St rep tokokken aus de r Umwe l t a l s Mas t i t i se r reger :

R. Tschischkale Th. Peters J. Ramm

Häufigkeiten von Streptococcus uberis und Enterokokken

im Untersuchungsmaterial eines Routinelabors

M i l c h t i e rh e rd e n -B e t re u u n g s - u n d F o rs c h u n g s g e s e l l s c h a f t m b H

● ist deutschlandweit tätig

● besitzt ein eigenes Labor für zyto- bakteriologische Untersuchungen

● ist aktiv an 7 Tagen pro Woche und 365 Tagen im Jahr

● 3 Tierärzte, zuständig für: - Beurteilung aller Bakterienkulturen - Erstellung der Befundberichte - Beratung – telefonisch und vor Ort -

● ist ein privater tierärztlicher Anbieter von Dienstleistungen im Bereich der Eutergesundheit (keine Abgabe von Medikamenten)

S t re p t o k o k k e n a l s M a s t i t i s e r re g e r

St. aureus"Sc. uberis"KNSColiformeSc. dysgalactiaeSc. agalactiaesonst

Im Labor der MBFG festgestellte Mastitiserreger(Jahres-Statistik 2007)199.168 untersuchte Milchproben (i. R. d. Mastitisdiagnostik); 59.256 mit Nachweis von Mastitiserregern (29,8%)

● St. aureus: 34,7%

●“Sc. uberis”: 32,7%

● KNS: 12,9%

● Coliforme: 6,7%

● Sc. dysgalactiae: 6,5%

● Sc. agalactiae: 2,2%

● Sonst.: 4,3%Relative Häufigkeiten von Mastitiserregern

R o u t i n e d ia g n o s t i k( s c h n e l l u n d k o s t e n g ü n s t i g )

Zellgehaltsmessung mittels Fossomatic am Tag des Probeneingangs

Erregeranzüchtung auf einem Schafblut-Agar(mit Äskulinzusatz !)

→ Erregeridentifizierung überKoloniemorphologie und evt. einfache und schnelle zusätzliche Untersuchungen wie z. B. Gramfärbung oder Katalase-Testam ersten Tag nach dem Probeneingang

→ → Antibiotikaresistenz-Test mittels Agardiffusionsverfahren (“Plättchen-Test”)

Auswertung am zweiten Tag nach Probeneingang und →→→ Befundbericht

R o u t i n e d ia g n o s t i kS t r e p t o k o k k e n a l s M a s t i t i s - E r r e g e r

In der Regel betahämolysierend:Streptococcus agalactiae (Lancefield-Gruppe B) Streptococcus canis (Lancefield-Gruppe G)

In der Regel alphahämolysierend ohne Äskulinspaltung: Streptococcus dysgalactiae (Lancefield-Gruppe C)

In der Regel alphahämolysierend mit Äskulinspaltung: Streptococcus uberis (Lancefield-Gruppe E)

Enterokokken (Lancefield-Gruppe D)und weitere wie z.B.: Streptococcus bovis, Lactococcus, Aerococcus, Leuconostoc

U m w e l t - a s s o z i i e r t e S t r e p t o k o k k e n a l s M a s t i t i s - E r r e g e r

Epidemiologisch “klassische” Einteilung:

Umwelt-assoziert:

Streptococcus uberis (Lancefield-Gruppe E)Enterokokken (Lancefield-Gruppe D)

= ~ “äskulin-positive Streptokokken” Intermediär(?):

Streptococcus dysgalactiae (Lancefield-Gruppe C)

Euter-assoziiert:Streptococcus agalactiae (Lancefield-Gruppe B) Streptococcus canis (Lancefield-Gruppe G)

● Auf äskulinhaltigem Nährboden gut identifizierbare Kolonien

● Erreger mit der höchsten bzw. zweithöchsten Nachweisrate

● Bedeutung des Nachweises bei kontaminierten Milchproben oft unklar (Zellgehalt der Probe als ein Hilfskriterium)

● Sc. uberis ?● Differenzierung von Sc. uberis,

Enterokokken und anderen Sc.morphologisch nicht möglich!

● Solche Differenzierung mit anderen Methoden zeit- und kostenaufwändig

Ä s k u l i n -p o s i t i v e S t re p t o k o k k e n... in den Mastitislaboren

Äskulinpositive Streptokokken

Ä s k u l i n -p o s i t i v e S t re p t o k o k k e n

● Erreger von klinischen und subklinischen Mastitiden

● Besonders häufiger Nachweis in Milchproben aus Betrieben mit Tiefstreu oder Tretmist

● Oft Rückmeldungen über “Erfolglosigkeit” kurzzeitiger antibiotische Behandlungen

● Berichte in landwirtschaftlicher Fachpresse: “Unlösbare Euterprobleme”

... in den milcherzeugenden Betrieben

● Warum können ubiquitäre Bakterien zu nachhaltigen Störungen der Eutergesundheit führen?

● Wie ist die Häufigkeitsverteilung von Sc. uberis und Enterokokken unter jenen äskulin-positiven Streptokokken, die aus Milchproben von Tieren mit gravierenden Mastitiden isoliert wurden?

● Wie sind die derzeit bekannten, begrenzt aufwändigen und preisgünstigen (nicht-molekularbiogischen / genetischen) Methoden zur Differenzierung zu bewerten? (Lohnend?)

● Wie ist das aktuelle Resistenzverhalten von Sc. uberis und Enterokokken?

● Führt die Kenntnis der Bakterienart zu Verbesserungen bei Vorbeuge, Prognose und Therapie?

W i c h t i g e F r a g e n i m Z u s a m m e n h a n g m i t ä s k u l i n - p o s i t i v e n S t r e p t o k o k k e n

● Untersuchungszeitraum: 01.07.2008 – 09.09.2008 (“Saison”)

● Isolierung aus Viertelgemelksproben, die im Rahmen der Mastitisdiagnostik an das Labor der MBFG eingeschickt wurden (“Routineproben”, zufällige Auswahl !)

● massenhaftes Wachstum auf äskulinhaltigem Schafblut-Agar (Lieferant: Oxoid)

● saubere Probe ● Zellgehalt der Sekretprobe >1 Mio. Zellen / ml bzw.

Sekretveränderungen wie z.B. Flocken als Zeichen einer akuten Mastitis

● → mit hoher Wahrscheinlichkeit Ausdruck einer intramammären Infektion mit dem betreffenden Erreger

● gute Identifizierung mit der “Referenz-Methode” = Bunte Reihe (“api strep” von Bio Merieux)

● nur ein Isolat pro Herkunftsbetrieb

E i n s c h l u s s k r i t e r i e n f ü r z u u n t e r s u c h e n d e I s o l a t e ä s k u l i n - p o s i t i v e r S t r e p t o k o k k e n

● Enzymatische “Kompetenz” mittels Bunter Reihe (System “api strep”) → Artbestimmung (“Referenzmethode”)

● Zugehörigkeit zu Lancefield-Gruppe D (Latex-Agglutinations-Test auf ScD ; Sc. uberis: - / Enterokokken: +)

● Wachstum auf Galle-Äskulin-Agar (Sc. uberis: - / Enterokokken: +)

● Wachstum auf Slanetz und Bartley-Medium (Sc. uberis: - / Enterokokken: +)

● Pyraseaktivität (Schnelltest auf Testkarte) (Sc. uberis: - / Enterokokken: +)

● Wachstum auf Blutagar bei 45°C (Sc. uberis: - / Enterokokken: +)

● Antibiotikaempfindlichkeit (Agardiffusionstest)

U n t e r s u c h t e M e r k m a l ed e r ä s k u l i n - p o s i t i v e n S t r e p t o k o k k e n

Artbestimmung mittels ““api-strep”

Bestimmung der Lancefield-Gruppe

Pyrasenachweis

B i l d e r z u U n t e r s u c h u n g s v e r f a h re n ( I )

B i l d e r z u U n t e r s u c h u n g s v e r f a h re n ( I I )

Wachstum auf Slanetz und Bartley-Medium

Wachstum auf Galle-Äskulin-Agar

Antibiotikaresistenz-Test Agardiffusionsverfahren

Ergebn isse I

Zahl der eingeschlossenen Isolate: 135 (zufällig ausgewählt!)

Ergebnisse mit “Referenzmethode”: Sc. uberis: 129

Enterokokken: 6 (1x E. avium, 1x E. durans, 2x E. faecalis, 2x E. faecium)

(Gute Identifizierung als Einschlusskriterium!)

● Sc. uberis-Nachweise kommen somit sehr viel häufiger vor als Enterokokken-Nachweise ! (mit gewählter “Referenzmethode”). (95,6 % : 4,4 %)

E r g e b n i s s e I I

Erreger Lancefield D Pyrase Galle-Äskulin Slanetz/Bartley Wachstum 45°CSc. uberis 7 + / 122 - 3 + / 126 - 3 + / 126 - 1 + / 128 - 124 + / 5 -Enterokokken 3 + / 3 - 4 + / 2 - 4 + / 2 - 4 + / 2 - 6 + / 0 -

Reaktionen der mit „Referenz-Methode“ (Bunte Reihe) identifizierten Sc. uberis und Enterokokken

in den fünf weiteren Testverfahren.

● Ergebnisse der Antibiotikaresistenz-Teste (Methode: Agardiffusionstest)

E r g e b n i s s e I I I

Antibiotikum Enterokokken (n = 6)s = sensibel nicht s (n) nicht s (%) nicht s (n) nicht s (%)Penicillin G 3 2 4 67Oxacillin 2 2 5 83Ampicillin 0 0 1 17Amox. + Clavulans. 0 0 3 50Pirlimicin 5 4 2 33Linco- + Neomycin 70 54 4 67Sulfon. + Trimethop. 1 1 3 50Erythromycin 13 10 2 33Tylosin 15 12 3 50Enrofloxacin 26 20 6 100Marbofloxacin 10 8 5 83Danofloxacin 79 61 5 83Cefazolin 2 2 3 50Cephalexin 2 2 4 67Cefaperazon 4 3 4 67Cefquinom 0 0 2 33

Sc. uberis (n = 129)

≥ 20% nicht sensibel

● Sc. uberis weisen weit weniger Antibiotika-Resistenzen auf als Enterokokken.

D is k u s s io n I

● Wegen des unterschiedlichen Resistenzverhaltens erscheint eine Differenzierung von äskulin-positiven Streptokokken in Sc. uberis und Enterokokken sinnvoll.

● Dies gilt insbesondere, wenn in Einsendematerial eines Betriebes viele Proben mit äskulin-positiven Streptokokken auftreten und nicht für jedes Isolat ein Antibiogramm angefertigt wird.

● Die verwendeten Differenzierungsmethoden können innerhalb des Zeitrahmens der “Routinediagnostik” angewandt werden.

● Die sechs eingesetzten Methoden führten aber zu nicht zu deckungsgleichen Ergebnissen.

D is k u s s io n I I

● Durch Prüfung auf Wachstumsmöglichkeit bei 45°C ist eine Unterscheidung von Sc. uberis und Enterokokken nicht möglich.

● Auch die anderen (“Nicht-Referenz”-)Methoden bieten hinsichtlich der Identifizierung von Sc. uberis keine zufriedenstellende Sicherheit.

● Enterokokken reagieren in den verwendeten Testverfahren (außer Wachstum bei 45°C) sehr uneinheitlich. (Zu den Enterokokken gehören verschiedene Arten!)

D i s k u s s i o n I I I

● Zusätzliche Untersuchungen verursachen zusätzliche Kosten.

● Die hier gewählte “Referenzmethode” (Bunte Reihe) ist von den vorgestellten Methoden am teuersten! (Auch mittels Bunter Reihe ist nicht jedes Isolat [gleich gut] zu identifizieren!)

● PCR als Ausweg?? (Zeit, Kosten???!)

● Lohnt die weitere Differenzierung????

D i s k u s s io n I V● Direkt mögliche Konsequenzen:● Äskulin-positive Streptokokken in Befundberichten nur als

solche ausweisen.

● Im Zweifelsfall mehr Antibiogramme für äskulin-positive Streptokokken pro Auftrag. (→ Im Zweifel ungünstigstes Antibiogramm für die anderen festgestellten äskulin-positiven Streptokokken annehmen.)

● Möglichkeit der optionalen weitergehenden Streptokokken-Differenzierung (und dadurch zusätzliche Kosten) gegenüber den Kunden stärker betonen. Restunsicherheit hinsichtlich der Bestimmung der Zugehörigkeit zu einer Bakterienart oder -untergruppe bleibt! (methodische Unsicherheiten und biologische Variabilität!)

St rep tokokken aus de r Umwe l t a l s Mas t i t i se r reger

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!