STRAHLQUELLEN

Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine be-währte Methode zur ortsaufgelösten Un-tersuchung von biologischen Mikrostruk-turen. Die Proben werden mit Fluorophorenpräpariert, die bei geeigneter Anregungmit Laserlicht ihre charakteristische Fluo-reszenz abgeben. Die Beobachtung dieserFluoreszenz unter dem Mikroskop erlaubtpräzise Aussagen über Zellstrukturen undermöglicht Rückschlüsse auf chemischeAbläufe innerhalb der Zellen.

Hohe Fluoreszenzausbeute erfordert leistungsstarke Laser

Im Gegensatz zur klassischen Anregung,bei der ein einziges hochenergetischesPhoton die erforderliche Energie bereit-stellt, werden die Fluorophore bei derMultiphotonenmikroskopie durch die fastgleichzeitige Absorption mehrerer nie-derenergetischer Photonen des Anre-gungslasers angeregt. Lebende Zellen

werden dadurch erheblich weniger ge-schädigt. Die Wahrscheinlichkeit einerMultiphotonenabsorption ist dabei sehrgering und wächst exponenziell mit derLaserintensität an. Im Fokus des Laser-strahls ergibt sich dadurch eine sehr guteLokalisierung der Fluoreszenz und somitein hoher Kontrast im aufgenommenenBild. Für eine ausreichende Fluoreszenz-ausbeute sind jedoch leistungsstarkeLaser erforderlich. Aus diesem Grund wer-den Kurzpulslaser eingesetzt, die bei Puls-längen von wenigen 100 fs Pulsspitzen-leistungen von mehreren 100 kW abge-ben.

Modengekoppelte Titan-Saphir-Laserfindet man häufig in solchen Anwen-dungsfällen. Als Lasermedium dient einTitan-Saphir-Kristall, der von einem dio-dengepumpten und frequenzverdoppel-ten Festkörperlaser gepumpt wird. Titan-Saphir- Laser geben Femtosekundenpulsehoher Pulsspitzenleistungen mit Wellen-längen zwischen 700 und 1000 nm ab.Die Stärke des Titan-Saphir-Lasers liegtin der Durchstimmbarkeit der Wellen-länge, wodurch die maximale Absorp-tionsrate bestimmter Fluorophore opti-mal getroffen werden kann. Um jedocheine optimale Leistung an den Grenzendes Wellenlängenbereichs (besonders imlangwelligen Bereich bei 1000 nm) zu er-reichen, muss der Laser nachjustiert wer-den. Obwohl Titan-Saphir-Laser deutlichkleiner und zuverlässiger geworden sind,bleiben noch Nachteile, wie hohe An-schaffungs-, Betriebs- und Wartungskos-ten und höhere Anforderungen an denBenutzer, bestehen.

18LASER+PHOTONIK APRIL 2005

Kurzpulslaser erobern dieMultiphotonenmikroskopie

Günstige und zuverlässige Alternative in der Forschung

Stefan Kremser, Wessling

Titan-Saphir-Laser werden häufig in der medizinisch-biologischen For-schung eingesetzt, sind aber komplex und teuer. Kurzpulslaser, basie-rend auf diodengepumpten Festkörperlasern, bieten günstige undanwenderfreundliche Perspektiven in der Multiphotonenmikroskopie.

Bild 1. Routine-einsatz eines Mul-tiphotonenmikro-skops bei derUntersuchung vonZellstrukturen

KONTAKTLaser 2000 GmbH,82234 Wessling,Tel. 0 81 53 /4 05 -0,Fax 0 81 53 /4 05 -33,www.laser2000.de

STRAHLQUELLEN

Titan-Saphir-Kristall oder Ytterbium

Moderne Kurzpulslaser basieren auf dio-dengepumpten modengekoppelten Fest-körperlasern. Als Lasermedium dientYtterbium, das im Gegensatz zum Titan-Saphir-Laser direkt mit einer Hoch-leistungslaserdiode gepumpt wird. Einzusätzlicher Laser mit Frequenzverdopp-lung ist nicht erforderlich. Hohe Zuver-lässigkeit, einfache Bedienbarkeit undein geringerer Preis sind die Folge.

Ytterbium-dotierte Festkörperlaser emit-tieren im modengekoppelten Betrieb Pul-se mit Pulslängen zwischen 200 und400 fs bei Pulsspit-zenleistungen zwi-schen 100 und500 kW. Die Puls-wiederholraten lie-gen zwischen 10 und50 MHz, sodass sichmittlere Leistungenvon 1 bis 2 W erge-ben. Die Wellenlängeliegt im infrarotenSpektralbereich bei1030 nm und ist imGegensatz zum Ti-tan-Saphir-Laserfestfrequent. Dies istjedoch bei den meis-ten Anwendungen kein Nachteil. Bei be-kannten Fluoreszenzproteinen, wie GFPoder DsRed, liegt das Maximum der Zwei-photonenabsorption bei 970 beziehungs-weise 1150 nm. Die Anregung ist daherbei 1030 nm sehr effektiv. Selbst beiMessungen mit Fluorophoren, die weni-ger effektiv angeregt werden können, hat

die Multiphotonenanregung bei 1030 nmgegenüber einer kürzerwelligen oder Ein-photonenanregung Vorteile:■ Fluorophore lassen sich gezielt und tief

im Präparat anregen, da infrarotes Lichtvon den meisten biologischen Sub-stanzen nur wenig gestreut und absor-biert wird.

■ Infrarotstrahlung schädigt lebende Prä-parate erheblich weniger als kürzer-wellige Strahlung.

■ Die Wellenlängen des Anregungslichtsund der Fluoreszenz liegen weit aus-einander, sodass die Fluoreszenz übereinen breiten Spektralbereich beob-achtet werden kann, ohne dass es zumÜbersprechen mit dem Anregungslichtkommt. Die Folge ist ein geringesHintergrundrauschen bei hoher Fluo-reszenzausbeute.

■ Sehr gute Lokalisierung der Fluoreszenzund damit hoher Bildkontrast im La-serfokus durch die starke Abhängigkeitder Fluoreszenz von der Laserintensität.

Zuverlässig und einfach zu bedienen

Für den praktischen Einsatz eines Kurz-pulslasers in der Multiphotonenmikrosko-pie spielen die Lasergröße, der Strom-und Wasserverbrauch, die einfache Be-dienbarkeit und hohe Zuverlässigkeiteine entscheidende Rolle. Nicht-Laser-

spezialisten müssen das Mikroskop samtLaser im täglichen Laboralltag routine-mäßig betreiben können. Diodenge-pumpte Festkörperlaser kommen dahermit einem normalen 220-V-/500-W-Netz-anschluss aus. Die Pumpdiode wird übereinen kleinen geschlossenen Wasser-kreislauf gekühlt. Der Laserkopf, bei-

spielsweise der ›t-Pulse-20‹ von Ampli-tude Systemes, ist klein und lässt sichmit 20 x 12 x 60 cm3 leicht in ein Mikro-skopsystem integrieren. Die Laser sindfür den täglichen routinemäßigen Einsatzkonzipiert. Außerdem sind sie wartungs-frei und gewährleisten einen zuverlässi-gen Betrieb.

Die Multiphotonenmikroskopie ent-wickelt sich aufgrund der Vorteile gegen-über der konventionellen Fluoreszenz-mikroskopie zu einer der wichtigstenMessmethoden in der medizinisch-biolo-gischen Forschung. Der diodengepumptemodengekoppelte Festkörperlaser kannhelfen, die Multiphotonenmikroskopieals Routinemessverfahren für einen brei-ten Anwenderbereich zugänglich zu ma-chen.

19LASER+PHOTONIK APRIL 2005

Dr. Stefan Kremser ist Vertriebsingenieur bei Laser 2000 in Wessling.

Bild 2. Hippocampus-Neuron einer Maus – Zweiphotonenanregung von GFP und Alexa568bei 1030 nm

Bild 3. Laserkopf und Controller des t-Pulse 20 von Amplitude Systemes