz gegenüber SDS,

was auch durch proteolytische Aktivität der Proben während der SDS-PAGE

demonstriert wurde (siehe 2.6.8).

h

0%

50%

100%

rela

ti

150%

200%

250%

300%

- B12/10-1(#748) -Peptidase A

B12/10-1(#748) -Peptidase B

ve P

eptid

ase-

Akt

ivitä

t

0,1% SDS0,5% SDS1% SDS

SJ2/3-1(#073) -Peptidase A

SJ2/3-1(#073) -Peptidase B

B3/1-2(#418) -Peptidase A

B3/1-2(#418)Peptidase B

Abb. 11: Relative Peptidase-Aktivität* der Peptidase A und B in Abhängigkeit zur SDS-Konzentration. * Die Peptidase-Aktivität einer Probe ohne den Zusatz von SDS entspricht 100%.

33..22..66 EEiinnfflluussss vvoonn IInnhhiibbiittoorreenn aauuff ddiiee PPeeppttiiddaasseenn

Der Einsatz von spezifischen Peptidase-Inhibitoren sollte die Zuordnung der

untersuchten Peptidasen zu bekannten Gruppen von Peptidasen ermöglichen.

61

Ergebnisse

Insbesondere wurde nach Serinpeptidasen und Metallopeptidasen gesucht (siehe

Einleitung, Abschnitt 1.2.1.1). Als Inhibitor für Serinpeptidasen (und einigen wenigen

nanthrolin und EDTA. Der

erinpeptidase-Inhibitor PMSF besaß nur geringe hemmende Wirkung (16-39%

r Peptidase A der

genannten Stämme um eine Metallopeptidase handelt.

s von Inhib r ie Aktivi r Peptidase A und B.

Cysteinpeptidasen) wurde PMSF benutzt, Phenanthrolin bzw. EDTA als Inhibitoren

für Metallo- und Metallionen-aktivierte Peptidasen (Salvesen & Nagase, 2001). Die

Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tab. 23 zusammengefasst.

Die Peptidase A der Stämme SJ2/3-1 (#073), SJ5Ü/12 (#140), B3/14 (#430) und

B12/10-1 (#748) zeigte eine komplette Inhibition bzw. starke Inhibition (58-68%

Inhibition) durch die Metallopeptidase-Inhibitoren Phe

S

Inhibition). Dies legt die Vermutung n s sich bei deahe, dass e

Tab. 23: Einflus ito en auf d tät de

Inhibi n [%] tioStamm Peptidase PMSF

(10 mM)Phe nna throlin

(10EDTA

M) m (5 mM)A 16 �5 >9 9a) 68SJ2/3-1 (#073) B >9 9a) -b) 11A 54 �18 >99a)

58SJ5Ü/8 (#098)

B >9 a)9 -b) 54A 36 �8 >9 n9a) .b.SJ5Ü/12 (#140) B >9 n9a) -b) .b.A 56 �9 >99a)

63SJ6S/14 (#148)

B >9 a)9 -b) 71A 69 �22 >99a)

29B3/1-2 (#418) B >99a) 18 40 � 62

A 61 �16 >9 9a) 68B3/14 (#430) B >99 - 50a)

b)

B8/26-2 (#504) b)B 91 �1 - 51A 39 �21 >99a)

58B12/10-1 (#748) a)

b)

B >99 - 91B12/16 (#795) B >99a)

-b) 35a)Peptidase-Aktivität unter der Nachweisgrenze; b)Aktivitätssteigerung bis zu 168% Restaktivität durch Phenanthrolin. n.b.: nicht bestimmt Ebenfalls starke (58-68% Inhibition) bis komplette Inhibition konnte durch die

Metallopeptidase-Inhibitoren bei der Peptidase A der Stämme SJ5Ü/8 (#098),

SJ6S/14 (#148) und B12/10-1 (#748) beobachtet werden. Schwierigkeiten für die

sichere Zuordnung zu den Metallopeptidasen bereitete aber die starke inhibitorische

Wirkung (54-61% Inhibition) von PMSF auf die Aktivität. Gleiches gilt für Peptidase A

des Stammes B3/1-2 (#418) mit 69% Inhibition durch PMSF und geringer Wirkung

von EDTA mit 29% Inhibition, aber kompletter Inhibition durch Phenanthrolin.

62

Ergebnisse

Die Peptidase B aller untersuchten Stämme wurde stark (91% Inhibition bei Stamm

B8/26-2 (#504)) bis komplett durch 10 mM PMSF inhibiert. Dagegen zeigte

SJ2/3-1 (#073) und B12/16 (#795) zu den Serin-

B aller Stämme sehr deutlich heraus, dass es

sich hierbei um zwei verschiedene Enzyme handelt. Insofern stehen diese

en des Einflusses des pH-Wertes, des NaCl-

Phenanthrolin nur bei Stamm B3/1-2 (#418) eine Inhibition der Peptidase B-Aktivität

von 40%, bei allen anderen Stämmen konnte keine Inhibition der Peptidase B

festgestellt werden.

Mit der geringen Inhibition von 11% bzw. 35% durch EDTA konnte eine Zuordnung

der Peptidase B der Stämme

peptidasen erfolgen. Die Peptidase B der restlichen Stämme zeigte eine Inhibition

von 50-71% durch 5 mM EDTA. Eine eindeutige Zuordnung dieser Peptidasen

konnte deshalb nicht erfolgen.

Zusammenfassend stellt die unterschiedliche Wirkung von PMSF und Phenanthrolin

bzw. EDTA auf die Peptidase A und

Ergebnisse im Einklang mit den Dat

Gehalts und von chaotropen Salzen.

33..22..77 GGeewweebbeeaauuffllöösseennddee AAkkttiivviittäätt

Auf Plattentests konnte nachgewiesen werden, dass die Peptidasen der 9

untersuchten Stämme sowohl Magermilch und reines Casein, als auch Gelatine als

Substrate verwerten konnten (Daten nicht gezeigt). Die Tauglichkeit der Peptidasen

für den Einsatz in Nukleinsäure-Aufreinigungskits wurde hier exemplarisch anhand

y) unter Standard-

des Lyse-Verhaltens gegenüber tierischem Gewebe untersucht. Für die Versuche

standen Mäuseschwanzstückchen zur Verfügung. Als Kontrolle diente die

kommerziell verwendete Proteinase K (10 μg/μl, MOLZYM).

Dieser Versuch wurde mit jeweils 450 μl Konzentrat aus 8 Kulturüberständen (siehe

Tab. 24) durchgeführt. Das Lyse-Verhalten der Peptidasen an tierischem Gewebe

wurde zunächst unter den zuvor gewonnenen Optimalbedingungen untersucht. Die

Gewebestückchen wurden in Puffer (30mM Tris-HCl, pH 9, 5 mM NaCl) mit

zellfreiem Kultur-Konzentrat bei 50°C inkubiert, wobei die enthaltene Peptidase-

Gesamtaktivität zwischen 0,4-1,08 kFl-Units (Fluoreszenzassa

bedingungen lag. Die nach Betriebsanweisung (PrestoSpin D Tissue-Kit, MOLZYM)

eingesetzte Gesamtaktivität der Proteinase K betrug dagegen 75 kFlU. Die Proben

wurden alle 10 min kräftig gemischt und ihr Zustand protokolliert.

63

Ergebnisse

Die Lyse der Gewebeproben erfolgte, abhängig vom Stamm, mit unterschiedlicher

Geschwindigkeit (siehe Tab. 24). Anfängliche Lyseerscheinungen, wie Trübung des

Puffers, traten bei den Stämmen SJ6S/14 (#148), B3/14 (#430) und B12/16 (#795)

schon nach 20 min Inkubation auf. Eine vollständige Zersetzung des Muskelgewebes

konnte bei diesen 3 Stämmen nach 120 min Inkubation beobachtet werden (siehe

Abb. 12). Eine Zersetzung der Mäuseschwanzhaut konnte nur in geringem Maße

festgestellt werden; sie wurde am Versuchsende zur Überprüfung der Muskel-

gewebelyse entfernt. Das Konzentrat von Stamm SJ5Ü/8 (#098) zeigte unter diesen

Bedingungen kein Anzeichen von gewebelytischem Verhalten, während die

Proteinase K aufgrund nicht optimaler Reaktionsbedingungen nur eine verlangsamte

Lyse zeigte.

a. b.

Abb. 12: Wirkung des zellfreien Kultur-Konzentrates von Stamm B12/16 (#795) auf ein Mäuseschwanzstückchen in Reaktionspuffer (30 mM Tris-HCl pH 9, 5 mM NaCl) und Inkubation bei 50°C. a. 0 min; b. 120 min: Haut wurde manuell entfernt, das Muskelgewebe hat sich von den Schwanzwirbeln (Pfeil) gelöst und wurde zersetzt. Beachte sung in b. aufgrund der Zersetzung des Muskelgewebes. die Trübung der Lö

kung der ko trie Ku rübers de auf ein tückchen (ca la ) nach 0, 60, 90 und 120 min

Reaktionspuffe mM ris-H H 9, M NaC bei

Tab. 24: Wir nzen rten ltu tänMäuseschwanzs . 1 cm ng 3Inkubation in r (30 T Cl p 5 m l)50°C.

Konzentrat Gesamtaktivität 30 min 60 min 90 min 120 min [kFlU]1)

SJ2/3-1 (#073) 0,4 - - + + SJ5Ü/8 (#098) 0,65 - - - - SJ6S/14 (#148) 0,9 ++ +++ 9 + + B3/1-2 (#418) 1,05 - (+) (+) + B3/14 (#430) 1,01 + + ++ +++ B8/26-2 (#504) 1,08 (+) (+) (+) + B12/10-1 (#748) 0,96 (+) (+) (+) + B12/16 (#795) 0,69 + + ++ +++ Prot. K (200 μg) 75,0 - - (+) + Kontrolle (H2O) - - - - - 1)Die Gesamtaktivität der eingesetzten Konzentrate (450 μl) wurde unter Standardbedingungen (Fluoreszenzassay, 30 mM Tris-HCl pH 9; 5mM NaCl; 30 min, 37°C) bestimmt. Zeichen-Erklärung: (+): leichte Trübung; +: Trübung; ++: Freisetzung von kleinen Gewebestückchen; +++: komplette Lyse des Muskelgewebes

64

Ergebnisse

Das Lyse-Verhalten in einem modifizierten Lysepuffer (0,5 M GuSCN; 0,5%

Tween 20; 5 mM CaCl2; 0,5% SDS; 30 mM Tris-HCl, pH 9) bei 50°C für die

Nukleinsäure-Extraktion wurde mit den aktivsten Konzentraten der Stämme SJ6S/14

(#148), B3/14 (#430) und B12/16 (#795) untersucht. Im Vergleich zum vorherigen

Versuch war die Lyse des Gewebes verlangsamt. Nach 120 min traten erste leichte

Lyseerscheinungen auf, die durch eine Freisetzung von kleinen Gewebeteilchen zu

erkennen waren. Eine vollständige Zersetzung des Muskelgewebes unter diesen

Bedingungen erfolgte nur bei Stamm B12/16 (#795) nach 18 h Inkubation, die

timierten Reaktionsbedingungen für

durch GuSCN im Gegensatz zur Proteinase K, die allerdings bis zu

100-fach konzentrierter vorlag, stark gehemmt.

wäre das gewebelytische Verhalten

anderen Proben blieben in ihren frühen Zersetzungszuständen stehen. Die Kontrolle

mit 75 kFlU Proteinase K hingegen konnte den Mäuseschwanz unter diesen

Bedingungen innerhalb von 3 h komplett bis auf die Sehnen und Knochen zersetzen.

Wurde die eingesetzte Menge an Proteinase K auf eine Aktivität von 1 kFlU reduziert,

verzögerte sich der komplette Abbau hingegen auf etwa 12 h.

In diesem Versuch konnte das gewebelytische Verhalten der Peptidasen aus 8

Konzentraten nachgewiesen werden. Unter op

die untersuchten Peptidasen zeigten einige der Konzentrate sogar eine höhere

Aktivität am Muskelgewebe als die hochkonzentrierte Proteinase K. In den

eingesetzten Konzentrationen wurde jedoch die sichtbare proteolytische Aktivität der

Konzentrate

In Hinblick auf die biotechnologische Nutzung

der hier beschriebenen Peptidasen im hochkonzentrierten Zustand (>75 kFlU) und

ein Einsatz der Enzyme für eine komplette DNA oder RNA-Isolierung aus Gewebe

interessant.

33..22..88 AAnnaallyyssee ddeerr PPeeppttiiddaasseenn mmiitttteellss PPAAGGEE

Zur Abschätzung des Molekulargewichts der Peptidasen und Analyse der

kontaminierenden Proteine wurden zellfreie Kulturen und Präparate aus der Phenyl-

sepharose-Chromatografie mit Hilfe der Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert.

Die Bestimmung der nativen Größe der Peptidasen sollte dabei über einen direkten

Aktivitätsnachweis im Gel erfolgen. Die Analyse erfolgte anhand einer

repräsentativen Auswahl, als Stämme kamen SJ2/3-1 (#073), B3/1-2 (#418) und

B12/10-1 (#748) zum Einsatz, die zueinander aufgrund von 16S-rRNA-Sequenz-

vergleichen (siehe 3.1.2) die meisten Unterschiede aufwiesen.

65

Ergebnisse

Für den Aktivitätsnachweis wurden die Proben unter denaturierenden Bedingungen

(2% SDS) im Gel aufgetragen, ohne sie vorher zu erhitzen. Eine Hitzedenaturierung

der Proben (5 min bei 85°C) im SDS-Probenpuffer deaktivierte jegliche proteolytische

Aktivität. Der Peptidasenachweis erfolgte nach der Auftrennung im Kontakt-

en großen

s Stammes B3/1-2 (#418) eine ~55 kDa-Bande mit schwacher

Aktivität und eine Doppelbande unterhalb von ~30 kDa mit ebenfalls schwacher

Aktivität. Es wird vermutet, dass durch Autoproteolyse eine Zersetzung der Peptidase

B in kleinere aktive Enzymteile stattgefunden hat. Dies ist auch von anderen

Serinpeptidasen bekannt (Arnorsdottir et al., 2002). Eine Verifizierung wurde nicht

vorgenommen.

Zymogramm (siehe 2.6.10). Eine direkte Zymografie, bei der die Auftrennung und der

Aktivitätsnachweis in PA-Gelen mit copolymerisiertem Substrat erfolgten, war nicht

erfolgreich. Die Peptidasen konnten offensichtlich aufgrund ihrer hohen Affinität zu

den copolymerisierten Proteinen im Gel nicht aufgetrennt werden und bildeten einen

hochmolekularen Schmier im aktivgefärbten Gel.

In allen drei genannten Stämmen konnten bei der Analyse mittels SDS-PAGE und

anschließender Kontakt-Zymografie in den Kulturüberständen zwei Aktivitätszonen

festgestellt werden (siehe bspw. Abb. 13). Das Molekulargewicht ließ sich mit ca. 55

kDa und ca. 35 kDa nur ungefähr ermitteln, da die Aktivitätszonen ein

Wirkungsbereich aufwiesen. Diese Aktivitäts-Banden konnten auf die beiden aktiven

Fraktionspools durch Phenylsepharose-Chromatografie zurückgeführt werden. Somit

lässt sich eine direkte Zuordnung der Aktivitätsbande, die bei ca. 35 kDa auftritt, zu

der Peptidase A bei den drei untersuchten Stämmen schlussfolgern. Dasselbe gilt für

die Peptidase B, die der Aktivität bei 55 kDa zugeordnet werden konnte.

Eine längere Lagerung der Proben in 30 mM Tris-HCl >4 Monate reduzierte nicht nur

die Aktivität, sondern es konnten auch Veränderungen hinsichtlich des Musters der

Aktivitätsbanden beobachtet werden. So zeigte die angereicherte Probe von

Peptidase B de

66

Ergebnisse

Abb. 13: SDS-PAGE der zellfreien Kultur (ZK) und den Phenylsepharosefraktionspools A (PA) und B (PB) des Stammes SJ2/3-1 (#073) und B12/10-1 (#748). a: Silbergefärbtes Polyacrylamidgel; b: Kontakt-Zymogramm mit Peptidase-Aktivitätszonen, durch grafische Aufhellung hervorgehoben. Die Position einiger Banden der Proteinleiter wurde mit weißen Strichen markiert. Marker = PageRuler Prestained Protein ladder.

3.33.3 Molekularbiologische Identifizierung von Subtilisin-ähnlichen Peptidasen Molekularbiologische Identifizierung von Subtilisin-ähnlichen Peptidasen

Für die weitere Charakterisierung der untersuchten Peptidasen bedurfte es einer

Identifizierung der unbekannten Peptidasegene. Das Screening nach

Peptidasegenen in den Genbanken wurde auf zwei Weisen durchgeführt: Zum einen

durch Identifizierung von Peptidase produzierenden Klonen auf Plattenassays (siehe

2.6.9), und zum anderen durch Kolonie-Hybridisierung mit Sonden.

Zum Auffinden von Klonen mit proteolytischer Aktivität wurden Genbanken der 9

Stämme im Vektor pNOFMCS auf Skimmilk-Agar untersucht, ebenso wie die

Genbanken von 4 Stämmen im Vektor pUC13 (Daten nicht gezeigt). Zur

Identifizierung kamen neben dem Skimmilk-Agar zwei weitere sensitive

Plattenassays (siehe 2.6.9) zum Einsatz, die auf zwei verschiedenen Substraten

(Casein und Gelatine) basierten. Es wurden u.a. Verfahren angewendet, um eine

Sekretion der rekombinanten Proteine zu erleichtern (z.B. Kälteschock oder

Inkubation der Klone bei Raumtemperatur). Ebenfalls erfolgte eine Exposition der

Klone mit Salz (Überschichtung der Kolonien mit 2% und 6% NaCl-Lsg.), um bei

möglicher Salzabhängigkeit der Peptidasen die proteolytische Aktivität auf den

ZK (#

073)

ZK (#

748)

Mar

ker

PB (#

073)

PA (#

073)

PB (#

748)

PA (#

748)

~100

kDa

~70 ~55

~40

~35

~25

~100

kDa

~70

~55

~40

a

b

ZK (#

073)

ZK (#

748)

Mar

ker

PB (#

073)

PA (#

073)

PB (#

748)

PA (#

748)

67

Ergebnisse

ansonsten salzarmen (1% NaCl) Agarplatten zu detektieren. Es konnte jedoch im

Screening kein Klon gefunden werden, der proteolytische Aktivität zeigte.

Das Screening nach Peptidasegenen in den Genbanken erfolgte daher im Kolonie-

Blot-Verfahren mit Sonden, deren Sequenz homolog zu bekannten Peptidasegenen

war. Die biochemische Charakterisierung ergab Hinweise auf die Zugehörigkeit der

untersuchten Enzyme zu zwei großen Peptidasegruppen: den Metallopeptidasen und

den Serinpeptidasen (siehe Abschnitt 3.2.6). Da über Metallopeptidasen

vergleichsweise wenige Sequenzinformationen vorlagen, wurde die Suche auf

Serinpeptidasen beschränkt. Innerhalb der Serinpeptidasen bilden die Subtilisin-

ähnlichen Peptidasen eine der größten Gruppen, mit Proteinase K und Subtilisin E

als bekannteste Vertreter. Sie besitzen ein breites Substratspektrum und viele

biotechnologische Anwendungen (Siezen, 1996). Sehr viele Enzyme dieser Familie

sind gut charakterisiert und einige schon rekombinant hergestellt worden. Anhand

von Sequenzinformationen der bekannten Peptidasen wurde eine Sonde für

Subtilisin-ähnliche Peptidasen konstruiert.

Die Genbanken für den Kolonie-Blot wurden mit dem CopyControl Fosmid Library

Production-Kit (Epicentre) in E. coli Epi300 erstellt. Fosmide bieten aufgrund der

großen Insertgröße und des Vorliegens als Einzelkopie im Wirt folgende Vorteile

gegenüber konventionellen Vektoren (z.B. pUC13, pNOFMCS):

1.) Die verringerte Anzahl der zu untersuchenden Klone durch die große Insertgröße

erbringt eine erhebliche Arbeitserleichterung. Bei einer durchschnittlichen Insertgröße

von ca. 40 kbp und Annahme einer Genomgröße von ca. 4,7 Mbp und 99%

Wahrscheinlichkeit zur Klonierung des gesamten Genoms beträgt die Kolonieanzahl

nunmehr <500 pro Genbank (Clarke & Carbon, 1976).

2.) Das Vorliegen des Fosmids als Einzelkopie ermöglicht aufgrund eines geringen

Gen-Dosis-Effektes auch die Klonierung von Genen für toxische Genprodukte

(Epicentre). Rekombinante Peptidasen können aufgrund ihrer unregulierten

Hydrolyse von essentiellen Proteinen und Destabilisierung der Bakterienzelle toxisch

auf die Wirtszelle wirken (Arnorsdottir et al., 2002; Bott & Betzel, 1996; Goldberg,

1992). So wurde eine Stabilisierung von Klonen mit funktionellen Peptidasegenen

durch einen geringen Gen-Dosis-Effekt erhofft.

68

Ergebnisse

3.3.13.3.1 Entwicklung der Sonde für Subtilisin-ähnliche Peptidasen Entwicklung der Sonde für Subtilisin-ähnliche Peptidasen

Für die Sondensynthese wurden Primer gesucht, deren DNA-Sequenz homolog zu

konservierten Genabschnitten der bisher bekannten Subtilisin-ähnlichen (subtilisin-

like) Serinpeptidasen (MEROPS-Nr: S8 (Rawlings et al., 2006)) war. Beim Alignment

der Aminosäuresequenzen von 6 Subtilisin-ähnlichen Peptidasen verschiedenster

Organismen (Gram-positive, Gram-negative Bakterien und ein Vertreter der

Ascomycota) wurden drei stark konservierte Bereiche gefunden (Abb. 14A). Sie

stellten sich als die Regionen um die hochkonservierten Aminosäurereste Aspartat

(Asp, D), Histidin (His, H) und Serin (Ser, S) heraus, die charakteristisch für die

Familie der Subtilisin-ähnlichen Peptidasen eine katalytische Triade im aktiven

Zentrum ausbilden (Siezen & Leunissen, 1997).

Aus dem Alignment der DNA-Sequenzen dieser drei konservierten Regionen konnten

drei degenerierte Primer entwickelt werden (Abb. 14B): SubDfor, SubHfor und

SubSrev.

Abb. 14: Sequenzvergleich von 6 verschiedenen Subtilisin-ähnlichen Peptidasen1).A. Alignment der Aminosäuresequenzen in der Umgebung der drei Aminosäurereste(*) des

katalytischen Zentrums. Identische und homologe Aminosäuren wurden schwarz bzw. grau hinterlegt. Die grün-gestrichelten Kästen stellen den abgeleiteten Bereich der unter B angezeigten DNA-Sequenzen dar.

B. Alignment der DNA-Sequenzen der konservierten Peptidase-Regionen. Oberhalb der jeweiligen Alignments sind die Sequenzen der daraus entwickelten degenerierten Primer2) vermerkt (forward Primer (5’-3’):SubDfor, SubHfor; reverse Primer (3’-5’): SubSrev). Homologe Nukleotide sind mit einem Kasten umschlossen. Die blau gestrichelten Kästen stellen den Bereich dar, an dessen Sequenzen die Primer entwickelt wurden. 1) Enzym-Kürzel: 1.Taq: Aqualysin I, Thermus aquaticus, 2.Bsu: Subtilisin E, Bacillus subtilis 168; 3.Tal: Proteinase K,

Tritirachium album; 4.Bst: Subtilisin AK1, Geobacillus stearothermophilus; 5.Val: Exoprotease A, Vibrio alginolyticus; 6.Asp: Apr Peptidase, Alteromonas sp. 0-7.

2) Basencode für Nukleotidgemische (Wobbles): Y= C+T; S= C+G; W= A+T; B= C+G+T.

69

Ergebnisse

Zusätzlich wurden zwei degenerierte Primer (hier bezeichnet als subtilisin_for, ein

forward-Primer in der H-Region und subtilisin_rev, ein reverse-Primer in der

S-Region) für Subtilisin-ähnliche Peptidasen von Jang et al. (2002) in die

Untersuchungen einbezogen.

Zur Amplifikation von Genabschnitten der Subtilisin-ähnlichen Peptidasen wurde als

Template chromosomale DNA der 9 moderat halophilen Stämme (siehe Tab. 35 im

Anhang, türkis markiert) und als Positivkontrolle DNA von Bacillus subtilis,

Geobacillus stearothermophilus und Thermus aquaticus in der PCR-Reaktion

eingesetzt. Aus den möglichen Kombinationen der 5 Primer trat das Primerpaar

SubHfor und subtilisin_rev hervor, das eine starke Amplifikation eines etwa 500 bp

großen Produktes bei allen genannten Stämmen ermöglichte. Andere mögliche

Kombinationen der 5 Primer erzielten entweder keine bis schwache Amplifikate oder

enthielten zusätzlich unspezifische Nebenamplifikate. Aufgrund der Übereinstimmung

mit der Größe des Amplifikates der Positivkontrollen und der halophilen Stämme

wurde vermutlich ein Peptidase-Sequenzabschnitt zwischen der Region H und

Region S (siehe Abb. 14 A) amplifiziert.

Das DIG-markierte PCR-Produkt (2.7.7), welches mit den Primern subHfor und

subtilisin_rev von Stamm B12/16 (#795) amplifiziert wurde, stellte die Sonde sub795

für das Screening der Genbanken nach Subtilisin-ähnlichen Peptidasen dar. Die

Auswahl des Stammes für die Sonde wurde beliebig getroffen, da über eine niedrige

Stringenz im Southern-Blot auch eine Hybridisierung von weniger homologen

Zielsequenzen erreicht werden sollte.

3.3.22 Identifizierung von Klonen und Subklonen mit homologen Sequenzen zu ogen Sequenzen z3.3. Identifizierung von Klonen und Subklonen mit homol uSubtilisin-ähnlichen Peptidasen Subtilisin-ähnlichen Peptidasen

Es wurden insgesamt Fosmid-Genbanken von 3 der halophilen Peptidase-

Produzenten mit der Sonde sub795 im Kolonie-Blot-Verfahren (2.7.5) untersucht. Die

Anzahl der untersuchten Klone (ca. 900) pro Genbank entsprach der etwa 1,8-fachen

Genomgröße. Die Fosmid-Genbanken der Stämme B3/1-2 (#418), B12/10-1 (#748)

und B12/16 (#795) erbrachten insgesamt 4 Klone mit positiven

Hybridisierungssignalen: F114 für den Stamm B3/1-2 (#418), F13 und F14 für

B12/10-1 (#748) und F9 für B12/16 (#795).

Stellvertretend wird eine Klonanalyse des Klons F13 mit anschließender

Hybridisierung gezeigt. In der Klonanalyse von F13 konnte eine zur Sonde sub795

homologe Sequenz u.a. auf zwei SalI-Fragmenten (Größe ca. 1,5 kb und 0,6 kb)

70

Ergebnisse

bzw. einem 8 kb BamHI-Fragment der restringierten Fosmid-DNA (Größe >38kb)

lokalisiert werden (Abb. 15).

Abb. 15: Klonanalyse und Southern-Blot des Fosmidklons F13 (Stamm B12/10-1 (#748)). a.) Gelelektrophorese der restringierten Fosmid-DNA mit folgenden Enzymen: 1. EcoRI, 2. SalI, 3. HindIII, 4. BamHI, 5. XhoI, 6. HaeI, 7. EcoRV, 8. XbaI, 9. SmaI. M= Marker-DNA �/HindIII-EcoRI (DIG-markiert). b.) Southern-Blot zur Klonanalyse (a.) mit der Sonde sub795.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

a b

bp 21226-

5148- 4973- 4268- 3530-

2027- 1904- 1584- 1375-

947- 831- 564-

Über eine Subklonierung (Tab. 25) des 8 kb BamHI-Fragmentes vom Fosmidklon

F13 in pNOFMCS wurden zwei SalI-Fragmente wiederum in pNOFMCS subkloniert

und erbrachten die Subklone NOF13-1-7 und NOF13-1-10 für die Sequenzierung

(3.3.3).

Tab. 25: Charakteristika des Fosmidklons F13 und seiner Subklone. Größe der hybridisierungspositiven Fragmente Klon Klonierungs-

Vektor SalI-restringiert BamHI-restringiert Peptidase-Aktivität1)

F13 pCC1FOS (Fosmid)

0,6 kb + 1,5 kb 8 kb +2)

NOF13-1 pNOFMCS 0,6 kb + 1,5 kb 8 kb - NOF13-1-7 pNOFMCS 1,5 kb - - NOF13-1-10 pNOFMCS 0,6 kb - - 1)Peptidase-Aktivität auf Skimmilk-Agar. 2)Aktivität nur nach Induktion der Zellen mit L-Arabinose (0,5 mM) und Inkubation für 4 d bei RT (~23°C). Die im Southern-Blot identifizierten Klone wurden auf Peptidase-Aktivität im

Plattenassay (2.6.9) überprüft. Es konnte keine proteolytische Aktivität der Klone und

Subklone festgestellt werden. Demgegenüber konnte bei dem Fosmidklon F13 nach

Erhöhung der Kopieanzahl durch eine L-Arabinose-Induktion (0,5 mM) und

anschließender Inkubation für 4 d bei RT (~23°C) im Plattenassay geringe

Peptidase-Aktivität festgestellt werden. Gleiches galt für Fosmidklon F114. Die

Fosmidklone F9 und F14 sowie mehrere beliebig ausgewählte Fosmidklone aus den

Genbanken zeigten hingegen keine Aktivität nach Induktion.

71

Ergebnisse

3.3.33.3.3 Identifizierung und Sequenzanalyse der Peptidasegene Identifizierung und Sequenzanalyse der Peptidasegene

Die Sequenzierung der Subklone (NOF13-1-7 und NOF13-1-10) von Fosmidklon F13

erbrachten eine 2293 bp große Nukleotidsequenz (Abb. 37). Die Analyse der

abgeleiteten Aminosäuresequenzen erbrachte ein offenes Leseraster (ORF) von

1584 Nukleotiden, das vom vermuteten Startcodon (ATG) bei Position 261 bp bis

zum vermuteten Stoppcodon (TAG) bei 1842 bp reichte. Eine vermutliche ribosomale

Bindungsstelle (AGGA) wurde 8 bp stromaufwärts des Leserasters identifiziert. Die

Übersetzung der Nukleotide des ORF in eine Aminosäuresequenz ergab ein

mögliches Protein von 528 AS Länge (Abb. 16). Eine BLAST-Analyse der AS-

Sequenz ergab Übereinstimmungen mit hinterlegten Sequenzen von Subtilisin-

ähnlichen Peptidasen (Tab. 26). Die höchste Übereinstimmung mit 65% (348 von

532 Übereinstimmungen) ergab sich mit der alkalischen Serinpeptidase A (Alkaline

Serine Exoprotease Precursor A, ProA) von Vibrio alginolyticus. Aufgrund der

niedrigen Homologie der abgeleiteten Aminosäuresequenz von <66% zu bekannten

Proteinen handelt es sich bei der hier identifizierten DNA-Sequenz vermutlich um

eine neue Subtilisin-ähnliche Peptidase. Die Benennung der neuen Peptidase erfolgt

in Anlehnung zur nächst verwandten Peptidase ProA aus Vibrio alginolyticus und

dem Ursprung aus Salinivibrio spec. Stamm B12/10-1 (#748) als ProAS(#748). Der

Anhang des Buchstaben S im Enzymnamen soll dabei auf die Herkunft aus

Salinivibrio und die Nummer auf die des Stammes hinweisen.

Die Peptidasebezeichnung ProA wurde aus Prioritätsgründen übernommen, obwohl

von Deane (1987) unglücklicherweise die missverständliche Peptidasegen-

Bezeichnung proA verwendet wurde. Die Bezeichnung proA steht bekanntlich für das

Gen der Glutamat-5-Semialdehyd-Dehydrogenase in der Prolin-Biosynthese von E.

coli (Kuo & Stocker, 1969) und vielen anderen Organismen.

Abb. 16: Abgeleitete Aminosäuresequenz des Peptidasegens proAS(#748) von Stamm B12/10-1 (#748).

MLKHALSCCVASALMAASPTALSEQHEGKQGVSQQQTLAPLMVAAKNRGIEDQYIVVLKQPMTLSDDPQALKTFTQQAVSSMVNQHAVKVEKVFDRSLSGFVAKLTPAQLRALRMDSQVDFIEQDKTISLDPVITPDANQNNPVWGLDRIDQRNLPLDNNYSTNFDGTGVTAYVIDTGVTTSHVEFGGRARSGYDFVDNDQDATDCNGHGTHVAGTIGGSQYGVAKNVDIVGVRVLSCSGSGSTSGVIGGVDWVAANANGPSVANMSLGGGVSTALDRAVASAVQSGVSFMLAAGNSNADACNSSPAREPSGVTVGSSTIRDTRSSFSNWGSCLDVFAPGSDIKSAWYDGSYRTISGTSMATPHVAGVAALYLQENSSLSPVQLANLISNRASVDKINDPRGSVNKLLYSQADSSCEPNCGTEPDPKGELKNGQALTDISGGQGAQRFFYVDVDAGQRLTVNISGGSGDADLYLRYGSKPTFNNWDCRPYNYGNSEVCTVQNTQKGRYHVMLNGYAAFSGVSVTAR

72

Ergebnisse

Tab. 26: BLAST-Analyse der Aminosäuresequenz der ProAS(#748)-Peptidase von Stamm B12/10-1 (#748).

Enzym Spezies Identische AS Ähnliche AS Alkaline serine exoprotease A precursor (ProA)

Vibrio alginolyticus 348 von 532 (65%) 408 von 532 (76%)

Extracellular subtilisin-like serine proteinase (VPR)

Vibrio sp. PA-44 336 von 528 (63%) 409 von 528 (77%)

Alkaline serine protease (Vco157)

Vibrio cholerae 295 von 535 (55%) 397 von 535 (74%)

Alkaline serine protease Photobacterium sp. SKA34 274 von 487 (56%) 359 von 487 (73%) Anhand der Sequenz von proAS(#748) wurden Primer (subHraus301 und

subHraus61) entwickelt, die eine direkte Sequenzierung der Fosmidklone F114 und

F9 der Stämme B3/1-2 (#418) und B12/16 (#795) ermöglichten. Somit konnten ohne

Subklonierung die vollständigen Sequenzen zweier weiterer Peptidasegene

proAS(#418) aus Stamm B3/1-2 (#418) und proAS(#795) aus Stamm B12/16 (#795)

identifiziert werden (siehe Abb. 38 & Abb. 39).

Des Weiteren wurden 400 bp große Peptidasegen-Teilsequenzen der übrigen 7

Stämme durch Sequenzierung von PCR-Produkten mit dem Primer subHfor

bestimmt.

Eine BLAST-Analyse der 8 abgeleiteten Nukleotidsequenzen und -teilsequenzen

erbrachte eine ähnlich hohe Übereinstimmung von 64 bzw. 65% mit alkalischen

Serinpeptidasen aus Vibrio, wie zuvor schon die Peptidase ProAS(#748). Dies lässt

die Schlussfolgerung zu, dass wahrscheinlich alle untersuchten halophilen Stämme

Subtilisin-ähnliche Peptidase besitzen. Sie wurden der oben angewandten

Bezeichnung folgend benannt.

Ausgehend von dem Alignment der proAS-Teilsequenzen (Abb. 17) lassen sich die

untersuchten 9 Peptidasegene in drei Gruppen unterteilen. Die Gruppen bestehen

jeweils aus sehr homologen oder identischen proAS-Sequenzen (99,3-100%

Identität), wobei Gruppe I die Stämme SJ2/3-1 (#073), SJ5Ü/8 (#098), SJ5Ü/12

(#140), SJ6S/14 (#148) und B3/14 (#430), Gruppe II den Stamm B3/1-2 (#418) und

Gruppe III die Stämme B8/26-2 (#504), B12/10-1 (#748) und B12/16 (#795)

einschließen. Zwischen diesen 3 proAS-Gruppen bestehen deutliche Unterschiede,

so weist die Gruppe I zu den Gruppen II und III ca. 14% bzw. 19% und Gruppe II zu

III 21% Divergenz auf.

73

Ergebnisse

Nukleotid-Austausch (x100)024681012141618

proAS(#098)proAS(#430)proAS(#140)proAS(#148)

78.9%67.5%

proAS(#073)38.0%

proAS(#418)

97.9%

proAS(#795)proAS(#748)

99.9%

proAS(#504)100.0%

69.9%

proA (V.alginolyticus)

Gruppe I

Gruppe II

Gruppe III

Abb. 17: Phylogenetischer Stammbaum der untersuchten Peptidasegene proAS der 9 untersuchten halophilen Stämme und des nächst verwandten Peptidasegens proA aus Vibrio alginolyticus, basierend auf DNA-Teilsequenzen (400 bp). Die Verwandtschaftsverhältnisse wurden mit CLUSTALW untersucht und der Stammbaum mit der Bootstrap-Methode (trials: 1000; seed: 111) auf seine Konsistenz und Robustheit überprüft (Felsenstein, 1988). Die Länge der Verzweigungen repräsentiert die Divergenz zwischen zwei Sequenzen, die Zahlen bezeichnen die Anzahl der Substitutionsereignisse. Die Prozentzahlen geben den Anteil der im Bootstrap-Verfahren bestätigten Verzweigungen wieder. Eine Gruppierung der nächst verwandten Sequenzen wurde in 3 Gruppen vorgenommen (Gruppe I, II und III). Ein Vergleich der ProAS-Sequenzabschnitte auf Aminosäureebene führt ebenfalls

zur oben genannten Gruppierung, jedoch mit erheblich geringeren Sequenz-

Unterschieden. Es besteht im Vergleich der Gruppe I zu den Gruppen II und III ca.

2% bzw. 5% Sequenzunterschied und beim Vergleich der Gruppe II zu III ca. 6%

Divergenz. Dies lässt auf eine enge Verwandtschaft der untersuchten ProAS-

Peptidasen schließen.

3.3.43.3.4 Identifizierung des Signalpeptids in ProAS(#748) Identifizierung des Signalpeptids in ProAS(#748)

Proteine, die über die bakterielle Cytoplasma-Membran transportiert werden müssen,

werden in den meisten Fällen als größere Prä-Proteine mit N-terminalem

Signalpeptid synthetisiert (Fekkes & Driessen, 1999; Müller et al., 2001).

Untersuchungen an der N-terminalen Seite von ProAS(#748), ProAS(#418) und

ProAS(#795) sollten Aufschluss über das Vorhandensein eines Signalpeptids

erbringen.

Die Analyse der Aminosäuresequenzen der drei Peptidasen und die der

nächstverwandten ProA aus Vibrio alginolyticus mit dem Programm SignalP 3.0

Server ergab eine wahrscheinliche Zugehörigkeit der ersten 23 N-terminalen AS zu

einem Signalpeptid (Abb. 18). Die zugewiesene Schnittstelle für ProA zwischen der

23. und 24. Aminosäure differierte allerdings um 2 AS von der von Deane et al.

(1989) theoretisch postulierten Stelle. Möglicherweise wurde ein anderes

Rechenmodell für die Analyse zu Grunde gelegt.

74

Ergebnisse

Bemerkenswert ist die Homologie der Signalpeptide der drei ProAS-Sequenzen mit

der Sequenz von ProA: 11 von 23 Aminosäuren sind identisch. Das Vorhandensein

von Signalpeptiden lässt die Schlussfolgerung zu, dass ein Signalpeptid-vermittelter

Transport der drei untersuchten ProAS Peptidasen im Wildtyp über die

Cytoplasmamembran erfolgt.

Abb. 18: Alignment der N-terminalen Sequenzen und vermutete Signalpeptide von Peptidasen dreier halophiler Stämme.

ProAS(#748): MLKHALSCCVASALMAASPTALS�EQHEGKQGVSQQQT...ProAS(#418): MLKHVLSCCIASALVTASPSVLA�KQEDGKQAIAQQQT...ProAS(#795): MLKHALSCCVASALMAASPTALS�EQHEGKQGVSQQQT...ProA(V. algin.): MLKKLLSCCITSALCFHSSLAFS�QPNEIADSAELQQA...

�

Zeichen und farbige Markierungen: �= Wahrscheinliche Spaltungsstelle des Signalpeptids nach Signal P 3.0 Server. �=Wahrscheinliche Spaltungsstelle des Signalpeptids von ProA nach Deane et al. (1989). Gelb hervorgehoben: Signalpeptid nach Signal P 3.0 Server. Rot: Identische Aminosäuren im Alignment. Orange: Homologe Aminosäuren im Alignment.

3.43.4 Heterologe Expression der Subtilisin-ähnlichen Peptidasen in E. coliHeterologe Expression der Subtilisin-ähnlichen Peptidasen in E. coli

Für die heterologe Expression der ProAS-Peptidasen wurden zwei verschiedene

Ansätze verfolgt.

1. (siehe 3.4.1) Eine Überexpression der Subtilisin-ähnlichen Peptidasen in E. coli

sollte durch den Einsatz von speziellen Expressionsvektoren die Herstellung von

größeren Enzymmengen erleichtern. Die Schwierigkeit bestand darin, dass keine

Daten für die Überexpression von Peptidasen aus moderat halophilen Bakterien in E.

coli vorlagen. Zudem wurde mehrfach von Problemen, vermutlich aufgrund der

Toxizität des Expressionsproduktes auf den Wirt, bei der Expression von Peptidasen

aus mesophilen Bakterien in E. coli berichtet (Arnorsdottir et al., 2002; Bott & Betzel,

1996; Sakamoto et al., 1996). Eine Modellstudie sollte daher zuvor die

Expressionssysteme mit einer bekannten Peptidase evaluieren.

2. (siehe 3.4.2) Die heterologe Expression der ProAS-Peptidase sollte ebenfalls

anhand der Fosmidklone F114 und F13 untersucht werden. Ohne Verwendung von

speziellen Expressionvektoren konnte bei diesen Klonen durch Erhöhung der

Fosmidkopiezahl pro Zelle eine Expression von aktiver Peptidase erlangt werden.

Eine Optimierung der Expressionsbedingungen sollte gewährleisten, dass genügend

rekombinantes Enzym für die folgende biochemische Untersuchung bereitstand.

75

Ergebnisse

3.4.13.4.1 Peptidase-Überexpression mit Expressionsvektoren Peptidase-Überexpression mit Expressionsvektoren

Es standen 3 verschiedene Expressionsvektoren zur Verfügung. Der Vektor

pJF118EH zeichnet sich durch einen starken tac-Promotor aus, der durch IPTG

induziert werden konnte. Er wurde bereits erfolgreich zur Expression von Enzymen

mit toxischer Wirkung (z.B. Endonukleasen, Disqué, pers. Mitteilung) eingesetzt.

Die Expressionsvektoren pBAD/gIII und pASKIBA44 wurden für die Sekretion der

rekombinanten Proteine ins Periplasma entwickelt. Die Sekretion wird über die

Fusion der rekombinanten Proteine mit E. coli-spezifischen Signalpeptiden erreicht.

Eine Abspaltung des Signalpeptides vom rekombinanten Protein erfolgt beim

Transport über die Cytoplasmamembran. Das Anhängen eines C-terminalen

Oligohistidinrestes sollte eine spätere Aufreinigung des rekombinanten Proteins

durch eine Nickel-Affinitätschromatografie erleichtern (Ni-NTA Spin Handbook,

QIAGEN, 2003). Zudem wird die heterologe Expression bei beiden

Expressionsvektoren über streng regulierte Promotoren gesteuert. So steht die

Transkription des klonierten Gens bei pASK-IBA44 unter Kontrolle des tet-Promotors.

Darüber hinaus befindet sich auf dem Plasmid ein Gen des tet-Repressors, der über

die entsprechende Promotor-/Operatorregion die Transkription des unter seiner

Kontrolle stehenden Gens reprimiert (Skerra, 1994). Die Induktion des tet-Promotors

erfolgt mit geringsten Mengen Anhydrotetracyclin, welche sich unterhalb der

antibiotischen Wirksamkeit befinden. Eine Induktion löst den Repressor von der

Promotor-/Operatorregion und erlaubt so die Expression des klonierten Gens.

Im Vektor pBAD wird die Expression über den araBAD-Promotor gesteuert. Dieser

Promotor wird positiv und negativ durch das plasmidkodierte Protein AraC reguliert.

In Abwesenheit von L-Arabinose reprimiert ein AraC-Dimer die

Transkriptionsinitiation im Promotor/Operator-Bereich. Nach der Bindung von L-

Arabinose an das AraC-Dimer wird diese Repression aufgehoben. Ein weiterer

Vorteil dieses Systems liegt in der dosisabhängigen Aktivierung des Promotors.

Somit ist es möglich, das Expressionsniveau durch die Menge an zugegebenem

Induktor zu regulieren.

3.4.1.13.4.1.1 Modellsystem: Expression von Subtilisin E in E. coliModellsystem: Expression von Subtilisin E in E. coli

Eine Evaluation und Optimierung der vorhandenen Expressionssysteme für die

extrazelluläre Expression in E. coli erfolgte mit einer bekannten Peptidase. Die Wahl

für diese Studien fiel auf eine mesophile Peptidase, da die heterologe Expression

76

Ergebnisse

einer Peptidase aus moderat halophilen Bakterien in E. coli bisher nicht publiziert

wurde. Als die bestuntersuchte Subtilisin-ähnliche Peptidase wurde Subtilisin E aus

Bacillus subtilis als Modellenzym ausgewählt. Ihre Expression in E. coli ist sehr gut

dokumentiert (z.B.: Bott & Betzel, 1996; Sroga & Dordick, 2002).

3.4.1.1.13.4.1.1.1 Konstruktion der Expressionsvektoren Konstruktion der Expressionsvektoren

Für die Konstruktion der Expressionsvektors wurde das Subtilisin E-Gen (aprE) über

PCR mit mutagenen Oligonukleotiden (Tab. 6) so modifiziert, dass die Amplifikate am

Startcodon und am Stoppcodon verschiedene Schnittstellen erhielten. Die Art und

der Ort der Schnittstellen wurden dabei dem verwendeten Vektor angepasst (siehe

Tab. 27). So wurde das aprE-Amplifikat über die EcoRI und SalI-Schnittstellen in den

Vektor pJF118EH hinter dessen tac-Promotor kloniert. Beim Vektor pASK-IBA44

erfolgte die Klonierung über die BsaI-Schnittstellen, die aufgrund ihrer

Erkennungssequenzen eine gerichtete Klonierung des Subtilisin E-Gens erlaubten.

Das Gen wurde hinter den kodierenden Sequenzen für das ompA-Signalpeptid und

einen Streptavidin-tag kloniert. Am 3’-Ende des Gens erfolgte über die Ligation mit

dem Vektor das Anfügen einer Sequenz für ein Oligohistidin. Im Vektor pBAD/gIII

wurde das aprE-Gen über eine NheI und EcoRI-Schnittstelle zwischen den

Vektorsequenzen für ein gIII-Signalpeptid und ein Oligohistidin eingebracht (vergl.

Tab. 27).

Tab. 27: Schematische Darstellung der Konstruktion der Expressionsvektoren für Subtilisin E.

Vektor Ursprung Schematische Vektor-Konstruktion pJF-SubE

pJF118EH

EcoRI SalI | | ...-lacIQ-Ptac-Prä-Pro-Subtilisin E-...

pASK-SubE

pASK-IBA44

BsaI BsaI | | ...-tetR-Ptet-ATG-ompA ss-Strep tag-Prä-Pro-Subtilisin E-6xHis-term-...

pBAD-SubE

pBAD/gIII-B

NheI EcoRI | | ...-araC-Pbad-ATG-gIII ss-Prä-Pro-Subtilisin E-6xHis-term-...

Grüne Kästen repräsentieren relevante Elemente der Expressionsvektoren. Rote Kästen repräsentieren die kodierende Region des Prä-Pro-Subtilisin E. Blaue Kästen repräsentieren die verwendeten Restriktionsenzyme und ihre Schnittstellen für die Klonierung. In dieser Studie wurde mit dem kompletten Peptidasegen gearbeitet, welches für ein

Prä-Pro-Subtilisin E kodierte. Die korrekte Insertion der Gene in den jeweiligen

Vektor wurde durch Sequenzierung der Klonierungsübergänge überprüft.

77

Ergebnisse

3.4.1.1.23.4.1.1.2 Expressionsanalyse Expressionsanalyse

Die Vektoren wurden für eine erste Überprüfung ihrer Expressionsleistung in E. coli

Top10 transformiert. Expressionsstudien am Plasmid pJF-subE konnten nicht

durchgeführt werden, da äußerst wenig Transformanten auftraten (1-2

cfu/Transformationsansatz) und eine hohe Plasmidinstabilität beobachtet wurde.

Klonanalysen zeigten durch Fehlen von charakteristischen Restriktionsschnittstellen

zusätzlich eine Veränderung des klonierten Inserts.

Mit den beiden Vektoren pASK-subE und pBAD-subE hingegen gelang die

heterologe Expression von aktivem Subtilisin E. Die beiden hierfür benutzten

Expressionsvektoren zeichnen sich durch eine besonders starke Regulation der

Promotoren aus (siehe 3.4.1).

Zur Analyse der Expressionsleistungen der zwei Vektoren erfolgte die heterologe

Expression unter verschiedenen Inkubationstemperaturen (23°, 30° und 37°C) und

Induktionsbedingungen. Eine Analyse der Zellfraktionen auf Peptidase-Aktivität, wie

unter 2.6.5 und 2.6.6 beschrieben, sollte Aufschluss über die Lokalisation des

Subtilisin E geben.

Die mit pASK-subE transformierten E. coli Top10-Zellen reagierten auf die Induktor-

Zugabe von 0,1 und 0,2 μg/ml Anhydrotetracyclin mit sofortigem Wachstumsstillstand

bei allen überprüften Inkubationstemperaturen (s.o.). Die ebenfalls mit

Anhydrotetracyclin induzierte Kontrolle (pASK-IBA44 in E. coli Top10) zeigte

dagegen keinerlei Wachstumshemmung. Die wachstumshemmende Wirkung auf

E. coli interpretierten Bott und Betzel (1996) mit der toxischen Wirkung des

exprimierten Subtilisin E. Geringe Mengen an aktivem Subtilisin E konnten nach

Induktion ausschließlich im Periplasma gefunden werden. Die höchste Peptidase-

Aktivität von 0,6 FlU/ml im Fluoreszenztest wurde nach Induktion mit 0,2 μg/ml

Anhydrotetracyclin und 4 h Inkubation bei 30°C erreicht.

Mit pBAD-subE transformierte E. coli Top10-Zellen reagierten bei Induktor-Zugabe

von � 1,3 mM L-Arabinose mit einer Verlangsamung des Wachstums. Nach 5 h

Inkubation wurde 1/3 bis ½ der Zelldichte (OD600 nm) von uninduzierten Kulturen

erreicht. Die Expression bei 37°C führte zu keiner Sekretion von aktivem Subtilisin E

(Tab. 28). Erst nach Temperatursenkung auf 30°C bzw. 23°C konnte Peptidase-

Aktivität nachgewiesen werden. Die höchste extrazelluläre Peptidase-Aktivität von

159,8 FlU/ml im Fluoreszenzassay wurde 5 h nach Induktion mit 12 mM L-Arabinose

bei 23°C erreicht (Tab. 28).

78

Ergebnisse

Tab. 28: Expression von Subtilisin E in E. coli Top10 mit pBAD-subE bei verschiedenen Temperaturen und Induktorkonzentrationen. Inkubation: 5 h bei 23°C und 200 rpm.

Inkubationstemperatur* Induktor (L-Arabinose) Konzentration [mM]

Extrazelluläre Peptidase-Aktivität

[FlU/ml]37°C 0-33 < 0,00001 30°C 0 < 0,00001 30°C 1,3 9,3 30°C 12,0 17,4 23°C 1,3 91,2 23°C 12,0 159,8 23°C 16,0 29,2

*nach Induktion Aufgrund des unterschiedlichen genetischen Hintergrundes der E. coli-Stämme kann

sich die Expressionsleistung der einzelnen Stämme je nach Genprodukt und

Expressionssystem deutlich unterscheiden (Sørensen & Mortensen, 2005). Eine

Evaluation von verschiedenen E. coli-Stämmen sollte zeigen, welcher Stamm sich

am besten für die heterologe Expression von extrazellulär lokalisiertem Subtilisin E

mit pBAD-subE eignete. Dabei zeigte der Stamm BL21(DE3) mit 255,8 FlU/ml 5 h

nach Induktion mit 12 mM L-Arabinose die höchste Peptidase-Aktivität in der

zellfreien Kultur (Abb. 20). Peptidase-Aktivität, wenn auch wesentlich geringer,

konnte ebenfalls sowohl im Periplasma als auch im Cytoplasma nach Induktion bei

den verschiedenen Stämmen in unterschiedlicher Stärke nachgewiesen werden.

Eine Analyse der periplasmatischen und extrazellulären Proteine im SDS-PAGE

(Abb. 19) zeigte eine stark überexprimierte Proteinbande im Bereich von ~37 kDa der

induzierten Kultur. Aufgrund der Größe handelt es sich hier wahrscheinlich um Pro-

Subtilisin E. Ohne Induktion konnte diese Bande im Gel nicht gefunden werden. Die

Evaluation zeigt, dass eine größere Expression an aktivem Subtilisin E nur durch den

Expressionsvektor pBAD-subE erfolgte. Eine Kombination von Expressionsstamm

E. coli BL21(DE3), geringer Induktorkonzentration und Inkubation bei

Raumtemperatur führte zur optimierten Produktion von aktiver Subtilisin E Peptidase.

79

Ergebnisse

E- E+ M P- P+

~100 kDa

~70

~55

~40

~35

~25

Abb. 19: SDS-PAGE (12% PA, silbergefärbt) der Expression von pBAD-SubE in BL21(DE3). E= zellfreie Kultur; P= Periplasmatische Zellfraktion; M= PageRuler Prestained Protein ladder; += Kultur induziert; -= Kultur uninduziert. Der Pfeil markiert die überexprimierte Proteinbande. Proben wurden vor dem Auftrag hitzedenaturiert.

0 50 100 150 200 250 300 350

FlU/ml

extrazellulärperiplasmatischcytoplasmatisch

Top10 1,2 mM O17

C600 BL21(DE3)

Top10 - (Kontrolle) O17

C600 BL21(DE3)

Top10 12 mM O17

C600 BL21(DE3)

Induktion Stamm (L-Arabinose) (E. coli)

Peptidase-Aktivität [FlU/ml]

Abb. 20: Vergleich der Peptidaseaktivität (Fluoreszenzassay) der Zellfraktionen von pBAD-subE transformiert in verschiedenen E. coli-Stämmen. Die Kulturen wurden nach Induktion mit drei verschiedenen L-Arabinose-Konzentrationen bei 23°C für 5 h inkubiert.

80

Ergebnisse

3.4.1.23.4.1.2 Heterologe Expression von ProAS(#748) Heterologe Expression von ProAS(#748)

Bei der heterologen Expression der untersuchten ProAS-Peptidasen mit den 3

vorhandenen Expressionssystemen sollten die Erkenntnisse der Modelluntersuchung

Anwendung finden (3.4.1.1). Die Konstruktion der Expressionsvektoren beschränkte

sich auf ProAS(#748). Bei dieser Peptidase handelte es sich um die bestuntersuchte

der drei vollständig sequenzierten ProAS-Peptidasen, bei der auch Kontrollelemente

außerhalb des Gens sequenziert worden waren (Abb. 37 im Anhang). Die

Konstruktion der Expressionsvektoren für ProAS(#748) erfolgte mit der gleichen

Strategie wie für die Subtilisin E-Expressionsvektoren in 3.4.1.1 beschrieben wurde.

Neben der Klonierung der vollständigen Sequenz des proAS(#748) wurde auch das

Gen ohne den kodierenden Bereich für das Wildtyp-Signalpeptid (3.3.4) kloniert.

Diese Variante wurde konstruiert, um zu vermeiden, dass eine fehlende Erkennung

und anschließende Prozessierung des fremden Signalpeptids in E. coli stattfindet

und es so zur Akkumulation von inaktivem rekombinantem Enzym (Baneyx, 1999)

kommen könnte. Ein Austausch des fremden gegen ein E. coli-spezifisches

Signalpeptid konnte in einigen Fällen zur Expression von aktivem rekombinanten

Enzym führen (Baneyx, 1999; Sørensen & Mortensen, 2005). Der Aufbau der

insgesamt 5 konstruierten Vektoren ist schematisch in Tab. 29 wiedergegeben.

Tab. 29: Schematische Darstellung der Konstruktion der Expressionsvektoren für ProAS(#748).

Vektor Schematische Vektor-Konstruktion

pJF-proAS(#748)

EcoRI SalI | | ...-lacIQ-Ptac-Prä-ProAS(#748)-...

pASK-proAS (#748)

BsaI BsaI | | ...-tetR-Ptet-ATG-ompA ss-Strep tag-Prä-ProAS(#748)-6xHis-term-...

pASK-proAS-ol (#748) BsaI BsaI | | ...-tetR-Ptet-ATG-ompA ss-Strep tag-ProAS(#748)-6xHis-term-...

pBAD-proAS (#748)

NcoI HindIII | | ...-araC-Pbad-ATG-gIII ss-Prä-ProAS(#748)-6xHis-term-...

pBAD-proAS-ol (#748) NcoI HindIII | | ...-araC-Pbad-ATG-gIII ss-ProAS(#748)-6xHis-term-...

Grüne Kästen repräsentieren relevante Elemente der Expressionsvektoren. Prä-ProAS(#748) repräsentiert die kodierende Region der ProAS(#748)-Peptidase inklusive hypothetisches Signalpeptid. ProAS(#748) repräsentiert die kodierende Region ProAS(#748)-Peptidase ohne hypothetisches Signalpeptid. Blaue Kästen repräsentieren die verwendeten Restriktionsenzyme und ihre Schnittstellen für die Klonierung. In Anlehnung an den Modellversuch in Abschnitt 3.4.1.1 wurde die Expression der

rekombinanten ProAS(#748)-Peptidase durch die in E. coli Top10 transformierten

81

Ergebnisse

Vektoren (Tab. 29) untersucht. Die Parameter Inkubationstemperatur,

Induktorkonzentration und Expressionsstamm wurden wie zuvor variiert. Die

Messung der Peptidase-Aktivität erfolgte mittels Fluoreszenzassay in der

cytoplasmatischen und periplasmatischen Zellfraktion sowie in der zellfreien Kultur.

Es konnte bei der Expressionsanalyse kein aktives ProAS(#748) nachgewiesen

werden. Auch die Anwendung der im Modellversuch optimierten

Expressionsparameter für pBAD-subE erbrachten mit den Vektoren pBAD-

proAS(#748) und pBAD-proAS-ol(#748) in E. coli BL21(DE3) keine messbare

Peptidase-Aktivität.

Der Einsatz weiterer E. coli-Stämme für die Expression, Änderung der

Medienzusammensetzung, Induktion von Chaperonen durch EtOH-Zugabe und

Rückfaltung der möglicherweise inkorrekt gefalteten Proteine ergab ebenfalls kein

aktives Enzym. Eine Zusammenfassung der wichtigsten Expressions-Parameter,

Beobachtungen und angewendeten Methoden gibt Tab. 30 wieder.

Tab. 30: Expressionsversuche mit ProAS(#748) in E. coli. Stichwortartige Zusammenfassung der Versuche und ihrer Ergebnisse. Die Messung der Peptidase-Aktivität erfolgte jeweils in den cytoplasmatischen und periplasmatischen Zellfraktionen und in der zellfreien Kultur.

Vektor Expressions- bedingungen Beobachtung Maßnahme Peptidase-

Aktivität pJF-proAS(#748)

- �Instabilität der Klone nach Transformation

- -

pASK-proAS(#748); pASK-proAS-ol(#748)

�Temp: 23°, 30°, 37°C �Induktorkonzentration: 0; 0,05; 0,1; 0,2 μg/ml Anhydrotetracyclin

�Wachstumsstillstand nach Induktion, keine Peptidase-Aktivität �Bildung von Inclusion Bodies bei Induktion mit 0,2μg/ml Anhydrotetracyclin

�Isolierung der Inclusion Bodies und Rückfaltung des denaturierten Proteins nach Parry (2002).

- -

pBAD-proAS(#748); pBAD-proAS-ol(#748)

�Temp: 23°, 30°, 37°C �Induktorkonzentration: 0; 1,3; 12; 16; 33 mM L-Arabinose

�Wachstumsstillstand nach Induktion, keine Peptidase-Aktivität

�Rückfaltung von Gesamt-Proteinextrakten nach Parry (2002) �Expressionsanalyse in E. coli-Stämmen: BL21(DE3); C600; DH5�, Epi300; HB101; LMG194; O17; SF8; Top10 und XL1 �Chaperon-Induktion durch 6% EtOH Zusatz ins Medium nach Thomas et al. (1997) �Variation der Medien: LB, M9-Medium, RM und Pepton-Wasser. 5 mM Calcium-Zugabe.

- - - -

Um Hinweise auf das Fehlen einer aktiven Peptidase bei den Expressionsansätzen

zu finden, wurde die Expression mit den Vektoren pBAD-proAS(#748) und pBAD

proAS-ol(#748) in E. coli BL21(DE3) näher untersucht. Die Induktions- und

Inkubationsparameter entsprachen dabei der optimierten Expression von Subtilisin E

durch pBAD-subE (Induktion mit 12 mM L-Arabinose, 23°C).

82

Ergebnisse

3.4.1.2.13.4.1.2.1 Analyse der Expression von ProAS(#748) durch pBAD Analyse der Expression von ProAS(#748) durch pBAD

Eine vollständige Sequenzierung der Klonierungsübergänge und des Inserts von

pBAD-proAS(#748) und pBAD-proAS-ol(#748) erwiesen den korrekten Sitz des

Inserts in Frame zu den Kontrollelementen des Expressionsvektors. Ebenso stimmte

die Sequenz von proAS(#748) mit der Insert-Sequenz des Vektors überein, so dass

eine Mutation im Gen ausgeschlossen werden konnte.

Zur Aufklärung des Fehlens von aktiver Peptidase bei den Expressionsansätzen

wurde die mRNA-Bildung im Northern-Blot überprüft. Eine fehlende Transkription

oder Instabilität der mRNA der Expressionsklone könnte ein Ausbleiben der

entsprechenden Proteine begründen. Der Nachweis der Transkription des proAS-

Gens in mRNA erfolgte mit der Sonde sub748, einem markierten 500 bp Fragment

des Peptidasegens proAS(#748) (siehe 2.7.7). Die Bildung von proAS(#748)-

spezifischer mRNA konnte nach Induktion der Expressionsklone (pBAD-proAS(#748)

und pBAD-proAS-ol(#748)) nachgewiesen werden (Abb. 21). Dabei wies die mRNA

70 min nach Induktion starke Degradationserscheinungen auf, die 30 min nach

Induktion noch nicht so deutlich hervortraten.

Kein Nachweis erfolgte dagegen in uninduzierten Kulturen der genannten Stämme,

ebenso wie in den Kontrollen (pBAD-Calmodulin und pBAD-subE). Vermutlich

aufgrund stringenter Hybridisierungs-Bedingungen und der Sequenzunterschiede

von der mRNA des Subtilisin E zur eingesetzten Sonde konnte bei pBAD-subE kein

Hybridisierungssignal nachgewiesen werden.

A Bbp 4000 -

3000 - 2000 -

1500 -

1000 - 500 -

200 -

M 1- 1+ 2- 2+ 3- 3+ 4- 4+ 5- 5+ 1- 1+ 2- 2+ 3- 3+ 4- 4+ 5- 5+

Abb. 21: RNA-Präparation und Northern-Blot-Analyse für die proAS(#748)-Expression in E. coliBL21(DE3). A. Denaturierende Gelelektrophorese der RNA-Präparation. B. Northern-Blot mit Sonde sub795. Erntezeitpunkt für die Zellen war 70 min nach Induktion (1-4.), bzw. 30 min (5.). Proben: - = uninduzierte Kulturen; + = induzierte Kulturen (12 mM L-Arabinose); 1. Kontrolle (pBad-Calmodulin); 2. Kontrolle (pBad-subE); 3. pBad-proAS-ol(#748); 4. & 5. pBad- proAS(#748). Die Analyse der extrazellulär und in das Periplasma sekretierten Proteine über SDS-

PAGE zeigte deutliche Unterschiede im Proteinmuster der induzierten zur

uninduzierten Kultur. Auffällig war eine deutliche Proteinbande bei ca. 60 kDa in den

83

Ergebnisse

induzierten Proben. Die ungefähre Größe des Proteins entsprach dem 60,1 kDa

großen unprozessierten rekombinanten Expressionsprodukt des Vektors pBAD-

proAS(#748).

E- E+ P- P+ M

~100

kDa

~130

~70

~55

~40

~35

Abb. 22: SDS-PAGE (12% PA, Coomassie gefärbt) der Expression von pBAD-proAS(#748) in BL21(DE3). Die Proben wurden vor dem Auftragen hitzedenaturiert. E= zellfreie Kultur; P= Periplasmatische Zellfraktion; M= PageRuler Prestained Protein ladder; += Kultur induziert; -= Kultur uninduziert. Der � markiert die überexprimierte Proteinbande. Über eine Affinitätschromatografie (Ni-NTA Spin Kit, QIAGEN) mittels des am

rekombinanten Protein fusionierten Oligohistidins sollte eine Aufreinigung der

rekombinanten Peptidase erfolgen. Es konnte jedoch kein Protein von der Säule

eluiert werden. Möglicherweise verhinderte eine inkorrekte Faltung des Proteins oder

die gewählten Pufferbedingungen eine Bindung der His-tags.

Abschließend lässt sich sagen, dass es klare Hinweise auf eine induzierbare

Transkription des rekombinanten Gens und vage Hinweise auf die Expression von

rekombinantem Protein gibt. Es konnte nicht geklärt werden, warum keine aktive

Peptidase exprimiert wurde.

3.4.23.4.2 Heterologe Expression einer aktiven Peptidase durch den Fosmidklon Heterologe Expression einer aktiven Peptidase durch den FosmidklonF114 F114

Um das Problem der fehlenden Expression aktiver Peptidasen bei den Versuchen mit

Plasmidvektoren zu untersuchen, wurde die heterologe Expression mit den

Fosmidklonen F13 und F114 analysiert. Die Klone hatten unter bestimmten

Induktions- und Inkubations-Bedingungen (Induktion mit 0,5 mM L-Arabinose;

Inkubation bei RT: ~23°C für >4 d) Aktivität im Plattenassay gezeigt (3.3.2). Dabei ist

84

Ergebnisse

zu bedenken, dass es sich bei den Fosmiden nicht um Expressionsvektoren handelt.

Die Fosmide besitzen keine Promotoren und andere Kontrollelemente für eine

Überexpression der Gene auf dem Insert. Die Induktion mit L-Arabinose erhöht die

Kopiezahl des bis zu 40 kb großen Fosmids auf bis zu 50, wobei die Kopiezahl von

der Menge des Induktors abhängt.

Eine Überprüfung, ob die Peptidase-Aktivität von Peptidasegenen resultierte, die auf

dem Fosmid kodieren, erfolgte durch Retransformation. Die isolierten Fosmide

wurden durch Elektroporation in E. coli Epi300 transformiert. Da die

Retransformanten unter den speziellen Induktionsbedingungen (s.o.) eine Peptidase-

Aktivität aufwiesen, kann davon ausgegangen werden, dass die Peptidase-Aktivität

von Genprodukten der Fosmidsequenz der Klone F13 und F114 resultierte. Die

weiteren Untersuchungen wurden am Fosmidklon F114 durchgeführt, da sich der

Klon F13 als instabil erwies.

Die optimale Induktionsmenge und Inkubationstemperatur wurde anhand der täglich

ermittelten Peptidase-Aktivitäten in 20 ml Kulturen bestimmt. Die Expression von

aktiver extrazellulärer Peptidase in Klon F114 zeigte eine Abhängigkeit zur

Inkubationstemperatur und Induktorkonzentration (Tab. 31). Eine Hemmung des

Wachstums konnte schon durch die kleinste zugesetzte Induktormenge ab einer

L-Arabinose-Konzentration von 0,05 mM beobachtet werden. Die höchste

extrazelluläre Peptidase-Aktivität (43,7 FlU/ml) konnte nach Induktion mit 0,5 mM

L-Arabinose und anschließender Inkubation für 5 Tage bei 23°C beobachtet werden.

Bei höheren Temperaturen oder Induktorkonzentrationen konnte keine Peptidase-

Aktivität mehr nachgewiesen werden. Aktive Peptidase konnte nicht im Cytoplasma

und Periplasma des induzierten Klons F114 im Fluoreszenzassay nachgewiesen

werden. Wie es schien, wurde das Enzym in der aktiven Form sekretiert.

Tab. 31: Peptidase-Aktivität (Fluoreszenzassay) in der zellfreien Kultur des Fosmidklons F114 nach 5 d Inkubation bei 23° und 37°C und verschiedenen Induktorkonzentrationen.

Induktion Extrazelluläre Peptidase-Aktivität [FlU/ml] L-Arabinose [mM] 37°C* RT (~23°C)*

0 - -0,05 - 32,3

0,1 - 39,80,5 - 43,7

2 - -5 - -

*Inkubationstemperatur nach Induktion; -= Peptidase-Aktivität unter der Nachweisgrenze (0,00001 FlU/ml)

85

Ergebnisse

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Inkubationszeit [h]

OD

600n

m

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Pept

idas

eakt

ivitä

t [Fl

U/m

l]

Wachstum Kontrolle (0mM ara) Wachstum (0,5 mM ara)Peptidaseaktvität Kontrolle Peptidaseaktvität (0,5 mM ara)

Abb. 23: Bildung extrazellulärer Peptidase1) während des Wachstums des Fosmidklons F114. Vergleich einer uninduzierten (Kontrolle) mit einer induzierten2) Kultur (LB-Medium; bei 23°C, 200 rpm).1)Messung der Peptidase-Aktivität im Fluoreszenzassay in FlU/ml2)Induktion der Kultur bei OD= 0,5 mit 0,5 mM L-Arabinose (ara)

Die Produktion von aktiver Peptidase des Fosmidklons F114 in Abhängigkeit zur

Inkubationszeit wurde anhand einer 300 ml Kultur ermittelt. Die Induktionsperiode

dauerte lang: Klon F114 zeigte erst 110 h nach Induktion mit 0,5 mM L-Arabinose

geringe Peptidase-Aktivität in der zellfreien Kultur (Abb. 23), die dann stetig zunahm

mit einer maximalen Aktivität nach 180 h (81,9 FlU/ml).

Zusammenfassend ist zu sagen, dass mit dem Fosmidklon F114 eine heterologe

Expression einer aktiven Peptidase in E. coli zu beobachten war. Geringe Mengen

an aktivem Enzym konnten nur nach Erhöhung der Fosmidkopiezahl und Inkubation

bei RT nach über 4 Tagen detektiert werden. Im Folgenden wird das rekombinante

Enzym aus Stamm B3/1-2 (#418) Peptidase F114 genannt.

3.4.33.4.3 Übereinstimmung der Peptidase F114 mit Peptidase B aus B3/1-2 (#418) Übereinstimmung der Peptidase F114 mit Peptidase B aus B3/1-2 (#418)

Als Nachweis für den Ursprung der rekombinanten Peptidase F114 aus dem Wildtyp-

Stamm B3/1-2 (#418) sollte ein Vergleich der biochemischen Merkmale und des

Molekulargewichtes des rekombinanten Enzyms mit denen des Wildtyp-Enzyms

durchgeführt werden. Von den beiden Peptidasen A und B aus dem Wildtyp B3/1-2

(#418) wurde vermutet, dass Peptidase B identisch mit F114 ist. Gefolgert wurde

dies aufgrund des übereinstimmenden Molekulargewichtes von etwa 55 kDa der

Peptidase B und der abgeleiteten Aminosäuresequenz von proAS(#418). Des

86

Ergebnisse

Weiteren stimmte die Zuordnung der Peptidase B zu den Serinpeptidasen mit der der

BLAST-Analyse von ProAS(#418) überein. Bei Peptidase A handelt es sich hingegen

um eine ~35 kDa große vermutliche Metallopeptidase.

3.4.3.13.4.3.1 Reinigung der rekombinanten Peptidase F114 Reinigung der rekombinanten Peptidase F114

Für die biochemische Charakterisierung erfolgte zuvor eine Anreicherung und

Reinigung der rekombinanten Peptidase F114 (siehe Tab. 32). Als Methoden zur

Aufreinigung standen die hydrophobe Interaktionschromatografie und die

anschließende Gelfiltration zur Verfügung (siehe 2.6.7.2 und 2.6.7.3). Die zellfreie

Kultur wurde im ersten Schritt über eine Phenylsepharosesäule gereinigt. Ähnlich zu

der Peptidase B des Wildtyps (siehe 3.1.5.1) eluierte die Aktivität von Peptidase

F114 nach Ende des Ammoniumsulfatgradienten (Abb. 24). Ein 30 ml Fraktionspool

aus 15 Fraktionen mit insgesamt 7500 FlU wurde gebildet. 200μl eines 10-fach

Konzentrates (mittels Dialyse gegen PEG3500, siehe 2.6.3) des Fraktionspools

wurden über eine Gelfiltrationschromatografie (Hiload Superdex200, V0=8 ml)

aufgereinigt. Es konnte Peptidase-Aktivität in 5 Fraktionen á 1 ml nachgewiesen

werden. Die Fraktion mit der höchsten Aktivität (206 FlU/ml) wurde als Probe für die

weiteren Versuche eingesetzt.

0

50

100

150

200

250

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280Retentionsvolumen [ml]

E280

nm [m

AU

]

0%

20%

40%

60%

80%

100%A

mm

oniu

msu

lfatg

radi

ent

Rel

. Pep

tidas

eakt

ivitä

t

Extinktionsmessung bei 280 nmrelative PeptidaseaktivitätAmmoniumsulfatgradient (100% = 1 M Ammoniumsulfat)

Abb. 24: Phenylsepharose-Chromatografie von zellfreier Kultur des Fosmidklons F114. Die relative Peptidase-Aktivität entspricht der prozentualen Aktivität in einer Fraktion im Vergleich zur maximalen Peptidase-Aktivität im Peak.

87

Ergebnisse

Tab. 32: Anreicherung von Peptidase F114 aus der zellfreien Kultur F1141).Anreicherungs-

methode Probe Volumen[ml]

Gesamt-protein

[mg]

Gesamt-aktivität [kFlU]


[kFlU/mg]

Ausbeute [%] an

Aktivität

Enzym-Anreicherungs-

faktor keine zellfreie

Kultur 230 9,27 14,4 1,55 100 1

hydrophobe Interaktions-chromatografie

Fraktions-pool B 30 4,1 7,5 1,82 52,1 1,2

Gelfiltration2)

Fraktion höchster Peptidase-Aktivität

1 0,025 0,206 8,24 1,42) 5,3

1)Inkubationsbedingungen: 160 h; 200 rpm; 23°C nach Induktion 0,5 mM L-Arabinose. 2)Eingesetzte Probenmenge: 0,2 ml eines 10x Konzentrates des Fraktionspools B.

3.4.3.23.4.3.2 Biochemische Eigenschaften der Peptidase F114 im Vergleich zur Biochemische Eigenschaften der Peptidase F114 im Vergleich zurWildtyp-Peptidase B Wildtyp-Peptidase B

Die biochemischen Eigenschaften der Peptidase F114 wurden ermittelt. Hierzu

wurden im Vergleich die Eigenschaften der Peptidase B aus dem Wildtyp B3/1-2

(#418) dargestellt. Als Proben wurden die über Gelfiltration gereinigten Enzyme

(3.4.3.1) mit jeweils 0,5-1 FlU je Ansatz eingesetzt.

Bei den Untersuchungen über den Einfluss der Temperatur auf die Peptidase-

Aktivität wiesen sowohl die rekombinante Peptidase F114 als auch das

Wildtypenzym ein Aktivitätsoptimum bei 50-55°C auf (Abb. 25). Auch im weiteren

Aktivitätsverlauf zeigten die beiden Enzyme eine große Ähnlichkeit. So war eine

Inhibition mit ca. 50% Restaktivität bei 60°C festzustellen, bei 80°C lag die

Enzymaktivität unter 10%.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95Temp [°C]

rela

tive

Pept

idas

e-A

ktiv

ität

Peptidase aus F114

Peptidase B - B3/1-2 (#418)

Abb. 25: Einfluss der Temperatur auf die relative Peptidase-Aktivität* der rekombinanten Peptidase aus Klon F114 und Peptidase B aus Stamm B3/1-2 (#418). *Die relative Peptidase-Aktivität entspricht der prozentualen Aktivität des Optimums.

88

Ergebnisse

Untersuchungen zur Abhängigkeit der Enzymaktivität vom pH-Wert ergaben sowohl

beim rekombinant hergestellten als auch beim Wildtypenzym ein Aktivitätsoptimum

mit über 90% Restaktivität zwischen pH 8 und 9,5 in Tris-HCl-Puffer (Abb. 26). Über

10% Aktivität war im Bereich von pH 6-12 messbar.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14pH

rela

tive

Pept

idas

e-A

ktiv

ität

Peptidase aus F114

Peptidase B - B3/1-2 (#418)

Abb. 26: Einfluss des pH-Wertes auf die relative Peptidase-Aktivität* der rekombinanten Peptidase aus Klon F114 und Peptidase B aus Stamm B3/1-2 (#418). *Die relative Peptidase-Aktivität entspricht der prozentualen Aktivität des Optimums.

Bei Untersuchungen zur NaCl-Abhängigkeit der Peptidase-Aktivität zeigten die

beiden untersuchten Enzyme ein Optimum bei 1-3 mM NaCl (Abb. 27). Mit

steigender Salzkonzentration wurde die Peptidase-Aktivität beider Enzyme

zunehmend gehemmt.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 100 200 300 400 500 600NaCl (mM)

rela

tive

Pept

idas

e-Ak

tivitä

t

Peptidase B - B3/1-2 (#418)Peptidase aus F114

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

b.

a. Abb. 27: Einfluss der NaCl-Konzentration auf die relative Peptidase-Aktivität* der rekombinanten Peptidase aus Klon F114 und Peptidase B aus Stamm B3/1-2 (#418). a. Gesamtansicht; b. Teilausschnitt im Bereich 0-30 mM NaCl.*Die relative Peptidase-Aktivität entspricht der prozentualen Aktivität des Optimums.

89

Ergebnisse

Eine Steigerung der Aktivität der beiden untersuchten Peptidasen durch Zusatz von

monovalenten und divalenten Kationen konnte nur in geringem Maße (103-120%)

durch Zusatz von 2 mM KCl hervorgerufen werden (Tab. 33). Die Zugabe

verschiedener Metallionen führte zu einer Verringerung der relativen Aktivitäten. Bei

Zusatz von 2 mM MgCl2, CaCl2 oder BaCl2 zeigten die Peptidasen 28-74% relative

Aktivität. Stärkerer Aktivitätsverlust mit 14 bzw. 17% Restaktivität wurde durch 2 mM

CuSO4 erreicht, wobei nach Zugabe von 2 mM MnCl2 oder ZnSO4 keine Aktivität im

Fluoreszenz-Assay nachweisbar war. Mehrfache Wiederholungen bestätigten diese

Ergebnisse.

Der Zusatz von 0,1% SDS resultierte in einer Aktivitätssteigerung mit 188% bzw.

139% relativer Aktivität. Eine Steigerung der SDS-Konzentration auf 1% ließ die

Aktivität auf ca. 20% sinken.

Tab. 33: Abhängigkeit der relativen Peptidase-Aktivität von Peptidase F114 und Wildtyp Peptidase B auf verschiedene Metallionen, SDS und Inhibitoren.

Zusatz Konzentration Relative Aktivität

Peptidase F114

Relative Aktivität Peptidase B –B3/1-2 (#418)

- - 100 % 100 %KCl 2 mM 120% 103%MnCl2 2 mM 0% 0%MgCl2 2 mM 46% 74%CaCl2 2 mM 28% 50%BaCl2 2 mM 59% 77%CuSO4 2 mM 14% 17%ZnSO4 2 mM 0% 0%SDS 0,1 % 188% 139%SDS 1% 21% 22%EDTA 2 mM 0% 27%PMSF 10mM 0% 0%Phenanthrolin 10mM 73% 76% Die beiden untersuchten Peptidasen zeigten in Gegenwart von Peptidase-Inhibitoren

(Tab. 33) eine hohe Toleranz gegenüber Phenanthrolin (73-76% relative Aktivität),

während PMSF und EDTA ihre Aktivität stark bis vollständig hemmte (0% bzw. 27%

relative Aktivität).

Peptidase F114 zeigte eine hohe Empfindlichkeit gegen die chaotropen Salze

GuSCN und GuHCl (siehe Tab. 34). Waren bei 0,1 M GuHCl noch 12% Restaktivität

vorhanden, konnte bei >0,5 M GuHCl und bei allen getesteten GuSCN-

Konzentrationen (0,1; 0,2; 0,6; 0,8 M) keine Aktivität nachgewiesen werden. Das

Wildtypenzym zeigte im Vergleich dazu mit Restaktivitäten von 52% bei 1 M GuHCl

90

Ergebnisse

und 33% bei 0,6 M GuSCN Toleranz gegenüber diesen Substanzen. Allerdings

konnte bei Versuchen mit Konzentrationen � 0,8 M GuSCN und � 2 M GuHCl keine

Enzymaktivität nachgewiesen werden.

Tab. 34: Einfluss von chaotropen Salzen auf die Peptidase-Aktivität der Peptidase F114 und Wildtyp Peptidase B. Die Peptidase-Aktivität einer Probe ohne den Zusatz von chaotropen Salzen wurde gleich 100% gesetzt.

Zusatz Relative Aktivität

Peptidase F114

Relative Aktivität Peptidase B –B3/1-2 (#418)

0,1 M GuHCl 12 % 101 %0,5 M GuHCl 4 % 75 %1 M GuHCl 0 % 52 %2 M GuHCl 0 % 0 %0,2 M GuSCN 0 % 76 %0,6 M GuSCN 0 % 33 %0,8 M GuSCN 0 % 0 %

3.4.3.33.4.3.3 Bestimmung des Molekulargewichtes von Peptidase F114 Bestimmung des Molekulargewichtes von Peptidase F114

Eine Bestimmung des Molekulargewichtes der rekombinanten Peptidase F114 und

der Peptidase B aus dem Wildtyp erfolgte sowohl über PAGE-Analysen als auch

über eine Gelfiltration.

Eine Auftrennung der Peptidase F114 und Peptidase B in einer SDS-PAGE zeigte

einen übereinstimmenden Aktivitätsbereich der nicht hitzebehandelten Proben

(Phenylsepharosefraktionspool) in der Größe von etwa 55 kDa (Abb. 28). Eine

Zuordnung der Aktivitätsbande zu den zahlreichen Proteinbanden im silbergefärbten

Gel konnte leider nicht erfolgen.

Eine Auftrennung der Aufreinigungen der rekombinanten Peptidase F114 und der

Wildtyp Peptidase B aus B3/1-2 (#418) mittels nativer PAGE (Abb. 29) zeigte eine

Vielzahl von Proteinbanden in dem Phenylsepharosefraktionspool des Klons F114,

wobei der Fraktionspool B des Wildtyps nur wenige Banden aufwies. Jeweils eine

sehr schwache Bande in der Gelfiltrationsfraktion verwies auf den hohen

Reinigungsgrad des Enzyms. Der Aktivitätsnachweis zeigte Peptidase-Aktivität bei

allen Proben in der Ebene der schwachen Bande aus der Gelfiltration. Eine

Bestimmung des Molekulargewichtes konnte nicht erfolgen, da der Proteinstandard

trotz Eiskühlung des Gels durch proteolytische Aktivität zerstört wurde.

91

Ergebnisse

M 1 2 3 4

Abb. 28: SDS-PAGE (10% PA), Konzentrate der B-Fraktionspools aus der Phenylsepharose-Chromatografie a.) silbergefärbt; b.) Aktivitätsnachweis mit Skimmilk-Kontakt-Zymogramm. 1. + 2.: F114; 3 +4.: B3/1-2 (#418). Proben 1+3 wurden vor dem Auftragen hitzedenaturiert (85°C, 5 min). Die proteolytischen Aktivitätsbereiche aus dem Zymogramm (B.) wurden als graue Umrisse in A. eingezeichnet.

Ebenfalls Aktivitätszonen auf gleicher Höhe ergab das Kontakt-Zymogramm einer

Isoelektrischen Fokussierung (IEF-Gel, pH 3-10 in X-Cell SureLock Kammer,

Invitrogen) der rekombinanten und der Wildtyp-Peptidase (Daten nicht gezeigt).

Eine Abschätzung des Molekulargewichts von Peptidase F114 durch PAGE-Analyse

erbrachte einen Wert von ~55 kDa. Weitere Hinweise über das Molekulargewicht der

~100

~70

~55

~40

~35

~130

1 2 3 4 M

a. b.

Abb. 29: Native PAGE, (10% Tris-Glycin) der Aufreinigungsstufen der Peptidase aus F114 (1. Phenylsepharosekonzentrat; 2. Gelfiltration) und Peptidase B von Stamm B3/1-2 (#418) (3. Phenylsepharosekonzentrat; 4. Gelfiltration). a.) Silberfärbung; b.) Aktivfärbung im Kontakt-Zymogramm. Schwarze Kästen zeigen die Lage der Ausgangspunkte der sich entwickelten Peptidase-Aktivität (helle Bereiche); Pfeile verdeutlichen die Lage der Peptidase-Bande im Gel.

1 2 3 4 1 2 3 4

a. b.

92

Ergebnisse

Peptidase erfolgten über eine Gelchromatografie mit einer Hiload Superdex200-

Säule. Die Elutionsfraktionen wurden mittels Fluoreszenzassay auf ihre Peptidase-

Aktivität geprüft. Eine Kalibrationskurve (Abb. 30) mit fünf Proteinstandards sollte die

Ermittlung des Molekulargewichtes der Peptidase ermöglichen.

y = 979,45e-5,9916x

R2 = 0,99151

10

100

1000

0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7Kav

log

Mol

ekul

arge

wic

ht [k

Da]

Catalase (232 kDa) Aldolase (158 kDa)

Albumin (67 kDa)

Chymotripsinogen (25 kDa)

RNase A (13,7 kDa)

Abb. 30: Kalibrationskurve für Hiload Superdex200-Säule (1,6x60cm). Formel der Kalibrationskurve: MW = 979,45e-5,9916Kav (R2 = 0,9915). Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo); Ve= Elutionsvolumen des jeweiligen Proteins; Vo= Totvolumen der Säule = Elutionsvolumen von Blue-Dextran (MW 2.000 kDa), Vt= Geometrisches Volumen der Säule. Ein 10-fach Konzentrat (200μl; mittels Dialyse gegen PEG3500, 500 FlU

Gesamtaktivität) des aktiven Phenylsepharosefraktionspools (siehe 3.4.3.1,

Gesamtaktivität 500 FlU) wurde auf die Säule aufgetragen. In 27 Elutionsfraktionen

konnten 63% der aufgetragenen Peptidase-Aktivität nachgewiesen werden (Abb. 31).

Die maximale Aktivität (>90% relative Aktivität) verteilte sich dabei breit über 8

Fraktionen. Dieser maximale Aktivitätsbereich korrelierte in etwa mit einem Peak der

Extinktionsmessung bei 280 nm (Abb. 31).

Entsprechende Elutionsprofile konnten bei zweifacher Wiederholung der Gelfiltration

reproduziert werden.

93

Ergebnisse

Extinktionsmessung bei 280nm

relative Peptidase-Aktivität

0

1

2

3

4

78.0 80.0 82.0 84.0 86.0A8 A9 A10 A11 A12 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7

82.46

100%

0%

20%

40%

60%

80%

E280

nm [m

AU]

Relative Pe ptid

ase-Aktivität

Retentionsvolumen [ml] Abb. 31: Ausschnitt der Gelchromatografie (Hiload Superdex 200) der rekombinanten Peptidase aus Klon F114. Die relative Peptidase-Aktivität entspricht der prozentualen Aktivität in einer Fraktion im Vergleich zur maximalen Peptidase-Aktivität im Peak. Für die Bestimmung des Kav-Wertes wurde das Aktivitäts-Maximum auf die Mitte des

maximalen Aktivitätsbereiches (>90% rel. Aktivität) festgelegt und ergab einen Kav-

Wert von 0,503 (Stabw: 0,07). Dies entspricht im Vergleich mit der Kalibrationskurve

(Abb. 30) einem ungefähren Molekulargewicht der rekombinanten Peptidase

ProAS(#418) von 48 kDa (nativ). Die Ermittlung des Molekulargewichtes des Wildtyp-

Enzyms (Peptidase B, Stamm B3/1-2 (#418)) durch Gelfiltration ergab mit ~50 kDa

(Kav= 0,495) eine vergleichbare molekulare Größe.

Das Molekulargewicht der Peptidase konnte mit den zur Verfügung stehenden

Methoden (SDS-PAGE und Gelfiltration) somit nur ungefähr ermittelt werden und

liegt bei ~50 kDa.

Zusammenfassend lässt die weitgehende Übereinstimmung der biochemischen

Eigenschaften und die identische Größe, ermittelt in verschiedenen PAGE-

Ausführungen und der Gelfiltration, den Schluss zu, dass die rekombinante

Peptidase F114 zu der Peptidase B aus Stamm B3/1-2 (#418) identisch ist. Weiterhin

liegt auch eine Übereinstimmung des Molekulargewichtes und der Zugehörigkeit zu

den Serinpeptidasen mit den Sequenzdaten von proAS(#418) vor. Dies lässt darüber

hinaus den Schluss zu, dass Peptidase B identisch mit ProAS(#418) ist.

94

Diskussion

44 Diskussion DiskussionExtrazelluläre Peptidasen aus halotoleranten und halophilen Bakterien sind im

Gegensatz zu den Peptidasen aus anderen extremophilen Bakterien, wie Alkaliphilen

und Thermophilen, erst wenig untersucht. Aufgrund ihrer Eigenschaft unter extremen

Umweltbedingungen noch Aktivität zu zeigen, sind halophile Enzyme von hervor-

ragendem biotechnologischen Interesse (Gomes & Steiner, 2004; van den Burg,

2003; Ventosa et al., 1998). So konnte gezeigt werden, dass extrem halophile

Enzyme nicht nur im hypersalinen Milieu, sondern auch unter Einfluss von

organischen Lösungsmitteln katalytisch aktiv sind (Marhuenda-Egea & Bonete,

2002). Beschränkte sich das Wissen über halophile Peptidasen bisher nahezu auf

wenige extrem halophile Peptidasen aus Archaeen und einige wenige biotech-

nologische Anwendungen im hypersalinen Milieu (Izotova et al., 1983; Ryu et al.,

1994), ist ein Anstieg des Interesses in den letzten 2-3 Jahren für Peptidasen aus

halophilen Bacteria zu verzeichnen (siehe Tab. 2 in der Einleitung). Die Berichte über

die Isolierung und biochemische Charakterisierung von extrazellulären Peptidasen

stehen zum Teil im Zusammenhang mit möglichen biotechnologischen

Anwendungen unter harschen Prozessbedingungen (Hiraga et al., 2005; Karbalaei-

Heidari et al., 2006; Namwong et al., 2006; Sánchez-Porro et al., 2003b; Setyorini et

al., 2006). So ist beispielsweise der Einsatz von halophilen Peptidasen aus einem

Filobacillus- und einem Halobacillus-Stamm für die beschleunigte Fermentation von

stark salzhaltigen asiatischen Fischsoßen sehr viel versprechend (Hiraga et al.,

2005; Namwong et al., 2006). Zudem sind einige halotolerante und moderat

halophile Peptidasen durch ihre breite Halotoleranz möglicherweise für die Protein-

hydrolyse in marinen bis stark salzhaltigen Flüssigkeiten oder Abwässern geeignet

(Karbalaei-Heidari et al., 2006; Lama et al., 2005; Sánchez-Porro et al., 2003b;

Setyorini et al., 2006).

Im Hinblick auf ihre außergewöhnlichen Eigenschaften standen halophile Enzyme im

Fokus dieser Arbeit. So sollten Peptidasen gefunden und charakterisiert werden, die

eine hohe Toleranz gegenüber chaotropen Bedingungen zeigen. Diese Eigenschaft

wurde hinsichtlich des Einsatzes der Enzyme in Kits für die Aufreinigung von

Nukleinsäuren gewählt. Die Peptidasen sollen hierbei die Zellen und das Gewebe

enzymatisch aufschließen und damit die darin enthaltenen Nukleinsäuren für das

weitere Extraktionsverfahren freisetzen. Die hierfür eingesetzten Lysepuffer besitzen

methodenbedingt einen alkalischen pH-Wert und hohe Konzentrationen an hoch-

95

Diskussion

chaotropen Guanidin-Salzen und Detergenzien, wie SDS. Untersuchungen, inwiefern

halophile Peptidasen diese Bedingungen im Lysepuffer tolerieren, lagen zum

Zeitpunkt der Untersuchung noch nicht vor.

Als Grundlage für das Screening nach neuen Peptidasen diente eine Stamm-

sammlung mit halotoleranten und halophilen Bakterien aus Salinen. Die Isolate

stammten aus Wasser- und Sedimentproben zweier Salinen und eines küstennahen

Sees auf Lanzarote (Kanarische Inseln, Spanien) sowie einer Saline bei La Baule

(Pays de la Loire, Frankreich) (Sinn-Meyer, 2003). Anhand von Plattenassays

konnten 355 Isolate mit extrazellulärer Peptidase-Aktivität unter halophilen

Bedingungen (12-20% NaCl) identifiziert werden. Eine taxonomische Einordnung der

Peptidase-Produzenten erfolgte bisher an 126 Stämmen aus Lanzarote, auf Basis

einer amplified ribosomal DNA-restiction analysis (ARDRA) Untersuchung (Sinn-

Meyer, 2003; Vogt, 2000). Diese zeigte, dass jeweils über 1/3 der Stämme entweder

den Pseudomonaceae (37%) oder Vibrionaceae (36%) angehören, während

geringere Anteile auf die Bacillaceae (10%), Halomonadaceae (9%), Archaea (6%)

und Alteromonadaceae (2%) entfielen.

Die Anwendung von Standardtechniken zur Gewinnung und Charakterisierung von

halophilen Enzymen kann sich als problematisch erweisen. So stellt die Proben-

konzentration und Aufreinigung von halophilen Enzymen wegen ihrer strukturellen

Besonderheiten und ihrer Salzabhängigkeit eine Herausforderung dar (Gupta et al.,

2005; Ventosa et al., 1998). Methoden zur Enzymfällung durch Aussalzen sind

zumeist aufgrund der Löslichkeit von halophilen Enzymen in hochkonzentrierten

Salzlösungen, wie gesättigtem Ammoniumsulfat, (Kirst, 1993) nicht anwendbar.

Darüber hinaus ist die Verwendung vieler chromatografischer Verfahren wegen der

Salzabhängigkeit der Enzyme ausgeschlossen (Madern et al., 2000). Durch

kristallografische Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass ein Überschuss an

negativer Ladung auf der Enzymoberfläche typisch für extrem halophile Enzyme ist

(Frolow et al., 1996; Jolley et al., 1997). Die negative Ladung ermöglicht dabei die

Ausbildung einer sog. Solvatisierungs-Hülle durch Bindung hydratisierter Ionen.

Diese Hülle reduziert die Hydrophobizität der Enzymoberfläche und verhindert damit

die Aggregation der Enzyme bei hohen Salzkonzentrationen (Costenaro et al., 2002;

Ebel et al., 2002). Bei Entfernung des Salzes kommt es hingegen zu einer Entfaltung

der extrem halophilen Enzyme durch die gegenseitige Abstoßung der negativen

Ladungen auf der Enzymoberfläche und zum Teil zu einer irreversiblen Inaktivierung

96

Diskussion

(Eisenberg, 1992). Welche Mechanismen zur Halotoleranz bei moderat halophilen

und halotoleranten Enzymen auftreten und inwiefern diese Einfluss auf die

Anwendung von Standardtechniken nehmen, wurde bislang noch nicht untersucht.

Ähnlichkeiten zu den oben genannten Schwierigkeiten zeigten sich in der

vorliegenden Studie bei der Anwendungen von Standardtechniken (siehe 3.1.5). Eine

Ammoniumsulfat-Fällung der hier untersuchten Peptidasen sowie ihre Aufreinigung

über eine Anionenaustauschchromatografie erbrachten sehr geringe Ausbeuten. Nur

die Entwicklung von modifizierten Verfahren zur Aufkonzentrierung sowie Trennung

und Anreicherung der Peptidasen aus den zellfreien Kulturen erlaubte eine

Durchführung dieser Studie (siehe 3.1.5). So eignete sich besonders eine Dialyse

gegen PEG3500 für eine Aufkonzentrierung der Proben, sowie eine hydrophobe

Interaktionschromatografie mit Phenylsepharose über einen Ammoniumsulfat-

gradienten für die Trennung und partielle Anreicherung. Ebenso erforderten die

verwendeten Aktivitätsassays eine Evaluation und Anpassung zur Verwendung unter

den angestrebten Bedingungen der Zielsetzung (siehe Abschnitt 3.1.4).

4.11 Zugehörigkeit der Peptidase produzierenden moderat halophilen Zugehörigkeit der Peptidase produzierenden moderat halophile4. nStämme zur Gattung SalinivibrioStämme zur Gattung Salinivibrio

Zu den für diese Studie zur Verfügung stehenden 355 Peptidase-Produzenten lagen

weder Daten über die Sekretionscharakteristika der Stämme noch über die bio-

chemischen Eigenschaften der extrazellulären Peptidasen vor. Eine Vorauswahl und

anschließende Vorcharakterisierung sollte die Anzahl der Isolate auf besonders

geeignete Peptidase-Produzenten reduzieren. Die Auswahlkriterien erfolgten dabei in

Bezug auf die Zielsetzung und eine erleichterte Probengewinnung: Ein schnelles

Wachstum (mit ~108Zellen/<5d) und starke Peptidase-Aktivität sollten eine zügige

und leichte Probengewinnung ermöglichen. Zudem wurde besondere Aufmerk-

samkeit auf Bakterien gelegt, die im haloalkaliphilen Bereich (NaCl: 10-20%; pH-

Wert: 8-9,5) isoliert wurden. Extrazelluläre Enzyme aus diesen Organismen besitzen

möglicherweise eine hohe Toleranz gegenüber denaturierenden Bedingungen, wie

einer hohen Salzkonzentration und alkalischem pH-Wert. Gleichfalls sollte die

Zugehörigkeit der ausgewählten Stämme zu verschiedenen taxonomischen Gruppen

(auf Basis einer ARDRA-Studie) eine hohe Diversität innerhalb der Auswahl

gewährleisten.

Eine Auswahl von 27 Stämmen entsprach diesen Kriterien und wurde bezüglich ihrer

Sekretionscharakteristika von Peptidasen in Flüssigkultur untersucht. Somit konnte

97

Diskussion

für die spätere Probennahme der Zeitpunkt der höchsten extrazellulären Peptidase-

Aktivität bestimmt werden. Im Gegensatz zur Kultur auf festen Medien erleichtert die

Flüssigkultur die Probennahme und eine exakte Quantifizierung des Zellwachstums

und der extrazellulären Peptidaseproduktion. Diese Kultivierungsmethode wurde

auch im Hinblick auf eine spätere Gewinnung der Enzyme im Produktionsmaßstab

gewählt. So stellt die Flüssigkultur in Fermentern und anschließende Aufreinigung

der extrazellulären Enzyme aus der zellfreien Kultur eine kostengünstige und weit

verbreitete Produktionsmethode dar (Demain & Davies, 1999; Gupta et al., 2002a).

Diese gewählten Selektionsbedingungen führten zu einer weiteren Einengung der

Auswahl, da ~30% der Stämme in Flüssigkultur nur sehr geringe oder keine

messbare Peptidasesekretion zeigten. Die Vorcharakterisierung der verbliebenen 19

Stämme erfolgte an den zellfreien Kulturen mit einem in vitro Test der Peptidasen in

einem Lysepuffer (1 M GuSCN; 0,1% SDS; 5 mM CaCl2; 50 mM Tris-HCl, pH 8), der

für eine RNA-Isolierung geeignet erschien.

9 Stämme mit extrazellulären proteolytischen Enzymen zeigten letztendlich

geeignete Eigenschaften bezüglich der Zielsetzung. Aufgrund eines 16S rRNA-Teil-

sequenzvergleichs konnten alle 9 Stämme in die Gattung Salinivibrio (Familie:

Vibrionaceae) eingeordnet werden. Des Weiteren lässt sich anhand der Sequenz-

vergleiche die mögliche Zugehörigkeit der 9 untersuchten Stämme zu min. 2-3

verschiedenen Salinivibrio-Spezies festlegen (vergleiche Abschnitt 3.1.2). So können

3 Stämme (B8/26-2 (#504), B12/10-1 (#748) und B12/16 (#795)) der Spezies

Salinivibrio costicola zugeordnet werden (mit 98,1-100% Sequenzidentität zur Sub-

spezies S. costicola alcaliphilus). Alle Isolate dieser Zuordnung stammen überein-

stimmend aus La Baule (Frankreich). S. costicola wurde zuerst von gesalzenen

Lebensmitteln (Australischer Schinken) isoliert (Garcia et al., 1987), weitere Fundorte

sind Salinen auf dem Spanischen Festland und den Kanarischen Inseln (Ventosa et

al., 1998) sowie ein hypersaliner Teich in Death Valley (Kalifornien, USA) (Huang et

al., 2000). Die hier nächst verwandte Subspezies S. costicola alcaliphilus wurde aus

einer Salzquelle in der Campania-Region (Italien) isoliert (Romano et al., 2005).

Soweit bekannt, handelt es sich um moderat halophile Bakterien mit einem

Wachstumsoptimum bei 10-12% NaCl. Es sind sowohl Stämme von S. costicola mit

als auch ohne proteolytische Aktivität bekannt (Lama et al., 2005). 4 weitere Stämme

(SJ2/3-1 (#073), SJ5Ü/8 (#098), SJ5Ü/12 (#140) und SJ6S/14 (#148)), die alle den

Salinas de Janubio (Kanarische Inseln, Spanien) entstammen, gehören vermutlich

98

Diskussion

der Art Salinivibrio aegyptiaca (Romano et al., 2006) an (mit �98,5% Sequenz-

identität zur Subspezies S. aegyptiaca sharmensis). Physiologische Daten über diese

Spezies fehlen, da sie bislang nur anhand ihrer 16S rRNA-Sequenz klassifiziert

wurde (NCBI-TTaxonomy ID: 390883). Keine Aussagen konnte aufgrund des nur

unvollständig sequenzierten Genabschnittes über die Artzugehörigkeit von Stamm

B3/14 (#430) gemacht werden. Dagegen ist es möglich, dass der Stamm B3/1-2

(#418) einer neuen Salinivibrio-Art angehört, mit S. costicola (97,1% Sequenz-

identität) und S. aegyptiaca (97,6% Sequenzidentität) als nächst verwandte Arten.

Hinsichtlich der untersuchten physiologischen Eigenschaften waren die hier

behandelten Stämme sich und bekannten Salinivibrio-Stämmen sehr ähnlich. Mit

einem Wachstum bei 2-20% NaCl (Optimum bei 6-10% NaCl) und pH 8 gehören sie

ebenfalls zu den moderat halophilen Bakterien. Im Gegensatz zur Peptidase-

Produktion von Salinivibrio sp. AF-2004, bei dem extrazelluläre Peptidase erst in der

stationären Phase nachzuweisen war (Karbalaei-Heidari et al., 2006), sekretierten

die hier untersuchten Salinivibrio-Stämme schon in den frühen Wachstumsphasen

Peptidasen, was auf eine konstitutive Peptidase-Expression schließen lässt.

4.24.2 Salinivibrio bildet zwei Typen von extrazellulären Peptidasen bildet zwei Typen von extrazellulären PeptidasenSalinivibrio

Salinivibrio ist als Produzent extrazellulärer Peptidasen bekannt (Sánchez-Porro et

al., 2003a). Bislang wurden zwei Salinivibrio-Stämme untersucht, bei denen jeweils

nur eine Peptidase identifiziert und biochemisch näher charakterisiert wurde

(Amoozegar et al., 2006; Karbalaei-Heidari et al., 2006; Lama et al., 2005). Bei vielen

mesophilen und einigen extremophilen Bakterienarten wurde die Sekretion von

mehreren Peptidasen beschrieben, wobei pro Bakterium 2 bis 12 verschiedene

Peptidasen nachgewiesen werden konnten (u.a. Deane et al., 1986; Nieto & Ellis,

1991; Saeki et al., 2000; Schmidt et al., 1995). So identifizierten beispielsweise

Schmidt et al. (1995) bei Bacillus sp. LG12 vier Subtilisin-ähnliche Peptidasen,

während Deane et al. (1986) bei Vibrio alginolyticus sieben extrazelluläre Peptidasen

verschiedener Familienzugehörigkeit nachweisen konnten. Dass verschiedene

Stämme einer Spezies eine unterschiedliche Anzahl von Peptidasen sekretieren

können, zeigten Nieto & Ellis (1991) für Aeromonas hydrophila. So konnten sie

abhängig von den untersuchten Aeromonas-Stämmen zwischen 1 und 12 extra-

zelluläre Peptidasen nachweisen. Allerdings liegen bislang keine Berichte über

mehrere sekretierte Peptidasen aus Salinivibrio vor. Neu ist insofern der Befund in

99

Diskussion

dieser Arbeit, dass bei 7 der 9 untersuchten Stämme zwei extrazelluläre Peptidasen

auftraten. Mittels Trennung in der hydrophoben Interaktionschromatografie konnten

eine Peptidase A und eine Peptidase B in der zellfreien Kultur nachgewiesen werden

(Abschnitt 3.1.5.1, Abb. 7; Tab. 36 im Anhang). Bei den verbleibenden zwei

Stämmen (B8/26-2 (#504) und B12/16 (#795)) wurde nur eine Peptidase gefunden,

und zwar vom B-Typ. Die chromatografische Unterscheidung der hier untersuchten

beiden Peptidasen in zwei verschiedene Typen konnte anhand ihrer biochemischen

Eigenschaften bestätigt werden (siehe Abschnitt 3.2).

4.2.14.2.1 Typ A: Metallopeptidase Typ A: Metallopeptidase

Das Verhalten gegenüber verschiedenen Peptidase-Inhibitoren ermöglichte eine

Zuordnung der Peptidase A aller 7 Salinivibrio-Stämme, die dieses Enzym

sekretierten, zu den Metallopeptidasen. Diese Zuordnung basiert vor allem auf der

kompletten Inhibition der Peptidase A durch Phenanthrolin (siehe Abschnitt 3.2.6).

Dieser spezifische Inhibitor inaktiviert Metallopeptidasen, indem durch eine

Komplexierungsreaktion das katalytisch wirksame Zinkion aus dem aktiven Zentrum

entfernt wird (Salvesen & Nagase, 2001). Weiterhin spricht die inhibierende Wirkung

von EDTA dafür, dass es sich bei Peptidase A um eine Metallopeptidase handelt.

EDTA ist ein unspezifischer Chelator für divalente Kationen, der die Inhibition von

Metallopeptidasen bewirkt (Auld, 1988). Konträr dazu steht allerdings eine Inhibition

(bis zu 69%) der Peptidase A durch den spezifischen Inhibitor für Serinpeptidasen

PMSF. Dieser Inhibitor bewirkt die irreversible Hemmung von Serinpeptidasen durch

eine kovalente Derivatisierung des Serinrestes im aktiven Zentrum. Eine

Verunreinigung der Enzymproben durch eine Serinpeptidase scheint daher

wahrscheinlich. Zumal es sich bei der zweiten von den Stämmen sekretierten

Peptidase um eine Serinpeptidase handelt (Peptidase B, siehe Abschnitt 4.2.2). Die

unscharfe Trennung der Peptidase A und B durch die hydrophobe Interaktions-

chromatografie (siehe Abb. 7) könnte daher zu einer Verschleppung der Peptidase B

in den verwendeten Fraktionspool der Peptidase A geführt haben. Gegen diese

Hypothese spricht allerdings, dass diese Verunreinigung weder im Kontakt-

Zymogramm der Peptidase A als Aktivitätsbande detektierbar ist (siehe Abb. 13)

noch die komplette Inhibition der Peptidase A durch Phenanthrolin stört. Die

Inhibition einer Metallopeptidase durch PMSF wurde bislang nur am gereinigten

Enzym aus Pseudoalteromonas ruthenica beschrieben (83% Inhibition bei 10 mM

100

Diskussion

PMSF; (Sánchez-Porro et al., 2003b)). Der Inhibitions-Mechanismus hierfür ist

unbekannt, da keine reaktiven Serinreste in der Aminosäuresequenz der Metallo-

peptidase gefunden wurden (Sánchez-Porro Álvarez, 2005). Für eine zukünftige

Aufklärung, ob es sich bei der hier festgestellten Inhibition der Peptidase A durch

PMSF um ein Artefakt oder einen bislang unbekannten Hemmmechanismus handelt,

wird eine strukturelle Aufklärung der Peptidase vorgeschlagen.

Mit der über SDS-PAGE ermittelten ungefähren Größe von 35 kDa entspricht die

Peptidase A der Größe von anderen Metallopeptidasen, u.a. charakterisiert in

Salinivibrio sp. AF2004 (Mr: 38-43 kDa; Karbalaei-Heidari et al., 2006) und

Pseudoalteromonas ruthenica (Mr: 38 kDa; Sánchez-Porro et al., 2003b).

Gemeinsamkeiten der Peptidase A zu den Metallopeptidasen von Salinivibrio und

Pseudoalteromonas bestehen ebenfalls bei vielen biochemischen Eigenschaften

(vergl. hierzu: Amoozegar et al., 2006; Karbalaei-Heidari et al., 2006; Sánchez-Porro

et al., 2003b). So handelt es sich bei diesen Enzymen um moderat alkaliphile

Peptidasen (pH-Optimum bei 8,5) mit moderat thermoaktivem Charakter. Das

Aktivitätsoptimum der hier untersuchten Peptidase A aus den Salinivibrio-Stämmen

lag mit 40-50°C unterhalb des Temperaturoptimums der Metallopeptidase aus einem

anderen Salinivibrio-Stamm (55°C; (Karbalaei-Heidari et al., 2006)) und aus

Pseudoalteromonas ruthenica (65°C; (Sánchez-Porro et al., 2003b)). Eine

Abhängigkeit von divalenten Kationen konnte bei der Peptidase A nicht festgestellt

werden. Lediglich CaCl2 und MgCl2 zeigten eine schwach aktivierende Wirkung auf

die Peptidase A bei einer Mehrzahl der untersuchten Salinivibrio-Stämme (siehe Tab.

21). Eine ähnlich schwache Aktivierung durch 5 mM CaCl2 (109% relative Aktivität)

und 5 mM MgCl2 (124% relative Aktivität) konnte für die Metallopeptidase aus

Salinivibrio sp. AF-2004 festgestellt werden (Karbalaei-Heidari et al., 2006),

wohingegen verschiedene divalente Kationen auf die Metallopeptidase aus

Pseudoalteromonas ruthenica einen inhibitorischen Effekt hatten (Sánchez-Porro et

al., 2003a).

Hinsichtlich der NaCl-Toleranz erwies sich die Peptidase A als salzempfindlich mit

einem Aktivitätsoptimum bei 10-200 mM NaCl, abhängig vom getesteten Stamm und

einer Restaktivität von < 20% bei 2 M NaCl. Erstaunlich ist hierbei der Ursprung der

Peptidase aus moderat halophilen Stämmen (Wachstum bei 2-20% (0,34-3,4 M)

NaCl), die erst bei erhöhtem Salzgehalt im Medium (�6% (1,02 M) NaCl, Optimum

bei 10-12% (1,71-2,05 M) NaCl) extrazelluläre Peptidasen produzierten. Ähnliche

101

Diskussion

Beobachtungen liegen auch für eine extrazelluläre Peptidase aus einem halo-

alkaliphilen Bacillus-Stamm vor (Gupta et al., 2005). Möglicherweise sind diese

Charakteristika ein Hinweis auf die Anpassung an die stark schwankenden

Salinitäten der Habitate (Salinen). Die Metallopeptidase aus Salinivibrio sp. AF2004

wies ebenfalls eine gewisse Salzempfindlichkeit auf, jedoch mit einer höheren

Toleranz gegenüber hohen NaCl-Konzentrationen (Karbalaei-Heidari et al., 2006).

Das Aktivitätsoptimum dieses gereinigten Enzyms lag im Bereich von 0-0,5 M NaCl

mit einem anschließenden Aktivitäts-Abfall der Aktivität auf unter 20% bei Steigerung

der Salinität auf 4 M. Ob neben der Übereinstimmung der Größe und einiger

biochemischer Eigenschaften der Peptidase A aus den hier untersuchten Salinivibrio-

Stämmen mit der Metallopeptidase aus Salinivibrio sp. AF-2004 auch eine Sequenz-

homologie vorliegt, könnte eine zukünftige Identifizierung ihrer DNA- oder Amino-

säuresequenzen erbringen.

Die taxonomische Einordnung der Stämme (B8/26-2 (#504) und B12/16 (#795)), bei

denen keine Sekretion von Peptidase A festgestellt werden konnte, legt die

Vermutung nahe, dass die Abwesenheit der Peptidase A stamm- aber nicht

artspezifisch ist. So wurde beim Stamm B12/10-1 (#748), der gemeinsam mit den

oben genannten Stämmen einer Art (S. costicola) zugeordnet werden konnte, die

Sekretion der Peptidase A nachgewiesen.

4.2.24.2.2 Typ B: Serinpeptidase Typ B: Serinpeptidase

4.2.2.14.2.2.1 Biochemische Charakteristika Biochemische Charakteristika

Das Verhalten der Peptidase B aus allen 9 hier untersuchten Salinivibrio-Stämmen

gegenüber verschiedenen Inhibitoren ermöglicht eine Zuordnung zu der Familie der

Serinpeptidasen. So konnte eine komplette Inhibition durch den für Serinpeptidasen

spezifischen Inhibitor PMSF erzielt werden (siehe Tab. 23). Keinen inhibitorischen

Effekt zeigte hingegen der Metallopeptidaseinhibitor Phenanthrolin auf die Aktivität

der Peptidase B. Die z. T. starke Inhibition (11-91%) durch EDTA, eigentlich als

Metallopeptidase-Inhibitor bekannt, widerspricht dieser Aussage nicht. Durch die

unspezifische komplexierende Wirkung kann EDTA ebenfalls solche Serinpeptidasen

hemmen, die für ihre Aktivität auf divalente Kationen angewiesen sind (Ordas et al.,

2001; Venugopal & Saramma, 2006). So hat beispielsweise Ca2+ über die Bindung

durch mehrere Calciumbindungsstellen in vielen bekannten Subtilisin-ähnlichen

Peptidasen eine wichtige strukturgebende Funktion bei der Faltung zum aktiven

102

Diskussion

Enzym (Siezen & Leunissen, 1997; Smith et al., 1999). Allerdings konnte eine

Abhängigkeit der Peptidase B von divalenten Kationen in der vorliegenden Arbeit

nicht aufgeklärt werden. So zeigte die Peptidase B von nur einigen Stämmen eine

schwache Aktivitätssteigerung durch Zugabe von 5 mM MnCl2 oder 5 mM CaCl2. Die

weitere biochemische Charakterisierung der Peptidase B stellte den moderat

alkaliphilen und moderat thermoaktiven Charakter dieses Enzyms mit einem

Temperaturoptimum bei 50-55°C und einem pH-Optimum von etwa pH 9-9,5 heraus.

Viele bekannte Subtilisin-ähnliche Peptidasen (eine Familie der Serinpeptidasen) aus

mesophilen und alkaliphilen Bakterien besitzen ebenfalls diese Eigenschaften (Rao

et al., 1998). Ein Beispiel stellen alkaliphile Subtilisine aus verschiedenen Bacillus-

Spezies mit einem Aktivitätsoptimum bei ~60°C und pH 9-10,5 dar (Bott & Betzel,

1996). Die nicht näher klassifizierten Serinpeptidasen aus den halophilen Bakterien

Filobacillus sp. RF2-5 und Halobacillus sp. SR5-3 besitzen gleichfalls einen thermo-

aktiven Charakter (Temperaturoptimum: 60°C bzw. 50°C) jedoch mit einem höheren

pH-Optimum von pH 10-11 (Hiraga et al., 2005; Namwong et al., 2006). In Bezug auf

die Salztoleranz zeigte sich die Peptidase B im Vergleich zur Peptidase A

empfindlicher gegenüber Salz. Ihr Optimum lag zwischen 0-100 mM NaCl und wies

bei 2M NaCl eine geringe Restaktivität (2-20%) auf. Wie schon bei Peptidase A

diskutiert, sind diese Eigenschaften für ein extrazelluläres Enzym eines moderat

halophilen Bakteriums überraschend.

Die ungefähre Größe der Peptidase B von 50 kDa konnte mittels SDS-PAGE-

Analyse und Gelfiltration ermittelt werden (siehe Abschnitte 3.2.8 & 3.4.3.3). Serin-

peptidasen von übereinstimmender Größe wurden z.B. bei Filobacillus sp. RF2-5 (49

kDa; (Hiraga et al., 2005)) oder Vibrio alginolyticus (54 kDa; (Deane, 1987))

beschrieben. Die hier festgestellte Autoproteolyse (siehe Abschnitt 3.2.8) der

Anreicherungen von Peptidase B nach längerer Lagerung konnte bereits mehrfach

bei verschiedenen Peptidasen festgestellt werden (Wilk, 2001). Die Autoproteolyse

muss dabei nicht automatisch zur Inaktivierung der Peptidasen führen, sondern kann,

wie auch hier beobachtet, in Peptide mit kleinerem Molekulargewicht und

proteolytischer Aktivität resultieren. Die autoproteolytische Entstehung von zwei

verschieden großen Polypeptiden mit proteolytischer Aktivität in dieser Studie lässt

den Schluss zu, dass die Spaltung der Peptidase B möglicherweise zwei

verschiedene Modi besaß. Eine Bestätigung dieser Hypothese und den Umfang der

verbleibenden Sequenzen könnte durch die zukünftige Bestimmung der terminalen

103

Diskussion

Aminosäuresequenzen von den beiden unterschiedlich großen Peptiden erbracht

werden. Weitere Experimente müssten klären, inwiefern die Zusammensetzung des

Lagerungspuffers der Peptidase B auf die Autoproteolyse Einfluss nimmt. So ist von

der Proteinase K bekannt, dass das Enzym durch Zusatz von Calciumionen über

lange Zeiträume stabilisiert werden kann (Bajorath et al., 1988).

4.2.2.24.2.2.2 Molekularbiologische Charakteristika Molekularbiologische Charakteristika

Eine Identifizierung der Gene der sekretierten Peptidasen aus den Salinivibrio-

Stämmen erfolgte in dieser Arbeit anhand von Genbanken in E. coli. Ein Screening

dieser Genbanken nach Peptidase produzierenden Klonen auf Plattenassays

misslang. Trotz sensitiver Assays und Verfahren zur Erleichterung der Sekretion von

rekombinanten Proteinen konnten keine Klone mit proteolytischer Aktivität gefunden

werden. Die vermutlichen Ursachen hierfür werden in Abschnitt 4.3 diskutiert.

Deshalb wurde das Screening nach Peptidasegenen in den Genbanken durch

Kolonie-Hybridisierung mit Sonden durchgeführt, deren Sequenz homolog zu

bekannten Peptidasegenen war. Eine Einschränkung der Suche auf Subtilisin-

ähnliche Peptidasen in diesem Verfahren hatte folgende Gründe: So wurden bisher

alle molekularbiologisch charakterisierten halophilen Serinpeptidasen, denen die

Peptidase B ebenfalls zugeordnet werden konnte, als Mitglieder der Familie der

Subtilisin-ähnlichen Peptidasen erkannt (siehe Tab. 2). Zudem scheinen die

Subtilisin-ähnlichen Peptidasen durch ihr breites Substratspektrum und ihren Einsatz

in vielen biotechnologischen Prozessen (Siezen, 1996) als sehr geeignet in Bezug

auf die Zielsetzung. Die Proteinase K findet als Vertreter dieser Familie schon

Anwendung in Kits für die Nukleinsäureaufreinigung. Weiterhin sind sehr viele

Enzyme dieser Familie gut charakterisiert und einige schon rekombinant hergestellt

worden. Dagegen liegen für die Metallopeptidasen, die hier durch die Peptidase A

vertreten werden, vergleichsweise wenige Sequenzinformationen vor. Erst eine

Primärstruktur von halophilen Metallopeptidasen wurde bislang publiziert (Sánchez-

Porro Álvarez, 2005). Ein Sondendesign für das Auffinden der Peptidase A aus der

Familie der Metallopeptidasen erschien daher wenig aussichtsreich.

Anhand eines Sequenz-Alignments von Subtilisin-ähnlichen Peptidasen

verschiedener Mikroorganismen (Bakterien und Pilze) konnten degenerierte Primer

entwickelt werden, die homolog zu drei konservierten Regionen der katalytischen

Triade dieser Peptidase-Familie waren. Mit Hilfe dieser Primer und chromosomaler

104

Diskussion

DNA des Salinivibrio-Stammes B12/16 (#795) wurde eine Sonde für das Screening

nach Subtilisin-ähnlichen Peptidasen synthetisiert. Die Hybridisierung der Sonde mit

Fosmid-Genbanken der Salinivibrio-Stämme in E. coli erbrachte mehrere

hybridisierungspositive Klone. Die Subklonierung und anschließende Sequenzierung

von hybridisierungspositiven Fosmidklonen führte zur Identifizierung eines

Peptidasegens. Das hier als proAS bezeichnete Peptidasegen kodiert für ein etwa 55

kDa großes hypothetisches Präprotein aus der Familie der Subtilisin-ähnlichen

Peptidasen (Abschnitt 3.3.3). Aufgrund einer Übereinstimmung des Molekular-

gewichtes und der Zugehörigkeit zu den Serinpeptidasen der ermittelten ProAS-

Sequenz sowie der biochemischen Eigenschaften der rekombinanten ProAS-

Peptidase (siehe Abschnitt 3.4.3 und 4.3), kann eine Identität der ProAS mit der

chromatografisch definierten Peptidase B geschlussfolgert werden.

Mit nur 65% Identität zur nächst verwandten Peptidase ProA aus Vibrio alginolyticus

bestehen deutliche Unterschiede im Vergleich der Aminosäuresequenz von ProAS

zu bekannten Peptidasen (Abschnitt 3.3.3).

Die Sequenzen der ProAS-Peptidase unterscheiden sich in den 9 untersuchten

Stämmen nur geringfügig (94% Übereinstimmung auf Aminosäureebene; Abb. 17,

Abschnitt 3.3.3). Ausgehend von der Analyse der proAS-Teilsequenzabschnitte (400

bp) bildeten sich jedoch spezifische Unterschiede heraus, so dass eine Einteilung

der ProAS-Peptidasen zu 3 nahe verwandten Gruppen erfolgen konnte. Diese

Gruppierung korreliert mit der systematischen Einordnung der Stämme aufgrund der

16S-rRNA-Analyse (siehe Abb. 32). So konnten die ProAS-Peptidasen der Gruppe I

in Stämmen der Salinivibrio aegyptiaca-Verwandtschaft nachgewiesen werden. Die

Identität der Stämme SJ2/3-1 (#073), SJ5Ü/12 (#140) und SJ6S/14 (#148) auf Basis

der 16s rRNA-Sequenzen ließ sich auch auf Ebene der Peptidasegene proAS wieder

finden. Der eigenständige Stamm B3/1-2 (#418) nimmt auch auf Ebene der

Peptidasegene eine Abseitsstellung ein, während die Peptidasegruppe III mit den

Stämmen aus der Verwandtschaft mit S. costicola übereinstimmt. Somit kann hier die

phylogenetische Einordnung der Stämme aufgrund ihrer 16S-rRNA–Sequenzen auch

auf Basis der proAS-Gene wieder gefunden werden.

105

Diskussion

16S-rDNA (Teilsequenz: 590 bp):

0

1.0

SJ5Ü/12 (#140)SJ6S/14 (#148)SJ2/3-1 (#073)SJ5Ü/8 (#098)Salinivibrio aegyptiaca sharmensisB3/1-2 (#418)B8/26-2 (#504)B12/10-1 (#748)Salinivibrio costicola alcaliphilus

Nukleotid-Austausch (x100) proAS (Teilsequenz: 400 bp):

Nukleotid-Austausch (x100)024681012141618

proAS(#098)proAS(#430)proAS(#140)proAS(#148)proAS(#073)proAS(#418)proAS(#79proAS(#74

5)8)

proAS(#504)proA (V.alginolyticus)

Gruppe I

Gruppe II

Gruppe III

Abb. 32: Gegenüberstellung der phylogenetischen Stammbäume auf Basis der 16S-rDNA- und proAS-Teilsequenzen. Die Länge der Verzweigungen repräsentiert die Divergenz zwischen zwei Sequenzen, die Zahlen bezeichnen die Anzahl der Substitutionsereignisse.

Folgt man einer weiteren Untergliederung der Subtilisin-ähnlichen Peptidasen von

Siezen & Leunissen (1997), kann die ProAS-Peptidase aufgrund homologer

Sequenzabschnitte der katalytischen Domänen der Proteinase K-Familie zugeordnet

werden (Abb. 40 im Anhang, Bereiche im Alignment gelb markiert). Diese Familie

beinhaltet, neben vielen Subtilisin-ähnlichen Peptidasen aus Pilzen, einige

Peptidasen aus gram-negativen Bakterien, so auch das Aqualysin I aus Thermus

aquaticus und ProA aus Vibrio alginolyticus. Von einigen Mitgliedern dieser Familie

ist bekannt, dass sie als Präproenzyme synthetisiert werden, wobei beim Aqualysin I

neben dem N-terminalen auch ein C-terminales Propeptid vorhanden ist (Larsen et

al., 2006). Während das Präpeptid als Signalpeptid nach dem Transport ins

Periplasma abgespalten wird, fungiert das N-terminale Propeptid möglicherweise als

Chaperon für die Faltung der Peptidase zum aktiven Enzym (Lee et al., 1992). Es

gibt viele Hinweise, dass die Abspaltung des Propeptids und Faltung zum aktiven

Enzym autoproteolytisch erfolgt. Das C-terminale Propeptid und seine Abspaltung

wird dagegen mit dem Transport des Aqualysins über die äußere Membran von

Thermus aquaticus in Zusammenhang gebracht (Lee et al., 1994; Lee et al., 1996).

Allerdings ist auch zumindest eine Subtilisin-ähnliche Peptidase charakterisiert

106

Diskussion

worden, bei der keine Abspaltung von Prosequenzen erfolgt (Kannan et al., 2001).

Im Alignment mit der Proteinase K und Aqualysin I konnten für die ProAS-Peptidase

keine Hinweise auf homologe Propeptid-Sequenzen gefunden werden (siehe Abb. 40

im Anhang). Während die vermutliche katalytische Peptidase-Domäne von ProAS ca.

60% Homologie zu Aqualysin I und Proteinase K aufweist, besteht im Bereich der

Prosequenzen nur etwa 20% Übereinstimmung. Eine Abspaltung größerer

Propeptide von 10-20 kDa, wie es von den zuvor genannten Peptidasen bekannt ist,

ist anhand des übereinstimmenden Molekulargewichts der sekretierten Peptidase B

(~50 kDa) im Vergleich mit ihrer von der Sequenz errechneten Größe (55 kDa,

abzüglich 2 kDa des hypothetischen Präpeptids) nicht ersichtlich. Das Vorhanden-

sein und die Größe von Prosequenzen bei der ProAS-Peptidase könnten zukünftige

Sequenzierungen der terminalen Enden des sekretierten Enzyms aufklären.

4.34.3 Heterologe Expression der Serinpeptidase ProAS in E. coliHeterologe Expression der Serinpeptidase ProAS in E. coli

Die heterologe Expression einer Vielzahl von Serinpeptidasen aus mesophilen und

extremophilen (insbesondere thermophilen und alkaliphilen) Bakterien und Pilzen in

E. coli wurde bereits beschrieben (u.a.: Arnorsdottir et al., 2002; Deane et al., 1987;

Gödde et al., 2005; Gunkel & Gassen, 1989; Gupta et al., 2002a; Ikemura et al.,

1987; Jang et al., 2002; Kwon et al., 1995; Maciver et al., 1994). Dahingegen fehlen

bislang Berichte über eine erfolgreiche heterologe Expression von halophilen

Peptidasen in ihrer aktiven Form in E. coli. So führte die Expression einer Peptidase

aus dem moderat halophilen Bakterium Pseudoalteromonas ruthenica in E. coli zur

Akkumulation von inaktivem Enzym in Inclusion Bodies (Sánchez-Porro Álvarez,

2005). Ebenfalls liegen keine Berichte über eine heterologe Expression von

Peptidasen in halophilen Vertretern der Bacteria vor. Die heterologe Expression von

halophilen Peptidasen aus Archaeen in halophilen Archaeen-Wirtsstämmen wurde

hingegen schon mehrfach beschrieben (Kamekura et al., 1992; Kamekura et al.,

1996; Shi et al., 2006). Ein Beispiel hierfür ist die Expression von aktivem Halolysin,

eine halophile Serinpeptidase von Haloferax mediterranei, in Haloferax volcanii

(Kamekura et al., 1992; Kamekura et al., 1996).

In dieser Studie gelang die Klonierung und heterologe Expression einer Subtilisin-

ähnlichen Peptidase aus dem moderat halophilen Salinivibrio sp. Stamm B3/1-2

(#418) in E. coli. Mit dem Fosmid F114 transformierte E. coli-Zellen zeigten eine

Sekretion von aktiver Peptidase. Diese erwies sich in der Analyse der biochemischen

107

Diskussion

Merkmale und des Molekulargewichtes als übereinstimmend mit der Wildtyp-

Peptidase ProAS(#418), die der chromatografisch definierten Peptidase B entspricht.

Das Fosmid F114 besaß ein ~40 kb großes DNA-Fragment von Stamm B3/1-2

(#418) als Insert, auf dem das Peptidasegen proAS(#418) identifiziert wurde. Dem

verwendeten Fosmidvektor fehlen eigene Promotoren und andere Kontrollelemente

für eine Expression der auf dem Insert lokalisierten Gene. Deshalb liegt der Schluss

nahe, dass die Expression von ProAS(#418) mit den wildtypeigenen Kontroll-

elementen (u.a. Promotor, Signalsequenz, Shine-Dalgarno-Sequenz, Terminator,

Stoppcodon) in E. coli gelang. Aktives Enzym konnte nur unter sehr spezifischen

Bedingungen nachgewiesen werden. So trat Aktivität nur nach einer geringen

Erhöhung der Fosmidkopiezahl pro Zelle (durch Induktion mit L-Arabinose) und

Absenkung der Temperatur auf 23°C in der zellfreien Kultur auf. Der Einsatz von

Fosmiden und die hier ausgearbeiteten Bedingungen zur heterologen Expression

einer Peptidase wurde bisher noch nicht beschrieben. Er könnte ein allgemein

gangbarer Weg zu optimierten Expressionssystemen für Klonierungen von letalen

Genen aus halotoleranten/halophilen Bakterien sein.

Für die heterologe Überexpression der Subtilisin-ähnlichen Peptidase ProAS wurden

in dieser Arbeit drei verschiedene üblich verwendete Expressionsvektoren

(pJF118EH; PBAD/gIII; pASK-IBA44) benutzt. In einer vorbereitenden Modellstudie

zur Auswahl eines bestgeeigneten Vektors und Optimierung der Expression in E. coli

wurde Subtilisin E aus Bacillus subtilis verwendet. Demnach kam es mit den

Vektoren pBAD/gIII und pASK-IBA44 zur erfolgreichen Expression von aktivem

Subtilisin E. Der Vektor pBAD/gIII schien nach Optimierung der Expressions-

Bedingungen als am besten geeignet.

Eine heterologe Expression von aktiver Peptidase ProAS(#748) aus dem moderat

halophilen Stamm B12/10-1 (#748) gelang jedoch mit keinem der zur Verfügung

stehenden Expressionsvektoren. Es konnten jedoch eindeutige Hinweise auf eine

induzierbare Transkription des rekombinanten Gens bei zwei Expressionsklonen

(pBAD-proAS(#748) und pBAD-proAS-ol(#748)) durch das Auftreten von

proAS(#418)-spezifischer mRNA nachgewiesen werden (siehe Abschnitt 3.4.1.2.1).

Vage Hinweise auf die Expression von rekombinantem Protein gab der Nachweis

eines Peptids mit ähnlicher Größe zum unprozessierten rekombinanten Expressions-

produkt in der PAGE-Analyse des Klons pBAD-proAS(#748) (siehe Abb. 22 /

108

Diskussion

Abschnitt 3.4.1.2.1). Der Grund für das Fehlen von aktiver rekombinanter Peptidase

ist unklar.

Für das Fehlschlagen der heterologen Expression von aktiver extrazellulärer ProAS-

Peptidase in E. coli mittels Expressionsvektoren werden hier folgende Hypothesen

aufgestellt:

1.) Toxizität der rekombinanten ProAS auf den Wirtsstamm:

Ein generelles Problem bei der heterologen Expression von aktiven Peptidasen stellt

die zumeist toxische Wirkung der gebildeten Enzyme auf den Wirtsstamm dar

(Wladyka et al., 2005). Je nach Lokalisation und Aktivität der rekombinanten

Peptidasen in der Wirtszelle kommt es zur Wachstumshemmung bzw. zum Zelltod

(Arnorsdottir et al., 2002; Bott & Betzel, 1996; Goldberg, 1992). Die toxische Wirkung

resultiert dabei aus der unregulierten Hydrolyse von essentiellen wirtseigenen

Proteinen. Diese führt im Cytoplasma zur Störung bzw. Zerstörung des zellulären

Metabolismus, während periplasmatisch oder extrazellulär sekretierte Peptidasen

eine Destabilisierung der Bakterienzellen durch Degradation von Membran- und

Zellwandbestandteilen bewirken können. Die Instabilität einiger Expressionsklone

und die beobachtete Wachstumshemmung aller hier untersuchten Expressionsklone,

schon ab einer Induktion auf niedrigstem Niveau, legt die Vermutung nahe, dass ein

toxischer Effekt vom Expressionsprodukt ausgeht. Gleiches scheint auch für die

Etablierung von Peptidase produzierenden Klonen in Genbanken mittels

konventioneller Vektoren zu gelten. Ein vollständiges Fehlen solcher Klone in

Screenings von Genbanken konnte auch an anderer Stelle beobachtet werden (u.a.

Herzog, 2002; Lämmle, 2004). Bei bakteriellen Peptidase-Produzenten wurden zwei

Mechanismen beschrieben, die dem Wildtyp eine Kontrolle über die proteolytische

Aktivität der gebildeten Enzyme ermöglichen (Wladyka et al., 2005). So werden

sekretierte Peptidasen zumeist als inaktive Zymogene ausgeschieden, die eine

Aktivierung durch Abspaltung der Proregionen außerhalb der Zelle erfahren (Khan &

James, 1998). Es wird vermutet, dass die Proregion als Chaperon für die korrekte

Faltung zum aktiven Enzym fungiert und z.B. beim Subtilisin E autokatalytisch

abgespalten wird (Yabuta et al., 2001). Des Weiteren ist die Produktion von

spezifischen Peptidase-Inhibitoren bekannt, die die Aktivität der zelltoxischen

Peptidase in der Zelle regulieren (Taguchi et al., 1997). Der letzt genannte

Mechanismus fand bei Wladyka et al. (2005) erstmalig Anwendung, eine heterologe

109

Diskussion

Co-Expression der Peptidase Staphopain A mit ihrem Inhibitor Staphostatin A wurde

in E. coli mit Erfolg durchgeführt. Die heterologe Expression von extrazellulären

Peptidasen als Zymogene findet dagegen allgemeine Anwendung und ist zumeist

notwendig zum Erhalt des aktiven rekombinanten Enzyms (Anderson et al., 1999;

Eder et al., 1993; Yabuta et al., 2003). Allerdings zeigen viele Studien, dass auch bei

der heterologen Expression der Peptidasen als Zymogene ein toxischer Effekt auf

den Wirt die Expression hemmt oder komplett inhibiert (Arnorsdottir et al., 2002; Bott

& Betzel, 1996; Goldberg, 1992). Ob dieser Effekt vom Zymogen selber oder einer

Aktivierung desselbigen zum aktiven Enzym durch Autoproteolyse resultiert, ist

bislang noch nicht untersucht worden. Ein Vorhandensein eines Propeptids in der

hier untersuchten Peptidase konnte nicht abschließend geklärt werden (siehe

4.2.2.2).

2.) Fehlende Stringenz in der Regulation der heterologen Expression

Bedingt durch den vermutlich toxischen Charakter von ProAS sollte die heterologe

Expression streng reguliert sein. So kann bei weniger dichten (leaky) Promotoren

und auch im Zusammenhang mit einer hohen Kopiezahl des Vektors eine geringe

basale Expression (background expression) im uninduzierten Zustand bereits

toxische Konzentrationen von ProAS entstehen lassen. Dies kann zum Absterben

der Zelle und damit zur Instabilität eines Klons führen (Arnorsdottir et al., 2002;

Sørensen & Mortensen, 2005). Der tac-Promotor des in dieser Arbeit verwendeten

Vektors pJF118EH besaß offensichtlich ein zu hohes basales Niveau der Expression:

Die Klonierung von Subtilisin E und der Peptidase ProAS(#748) in diesem Vektor

führte zu instabilen Klonen. Es bedarf somit stark regulierter Promotoren auf den

verwendeten Expressionsvektoren, die mit pASKIBA44 und pBAD/gIII in dieser Arbeit

zur Verfügung standen.

Neben der Dichtigkeit stellt die Stärke von Promotoren ein allgemeines Problem bei

der heterologen Expression von Proteinen dar. Hohe Expressionsraten führen dabei

häufig zu einer Proteinaggregation im Cytoplasma (Villaverde & Carrio, 2003), den so

genannten Inclusion Bodies, welche die Sekretion aktiver Enzyme verhindert. Abhilfe

kann eine Senkung der Expressionsrate durch Verringerung der Induktormenge

schaffen. Die Ausbildung von Inclusion Bodies konnte bei Verwendung des Vektors

pASK-IBA44 in dieser Studie beobachtet werden. In mit 0,2 μg/ml Anhydrotetracyclin

induzierten E. coli-Zellen konnten bei der proAS-Expression Inclusion Bodies

110

Diskussion

mikroskopisch nachgewiesen werden. Eine Verringerung der Induktormenge führte

zum Verschwinden der unlöslichen Proteinaggregate, allerdings nicht zur Sekretion

von aktivem Enzym. Möglicherweise wurde die Peptidase als inaktives Enzym

sekretiert, wie ein Protein ähnlicher Größe zur Wildtyp-Peptidase in der PAGE-

Analyse der zellfreien Kultur vermuten ließ.

In einigen Expressionsstrategien ist die Bildung von Inclusion Bodies Teil des

Verfahrens (Baneyx, 1999). Ein Vorteil ergibt sich hierbei durch Verringerung des

zelltoxischen Effektes durch die Inaktivität der aggregierten rekombinanten

Peptidasen. Eine Aktivierung des gereinigten Enzyms wird in einigen Fällen über

eine Denaturierung und anschließende Renaturierung unter geeigneten Puffer-

bedingungen erreicht (Parry, 2002; Villaverde & Carrio, 2003). Thermophile

Peptidasen können dagegen einfach über Erhitzen der Enzymaufreinigung aktiviert

werden (Fu et al., 2003; Gödde et al., 2005; Morikawa et al., 1994; Wu et al., 2004).

Die Aktivierung der rekombinanten Peptidase erfolgt dabei in vielen Fällen über eine

Prozessierung durch Autoproteolyse und Faltung zum reifen und aktiven Enzym

(Gödde et al., 2005; Villaverde & Carrio, 2003). Eine Anwendung der

Renaturierungs-Verfahren für Serinpeptidasen nach Parry (2002) führte allerdings in

dieser Studie zu keiner aktiven Peptidase in der Aufreinigung der Inclusion Bodies.

Womöglich konnten die Bedingungen für eine Renaturierung zum aktiven Enzym

nicht eingestellt werden. Möglicherweise waren die Enzyme auch irreversibel

denaturiert.

3.) Abweichende Codon-Usage durch den Wirtsstamm

Ebenfalls ein allgemeines Problem bei der heterologen Expression von Proteinen ist

die unterschiedliche Codon-Usage von Wirtsstamm und Wildtyp. Eine Verminderung

der Expressionsrate kann durch eine hohe Anzahl von Codons in der heterologen

DNA verursacht werden, die in E. coli selten genutzt werden (Makrides, 1996). Eine

computergestützte Analyse mit dem Programm codon usage analyser 2.0 (Fuhrmann

et al., 2004) deckte für das proAS-Gen aus 3 Salinivibrio-Stämmen 5 (bei

proAS(#418) und proAS(#795)) bzw. 8 (bei proAS(#748)) Codons auf, die von E. coli

K12-Stämmen wenig genutzt werden (<10% Anpassungsfähigkeit). Möglicherweise

resultierte daraus eine verminderte Syntheserate des heterologen Proteins. Auf das

vollständige Ausbleiben von aktiver Peptidase bei den Expressionsklonen hatte die

abweichende Codon-Usage jedoch vermutlich keinen ausschlaggebenden Einfluss.

111

Diskussion

Zum einen konnte die Sekretion einer aktiven ProAS-Peptidase durch den

Fosmidklon F114 in E. coli gezeigt werden. Zum anderen legte ein nach der

Induktion gebildetes Peptid in der PAGE-Analyse der Expressionsklone (pASK-

proAS(#748) und pBAD-proAS(#748)), welches eine ähnliche Größe zum erwarteten

Genprodukt besaß, die Vermutung nahe, dass eine Translation stattgefunden hatte.

Für eine spätere Produktionsoptimierung wird die Verwendung von speziellen E. coli-

Stämmen, die zusätzliche Genkopien für seltene tRNA-Codons besitzen,

vorgeschlagen. Ebenso wäre eine Mutagenese der betreffenden Codons in der

proAS-Sequenz vorstellbar, um diese durch für E. coli häufig genutzten Codons zu

ersetzen.

4. Transport, Prozessierung und Faltung der rekombinanten Peptidase

Für die extrazelluläre Lokalisation von Proteinen muss in gramnegativen Bakterien

ein Durchqueren von zwei Membranen (Cytoplasma- und äußere Membran)

gewährleistet sein. Mehrere Transportsysteme für die Membran-Translokation in

Prokaryoten wurden beschrieben (Pugsley et al., 2004). Die Sekretion kann dabei

schematisch in einen Sec-abhängigen und einen Sec-unabhängigen Weg

unterschieden werden (Coutte et al., 2001). Sekretierte Proteine des Sec-

unabhängigen Wegs beinhalten dabei kein abspaltbares N-terminales Signalpeptid

und werden in einem Schritt durch beide Membranen transportiert (Fath & Kolter,

1993; Plano et al., 2001). Beim Sec-abhängigen Weg erfolgt der Transport

zweistufig. Der Transport ins Periplasma wird über ein N-terminales Signalpeptid

vermittelt, welches während des Transports proteolytisch abgespalten wird. Im

zweiten Schritt kann das Enzym über verschiedene Transportwege durch die äußere

Membran exportiert werden (Coutte et al., 2001). Hierfür sind einige Transport-

systeme bekannt: der AT-Weg (autotransporter pathway) (Desvaux et al., 2004;

Henderson et al., 1998), TPS-Weg (two-partner secretion pathway)(Jacob-Dubuisson

et al., 2004), der Typ II Sekretionsweg (general secretory pathway) (Sandkvist, 2001)

und Typ IV-Sekretionssysteme (Backert & Meyer, 2006).

Bei der Analyse der proAS-Gene konnte ein hypothetisches N-terminales Signal-

peptid identifiziert werden. Dies lässt auf den Signalpeptid-vermittelten posttrans-

lationalen Transport der Proteine ins Periplasma schließen. Bisher wurden zwei

dieser Transportwege in Bakterien beschrieben: Der gut untersuchte und weit

verbreitete Sec-Transportweg (Sec: secretory) und der Tat-Transportweg (Tat: twin-

112

Diskussion

arginine-translocation). Die markante Consensus-Sequenz (R-R-X-F-L-K*) im

Signalpeptid des Tat-Wegs (Blaudeck et al., 2003) lag in den 3 untersuchten

Signalpeptiden der Salinivibrio-Stämme dieser Studie nicht vor.

Die ProAS-Sequenz der hier untersuchten moderat halophilen Bakterien besaß

dagegen die typischen Eigenschaften (von Heijne, 1983) für eine Translokation über

den Sec-Weg. Dieser wird hier als Transportweg der Peptidase ProAS ins

Periplasma angenommen. Die Abspaltung des Signalpeptides vom zumeist inaktiven

Vorläufer (Winnacker, 1985) nach dem Transport über den Sec-Weg ist

entscheidend für die Expression der rekombinanten Proteine mit authentischem N-

terminalen Ende (Sørensen & Mortensen, 2005). Der Sec-Weg ist ebenfalls im

Wirtsstamm E. coli vorhanden. Einige heterologe Signalpeptide erwiesen sich dabei

als voll funktional in E. coli (Sørensen & Mortensen, 2005). Die Sekretion von ProAS

Peptidase durch den Fosmidklon lässt vermuten, dass das Wildtyp-Signalpeptid von

E. coli erkannt wird. Möglicherweise wurde die Sekretion aber auch durch Proteine

ermöglicht, die ebenfalls auf dem Fosmid kodieren und eine transportvermittelnde

bzw. sekretionserleichternde Funktion besitzen, so wie es bei der Sekretion einer

Pektat-Lyase aus Erwinia chrysanthemi in E. coli beschrieben wurde (He et al.,

1991a; He et al., 1991b). Die Sequenzierung eines Fosmidabschnittes (~1000 bp)

stromaufwärts vom proAS(#418) ergab jedoch keinen Hinweis auf Sequenzen, die

homolog zu bekannten Transportergenen waren.

Um die Sekretion von rekombinanten Proteinen ins Periplasma bei E. coli zu

gewährleisten, wird für die Überexpression das Wildtyp-Signalpeptid häufig gegen

ein E. coli-spezifisches ersetzt. Die hier verwendeten Expressionsvektoren pASK-

IBA44 und pBAD/gIII beinhalteten dementsprechend die kodierende Sequenz des

ompA- bzw. gIII-Signalpeptides für E. coli. Dass sogar die Fusion eines Wildtyp-

signalpeptides mit dem gIII-Signalpeptid des Vektors in E. coli zur heterologen

Expression von aktivem periplasmatischen bzw. extrazellulären Subtilisin E führt,

konnte hier im Modellversuch und bei Sroga & Dordick (2002) gezeigt werden. Das

Vorhandensein eines Proteins ähnlicher Größe zum Expressionsprodukt im

Periplasma des Klons pBAD-proAS(#748) legt die Vermutung nahe, dass in diesem

Klon ebenfalls ein Transport der rekombinanten ProAS(#748) ins Periplasma

stattfand. Im Vektor pBAD-proAS(#748) liegt die kodierende Sequenz des vektor-

eigenen gIII-Signalpeptides fusioniert mit dem kompletten proAS(#748)-Gen vor,

*X steht hier für eine hochvariable Stelle in der Aminosäuresequenz.

113

Diskussion

welches am 5’-Ende für ein hypothetisches Signalpeptid des Wildtyps kodiert. Ob

und welches der beiden Signalpeptide des rekombinanten Proteins im Periplasma

abgespalten wurde, konnte nicht aufgeklärt werden.

Ebenfalls wichtig für die Expression eines aktiven Enzyms ist die Ausbildung von

möglichen Disulfidbrücken im Periplasma. Ein Alignment mit der kristallografisch gut

untersuchten Peptidase Aqualysin I (Takagi et al., 1990) ergab für die ProAS-

Peptidase eine hohe Homologie von zwei Bereichen, die im Aqualysin I an der

Ausbildung von Disulfidbrücken beteiligt sind (Kwon et al., 1988). So besitzt die

Peptidase ProAS vermutlich zwei Disulfidbrücken (208. + 240. AS und 309. + 340.

AS*, siehe Abb. 40 im Anhang), die auch in der nächst verwandten Peptidase ProA

vermutet werden (Siezen & Leunissen, 1997). Somit scheint die Sekretion ins

Periplasma eine Voraussetzung zur Ausbildung von korrekt gefalteter ProAS-

Peptidase zu sein.

Der weitere Transport aus dem Periplasma über die äußere Membran ist weniger gut

untersucht. Die bislang bekannten Systeme, die diesen Transport gewährleisten,

wurden schon weiter oben genannt. E. coli K12 fehlen offensichtlich solche

Transportwege. Eine extrazelluläre Lokalisation der rekombinanten Proteine wird

zumeist mit einem passiven Transport aufgrund einer Destabilisierung der äußeren

Membran erklärt (Sørensen & Mortensen, 2005). Dieser Mechanismus wird auch für

die extrazelluläre Lokalisation von aktivem Subtilisin E im Modellsystem vermutet.

Möglicherweise spielte daher ein aktiver Transport durch die äußere Membran für die

heterologe Expression von kleineren Mengen der ProAS-Peptidasen in dieser Studie

keine Rolle.

Folglich ist nicht nur die extrazelluläre Lokalisation der heterologen Peptidasen an

sich bedeutend, sondern ebenfalls die darin eingeschlossenen Transport-,

Prozessierungs- und Faltungsvorgänge zum Erhalt eines aktiven Enzyms.

Die Notwendigkeit von höheren Salzkonzentrationen bei der heterologen Expression

zur Sekretion von aktiven Enzymen wird für einige halophile Peptidasen vermutet. So

kennzeichnet eine sehr geringe Enzym-Stabilität unter salzarmen Bedingungen

einige halophile Peptidasen (Izotova et al., 1983; Kamekura et al., 1992). Die relative

Salzempfindlichkeit der hier untersuchten Peptidasen und die gelungene Expression

von aktiver ProAS-Peptidase in E. coli (bei ~170 mM NaCl im Medium) lässt eine

*Die Nummern geben die Position der Cysteinreste im Alignment der Aminosäuresequenzen an.

114

Diskussion

ausgeprägte Salzabhängigkeit bei der Expression der ProAS-Peptidasen zum

jetzigen Forschungsstand allerdings nicht erkennen.

Bei der zukünftigen Klonierung von stark salzabhängigen Peptidasen würde eine

heterologe Expression in halophilen Bakterien sinnvoll erscheinen. Zumal wenn

diese über notwendige Transporter für die extrazelluläre Sekretion verfügen. Seit

kurzem stehen Vektoren für die heterologe Expression von Proteinen in den moderat

halophilen Bakterien aus der Gattung Halomonas und Chromohalobacter zur

Verfügung (Afendra et al., 2004; Vargas & Nieto, 2004).

Entscheidend für die heterologe Expression von aktiver Peptidase in E. coli

(Fosmidklon) zeigte sich letztendlich die Kombination von niedriger Syntheserate und

niedriger Inkubationstemperatur (~23°C). Wie schon an anderer Stelle vermutetet

(Ikemura et al., 1987; Sroga & Dordick, 2002) sind diese Bedingungen

wahrscheinlich bei einigen rekombinanten Peptidasen Voraussetzung für eine

korrekte Prozessierung und Faltung zum aktiven Enzym. Möglicherweise liegt unter

diesen spezifischen Bedingungen ein Gleichgewicht vor, so dass es zur Expression,

zum Transport und zur Prozessierung der aktiven Enzyme kommen kann, allerdings

ohne die dafür zugehörigen Systeme im Wirtsstamm zu inaktivieren. Die Ergebnisse

der Modellstudie mit Subtilisin E und die Expression von aktiver ProAS-Peptidase

durch den Fosmidklon F114 begründen jedenfalls diese Annahme, auch wenn im

Fall des Fosmidklons ein anderes System verwendet wurde. Die schwache

Anhebung der Fosmidkopiezahl entspricht hier durch Vervielfältigung der proAS-

Gene und ihrer Kontrollelemente ebenfalls einer leichten Steigerung der Synthese-

rate. Dies und die Inkubation bei 23°C führten letztendlich nach einer erstaunlich

langen Induktionsphase von 110h zur aktiven ProAS-Peptidase in der zellfreien

Kultur. Auch bei Deane et al. (1987) konnte bei der heterologen Expression der

nächstverwandten ProA in E. coli eine Verzögerung nach der Induktion von 18 h bis

zum Nachweis von aktiver Peptidase festgestellt werden. Warum es zu dieser extrem

langen Induktionsphase kam, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht beantwortet werden.

Möglicherweise trat eine eher spontane, nicht völlig korrekte Faltung zum aktiven

Enzym in der zellfreien Kultur auf. Hinweise auf eine eventuelle labile Struktur gab

der Vergleich der biochemischen Eigenschaften. So zeigte die rekombinante

Peptidase im Gegensatz zum Wildtypenzym eine hohe Empfindlichkeit gegenüber

stark chaotropen Salzen.

115

Diskussion

Letztendlich scheint für die heterologe Expression von größeren Mengen an aktiver

ProAS-Peptidase kein gängiges Expressionssystem geeignet. Die toxische Wirkung

der rekombinanten Peptidase auf den Wirt oder auf essentielle Proteine bei zellfreien

Expressionssystemen scheint bislang unvereinbar mit einer ökonomischen

Produktion. Die heterologe Expression als inaktives Enzym und spätere

Prozessierung zur aktiven Peptidase bietet sich hierbei als mögliche Lösung an. Eine

Möglichkeit ist hierfür die Überexpression als inaktives Fusionsprotein (Makrides,

1996). Um allerdings die anschließenden Verfahren und Bedingungen zur korrekten

Prozessierung und Faltung des Enzyms herauszufinden, bedarf es in Zukunft weiter-

gehender Analysen der Sequenz und Struktur der reifen Peptidasen aus den

Wildtypen.

4.44.4 Einsatz der Metallopeptidase und der Serinpeptidase (ProAS) aus Einsatz der Metallopeptidase und der Serinpeptidase (ProAS) ausSalinivibrio in der Biotechnologie in der BiotechnologieSalinivibrio

Extrazelluläre Peptidasen gehören zu der bedeutendsten Enzym-Gruppe aus

extremophilen Bakterien, die eine weite Anwendung zur Modifikation oder

Degradation von Proteinen in diversen industriellen Prozessen finden. Ihre Einsatz-

gebiete reichen dabei von der Reinigungs- und Waschmittelindustrie, der Abwasser-

und Abfallbehandlung, Lederverarbeitung, Nahrungs- und Futtermittelindustrie zur

Pharmaindustrie (Gupta et al., 2002b; Rao et al., 1998).

Ein Einsatzgebiet für Peptidasen in der Molekularbiologie ist u.a. der enzymatische

Aufschluss von Zellen und Geweben sowie die Hydrolyse kontaminierender

Zellproteine. Die Verwendung von Peptidasen in Kits zur Nukleinsäureaufreinigung

setzt dabei eine Toleranz gegenüber alkalischem Milieu, hochchaotropen Salzen

(Guanidin) und Detergenzien wie SDS voraus. In diesen Verfahren kommt es zum

Einsatz von stark chaotropen Salzen zum Schutz der zu gewinnenden Nukleinsäuren

vor nukleolytischen Enzymen. Werden zelluläre Desoxyribonukleasen in der Regel

schon durch GuHCl-Konzentrationen von 3-6 M oder GuSCN-Konzentrationen von

0,5 M im Zellaufschluss inaktiviert (Bowtell, 1987; Jeanpierre, 1987; Pramanick et al.,

1976; Sambrook & Russell, 2001; Verma, 1988), besitzen Ribonukleasen im

allgemeinen eine höhere Toleranz gegenüber chaotropen Salzen (Arnold & Ulbrich-

Hofmann, 2000; Sambrook & Russell, 2001). Der Einsatz des stärker chaotropen

GuSCN in Konzentrationen oberhalb von 1-1,5 M hat sich dagegen für eine effektive

Inaktivierung der Ribonukleasen aus den aufgeschlossenen Zellen bewährt

116

Diskussion

(AMBION, 2006; Boom et al., 1990; Chirgwin et al., 1979; Chomczynski & Sacchi,

1987). Zudem werden verschiedene Detergenzien, vor allem das sehr chaotrope

SDS, den Lysepuffern dieser Kits für den Zellaufschluss und die Protein-

denaturierung zugesetzt. Überwiegend wird zur enzymatischen Zelllyse unter diesen

harschen Bedingungen Proteinase K eingesetzt (Hilz et al., 1975; Hofstetter et al.,

1997; Sambrook & Russell, 2001; Sweeney & Walker, 1993). Nur wenige Verfahren

zur Verwendung anderer Peptidasen bei der Nukleinsäureaufreinigung sind bekannt

(z.B. Firma QIAGEN), wurden aber nicht publiziert. Ebenso fehlen eingehende

Untersuchungen zur Toleranz der Aktivität von Peptidasen gegenüber chaotropen

Salzen, mit Ausnahme von Proteinase K (Arnold & Ulbrich-Hofmann, 2000; Yang &

Tsou, 1995).

Die Proteinase K, eine Serinpeptidase aus dem saprophytischen Pilz Tritirachium

album, zeigt unter Einfluss von chaotropen Salzen und Detergenzien eine Steigerung

ihrer enzymatischen Aktivität. So liegt ihr Aktivitätsoptimum bei 0,2-1% SDS (Hilz et

al., 1975) und sie zeigt unter Einfluss von 3 M GuHCl oder 0,8 M GuSCN noch

gesteigerte Aktivität gegen Hämoglobin (Produktdatenblatt Proteinase K, QIAGEN,

1997). Des Weiteren ist sie thermoaktiv mit einem Temperaturoptimum bei 65°C

(Ebeling et al., 1974). In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob sich weitere

Peptidasen finden lassen, die sich für eine Nukleinsäureaufreinigung eignen.

Beweggründe dafür waren zum einen technische Erwägungen, zum anderen

ökonomische Betrachtungen. Zu dem technischen Fokus gehörte das Ziel, möglichst

günstige Eigenschaften über diejenigen der Proteinase K hinaus reichenden zu

erlangen. Konkret wurde angestrebt, Peptidasen bei erhöhten chaotropen

Verhältnissen einsetzen zu können. Denn gerade bei der RNA-Reinigung ist der

Einsatz der Proteinase K sehr limitiert, da RNasen ähnlich resistente Eigenschaften

gegenüber GuSCN zeigen. Für diesen Einsatzbereich gilt es, neue Peptidasen zu

suchen, die erhöhte chaotrope Verhältnisse tolerieren. Ökonomisch ist es für eine

Firma attraktiv, sich von der Abhängigkeit gegenüber Zulieferern zu lösen, vor allem,

wenn deren Zahl sehr beschränkt ist. Hier geht es um Qualitätssicherung im

Produktionsprozess ebenso wie um eine Kostenreduzierung und damit erhöhte

Wertschöpfung. Ansatzpunkt für die Suche nach neuen Peptidasen mit extremen

Eigenschaften waren deshalb halotolerante, halophile und alkaliphile Bakterien, da

im salzhaltigen Milieu Enzyme stark denaturierenden Bedingungen ausgesetzt sind.

117

Diskussion

Im Laufe der Evolution sollten Organismus und externe Enzyme optimal an diese

Bedingungen angepasst sein.

Erwartungsgemäß zeichneten sich die beiden in dieser Arbeit charakterisierten

Enzyme Peptidase A und Peptidase B durch eine Toleranz gegenüber GuHCl und

GuSCN aus. So besaßen die Peptidasen der untersuchten Stämme im Casein-Assay

größtenteils noch über 25% Aktivität in 2 M GuHCl und über 40% in 0,6 M GuSCN.

Weiterhin waren die moderat alkaliphilen (Optimum bei pH 8-9,5) und thermoaktiven

(Optimum bei 40-55°C) Eigenschaften beider Peptidasen, sowie die Toleranz

gegenüber SDS ideal für den Einsatz bei der Nukleinsäureaufreinigung. Eine direkte

Quantifizierung der Enzymaktivität im Lysepuffer eines Kits (MOLZYM) erwies sich

wegen der Bestandteile als nicht durchführbar. Die Kombination von SDS und hohen

Konzentrationen chaotroper Salze führte zu Präzipitaten in den Assays, die

vergleichbare Aktivitätsmessungen verhinderten. Die Eignung der Enzyme wurde

deshalb anwendungsbezogen anhand eines Aufschlusses von Mäuseschwanz-

gewebe getestet. Zellfreie Konzentrate von 3 der 8 untersuchten Stämme zeigten

unter Optimalbedingungen (30mM Tris-HCl, pH 9, 5 mM NaCl) die Fähigkeit Mäuse-

schwänze innerhalb von 2 h zu lysieren. Sie wiesen sogar eine bessere muskel-

gewebeauflösende Wirkung auf, als die mit über 75-fach höherer Aktivität

eingesetzte Proteinase K. Das Konzentrat eines Stammes (B12/16 (#795)) hatte

auch in einem für DNA-Extraktionen üblichen Lysepuffer mit stark chaotropen

Bedingungen (0,5 % Tween, 0,5 % SDS, 0,5 M GuSCN) die Eigenschaft Muskel-

zellen zu lysieren. Allerdings ergab sich aufgrund der inhibierenden Substanzen eine

verlangsamte Lyse (über 18 h). Dieser Befund entsprach den Ergebnissen mit der

Proteinase K: mit gleicher Enzymaktivität (~ 1 kFlU) wurde eine komplette Lyse der

Mäuseschwanzstücke in vergleichbarem Zeitraum erreicht (ca. 12 h). Zukünftige

Studien müssten zeigen, ob bei Einsatz größerer Peptidasemengen aus den hier

untersuchten Stämmen eine wie bei Proteinase K beobachtete schnelle Lyse (inner-

halb von 3 h) auch im chaotropen Milieu zu erreichen ist. Zudem wäre es interessant

zu untersuchen, ob beide in den Konzentraten enthaltenen Peptidasen zelllytisches

Verhalten zeigen. Die hervorragenden Lyseeigenschaften des Kulturkonzentrats von

Stamm B12/16 (#795), welches in der chromatografischen Auftrennung keine

Peptidase A zeigte, weist daraufhin, dass für die Gewebeauflösung die Peptidase B

verantwortlich war, also wie Proteinase K eine Serinpeptidase. Zusammenfassend

kann aus dieser Studie gefolgert werden, dass die hier charakterisierten Peptidasen

118

Diskussion

Eigenschaften aufweisen, die ihren Einsatz in der DNA-Extraktion ermöglichen. Ihre

Verwendung unter stärker chaotropen Bedingungen, wie sie für eine RNA-Extraktion

erforderlich sind, scheint dagegen eher nicht angezeigt zu sein.

Auch wenn sich die hier untersuchten Peptidasen wegen ihrer Eigenschaften noch

nicht für einen breiten Einsatz in der Nukleinsäurereinigung als geeignet zeigten,

weist diese Studie doch auf das Vorhandensein eines hohen Potentials von

bakteriellen Peptidasen unter den halotoleranten/halophilen Bakterien hin. Für

zukünftige Studien würde es sich deswegen lohnen weitere Screenings an

Peptidasen aus halotoleranten und halophilen Bakterien vorzunehmen. Im Hinblick

auf das Auffinden von Peptidasen mit einer noch höheren Toleranz gegenüber

chaotropen Bedingungen als die hier beschriebenen Enzyme scheint die Auswahl

von extrem halophilen/alkaliphilen Bakterien sinnvoll. Wie zuvor schon beschrieben

ist anzunehmen, dass die sekretierten Enzyme dieser Organismen neben ihrer sehr

hohen Halotoleranz auch hervorragende Toleranzen gegenüber anderen

denaturierenden Bedingungen besitzen. Im Hinblick auf das mitunter langsame

Wachstum extrem halophiler Bakterien, einhergehend mit einer geringen Peptidase-

produktion, kann mit einer erschwerten Probengewinnung gerechnet werden. Die in

dieser Arbeit entwickelten Verfahren zur Aufkonzentrierung und chromatografischen

Anreicherung/Trennung von halophilen Peptidasen stellen möglicherweise hilfreiche

Werkzeuge für die Gewinnung geeigneten Probenmaterials dar. Weiterhin ist zu

überlegen, ob die Probengewinnung für die Enzym-Charakterisierungen auf Platten-

kulturen ausgeweitet werden sollte. Die Gewinnung von Probenmaterial erfolgte in

dieser Arbeit gemäß den Auswahlkriterien (siehe Abschnitt 3.1.1) ausschließlich aus

Flüssigkulturen. Dabei zeigte sich, dass einige Peptidase-Produzenten nicht erfasst

werden konnten, da sie, im Gegensatz zur Agarplattenkultur, in der Flüssigkultur

keine oder nur sehr geringe Mengen an Peptidasen sekretierten (siehe Abschnitt

3.1.3). Somit könnte bei einer veränderten Probengewinnung eine erweiterte

Auswahl an Peptidasen für die Charakterisierung zur Verfügung stehen.

Darüber hinaus zeigten sowohl Peptidase A als auch Peptidase B aufgrund ihrer bio-

chemischen Eigenschaften ein Potential für weitere Einsatzfelder der Biotechnologie:

Ihr breiter Aktivitätsbereich zwischen pH 6-11, ihr moderat thermoaktiver Charakter

(Optimum zwischen 40°C und 55°C), ihr breites Substratspektrum und ihre Toleranz

gegenüber höheren SDS-Konzentrationen legen den Einsatz bei der Entfernung von

proteinhaltigen Verschmutzungen in der Abfall- und Abwasserbehandlung sowie

119

Diskussion

möglicherweise als Zusatz in Wasch- und Reinigungsmitteln nahe. Ihre Fähigkeiten

sowohl ohne Salz als auch bis zu 2 M NaCl proteolytisch aktiv zu sein, unterscheidet

sie deutlich von Peptidasen aus extrem halophilen Bakterien. Diese erfahren bei

NaCl-Konzentrationen unterhalb ihres Aktivitätsoptimums einen sehr starken Abfall

und eine irreversible Inaktivierung (Adams & Kelly, 1995), was den Einsatz der

extrem halophilen Peptidasen im Gegensatz zu den hier untersuchten Peptidasen

aus moderat halophilen Bakterien stark einschränkt. Somit könnten die hier

untersuchten Peptidasen ebenfalls zur Proteinhydrolyse in schwach bis moderat

salzhaltigen Flüssigkeiten mit stark schwankendem Chemismus Anwendung finden,

wie es beispielsweise für stark proteinverschmutzte Abwässer der leder-

verarbeitenden Industrie beschrieben wird (Park et al., 2004).

120

Zusammenfassung

55 Zusammenfassung ZusammenfassungDas Ziel der vorliegenden Arbeit war das Auffinden von extrazellulären Peptidasen

aus halotoleranten bzw. halophilen Bakterien, deren proteolytische Aktivität eine

hohe Toleranz gegenüber chaotropen Bedingungen aufweist. Dies geschah im

Hinblick auf den möglichen Einsatz der neuen Enzyme zur Zelllyse in Puffern mit

hohen Konzentrationen von hochchaotropen Guanidin-Salzen (Guanidinisothio-

cyanat oder Guanidinhydrochlorid) und Detergenzien, wie Natriumdodecylsulfat

(SDS), für ein Nukleinsäure-Extraktionsverfahren.

Eine Auswahl an 27 Stämmen mit verschiedenen physiologischen Eigenschaften aus

355 Peptidase-Produzenten einer Stammsammlung von halophilen und

halotoleranten Isolaten aus Salinen wurde auf ihre Sekretionscharakteristika für

Peptidasen untersucht. Eine weiterführende biochemische Charakterisierung wurde

an den sekretierten Peptidasen von 9 moderat halophilen Stämmen vorgenommen,

deren zellfreie Kulturen in einem in vitro Test bezüglich der Zielsetzung besonders

geeignete Peptidase-Merkmale aufwiesen.

Alle 9 Isolate gehörten der Gattung Salinivibrio an, wobei eine Unterscheidung der

Stämme auf Basis einer 16S-rRNA-Teilsequenzanalyse in mindestens 2-3

verschiedene Arten vorgenommen werden konnte. So konnten 8 der 9 Stämme den

Arten Salinivibrio costicola, S. aegyptiaca und möglicherweise einer neuen

Salinivibrio-Spezies zugeordnet werden.

Speziell angepasste Verfahren zur Aufkonzentrierung und Aufreinigung der

Peptidasen aus den salzhaltigen zellfreien Kulturen wurden in dieser Arbeit

entwickelt. Bei 7 der 9 hier untersuchten Stämme konnten mittels Trennung in der

hydrophoben Interaktionschromatografie zwei verschiedene Typen von extra-

zellulären Peptidasen (Peptidase A und B) nachgewiesen werden, während bei den

übrigen zwei Stämmen nur ein Peptidasetyp (Peptidase B) gefunden wurde. Die

chromatografische Unterscheidung der beiden Peptidasen in zwei verschiedene

Typen konnte anhand ihrer biochemischen Eigenschaften bestätigt werden. Die

inhibitorische Wirkung von 1,10-Phenanthrolin und EDTA auf die Aktivität der

Peptidase A legte nahe, dass es sich hierbei um eine Metallopeptidase handelt. Das

etwa 35 kDa große Enzym (SDS-PAGE-Analyse) wies einen moderat alkaliphilen

und thermoaktiven Charakter (Aktivitätsoptimum: pH 8,5; Temp.: 40-50°C) mit einem

niedrigen Salzoptimum (10-200 mM NaCl) und abnehmender Aktivität bei steigender

Salzkonzentration (<20% Restaktivität bei 2 M NaCl) auf. Die komplette Inhibition der

121

Zusammenfassung

zweiten Peptidase (Peptidase B) durch Phenylmethylsulphonylfluorid (PMSF) wies

auf eine Zugehörigkeit des etwa 50 kDa großen Enzyms zu den Serinpeptidasen hin.

Ein Aktivitätsoptimum bei 50-55°C und pH 9-9,5 zeichnete es ebenfalls als moderat

thermoaktives und alkaliphiles Enzym aus, welches ein Aktivitätsoptimum bei 0-

100 mM NaCl aufwies. Eine Klonierung und Identifizierung des Peptidase B-Gens,

hier als proAS bezeichnet, erfolgte mit Hilfe von Sonden, ausgehend von

konservierten Domänen bekannter Serinpeptidasen, speziell Subtilisin-ähnlicher

Peptidasen. Die Bestimmung der Nukleotidsequenz des proAS-Gens zeigte, dass es

für eine etwa 55 kDa große Subtilisin-ähnliche Peptidase kodiert, die 65%

Übereinstimmung zur nächst verwandten Peptidase ProA von Vibrio alginolyticus

aufweist. Peptidase ProAS besitzt ein hypothetisches Signalpeptid von 23

Aminosäuren Länge. Eine hohe Homologie (>94% Aminosäuresequenzidentität)

bestand zwischen den ProAS-Teilsequenzen der 9 Stämme, wobei die

zwischenstammlichen Unterschiede der Peptidasesequenzen mit der taxonomischen

Einordnung der Stämme (16S rRNA-Analyse) korrelierten.

Über eine Fosmid-Klonierung gelang die heterologe Expression der Subtilisin-

ähnlichen Peptidase ProAS(#418) aus dem moderat halophilen Salinivibrio sp.

Stamm B3/1-2 (#418) in E. coli. Aktives Enzym zeigte sich dabei nur unter sehr

spezifischen Bedingungen (Induktion: 0,5 mM L-Arabinose; Inkubation für >110h bei

23°C, 200 rpm). Die Expression der ProAS-Peptidase mittels induzierbarer

Promotoren von Expressionsvektoren gelang auf Transkriptionsebene, führte aber zu

keinem aktiven Enzym. Die Ursachen hierfür wurden diskutiert.

Beide Peptidasen erwiesen sich durch ihre Eigenschaften, u.a. eine breite Substrat-

spezifität, Toleranz gegenüber hochchaotropen Guanidin-Salzen mit größtenteils

noch über 25% Aktivität in 2 M GuHCl und über 40% in 0,6 M GuSCN, sowie

Toleranz gegenüber höheren SDS-Konzentrationen, als geeignet für den Einsatz bei

der DNA-Isolierung. Dies zeigten auch erste anwendungsbezogene Studien am

gewebelytischen Verhalten in einem angepassten Lysepuffer, wobei sich die

Peptidase B aus Stamm B12/16 (#795) als besonders geeignet erwies.

122

Literaturverzeichnis

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139

Anhang

77 Anhang AnhangTab. 35: Für die Voruntersuchungen ausgewählte Stämme und einige ihrer Eigenschaften. Türkis unterlegt sind 9 Stämme, die aufgrund ihrer Eigenschaften für weitere Untersuchungen ausgewählt wurden.Stamm Isolations-

bedingungen (% NaCl/ pH)1)

ARDRA-Gruppe2)

Wachstums-rate(12% NaCl, pH 8) 3)

Peptidase-produktion aufAgarplatte3)

Submerse Peptidase-produktion bei 12% NaCl; Maximale Aktivität (Inkubationszeit) 3)

Restaktivität bei 1 M GuSCN, 0,1% SDS, 5 mM CaCl2, 50 mM Tris-HCl pH 8 im Azocaseinassay3)

SJ5S/2b (#038) 12/8 7 n.b. + <0,001 AzU/ml n.b.

SJ2/3-1 (#073) 12/8 2 1,2 + 216 AzU/ml (37h) 44%

SJ6/4 (#079) 12/8 13 1,3 + 69,6 AzU/ml (43h) 33%

SJ6/6 (#080) 12/8 2 1,2 + 194,6 AzU/ml (37h) 25%

SJ2/2 (#096) 12/8 3 n.b. + 15 AzU/ml (72 h) 0%

SJ5Ü/8 (#098) 12/8 2 0,9 + 195 AzU/ml (37h) 40%

EG1Ü/1 (#100) 12/8 16 n.b. + <0,001 AzU/ml n.b.

SJ1S/8 (#108) 20/8 1 n.b. + <0,001 AzU/ml n.b.

SJ5Ü/11 (#139) 12/9,5 2 1,2 + 131,9 AzU/ml (43h) 4%

SJ5Ü/12 (#140) 12/9,5 2 1,0 + 197,4 AzU/ml (37h) 76%

SJ6S/14 (#148) 12/9,5 2 1,1 + 205,2 AzU/ml (37h) 69%

SJ6S/16 (#150) 12/9,5 2 1,3 + 236 AzU/ml (37h) 30%

SR3Ü/1 (#155) 20/8 1 n.b. + 2 AzU/ml (72 h) n.b.

SJ6Ü/25 (#223) 12/8 1 n.b. + <0,001 AzU/ml n.b.

EG1S/8 (#233) 12/8 9 n.b. + <0,001 AzU/ml n.b.

SJ6Ü/18 (#238) 12/8 6 n.b. + 4 AzU/ml (72 h) n.b.

SJ5Ü/17 (#245) 12/8 8 n.b. + <0,001 AzU/ml n.b.

B3/1-2 (#418) 12/9,5 n.b. 0,9 +++ 124,2 AzU/ml (37h) 73%

B3/14 (#430) 12/8 n.b. 0,9 + 232,8 AzU/ml (37h) 68%

B6/8 (#461) 12/9,5 n.b. 1,3 ++ 37,8 AzU/ml (120 h) 25%

B6/18 (#473) 12/8 n.b. 0,8 + 143 AzU/ml (43h) 18%

B8/26-2 (#504) 12/8 n.b. 1,0 +++ 234,8 AzU/ml (37h) 4%

B2/22 (#521) 20/8 n.b. 0,9 +++ 0,914 AzU/ml (37h) 17%

B12/10-1(#748) 12/8 n.b. 1,3 ++ 182,8 AzU/ml (37h) 51%4)

B12/10-2 (#749) 12/8 n.b. 1,0 ++ 176 AzU/ml (37h) 55%4)

B3/4-1 (#759) 12/9,5 n.b. 0,8 n.b. 68 AzU/ml (43h) 0%

B12/16 (#795) 12/8 n.b. 0,9 +++ 213,8 AzU/ml (43h) 34%

Quellen: 1)(Sinn-Meyer, 2003); 2)(Vogt, 2000); 3)Ergebnisse dieser Arbeit. 4)Aufgrund des gleichen Ursprungs der Isolate B12/10-1 (#748) und B12/10-2 (#749) aus Ansatz B12/10 wurde letzterer nicht in die Auswahl übernommen. Zeichenerklärung: AzU: Azocaseinunits; n.b.: nicht bestimmt. Emerse Peptidase-Aktivität: -= keine Aktivität; += kleiner Aktivitätsbereich ~1 mm; ++=mittlerer Aktivitätsbereich ~2-3 mm ; +++= großer Aktivitätsbereich >3 mm

140

Anhang

Tab. 36: Fraktionspools mit proteolytischer Aktivität (Fluoreszenzassay) in der hydrophoben Interaktionschromatografie.

Stamm Kulturvolumen [ml]

Gradientenlänge [min] Fraktionspool Vereinigte

Fraktionen Aktivität [FlU/ml]

A 120-134 ml 11,9SJ2/3-1 (#073) 125 120 B 140-174 ml 104,3

A 120-134 ml 7,6SJ5Ü/8 (#098) 125 120 B 144-178 ml 38,8

A 120-134 ml 19,1SJ5Ü/12 (#140) 150 120 B 144-176 ml 157,3

A 120-134 ml 20,5SJ6S/14 (#148) 150 120 B 140-174 ml 163,7

A 112-126 ml 30,2B3/1-2 (#418) 270 120 B 136-176 ml 198,7

A 122-136 ml 17,8B3/14 (#430) 120 120 B 144-176 ml 165,4

A - -B8/26-2 (#504) 150 120 B 144-176 ml 178,5

A 128-152 ml 70,8B12/10-1 (#748) 350 180 B 190-242 ml 407,7

A - -B12/16 (#795) 150 120 B 144-176 ml 119,5

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SJ2/3-1 (#073) SJ5Ü/8 (#098) Abb. 33: Einfluss des pH-Wertes auf die proteolytische Aktivität der Peptidase A (a) und B (b) der Stämme SJ2/3-1 (#073) und SJ5Ü/8 (#098). Die relative Peptidase-Aktivität entspricht der prozentualen Aktivität des Optimums.

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SJ5Ü/12 (#140) SJ6S/14 (#148)

b

b

a

a

Abb. 34: Einfluss des pH-Wertes auf die proteolytische Aktivität der Peptidase A (a) und B (b) der Stämme SJ5Ü/12 (#140) und SJ6S/14 (#148). Die relative Peptidase-Aktivität entspricht der prozentualen Aktivität des Optimums.

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Anhang

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B3/14 (#430) B8/26-2 (B8/26-2 (#504))

a b

Abb. 35: Einfluss des pH-Wertes auf die proteolytische Aktivität der Peptidase A (a) des Stammes B3/14 (#430) und B (b) der Stämme B3/14 (#430) und B8/26-2 (#504). Die relative Peptidase-Aktivität entspricht der prozentualen Aktivität des Optimums.

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B12/16 (#795) Abb. 36: Einfluss des pH-Wertes auf die proteolytische Aktivität der Peptidase B des Stammes B12/16 (#795). Die relative Peptidase-Aktivität entspricht der prozentualen Aktivität des Optimums.

142

Anhang

Abb. 37: Nukleotidsequenz eines Teilbereiches des Inserts von Klon F13 aus Stamm B12/10-1 (#748). Erklärung zu den farbigen Nukleotiden: rot: Start- und Stoppcodon; türkis: mögliche Ribosomenbindungsstelle; gelb hervorgehoben: kodierende Sequenz des hypothetischen Signalpeptids der Peptidase ProAS(#748).

Abb. 38: Nukleotidsequenz eines Teilbereiches des Inserts von Klon F114 aus Stamm B3/1-2 (#418). Erklärung zu den farbigen Nukleotiden: rot: Start- und Stoppcodon; gelb hervorgehoben: kodierende Sequenz des hypothetischen Signalpeptids der Peptidase ProAS(#418).

GTGGTGGGTGTCTAAAATAAAGGACTAACAATGCCTAGTTAAAAAGTGTTAGATGTGAGTGAGCTGAGTCAATTAACGCATTGTAAACAATTAGTTAAAAAATTTTGGCTGACAAAAAGGTCAATAATACTAATGAATCTCCTTAATAAAGTGATTTTCACTACGGAAAAAACAGCCTTAGTTGTATAGCTTTAAAGCGTTATTGTTGATTTTTGTAGGCAATAATTGCTAATACATTTAACCATTGTAAGGAATACAATATGTTAAAGCATGCTCTTAGCTGTTGCGTCGCGTCGGCGCTGATGGCGGCATCACCCACAGCACTATCTGAACAACATGAAGGTAAACAAGGCGTCTCTCAGCAGCAAACGCTAGCGCCATTGATGGTTGCGGCGAAAAACCGGGGGATTGAGGATCAGTACATCGTGGTACTCAAGCAGCCAATGACTCTGAGTGATGATCCGCAAGCGTTGAAAACCTTTACTCAACAAGCCGTGTCTAGCATGGTTAACCAACATGCGGTTAAGGTAGAAAAAGTGTTTGATCGCTCGTTAAGTGGGTTTGTAGCTAAGCTCACACCGGCACAATTACGTGCATTACGCATGGATTCGCAAGTTGATTTTATTGAACAAGATAAGACCATTTCATTGGACCCGGTGATTACCCCTGACGCGAACCAAAATAACCCTGTTTGGGGGTTAGATCGTATTGATCAGCGCAATCTTCCTCTAGACAACAACTACAGCACTAACTTTGATGGCACAGGTGTCACTGCTTATGTTATTGATACTGGTGTGACAACGTCACATGTTGAGTTTGGTGGTCGTGCACGCTCCGGATATGACTTTGTTGATAACGATCAAGATGCGACTGACTGTAACGGCCACGGTACGCATGTGGCTGGCACCATTGGCGGTAGTCAATACGGAGTCGCTAAAAATGTCGATATTGTCGGGGTGAGGGTGCTCAGCTGTAGCGGTTCGGGGTCGACGTCCGGTGTGATTGGTGGTGTCGATTGGGTAGCAGCCAATGCGAATGGCCCGTCAGTGGCAAACATGAGCCTAGGTGGAGGCGTATCAACAGCGCTCGATCGTGCCGTTGCCAGTGCGGTACAATCTGGCGTGAGTTTTATGCTAGCAGCGGGTAACTCCAATGCTGATGCCTGTAATAGTTCGCCTGCACGAGAGCCAAGCGGTGTCACTGTAGGATCTAGCACGATTCGCGATACCCGCTCTAGCTTCTCAAACTGGGGAAGCTGCTTGGATGTGTTCGCCCCAGGATCGGACATAAAGTCCGCTTGGTATGATGGGAGTTATCGCACCATCAGCGGCACCTCGATGGCGACCCCTCATGTTGCTGGGGTTGCTGCCTTGTACCTACAAGAAAACAGCAGCCTTTCGCCTGTACAATTAGCGAATTTAATTAGCAACCGCGCGAGTGTCGATAAAATTAACGACCCTCGTGGCTCCGTCAACAAACTGTTGTATAGTCAAGCCGATAGTAGTTGTGAGCCAAATTGCGGTACAGAGCCTGATCCTAAGGGTGAGCTTAAAAATGGTCAGGCGCTAACAGATATTTCGGGTGGGCAAGGCGCCCAGCGCTTCTTCTATGTTGATGTAGACGCTGGGCAACGCCTCACGGTGAATATTAGCGGCGGCTCAGGCGATGCTGATTTGTACCTGCGCTATGGCTCAAAGCCAACCTTTAATAACTGGGATTGTCGACCGTACAATTACGGTAATAGCGAAGTGTGTACCGTGCAGAACACCCAGAAAGGTCGCTATCATGTGATGTTGAACGGCTACGCAGCATTTAGTGGTGTCAGCGTGACCGCCCGTTACTAGGCGTTTGTTGGCAATAAATAGCATTCGCTGCACGACAAGTGATGAATGGTAAGATACCGAGTTAAACGCGCGGATATGATCCGCGCGTTATTTATCAGACTTGCCGAAAACCTCTTCGTTTAGGCAGGAGAGCAGTCAATTGTAGTGGCGTATACACTTACACAGTAAATCGATAAACCCTTCTCGGTTGATTGCCATTGCAACCTCGGCATTGGCTGGATTACCTGTAACTTGATAACGATCGACCACTGTCATACCTGTTGTCAGTGCTCCCTGAGTTTCTATACCCACCCAAACGGATTCACAGTCAAAAAGCTCAGGCTTGACTAACCACGCAATCGTGCATGGATCATGTAACGGTGAGCCATCAAGTCGCCATTTAGGATCGCGATGGTAGCGCATAAAGAAATCAAGCCACCCCGCGACAGTTTGCGCGACAGGATTATTA

ATGTTAAAGCATGTTCTTAGCTGCTGTATCGCATCTGCACTCGTGACTGCTTCACCCTCTGTGCTCGCAAAACAAGAGGACGGTAAACAAGCGATTGCTCAGCAGCAAACGCTAGCTCCATTAGTGGTTGCATCAGACAAGCAGGGTATTGAGGACCAATACATTGTGGTGTTTAAGCAACCAATGACACTCAGTGATGATCCACAAGCGTTAAAAACCTTCACACAGCAAACGGTTTCCAGCATGGTCAACCAACACGCGGTTAAGGTTGAGAAAGTGTTTGATCGCTCGCTGAGTGGTTTCGTGGCCAAATTAACACCAGAGCAATTGCGTGCGCTACGCATGGATTCACAAGTTGATTTTATCGAACAAGATAAAACGATTTCCTTGGACCCGGTAATCACCCCAAACGCGAACCAGAGCAATCCAGTTTGGGGGTTGGATCGCATTGATCAACGTAACCTGCCTTTGGATAACAATTACAGTACCAACTTTGATGGTACAGGTGTGACGGCGTATGTGATTGATACTGGCGTGACAACGTCACATGTTGAGTTCGGCGGTCGTGCTCGCTCTGGCTATGATTTTGTTGATAACGACAATGACGCCTCAGACTGTAACGGTCATGGTACCCATGTGGCCGGTACTATCGGGGGAAGCCAATATGGTGTCGCCAAAAATGTCGACATTGTTGGGGTGAGAGTCCTTAGCTGTAGTGGCTCAGGTTCAACGTCCGGCGTGATTGGCGGGGTTGACTGGGTGGCAGCCAATGCCAGTGGACCATCGGTAGCAAATATGAGCTTGGGTGGCGGTGTATCAACCGCACTGGATAGAGCGGTTGCCAGTGCCGTGCAATCGGGTGTGAGCTTTATGTTGGCAGCAGGGAATTCCAATGCCGATGCATGTAATAGCTCTCCAGCGCGTGAGCCAAGCGGTGTTACCGTGGGCTCTACCACCAGCAGCGATAGCCGCTCAAGCTTCTCAAACTGGGGCAGCTGTGTCGATGTGTTTGCGCCGGGCTCTCAAATCAAGTCAGCATGGTATGACGGTGGCTATCGCACCATCAGCGGGACATCGATGGCGACCCCTCATGTCGCGGGTGTAGCGGCTTTATATTTGCAAGAAAACAGCAGCCTATCTCCTGCGCAAGTAGCAAGCTTGATCAGTAATCGTGCCAGTGTGGGTAAGATCAGTGACACGCGCGGAACGGTCAACAAATTGCTCTATAGCCAAGCTGATAGTGGCTGTGAGCCGGATTGCGGCCCGACGCCAGATCCCGAAGGTGAGCTTAAAAATGGTCAGCCTGTTACGGGCATCTCTGGTGGGCAAGGAGCGCAACGCTTTTTCTACGTGGATGTAGAAGCCGGTCAGCGCCTGAGCGTGAATATCAGCGGTGGGTCGGGTGATGCAGACTTATATGTTCGCTATGGTGCTAAACCTACGCTGTCGAGCTGGGACTGTCGTCCATACAACTATGGCAACAGTGAAGTGTGCACGGTGCAGAGCACTCAGAAGGGACGTTATCATGTCATGTTAAATGGTTATACAGCCTTTAGCGGTGTAAGCGTCACAGCACGATATTAG

143

Anhang

ATGTTAAAGCATGCTCTTAGCTGTTGCGTCGCGTCGGCGCTGATGGCGGCATCACCCACAGCACTATCTGAACAACATGAAGGTAAACAAGGCGTCTCTCAGCAGCAAACGCTAGCGCCATTGATGGTTGCGGCGGAAAACCGGGGGATTGAGGATCAGTACATCGTGGTACTCAAGCAGCCAATGACTCTGAGTGATGATCCGCAAGCGTTGAAAACCTTTACTCAACAAGCCGTGTCTAGCATGGTTAACCAACATGCGGTTAAGGTAGAAAAAGTGTTTGATCGCTCGTTAAGTGGGTTTGTAGCTAAGCTCACACCGGCACAATTACGTGCATTACGCATGGATTCGCAAGTTGATTTTATTGAACAAGATAAGACCATTTCATTGGACCCGGTGATTACCCCTGACGCGAACCAAAATAACCCTGTTTGGGGGTTAGATCGTATTGATCAGCGCAATCTTCCTCTAGACAACAACTACAGCACTAACTTTGATGGCACAGGTGTCACTGCTTATGTTATTGATACTGGTGTGACAACGTCACATGTTGAGTTTGGTGGTCGTGCACGCTCCGGATATGACTTTGTTGATAACGATCAAGATGCGACTGACTGTAACGGCCACGGTACGCATGTGGCTGGCACCATTGGCGGTAGTCAATACGGAGTCGCTAAAAATGTCGATAtTGTCGGGGTGAGGGtGcTCAGCTGTAGCGGTTCGGGGTCGACGTCCGGTGTGATTGGTGGTGTCGATTGGGTAGCAGCCAATGCGAATGGCCCGTCAGTGGCAAACATGAGCCTAGGTGGAGGCGTATCAACAGCGCTCGATCGTGCCGTTGCCAGTGCGGTACAATCTGGCGTGAGTTTTATGCTAGCAGCGGGTAACTCCAATGCTGATGCCTGTAATAGTTCGCCTGCACGAGAGCCAAGCGGTGTCACTGTAGGATCTAGCACGATTCGCGATACCCGCTCTAGCTTCTCAAACTGGGGAAGCTGCTTGGATGTGTTCGCCCCAGGATCGGACATAAAGTCCGCTTGGTATGATGGGAGTTATCGCACCATCAGCGGCACCTCGATGGCGACCCCTCATGTTGCTGGGGTTGCTGCCTTGTACCTACAAGAAAACAGCAGTCTTTCGCCTGTACAATTAGCGAATTTAATTAGCAACCGCGCGAGTGTCGATAAAATTAACGACCCTCGTGGCTCCGTCAACAAACTGTTGTATAGTCAAGCCGATAGTAGTTGTGAGCCAAATTGCGGTACAGAGCCTGATCCTAAGGGTGAGCTTAAAAATGGTCAGGCGCTAACAGATATTTCGGGTGGGCAAGGCGCCCAGCGCTTCTTCTATGTTGATGTAGACGCTGGGCAACGCCTCACGGTGAATATTAGCGGCGGCTCAGGCGATGCTGATTTGTACCTGCGCTATGGCTCAAAGCCAACCTTTAATAACTGGGATTGTCGACCGTACAATTACGGTAATAGCGAAGTGTGTACCGTGCAGAACACCCAGAAAGGTCGCTATCATGTGATGTTGAACGGCTACGCAGCATTTAGTGGTGTCAGCGTGACCGCCCGTTACTAG

Abb. 39: Nukleotidsequenz eines Teilbereiches des Inserts von Klon F9 aus Stamm B12/16 (#795). Erklärung zu den farbigen Nukleotiden: rot: Start- und Stoppcodon; gelb hervorgehoben: kodierende Sequenz des hypothetischen Signalpeptids der Peptidase ProAS(#795).

144

Anhang

10 20 30 40 50 60 70 80 90

MLKHALSCCVASALMAASPTALSEQHEGKQGVSQQQT--LAPLMVAAKNRGIEDQYIVVLKQPMTLSDDPQALKTFTQQAVSSMVNQHAVK1 ProAS(#418)-MRKTYWLMALFAVLVLGGCQMASRSDPTPTLAEAFWPKEAPVYGLDDPEAIPGRYIVVFKKGKGQSLLQGGITTLQARLAP QGVVMRLSVLLSLLP LALGAPAVEQRSEAAP-LIEARG EMVANKYIVKFKEGSALSALDAAMEKISGKPD

-----1 Aqualysin I- -- ------------ ----------1 Proteinase K

100 110 120 130 140 150 160 170 180

VEKVFDRSLSGFVAKLTPAQLRALRMDSQVDFIEQDKTISLDPVITPDANQNNPVWGLDRIDQRNLPLDNNYSTNFDGTGVTAYVIDTGVT 89K------ ATQSPAPWGLDRIDQRDLPLSNSYTYTATGRGVNVYVIDTGIR 85

-- A------ AAQTNAPWGLARISSTSPGTSTYYYDESAGQGSCVYVIDTGIE 66VTQAYTGALQGFAAEMAPQALEAFRQSPDVEFIEAD VVRAWHVYKNVFSGFAATLDENMVRVLRAHPDVEYIEQD VVTIN

190 200 210 220 230 240 250 260 270

TSHVEFGGRARSGYDFVDNDQDATDCNGHGTHVAGTIGGSQYGVAKNVDIVGVRVLSCSGSGSTSGVIGGVDWVA-----ANANGPSVANM180TTHREFGGRARVGYDALGGNG--QDCNGHGTHVAGTIGGVTYGVAKAVNLYAVRVLDCNGSGSTSGVIAGVDWVT-----RNHRRPAVANM170ASHPEFEGRAQMVKTYYYSS---RDGNGHGTHCAGTVGSRTYGVAKKTQLFGVKVLDDNGSGQYSTIIAGMDFVASDKNNRNCPKGVVASL149

280 290 300 310 320 330 340 350 360

SLGGGVSTALDRAVASAVQSGVSFMLAAGNSNADACNSSPAREPSGVTVGSSTIRDTRSSFSNWGSCLDVFAPGSDIKSAWYDG--SYRTI266SLGGGVSTALDNAVKNSIAAGVVYAVAAGNDNANACNYSPARVAEALTVGATTSSDARASFSNYGSCVDLFAPGASIPSAWYTSDTATQTL254SLGGGYSSSVNSAAARLQSSGVMVAVAAGNNNADARNYSPASEPSVCTVGASDRYDRRSSFSNYGSVLDIFGPGTSILSTWIGG--STRSI237

370 380 390 400 410 420 430 440 450

SGTSMATPHVAGVAALYLQENSSLSPVQLANLISNRASVDKINDPR-GSVNKLLYSQADSSCEPN--CGTEPDPKGELK-----NGQALTD355NGTSMATPHVAGVAALYLEQNPSATPASVASAILNGATTGRLSGIGSGSPNRLLYSLLSSGS345SGTSMATPHVAGLAAYLMTLG-KTTAASACRYIADTANKGDLSNIPFGTVNLLAYN----------------------------NYQA.326

GSTAPCTSCSYYTGSLSGPGDYNFQPNGT

460 470 480 490 500 510 520 530 540

ISGGQGAQRFFYVDVDAGQRLTVNISGGSGDADLYLRYGSKPTFNNWDCRPYNYGNSEVCTVQNTQKGRYHVMLNGYAAFSGVSVTARY.438436

ProAS(#418)Aqualysin IProteinase K



ProAS(#418)Aqualysin I


YYYSPAGTHRAWLRGPAGTDFDLYLWRWDGSRWLTVGSSTGPTSEESLSYSGTAGYYLWRIYAYSGSGMYEFWLQRP.

Abb. 40: Alignment der Aminosäuresequenz von ProAS(#748), Aqualysin I und Proteinase K. Homologe Bereiche sind mit einem schwarzen Kasten umschlossen. Die Sequenzen der in Aqualysin I und Proteinase K nachgewiesenen N-terminalen Propeptide (Siezen & Leunissen, 1997) und des in Aqualysin I nachgewiesenen C-terminalen Propeptids (Terada et al., 1990) wurden rot markiert. Die Cysteinreste für eine hypothetische (in ProAS(#748)) bzw. nachgewiesene (in Aqualysin I) SH-Bindungsstelle wurden blau hervorgehoben. Grün markiert sind die Aminosäurereste der katalytischen Triade. Die konservierten Regionen, die der Einteilung der Subtilisin-ähnlichen Peptidasen in 6 Familien nach Siezen & Leunissen (1997) zugrunde liegen, wurden gelb hervorgehoben.

145

EErrkklläärruunngg ggeemmääßß §§ 66 AAbbss.. 55 ddeerr PPrroommoottiioonnssoorrddnnuunngg ddeerr UUnniivveerrssiittäätt BBrreemmeenn ffüürrddiiee mmaatthheemmaattiisscchheenn,, nnaattuurr-- uunndd iinnggeenniieeuurrwwiisssseennsscchhaaffttlliicchheenn FFaacchhbbeerreeiicchheevvoomm 55..77..11998855

Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Dissertation mit dem Titel Heterologe Expression und biochemische Charakterisierung von extrazellulären Peptidasen aus halotoleranten bzw. halophilen Bakterien in Hinblick auf ihre biotechnologische Nutzung selbstständig verfasst und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe. 28355 Bremen, im Januar 2007

(Helge Mühl)

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Documents

Heterologe Expression und biochemische Charakterisierung ...elib.suub.uni-bremen.de/diss/docs/00010962.pdf · dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat Phenanthrolin 1,10-Phenanthrolin