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Histochemische Untersuchung der Alcianblaufiirbung mesenchymaler Gewebe Von

K~Avs L o ~ z Aus der II. 5ledizinischen Klinik und Poliklinik der Freien Universit~t Berlin (Direktor: Prof. Dr. G. SCHETTLER)

Seit e inem guten J a h r z e h n t (VI~LLI, 1951) d ien t Ale ianblau in der t l i s to log ie zur Dars te l lung yon Po lysaeehar iden a n d wi rd yon verschiedener Seite (Rizzo~I 1955; H ] ~ l ~ ] ~ s u n d V~]~I¢SIA~" 1958) ztun spezifisehen Naehweis saurer Mueopolysacehar ide be- nutz t . E ine einheit l iche Ans ich t iibe~ die his toehe- misehe Bedeu tung dieses Farbs to f f s bes t eh t b isher jedoeh n ieht (P~Alcsv, 1953 u. 1954; L l s o ~ 1954; G ~ et al. 1952; RI~'~ '~ u. 3~ ta rb . !956). ~ t dieser Arbe i t soil daher ein Be i t r ag zur F r a g e der spezifisehen Anfa rbung mi t Alc ianblau gegeben werden.

Material und Methoden Als S u b s t r a t d ien ten Knoehenzy l inde r aus dem

Beekenkamm, da sie die gMchzei t ige UIl tersuehung folgender Gewebe in demselben Sehn i t t zulieBen: Knoehen , Knorpe l , Per ios t (Kollagen), Mark (Reti- culumzel len un4 -fasern, E r y t h r o e y t e n und kernhal~ige Zeilen der H~matopoese) , kleinere Gefi~Be a n d teilweise Ske le tmuskn la t a r .

Es wurden insgesamt etwa 125 Pri~parate yon Knochen- zylindern angefeI4igt, die bei 5 verschiedenen Patienten aus diagnostisehen Griinden intravital entnommen wnrden, aber eine normale Knochenstruktur aufwiesen and bei der Azan- f/~rbung ein unauffMliges, histologisehes Bild boten. Auf Me- rhode und Aeidit~tsstufe entfielen somit jeweils 4--5 ver- sehiedene Schnitte.

Naeh zweitiigiger Formalin(l:9)-Fixierlmg ~-arden die Knochen elektrolytisch entkalkt, sodann gew/~ssert, ent- wa.ssert und naeh Einbringen in hartes ParMfin mit einer Dieke yon 8 # geschnitten (ROMnlS).

Bei jeder der nachstehend aufgefiihrten Methoden wurde in 4 Acidit~tsbereichen gearbeitet: pt~ 1,5 (Citrat-SMzsiiure- puffer naeh S61~l~S~) ; pI~ 3,0, p~ 3,8 und pI~ 5,7 (Phosphat- Citratpuffer nach I~lcI~Vxt~.). tIerstellung der L6sungen siehe HI~SBnRo-L~.

F~Lrbung (0,5 To ige LSsung yon Aleianblau, Bauer 120 mill, Temperatur 20°)und Differenzicrung (Dauer 20 rain, Tempera- tar 20 ~) erfolgten bei dem gleiehen pl~ in den angegebenen Puffern. Die aus ihnen entnommenen Pr~o~rate konnten dar- auf unmittelbar mit I~vulose eingedeckt werden.

Es wurden folgende Verfahren angewendet: 1. Aleianblau ohne Vorbeh~ndlung.

2. Einwirkung von Hyaluronidase (Kinetin ,,Schering") 1200 IE auf 100 ml, Dauer 180 rain, Temperatur 32 o C, PH 5,9.

3. Sulfonierung nach GO~mRI (Sehwefelsi~ure 96 %it, 20 ml, und ~ther 80 ml) Dauer 150 rain, Temperatfir 200 C.

4. Anilinblockade nach LILLI~ und GI~]~ I~ (Anilin 19 ml und Eisessig 181 ml) Bauer 240 min, Temperatur 20 ° C.

5. Aeetylierung naeh MeMn_~vs und CAso~ (Pyridin 60 ml und Essigs~ureanhydrid 40,5 ml) Dauer 150 mill, Tempera- fur 200 C.

6. Methylierung nach F~Sl~nR und LILLIE (0,25%ige Satz- s~Lure in Methanol=0,07 nHC1) Dauer 240 rain, Temperatur 580 C.

7, Perjods~ure-Oxydation (1%ige Perjods~ure in w~Briger LSsung) Bauer 30 rain, Temperatur 200 C, pH 5,8.

Ergebnisse ~Vie e ingangs erwfi.hnt, lassen sich innerhMb eines

P r~para te s verschiedene Bindegewebss t ruk tu ren be- urteflen. Knochengewebe zeigt bei p~ 1,5 f ibe rhaup t keine Anf~rbung, bei P~r 3,0 nu r nach vorher iger Sulfonierung. VC'ird bei e inem PH yon 3,8 gearbei te t , so s ind die sulfonier ten u n d die m i t Per jods~ure oxy- d ie r ten Sehni t te dunkler gef~rbt als die Kon t ro l l en a n d die mi t t t y a l u r o n i d a s e behande l t en Pr~.parate. Anf l inbloekade h e m m t die A lc i anb lauaufnahme deut - lich, Aee ty l i e rung a n d ' Methyl ie rung ve rh indern sic vSllig. E r s t bei e inem pi t yon 5,7 erfolgt, m i t Ausnahme d e r me thy l i e r t en Pr~para te , d ie farblos b le iben und der aee ty l ie r ten , die sichtl ich weniger Fa rbs to f f auf- n e h m e n , / i b e r a I l dunke lb laue Anf/£rbung.

I m Gegensatz zum Knochen is t hya l iner K norpe l sehon bei p ~ 1,5 deut l ich blau. Ani l inb loekade a n d Acety] ie rnng hemmen die Anfi~rbung par t ie l l , Me- thy l i e rung to ta l . Bei p ~ 3,0 ver l ie r t Anitin, bei p ~ 5,7 Ess igs~ureanhydr id seine Hemmwirkung . Einz~g die MethylMkohol -Sa lzs~ure-Vorbehandlung blockier t in al len Acidit~.~sbereichen die Aufnahme yon Aleian- blau,

Ein ~hnliches VerhMten zeigen die kollagenen Fa- sern des Per ios ts und der Adven t i t i a . Auch hier ver- h inde r t die Methyl ie rung in Mien un te r such ten pH- Stufen die Anfgrbung vSllig, d ie Aee ty l ie rung se tz t sie

Jg. 40, Heft 13 KLAUS LOtI~ENTZ: H i s t o c h e m i s c h e Untersuchung der Aleianblaufi~rbung mesenchymaler G e w e b e 697 1. Juli 1962

deutlich herab, w/~hrend die Anilinbloekade nur noch geringe Hemmwirkung zeigt, und die Sulfonierung die Aufnahme des Farbstoffs, besonders unterhalb PH 3,8 eindeutig erh6ht. Eine l~bersieht gibt die folgende TabeIle.

Tabelle. Verhalten einiger Stiitzgewebe gegeniiber Alcianblau bei verschiedener Vorbehandlung

B1/tu- Gewebe p~ ]~lau Hellblau lieh Farblos

Knoehen

Knorpet

Kollagen

I~eti- culum

1,5 3,0 3,8 5,7

1,5 3,0 3,8 5,7

1,5 3,0 3,8 5,7

1,5 3,0 3,8 5,7

3,7 3, 7, 1, 2

3, 7, 1, 2 3, 7, 1, 2, 4 3, 7, 1, 2, 4 3 ,7 ,1 ,2 ,4 ,5

3 3,1 3,7,1,2 3,7,1,2

3, 7, 1, 2, 4, 5

,2 I 4

4, 5

o

7, 1,2,4 7,2,4 4 4,5

3, 7, 1, 2, 4, 5, 6 7,1,2,4,5,6 5,6 6

3, 7, 1, 2, 4, 5, 6 7, 1, 2, 4, 5, 6 1, 2, 4, 5, 6 6

1 =Kontrolle; 2=Hyaluronidase; 3=Sulfonieru~g; 4 = Anilinbloekade; 5 = Aeetylierung; 6 = Methylierung; 7 = Per- jods&ureoxydation.

Die Retieulumfasern des Knoehenmarks und die Media yon Gefggen lassen keine unterschiedliehe Wir- kung der einzelnen Verfahren erkennen. Aueh hier fiihrt die Methyliernng zu einer totalen Blockade der Aleianblaufi~rbung bis einsehlieBlich p g 5,7.

Ebenso weisen die einzelnen Vorstufen der Hgmato- poese gegenfiber den versehiedenen Vorbehandhmgen ein ziemlich einheitliehes Verhalten auf. Bis p~ 3,0 sind Plasma und Kerne der Zelle sgmtlieh farblos, bei pH 3,8 noah die mi t Perjods£ure, Anilin, Essig- s/~ureanhydrid und Methylalkohot-Satzsi~nre vorbe- handel ten Pr~parate. I m Bereich yon p g 5,7 lassen sieh Plasma und Zellkerne aussehlieglieh der unge- ffirbten methyl ier ten Schnit te unterschiedslos s tark anfarben, lediglich die Per jodsgnreoxydat ion ver- minder t gering die Farbintensi tgt . - - E ry th rocy t en f~rben sieh einzig bei p~ 5,7 naeh vorheriger Sulfonie- rung sehwaeh an.

Diskussion

Allen untersuehten Geweben ist die to,ale Blockade der Aleianblauf/~rbung dureh Methyliernng gemeinsam. Dieses I~esultat kann als Folge der Vergnderung yon Sutfos/~uregruppen im Subst ra t be t rachte t werden, da naeh Angaben yon F~s~n~ und L~LL~E (1954) t texos- aminsehwefels/~ure bei dem vorstehend beschriebenen Verfahren bIockiert wird. Derselbe Effekt t r i t t bei 1,2-Glykol-Verbindungen, Phosphors/ iuregruppen und der Feulgensehen Nuelealreaktion erst nach l~ngerer Einwirkung auf. Einen weiteren Hinweis ffir die wesenttiehe Bedeutung yon Sulfos/~ure-I~adikalen bei der Aleianblauf/irbung liefert aueh der Ausfull der Sulfonierung. Dureh sie nehmen manche Gewebe

gegeniiber den unbehandel ten Prgpara.ten sehon bei niedrigerem pg Farbstoff auf, E ry th roey ten lassen sich f iberhaupt erst bei p~ 5,7 anf~.rben. Gegenfiber der Wirkung des Sehwefets~ure-J~ther-Gemisehes sind die anderen Verfahren zu vernaeht~ssigen. Am ehesten lgBt noeh die Aeetytierung, welehe Amino- und Glykolgruppen erfagt, eine Verminderung der F~rbungsintensi t~t erkennen, vor allem beim Knoehen und Kollagen. Aldehydgruppen dfirften noeh weniger die Aleianblauf~rbung beeinflussen. Ihre Bloekierung dureh Anitin hemmt die Anfgrbung nnr gering, ihre Synthesc dutch Per jodsgure-Oxydat ion steigert sie nicht nennenswert. Hyaluronidase ist wirkungslos.

Auffatlend ist der EinfluB der Wasserstoffionen- konzentrat ion. McMAsus (1954) sah daher aueh die Darstellung saurer Mueopolysaceharide mit Aleian- blau in saurem Milieu ffir spezifiseh an. Naeh dan hier mitgetei l ten Ergebnissen fehlen sic somit im aus- gereiften Knoehen, ein Befund, der sich mi t S o e ~ A n s ' (1955) Beobaehtungen fiber die Metachromasie mi t Toluidinblau und Basophitie bei Methylenblauf£r- bung deekt.

Zu~ammen/assung

Anhand versehiedener Bloekierungsversuehe konnte gezeigt werden, da~ die Aleianblauf/~rbnng einiger mesenchymaler S t rukturen wesentlieh yon ihrem Ge- halt an Sehwefels~are-Radikalen abhfi~ngt. Geringere Bedeutung k o m m t dan Amino- und Glykolgruppen zu, Aldehyde sind praktiseh unwesentlieh.

Die eindrueksvotle p~-Abh£ngigkei t der F/irbung wird hervorgehoben.

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