Histochemische Untersuchungen über das Inselzink

Zeitschrift fiir die gesamte experimentelle Medizin, Bd. 124, S. 236--256 (1954).

Aus der Medizinischen Universitats-Poliklinik Marburg a. d. Lahn (Direktor: Prof. Dr. H. SCHWlEGK).

Histochemische Untersuchungen fiber das Inselzink%

Yon

It . WOLFF und D. RIN~LEB.

Mit 18 Textabbfldungen (davon 9 farbig).

(,Eingegangen azn 24. Februar 1954.)

A. Einleitung und Problemstellung.

Exper imente l le Un te r suchungen der le~zten Jahre Iegen die Ver- m u t u n g nahe, dab die Z inkvorkommen in den Lal~G~l~HA~sschen Inse ln des Pankreas aufs engste mi t ihren innersekretorischen Aufgaben ver- knfipft sind. Sic Stfitzt sich auf folgende in Kfirze wiedergegebenen Beobach tungen :

1. Nach der Pyridin-Brucin- oder der Saponinmethode gewonnene Insulinkristalle enthielten stets Zink (ScoTw 1934). Der Kristalisierungsvorgang war yon der Gegen- wart kleinster Zinkmengen, ersatzweise auch Kobalt oder Cadmium, abh~ngig (SCOTT 1934). Die Kristalle schienen Zink nicht als Verunreinigung, sondern ~ls chemiseh gebundene Bestandteile zu enthalten (SCOTT u. FISI~nI~ 1935, a). Durch sts Zinkzus~tze (400--1000 mg Zn/1000 E Insulin) wird die Insulinwirkung retardiert (SCOTT U. FISHER 1935, b). :Die Erscheinung wird durch die Beobachtung erklart, dab Zinkionen bei PH 7 die LSslichkeit des Insulins bis zu seiner F~tllung ver- schlechtern (BIscHoFF U. JEMTEGARD 1937, SAHYUN 1939, AV~ERTIN, SERVA~TI U. C~SS~GNETTE 1939, HALLAs-MoLLER, PETERSEN U. SCHLICHTKI%ULL 1951, 1952).

2. Die 1938 yon SCOTT U. FISHE~ geaul~erte, 1941 Yon EISENBRAND U. SIENZ widerlegte Vermutung, dalB Pankreasorgane yon Diabetikern elnen gegeniiber der Norm erniedrigten Zinkgehalt besa~en, lenkte die Aufmerksamkeit auf das Pan- kreaszink.

3. Die histochemische Sichtbarmaehung des Gewebszinks mittels Diphenylthio- karbazid wies starkste Anreicherung des Metalls in den LANGE~HANsschen Inseln nach (OKA~OTO 1942, 1943). Das Verhalten des ,,Inselzinks" zeigte eine quantitative Abhangigkeit yon den Bewegungen des Kohlenhydratstoffwechsels: Zunahme im Hunger, Abnahme nach Kohlenhydmtmahlzeiten, sowie oralen und parenter~len Glucosebelastungen (OKAMOTO 1942, 1943, 1949, bestatigt dureh STAMPFn 1952 U. MASKE 1952, 1953). Dureh direkte ehemische Analyse wurde der Zinkgehalt isolier- ter Inselorgane yon Knochenfisehen bestimmt. Diese enthielten fund 100--1000 Zn/g frischem Inselgewebe, wahrend der entspreehende Wert im exokrinen Pan- kreas nur rund 20--30 y .Zn/g betrug. (W~ITZEL, STREC~E~, ROESTE~, F~ETZ- DORFF U. BUDI)ECKE, 1953 )

* Durchgefiihrt mit Unterstfitzung der Deutsehen Forsehungsgemeinschaft.

Histoehemische Untersuehungen tiber das Inselzink. 237

4. Dureh i. v. Injektion zinkaffiner MetMlreagentien-- z. B. Dithizon, Alloxan 1 und Oxin - - warden lOassagere und permanente Formen yon experimentellem Pankreas- diabetes erzeugt (OKA~OTO 1949, KADOT~X 1950, KADOTA U. MIDOI~IKAWA 1951, WOLFF 1952).Die vermutete Reaktion zwischen Zink und den genanntenVerbindungen konnte im Blur, Geweben und besonders den Inseln naehgewiesen werden (WOLF F u. MASl~. 1951, WOLFF, M_aSI;E, STAMPFI~ U. BAInUGAI~T~ 1952, WOLFF 1952). Ferner konnte gezeigt werden, dab das Inselzink Ms Leitsubstrat fiir die Anreicherung der cytotoxischen Metallreagentien in den B-Zel]en wirkt, und dab seine experimentelle Entfernung die diabetogene Wirkung anschliel3end verabreichter Alloxun- oder Dithizongaben anfhebt. (WOLFF 1952, MASKE, WOLFF U. STA~PEL 1953).

5. Die initiMe Hyperglykgmie yon Handelsinsulinen und die blutzuckersteigernde Wirkung yon Glukagonprgparaten wurde auf die Gegenwart eines spezifi- sehen Zink-Komplexes (Zink-peptid) zurtiekgeftihrt. ~hnliehe hyperglyk~mi- sierende Effekte tiefien sieh dureh bestimmte, synthetisch gewonnene Zink-Kom- p!exverbindungen auslSsen. (WErrZEL 1952; WEITZEI~, STI~EOKEI~, FRETZDOI~FF U. ROESTE~ 1953; WmTZEL, STI~ECKER U. t~O~STE~ 1953.)

Diese Befunde s tel len die F r a g e naeh der B e d e u t u n g des Inse lz inks fiir die inkre tor i sehe Pankreas funk t ion . Ih re Diskuss ion seheint wenig er fo lgverspreehend, solange die Z inkver te i lung au f die A- und B-Zel len und die q u a n t i t a t i v e n Beziehungen zwisehen Inse lz ink und Inse lwirk- stoffen in Abh~ng igke i t yon versehiedenen F u n k t i o n s z u s t ~ n d e n des I n s e l a p p a r a t e s ungeni igend b e k a n n t sind. Hierbe i kann aueh n ight au f Un te r suehungen der verg le iehenden Cytologie und Physiologie ve rz ieh te t werden, da fr i ihere Beobaeh tungen 0KAMOTOS (1942/43) grebe Verhal- tensdif ferenzen des Inse lz inks bei verseh iedenen T ie ra r t en v e r m u t e n lassen.

I m I ~ h m e n dieser P rob lems te l lungen sell d~her 1. die Gegenwar t yon Zink in den Inse ln verseh iedener T ie ra r t en und

seine Ver te i lung auf die A- und B-Zel len sowie 2. das VerhMten des Inse lz inks einzelner T ie ra r t en in Abh~ng igke i t

yon versehiedenen, den I n s e l a p p a r a t t ref fenden Funk t ions re i zen wie Hunger , S t anda rd f t i t t e rung , Glucose-, Adrena l in- und Insu l inbe las tungen sowie naeh Sympath ieus - und Pa ra sympa th i e us r e i z ung un te r sueh t werden.

B. Versuehstiere und Methodik.

Versuchstiere. ~ischrassige Hunde (10--28 kg), misehrassige Kaninehen (2000 bis 4000 g), mischrassige Meersehweinchen (500--800 g), Albinoratten (200~350 g) und Albinom~use (2"5--50 g).

Histochemisvhe Zinkd, arstellung. Die ange~trebte topographische Einordnung des Zinks in das Zellbitd der Inseln setzt einen enapfindlichen histoehemischen Naehweis voraus, der eine Sichtbarmaehung des Metalls am Ort seiner Abl~gerung und in einem strukturell unver~nderten Gewebe erm6glieht, ttierftir zeigte sieh der yon uns in friiheren Untersuehungen benutzte Zinknachweis mittels Diphenylthio- karbazid naeh OK~I~IOTO (19~2/43) wenig geeignet, da seine Sensibilitat gering ist,

Allox~n reagiert naeh DELUGES (1910 a, b) mit Zink in sehwaeh alkalisehem Milieu unter Bildung orangegelber Komp]exverbindungen.

z. exper. Med., l~d. 124. 16

238 H. WOLFF und D. RI~OLEB:

und die Feinstruktur der Inseln durch die FixierungsmaSnahmen erheblich ver- gndert wird. Es wurde daher nach einem histoehemischen Zinknachweis gesueht, tier sieh intravital vollziehen lgl3t. Eine Zufallsbeobachtung im Laufe frfiherer Untersuehungen fiber Dithizondiabetes vermittelte die LSsung (WolFF, MASKE, STAr, St, U. BAU~rGAI~TEN 1952): Hier wurden im Anschlul~ an die intravenSse Injektion wgBriger Dithizonl6sungen auf der Pankreasoberflgehe kleinste Fleck- chert yon tier GrSl~e und raumlichen Anordnung tier Inseln und der Purpurfarbung eines Metalldithizonats sichtbar. Im nativen Gefrierschnitt zeigte sieh innerhalb der Inseln ein scharf begrenztes, granular abgelagertes, intensiv rotviolett gef/~rbtes Metalldithizonat. Da bei der scbwach alkalischen Reaktion des physiologischen Milieus neben Zink such Blei, Kobalt und Cadmium ~thnlich gefarbte Dithizonate bilden, wurde versucht, die Zinkspezifit~t der Reaktion durch die folgenden Unter- suchungen zu klgren:

a) Durch Gangunterbindung wurde das exkretorische Pankreasparenchym yon 2 Hunden zur VerSdung gebraeht. Irn Homogenisat des restlichen, aus Bindegewebe und zahlreichen Inseln bestehenden Stranges wurden bei beiden Tieren die Konzen- trationsverhMtnisse yon Zn, Co, Pb und Cd emissionsspektographiseh untersueht.

Anregungsverfahren: WechselstromabreiBbogen (PFsILSTICKEg) 5A/230V, Koble- elektroden.

Analysenlinien: Zn 1 2138,5 A Co 1 3453,5 Co 1 3405,1 -~ Pb I 3639,6 A Pb I 2833,1 J~ Cd 1 3610,5 A Cd I 3261,1 J~

Ergebnis: Die Konzentrationsverh&ltnisse der analysierten Metalle ver- hielten sich im Mittel ~Je 100 Zn: 1,5 Co: 0,2 Pb : 0,0 Cd.

b) Bei Kaninchen wurde nach 72stfindigem Hunger je 200 mg/kg Dithizon in w/~$riger L6sung i. v. injiziert und das Auftreten einer kr~ftigroten Dithizonreaktion an der Pankreasoberfl~ehe gesichert. Nach ttomogenisierung des Organs erfolgte Extraktion des Farbstoffes mit Tetraehlorkohlenstoff und ~essung der spektra]en Absorption im sichtbaren Bereich. Die Extinktionskurven ergeben in jedem Fa]le ein reines Zinkdithizonat 1 ohne Beimischungen der ebenfalls in CC14 16sliehen Dithizon- koraplexe yon Co, Pb und Cd (s. Abb. 1).

Die in den Pankreasinseln abgelaufene Dithizonreaktion darf somit a]s spezifisch ffir Zink gelten. Die intravitale Anf~rbung des Metalls mittels intravenSser Dithizon- injektion wurde daraufhin routinem~l]ig ffir den histochemischen Zinknachweis ver- wendet. Sie ist inzwischen aueh yon STAMPrL (1952) und MASKE (1953) mit Erfolg zum Studium des Inselzinks bentitzt w6rden.

Arbeitsvorschrifl. Diphenylthiokarbazon (D) feinst pulverisieren, 200 mg/kg Versuehstier einwiegen, mit konzentriertem Alkoho] zu einer dicken Paste anrfihren, 1--2 Tropfen 1:10 verdfinnter NH~OI-I/50 mg D zusetzen und 3--4 ml heil]en 96%igen Alkohol/50 mg D tropfenweise unter Rfihre n zugebe n. Danaeh ca. 10 ml beiSes aqua dest. portionsweise unter Rfihren zulaufen lassen, 10--15 min im Wasserbad yon 70~80 ~ erhitzen. Dutch Faltenfilter filtrieren, Rfickstand trocknen, einwiegen und ge]6ste Dithizonmenge berechnen. Endvolumina ca. 3,~ der Aus- gangslSsung, Alkoholgehalt auf ca. 30--400/o der Ausgangsmenge abgedampft. Langsam und unter Atemkontrolle kSrperwarm i.v. injizieren. TOtung 3--10 min post inject. Bei einwandfreier Technik zeigen sieh bereits makroskopisch nach Er-

1 ])as gleiche Ergebnis erhielt nach persOnlicher Mitteilung STAM~FL.

Histochemisehe Untersuehungen fiber das Inselzink. 239

5ffnung der BauchhShle die Zeichen der vollzogenen Dithizonreaktion: griines Fett- gewebe, himbeerfarbenes Ileum und Pankreas, an dessen Oberflache die Inseln als feinste Purpurfleeken sichtbar werden. In sofort angcfertigten, mit Glycerin oder 0,9%iger NaC1-LSsung eingedeckten Nativgefrierschnitten lassen sich die 5rtlichen Zinkvorkommen bei allen VergrSl3erungen einwandfrei studieren. Der Farbstoff wird durch organische LSsungsmittel leicht eluiert. Er verblal~t yon selbst ira Laufc yon Stunden. Die quantitative Darstellung des Insclzinks gelingt im allgemeinen yon 50 mg D/kg ab. Aus Sicherheitsgrfinden empfiehlt es sich ]edoeh, Dosen yon 100--150 mg D/kg zu injizieren. Es sind dann s~imtliehe Inseln des Pankreas mit geringen, durch ihren jcweiligen Funktions- zustand bestimmten Intensit~tsunterschie- den eptimal angefgrbt.

Histologische Inseldarstellung. Differen- tialfarbung mit Chromalaunh/~matoxy]in- Phloxin nach Go~oRz.

Capillardarstellung. Intraaortale Injek- tion von mit RingerlSsung verdfinnter und mehrfach filtrierter Perltusehe.

Blutzuc]cer. Nach ttAO~DO~-J]~SE~-.

Abb . 1. S p e k t r a l e A b s o r p t i o n des r e i n e n Z ink - 4 i t h i z o n a t s u n d des n a c h i n t r a v e n 6 s e r I n j e k - t i o n Yon D i t h i z o n i n den LANGEPdtANSSC]len In - se ln g e b i l d e t e n Fa rbs to f f s . A . . . . . . Te t r a - c h l o r k o h l e n s t o f f e x t r a k t y o n h o m o g e n i s i e r t e m K a n i n c h e n p a n k r e a s (pit 7,8) n a e h i. v . I n j e k - t i o n y o n 200 m g D i t h i z o n / k g . B - - Syn- t h e t i s c h e s Z i n k d i t h i z o n a t i n T e t r a c h l o r k o h l e n -

s to f f ge lSs t . E E x t i n k t i o n .

E

O,5

o,3

o,2

o,I :fir

i I

C. Untersuchungen fiber das Inselzhik.

I. Vorkommen yon histochemisch nachweisbarem Zink in den Pan/creas- inseln verschiedener Tierarten und seine Verteilung au/ das Inselzellbild.

1. K a n i n c h e n . Be i 24 K a n i n c h e n w u r d e das I n s e l z i n k n a c h m e h r -

t~tgiger a u f das G e w i e h t b e z o g e n e r S t a n d a r d k o s t 1 m i t Hi l fe des be-

s e h r i e b e n e n Ver f ah rens da rges te l l t . H i e r b e i w u r d e n fo lgende E rgebn i s s e

e rz ie l t :

Nfichternperiode Tierzahl Zinkdarst ellung ante inject. r (+ ) +

O h 6 - - - - 6 8 h 8 - - 8

]2 h 10 - - - - 10

= negativ, (+ ) = fragtich bis schwach positiv, + = positiv.

Be i a l len 24 T i e r e n fund sieh m i t i n d i v i d u e l l e n S c h w a n k u n g e n eine

k r~f t ig p o s i t i v e Z i n k r e a k t i o n . Zur g e g i s t r i e r u n g fe ine re r q u a n t i t a t i v e r U n t e r s e h i e d e des Inse lz inks be i d e n e i n z e l n e n T i e r e n u n d B e o b a c h t u n g s -

g r u p p e n r e i ch t e j e d o c h die v i sue l le K o n t r o ] l e n i e h t aus. D e r u r t i g e

1 Hafer, Kohlbl&tter, tteu.

Z. exper , ivied., Bd. 124. 16"

240 H. WOLFF und D. RI~aLEB:

Abb. 2

Abb . 3

A b b . 4

A b b . 2---4. K a n i n c h e n i n s e l n n a c h i n t r a v i t a l e r Z i n k d a r s t e i l u n g . 150 m g D i t h i z o n / k g , ~ a t i v g e f r i e r s c h n i t t , 20 /~. A b b . 2. l l 0 i a c h , A b b . 3. 450fach , A b b . 4. 1050f&ch.

Histoehemisehe Untersuchungen fiber das Inselzink. 241

Frages te l lung dfirfte sich im Fa l le des Kan inchens nu r durch objek t ive , d. h. h i s topho tomet r i sche Messungen beur t e i l en ]assen.

Die Anordnung des Zinks im Gefr ie rschni t t i s t aus Abb. 2 - 4 ersicht- lich. Bei schwacher VergrSI~erung erscheinen die Inse ln als v iole t te , grob gekSrn te F lgchen. Bei s tg rke ren VergrSl3erungen zeigt sich eine in t ra - cellulgre, cap i l la rnahe A n o r d n u n g v io le t tge fgrb te r Granula , die die Ge- fgBe fSrmlich e inscheiden (s. bes. Abb. 3). Ob die Z inkvo rkomlnen nur in cap i l l a rnahen Zel]antei len abge lager t sind, oder ob das F a r b r e a g e n s bei seiner Diffusion in die Zelle nur die cap i l l a rnahen Granu]a erreicht , geht aus diesen Bi ldern zungchs t n ich t hervor . Ebensowenig g e s t a t t e t be im K a n i n c h e n der Vergleich der rguml ichen Zinkver~ei lung mi t der Ze l lanordnung im Dif ferent ia lb i ld nach Go•oa I eine Zuordnung des Metal ls zum A- oder B-Zel l sys tem. Die A-Zel len l iegen be im K a n i n c h e n zumeis t gruppenweise in den gul3eren Inse lbez i rken , im Inne ren f inden sie sich seltener. E in en tsprechendes Ver te i lungsmus te r zeigt sieh bei der Dars te l lung des Inselzhlks n ich t (s. Abb . 5). Eine Zuordnung des Metal ls zu den Ze l l typen ]iel~ sieh jedoch auf folgende Weise er re iehen:

a) Zinkdarstellung nach B-Zellzerst6rung. Bei 16 yon 22 Kaninchen wurde durch hohe Alloxandosen (200 mg/kg) ein schwerer Alloxandiabetes mit tiglichen Blut- zuekerwerten yon 400--800 rag-% erzeugt. 6--8 Tage post inject, wurden die Tiere nach Ditbizongabe get6tet und Zinkfirbung und histo]ogische Struktur der Insel- reste kontrolliert. Zur Auswertung wurden nur Tiere benutzt, deren A-Zellanteil veto Normalwert - - ca. 20o/0 der Insehl - - auf 90--100 % vermehrt war, d. h. Tiere, bei denen die geschrumpften Inselreste praktisch frei yon B-Zellen waren und keiner- ]el Reste yon B-Zelldetritus enthielten. Unter diesen Umstgnden waren die massiven violetten Zinkreaktionen der Normaltiere verschwunden. Dagegen zeigten die iibrig- gebliebenen A-Zellkonglomerate eine homogene, zarte Zinkan/~irbung, die sich bei ent- spreehender Vergr58erung in feinste, blal3rose Granula innerhalb des Cy~oplasm~s der A-Zellen auflSste.

b) Zinkdarstellung naeh A.Zellzerst6rung. Bei 5 Kaninchen wurde eine ZerstSrung der A-Ze]len dureh inbravenSse Kobaltehloridgaben nach GOLDNEI~, Vonx, LAZA- I~US (1952)oder durch Na-diaethyl-dithiokarbamat nach KADOTA U. MIDORIKAWA (1951) versucht. In keinem Falle konnte eine iiberzeugende Verminderung der A-Zellen beobaohtet werden. Die wie bei unvorbehandelten Kaninehen ausfa]lende Zinkdarstellung liel~ daher keine Rfickschlfisse zu.

Ergebnis: Bei K a n i n e h e n sind daher in den B-Zel len mi t Sicherhei t groI3e und in den A-Zel len mi t hoher Wahrsche in l i ehke i t geringe, ari g ranulare Ze] lbes tandte i ]e gebundene Mengen reakt ionsf~higen Zinks vorhanden .

2. I la t te . A n 20 mi t S t a n d a r d f u t t e r ad l ib idum e rnahr t en R a t t e n ,T wurde das Inse lz ink naeh Ni ieh te rnper ioden kurze r Daue r mi t folgendem

Ergebnis un te rsuch t 1 :

1 Die Injektion erfo]gte in 2--3minutigem Xtherrauseh in dis freigelegte Ober- schenkelvene. Vorversuche an nicht narkotisier~en Tieren ergaben keinerlei Beein- flussung des Zinkverhaltens in den Inseln durch ktu'ze ~thernarkosen.

Z. exper, ivied., ]34. 124. 16a

242 H. WOLFF und D. RINGLEB :

Niichtcrnperiode Tierzahl Zinkdarstellung ante inject. r (-4-) ~-

O h 6 - - - - 6 8 h 8 - - - - 8

12 h 8 - - - - 8

Die einzelnen Tiergruppen liel~en keine sichtbaren Unterschiede im Verhalten ihres Inselzinks erkennen. Die Zinkdarstellung der Ratteninsel bietet ein vSllig neues Bild. Die zar t ~ngefiirbte Inselinnenfl~ehe ist yon einem tiefdunklen, riffartigen, yon Lficken durchsetzten R~ndwall um- schlossen (s. Abb. 6). Bei st~rkerer Vergr5Berung 15st sich das Zent rum in feinste, blasse, rotbr~unliche Granul~ nnd der Randw~ll in diehte, gr5bere, dunkelviolet te KSrnchen auf (s. Abb. 8). Letztere sind wie bei Kaninchen in Capillarn~he angeordnet . DiG Farbdichte des l~and- wa]ls zeigt bei versehiedenen Inseln verschiedener Tiere keine visuell er- kennbaren Schwankungen. Eine topogropgische Einordnung der Metall- v o r k o m m e n in das Zellbild der Rat teninsel ist bei Vergleich mit dem GoMo~Ischen Differentialpriiparat mSglich. Hier ist ein geschlossener, zentraler B-Zellkomplex yon einem lfiekenhaften l ~ n d w a l l aus A-Zellen umgeben (s. Abb. 7 u. 9). Dieses cytol0gische Vertei lungsmuster gilt bei der t~atte als typiseh und gesiehert (FERNEtr 1952). Das Zinkspuren enthal tende Mittelfeld scheint daher mit dem zentralen B-Zellenareal, der intensive randst/~ndige Zinkwall mit der A-Zellschale identifizier- bar. Die Randwall i ieken sind im Differentialbild deutlicher, da hier bei 3 - - 6 / t Sehnittdieke nur eine Zellsehicht dargestellt wird, w/~hrend sieh bei der Zinkfi~rbung i m Nat ivpr i iparat yon 15--25 /~ mehrere Zellsehiehten fibereinander projizieren. Durch Gef/~$injektionen mit Perltusehe konnte ferner gesichert werden, dab das Vertei lungsmuster des Metalls nieht dureh die Capil]aranordnung, sondern dureh die typische Lage der Zell typen bes t immt wird. Eine Besti~tigung der Be- funde ergab die folgende Versuehsanordnung:

a) Zinkdarstellung nach B-ZellzerstSrung: Bei 20 Rattcn wurde ein schwerer Alloxandiabetes (150~200 mg/kg, Blutzucker 380--750 mg-~ erzeugt und bei den 12 fiberlebenden Tieren am 3.--6. Tag post inject, das Inselbild untersueht. Je nach Entwicklungsstufe des Diabetes fanden sich zusammengesinterte Inseln, deren eingesunkene A-Zellw~lle eine starke viollette, und deren B-Zelldetrius eine schwache, rotbr/~unliehe Anf~rbung zeigte. ]3ei Inselresten in Form reiner A-Zellkonglomerate fand sieh eine dichte granul/~re Ablagerung yon Zinkdithozonat(s.Abb.10 u. 11).

b) Zinkdarstellung nach A-Zellzerst6rung. Versuche mit Injektionen yon Kobalt- chlorid nach GOLDNER,VOLK U. LAZARUS (1952) und VoLK, LAZARUS U. GOLDNER (1953) undvon Natrium-diaethyl-dithiokarbamat nach KADOTA U. MIDOI~IKAWA (1952) ergaben keinen nennenswerten A-Zelluntergang und damit keine brauehbaren Ergebnisse.

Ergebni8: Die Befunde spreehen ffir s tarke Vorkommen reaktions- f/s Zinks in den A-Zellen und schwaehe, nieht stets mit Sieherheit nachweisbare Konzent ra t ionen in den B-Zellen der l~atteninsel.

Histochemische Untcrsuchungen fiber das Inselzink. 243

3. Meerschweinchen. Bei 12 Meerschweinehen wurde nach S tanda rd - e rnghrung und Nf ieh te rnper ioden versehiedener Daue r der Zinknaeh- weis ve r such t :

Nfichternperiode Tierzahl Zinkdarstellung ante inject. ~ (-4-) d-

O h 6 6 - - - - 48 h 6 6 - - - -

Bes t anden bei K a n i n c h e n und l~a t t en schon betri~ehtliche Unte r - sehiede in der t opograph i sehen A n o r d n u n g des Inse lz inks und seiner Zu- gehSr igkei t zum Zel l typ , so e rgaben sich be im Meerschweinehen vSllig neue Verh~ltnisse. I m GoMol~i-Pr~parat l iegen hier die A-Ze]len in un- regelm~13igen Nes te rn oder Area len fiber die Insel ve r s t r eu t (s. Abb . 13). Bei der Z inkdars te l lung normalgef f i t t e r t e r Tiere l a n d sich niemals eine posi t ive Reak t ion . D a fr i ibere Un te r suchungen eine Anre ieherung des Inse lz inks be im hunge rnden Tier wahrscheinl ich m a e h t e n (OKAMOTO

1942/43), wurden die Versuche nach 48stf indigem F a s t e n wiederhol t . Aueh hierbei konn ten n ich t die ger ings ten Z inkspuren in den Inse ln s ieh tbar gemach t werden.

Ergebnis: Die Versuehe zeigen, dab in den Inse ln des Meersehweinehens mi t t i i ] fe des beschr iebenen Verfahrens ke in Zink naehgewiesen werden kaIlI1.

4. Hund. Bei 10 normalen und a l loxand iabe t i sehen H u n d e n ergab die Z inkdars te ] lung folgende R e s u l t a t e :

Nfichternperiode Tierzahl Zinkdarstellung ante inject. r (+) +

O h 2 - - - - 2 12 h I - - - - 1 24 h 2 - - - - 2 48 h 2 - - - - 2

nach 5--7ti~g. Alloxandiabetes 5 5 - - - -

Bei al len Norma l t i e r en fand sieh unabhi~ngig von der D a u e r der Nf ich te rnper iode eine kri~ftige Z inkreak t ion . Auffi~]lig war hier gelegent- l ich eine zentra]e Ausspa rung der Fa rbs to f fve r t e i lung in der Insel . Ih re Ident i f iz ie rung mi t der im GoMol~I-Pr/ iparat h~Lufig be oba e h t e t e n zen- t r a l en A-Ze l l anordnung (Fs.RI,~I~ 1952) war n ieh t mi t S icherhei t mSglich. Bei 5 hochgradig a l loxand iabe t i schen H u n d e n mi t B lu t zueke rwer t en yon 300- -700 rag-%, deren Inse ln im al]gemeinen keine f iber lebenden B- Zellen enthie l ten , lieg sich niemals Z ink nachweisen.

Ergebnis: Beim H u n d kSnnen s te ts s t a rke Z inkkonzen t r a t i onen in den B-Zel len nachgewiesen werden, n ich t dagegen in den A-Ze]len.

Z. exper. Med., Bd. 124. 16b

A b b . 6.

A b b . 5 Abb. 7

Abb . 8 Abb . 9

A b b . 10 Abb . 11

A b b . 12 Abb . 13

Histochemische Untersuchungen fiber das Inselzink. 245

5. Maus. Bei 12 unvorbehandelten M~usen wurde dam Inselzink nach 12stiindigem Fasten untersueht.

Acs technischen Grfinden wurde bei der Maus die DithizonlSsung intraperitonal verabfolgt und die Tiere ]5--30 min sparer get6tet. Die Dithizonanfiutung an die Inseln is t b ei diesem Verfahren vermutlich geringer als bei der intraven6sen Injektion, sie reicht jedoch fiir eine deutliche Zinkdarstellung aus.

Bei allen Tieren zeigte sich eine den Verh~iltnissen an der Kaninchen- insel ~hnelnde Anordnung des Metal]s. Bei allen Tieren erschienen die Inseln als orangefarbene Fl~chen, in denen zahlreiehe violettgef~rbte Granula in capi]larnaher Anordnung hervortraten. Die Granulazahl sehien jedoeh bei der Maus bedeutend geringer Ms beim Kaninchen, quantitative Vergleiehe verbietet hier Mlerdings die abweiehende Injek- tionsteehnik. Die Betraehtung des histologisehen Inselbildes, in dem wir nur vereinzelte peripher ge]egene A-Zellen sahen, legt die Vermutung nahe, dab das Zink der Mauseinseln vorwiegend in den B-Zellen ]okali- siert ist.

Ergebnis: Bei der Maus fanden sieh also regelm~l~ig Zinkvorkommen in den Inseln, die wohl vorwiegend in den B-Zellen lokalisiert sind.

I I . Verhalten des histoehemiseh nachweisbaren Zinks in Abhiingigkeit yon versehiedenen, die Inseln tre//enden Funktionsreizen.

Nach den besehriebenen Beobachtungen l~13t sich das Inselzink bei Ratten besonders eindrucksvoll in den A-Zellen, bei Kaninehen in den B-Zellen darstellen. Um die Beziehungen zwisehen Inselfunktion und Zinkkonzentration in beiden Zellsystemen zu studieren, wurden daher Paralleluntersuchungen an Ratten und Kaninchen in verschiedenen Situationen des Kohlenhydratstoffwechsels durehgefiihrt.

Ratte. a) Hunger. Bei 32 Ratten wurden die Inseln nach verschieden langen Hungerperioden untersucht. W/~hrend die Zinkreaktion im zentralen InselareM - - also in den B-Zellen - - keine objektivierbaren Ver- ~nderungen anfwies, schwanden die starken Zinkvorkommen des Rand-

A b b . 5. V e r t e i l u n g y o n A- ~ n d B - Z e ] l e n i n de r K a n i n c h e n i n s e L P a r a ~ f i n s c h n i t t , 5z, C b r o r n ~ l a u n h ~ i m a t o x y l i n - P h l o x i n - F ~ . r b n n g n a c h GOMORI, 460 f ach ( • 2/3). A - Z e l l e n ro t ,

B - Z e l l e n b ]an . A b b . 6. I t a t t e n i n s e l n n a c h i n t r a v i t a l e r Z i n k d a r s t e l ] u n g . T e c h n i k wie A b b . 2.

120fgch ( • 2/3). A b b . 7. V e r t e i l u n g yon A- u n d B - Z e l l e n in t ier P~at teninse l . T e c t m i k wie A b b . 5.

230 fach ( • 2/s). A b b . 8. A - Z e l l r g n d w a l l e ine r R a t b e n i n s e l be i Z i n k d a r s t e l l u n g . T e c h n i k wie A b b . 2.

1 0 0 0 l a t h ( • 2/s). A b b . 9. A - Z c l l r a n d w a l l de r I ~ a t t e n i n s e ] n be i Go.~1oRi-F~irbung. T e c h n i k wie A b b . 5.

1000 faeh ( • ~/~). A b b . 10. I n s e l e i n e r 6 T a g e a l l o x a n d i a b e t i s c h e n RaLte (150 m g A l l o x a n / k g i. v . ) .

T e c h n i k wie A b b . 5. 4 6 0 f a c h ( • 2/3). Abb. II. Zinkreaktion eines A-Zellh~ufchens bei einer 6 Tage alloxanctiabetische~l

Ratte (150 mg Alloxan/kg i. v.). Technik wie Abb. 9.. 230fach ( • 2/3).

Abb. 12. Inselzink cler Ratte in extremem Hung'er (72 h.) Gleiehe ]3ilder nach Insulin- oder Adrenalin-BelastLmg'. Technik wie Abb. 2. 230fach ( • 2/s).

Abb. 13. Gleiehm~tBige Verteilung yon A- und B-Zellen fiber die N[eerschweincheninsel. Technik wie Abb. 5. 1000fach ( • 2/3).


wMls - - also der A-Zellan - - von 48 Std an mi t zunehmendem Hunger bis auf Spuren (s. Abb. 12). Dureh sehematisehe Dars te l lung der Zink- abwanderung und des gleiehzeitigen Blutzuekerverha l tens werden die Beziehungen zwisehen Kohlenhydratstoffweehsel lage und histochemisehen Ver~inderungen verdeut l icht (s. Abb. 14).

Ergebnis: Die Versuche Zeigen, dab der Zinkgehal t in dan A-Zellen der R a t t e n i n s a l n mi t l angdaue rndem Hunger a b n i m m t .

74a 0 -

73o

120--

lla -

~ loO-

,<

70

80 �9 @ Q

Abb. 14. A-Zellzink der Ratte im Hunger. Jeder Kreis entspricht 9 Tieren. Schwarz = A-Zellzink vorhanden. ~eiB = A-Zellzink geschwunden.

b) Insu l inbe las tung . 30 zwSlf Std fastande t ~ t t e n erhielten ja 12 E Al t insu l in /kg s. e. und wurden nach versehiedenen Ze i tabs t~nden get6tet u n d untersueht . Durch Abb. 15 werdan die beobaeh te ten Inselbi lder in Baziehung zum indiv idual len Blu tzuekervarha l tan veranschaul ieht . W~h- rand der in i t ia len Hypoglyk~mie zeigte das A-Zellzink keina Vergnde- rungan. Mit Beginn des folgenden Blutzuekeranst ieges sehwand es jedoeh bis auf geringe Spuren. Die sehon vorher schwaehe Zinkreak t ion im I n n a r e n dar Insel - - also in den B-Zellen - - be t kaine sub jek t iv wahr- n e h m b a r e n Vergnderungan.

Ergebnisse." Die Beobaeh tungen spreehen daftir, dab das A-Zink der l~at teninsel wghrend des gegenregulator isehen Blutzuckeranst ieges nach Insu l inbe la s tung seine Ab]agerungss tg t ten ver]gBt.

c) Glucosebelastung. Die Un te r suchungen an 12 Std fas tenden R a t t e n erfolgten in zwei verschiedenen Anordnungen .

Es wurde zuerst an 8 Tiere je 10 g Glucose/kg in 50~oiger LSsung intraperito- neal verabfolgt und Blutzucker und Inselzink naeh verschiedenen ZeitintervMlen kontrolliert.

Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8

N~ch Glucoseg~be 1 2 3 4 5 6 Blutzueker 984 - - 615 599 770 - - Inselzink n n n n n n

10 24 Std 640 448 mg-~o n n (n =normal)

Histochemisehe Untersuehungen tiber das Inselzink. 247

Durch die gew/~hlte Dosierung und Verabreichungsform der Glucose wurde das Blutzuckerniveau fiber 24 Std s tark erhSht. In diesem Zeit- raum bot das Inselzink bei allen Tieren das normale Konzentrations- und Verteilungsbild. Hierauf wurde bei 20 l~atten je 2 g/kg und bei 6 Tieren je 4 g/kg Glucose in 10~/oiger L6sung einmalig i. v. verabreicht und das Pankreas w~hrend der t typerglyk~mie und der folgenden gegenregulatorisehen Schwankungen untersueht. Die Ergebnisse we rden dureh

r ~ %

2gO~

220~ 72E A//l~zsu/z?z/k~

~ 780 -

~ z/O

700

8D

60

zOO

20-- I I I , I I l I I r I I I , r q I

0 2 4r C 8 10 72 18 2g l~ A b b . 15. I n s e l z i n k t ier I l a t t e w h h r e n d I n s u l i n b e l a s t u n g . J e d e r K r e i s b e d e u t e t d a s I n s e l b i l d

e ine s T ie re s .

O = A - Z e l l z i n k r e g e t r e c h t .

O = A - Z e l l z i n k s e h w a c h .

�9 ~[~ = A - Z e n z i n k s p u r e n h a f t o d e r f r a g l i c h .

_ _ -- S c h w a n k u n g s b r e i t e des B l u t z u c k e r s .

Abb. 16 veranschaulicht. W~thrend an den sehwach gef~rbten Innen- fl~chen der Inseln - - also an den B-Zellen - - keine quanti tat iven Ver- /~nderungen des ZinkgehMtes sichtbar wurden, sehwand das randstgndige A-Zellzink 5--10 Std naeh Glucosebelastung weitgehend. Diese Zeit- spanne fgllt mi t dem Ende der gegenregulatorischen I-Iypoglyk/~mie und der Einstellung des Blutzuekers auf das NormMniveau zusammen.

Ergebnis: Bei Glucosebelastungen der Rat te lassen sieh wghrend der hyperglyk~mischen Phase keine Vergnderungen am Inselzink nachweisen. I m AnschluB an die gegenregulatorische HYlooglykgmie finder jedoch eine Abwanderung yon Zink aus den A-Zellen statt .

d) Adrenalinbelastun9. An 12 Std fastenden Rat ten wurde eingangs die Reaktion des Blutzuckers und des Inselzinks auf verschieden hohe AdrenMindosen geprfift.

248 H. WOLFF und D. R~GLEB :

Blutzuckermaxima Dosis Tierzah] (rag- ~o ) Inselzink

5 y/kg 6 90--125 normal 10 y/kg 4 90--125 normal 50 y/gk 4 100--135 normal

200 ~/kg 32 250--350 ver~ndert

Erst bei Dosen von 200 y/kg fanden sich kr~ftige Ver/~nderungen des Blutzuckers und Inselzinks. Bei den Tieren dieser Gruppe begann 1--2 Std nach Adrenalingabe - - a]so auf dem HShepunkt der folgenden Blut- zuckers~eigerung-- eine Abwanderung des randst/~ndigenA-Zellzinks, das

rnff%

300 t

250 ]

~ 200

150

700

so ,2-~ g/~s I Glukose L v I I I I I I I I I ~ ] i ] i I I p r ' 0 2 ~I 6 8 70 12 78 ~z b,

Abb. 16. Inse lz ink tier R a t t e w~hrend Glucosebelas tung. Ze ichenerk l~rung s. Abb. 1 5.

naeh ca. 4 Std in allen F~llen vSllig geschwunden war. Das Inselverhalten in Beziehung zum Blutzucker wird durch Abb. 17 veranschau]icht.

Ergebnis: Die Beobachtungen zeigen, dab das A-Zellzink der Ratten- inseln nach Adrenalingabe sctmell seine Ablagerungsst~tten verl~13t.

e) Sympathicusreizung. Urn den AuslSsungsreiz ftir die Zinkabwan- derung aus den A-Zellen der Ratte n~her zu differenzieren, wurden die Inselverh~ltnisse bei Sympathicusreizung normaler und adrenal- ektomierter Tiere untersucht.

Hierzu wurdcn 30 Ratten in 3 Gruppen ~ 10 Tieren (A, B, C) eingetcilt und folgenden Versuchsanordnungen unterworfen:

A. Freilegung des n. ischiadicus, elektrische Reizung (4,5 V) in 4 Perioden ~, 15 rain mit 15mintitigen Intervallen. Keine Narkose. Zinkdarstelhng 30 rain nach ]3eendigung der Reizung.

B. Adrenalektomie und Zinkdarstellung 24 bzw. 48 Std post operationem. C. Wie A, jedoch 24 bzw. 48 Std nach vorausgegangener Adrenalektomie. Die Zinkdarstellung erfolgte bei sAmtlichen Tieren nach 12sttindigem Fasten.

Histochemisehe Untersuchungen fiber das Inselzink. 249

Nach Sympathicuserregung durch wiederholte elektrische Reizung des freigelegten n.ischiadicus land sich eine betrBchtliche Erh5hung des Blutzuckers, die nach der zweiten Reizperiode im Mittel 365 mg-~o, nach der vierten Reizperiode 297 mg- ~o betrug. Bei der Zinkdarstellung 30 rain nach Ende der Reizung war das Metall bis auf Spuren, ge]egentlich auch vSllig, aus den A-Zellen geschwunden. Wurde der gleiche Versuch 24 oder 48 Std nach vorausgegangener Adrenalektomie durchgeffihrt, so fehlten diese ftir das NormMtier typischen Ver~nderungen. Leichte

380 25O ~ , , , , zo~ '@ @ @

I ~oo~,/kg Xdroi7.,,,.nl/n aC. ! ', I I ! I '

o o 7 2 3 ~ ~ ~ 8 12 2+~< Abb. 17. Inse lz ink der R a t t e w~ihrend Adrena l inbe las tun~ . Zeiehenerkl~rung" s. Abb. 15.

individuelle Schwankungen des A-Zellzinks scheinen nachAdrenMektomie h~iufiger aufzutreten. Sie fanden sich mit und ohne Sympathicusreizung (s. Abb. 18).

Ergebnis: Wiederholte starke Sympathicusreize bringen das A-Zell- zink normaler Ra t ten zum Schwinden. Dieser Effekt lal3t sich durch vor- hergehende Adrenalektomie verhindern.

/) Parasympathicusreizung. Bei 10 normalen Rat ten (~ 200 g) wurde das cho]inergische Nervensystcm durch intraperitoneale Dauerinfusionen yon Azetylcholin (Gesamtdosis 30 rag, I)auer 60 rain, kombiniert mif, 3 i. m. Injektionen yon je 10 mg in 20 rain AbstBnden)gereizt . Bei den meisten Tieren zeigten sich im Verlauf des Versuches Blut- zuckersenkungen um 20--50~o des Ausgangsniveaus, Bradykardie und enorme sekretoriscbe Drfisents Bei keinem Tier liel~ sich in einem Zeitraum bis zu 3 Std nach Infusionsbeginn Anderung am Inselzink bcobachten.

Ergebnis: Langdauernde starke Parasympaticusreize rufen am Insel- zink der Rat te keine VerBnderungen hervor.

250 H. WOLFf und D. RINGLEB :

2. Kaninehen. a) Hunger . Bei 18 Kaninehen zeigte das Inselzink - - das nach den voransgegangenen Beobaehtungen zum grSgten Tell in den B-Zellen lokalisiert i s t - nach versehieden langen Hungerperioden fol- gendes Verhalten :

Hungerperiode Tierzahl Zinkdarstellung

a) 24 h 6 kr~ftig b) 48 h 6 kraftiger als a c) 96 h 6 kr/~ftiger als b

Mit zunehmendem Hunger fund sich also eine eindeutige Vermehrung des Inselzinks, eine Beobaehtung, die mit den Befunden anderer Autoren fibereinstimmt (OKAMOTO 1942, 1943, STAMP~Z 1952, MASKE 1952,1953).

Ein genauer quanti tat iver ag% 4.05-

350-

3OG

250

k 200

N *. II0

100

90

80

70

65

56

~6

35

'lllf'

%

|

A - Zellz/hk den s noch :

A: Syrnpolh/'ku3re/~ung

B." ~fympo~hl~USre/zung n~ch Adpen ole htom / e

~: Adreoale}tom/e

8 o |

8 8 0 0 O

O O 8 o

I I I I I 24 ~,8 h 24, ,48 h po3r

A B C Abb. 18. Inse lz ink der R a t t e nach (A) S ympa th i eus - reizung, (B) S y m p a t h i c u s r e i z u n g nach Adrena lek- tomie, (C) nach Adrena lek tomie . Ze ichenerk l~rung

s. Abb. 15.

Vergleich der Zinkreaktionen bei den versehiedenen Tier- gruppen wurde durch die individuellen Sehwankungen der Inselfgrbung g]eieher 0rgane und die begrenzte Vergleichsf~higkeit visueller Wahrnehmungen unm5glich gemaeht. Sie kann nur durch Mittelbildung aus histo- photometrisehen Serienmes- sungen erfo]gen.

Ergebnis: Die Versuehe zeigen, dag der Zinkgehalt in den B-Zel]en yon Kanin- ehen w~hrend l--4t~Lgigem Hunger fortlaufend zunimmt.

b) Insul inbelas tung. 3 Ka- ninehen zeigten auf Gaben yon 10--15 E Altinsulin/kg keine visuel] gegentiber der Norm differenzierbaren Ab- weiehungen des Inselzinks.

c) Glucosebelastung. 14

Kaninehen erhielten naeh 12stiindigem Fasten 5 g Glucose/kg als einmalige Injektion einer 30--40%igen L6sung i. v. In den Zeitabst~tnden yon 3, 4 und 5 Std post inject, wurden Blutzuekerkontrollen durehgeffihrt, die einzelnen Tier- gruppen getStet und ausgewertet. Es fund sieh eine ca. 2 Std post inject. beginnende progressive Abwanderung des Inselzinks, das naeh 4- -5 Std

Histochemische Untersuehungen iiber das Inselzink. 251

i. A. bis auf Bruehteile der Normalvorkommen gesehwunden war. Dieses Ergebnis stimmt mit Beobachtungen nach peroralen Kohlenhydrat- belastungen (OKA•OTO 1942, 1943, STAMPFL 1952, MASK• 1952, 1953) sinngem/il~ fiberein. Das Maximum der Zinkabwanderung f~llt zeitlieh mit der gegenregulatorischen Hypoglyk/tmie zusammen. Auf eine weiter- gehende quantitative Klassifizierung der Inselbefunde wurde aus den vorher genannten Grfinden (s. 2a) verziehtet.

Ergebnis: Nach i. v. Glucosebelastung zeigte sieh beim Kaninchen eine Abwanderung der Zinkvorkomrnen aus den B-Zellen bis auf geringe Reste.

d) Adrenalinbelastung. 8 Kaninehen erhielten nach 12stfindigem Fasten je 100 y/kg, 16 je 250 y/kg Suprarenin s.c. injiziert. Hierauf wurde der Blutzueker in stiindlichen Interva]len kontrolliert. Die Tiere mit geringen Adrenalingaben wiesen nur geringe Blutzuckerreaktionen --mit t leres Maximum = 180 m g - ~ o - und ihr Inselzink nach 3--5 Std nur ehle leichte Ablassungstendenz auf. Die mit der grSl3eren Dosis be- handelte Gruppe zeigte dagegen betrgchtliche B]utzuckerspitzen - - mittleres Maximum -- 323 mg-~o - - und eine Abwanderung des Insel- zinks, die etwa 2 Std post inject, einsetzte und nach weiteren 2--3 Std ihren HShepunkt erreicht hatte: Um diese Zeit waren auf einem zartrStlich gef/~rbtem Inselhintergrund i. A: nur wenige Zinkgranula erkennbar.

E~yebnis: Beim adrenalinbelasteten Kaninchen tritt mit Ausbildung der gegenregulatorisehen Hypoglyk~mie eine Abwanderung des B-Zell- zinks ein.

D. Ergebnisdiskussion.

I. Vor]commen und topographische Verteilung des Inselzin]cs.

Histochemiseh darstellbare Zinkvorkommen fanden sieh mit der beschriebenen Methode regelm~gig in den Inseln yon Hund, Kaninchen, Rat ten und M/~usen, dagegen nie beim Meersehweinehen. Versucht man grobquantitativ die Zinkkonzentration in den Inseln der verschiedenen Tierarten in Beziehung zu setzen, so ergibt sieh folgende Reihe:

Kaninchen ~ Hund ~ Ratte ~ Maus ~ Meerschweinchen 1

Zwischen Menge und Anordnung des Inselzinks einerseits und Gattung der Tiere andererseits fand sieh keine zur Zeit verst~nd]iehe Beziehung. Die groben Konzentrationsdifferenzen des Metalls bei nach Art und Nah- rungswahl so nahe verwandten Tieren wie Kaninchen, Ratte und Meer- schweinchen waren sehr auffitllig. Entweder bestehen hier tatsi~chlich schwer erkl/~rbare Unterschiede in den Zinkgehalten oder alas Metall liegt

1 Mit Hilfe der alten O~AMOTOschen Methode fanden wir auch in den Inseln yon Menschen und Schweinen gr6Bere Zinkvorkommen. Erstere entsprechen quantitativ etwa denen des Hundes, letztere denen des Kaninchens.


bei einzelnen Tierarten in einer chemisch verschiedenen, mit Dithizon niCht reagierenden Form vor.

Versuche bei verschiedenen Tierarten die topographische Zinkver- teilung in den Inseln zu ld~ren, hinterlieBen keine Zwei/el, daft das Metall sowohl in A- als auch in B-Zellen vorhanden sein lcann. Als Beispiel hierfiir dient die beschriebene Zinkanordnung in den Inseln normaler und alloxan- diabetischer Rat ten und Kaninchen. Hinsichtlich der qualitativen und quantitativen Verteilung des Meta]ls auf die beiden Zellsysteme scheinen jedoch bei verschiedenen Tierarten erhebliche Differenzen zu bestehen. So enthielten bei einzelnen der untersuchten Tierarten die A-Zellen (Ratte), bei anderen die B-Zellen (Kaninchen) den Hauptanteil des nachweisbaren Inselzinks. Bei anderen Tieren zeigten ein oder beide Zellsysteme ~berhaupt keine Zinkvorkommen. Ob es sich hier um grnnd- satzliche, funktionsbedingte Unterschiede in der Zinkver~eilung auf die beiden Zelltypen handelt oder ob das Metall einmal in reaktionsfahiger, das andere Mal in maslderter Form vorliegt, werden zukfinftige Unter- Snchungen kl~ren miissen.

Reaktionsfahiges A-Zellzinlc konnte mit Sicherheit bei der Ratte, mit hoher Wahrscheinliehkeit beim Kaninehen, dagegen nicht beim Hunde oder Meerschweinchen nachgewiesen werden. Bei der g a t t e land sieh das Metall an grobgranulare E]emente gebunden. Ihre Identifizierung mit dem im GoMo~Ischen Differentialbild 5frets beobachteten a-Granula liegt nahe, ist auf Grund der bisherigen Ergebnisse jedoch nieh~ ohne weiteres mSglich. Bei visuel]en Vergleichen entstand vie]mehr tier Ein- druck, dab die mit tier Zinkreaktion angefarbten Partikelchen die a- Granula an GrSBe fibertreffen.

Reaktionsfahiges B-Zellzinlc lieB sich regelmaBig und reichlich bei Kaninchen, Hund und Maus, in Spuren bei der I~atte und niemals beim Meerschweinchen nachweisen. Es war stets in granularer Form und capillarnaher Anordnung vorhanden. In diesen gefaBnahen Inselzonen wird zwar das Farbreagens am intensivsten angeflutet, eine capillar- warts zunehmende Dichte gilt abet auch fiir die Lage der bei GOMORI- Farbung sichtbaren fl-Granula a]s typisch. Die Vermutung, dab die Zinkgranula mit den als Insulinvorstufe angesprochenen fl-Granula identisch sind, liegt daher nahe . Sie laBt sich jedoch an Hand der bisherigen Befunde noch nicht beweisen, da Zink- und fi-Granula bei ge- wissen extremen Funktionszust~nden der Insel spater zu beschreibenden Verhaltensdifferenzen zeigen. Auch sche~nen die Zinkgranu]a den #-Granula an GrSBe fiberlegen. Ob der Eindruck einer derartigen GrSBen- differenz durch physikalisch-chemische Veranderungen an den fl-Granula im Gefolge der Dithizonreaktion entsteht, oder ob es sich bei den beiden Granulatypen um versehiedene morphologische Individua]itaten handelt, kann zur Zeit nicht beurteilt werden.

Histochemische Untersuchungen fiber das Inselzink. 253

I I . Verhalten des Inselzinks in verschiedenen Situationen des Kohlen- hydratsto//wechsels.

Sowohl das A-Zink der I~atte wie das B-Zink des Kaninchens zeigten in Abh~ngigkeit von verschiedenen, die Inseln treffenden Funktions- reizen ein charakteristisches Verhalten.

Die Beurteilung des A-Zellzinks erfolgte auf Grund der bisherigen Befunde an der l~atte, denen die Beobachtungen bei den anderen Tier- arten nicht widersprachen. Das A-Zellzink der Rat te schien seine Depots in den Inseln immer dann zu verlassen, wenn blutzuckersteigernde l~egu- lationsmechanismen in Kraf t traten, z. B. im protrahierten Hunger, nach Insulinhypoglyks oder nach der gegenregulatorischen Blutzucker- senkung bei Glucosebelastung (STAv•-Effekt). Die gleiche partielle bis totale Abwanderung des Zinks aus den A-Zellen naeh Adrenalingabe oder naeh wiederholten Sympathicusreizen deutet auf eine AuslSsbarkeit des Vorganges durch das adrenergische System hin. Die Unw;rksamkeit yon Sympathicusreizen n~ch vorangegangener Adrenalektomie 1/il3t eine aktive Beteiligung yon Nebennierenwirkstoffen bei der Mobi]isierung des A-Zellzinks annehmen. Die Beobaehtungen erwecken den Eindruck, dab unter den beschriebenen AuslSsungsreizen eine mit Zink beladene Sub- stanz die A-Zellen verl/~l~t, sie liefern jedoeh noch keinen Beweis ffir die Sekretion eines Wirkstoffes. Ffir die Diskussion der Ergebnisse seheinen die folgenden Beobachtungen anderer Autoren bedeutungsvo]l:

1. Die Zuordnung eines blutzuckersteigernden Wirkstoffes (hyper- glycemie-glycogenolytic factor, Glukagon) zum A-Zel]system (Tnol~o- GOOD U. ZTMMnRMAN~ 1945, CANDELA 1947, SVTHER~A~CD U. DE DUVE 1948, FERNEI~ 1950/51, GAEDE, FERNE~ U. CASTRUP 1950).

2. Die Feststellung, dal3 die hyperglyk/imisierende Wirkung kristal- liner Insulinpr/~parate dureh Zinkentzug beseitigt wird, wobei eine komplexe Zinkverbindung den Kristall ver]/~l~t ( W E I T Z E L 1952; WEIT- ZEL, FRETZDOI~FF, STRECKEI~ U. X:~OESTEI~ 1953), SO dal~ die Autoren der Ansicht sind, die blutzuckersteigernde Substanz sei ein Peptid mit aus- gesprochenem ZinkbindungsvermSgen.

3. Die Kristallisation eines hyperglyk/~misch-glykogenolytischen Pan- kreasfaktors aus amorphem Handelsinsulin (STA~B, SIgN u. BEHRENS 1953), der Zinkspuren enth/~lt.

Ein konsensuelles Verhalten von B-Zellzink und Insulin mul~ auf Grund der Beobachtung angenommen werden, dal3 der Mobilisierungsreiz ffir Insulin - - Hyperglyk~mie verschiedener Ursache - - auch eine Zink- ausschwemmung aus den B-Zellen hervorruft. Derartige typische, parallel zur B-Zellfunktion verlaufende Zinkreaktionen wurden bisher allerdings nur am Kaninchen beobachtet, bei den geringen Metallvorkommen in den B-Zellen der l~atte konnten nach den beschriebenen Reizen niemals

Z. exper. Med., Bd. 124. 17

254: H. WOLF und D. I~INGLEB :

sichere Ver~nderungen der schwachen Zinkf~rbung beobachtet werden. Auch beim Kaninchen liel~en sich die beschriebenen typischen Verhal- tensweisen des B-Zellzinks nur aus extremen Zust~nden des Kohlen- hydratstoffwechsels ableiten, in denen die Konzentrationsdifferenzen des Metalls in den Inseln auf Zehnerpotenzen gesch~tzt werden dfirfen (Zink- massierung im H u n g e r , Zinkspuren nach Glucose- oder Adrenalinbe- tastung) und in denen die individuellen Schwankungen des Inselzinks

wohl einer alternierenden Inselfunktion entsprechend - - in den Hin- tergrund traten. Eine genauere quanti tat ive Beurteilung verschieden- artig ausgel5ster Konzentrationsschwankungen des B-Zellzinks ist beim Kaninchen nach unseren Erfahrungen nur dureh die Mittel histophoto- metrischer Serienmessungen m5glieh. Untersuchungen dieser Art wurden inzwisehen yon uns begonnen. Die ffir enge funktionelle Beziehungen zwischen Insulin und Zink in den B-Zellen spreehenden Befunde erhalten durch neuere Beobachtungen einen interessanten Kommentar :

1. Zinkionen bilden bei physiologischem pH und in best immter Kon- zentration (~2~o) unlSsliehe Verbindungen mit Insulin. Dieser Effekt l~il~t sich dutch die Gegenwart yon Komplexbildnern mit h5herer Zink- affinit~it verhindern oder aufheben (HALLAs-MoLLEI%, PETEI%SEN, SCHLIGHTXR~LL 1952, 1953).

2. Untersuchungen fiber die Beziehungen zwischen Metallen und Pro- teinen ffihrten Co]~N, SUI~GENOR, SCttMID, ]~ACI~ELOR und ALAMERY (1952) zu folgender Annahme:

"The role of zinc in the hormone insulin and in the interaction of certain enzymes with their substrates appears to be closely related to the formation of zinc protein complexes of low solubility at neutral reaction at which the sodium salts of these proteins are completely dissociated and soluble."

Beide Beobachtungen deuten auf die MSglichkeit bin, dab sich in den B-Zellen unter ZinkeinfluB eine schwer 15sliche Insulinverbindung (, ,Depotform") bildet, die erst durch Einwirkung best immter Mobili- sierungsreize ihren Zinkanteil verliert und ]Ssliehes Insulin freigibt.

Grunds/itzliche Betrachtungen fiber die biologische Ro]le des Metalls in den Inseln scheinen jedoch angesichts der Beobachtungen verfrfiht, dab

a) Zink in den A- und B-Zellen mancher Tierarten auftritt , d. h. kaum spezifische Aufgaben bei der Funktion eines der beiden Zellsysteme ver- sehen dfirfte, und dab

b) nach Abstammung und Nahrungswahl so nahe verwandte Tier- arten wie Kaninehen, Rat te und Meersehweinchen so erhebliehe Diffe- renzen in lKenge und Verteilung ihres Inselzinks zeigen.

Aufgabe weiterer morphologischer, histochemischer und biochemischer Untersuchungen ware es vorerst zu klaren, ob die Zinkreaktion in den

Histoehemische Untersuchungen fiber das Inselzink. 255

A- und B-Zel len als eine A r t F a r b m a r k i e r u n g yon Inse l ink re t en aufge- f a s t und die Z inkbewegungen mi t Sekre t ionsvorg~ngen be ider Ze]l- sys t eme ident i f iz ier t werden dfirfen; ferner zu pri ifen, ob wirkl ich grobe Unte rsch iede im Verha l t en des Inse lz inks bei verschiedenen T ie ra r t en a n g e n o m m e n werden mfissen, oder ob sie nur durch die Exis tenz verschiedener Zus t ands fo rmen des Metalls , r eak t ions fah iger und maskie r te r , vor- ge t~uscht werden.

Zusammen[assung. 1. U m Einb l i ck in die biologische Ro]le des Zinks in den Pankreas -

inseln zu gewinnen, wurde bei mehre ren T ie ra r t en das Metal l mi t te l s i n t r av i t a l e r Anfi~rbung du tch i. v. D i th i zon in jek t ionen his tochemisch darges te l l t und anschliel~end seine V o r k o m m e n und seine Anordnung in den A- und B-Zellen, sowie sein Verha l t en in A bha ng igke i t yon verschiedenen, die Inse]n t ref fenden Funk t ions re i zen s tud ier t .

2. Zink konn te in den A-Zel]en yon R a t t e n und K a n i n c h e n und in den B-Zel len yon Kan inchen , Hunden , M~usen und R a t t e n nachgewiesen werden. Mereschweincheninseln en th ie l t en ke in reakt ionsfahiges Zink.

3. Das A-Ze]lzink yon l~a t t en ve r schwand im p ro t r a h i e r t e n Hunger , nach Insu l inbe la s tung oder gegenregula tor i schen Hypog]ykKmien bis auf Spuren oder vSllig. Der gleiche Effekt t r a t im Ansehlu$ an Adrena l in- gaben ode r in tens ive Sympath icus re ize ein. Le tz te re zeigten be im adrenal - e k t o m i e r t e n Tier jedoch keine W i r k u n g mehr .

4. Das B-Zel lz ink von K a n i n c h e n nahm nach Glucose- oder Adrena l inbelas tung, also insu l inmobihs ie renden ]~eizen, ab. I m Hunge r zeigte es eine deut l iche Vermehrung.

5. Es wird die F rage d i sku t ie r t , ob die Z ink re a k t i on in den A- und B- Zellen yon Pankreasinseln als eine Art Farbmarkierung yon Inselinkreten

aufgefagt und Zinkbewegungen mit Sekretionsvorg~ingen in den Inseln

identifiziert werden dtirfen. Diese Vermutung liegt angesichts der gewon-

nenen Erkenntnisse nahe, sie wird ]edoch durch sie noch nicht bewiesen.

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Prof. Dr. H. WOLFF u. Dr. D. R~NGLEB, Madizinischc Universitiits-Poliklinik , Marburg ~. d. Lahn .

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Histochemische Untersuchungen über das Inselzink