Identifizierung und Charakterisierung eines Gens in ...schnerr.net/diplom/diploma2.pdf · Inhaltsverzeichnis - III - 4.15 Dephosphorylierung von DNA 27 4.16 Ligation von DNA 27 4.17

Klonierung und Sequenzierung eines potentiellenHalogenasegens der Thienodolinbiosynthese

aus Streptomyces albogriseolus

Diplomarbeit

Technische Universität DresdenFakultät Mathematik und Naturwissenschaften

Fachrichtung Chemie

eingereicht von Helge Schnerrgeb. am 17.02.1975 in Bautzen

Gutachter: Prof. Dr. K.-H. van Pée

Dresden, den 10. Juni 1999

Inhaltsverzeichnis - II -

Bei der Gentechnik handelt es sich um einen sehr jungen Zweig der Naturwissenschaft. Erst

Anfang der 70er Jahre im Aufschwung, gehört sie heute schon zu den etablierten Methoden in

Wissenschaft und Industrie. Die Gentechnik zählt mit ihrem enormen Potential an Einsatz-

möglichkeiten zu den wichtigsten Zukunftstechnologien unserer Industriegesellschaft.

Sie ist dabei wie jede andere Technik auch wertneutral. Erst durch die Anwendung des

Menschen erfährt sie positive oder negative Seiten - sie ist also ambivalent in ihren Folgen.

Ihre Verwendung kann in vielen Fällen nützlich und deshalb erstrebenswert sein, aber nicht,

ohne Chancen und Risiken sorgfältig und objektiv gegeneinander abzuwägen. Anderseits

besteht auch die Möglichkeit des Mißbrauchs, dem es entgegen zu wirken gilt.

In unseren Händen als Wissenschaftler und angehende Wissenschaftler liegt die

Verantwortung einer sinnvollen Nutzung zum Wohle der Allgemeinheit und zum Fortschritt

der Menschheit.

Der freien Wissenschaft kommt insbesondere die Aufgabe zu, mögliche Gefahren aus der

Gentechnik wie auch die Folgen eines Verzichts auf die Gentechnik zu erkennen und einer

breiten Masse zugänglich zu machen. Nur einer soliden Grundlage von Wissen und

Erkenntnissen können Handlungsvorgaben für einen verantwortungsvollen Umgang mit neuen

Techniken erwachsen.

Genauso unverzichtbar ist eine gesellschaftliche Diskussion, die durch Sachlichkeit und

Redlichkeit geprägt ist. Aussagen sollten kritisch daraufhin überprüft werden, ob sie durch

Fakten belegt sind oder nur auf Vorurteilen beruhen.

Jedem muß es möglich sein, sich auf der Basis von Sachinformationen eine eigene Meinung

bilden zu können.

Nur so kann auch in einer breiten Bevölkerungsschicht ein Grundkonsens über einen

verantwortungsvollen Einsatz von innovativen Technologien oder gar Schlüsseltechnologien,

wie der Gentechnik, erzielt werden.

Inhaltsverzeichnis - II -

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis II

Abbildungsverzeichnis V

Tabellenverzeichnis VI

Symbol- und Abkürzungsverzeichnis VII

1 Einleitung 1

2 Theoretische Grundlagen 52.1 Halogenierende Enzyme 5

2.2 Die Tryptophan-Halogenase (PrnA) 5

2.3 Die Biosynthese des Pyrrolnitrins 7

2.4 Erforschung weiterer Halogenasegene in anderen Organismen 8

2.5 Das Thienodolin 9

3 Aufgabenstellung 11

4 Material und Methoden 124.1 Geräte 12

4.2 Chemikalien und Enzyme 14

4.3 Bakterienstämme, Plasmide und Phagen 154.3.1 Bakteriophagen M13mp18 und M13mp19 164.3.2 Der Vektor pUC18 17

4.4 Antibiotika, Isopropyl-β-D-thiogalaktosid (IPTG)und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid (X-Gal) 18

4.5 Medien 18

4.6 Puffer und Lösungen 20

4.7 Organische Lösungen 21

4.8 Sterilisation 21

4.9 Kulturbedingungen 214.9.1 Züchten von Streptomyces albogriseolus MJ286-76F7 214.9.2 Escherichia coli-Lösung für die Stammsammlung 21

4.10 Isolierung von DNA 224.10.1 Isolierung der Gesamt-DNA aus Streptomyces albogriseolus 224.10.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli und M13-Bakteriophagen mit der S-Lyse 23

4.11 Quantitative Bestimmung von DNA 24

4.12 Agarosegelelektrophorese 24

4.13 Elution von DNA aus Agarosegelen 254.13.1 Elution mittels „Geneclean III Kit„ 254.13.2 Elution mittels „freeze squeeze„-Methode 26

4.14 Restriktion von DNA 26

Inhaltsverzeichnis - III -

4.15 Dephosphorylierung von DNA 27

4.16 Ligation von DNA 27

4.17 Klonierung in Escherichia coli 284.17.1 Präparation von kompetenten Zellen 284.17.2 Transformation von Escherichia coli 294.17.3 Selektion der Escherichia coli-Transformanten 30

4.18 Polymerasekettenreaktion 304.18.1 PCR-Versuche 31

4.19 Hybridisierung von DNA 324.19.1 Southern-Transfer 324.19.2 Markierung der Sonden 334.19.3 Hybridisierung 344.19.4 Detektion 364.19.5 Rehybridisierung 37

4.20 Klonierung des potentiellen Halogenase-Gens aus Streptomyces albogriseolus 374.20.1 Anlage einer angereicherten Genbank der genomischen DNA von Streptomyces albogriseolus

in pUC18 374.20.2 Klonanalyse 384.20.3 Erstellung einer partiellen Restriktionskarte 39

4.21 Klonierung in M13-Bakteriophagen 394.21.1 Subklonierung in M13mp18 und M13mp19 394.21.2 Transfektion von Escherichia coli TG1 404.21.3 Untersuchung rekombinanter M13-Phagen 414.21.4 ssDNA-Isolierung 41

4.22 DNA-Sequenzierung 424.22.1 Primer-Annealing 434.22.2 Extension und Termination 434.22.3 Elektrophorese 444.22.4 DNA-Fixierung und Antikörperbindung 454.22.5 Kolorimetrische Detektion 45

5 Ergebnisse 475.1 Identifizierung eines potentiellen Halogenasegens in der genomischen DNA von

Streptomyces albogriseolus 47

5.2 Anlage einer angereicherten Genbank der genomischen DNA aus Streptomycesalbogriseolus in pUC18 48

5.3 Klonanalyse durch Plasmidisolierung, Southern-Blotting und Hybridisierung 49

5.4 Die PCR-Sonde 51

5.5 Restriktionsanalyse des Plasmids pHI1536 53

5.6 Restriktionsanalyse des Inserts aus pHI1536 54

5.7 Erstellung einer partiellen Restriktionskarte des 4,5 kb Pae I/Kpn I-Fragments 56

5.8 Subklonierung des 0,52 kb Pst I/Cfr9 I-Fragments in M13-Phagen und Sequenzierungdieses Fragments 59

6 Diskussion 64

7 Zusammenfassung 66

Inhaltsverzeichnis - IV -

8 Literaturverzeichnis X

Anhang XVII

Danksagung XVII

Eidesstattliche Erklärung XVIII

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis - V -

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Beispiele natürlicher Halogenverbindungen 3

Abb. 2: Struktur des Epibatidins 4

Abb. 3: Allgemeines Reaktionsschema von Haloperoxidasen 5

Abb. 4: Spezifische Halogenierung am Beispiel von Tryptophan zu 7-Chlortryptophan durch

die Tryptophan-7-Halogenase 6

Abb. 5: Biosyntheseweg des Pyrrolnitrin (HOHAUS et al., 1997) 7

Abb. 6: Die Struktur des Thienodolins (KANBE et al., 1992) 9

Abb. 7: Restriktionskarte und Polylinker von M13mp18 und M13mp19

(YANISCH-PERRON et al., 1985) 16

Abb. 8: Restriktionskarte von pUC18 (YANISCH-PERRON et al., 1985) 17

Abb. 9: Aufbau eines Kapillarblots 32

Abb. 10: Agarosegel der Restriktionsansätze 47

Abb. 11: Hybridisierungsergebnis des Gels 47

Abb. 12: Klonierungsschema für das rekombinante Plasmid pHI1536 48

Abb. 13: Agarosegel zur Analyse der Klone vonPlatte 32 49

Abb. 14: Ergebnis der Hybridisierung mit PCR-Sonde 49

Abb. 15: Hybridisierungsversuche zur Optimierung des Genbankscreenings 52

Abb. 16: Restriktionsanalyse von pHI1536 53

Abb. 17: Agarosegel der Restriktion des Inserts aus pHI1536 55

Abb. 18: Hybridisierung mit der PCR-Sonde 55

Abb. 19: Restriktionskarte für Bam HI 56

Abb. 20: Restriktionskarte für Pst I 56

Abb. 21: Restriktionskarte für Sma I 56

Abb. 22: Restriktionskarte für Sal I 56

Abb. 23: Agarosegel der doppelten Restriktionsspaltung 57

Abb. 24: Restriktionskarte Bam HI/Sma I- Doppelspaltung 58

Abb. 25: Restriktionskarte Bam HI/Pst I-Doppelspaltung 58

Abb. 26: Restriktionkarte Pst I/Sma I-Doppelspaltung 58

Abb. 27: Partielle Restriktionskarte des Inserts aus pHI1536 59

Abb. 28: Schema der Subklonierung in M13-Bakteriophagen 60

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis - VI -

Abb. 29: Vergleich der Sequenz 1 des 520 bp-Fragments in M13mp18 mit prnA 61

Abb. 30: Vergleich der Aminosäuresequenz von Fragment 1 des 520 bp-Fragments in

M13mp18 mit prnA 62

Abb. 31: Bindestelle für den PCR-Primer trpst1+ 62

Abb. 32: Vergleich der Nucleotidsequenz von Fragment 2 des 520 bp-Fragments in

M13mp19 mit prnA 63

Abb. 33: Bindestelle für den PCR-Primer trpst1- 63

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Übersicht über die verwendeten Organismen 15

Tab. 2: Übersicht über die Plasmide 16

Tab. 3: Antibiotika, ITPG und X-Gal 18

Tab. 4: Primer für homologe Proteine der Tryptophanhalogenase 31

Tab. 5: Prähybridisierungslösung für die entsprechenden Sonden 35

Tab. 6: Bedingungen für die Hybridisierung und die Stringenzwaschschritte 35

Tab. 7: Restriktionsanalyse von pHI1536 54

Tab. 8: Restriktionsanalyse des Plasmids aus pHI1536 55

Tab. 9: Fragmente der Doppelrestriktionsspaltung von pHI1536 58

Symbol- und Abkürzungsverzeichnis - VII -

Symbol- und Abkürzungsverzeichnis

A AdenosinAbb. AbbildungAmp AmpicillinAmpR AmpicillinresistenzAPS Ammoniumperoxodisulfatatm Atmosphäre(n)ATP Adenosintriphosphatbidest. bidestilliertbp BasenpaareC Cytosin°C Grad CelsiusCDP-StarTM Dinatrium-2-chloro-5-(4-methoxyspiro1,2-dioxethan-3,2‘-(5‘-chloro)-

tricyclo[3.3.1.1.]decan-4-yl)-1-phenylphosphatDa Daltondeion. deionisiertDMF N,N-DimethylformamidDMSO DimethylsulfoxidssDNA Einzelstrang-DNAdsDNA Doppelstrang-DNADTT 1,4-DithiothreitdATP 2´-DesoxyadenosintriphosphatdCTP 2´-DesoxycytidintriphosphatdGTP 2´-DesoxyguanosintriphosphatdTTP 2´-DesoxythymidintriphosphatddATP 2´,3´-DidesoxyadenosintriphosphatddCTP 2´,3´-DidesoxycytidintriphosphatddGTP 2´,3´-DidesoxyguanosintriphosphatddTTP 2´,3´-DidesoxythymidintriphosphatddNTP DidesoxynucleotideE ExtiktionEDTA EthylendiamintetraessigsäureEtBr EthidiumbromidEtOH EthanolF FaradFAD Flavinadenindinucleotid

Symbol- und Abkürzungsverzeichnis - VIII -

g GrammG Guaninh Stunde(n)IPTG 1-Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosidl Literkb Kilobasenkonz. konzentriertM Molm Metermcs multiple cloning sitemin Minute(n)NADP NikotinamidadenindinucleotidphosphatNBT Nitroblau-TetrazolinumsalzOD optische DichteΩ Ohmori origin of replicationPrn Enzym der Pyrrolnitrinsyntheseprn Gen für Enzym der PyrrolnitrinbiosyntheseRF ReplikationsformpH pondus hydrogeniiRT RaumtemperaturSDS Natriumdodecylsulfatsec SekundenSSC standard sodium citratTm Schmelztemperatur des HybridsTH HybridisierungstemperaturTAE Tris-Acetat-EDTATBE Tris-Borat-EDTATE Tris-EDTATEMED N,N,N´,N´-TetramethylethylendiaminTris Tris(hydroxymethyl)-aminomethanU Unit(s)Upm Umdrehungen pro MinuteUV UltraviolettVol. Volumenv/v Volumen pro Volumenw/v Gewicht pro VolumenX-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indoyl-β-D-galactopyranosidX-Phosphat 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat-Toluidiniumsalz

Symbol- und Abkürzungsverzeichnis - IX -

Präfixe für Einheiten:

k Kiloc Centim Milliµ Mikron Nanop Pico

Dreibuchstaben- und Einbuchstabencodes der natürlichen Aminosäuren:

Alanin Ala ACystein Cys CAspartat Asp DGlutamat Glu EPhenylalanin Phe FGlycin Gly GHistidin His HIsoleucin Ile ILysin Lys KLeucin Leu LMethionin Met MAsparagin Asn NProlin Pro PGlutamin Gln QArginin Arg RSerin Ser SThreonin Thr TValin Val VTryptophan Trp WTyrosin Tyr Y

Theoretische Grundlagen - 1 -

1 Einleitung

Das Chlor, aus der Gruppe der Halogene (griech.: Salzbildner), gehört zu den 20 häufigsten

Elementen. Da es sich um ein sehr reaktives Element handelt, kommt es in der Natur nicht im

freien Zustand vor. Es ist mineralisch in Gesteinen und Erden gebunden, so im Steinsalz

NaCl, im Sylvin KCl oder im Carnallit KCl ⋅ MgCl2 ⋅ 6 H2O. Außerdem enthält das Wasser

der Ozeane etwa 2 Prozent an ionisiertem Chlor, vor allem in Form von Natriumchlorid. Aber

auch in der belebten Natur gibt es schon seit Jahrmillionen Halogenverbindungen. Denkt man

nicht zuerst an das Vorhandensein von 0,3 - 0,4 % Chlorwasserstoff im Magensaft des

Menschen, entsprechend einer 0,1 molaren Salzsäurelösung.

Bereits vor über 100 Jahren wurde die erste natürliche Halogenverbindung, 3,5-Diiodtyroxin,

eine iodierte Aminosäure, aus der Koralle Gorgonia cavolinii isoliert und identifiziert

(DRECHSEL, 1896). Heute dringt man mit hochmodernen Methoden immer tiefer in den

Mikrokosmos der Natur vor. Durch Analyseverfahren, die inzwischen Ultraspuren

nachweisen, kennt man bisher mehr als 3000 natürliche organische Halogenverbindungen.

Diese Verbindungen finden sich in Algen, Flechten, Bakterien und Pilzen, aber auch in

Pflanzen und sogar Tieren. Die Zahl der Organismen, die diese strukturell und biologisch

interessanten Chemikalien synthetisieren, ist ebenso groß wie die Vielfalt der Verbindungen

(GRIBBLE, 1998).

Dabei handelt es sich keineswegs um Kuriositäten – viele dieser Verbindungen sind für die

jeweiligen Organismen als Stoffwechselprodukte, Abwehrstoffe, Hormone und Signalstoffe

von Nutzen, vielfach sogar unentbehrlich (STEGLICH, 1997).

Man findet bei marinen Organismen überwiegend bromierte Verbindungen, bei den

terrestrisch lebenden Organismen dominieren hingegen die chlorhaltigen Metabolite. Die

geringere Häufigkeit an fluor- und jodhaltigen Verbindungen beruht auf den sporadischen,

natürlichen Vorkommen. Die recht seltenen jodierten Metabolite analysierte man in Algen

und Säugetieren; in Pflanzen und Bakterien die noch seltener vorkommenden fluorierten

Verbindungen.

In der organischen Synthese nehmen die Halogene eine Schlüsselrolle ein; als Elektrophile,

Radikale und Abgangsgruppen haben sie enorme Bedeutung. Allerdings sind Industrie-

verfahren zur Erzeugung halogenierter Verbindungen recht energie- und kostenaufwendig,

außerdem kann die Bildung unerwünschter Nebenprodukte nicht ausgeschlossen werden.


Da in der Natur mit Hilfe von Enzymen ohne großen Energieaufwand substratspezifisch und

regioselektiv halogeniert werden kann, bietet die Biosynthese halogenierter Verbindungen

eine interessante Alternative (VAN PÈE, 1996).

Viele der natürlichen Halogenverbindungen besitzen eine hohe biologische Aktivität und

zeigen oft eine ausgeprägte Wirkung auf tierische und pflanzliche Organismen. Die

Wirkungen können antibiotisch, cytotoxisch oder insektizid sein, oder die Verbindungen

wirken als Enzyminhibitoren, man findet aber auch viele meist heterozyklische Metabolite mit

unbekannter Wirkung (WIESNER, et al. 1990).

Seit etwa 50 Jahren werden Wirkstoffe aus Mikroorganismen in biotechnologischer

Produktion gewonnen. Seither ist es möglich, bakterielle Infektionen mit Antibiotika zu

therapieren. Man unterscheidet dabei Antibiotika mit bakteriostatischer Wirkung, die das

Wachstum von Mikroorganismen hemmen, und solche mit bakteriozider Wirkung, die die

Mikroorganismen abtöten. Ein ernsthaftes Problem bei diesen Therapien liegt in der

Möglichkeit, resistente pathogene Bakterien zu selektionieren und zu verbreiten – dies führt

zu einer vermehrten Morbidität und Mortalität. Deshalb werden auch heute erhebliche

Anstrengungen bei der Suche nach neuen wirksamen Verbindungen unternommen. Als

interessantes Suchfeld erkannte man die originären Wirkstoffquellen wie marine Organismen,

z.B. Hohl- und Manteltiere, Plankton und Algen oder Bodenbakterien, z.B. Streptomyceten.

Mit den bisher bekannten bioaktiven Substanzen mikrobieller Herkunft wurden

schätzungsweise erst 10 % des Gesamtpotentials der Mikroorganismen zur Wirkstoff-

biosynthese erfaßt (ZÄHNER, 1982).

Dennoch ist heute das Wissen um die biologische Wirkung der meisten halogenierten

Verbindungen, die in überaus hoher Zahl isoliert und charakterisiert sind, meist noch äußerst

lückenhaft.

Viele halogenierte Verbindungen, die man bis heute isoliert hat, haben aber eine große

Bedeutung erlangt, und sind aus unserem Leben nicht mehr wegzudenken. Verbindungen mit

therapeutischer Wirkung haben zusammen mit anderen Antibiotika in den Industrienationen

einen wesentlichen Anteil an der Kontrolle und Ausrottung epidemischer Erkrankungen und

dem generellen Anstieg der Lebenserwartung.

Die häufigste aller Chlorverbindungen, die in der Natur entsteht, ist das Methylchlorid mit

fünf Millionen Jahrestonnen (NAUMANN, 1993).


Doch die Diversifikation der Halogenverbindungen ist enorm; so gehören einfachere

Metabolite wie Trichlorethylen oder Perchlorethylen aus Meeresalgen genauso zum Spektrum

wie die von Bakterien halogenierten Verbindungen, welche eine antibiotische Aktivität in

ihrer Wirkung zeigen und weitaus komplexer und komplizierter aufgebaut sind

(siehe Abb. 1), z.B. das Pyrrolnitrin [1] aus Pseudomonas fluorescens, das Chloramphenicol

[2] aus Streptomyces venezuelae oder das Vancomycin [3] aus Amycolatopsis orientalis.

[1] [2]

[3]

Abb. 1: Beispiele natürlicher Halogenverbindungen

Wie oben schon erwähnt, sind nicht nur Mikroorganismen in der Lage, solche Strukturen zu

synthetisieren. Eine vielversprechende Verbindung wurde erst kürzlich in Ecuador in der Haut

des Frosches Epipedobates tricolor entdeckt – das Epibatidin (Abb.2).

HClNO2 N

ClO2N CH CH

OH

NHCOCHCl2

CH2OH

OO

NH2

CH3

OH

H3C

O

OH

CH2OH

O

OH

O O

Cl

Cl

NH

HO

H

N

HO

H

HOO

HO OHOH

O

H

NH

O

HNH

O

NH2O

H

N

O

HNH

HOH

OH

NH

CH3

H3C HCH3

HH


Abb. 2: Struktur des Epibatidins

Bei dieser Verbindung handelt es sich um das bisher stärkste bekannte Schmerzmittel. Es ist

rund 200 mal wirksamer als Morphium. Die Wirkung entwickelt sich hierbei am

Acetylcholin-Rezeptor und das Suchtpotential ist gleich Null. Die gentechnische Gewinnung

ist notwendig, damit die Substanz unbegrenzt zur Verfügung steht und der Frosch nicht

aufgrund seiner wertvollen Haut ausgerottet wird.

Aber es gibt auch Schattenseiten; einer der umstrittensten Vertreter ist hierbei das Dichlor-

diphenyltrichlorethan, das DDT. Dabei handelt es sich um ein Kontaktinsektizid, dessen

Wirkung 1939 von dem Schweizer Paul Müller entdeckt wurde, der dafür 1948 mit dem

Nobelpreis für Medizin ausgezeichnet wurde.

Der Siegeszug begann in der Nachkriegszeit durch den Einsatz in der medizinischen Hygiene.

Man konnte wirksam die Überträger von Erregern der Krankheiten Malaria, Fleckfieber,

Typhus und Cholera bekämpfen. Die Resistenz einiger Insektenarten gegen das DDT, die

Anreicherung in der Umwelt sowie im tierischen und menschlichen Fettgewebe - und damit

auftretende chronische Vergiftungen - führten Anfang der 70er Jahre zum Verbot der

Herstellung und Verwendung von DDT in allen Industrienationen.

Auf DDT zurückzuführende Erkrankungen von Menschen, die besonders häufig mit dem

Wirkstoff in Berührung kommen, sind bisher nicht bekannt; auch das Argument der Persistenz

des Wirkstoffes sieht man heute differenzierter. Es konnte nachgewiesen werden, daß DDT

unter dem Einfluß von UV-Licht sogar sehr schnell zu CO2 und HCl abgebaut wird. In den

Entwicklungsländern wird es weiterhin produziert und angewendet, dort wird es vor allem zur

Bekämpfung der Malaria übertragenden Anopheles-Mücke eingesetzt

(Römpp/Chemielexikon).

Dieses Beispiel zeigt deutlich, daß eine der Hauptaufgaben der Wissenschaftler in der

Wahrnehmung ihrer Verantwortung liegt. Sie sind es, die neue Stoffe objektiv einschätzen

und auf Abbaubarkeit, mögliche Gesundheitsrisiken und Umweltbelastungen prüfen müssen.

H N ClN

H


2 Theoretische Grundlagen

2.1 Halogenierende Enzyme

Halogenierte Verbindungen in Organismen werden durch Enzyme gebildet.

Bei den halogenierenden Enzymen unterscheidet man die Haloperoxidasen und die

Halogenasen. Bei ersteren differenziert man in Häm-Haloperoxidasen, welche Häm als

prosthetische Gruppe besitzen, und in Nicht-Häm-Haloperoxidasen.

Haloperoxidasen katalysieren folgende Reaktion:

Abb. 3: Allgemeines Reaktionsschema von Haloperoxidasen

Erst in den fünfziger Jahren wurde halogenierende Aktivität in herkömmlichen Peroxidasen,

wie der Meerrettichperoxidase, neben der eigentlichen Peroxidase-Aktivität nachgewiesen.

Die erste Haloperoxidase aus einem Mikroorganismus wurde 1959 aus dem Pilz

Caldariomyces fumago isoliert (HAGER et al., 1966). Erst 25 Jahre später konnte die erste

bakterielle Haloperoxidase, eine Bromperoxidase, in Streptomyces phaeochromogenes

nachgewiesen werden (VAN PÈE, LINGENS, 1984).

Heute kennt man solche Enzyme aus über einhundert verschiedenen Quellen, wobei einige

sogar schon kommerziell erhältlich sind.

Die Vertreter der zweiten Gruppe, die Halogenasen, katalysieren die Halogenierung

organischer Substrate, sowohl Aromaten, deren aliphatische Seitenketten als auch reine

Aliphaten. Unter milden Bedingungen wird ein Halogenidion spezifisch, z.B. in ein

aromatisches System, eingeführt.

2.2 Die Tryptophan-Halogenase (PrnA)

R- H + H2O2 + H+ + X- R- X + 2 H2O

X-= I-, Br- oder Cl-


Das Tryptophan-Halogenase-Gen (prnA) ist von HAMMER et al. (1997) im Pyrrolnitrin-

Biosynthese-Gencluster aus Pseudomonas fluorescens identifiziert worden.

Die Sequenzierung des 1616 bp großen Gens (prnA) ergab die 538 Aminosäuren umfassende

Primärstruktur.

Die bereits an PrnA durchgeführten Untersuchungen haben gezeigt, daß für die

Halogenaseaktivität die Cofaktoren NADH (HOHAUS et al., 1997)und FAD benötigt werden.

Desweiteren konnte bei ersten Reinigungsversuchen mit Anionenaustausch-Chromatographie

aus dem Rohextrakt ein für die Aktivität ebenfalls existenzielle Komponente teilweise

abgetrennt und angereichert werden. Aufbauend auf dieser Erkenntniss wurde ein spezifischer

Aktivitätstest entwickelt. Das es sich bei dem abgtrennten Enzym um eine NADH:FAD-

Oxidoreduktase handelt, ist kürzlich durch Untersuchungen mit SsuE, einer NAD(P)H:Flavin-

Oxidoreduktase aus Escherichia coli, bestätigt worden. (WAGE, persönl. Mitteilung).

Somit ist folgender, in Abb. 4 zusammenfassend dargestellter Reaktionsmechanismus für die

Umsetzung von Tryptophan zu 7-Cl-Tryptophan an PrnA zu postulieren:

Abb. 4: Spezifische Halogenierung am Beispiel von Tryptophanzu 7-Chlortryptophan durch die Tryptophan-7-Halogenase

+ +,

- FAD , - H2O

- H2O

FAD + NADH + H + FADH2 + NAD +

FADH2 + O2 FADHOOH

FAD-HOOH

D,L-Tryptohan

7-Chlortryptophan

H+

Cl

N

NH2

COOH

N

NH2

COOH

Cl

N

NH2

COOH

O

N

NH2

COOH

ClHO

H H

HH


Zunächst wird in einer PrnA vorgelagerten Reaktion an der NADH:FAD-Oxidoreduktase mitFAD, NADH und O2 das FAD-Hydroperoxid nach bereits bekanntem Mechanismus(MASSEY, 1994) gebildet. Dieses FADHOOH wird von PrnA mit Tryptophan zumdargestellten Oxiran umgesetzt (Epoxidierung). Damit wird das Substrat aktiviert, denn dieRingspaltung durch nukleophilen Angriff ist eine typische Reaktion für Epoxide. So wird dasChlor als Anion in das Substrat unter Bildung des entsprechenden Chlorhydrins eingeführt.Abschließend wird unter Wasserabspaltung das halogenierte Produkt, 7-Chlortryptophan,gebildet.

2.3 Die Biosynthese des Pyrrolnitrins

Beim Pyrrolnitrin handelt es sich um eine antifungisch wirkende Substanz, die 1965 entdeckt

wurde (ARIMA et al., 1964) und deren Struktur kurze Zeit später aufgeklärt wurde

(NAKANO et al., 1966).

Abb. 5: Biosyntheseweg des Pyrrolnitrin (HOHAUS et al., 1997)

NH

NH2

COOH

NH

NH2

COOH

Cl

NHNH2

Cl

NHNH2

Cl

Cl

NH

Cl

Cl

NO2

D,L-Tryptophan 7-Chlortryptophan

Monodechloraminopyrrolnitrin

AminopyrrolnitrinPyrrolnitrin


Bei der Untersuchung des Biosyntheseweges des Pyrrolnitrins entdeckte man erstmalig

Enzyme, die nicht nach dem bisher bekannten Mechanismus der Haloperoxidasen, sondern

regioselektiv und substratspezifisch unter Einwirkung von NADH und Sauerstoff das Substrat

halogenieren (2.1) (HOHAUS et al.,1997).

Die Biosynthese (Abb. 5) verläuft über drei Zwischenstufen und wird durch vier Enzyme

PrnA, PrnB, PrnC und PrnD katalysiert. Im ersten Schritt wird Tryptophan unter Einwirkung

von PrnA zu 7-Chlortryptophan chloriert. Beim zweiten Schritt findet eine

Umlagerungsreaktion zu Monodechloraminopyrrolnitrin statt. Im dritten Schritt wird mit Hilfe

der zweiten Halogenase (PrnC) ein weiteres Chloridion in das Substrat eingebaut; worauf im

letzten Schritt das so entstandene Aminopyrrolnitrin unter Oxidation der Aminogruppe zur

Nitrogruppe in das Pyrrolnitrin umgewandelt wird (VAN PÉE et al.,1980; KIRNER et al.,1998).

2.4 Erforschung weiterer Halogenasegene in anderen Organismen

Die Gene für die halogenierenden Enzyme prnA und prnC aus Pseudomonas fluorescens

konnten kloniert und sequenziert werden (HAMMER et al.,1997).

Weiterhin untersuchte man Gesamt-DNA verschiedener Organismen, die auch halogenierte

aromatische Verbindungen bilden und deren Grundstruktur ebenfalls der Indolring ist, der an

verschiedenen Positionen durch unterschiedliche Halogene (Chlor oder Brom) substituiert

sein kann.

Die Hybridisierungsexperimente mit den Halogenasegenen prnA und prnC als Sonden führten

zu positiven Ergebnissen (BURD et al., 1997).

Die Untersuchungen zur Substratspezifität der Tryptophanhalogenase PrnA führten zu dem

Ergebnis, daß eine Vielzahl vom Tryptophan abgeleiteter Verbindungen als Substrat

akzeptiert werden (HÖLZER, persönliche Mitteilung). Diese Tatsachen erlauben die

Schlußfolgerung, daß die Enzyme, die in verschiedenen Organismen ähnliche Strukturen

synthetisieren, in ihrem Aufbau Analogien aufweisen müßten.

Diese Schlußfolgerung ist auch die Grundlage der vorliegenden Arbeit, bei der die

Chlorierung in der Biosynthese des Thienodolins aus Streptomyces albogriseolus untersucht

wurde.


2.5 Das Thienodolin

Bei dieser Verbindung handelt es sich um eine Substanz, die das Pflanzenwachstum reguliert.

Die Verwendung von Wachstumsregulatoren ist in der modernen Agrarwirtschaft

ausschlaggebend für hohe Erträge bei weiterer Verbesserung der Qualität des jeweiligen

Produkts. Viele dieser Substanzen wurden hauptsächlich nur deshalb entwickelt, um drei

Hauptziele im Reisanbau zu erreichen.

1. Ein verstärktes Wurzelwachstum bei den jungen Setzlingen

2. Verhinderung der Wirkung von Wachstumsinhibitoren

3. Erhöhung der Einzelkorngröße während der Reife.

Neben synthetisch gewonnen Produkten, die in verschiedenen Wachstumsphasen zum Einsatz

kommen, kennt man heute auch viele natürliche wachstumsregulierende Substanzen, die man

aus Mikroorganismen, hauptsächlich Pilzen, isoliert hat. Dazu gehören z.B. Helminthosporol,

Cotylenin, Ampullicine oder Specifenin (KANBE et al., 1992). Diese Verbindungen zeigen

eine regulierende Aktivität, wenn Pflanzen oder Pflanzenteile damit behandelt werden. Sogar

bei geringen Konzentrationen kann diese Wirkung noch beobachtet werden, aber aus einigen

Gründen, wie Kosten, begrenzter Verfügbarkeit oder Phytotoxizität, haben sie keine

praktische Bedeutung erlangt.

In dem Streptomyceten-Stamm MJ286-76F7, der als Streptomyces albogriseolus identifiziert

und bereits 1954 von Benedict et al. entdeckt wurde, fanden Kanbe und seine Arbeitsgruppe

eine Verbindung, die signifikante Regulatoraktivität gegenüber Sämlingen der Reispflanze

zeigt - das Thienodolin (KANBE et al., 1992).

Kanbe war es auch, der die Struktur der neu entdeckten Verbindung aufklären konnte, die in

Abb. 6 dargestellt ist.

Abb. 6: Die Struktur des Thienodolins (KANBE et al., 1992)

HN SCl

NH2

O


Das Thienodolin zeigt sowohl eine Wachstumsunterstützung, als auch eine Wirkung als

Inhibitor bei jungen Reispflanzen. Diese Eigenschaft steht im Zusammenhang mit der

Konzentration; so sind hohe Konzentrationen wachstumshemmend und geringe

Konzentrationen wachstumsfördernd.

Man erkennt bei einer Behandlung der Sämlinge mit 0,4 x 10-5 M Thienodolin, daß sich die

Länge der Sprößlinge um 25 % und die Länge der Wurzeln sogar um 59 % im Vergleich zu

nichtbehandelten Sämlingen erhöht. Eine Behandlung mit 4,0 x 10-5 M Thienodolin inhibiert

jedoch das Wachstum der Sprossen (28 %) wie auch der Wurzeln (27 %) (KANBE et al.,

1992).

Wäre es möglich, Thienodolin effizient auf gentechnischem Weg zu gewinnen, könnte es

einen Einsatz in der modernen Agrarwirtschaft finden. Damit könnte man Wachstums-

rückstände an Reispflanzen, die durch Herbizide verursacht werden, ausgleichen.

Aufgabenstellung - 11 -

3 Aufgabenstellung

Bedingt durch strukturelle Analogien mehrerer chlorierter Verbindungen zu den Metabolitender Pyrrolnitrinbiosynthese erwartet man auch ähnliche halogenierende Enzyme, so z.B. imSyntheseweg des Thienodolins.Erfolgreiche Untersuchungen zu Sequenzhomologien von Halogenasegenen bei ver-schiedenen Bodenbakterien haben diese Vermutung bestätigt. Durch Hybridisierungs-experimente wurden homologe Gene NADH-abhängiger Halogenasen in unterschiedlichenMikroorganismen detektiert (BURD et. al, 1997).Mit dem DNA-Abschnitt, der das Enzym codiert, welches die spezifischeChlorierungsreaktion zu 7-Chlortryptophan katalysiert, sollte in Streptomyces albogriseolusein Gen nachgewiesen werden, dessen Enzym für den Halogenierungsschritt in derThienodolinbiosynthese verantwortlich ist.Nach Identifizierung eines potentiellen Gens sollte dieses kloniert und sequenziert werden.Zum Einsatz kamen die Hybridisierungstechnik, die Polymerasekettenreaktion, dieSequenzierungsmethode nach Sanger und andere molekulargenetische Arbeitstechniken.

Materialien und Methoden -12-

4 Material und Methoden

4.1 Geräte

Autoklaven:

- Varioklav® Dampfsterilisator Typ 500, H+P Labortechnik GmbH, Oberschleißheim

DNA-Dokumentation:

- Gel Doc 1000 Mini-Transilluminator, Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Einschweißgerät:

- vacuplus, petra electric

Elektrophorese:

- Horizontale Submersapparaturen für Agarosegelelektrophoresen, Zentralwerkstatt,

Universität Hohenheim

- EasycastTM Horizontal Electrophoresis System, peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen

Elektroporation:

- Easyjec T Basic, peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen

Hybridisierung:

- Hybaid Hybridisierungsofen, MWG-Biotech Gesellschaft für Angewandte Biotechnologie

mbH, Ebersberg

- Mini Hybridisation oven, Appligene-Oncor, Illkirch (Frankreich)

Mikrowellengerät:

- Moulinex Compact Y50, Groupe Moulinex, Paris (Frankreich)

Netzgeräte:

- Blue Power 500, Serva Feinbiochemica GmbH & Co KG, Heidelberg

- EPS 3500, Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg

- PowerPack 300, Bio-Rad Laboratories GmbH, München

pH-Messung:

- pH-Meter DELTA 320, Mettler-Toledo Prozeßanalytik GmbH, Steinbach/Ts.

Photometer:

- Biochrom 4060, Pharmacia Biotech, Freiburg

Rührer:

- Heidolph MR 1000, Heidolph Elektro GmbH & Co. KG, Kehlheim


Rundschüttlermaschine:

- GFL® 3005, Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel

Sequenzierung:

- Direkt-Blotting-Elektrophorese-System GATC 1500, DNA-Sequencer, GATC-Gesell-

schaft für Analyse-Technik und Consulting mbH, Konstanz

- Personal Cycler, Biometra biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen

Shaker:

- Minishaker MS1, IKA® works, INC., Wilmington, Il. (USA)

Spritzenfilter:

- Nalgene® 0,45 µm Syringe Filter, 25 mm surfactant free cellulose acetate membrane

(steril), Nalgene Company, New York (USA)

Sterilbank:

- LaminAir HB2448, Holten, Allerod (Dänemark)

Thermoblock:

- Thermomixer 5436, Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg

Waagen:

- Kern 510-37, Gottlieb Kern & Sohn GmbH, Albstadt

- MC 1 Research RC 210P, Sartorius, Göttingen

Wasseraufbereitungsanlage:

- Kleinreinstwassersystem RS 40 EZ, Wasseraufbereitung und Regenerierstation GmbH,

Barsbüttel

- Wasseraufbereitungsanlage bestehend aus: Enthärtunganlage (Seralsoft SW 300), Revers-

Osmose-Anlage (Seradest BETA 25) und Ionenaustauscher (Seradest USF 800), Seral

Reinstwassersysteme GmbH, Ransbach-Baumbach

Wasserbad:

- W6, Prüfgeräte-Werk Medingen GmbH, Medingen

Zellzüchtung:

- MULTITRON Incubatorshaker, INFORS AG, Bottmingen, Schweiz

- Brutschrank BE 500, Memmert GmbH & Co.KG, Schwabach

Zentrifugen:

- Tischzentrifuge GS-15R, Rotoren S 4180 und F3602, Beckman Instruments GmbH,

München

- Centrifuge 5415 C, Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg


4.2 Chemikalien und Enzyme

AGS GmbH, Heidelberg und MBI-Fermentas, St. Leon Rot:

Restriktionsenzyme: Bam HI, Bgl II, Eco RI, Hind III, Kpn I, Pst I, Sal I, Sma I, Xma I, Cfr9 I,

Pae I; Restriktionspuffer; T4-DNA-Ligase, DTT, ATP, Ligasepuffer; Taq Polymerase

Amersham, Braunschweig:

Phosphatasen, Dephosphorylierungspuffer, Ligasepuffer; T4-DNA-Ligase

Baker, Deventer:

NaOH, NaCl, KCl, Chloroform, i-Propanol

Biomol, Hamburg:

IPTG, TES, Tris, X-Gal

Bio-Rad, München:

NBT, X-Phosphat

Boehringer Mannheim, Mannheim:

Anti-DIG-AP, Blocking Reagenz, DIG-High Prime, DIG Luminescent Detection Kit, DIG

Taq DNA Sequencing Kit

Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe:

Roti®-Phenol

GATC, Konstanz:

APS, GATC-Gel 30%, Harnstoff, TEMED, Tris

Dianova, Hamburg:

Geneclean III Kit

Difco, Augsburg:

Bacto Pepton, Bacto Trypton, Casamino acids, Hefeextrakt, Malzextrakt

ICN Biomedicals Inc, Ohio (USA):

Tween 20®

Laborchemie Apolda, Apolda:

8-Hydroxychinolin, Natriumcitrat

Merck, Darmstadt:

Borsäure, CaCl2, Fleischextrakt, Glucose, Glycerin, Kaliumacetat, Mannit, MgCl2,

Natriumacetat, Saccharose, RNase, Maleinsäure, EDTA

Messer Griesheim GmbH, Krefeld:

Stickstoff (flüssig)


Pharmacia Biotech GmbH, Freiburg:

λ-DNA; One-Phor-All-Puffer; Restriktionsenzyme: Xba I, Xho I

Promega Corporation, Madison (USA):

CDP-Star®

QIAGEN GmbH, Hilden:

Qiaprep Spin M13 Kit

Riedel-de Haën, Seelze:

HClkonz

Serva, Heidelberg:

Agar, Agarose, EtBr, L-Prolin, Lysozym, Natriumtriisopropylnaphthalinsulfonat, SDS,

Spermin-HCl, Tris-HCl, Pepton aus Fleisch

Sigma Chemical Company, St. Louis, USA:

Amp, Natriumlaurylsarkosinat

Magermilchpulver und Sojamehl wurden im Reformhaus erworben. Alle hier nicht

aufgeführten Chemikalien wurden dem Chemikalienvorrat des Institutes entnommen und

waren von p.A.-Qualität.

4.3 Bakterienstämme, Plasmide und Phagen

Alle verwendeten Organismen sind in Tab. 1 und die Plasmide in Tab. 2 aufgeführt.

Tab. 1: Übersicht über die verwendeten OrganismenOrganismen Eigenschaft Referenz

Streptomyces albogriseolus

MJ286-76F7

Thienodolinproduzent,

Wildtyp

BENEDICT, 1954

Escherichia coli TG1 supE, hsd∆5, thi ∆(lac-

proAB), F´(traD36, proAB+,

lacI, lacZ∆M5)

GIBSON, 1984

Escherichia coli DH5α supE44, ∆lac U169 (φ80, lacZ

∆M15), hsdR17, recA1,

gyrA96, thi-1, relA1

HANAHAN, 1983;

Bethesda Research Labora-

tories, 1986


Tab. 2: Übersicht über die PlasmidePlasmide Eigenschaften Referenz

pUC 18 AmpR, lacZ‘ YANISCH-PERRON et al., 1985

pHI1536 AmpR, 4,5 kb Fragment

(Kpn I/ Pae I) aus

Streptomyces albogriseolus

diese Arbeit

M13mp18 AmpR, lacZ‘ YANISCH-PERRON et al., 1985

M13mp19 AmpR, lacZ‘ YANISCH-PERRON et al., 1985

4.3.1 Bakteriophagen M13mp18 und M13mp19

M13 ist ein filamentöser Bakteriophage, dessen Genom aus einzelsträngiger, zirkularer DNA

besteht und eine Größe von 6407 bp hat. Durch verschiedene Modifizierungen beträgt die

Größe des M13mp18 bzw. M13mp19 7250 bp.

M13mp18/19 7250 bp Bsm I

Sna BI

Apa LI

Bal I

Cfr10 INae I

Dra IIIAva IINar Aha I, II

Bgl IISau I

Bbe I

Hgi EII

Pvu IFsp I

Bgl I

TACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTHind III Sph I Pst I

Acc HinSal

Ic II I Xba I Bam HI

SmaXma

I I

AspKpn

718 I Sac I Eco RI

M13mp19

Hind IIISph IPst I

AccHinSal

Ic II IXba IBam HI

SmaXma

I I

AspKpn

718 ISac IEco RI

TACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACT

M13mp18

lacZ’

ori

Abb. 7: Restriktionskarte und Polylinker von M13mp18 und M13mp19 (YANISCH-PERRON et al., 1985)


Im Wirt erfolgt die Synthese des komplementären Stranges, wodurch die ssDNA in die

replikative Form (dsDNA) umgewandelt wird. Die dsDNA wird vom Replikationssystem des

Wirts vervielfältigt und ssDNA ausgehend von den dsDNA-Kopien synthetisiert. Nach

Verpacken dieser in M13-Capside werden die neuen Phagen aus der Wirtszelle ausgeschleust,

ohne diese zu zerstören.

Um M13 als Klonierungsvektor zu nutzen, wurde dessen DNA modifiziert. Es wurde aus E.

coli DNA ein Teil des lacI Gens, die gesamte Regulatorregion des lac Operons und die ersten

146 Codons des lacZ Gens, welche für das α-Protein der β-Galactosidase codieren, eingefügt

(MESSING et al., 1977). Weiterhin wurde ein Polylinker in das lacZ‘-Gen eingebaut (YANISCH-

PERRON et al., 1985). M13mp18 und M13mp19 unterscheiden sich nur in der Orientierung des

Polylinkers (Abb. 7).

4.3.2 Der Vektor pUC18

Das Plasmid pUC18 ist ein E. coli Klonierungsvektor der Größe 2686 bp, mit einer

Replikationsrate von 500-700 Kopien pro Zelle.

Abb. 8: Restriktionskarte von pUC18 (YANISCH-PERRON et al., 1985)

AGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTA

pUC182686 bp

lacZ’

Ampr

393 458Hin Sph Pstd III I I

Acc Hin

Sal

Ic II I

AvaSmaXma

I I IXba Bam I HI

AspKpn

718 I

BanSac

II I Eco RI

Afl III806

Bbe I239

Nar I236

Nde I184Pss I

2678

Dra II2675Ast II

2621Ssp I2503

Asp7002298

Sca I2179

Gsb I1783

Cfr10 I1779 Eco31 I

1760


Es ist vom Plasmid pBR322 (BOLIVAR et al., 1977) abgeleitet. Das Plasmid enthält die

Ursprungsregion der DNA-Replikation, codiert in einer Region für β-Galactosidase und trägt

das Resistenzgen gegen Ampicillin. Der Polylinker befindet sich im lacZ‘-Gen zwischen den

Hind III- und Eco RI-Schnittstellen (Abb. 8).

4.4 Antibiotika, Isopropyl-β-D-thiogalaktosid (IPTG)

und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid (X-Gal)

Von den in Tab. 3 aufgeführten Substanzen wurden Stammlösungen hergestellt und Aliquote

dieser Lösungen bei –20 °C aufbewahrt.

Alle wäßrigen Lösungen wurden durch eine surfactant free cellulose acetate-Membran

(Porengröße 0,2 µm) sterilfiltriert.

Tab. 3: Antibiotika, ITPG und X-GalStammlösung Endkonzentration

Ampicillin 100 mg/ml in H2O 100 µg/ml

IPTG 200 mM in H2O 0,2 mM

X-Gal 2% in DMF 0,004%

4.5 Medien

Für Festmedien wurde 1,5 % Agar zugesetzt. Antibiotikastammlösungen wurden nach dem

Autoklavieren steril zugegeben. Die folgenden Gewichtsangaben beziehen sich auf jeweils 1 l

deion. H2O, wenn nicht anders angegeben.

H-Medium: (SAMBROOK et al., 1989)

Bacto Trypton 10 g

NaCl 8 g

Für Top-Agar wurden 0,8 % Agar zugegeben.


HNB-Komplettmedium: Fleischextrakt 3 g

Hefeextrakt 5 g

Pepton aus Fleisch 5 g

NaCl 5 g

LB (Luria-Bertani)-Medium: (SAMBROOK et al., 1989)

Bacto Trypton 10 g

Hefeextrakt 5 g

NaCl 10 g

SM-Medium: (KÖNIG et al., 1977)

Sojamehl 20 g

Mannit 20 g

SOC-Medium: (SAMBROOK et al., 1989)

Bacto Trypton 20 g

Hefeextrakt 5 g

NaCl 0,5 g

KCl 0,0 g

Nach dem Autoklavieren wurden folgende Lösungen steril zugegeben:

2 M MgCl2 5 ml

1 M Glucose 20 ml

2xTY-Medium: (SAMBROOK et al., 1989)

Bacto Trypton 16 g

Hefeextrakt 10 g

NaCl 5 g


4.6 Puffer und Lösungen

Der pH-Wert der Puffer wurde, wenn nicht anders angegeben, vor dem Autoklavieren

(20 min bei 121 °C, 1 atm) mit NaOH oder HCl eingestellt.

Probenpuffer: Saccharose 25 % (w/v)

Bromphenolblau 0,05 % (w/v)

EDTA, pH 8,0 100 mM

TE-Puffer: Tris-HCl, pH 8,0 10 mM

EDTA, pH 8,0 1 mM

Tris-Puffer (10-fach): Tris 1 M

mit HClkonz auf pH 7.8 eingestellt

SSC-Puffer (20-fach): NaCl 3 M

Trinatriumcitrat, pH 7,0 300 mM

Denaturierungslösung: NaCl 1,5 M

NaOH 500 mM

Neutralisierungslösung: NaCl 1,5 M

Tris 0,5 M

EDTA 1,0 mM

pH 7,2

Elektrophoresepuffer:

TBE-Puffer: Tris 89 mM

Borsäure 89 mM

EDTA, pH 8,0 2 mM

TAE-Puffer: Tris 40 mM

EDTA, pH 8,0 2 mM

mit Eisessig auf pH 8,0 eingestellt

Der TBE-Puffer wurde in 5-facher und der TAE-Puffer in 50-facher Konzentration hergestellt.

Für die Sequenzierungsversuche wurde der der TBE-Puffer 10-fach konzentriert als Vorrat

hergestellt.

Weitere Puffer und Lösungen sind in den entsprechenden Abschnitten mit aufgeführt.


4.7 Organische Lösungen

Phenol-Mischung: Phenol 500 g

8-Hydroxychinolin 5 g

gesättigt mit 50 mM Tris/HCl, pH 8,0

Phenol/Chloroform: Phenol-Mischung 50 ml

Chloroform 50 ml

Isoamylalkohol 1 ml

4.8 Sterilisation

Medien und Pufferlösungen sowie alle für molekulargenetische Arbeiten benötigten

Materialien und Geräte wurden 30 min bei 121 °C, 1 atm Druck autoklaviert oder 4 h bei

160 °C sterilisiert, um Kontaminationen zu vermeiden. Die Lösungen, die nicht

hitzebeständige Substanzen enthielten, wurden sterilfiltriert (SFCA-Membran, 0,2 µm).

4.9 Kulturbedingungen

4.9.1 Züchten von Streptomyces albogriseolus MJ286-76F7

Zur Züchtung dieses Streptomyces-Stamm`s wurden 50 ml Soja-Mannit-Medium

(KÖNIG et al. 1977) von der Platte aus der Stammhaltung angeimpft. Die Flüssigkultur wurde

bei 37 °C in Rundschüttelmaschinen bei 160 Upm 3 Tage inkubiert. Für die Züchtung der

Streptomyces-Kulturen wurden Erlenmeyerkolben mit Edelstahlspirale verwendet, um einen

höheren Sauerstoffeintrag in das Medium zu gewährleisten.

4.9.2 Escherichia coli-Lösung für die Stammsammlung

Für die Herstellung der E. coli Stammlösungen wurden die Zellen einer Übernachtkultur

(5 ml HNB-Medium, 37 °C, 160 Upm) abzentrifugiert (10 min, 3000 Upm, RT) und in 1,5 ml

20 % (v/v) Glycerin resuspendiert. Diese Suspension wurde bei -80 °C gelagert.


4.10 Isolierung von DNA

4.10.1 Isolierung der Gesamt-DNA aus Streptomyces albogriseolus

Die Gesamt-DNA Isolierung wurde nach der Methode von HOPWOOD et al. 1985

durchgeführt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (10 min, 3500 Upm, RT) abgetrennt,

mit 10,3 %iger Saccharoselösung gewaschen und in 3 ml Lysozympuffer, dem 10 mg/ml

Lysozym zugesetzt war, resuspendiert. Nach 15 min Inkubation bei 37 °C wurden 4 ml

2xKirby-Mix zugegeben und eine Minute geschüttelt. Zur Proteinfällung wurde mit 8 ml

Phenol/Chloroform extrahiert und zur Phasentrennung 10 min bei 3000 Upm und RT

zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde in ein neues Universal überführt, mit 0,1 Vol. 3 M

Natriumacetat (pH 6,0) versetzt und mit 1 Vol. Isopropanol überschichtet.

Durch vorsichtiges Schwenken wurden die Phasen gemischt, wobei die DNA als Knäuel an

der Phasengrenze ausfällt. Mit einer zugeschmolzenen und gebogenen Pasteurpipette wurde

die DNA in ein Universal, das bereits 7 ml 96 %iges Ethanol enthielt, überführt und

gewaschen. Danach wurde die DNA mit der Pasteurpipette in ein Universal mit 5 ml TE-

Puffer gegeben und gelöst. Zur Beseitigung der RNA wurde RNase in einer Endkonzentration

von 40 µg/ml zugegeben, 30 min bei 37 °C inkubiert und anschließend die RNase durch

Extraktion mit 1,5 ml Phenol/Chloroform gefällt. Zur Phasentrennung wurde 10 min bei

3000 Upm und RT zentrifugiert und die wäßrige Phase in ein neues Universal überführt.

Durch Zugabe von 0,1 Vol. 3 M Natriumacetat (pH 6,0) und 1 Vol. Isopropanol fällte man die

DNA wie oben aufgeführt. Nach Waschen mit 70 %igem und 96 %igem Ethanol und

anschließendem Trocknen bei 60 °C wurde das Pellet in 1 ml TE-Puffer gelöst.

Lösungen für die Gesamt-DNA Isolierung:

Lysozympuffer: Saccharose 0,3 M

Tris-HCl, pH 8,0 25 mM

EDTA, pH 8,0 25 mM

2xKirby-Mix: Natriumtriisopropyl-naphthalinsulfonat 2 g

Natrium-4-aminosalicylat 12 g

2 M Tris-HCl, pH 8,0 5 ml

Phenol-Mischung 6 ml

mit H2Odeion. auf 100 ml auffüllen


4.10.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli und M13-Bakteriophagen mit

der S-Lyse

Plasmid-DNA, die für analytische und präparative Zwecke bestimmt war, wurde nach einer

Methode von Holmes und Quigley (1981) isoliert.

Für die Plasmidisolierung aus E. coli wurden 5 ml HNB-Medium, welches 0,1 % Ampicillin-

Lösung enthielt, mit dem zu untersuchenden Klon angeimpft und über Nacht bei 37 °C

geschüttelt. Für die Plasmidisolierung aus M13-Bakteriophagen wurden 5 ml 2xTY-Medium

mit dem zu untersuchenden Klon und 100 µl einer E. coli-Übernachtkultur angeimpft und 6 h

bei 37 °C geschüttelt.

Die Zellen wurden abzentrifugiert (10 min, 4000 Upm, 4 °C), der Überstand völlig entfernt

und das Pellet in 50 µl STE-Lösung resuspendiert. Danach gab man 0,7 ml STET-Lösung

hinzu (Die Lösung durfte nicht mehr gemischt werden!), kochte die Proben für 60 sec bei

100 °C im Wasserbad und stellte sie sofort für 10 min auf Eis.

Nach Zentrifugation (20 min, 14000 Upm, 4 °C) wurde der klare Überstand in ein neues

Eppendorfgefäß überführt und mit 200 µl Phenol/Chloroform extrahiert. Zur Phasentrennung

wurde 5 min bei 14000 Upm und 4 °C zentrifugiert. Die wäßrige Phase wurde in ein weiteres

Eppendorfgefäß überführt und zur DNA-Fällung mit 700 µl Isopropanol versetzt und bei RT

inkubiert. Nach 2 min wurde zentrifugiert (20 min, 14000 Upm, 4 °C), der Überstand völlig

entfernt und das Pellet zuerst mit 70 % EtOH und danach mit 96 % EtOH gewaschen, um alle

Salzrückstände zu entfernen. Das bei 60 °C getrocknete Pellet wurde in 50 µl TE-Puffer mit

20 µg/ml RNase gelöst.

Lösungen für die S-Lyse:

STE-Lösung: 8 % Saccharose

50 mM Tris

50 mM EDTA

pH 8,0

STET-Lösung: 8 % Saccharose

50 mM Tris

50 mM EDTA

5 % Triton X-100

pH 8,0


4.11 Quantitative Bestimmung von DNA

Die Konzentrationsbestimmung der DNA erfolgt spektralphotometrisch nach Sambrook et al.

1989. Es wurden Extinktionen bei 260 und 280 nm gemessen. Eine Extinktion von 1,0 bei

260 nm entspricht 50 µg DNA/ml Probe. Das Verhältnis der Extinktionen:

VE = EE

nm

nm

260

280

läßt eine Abschätzung der Reinheit der DNA zu.

Bei reiner DNA-Lösung beträgt dieser Quotient mindestens 1,8. Verunreinigungen, wie

Phenol oder Proteine, führen zu einem kleineren Extinktionsverhältnis.

Eine weitere Möglichkeit der Konzentrationsbestimmung besteht darin, die

Fluoreszenzintensität der zu bestimmenden DNA-Probe mit der eines Standards bekannter

Konzentration zu vergleichen. Dazu wurden Probe und Standard einer Agarosegel-

elektrophorese unterzogen, das Gel anschließend mit EtBr gefärbt und auf dem

Transilluminator betrachtet.

Mit der Molecular Analyst® Software (Bio-Rad) wurde eine Profilanalyse der Banden

durchgeführt. Nach Vergleich der Fluoreszenzintensitäten kann die DNA-Konzentration der

Probe berechnet werden. Als Standard diente λ-DNA.

4.12 Agarosegelelektrophorese

Die Agarosegelelektrophorese dient zur Trennung, Identifizierung und Isolierung von DNA-

Fragmenten. Dabei ist die Wanderungsgeschwindigkeit eines DNA-Fragments indirekt

proportional zum Logarithmus seines Molgewichts. Die Größe unbekannter Fragmente läßt

sich bestimmen, wenn neben der zu untersuchenden Probe ein Längenstandard aufgetragen

wird. Als Längenstandard wurde mit Eco RI bzw. Pst I verdaute λ-DNA verwendet.

Es wurden 5 mm dicke, horizontale Gele mit 0,7 bis 1% Agarose in TBE- oder TAE-Puffer

gegossen. Zum Gießen der Gele wurde Agarose in dem entsprechenden Volumen Puffer

vorgequollen und dann durch Erhitzen in der Mikrowelle gelöst, auf etwa 50 °C abgekühlt

und in die Gelapparatur gegossen. Nach Erstarren des Gels wurde dieses in die

Elektrophoresekammer eingesetzt, mit Puffer überschichtet und die mit 0,1 Vol. Probenpuffer

versetzten DNA-Proben in die Geltaschen eingetragen.


Die angelegte Spannung betrug 10 V/cm Gellänge. Wurde DNA auf größeren Gelen (12 cm

Gellänge) über Nacht getrennt, betrug die Spannung nur 2,5 V/cm.

Nach dem Lauf wurden die Gele in einem EtBr-Bad (Konzentration: 1µg/ml) für 10-15 min

gefärbt, dabei interkaliert das EtBr in die Doppelhelix der DNA und ermöglicht durch seine

Fluoreszenz im UV-Licht die Detektion der DNA-Fragmente im Gel.

Die Auswertung erfolgte auf dem Transilluminator bei 302 nm. Mit dem Bilddoku-

mentationssystem wurde das Ergebnis fotografisch dokumentiert.

4.13 Elution von DNA aus Agarosegelen

Bei allen präparativen Agarosegelelektrophoresen wurde für das Gel, sowie als Elektro-

phoresepuffer TAE-Puffer verwendet. Die Elution von DNA aus dem Gel erfolgte mit dem

„Geneclean III Kit„ der Dianova GmbH oder mit der „freeze-squeeze„-Methode

(4.13.2).

4.13.1 Elution mittels „Geneclean III Kit„

Der Restriktionsansatz wurde mittels präparativer Agarosegelelektrophorese getrennt, das

entsprechende DNA-Fragment mit einem Skalpell aus dem Gel geschnitten und das Gelstück

gewogen, wobei 1 mg genau 1 µl Gelvolumen entspricht. Es wurden 3 Vol. Natriumiodid-

lösung zugegeben und 5 min bei 55 °C inkubiert, um das Gelstück aufzulösen. Danach wurde

für 5 µg DNA 5 µl der Glasmilch und für jedes weitere µg DNA zusätzlich 0,5 µl der

Glasmilch zugesetzt und zur Adsorption der DNA 5 min bei RT inkubiert, wobei das

Reaktionsgefäß alle 2 min geschüttelt wurde. Es wurde 5 sec zentrifugiert, der Überstand

abgenommen und das Pellet dreimal mit jeweils 50 Vol. der Glasmilch mit New wash-Lösung

gewaschen. Nach völligem Entfernen der Waschlösung wurde 1 Vol. der Glasmilch an

TE-Puffer zugegeben und 2-3 min bei 55 °C inkubiert, wobei die an die Glasmilch gebundene

DNA wieder desorbiert wird. Es wurde 30 sec zentrifugiert und der Überstand in ein steriles

Eppendorfgefäß gegeben. Um eine bessere Ausbeute zu erzielen, wurde die Glasmilch

nochmals mit 1 Vol. TE-Puffer extrahiert. Die so isolierte DNA wurde zur Ligation

verwendet.


4.13.2 Elution mittels „freeze squeeze„-Methode

DNA-Fragmente, welche für präparative Zwecke bestimmt waren, wurden nach der Methode

von Tautz und Renz (1982) isoliert. Diese Methode ist eine Abwandlung der Methode von

Thuring (1975).

Nach der elektrophoretischen Trennung der DNA wurden die gewünschten Banden aus dem

Agarosegel ausgeschnitten und 15 min in 0,3 M Natriumacetat-Lösung (pH 7), der 1 mM

EDTA zugesetzt war, äquilibriert. Danach wurden die Gelstücke in kleine Eppendorf-Tubes

(0,6 ml), die mit silanisierter Glaswolle gestopft waren und am Boden mit einer Öffnung

versehen waren, mit möglichst wenig Flüssigkeit überführt. Die Deckel der Eppendorf-Tubes

wurden mit Parafilm fixiert und 5 min in flüssigen Stickstoff getaucht. Die Tubes wurden

dann in große Eppendorf-Tubes (ohne Deckel) gesteckt und sofort 10 min bei 14000 Upm und

RT zentrifugiert. Die eluierte Flüssigkeit wurde in ein frisches Eppendorfgefäß (1,5 ml)

pipettiert und die Zentrifugation wiederholt. Der gepoolten Lösung setzte man 1/100 Vol. 1 M

MgCl2-Lösung mit 10 % Essigsäure und 2,5 Vol. 96 %igen Ethanol zu. Man inkubierte 15

min bei -80 °C und zentrifugierte anschließend wieder 10 min bei 14000 Upm und RT. Die

so erhaltenen Pellets wurden mit 70 %igem Ethanol und mit 96 %igem Ethanol gewaschen

und anschließend bei 60 °C getrocknet. Die getrocknete DNA nahm man in wenig Wasser auf

und konnte sie nun zur Ligation oder als Ausgangsmaterial für eine Sonde verwenden.

4.14 Restriktion von DNA

Die Gesamt-DNA wurde mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen verdaut, wobei für

1 µg DNA mindestens 1 U des Enzyms eingesetzt wurde. Die Restriktionsansätze wurden in

der angegebenen Reihenfolge zusammenpipettiert und mindestens 4 h bei 37 °C inkubiert.

Danach wurde das Restriktionsenzym hitzeinaktiviert. Wenn die Restriktion nur zu

analytischen Zwecken diente war der Schritt der Hitzeinaktivierung überflüssig und die

Restriktionsansätze konnten sofort einer Agarosegelelektrophorese unterzogen werden.

Reihenfolge: Gesamt-DNA-Lösung [8-12 µg]

10x Reaktionspuffer

steriles Wasser

Enzym


4.15 Dephosphorylierung von DNA

Wenn Plasmid-DNA mit nur einem Restriktionsenzym verdaut wurde, war eine anschließende

Dephoshorylierung notwendig, um eine Religation des linearen Vektors zu vermeiden. Dazu

wurde dieser mit alkalischer Phosphatase aus Krabben (SAP) oder aus Kälberdarm (CIAP)

behandelt. Diese Enzyme entfernen im alkalischen Milieu die 5´-Phosphatgruppen.

Die Dephosphorylierungsreaktion wurde in dem vom Hersteller des Enzyms angegebenen

Puffer durchgeführt. Für 4,8 µg DNA im 50 µl Reaktionsansatz wurden 0,5 µl SAP [0,5 U]

bzw. 0,5 µl CIAP [10 U] verwendet. Es wurde 1,5 h bei 37 °C inkubiert.

Die SAP wurde 15 min bei 65 °C hitzeinaktivert. Die CIAP dagegen wurde durch

Phenol/Chloroform-Extraktion inaktiviert und die DNA aus der wäßrigen Phase mit

Isopropanol gefällt.

4.16 Ligation von DNA

Die T4-DNA-Ligase katalysiert die Ausbildung einer kovalenten Phosphodiesterbindung

zwischen der 5´-Phosphatgruppe und der 3´-Hydroxygruppe von DNA-Fragmenten in

Gegenwart von Mg2+-Ionen und unter ATP-Verbrauch.

Für die Anlage der angereicherten Genbank von Streptomyces albogriseolus

(~4,5 kb Pae I/Kpn I-Fragment) wurde ein Vektor-Insert-Verhältnis von 1:2,5 gewählt. Für

Subklonierungen wurde Vektor zu Insert nur im Verhältnis 1: 1,5 eingesetzt.

Der Ligationsansatz wurde bis auf die T4-DNA-Ligase zusammenpipettiert, 5 min bei 65 °C

inkubiert, um Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den überhängenden DNA-Enden zu

zerstören, und dann auf Eis abgekühlt. Die T4-DNA-Ligase wurde dazugegeben und

mindestens 4 h bei 16 °C inkubiert.

Wenn mittels Elektroporation transformiert werden sollte, wurde die DNA gefällt und in H2O

wieder aufgenommen, da sich bei der Elektroporation die Gegenwart von Salz in der DNA-

Lösung als störend erweist.


4.17 Klonierung in Escherichia coli

4.17.1 Präparation von kompetenten Zellen

Als kompetente Zellen werden Bakterienzellen bezeichnet, die die Fähigkeit besitzen, fremdeDNA aufzunehmen. Damit dies möglich ist, muß die Zellwand durchlässig gemacht werden.Heute bedient man sich vorwiegend zweier Methoden; bei der einen wird die Zellwand durchhohe Konzentrationen an CaCl2 durchlässig gemacht (MANDEL & HIGA, 1970) und bei deranderen, der sogenannten Elektroporation, erreicht man die Durchlässigkeit durch einenstarken elektrischen Impuls (DOWER et al.,1988).

4.17.1.1 Kompetente Zellen für die CaCl2-Methode

Zur Herstellung kompetenter Zellen wurden E. coli DH5α- oder E. coli TG1-Zellen benutzt.

Es wurden 40 ml 2xTY-Medium mit 400 µl einer 5 ml E. coli-Übernachtkultur angeimpft und

bei 37 °C inkubiert, bis die optische Dichte bei 550 nm 0,2 bis 0,3 betrug. Die Zellen wurden

10 min bei 3000 Upm und 4 °C abzentrifugiert und in 20 ml auf Eis vorgekühlter 50 mM

CaCl2-Lösung suspendiert. Nach 30 min Inkubation auf Eis wurden die Zellen wieder

zentrifugiert (10 min, 3000 Upm, 4 °C), in 4 ml eiskalter 50 mM CaCl2-Lösung suspendiert

und 1 h bei 0 °C inkubiert. Die so hergestellten kompetenten Zellen wurden in 200 µl

Aliquots geteilt, jedem Aliquot 40 µl Glycerin zugesetzt und bei -80 °C gelagert. Vor

Gebrauch wurde die benötigte Menge kompetenter Zellen auf Eis wieder aufgetaut.

4.17.1.2 Kompetente Zellen für die Elektroporation

Zur Herstellung der kompetenten Zellen wurden E. coli DH5α- oder E. coli TG1-Zellen

benutzt. Es wurden 500 ml LB-Medium ohne Salz ( in 2,5 l-Erlenmeyerkolben) mit 2 ml einer

5 ml E. coli-Übernachtkultur angeimpft und bei 37 °C inkubiert, bis die optische Dichte bei

550 nm 0,5 bis 0,7 betrug. Die Zellen wurden 10 min auf Eis abgekühlt und anschließend bei

3000 Upm und 4 °C abzentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal mit 0,5 l bidest. und sterilem

Wasser (auf Eis) suspendiert und wieder bei gleichen Bedingungen zentrifugiert.

Das Pellet wurde mit wenig Flüssigkeit in 50 ml-Zentrifugengefäße überführt und mit kaltem

15 % Glycerin aufgefüllt und zentrifugiert. Das Volumen des Pellets wurde abgeschätzt und in


1,5 Vol. 15 % Glycerin aufgenommen. Man portionierte 100 µl große Chargen in Eppendorf-

Tubes (1,5 ml) und fror diese sofort in flüssigem Stickstoff ein. Die kompetenten Zellen

wurden bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert.

4.17.2 Transformation von Escherichia coli

4.17.2.1 Transformation nach Hanahan (1983)

Zur Transformation wurden zum Ligationsansatz 200 µl kompetente Zellen, deren Herstellung

in 4.17.1.1 beschrieben ist, gegeben, gemischt und 30 min auf Eis inkubiert, dabei lagert sich

die DNA an die Zellmembran an. Danach folgte ein Hitzeschock von 1,5 min bei 42 °C,

wobei die DNA von den Zellen aufgenommen wurde. Die Zellen wurden dann auf Eis wieder

abgekühlt, 900 µl LB-Medium zugefügt und 45 min bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Es

wurden 50, 100 und 200 µl des Transformationsansatzes auf Selektionsplatten (HNB-Medium

mit Amp, IPTG und X-Gal) ausplattiert. Der restliche Transformationsansatz wurde bei 4 °C

aufbewahrt und am nächsten Tag mit optimalem Volumen ausplattiert.

Zur Kontrolle der Transformation wurden gleichzeitig eine Sterilkontrolle, welche nur 200 µl

kompetente Zellen enthielt, und eine Kompetenzkontrolle durchgeführt. Als

Kompetenzkontrolle wurden 200 µl kompetente Zellen mit dem Vektor

(DNA-Menge < 50 ng) transformiert. Von der Sterilkontrolle wurden 100 µl und von der

Kompetenzkontrolle 50, 100 und 200 µl auf Selektionsplatten ausplattiert.

4.17.2.2 Transformation durch Elektroporation nach Dower et al. (1988)

Die für diese Transformation verwendeten kompetenten Zellen wurden wie unter 4.17.1.2

beschrieben hergestellt. Die bei -80 °C gelagerten kompetenten Zellen wurden auf Eis

aufgetaut. Zu 40 µl Zellsuspension wurden maximal 2 µl DNA-Lösung in H2O gegeben, gut

gemischt und in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette überführt. Die anschließende

Inkubation von 1 min auf Eis führte zur Anlagerung der DNA an die Zellmembran.

Zur Inkorporation der DNA wurden die Zellen einem Puls unter folgenden Bedingungen

ausgesetzt: Gene Pulser 15 µF, Pulse Controller 335 Ω und 2500 V.


Danach wurden sofort 960 µl auf 37 °C vorgewärmtes SOC-Medium zugegeben, die

Zellsuspension in ein Eppendorfgefäß überführt und 1 h bei 37 °C inkubiert. Es wurden

jeweils 100 µl dieses Ansatzes pro Selektionsplatte (HNB-Medium mit Amp, IPTG und

X-Gal) ausplattiert.

4.17.3 Selektion der Escherichia coli-Transformanten

Alle Bakterien, die ein Plasmid aufgenommen hatten, waren ampicillinresistent. Eine weitere

Selektion erfolgte über die blau-weiß-Indikation. Bakterien, welche nur religierten Vektor

aufgenommen hatten, wuchsen blau und Bakterien, die das rekombinante Plasmid enthielten,

dagegen weiß. Einzelne weiße Klone wurden mit sterilen Holzstäbchen auf ampicillinhaltige

HNB-Platten gepickt. Nach Plasmidisolierung, wie in 4.10.2 beschrieben, wurde durch

Restriktionsanalyse oder Hybridisierung der Klon mit dem richtigen Insert gesucht.

4.18 Polymerasekettenreaktion

Bei der PCR (polymerase chain reaction) handelt es sich um eine in vitro Methode zur

Amplifikation von DNA. Das Verfahren, daß von MULLIS 1983 (Nobelpreis 1993) erdacht

wurde, beruht auf der Denaturierung eines doppelsträngigen DNA-Templates, an welches

sich, während der Annealing-Phase, am 5‘- und 3‘-Ende des zu amplifizierenden Bereiches

spezifische Primer anlagern. Diese werden durch eine hitzestabile DNA-Polymerase in

Gegenwart von freien Desoxynukleosid-Triphosphate (dNTPs) verlängert. Die Elongation

läuft so lange, bis sich die Polymerase von der DNA ablöst oder die Reaktion unterbrochen

wird. Das erreicht man durch einen anschließenden Hitzeschritt, wobei die DNA auch wieder

denaturiert wird. Senkt man die Temperatur bis unter die spezifische Schmelztemperatur, so

binden die Primer wieder an die komplementären Sequenzen des Templates. Am Ende des

dritten Zyklus besteht die Hälfte aller DNA-Stränge aus der Zielsequenz, flankiert von den

Primern, und unterliegt in den anschließenden Zyklen einer exponentiellen Vermehrungsrate,

während die Zahl der anderen Sequenzen in der Mischung nur linear zunimmt. Mit einer

thermostabilen Polymerase führt man in der Regel 25-30 dieser Zyklen durch und erhält 106

bis 107 Kopien.


4.18.1 PCR-Versuche

Mit Primern, die freundlicherweise von Dr. S. Tölzer zur Verfügung gestellt wurden, konnten

mit Gesamt-DNA aus Streptomyces albogriseolus PCR-Versuche durchgeführt werden.

Die Primer wurden von prnA abgeleitet und sind in Tab. 4 zusammengestellt.

Tab. 4: Primer für homologe Proteine der TryptophanhalogenasePrimer Sense-Strang

trpst1+ Bam HITATCGGATCCGGCTGGACCTGGAAGATTCC G G C C30 bp, 60 % G/C, 16 Kombinationen

Primer Antisense-Strang

trpst1- Kpn I_AGTTGGTACCGCGCCGCGTAGAGGAAGTA G G C T29 bp, 59 % G/C, 8 Kombinationen

Für die Ansätze wurde ein PCR-Mix hergestellt; dieser bestand aus:

50 µl Reaktionspuffer

34 µl dGTP/dCTP (je 10 mM)

16 µl dATP/dTTP (je 10 mM)

Davon wurden jeweils 20 µl verwendet, außerdem enthielten die Ansätze 10 µl MgCl2-

Lösung, 5 µl DMSO und von jedem Primer 2 µl. Zum PCR master mix wurden 100 ng DNA

gegeben und mit sterilem bidest. Wasser auf ein Endvolumen von 100 µl aufgefüllt. Es wurde

mit der „hot-start„-Methode gearbeitet, d.h. die thermostabile Polymerase wird erst nach

einem 10 min Denaturierungsschritt (96 °C) zugegeben.

Danach wurden 30 Zyklen mit folgenden Bedingungen durchlaufen:

30 sec 96 °C Denaturierung

60 sec 44,8 °CAnnealing

30 sec 72 °C Extension


Die Annealing-Temperatur berechnete sich dabei analog der Schmelztemperatur bei der

Hybridisierung (4.19.3), die Extensionstemperatur wurde Standardprotokollen entnommen

und die Dauer der Extension wurde an die zu erwartende Templatelänge angepaßt.

Nach den 30 Zyklen erfolgte noch ein 5 min Extensionsschritt, um sicherzustellen, daß die

DNA nach der PCR vollständig als Doppelstrang vorliegt. Nach Abschluß des Programms

wurde die Temperatur auf 4 °C gehalten. Das erhaltene Produkt wurde über

Gelelektrophorese, mit anschließender Elution der gewünschten Bande aus dem Gel,

gereinigt. Das so erhaltene Fragment wurde nach der Markierung (4.19.2) als Sonde

verwendet.

4.19 Hybridisierung von DNA

4.19.1 Southern-Transfer

Nach einer Methode von SOUTHERN (1975), welche von REED & MANN (1985) modifiziert

wurde, wird DNA aus Agarosegelen auf Nylonmembranen transferiert.

Nach beendeter Elektrophorese und Fotodokumentation wird das Agarosegel 2 x 15 min unter

leichtem Schütteln in 0,25 M HCl inkubiert, um Strangbrüche in der hochmolekularen DNA

zu erzeugen und damit den späteren Transfer zu erleichtern. Danach wird das Gel 30 min in

Denaturierungslösung ebenfalls unter Schütteln inkubiert. Anschließend wird noch mit einer

Neutralisierungslösung für weitere 30 min gewaschen. Während dieser Inkubationszeit

erfolgt die Vorbereitung für den Kapillarblot (siehe auch Abb. 9).

Abb. 9: Aufbau eines Kapillarblots

1 kg Glasplatte

ZellstoffFilterpapier (2x)

Agarosegel

ElektrophoreseeinsatzWanne mit 20 x SSC-Lösung

Membran

Filterpapier (1x)


Dazu wird 20 x SSC-Lösung in eine Schale gegeben und ein großer Elektrophoreseeinsatz

umgekehrt eingesetzt. Ein entsprechend breiter, mit Lösung getränkter Filterpapierstreifen

wird so über den Einsatz gelegt, daß beide Enden in den Puffer eintauchen.

Das Gel wird mit den Taschen nach oben darauf gelegt. Die auf Gelgröße zugeschnittene

Membran wird luftblasenfrei aufgelegt und mit zwei ebenso großen Filterpapieren abgedeckt.

Als Saugkörper wird ein 6 cm hoher Papierstapel aufgesetzt und mit einem 1 kg Gewicht

beschwert. Es wird mindestens 4 h geblottet. Nach dem Blot werden die Geltaschen mit

Bleistift auf die Membran übertragen, diese danach kurz in 2xSSC gewaschen und 10 min bei

80 °C getrocknet. Die DNA wird durch 3 min UV-Bestrahlung auf der Membran fixiert. Die

Membran kann so gelagert oder sofort zur Hybridisierung eingesetzt werden.

4.19.2 Markierung der Sonden

Zur Untersuchung der Gesamt-DNA auf Homologien zur Tryptophanhalogenase der

Pyrrolnitrinbiosynthese wurde eine DNA-Sonde von prnA aus Pseudomonas fluorescens

verwendet. Dazu wurde das Fragment mit dem Restriktionsenzym Bam HI aus dem

entsprechenden Plasmid geschnitten (4.14), über Gelelektrophorese aufgetrennt (4.12) und aus

dem Gel eluiert (4.13.2).

Für Membranen mit einer Fläche von ca. 150 cm2 wurde 1 µg DNA markiert. Die

Markierung erfolgte nach der Vorschrift der Firma Boehringer unter Verwendung des „DIG

High Prime„-Kits dieser Firma. Dazu wurde 1 µg DNA mit sterilem bidest. Wasser auf ein

Endvolumen von 16 µl gebracht und die DNA durch einen 10 min Hitzeschritt bei 100 °C und

Abschrecken auf Eis denaturiert. Die einzelsträngige DNA wurde mit 4 µl der

Markierungslösung versetzt, anzentrifugiert und danach 20 h bei 37 °C inkubiert. Die

Markierungslösung enthält Reaktionspuffer, Zufallshexamere, dNTPs, DIG-11-dUTP und 1

U/µl Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I. Die Reaktion wurde 15 min bei 65 °C

abgestoppt und der Reaktionsansatz in 10 ml Prähybridisierungslösung entsprechender SSC-

Konzentration aufgenommen. Vor Einsatz der Sonde zur Hybridisierung mußte diese immer

15 min bei 100 °C denaturiert und anschließend auf Eis abgekühlt werden.

Die Markierung des PCR-Fragments wurde analog zur Markierung der prnA-DNA

durchgeführt.


4.19.3 Hybridisierung

Die Hybridisierungen wurden mit prnA oder mit dem PCR-Fragment als Sonde durchgeführt.

Die Bedingungen für die Hybridisierung berechnen sich nach folgender Gleichung

(SAMBROOK et al., 1989):

)N/600()CG(%41,0]Nalog[6,16C5,81Tm −+++°= +

Dabei ist Tm die Schmelztemperatur des Hybrids, [Na+] die Natriumionenkonzentration der

Hybridisierungs- bzw. der Waschlösung, (%G+C) der GC-Gehalt des Oligonucleotids und

N dessen Nucleotidanzahl.

Die Hybridisierungs- und Waschtemperatur wurden jeweils nach gewünschter Homologie

niedriger als Tm gewählt. Bei Tm entstehen nur Hybride mit 100 % Homologie. Eine

Temperaturerniedrigung um 1 °C führt zu einer Fehlpaarung von 1 %, d.h. die Homologie

wird um 1 % herabgesetzt. Bei den Waschschritten kann die Stringenz nicht nur durch

Temperaturerhöhung, sondern auch durch eine Verringerung der Salzkonzentration erhöht

werden.

4.19.3.1 Prähybridisierung

Die Membran wurde in 2xSSC befeuchtet und in die Hybridisierungsröhre eingelegt. Nach

Zugabe der Prähybridisierungslösung (siehe Tab. 5) wurde 1 bis 2 h bei der Hybridisierungs-

temperatur inkubiert, um freie Bindungsstellen der Membran abzusättigen und unspezifische

Bindung der Sonde zu verhindern.

Lösungen für die Prähybridisierung:

Puffer I: Maleinsäure 0,1 M

NaCl 0,15 M

mit NaOH-Plättchen auf pH 7,5 eingestellt


Tab. 5: Prähybridisierungslösung für die entsprechenden SondenprnA-Sonde PCR-Sonde

20xSSC 5 ml 1 ml

10 % (w/v) Blocking-Reagenz

in Puffer I

2 ml 2 ml

10 % (w/v)

Natriumlaurylsarcosinat

200 µl 200 µl

10 % (w/v) SDS 40 µl 40 µl

steriles H2O 12,76ml 16,76 ml

4.19.3.2 Hybridisierungsreaktion und Stringenzwaschschritte

Die Prähybridisierungslösung wurde verworfen, durch die Hybridisierungslösung ersetzt und

anschließend wurde bei TH über Nacht inkubiert. Die nachfolgenden Stringenzwaschschritte

dienten dazu, Hybride mit niedrigerer Homologie als die gewünschte wieder auszuwaschen.

Für die prnA-Sonde wurde eine Schmelztemperatur des Hybrids berechnet, dabei wurde ein

GC-Gehalt der Sonde von 64 % zugrunde gelegt. Für die PCR-Sonde postulierte man einen

GC-Gehalt von 70 %. Dieser liegt in der Größenordnung von Streptomyceten-DNA. Die

Temperatur der Hybridisierung wurde so gewählt, daß sich Hybride mit geringerer Homologie

bilden konnten als in den anschließenden Waschschritten. Die berechneten Bedingungen sind

in Tab. 6 zusammengestellt. Anschließend wurde sofort die Detektion vorgenommen.

Tab. 6: Bedingungen für die Hybridisierung und die StringenzwaschschritteprnA-Sonde (5 x SSC) PCR-Sonde (1 x SSC)

Tm in °C 107,2 95,6

TH in °C 67,2 75,6

1. Stringenzwaschlösung

Temperatur in °C

2 x SSC

65,6

0,5 x SSC

74,0

2. Stringenzwaschlösung

Temperatur in °C

1 x SSC

65,6

0,2 x SSC

74,0

Sonden-Homologie 70 % ~90 %


4.19.4 Detektion

Die Detektion erfolgte mit dem DIG Luminescent Detection Kit (Boehringer Mannheim) nach

der Anleitung des Herstellers.

Die ersten Schritte, einschließlich der Antikörperbehandlung, wurden in der

Hybridisierungsröhre durchgeführt. Alle weiteren Schritte erfolgten in einer Glasschale auf

dem Schüttler. Es wurde bei RT gearbeitet.

Zuerst wurde die Membran 5 min in 100 ml Waschpuffer gewaschen und 30 min in 90 ml

Puffer II bei RT inkubiert. Danach wurde mit 1 µl Anti-Dig-AP in 10 ml Puffer II weitere 30

min inkubiert. Es wurde 2 x 15 min mit je 100 ml Waschpuffer gewaschen und die Membran

5 min in Puffer III equilibriert. Für eine 5minütige Inkubation mit der CDP-Lösung, welche

vorher durch Verdünnen der Stammlösung 1:100 in Puffer III hergestellt worden war, wurde

die Membran auf eine Klarsichtfolie gelegt, 500 µl CDP-Lösung darauf gegeben, eine zweite

Klarsichtfolie aufgelegt, die Lösung zwischen den Folien durch Reiben mit einem

Tuch über die gesamte Membran verteilt und anschließend 5 min im Dunkeln inkubiert. Die

feuchte Membran wurde luftblasenfrei in Folie eingeschweißt und 15 min bei 37 °C inkubiert.

Danach wurde für zwei Stunden auf der Membran ein Röntgenfilm exponiert.

Lösungen für die Detektion:

Waschpuffer: 0,3 % (v/v) Tween 20 in Puffer I

Puffer II: 10 % Magermilchpulver in Puffer I

Puffer III: 0,1 M Tris

0,1 M NaCl

50 mM MgCl2; auf pH 9,5 einstellen

Nach dieser Zeit wurde der Film in der Dunkelkammer entwickelt.

Dazu wurde der Film in Entwicklerlösung gelegt, die Zeit ist hierbei mit Fortschreiten der

Entwicklung des Bildes abzuschätzen. War der Film entwickelt, wurde er für 1 min ins

Stopbad, anschließend für 5 min in Fixierer gelegt und zum Schluß mit klarem Wasser gespült

und getrocknet. Genügte die Qualität noch nicht den Ansprüchen (Bandenmuster zu schwach)

wurde ein neuer Film über Nacht bei 37 °C auf der Membran exponiert.


Lösungen zur Filmentwicklung

Entwickler

Stoplösung 3 % Essigsäure

Fixierer

4.19.5 Rehybridisierung

Zur Rehybridisierung wurde die Membran kurz in H2O geschwenkt, in die Hybridisierungs-

röhre eingelegt und 2 x 15 min bei 37 °C mit Rehybridisierungslösung inkubiert. Nach Spülen

der Membran in 2xSSC konnte diese sofort zur Prähybridisierung eingesetzt werden.

Rehybridisierungslösung: 0,2 M NaOH

0,1 % (w/v) SDS

4.20 Klonierung des potentiellen Halogenase-Gens aus Streptomyces

albogriseolus

4.20.1 Anlage einer angereicherten Genbank der genomischen DNA von Streptomyces

albogriseolus in pUC18

Aus Streptomyces albogriseolus wurde Gesamt-DNA isoliert (4.10.1), 30 µg dieser DNA mit

Pae I und Kpn I verdaut (4.14), einer Agarosegelelektrophorese unterzogen (4.12) und die

Fragmente mit einer Größe von ~4,5 kb aus dem Gel eluiert (4.13.1). Parallel wurden 10 µg

pUC18 Vektor-DNA mit Pae I und Kpn I verdaut (4.4). Die Ligation wurde wie in Abschnitt

4.16 beschrieben, durchgeführt. Die Transformation von kompetenten E. coli DH5α-Zellen

(4.17.1.2) erfolgte durch Elektroporation (4.17.2.2).

Restriktionsansätze:

1) 50 µl pUC18 [≈10 µg DNA] 2) 48 µl Gesamt-DNA [≈30 µg]

6 µl 10xH-Puffer 15 µl 10xH-Puffer

2 µl H2O 83 µl H2O

2 µl Pae I [20 U] 4 µl Pst I [40 U]

2 µl Kpn I [20 U] 4 µl Kpn I [40 U]


Ligationsansatz:

4 µl Vektor [≈50 ng DNA 0,02 pmol stickyends]

11,5 µl ~4,5 kb Insert [≈150 ng DNA 0,06 pmol stickyends]

4 µl 5xLigasepuffer

0,5 µl T4-Ligase [0,5 U]

4.20.2 Klonanalyse

4.20.2.1 Klonanalyse durch Plasmidisolierung und Hybridisierung mit der prnA-Sonde

Die nach der Transformation erhaltenen weißen rekombinanten Klone wurden in einem

geometrischen Muster auf HNB-Amp-Platten gepickt. Aus den jeweils 48 Klonen einer Platte

wurden die Plasmide isoliert (4.10.2), mit Hind III und Kpn I die einklonierten ~4,5 kb Inserts

herausgeschnitten (4.14) und die Fragmente durch Agarosegelelektrophorese (4.12) getrennt.

Nach Blotten der DNA-Fragmente auf eine Nylonmembran und anschließender

Hybridisierung (4.19) wurde festgestellt, auf welchen Platten sich mindestens 1 Klon mit dem

gewünschten Insert befand. Eine dieser Platten wurde dann auf die beschriebene

Vorgehensweise weiter analysiert, wobei die Anzahl der jeweils zusammen untersuchten

Klone ständig eingeengt wurde; zuerst 12 Klone eines Quadranten zusammen und

anschließend 12 Einzelklone des positiven Quadranten, so daß zum Schluß der Klon mit dem

hybridisierenden Insert identifiziert war.

4.20.2.2 Klonanalyse durch Koloniehybridisierung mit der PCR-Sonde

Der Vorteil dieser Methode (HANAHAN 1980; 1983) zu der in 4.20.2.1 beschriebenen ist der,

daß man die 48 Klone einer Platte auf einmal screenen kann.

Zunächst übertrug man die Kolonien mit Hilfe eines Stempels auf eine Nylonmembran und

legte diese auf eine HNB+Amp-Platte und ließ die Klone 6-8 h bei 37 °C wachsen.

Anschließend wurde die Membran mit der Kolonieseite nach oben auf Filterpapier, das mit

folgenden Lösungen getränkt war, gelegt: 5 min auf Filterpapier mit 10 % SDS getränkt,

7 min auf Filterpapier mit Denaturierungslösung und 6 min auf Filterpapier mit


Neutralisierungslösung. Anschließend wurde die Membran in 2xSSC-Lösung gewaschen,

getrocknet und die DNA 2 min mit UV-Licht an die Membran fixiert.

Nach der Fixierung der DNA wurde die Membran 3 h bei 50 °C in 3xSSC mit 0,1 % SDS

gewaschen. Danach wurden die Zellreste sorgfältig von der Membran gerieben und sofort die

Hybridisierung, wie in 4.19.3 beschrieben, angeschlossen.

4.20.3 Erstellung einer partiellen Restriktionskarte

Aus dem beim Screening (4.20.2.1) identifizierten Klon wurde das Plasmid pHI1536 isoliert

(4.20.2). Da das ~4,5 kb Pae I/Kpn I Insert zur vollständigen Sequenzierung zu groß war,

wurde davon eine partielle Restriktionskarte erstellt, um ein kleineres Fragment, welches zur

Subklonierung in M13mp18 und M13mp19 geeignet war, zu finden.

Zur Erstellung der Restriktionskarte wurde sowohl das gesamte Plasmid pHI1536 als auch nur

dessen ~4,5 kb Insert mit verschiedenen Restriktionsenzymen geschnitten. Dazu wurde erst

mit diversen Enzymen einzeln geschnitten (4.14) und nach Auswertung dieser Restriktionen

mittels Agarosegelelektrophorese (4.12) verschiedene Doppel-Restriktionsspaltungen

durchgeführt. Diese wurden dann durch Agarosegelelektrophorese (4.12) und anschließender

Hybridisierung mit der prnA-Sonde (4.19) ausgewertet.

4.21 Klonierung in M13-Bakteriophagen

4.21.1 Subklonierung in M13mp18 und M13mp19

Zur Subklonierung in die M13-Phagen wurde das ~0,52 kb Pst I/Cfr9 I Fragment aus pHI1536

als neues Insert verwendet. Dieses wurde durch Pst I/Cfr9 I Doppel-Restriktions-spaltung von

pHI1536 (4.14), anschließende Agarosegelelektrophorese (4.12) und Elution der DNA aus

dem Gel (4.13.2) erhalten.

Parallel wurde RF-DNA von M13mp18 und M13mp19 als Vektoren ebenfalls Pst I/Cfr9 I

geschnitten (4.14). Die Ligation und Transfektion wurden, wie in 4.16 bzw. 4.21.2

beschrieben, durchgeführt. Die Kontrolle der erhaltenen rekombinanten Klone erfolgte, wie in

4.21.3 beschrieben.


Restriktionsansätze:

1) 1 µl M13mp18 dsDNA [≈420 ng] 2) 2 µl M13mp19 dsDNA [≈2,7 µg]

1 µl 10xOne-Phor-All-Puffer 1 µl 10xOne-Phor-All-Puffer

7 µl H2O 6 µl H2O

0,5 µl Cfr9I [5 U] 0,5 µl Cfr9I [5 U]

0,5 µl Pst I [5 U] 0,5 µl Pst I [5 U]

3) 10 µl pHI1536 [≈12,6 µg DNA]

4 µl 10xOne-Phor-All-Puffer

24 µl H2O

1 µl Cfr9I [10 U]

1 µl Pst I [10 U]

Ligationsansätze:

1) 9 µl Restriktionsansatz M13mp18 2) 3 µl Restriktionsansatz M13mp19

[≈376 ng DNA] [≈410 ng DNA]

0,5 µl ~0,52 kb Insert 0,5 µl ~0,52 kb Insert

[≈200 ng DNA] [≈200 ng DNA]

14,5 µl H2O 20,5 µl H2O

3 µl 10xReaktionspuffer 3 µl 10xReaktionspuffer

0,6 µl 50 mM DTT 0,6 µl 50 mM DTT

0,6 µl 50 mM ATP 0,6 µl 50 mM ATP

2 µl T4-DNA-Ligase [2 U] 2 µl T4-DNA-Ligase [2 U]

4.21.2 Transfektion von Escherichia coli TG1

20 ml 2xTY-Medium wurden mit 200 µl einer E. coli TG1-Übernachtkultur beimpft und bei

37 °C 2-3 h bis zu einer optischen Dichte von 0,3-0,5 bei 550 nm gezüchtet. Die Kultur wurde

dann bis zum Gebrauch im Kühlschrank aufbewahrt. Der Ligationsansatz wurde mit 50 mM

Tris-HCl, pH 7,2 auf ein Endvolumen von 50 µl aufgefüllt. Es wurden 300 µl auf Eis

aufgetaute, kompetente Zellen (4.17.1.1) zugegeben und 40 min auf Eis inkubiert.


Während dieser Inkubationszeit wurden Zentrifugengläser mit je 3 ml geschmolzenen H-Top-

Agar vorbereitet und bei 42 °C aufbewahrt.

In jedes Zentrifugenglas wurden 40 µl 2 % X-Gal und 40 µl 100 mM IPTG gegeben. Nach der

Inkubation auf Eis folgte ein 3minütiger Hitzeschock bei 42 °C. Danach wurden die

Transfektionsansätze sofort wieder auf Eis gestellt. Dann wurden nacheinander 5 µl, 30 µl

und der restliche Transfektionsansatz mit jeweils 200 µl der im Kühlschrank aufbewahrten

E. coli-Kultur in die vorbereiteten Zentrifugengläser gegeben, schnell und vorsichtig gemixt

und auf einer bei 37 °C vorgewärmten HNB-Platte verteilt. Nach Festwerden des Top-Agars

wurden die Platten bei 37 °C über Nacht inkubiert. Die Sterilkontrolle wurde mit 50 µl 50

mM Tris-HCl, pH 7,2 und die Kompetenzkontrolle mit 500 ng M13 RF-DNA in 50 µl 50 mM

Tris-HCl, pH 7,2 durchgeführt.

4.21.3 Untersuchung rekombinanter M13-Phagen

Rekombinante Phagen bildeten weiße Plaques, während die nicht rekombinanten eine blaue

Farbe aufwiesen. Die weißen Plaques wurden mit einer Pipette von der Platte abgesaugt und

in 5 ml 2xTY-Medium, welches 100 µl einer E. coli TG1-Übernachtkultur enthielt, gegeben.

Man inkubierte das Medium 6 h bei 37 °C. Nach Zentrifugation (10 min, 4000 Upm, RT)

wurden jeweils 1,5 ml des Überstandes in 2 Eppendorfgefäße pipettiert, welche bis zur

ssDNA-Isolierung bei –20 °C gelagert wurden. Der Rest des Überstandes wurde verworfen.

Zur Untersuchung der Phagen-DNA wurde aus dem Pellet die RF-DNA isoliert (4.10.2).

Durch Restriktionsanalyse und gegebenenfalls Hybridisierung mit der prnA-Sonde (4.19)

wurde der M13-Klon mit dem richtigen ~0,52 kb Insert identifiziert.

4.21.4 ssDNA-Isolierung

Die Isolierung der ssDNA des Phagen M13 wurde mit dem QIAprep Spin M13 Kit der Firma

QIAGEN durchgeführt. Hierfür benutzte man den Überstand (siehe 4.21.3) der rekombinanten

M13-Phagen, die sich als positiv erwiesen haben. Nach nochmaliger Zentrifugation 10 min

bei 5000 Upm wurde dem Überstand 1/100 Vol. Puffer MP zugesetzt, intensiv durchmischt

und dann 2 min bei RT inkubiert.


In ein 2 ml Microzentrifugengefäß steckte man eine QIAprep-Säule, gab in diese 0,7 ml der

Probe und zentrifugierte 15 sec bei 8000 Upm. Diese Prozedur wurde wiederholt, bis die

gesamte Probe auf die Säule geladen war. Danach gab man 0,7 ml Puffer MLB auf die Säule,

um die M13-Phagen zu lysieren, und zentrifugierte wieder 15 sec bei 8000 Upm. Die Zugabe

wurde wiederholt, wobei die Inkubationszeit 1 min betrug, um die Lyse möglichst vollständig

durchzuführen. Anschließend wusch man mit 0,7 ml PE-Puffer und zentrifugierte mehrmals

bei 8000 Upm für 15 sec, damit die Membran vollständig trocken wurde. Die Säule überführte

man in ein frisches Eppendorf-Tube (1,5 ml). Mit 100 µl EB-Puffer inkubierte man für 10 min

die Matrix und zentrifugierte danach 30 sec bei 8000 Upm. Die Konzentration der ssDNA-

Lösung wurde durch Vergleich der Fuoreszenzintensität mit der einer ssDNA-Probe bekannter

Konzentration ermittelt (siehe 4.11).

4.22 DNA-Sequenzierung

Zur DNA-Sequenzierung wurde die Kettenabbruchmethode (SANGER et al., 1977)

angewendet. Bei dieser Methode wird an eine ss-Template-DNA ein Primer gebunden und

ausgehend von diesem werden mit einer Polymerase Ketten unterschiedlicher Nucleotidanzahl

synthetisiert. Es sind vier Ansätze notwendig, von denen jeder alle vier Desoxynucleotide und

jeweils ein Didesoxynucleotid enthält. Wird von der Polymerase ein ddNTP eingebaut, erfolgt

der Kettenabbruch, da die für die Bildung der nächsten Phosphordiesterbindung erforderliche

3´-Hydroxygruppe fehlt.

Es wurde der DIG Taq DNA Sequencing Kit von Boehringer Mannheim eingesetzt. Dieser

enthält die Taq DNA Polymerase, eine 5´-3´-DNA Polymerase mit fehlender 3´-5´-Exo-

nucleaseaktivität (TINDALL & KUNKEL, 1988), den 5´-digoxigeninmarkierten Primer und die

Terminationsmischungen. Da die zu sequenzierende DNA GC-reich war, wurden

Terminationsmischungen, die 7-Deaza-dGTP statt dGTP enthielten, eingesetzt. Damit wird

die Bandenüberlagerung verringert, welche durch Sekundärstrukturen, die bei der

Elektrophorese nicht vollständig denaturieren, verursacht wird (MIZUSAWA et al., 1986). Die

Cycle-sequencing-Methode erlaubt den Einsatz von wenig Template-DNA, da Primer-

Annealing und Extension wiederholt durchgeführt werden. Nach jeder Elongationsreaktion

wird hitzedenaturiert, wodurch die Template-DNA für die nächste Runde wieder zur

Verfügung steht.


4.22.1 Primer-Annealing

Folgende Ansätze wurden in einem sterilen Eppendorfgefäß zusammenpipettiert:

1 µl ss-Template-DNA ( ≈ 2,5 µg M13mp18+0,75 kb bzw.

≈ 1,4 µg M13mp19+0,75 kb)

1 µl Primer (= 1 pmol )

2 µl 10x Reaktionspuffer

6 µl H2Obidest.

Es wurde gemischt und nach Anzentrifugieren 10 min bei 55 °C inkubiert. Nach Abkühlen auf

RT wurden 8 µl H2Obidest. und 2 µl Taq DNA Polymerase [6 U] zugegeben, erneut gemischt

und zentrifugiert.

4.22.2 Extension und Termination

In vier 0,5 ml Eppendorfgefäße wurden jeweils 2 µl A-, C-, G- bzw. T-Mischung pipettiert

und zu jedem Ansatz 4 µl des Reaktionsgemisches aus der Primer-Annealing-Reaktion

gegeben. Nach Mixen und Zentrifugieren wurde 3 min bei 70 °C inkubiert. Danach wurden

die Proben mit je 10 µl Mineralöl überschichtet und in den Thermo-Cycler zurückgestellt.

Nach 5minütiger Inkubation bei 95 °C zur Denaturierung folgten eine erneute Annealing-

Reaktion, Extension und Termination. Insgesamt wurden 30 Zyklen durchlaufen:

- 30 sec bei 95 °C zur Denaturierung

- 30 sec bei 60 °C zur Annealing Reaktion

- 1 min bei 70 °C für Extension und Termination.

Nach Beendigung der Zyklen wurde auf 4 °C abgekühlt und zum Abstoppen der Reaktion 2 µl

Formamidpuffer zugegeben. Die Proben wurden bis zum Auftragen auf das Polyacrylamidgel

bei –20 °C gelagert.


Zusammensetzung der Terminationsmischungen:

A-Mix: dATP, dCTP, 7-deaza-dGTP, dTTP (je 25 µM); 850 µM ddATP; 950 µM

MgCl2

C-Mix: dATP, dCTP, 7-deaza-dGTP, dTTP (je 25 µM); 400 µM ddCTP; 500 µM

MgCl2

G-Mix: dATP, dCTP, 7-deaza-dGTP, dTTP (je 25 µM); 75 µM ddGTP; 175 µM MgCl2

T-Mix: dATP, dCTP, 7-deaza-dGTP, dTTP (je 25 µM); 1275 µM ddTTP; 1370 µM MgCl2

4.22.3 Elektrophorese

Die synthetisierten DNA-Fragmente wurden durch denaturierende Polyacrylamidgel-

elektrophorese getrennt. Es wurde ein 0,125 mm dickes, 5 %iges Gel mit einem

Harnstoffgehalt von 8,3 M gegossen. Die Proben wurden vor dem Auftragen auf das Gel

10 min bei 95 °C denaturiert. Der hohe Harnstoffgehalt des Gels sowie die durch die

angelegte Hochspannung (1850 V) entstehende Wärme bewirkten, daß die Proben auch

während der Elektrophorese denaturiert blieben. Der Probeneinlauf in das Gel erfolgte bei

einer Spannung von 500 V. Als Elektrodenpuffer diente TBE-Puffer. Der Verlauf der

Elektrophorese wurde anhand der zwei dem Formamidpuffer zugesetzten Farbstoffe,

Bromphenolblau und Xylencyanol, verfolgt. Wenn die Bromphenolblau-Front die

Gelunterkante erreicht hatte, wurde eine 46 cm lange Nylonmembran unter das Gel

transportiert und die Elektrophorese fortgesetzt. Dabei wurden alle aus dem Gel

herauslaufenden DNA-Fragmente direkt auf die Membran geblottet. Die

Transportgeschwindigkeit der Membran betrug 15 bis 10 cm/h. Die Membran wurde sofort

zur DNA-Fixierung eingesetzt.

Lösungen für das Gel:

Harnstoff-Diluent: Harnstoff 84 g

10xTBE 18,7 g

H2O 67,5 ml

Sequenziergel: GATC-Gel 30 % 6,6 ml

Harnstoff-Diluent 33,4 ml


Diese Gellösung wurde durch einen SFCA-Filter mit einer Porengröße von 0,45 µm filtriert.

Für ein Gel reichten 20 ml Gellösung aus. Vor Gießen des Gels wurden 68 µl

10 % APS und 17 µl TEMED zugesetzt.

4.22.4 DNA-Fixierung und Antikörperbindung

Die Membran wurde 20 min bei 80 °C getrocknet und 2 min unter UV-Licht exponiert. Nach

Einlegen der Membran in ein GATC-TUBE wurden 150 ml H2Obidest. eingefüllt und dieses in

den Hybridisierungsofen eingesetzt. Es wurde 5 min bei 30 °C equilibriert und 5 min mit

150 ml Maleinsäurepuffer behandelt.

Danach wurde die Membran 45 min in 80 ml 1,5 % (w/v) Magermilchpulver in

Maleinsäurepuffer und weitere 45 min in 20 ml 1,5 % (w/v) Magermilchpulver in

Maleinsäurepuffer mit 3 µl Anti-Dig-AP inkubiert.

Es folgte eine 3 x 10minütige Inkubation in jeweils 150 ml Maleinsäurepuffer. Zuletzt wurde

5 min in 150 ml Reaktionspuffer inkubiert und sofort mit der kolorimetrischen Detektion

fortgefahren.

Puffer für die DNA-Fixierung:

Maleinsäurepuffer: Der Maleinsäurepuffer entspricht dem in 2.19.2 aufgeführten Puffer

I.

Reaktionspuffer: NaCl 5,84 g

MgCl2.6H2O 2 g

Tris-HCl 0.83 g

Tris 11,58 g

mit H2Odest. auf 1 l auffüllen

4.22.5 Kolorimetrische Detektion

Zur kolorimetrischen Detektion wurden 25 ml Reaktionspuffer, 68 µl NBT-Lösung und 90 µl

X-Phosphat zur Membran gegeben und über Nacht entwickelt. Danach wurde die Membran

15 min mit 150 ml H2Odest. und 15 min mit 150 ml TE-Puffer gewaschen und nach dem

Trocknen dunkel aufbewahrt.


Lösungen für die kolorimetrische Detektion:

NBT-Lösung: 100 mg/ml Nitroblau-Tetrazoliumsalz in 70 % DMF

X-Phosphat-Lösung: 50 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat-Toluidiniumsalz in

DMF

Ergebnisse -47-

5 Ergebnisse

5.1 Identifizierung eines potentiellen Halogenasegens in der genomischen

DNA von Streptomyces albogriseolus

Aus Streptomyces albogriseolus wurde Gesamt-DNA isoliert (4.10.1), diese mit

verschiedenen Restriktionsenzymen geschnitten (4.14) und einer Agarosegelelektrophorese

unterzogen (4.12). Die DNA wurde auf eine Nylonmembran geblottet (4.19.1) und diese mit

der prnA-Sonde hybridisiert (4.19.3/4.19.4). Das Ergebnis dieser Elektrophorese ist in Abb.

10 und der dazugehörige, nach Southern-Transfer und Hybridisierung erhaltene Röntgenfilm

in Abb. 11 dargestellt. Die Größen des verwendeten Standards sind in kb angegeben. Als

Positivkontrolle diente Gesamt-DNA aus Pseudomonas pyrrocinia.

Abb. 10: Agarosegel der Restriktionsansätze Abb. 11: Hybridisierungsergebnis des Gels

Der Bereich mit einer Größe von 4-5 kb nach Pae I/Kpn I-Restriktionsspaltung wurde fürweitere Arbeiten verwendet.

Ergebnisse -48-

5.2 Anlage einer angereicherten Genbank der genomischen DNA aus

Streptomyces albogriseolus in pUC18

Die Anlage der angereicherten Genbank wurde, wie in Abschnitt 4.20.1 beschrieben,

durchgeführt. Das Schema dieser Klonierung ist in Abb.12 dargestellt. Die Ligation mit den

~4,5 kb Fragmenten aus Streptomyces albogriseolus wurde nach 4.16 durchgeführt. Zur

Transformation wurde die Elektroporation (4.17.2.2) der CaCl2-Methode vorgezogen, da mit

dieser wesentlich höhere Transformationsraten erzielt werden können.

Abb. 12: Klonierungsschema für das rekombinante Plasmid pHI1536

GCATGCCGTACG

GGTACCCCATGG

- C- CGTACG

PHO

GGTACC - C -

OHP

- C - CGTACG

PHO

GGTACC - C -

OHP

Pae Kpn I/ I

Gesamt-DNA aus Streptomyces albogriseolus

~ 4,5 kb Fragmente

Vektor pUC18

T4-DNA-Ligase

Pae Kpn I/ I

rekombinante Plasmide

pUC182,7 kb

LacZ’

Ampr

mcs

Ampr

Pae I

Kpn I

PHI15367,1 kb

Fragmente ~4,5 kb

Ergebnisse -49-

5.3 Klonanalyse durch Plasmidisolierung, Southern-Blotting und

Hybridisierung

Die Analyse der erhaltenen ca. 2000 Klone wurde mit dem Verfahren der Plasmidisolierungdurchgeführt. Bei sechs verschiedenen Platten detektierte man mit der prnA-Sonde einpositives Signal; aber nur eine, Platte 32, wurde weiter untersucht. Dazu wurde die Platte invier Quadranten unterteilt, um das positive Signal der Hybridisierung einem Quadranten vonzwölf Klonen zuordnen zu können. Danach wurden die Einzelklone in diesem Quadrantenuntersucht. Dazu wurden die Plasmide jedes einzelnen Klons isoliert, die Inserts mit Kpn Iund Hind III herausgeschnitten und die DNA-Fragmente mittels Agarosegelelektrophoresegetrennt. Das Ergebnis dieser Elektrophorese ist in Abb. 13 und der dazugehörige, nachSouthern-Transfer und Hybridisierung, erhaltene Röntgenfilm in Abb. 14 dargestellt. DieGrößen des verwendeten λ-Standards sind in kb angegeben.

Abb. 13: Agarosegel zur Analyse der KlonevonPlatte 32

Abb. 14:Ergebnis der Hybridisierung mit PCR-Sonde

Die Hybridisierung mit der PCR-Sonde wurde bei 75,6 °C durchgeführt. Damit betrug die

Homologie ~80 % und die der Stringenzwaschschritte ~90 %.

Ergebnisse - 51 –

Anfangs wurde die Hybridisierung mit der prnA-Sonde durchgeführt (70 % Homologie); diese

hybridisierte jedoch auch mit dem Vektor und man erhielt auch bei 2,7 kb ein positives

Signal. Deshalb wurde in weiteren Hybridisierungen das PCR-Fragment als Sonde verwendet.

Das PCR-Fragment bindet spezifisch nur noch mit dem gesuchten DNA-Abschnitt.

In Abb. 14 ist zu sehen, daß nur bei Probe 9 ein etwa 4,5 kb großes DNA-Fragmenthybridisiert hat, welches dem gewünschten Insert entspricht.

Es hybridisierte ein Fragment mit der erwarteten Größe von ~4,5 kb aus dem Klon P 32/IV/9

mit der prnA- wie auch mit der PCR-Sonde. Dieses Plasmid wurde pHI1536 genannt.

5.4 Die PCR-Sonde

Abb. 15 zeigt die Röntgenfilme von Hybridisierungsversuchen zur Optimierung des

Genbankscreenings. Die Hybridisierung mit der prnA-Sonde wurde wie in 4.19.3

durchgeführt; damit ergab sich eine Homologie von 70 %. Die Ergebnisse für den Southern-

Blot sind in Abb. 15 [1] und für eine Membran, auf die DNA-Lösung aufgetragen wurde, in

Abb. 15 [2] dargestellt. Eine deutliches Signal des Vektors unter diesen Bedingungen ist

sichtbar. Die Homologie für die prnA-Sonde ließ sich nicht erhöhen, da sonst das Signal der

DNA aus Streptomyces albogriseolus nicht mehr detektiert werden konnte.

Aus diesem Grunde sollte ein neue Sonde zur Anwendung kommen.

Die in 5.3 verwendete PCR-Sonde wurde wie in 4.18.1 und 4.19.2 beschrieben gewonnen.

Ihr größter Vorteil ist die hohe Spezifität gegenüber dem DNA-Abschnitt der in der PCR als

Template diente; deshalb bindet die Sonde nur noch mit dem gesuchten Insert, welches diesen

DNA-Abschnitt trägt.

Die Ergebnisse für die Hybridisierungen mit der PCR-Sonde sind in Abb. 15 [3] und [4]

dargestellt. Es handelt sich hierbei um Röntgenfilme der selben Membranen, wie bei den

Versuchen mit der prnA-Sonde. Die Bedingungen für die Hybridisierung wurden wie in

4.19.3 angegeben, gewählt. Damit beträgt die Homologie ~90 %.

Man erkennt auf den Filmen nur noch die DNA aus Streptomyces albogriseolus und nicht

mehr den Vektor pUC 18 oder die Gesamt-DNA aus Pseudomonas pyrrocinia, die als

Positivkontrolle für die prnA-Sonde diente.

Ergebnisse - 52 –

Abb. 15: Hybridisierungsversuche zur Optimierung des Genbankscreenings

[1], [2]: Hybridisierung mit der prnA-Sonde (70 % Homologie)[3], [4]: Hybridisierung mit der PCR-Sonde (~90 % Homologie)

pUC18

DNA aus Pseudomonas pyrrocinia

DNA aus S. albogriseolus

pUC18(linearisiert)

DNA aus

( I/ I)S. albogriseolus

Pae Kpn

pUC18

DNA aus Pseudomonas pyrrocinia

DNA aus S. albogriseolus

pUC18(linearisiert)

DNA aus

( I/ I)S. albogriseolus

Pae Kpn

[1] [2]

[3] [4]

Ergebnisse - 53 –

5.5 Restriktionsanalyse des Plasmids pHI1536

Die Restriktionsanalyse des rekombinanten Plasmids pHI1536 erfolgte wie in Abschnitt

4.20.3 angegeben. Das Plasmid wurde mit folgenden Restriktionsenzymen verdaut: Bam HI,

Sma I, Sal I, Eco RI, Sac I, Pst I, Bgl II und Xho I. Das Gel der anschließenden

Agarosegelelektrophorese ist im Folgenden dargestellt.

Abb. 16: Restriktionsanalyse von pHI1536

Die Anzahl der bei der Verdauung mit einem Enzym erhaltenen Banden entspricht der Anzahl

der Schnittstellen dieses Enzyms im Plasmid. Da die Zahl der Schnittstellen im Vektor pUC18

für die verwendeten Enzyme bekannt war, konnte auf die Zahl der Schnittstellen im Insert

geschlossen werden.

Die Auswertung der Restriktionsanalysen von pHI1536 ist in Tab. 7 dargestellt.

Bam

HI

Sma I

Sal I

Eco

RI

Sac

I

Pst I

Xho

IBg

l II

λ- I

Pst

pHI1

536

14,0

5,0

2,8

1,1

Ergebnisse - 54 –

Tab. 7: Restriktionsanalyse von pHI1536

Enzym Schnittstellen im Vektor Restriktionsanalyse von pHI1536

Anzahl der Banden Schnittstellen im Insert

Bam HI 0 3 3

Pst I 0 3 3

Sal I 0 3 (+n Fragmente)1 3 (+n Fragmente)1

Sma I 0 3 3

Eco RI 1 1 0

Hind III 1 1 0

Pae I 1 1 0

Kpn I 1 1 0

Sac I 1 1 0

Xho I 0 0 0

Bgl II 0 0 0

5.6 Restriktionsanalyse des Inserts aus pHI1536

Das Plasmid pHI1536 wurde mit zwei Restriktionsenzymen gleichzeitig geschnitten. Einesder Restriktionsenzyme war hierbei Kpn I oder Pae I (Restriktionsenzyme der Klonierung) inKombination mit den Restriktionsendonukleasen, die im Insert nachweislich Schnittstellenaufwiesen (Bam HI, Sma I, Sal I und Pst I). Aus Kostengründen wurde auf das teurere Pae Iverzichtet. Dafür wurde Hind III verwendet, von dem gezeigt werden konnte, daß es keineSchnittstelle im Insert besitzt, aber im Polylinker des Vektors seine Schnittstelle neben Pae Ihat. Die geschnittene Plasmid-DNA wurde einer Agarosegelelektrophorese (4.12) unterzogen,anschließend wurde ein Southern-Blot angefertigt (4.19.1) und mit der PCR-Sondehybridisiert (4.19.3 und 4.19.4). Die Ergebnisse sind in Abb. 17 und Abb. 18 dargestellt. AlsMarker diente der Ladder-Mix; die Fragmentgröße ist in kb angegeben.In Tab. 8 sind die Größen der erhaltenen Fragmente aufgeführt. Die Fragmente, die mit derPCR-Sonde hybridisierten, sind hervorgehoben.

1 n = unbekannte Anzahl

Ergebnisse - 55 –

Tab. 8: Restriktionsanalyse des Plasmids aus pHI1536Enzym Fragmente, Größe in kb

Kpn I/ Bam HI 4,1; 2,1; 0,5; 0,4

Hind III/ Bam HI 4,8; 1,4; 0,5; 0,4

Kpn I/ Pst I 3,4; 2,1; 1,1; 0,5

Hind III/ Pst I 4,8; 1,1; 0,7; 0,5

Kpn I/ Sal I 3,1; 1,2; 1,7; 0,25 (~1 kb in Fragmente < 0,2 kb)

Hind III/ Sal I 3,9; 1,7; 0,4; 0,25 (~1 kb in Fragmente < 0,2 kb)

Kpn I/ Sma I 3,0; 1,6; 1,5; 1,0

Hind III/ Sma I 4,3; 1,5; 1,0; 0,3

Abb. 17: Agarosegel der Restriktion des Insertsaus pHI1536

Abb. 18: Hybridisierung mit der PCR-Sonde

Kpn

Bam

I/

HI

Hin

Bam

d II

I/ H

I

Kpn

Pst

I/

I

Hin

Pst

d II

I/ I

Kpn

Sal

I/

I

Hin

Sal

d II

I/ I

Kpn

Sma

I/

I

Hin

Sma

d II

I/ I

Ladd

er-M

ix

Kpn

Bam

I/

HI

Hin

Bam

d I I

I/ H

I

Kpn

Pst

I/

I

Hin

Pst

d II

I/ I

Kpn

Sal

I/

I

Hin

Sal

d I I

I/ I

Kp n

Sma

I/

I

Hin

Sma

d II

I/ I

Ladd

er-M

ix

10,05,0

3,0

2,0

1,5

1,0

0,7

0,5

Ergebnisse - 56 –

5.7 Erstellung einer partiellen Restriktionskarte des 4,5 kb

Pae I/Kpn I-Fragments

Mit dieser Restriktionsanalyse konnte nur über die Schnittstellen im Insert genaue Aussagen

gemacht werden, die in Nachbarschaft zu den Klonierungsschnittstellen liegen. Die

Schnittstellen für die verschiedenen Restriktionsenzyme in pHI1536 sind im folgenden

dargestellt.

Abb. 19: Restriktionskarte für Bam HI Abb. 20: Restriktionskarte für Pst I

Abb. 21: Restriktionskarte für Sma I Abb. 22: Restriktionskarte für Sal I

Um über die verbleibenden Schnittstellen von Bam HI, Sma I und Pst I im Insert genauere

Informationen zu erhalten, mußte pHI1536 mit zwei Restriktionsenzymen gespalten werden.

Hind III Kpn I

pHI15367,1 kb

2,7 kbpUC18

Bam HIBam HI

1,4 kb

2,1 kb

0,9 kb

Hind III Kpn I

2,7 kbpUC18

Pst I

2,1 kb

Pst I

0,7 kb

1,6 kb

pHI15367,1 kb

Hind III Kpn I

2,7 kbpUC18

pHI15367,1 kb

Sma I

Sma I

1,6 kb

0,3 kb

2,5 kb

Hind III Kpn I

pHI15367,1 kb

2,7 kbpUC18

Sal I

Sal I2,8 kb

1,2 kb

0,4 kb

Ergebnisse - 57 –

Das Plasmid pHI1536 wurde deshalb mit Bam HI + Sma I, Bam HI + Pst I und Sma I + Pst I

geschnitten.

Auf Restriktionsansätze mit Sal I als Kombination wurde verzichtet, da Sal I im Insert relativ

viele Schnittstellen (< 200 bp) aufweist, so daß die Bestimmung der Lage dieser Schnitt-

stellen großen Aufwand erfordert. Darauf wurde jedoch verzichtet, weil im Ergebnis der

Restriktionsanalyse ein hybridiserendes Fragment, das sich zur Sequenzierung eignet, d.h.

kleiner als 800 bp ist, gefunden werden sollte, wozu eine partielle Restriktionskarte des Inserts

ausreichte.

Das erhaltene Agarosegel der doppelten Restriktionsspaltung ist in Abb. 23 zu sehen. DieGrößen der erhaltenen Fragmente sind in Tab. 9 aufgeführt.

Abb. 23: Agarosegel der doppelten Restriktionsspaltung

von pHI1536

Ergebnisse - 58 –

Tab. 9: Fragmente der Doppelrestriktionsspaltung von pHI1536Enzyme Bam HI

Pst I

Bam HI

Sma I

Sma I

Pst I

Größe der erhal-

tenen Fragmente

in kb

5,5

0,7

0,5

0,4

4,5

1,1

0,5 (2x)

0,4

4,5

0,7

0,5 (2x)

0,4 (2x)

Mit Hilfe der in Tab. 9 aufgeführten Fragmente konnte für das Insert aus pHI1536 einepartielle Restriktionskarte, welche Bam HI-, Sma I und Pst I-Schnittstellen beinhaltet, erstelltwerden. Diese Schnittstellen sind in den folgenden Abbildungen gezeigt.

Abb. 24: Restriktionskarte Bam HI/Sma I-Doppelspaltung

Abb. 25: Restriktionskarte Bam HI/Pst I-Doppelspaltung

Abb. 26: Restriktionkarte Pst I/Sma I-Doppelspaltung

Hind III Kpn I

2,7 kbpUC18

Pst Bam I/ HI

2,1 kb

Pst I

0,7 kb pHI15367,1 kb

Bam HI

0,7 kb

Bam HI0,5 kb

0,4 kb

Hind III Kpn I

2,7 kbpUC18

pHI15367,1 kb

Sma I

Sma I

1,6 kb

0,3 kb

Sma BamI/ HIBam HI

0,5 kb0,4 kb

Bam HI

1,1 kb

0,5 kb

Hind III Kpn I

2,7 kbpUC18

pHI15367,1 kb

Sma I

Sma I

1,6 kb

0,3 kb

Pst I0,5 kb

Pst I0,5 kb

Pst I

Sma I0,4 kb

0,4 kb

0,7 kb

Ergebnisse - 59 –

Damit ergibt sich die in Abb. 27 zusammengefaßte partielle Restriktionskarte. Das PCR-

Fragment hybridisierte mit dem hervorgehobenen Bereich des Inserts. Davon wurde später

das 0,5 kb große Fragment (Pst I/Sma I) sequenziert.

Abb. 27: Partielle Restriktionskarte des Inserts aus pHI1536

Aus Gründen der Übersichtlichkeit wurden die restlichen Restriktionsschnittstellen nicht mit

aufgeführt.

5.8 Subklonierung des 0,52 kb Pst I/Cfr9 I-Fragments in M13-Phagen und

Sequenzierung dieses Fragments

Die Subklonierung des 0,5 kb Pst I/Cfr9 I (Sma I)-Fragments aus pHI1536 in die Vektoren

M13mp18 und M13mp19 erfolgte wie in 4.21.1 beschrieben. Das Schema dieser

Subklonierung ist in Abb. 28 dargestellt. Dieses Fragment wurde zur Subklonierung in M13

ausgewählt, da dessen Größe zur vollständigen Sequenzierung geeignet schien.

Die Sequenzierung des 0,5 kb Pst I/Cfr9 I-Fragments wurde, wie in Abschnitt 4.22

angegeben, durchgeführt. Das Ergebnis der Sequenzierung befinden sich im Anhang. Es

konnten pro Sequenzierung nur ca. 200 Basen des 0,5 kb Fragments in jeder Richtung gelesen

werden.

Hind III Kpn I

2,7 kbpUC18

Pst Bam I/ HI

pHI15367,1 kb

0,4 kb

0,5 kb

Sal I

1,2 kb

Sma I

2,3 kb

Ergebnisse - 60 –

Abb. 28: Schema der Subklonierung in M13-Bakteriophagen

Es wurde die nachfolgend aufgeführten Sequenzen ermittelt

Für das Fragment in M13mp18:

30

..ACTCTTCGTCGACTGCTCCGGCTTCCGCGGGCTGCTGATCAACAAGGCCATG

L F V D C S G F R G L L I N K A M

60 90

GAGGAGCCGTTCATCGACATGAGCGACCACCTCCTGTGCAACAGCGCGGTCGCC

Q Q P F I D M S D H L L C N S A V A

120 150

ACGGCCGTACCGCACGACGACGAGAAGAACGGTGTCGAGCCGTACACCTCCTCG

T A V P H D D Q K N G V Q P Y T S S

180 210

ATCGCATGGAGGCCGGTGGCCTGGAAGATTCATGCTGGGCCGTTGGAGGGTTA I A W R P V A W K I H A G P L

Für die Sequenz gibt es 6 theoretische Leserahmen, welche für eine Aminosäuresequenz

codieren. Diese Leserahmen wurden überprüft. Nur der Leserahmen, der eine

Pst Cfr I/ 9 I

PHO

- ACGTC - G

GGGCC - C -

OHP

0,5 kb Fragment

Cfr Pst9 I/ I

PHO

- C - CCGGG

G - CTGCA -

OHP

M13mp18

Cfr Pst 9 I/ I

PHO

- ACGTC - G

GGGCC - C -

OHP

M13mp19

M13mp19 + 0,5 kbM13mp18 + 0,5 kb

T4-DNA-Ligase T4-DNA-Ligase

Ampr

Pae I

Kpn I

PHI15367,1 kb

Fragment ~4,5 kb

Ergebnisse - 61 –

Aminosäuresequenz liefert, die zu der Aminosäuresequenz des PrnA Homologien aufweist, ist

unter der Gensequenz angegeben.

Für das Fragment M13mp19:

30

TCTCCCGGTTGAACCGTCGACGAGCACCTTGTCGAAGGTCTTGTCGGGGAAGTGC

60 90

CTTGGCCAGCATGTGGATGGCCGCGTAGATGAAGTAGATGCCGCTGGACTCCAGC

120 150

GTCCACGAAGCACACGCGAGGCCGACGCTGACGCAGTTGCGCACCCAGGCCCTGC

180 206

GGTTGCGGCCGACCGAGGACGTGGTTAACTCGGTGTTGTAC

Für diese Sequenz konnte kein sinnvoller Leserahmen gefunden werden, dessen

Aminosäuresequenz eine Homologie zur Sequenz des PrnA aufweist. Ein Grund hierfür wäre

ein Lesefehler in der Sequenz der Nucleotide. Mit den beiden Sequenzen wurde ein

Sequenzvergleich nach dem Algorithmus von NEEDLEMAN & WUNSCH (1970) zur Sequenz

von prnA durchgeführt. Für das 520 bp-Fragment aus M13mp18 (F 1) wurde eine Homologie

von 77,5 % ermittelt. Das Ergebnis ist in Abb. 29 zu sehen.

prnA 1051 AGGCGGACCTGTTCATCGACTGCTCCGGCATGCGGGGGCTCCTGATCAAT II III IIIIIIIIIIIIII I II IIIII IIIIIIIIF 1 1 .......ACTCTTCGTCGACTGCTCCGGCTTCCGCGGGCTGCTGATCAAC

prnA 1101 CAGGCGCTGAAGGAACCCTTCATCGACATGTCCGACTACCTGCTGTGCGA IIII II IIII II IIIIIIIIIIII IIII IIII IIIIII IF 1 44 AAGGCCATGGAGGAGCCGTTCATCGACATGAGCGACCACCTCCTGTGCAA

prnA 1151 CAGCGCGGTCGCCAGCGCCGTGCCCAACGACGACGCGCGCGATGGGGTCG IIIIIIIIIIIIII IIIII II IIIIIIIII I I II IIIIF 1 94 CAGCGCGGTCGCCACGGCCGTACCGCACGACGACGAGAAGAACGGTGTCG

prnA 1201 AGCCGTACACCTCCTCGATCGCCATGAACTCGGGATGGACCTGGAAGATT IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII II III I IIIIIIIIIIIF 1 144 AGCCGTACACCTCCTCGATCGCATGGAGGCCGG TGGCCTGGAAGATT

prnA 1251 CCGATGCTGGGCCGGTTCGGCAGCGGCTACGTCTTCTCGAGCCATTTCAC I IIIIIIIIIII I IF 1 191 C ATGCTGGGCCGTTGGAGGGTTA.........................

Abb. 29: Vergleich der Sequenz 1 des 520 bp-Fragments in M13mp18 mit prnA

Ergebnisse - 62 –

Weiterhin wurde ein Aminosäuresequenzvergleich mit diesem Fragment durchgeführt. Dabeiwurde eine Homologie von 78 % ermittelt. Das Ergebnis des Vergleichs ist in Abb. 30dargestellt.

prnA 1059 CTGTTCATCGACTGCTCCGGCATGCGGGGGCTCCTGATCAATCAGGCGCTG IIIIII:::IIIIIIIIIIII IIIIIIIIIIIIIIIIII:::III:::F 1 1 LeuPheValAspCysSerGlyPheArgGlyLeuLeuIleAsnLysAlaMet

prnA 1111 AAGGAACCCTTCATCGACATGTCCGACTACCTGCTGTGCGACAGCGCGGTC ...IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII:::IIIIIIIII...IIIIIIIIIF 1 18 GluGluProPheIleAspMetSerAspHisLeuLeuCysAsnSerAlaVal

prnA 1162 GCCAGCGCCGTGCCCAACGACGACGCGCGCGATGGGGTCGAGCCGTACACC III...IIIIIIIII...IIIIII :::...IIIIIIIIIIIIIIIIIIF 1 35 AlaThrAlaValProHisAspAspGluLysAsnGlyValGluProTyrThr

prnA 1213 TCCTCGATCGCCATGAACTCGGGATGGACCTGGAAGATTCCGATGCTGGG IIIIIIIIIIII IIIIIIIII IIIIIIF 1 52 SerSerIleAlaTrpArgPro...ValAlaTrpLysIle..HisAlaGly

prnA 1263 CCGGTT 1268 III...F 1 67 ProLeu 68

Abb. 30: Vergleich der Aminosäuresequenz von Fragment 1 des 520 bp-Fragments in M13mp18 mit prnA

In der ermittelten Sequenz konnte auch eine Bindestelle des PCR-Primers trpst1+ gefundenwerden. Diese liegt zwischen Nucleotid 162 und 192.

Bam HItrpst1+ TATCGGATCCGGCTGGACCTGGAAGATTCC I I IIIIIIIIIIIIF 1 162 ...CGCATGGAGGCCGGTGGCCTGGAAGATTCA... 192

Abb. 31: Bindestelle für den PCR-Primer trpst1+

Der Sequenzvergleich auf Nucleotidbasis des 520 bp-Fragments in M13mp19 (F 2) erbrachteeine Homologie von 65,5 % gegenüber der Nucleotidsequenz von prnA. Der Vergleich ist inAbb. 32 dargestellt.

Ergebnisse - 63 –

ACAATCAGCCGCTCAACCAGATCAAGTTCCGGGTCGGGCGCAACAAGCGG 1400 prnA I I I I II II I IIIIII IIIIII II....GTACAACACCGAGTTAACCACGTCCTCGGTCGGCCGCAACCGCAGG 162 F 2

GCGTGGGTCAACAACTGCGTCTCGATCGGGCTGTCGTCGTGCTTTCTGGA 1450 prnAII IIIII IIIIIIIIII IIII II IIIIIIIIII IIIIGCCTGGGTGCGCAACTGCGTCAGCGTCGGCCTCGCGTCGTGCTTCGTGGA 112 F 2

GCCCCTGGAATCGACGGGGATCTACTTCATCTACGCGGCGCTTTACCAGC 1500 prnA I IIIII II I II IIIIIIIIIIIIIIIIIIII I II II..CGCTGGAGTCCAGCGGCATCTACTTCATCTACGCGGCCATCCACATGC 64 F 2

TCGTGAA.GCACTTCCCCGACACCTCGTTCGACCCGCGGCTGAGCGACGC 1549 prnAI I II IIIIIIIIIIIIII I IIIIII I III IIIIITGGCCAAGGCACTTCCCCGACAAGACCTTCGACAAGGTGCTCGTCGACGG 14 F 2

TTTCAACGCCGAGATCGTCCACATGTTCGACGACTGCCGGGATTTCGTCC 1599 prnAII I IITTCAACCGGGAGA..................................... 1 F 2

Abb. 32: Vergleich der Nucleotidsequenz von Fragment 2 des 520 bp-Fragments in M13mp19 mit prnA

In der ermittelten Sequenz des 520 bp-Fragments in M13mp19 (F 2) konnte eine zweiteBindestelle für den PCR-Primer trpst1- ermittelt werden. Diese liegt zwischen Nucleotid 75und 91.

Kpn I_trpst1- AGTTGGTACCGCGCCGCGTAGAGGAAGGTA II II IIIIIIIIII IIIIF 2 62 ...AGCATGTGGATGGCCGCGTAGATGAAGTAG... 90

Abb. 33: Bindestelle für den PCR-Primer trpst1-

Diskussion - 64 -

6 Diskussion

Bei den Hybridisierungsversuchen von Gesamt-DNA aus Streptomyces albogriseolus mitprnA aus Pseudomonas fluorescens als Sonde detektierte man bei Hybridisierungs- undStringenzbedingungen für 70 % Homologie ein spezifisches Signal. Damit bestätigte sich dieAnnahme, daß ein Zusammenhang zwischen analogen Strukturen und den Enzymen derBiosynthese, welche die Strukturbildungen katalysieren, besteht. Hat man also Metabolite, diein ihren Strukturen signifikante Analogien aufweisen, so besteht die Möglichkeit mit demBiosynthesegen des einen Metaboliten das entsprechende Gen des anderen zu detektieren.Die Methode ist vom zeitlichen und arbeitstechnischen Aufwand sehr effizient.Bezieht man in diese Betrachtungen noch die Ergebnisse der durchgeführten PCR mit ein, beider Oligonucleotidprimer zum Einsatz kamen, die aus Konsensusbereichen unterschiedlicherHalogenasegene abgeleitet waren und auf Grund der codon usage in verschiedenenMikroorganismen als degenerierte Primer synthetisiert wurden (TÖLZER, persönlicheMitteilung), so läßt sich feststellen, daß sich bei der Suche nach entsprechendenBiosynthesegenen neue Möglichkeiten eröffnen.Vergleicht man Halogenasen mit unterschiedlicher Regioselektivität und unterschiedlichenUrsprungs und findet dabei konservierte Bereiche in allen Nucleotidsequenzen, könnte maneine Universal-Sonde für NADH/FAD-abhängige Halogenasen oder neue PCR-Primerkreieren.Bestätigte sich die Vermutung der Konsensusbereiche durch die gesamte Klasse derHalogenasen nicht, so hätte man aber die Einzelsonden und Primer zur Verfügung, die auchden Einsatz in Hybridisierungs- und PCR-Versuchen fänden, so z.B. bei gleichenRegioselektivitäten.In dieser Arbeit wurden mit den Oligonucleotidprimern trpst1+ (sense) und trpst1- (antisense)und der Gesamt-DNA aus Streptomyces albogriseolus als Template zwei Produkteamplifiziert. Die PCR-Produkte unterscheiden sich in der Größe um ~20 bp. Deshalb istanzunehmen, daß einer der beiden Primer zwei Bindestellen innerhalb des potentiellenHalogenasegens aus der DNA von Streptomyces albogriseolus findet.In den bisher gewonnen Nucleotidsequenzen, konnten aber nur zwei Primerbindestellennachgewiesen werden, die Dritte liegt aller Wahrscheinlichkeit nach im 520 bp-Fragment inM13mp18 (F 1) weiter in 5‘-Richtung, bei ca. 210-230 bp.

Das PCR-Produkt wurde als Sonde für das Screening der angereicherten Genbank verwendet,da die Spezifität dieser Sonde sehr hoch ist. Im Gegensatz dazu hybridisiert die prnA-Sondeunter den zu wählenden Bedingungen mit dem Vektor pUC18 (siehe auch 5.4.).Zu Beginn des Screenings der angereicherten Genbank bediente man sich des Verfahrens derKoloniehybridisierung.

Diskussion - 65 -

Dieses Verfahren ist vom Zeit- und Materialaufwand dem Screening über Plasmidisolierung

vorzuziehen. Es konnte jedoch kein zufriedenstellendes Ergebnis mit dieser Methode erhalten

werden, da die Spezifität trotz des Einsatzes der PCR-Sonde nicht besonders hoch ist. Zum

Beispiel erhält man auch Signale, wenn die Zellreste nicht absolut vollständig entfernt sind.

Desweiteren war die Koloniegröße ein Problem, da bei zu großen Kolonien die Gefahr

bestand, daß diese bei der Denaturierung von der Membran gespült werden und nicht mehr

detektiert werden können. Deshalb wurde das Genbankscreening nach der Methode der

Plasmidisolierung, anschließender Agarosegelelektrophorese, Southern-Blot und

Hybridisierung mit PCR-Sonde fortgesetzt (siehe 4.10.2, 4.12 und 4.19).

Der Einsatz des PCR-Produktes als hochspezifische Sonde hat gezeigt, daß es sogar

ausreichend ist, degenerierte Primer aus konservierten Bereichen von verschiedenen

Halogenasen zur Verfügung zu haben, denn somit kann man sich für jeden Organismus

wieder eine neue spezifische Sonde herstellen.

Die Sequenzierung gestaltete sich nicht sehr effektiv, da man in jede Richtung nur etwa

200 Basen lesen konnte.

Da das Gen innerhalb des ~4,5 kb großen Pae I/Kpn I-Fragments lokalisiert ist und für den

Start schon entsprechende Sequenzen vorliegen, sollte bei der vollständigen Sequenzierung

des potentiellen Halogenasegens die Strategie des sogenannten primer walkings gewählt

werden. Diese Methode ist aus geringerem Zeit- und Arbeitsaufwand der Methode, des

Zusammenfügens einer längeren DNA-Sequenz durch Bestimmung der Basenabfolge von

überlappenden Restriktionsfragmenten vorzuziehen.

In folgenden Arbeiten sollte das Plasmid pHI1536 noch weiter untersucht werden. Ist das

gesamte Gen vollständig sequenziert, soll dieses zur Überexpression gebracht werden. Nach

erfolgreicher heterologer Expression des Gens und anschließender Reinigung des Enzyms

mittels chromatographischer Techniken werden umfassende Untersuchungen zur Protein-

charakterisierung möglich.

Diese Untersuchungen sollen weiteren Aufschluß über den Reaktionsmechanismus und die

Regioselektivität spezifischer Halogenasen ermöglichen.

Zusammenfassung - 66 -

7 Zusammenfassung

Das Ziel der vorliegenden Diplomarbeit bestand darin, mit Hilfe molekulargenetischer

Methoden den Nachweis für ein Halogenasegen im Genom von Streptomyces albogriseolus

zu erbringen. Es wurde Gesamt-DNA aus diesem Mikroorganismus mittels DNA-

Hybridisierungstechnik und Polymerasekettenreaktion untersucht. Dabei sollte eine Sequenz

detektiert werden, die für eine Halogenase codiert, welche in der Biosynthese des

Thienodolins die Chlorierung an der 6-Position des Indolrings katalysieren können. Ein

Halogenasegen wurde aufgrund von Strukturanalogien zwischen Thienodolin und 7-Chlor-

tryptophan, dem ersten halogenierten Metaboliten der Pyrrolnitrinbiosynthese, vermutet.

Nach dem Auffinden eines potentiellen DNA-Bereichs mittels der DNA-Hybridisierungs-

technik wurde dieser kloniert und sequenziert.

Dazu wurde die Gesamt-DNA aus Streptomyces albogriseolus isoliert und mit verschiedenen

Restriktionsenzymen gespalten. Die Hybridisierung der Genomfragmente erfolgte mit prnA

als Sonde. Man fand bei einer Sondenhomologie von 70 % ein Bandenmuster, worauf man

auf komplementäre Bereiche im Genom schließen konnte.

Das Pae I/Kpn I-Fragment, mit einer Größe von ~4,5 kb, wurde zur Klonierung ausgewählt.

Es wurde eine angereicherte Genbank der genomischen DNA im Vektor pUC18 angelegt.

Diese Genbank wurde mit einer PCR-Sonde gescreent. Die Sonde erhielt man durch

Polymerasekettenreaktion mit Gesamt-DNA aus Streptomyces albogriseolus, wobei die

verwendeten Primer von Konsensusbereichen verschiedener Halogenasen abgeleitet wurden

(TÖLZER, persönliche Mitteilung).

Beim Screening fand man in einem Klon ein ~4,5 kb großes Fragment, das mit der PCR-

Sonde bei 90 % Homologie ein Signal gab.

Von diesem Fragment wurde eine partielle Restriktionskarte erstellt, um ein kleineres zur

Sequenzierung geeignetes Fragment zu finden. Ein ~0,52 kb Cfr9 I/Pst I-Fragment wurde in

die Vektoren M13mp18 und M13mp19 subkloniert und anschließend sequenziert.

Die erhaltenen Nucleotidsequenzen zeigen Homologien zu prnA von 77,5 bzw. 65,5 %.

Für das Fragment, welches aus ss-DNA von M13mp18 sequenziert wurde, konnte eine

Aminosäuresequenz ermittelt werden, die eine Homologie von 78 % zu prnA aufweist.

Zusammenfassung - 67 -

Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein potentielles Halogenasegen in Streptomyces

albogriseolus identifiziert werden. Dies läßt vermuten, daß der Chlorierungsschritt in der

Biosynthese des Thienodolins durch ein, der Halogenase PrnA ähnliches Enzym, katalysiert

wird.

Die Arbeit hat weiterhin gezeigt, daß die Möglichkeit besteht, Gene in Mikroorganismen

aufzuspüren, wenn eine geeignete Sonde oder geeignete Primer zur Verfügung stehen.

Diese Vorgehensweise bietet einen großen Vorteil gegenüber der reversen Genetik.

Im Gegensatz zu dieser stellt die verwendete Methode eine sehr gute Möglichkeit dar, viele

Mikroorganismen auf mögliche Halogenasegene zu screenen; man erhält in kurzer Zeit

wichtige Informationen über die Gegenwart halogenierender Enzyme in unterschiedlichen

Spezies.

Mit der Verfügbarkeit der verschiedenen Halogenasen wird es möglich, das Potential an

Spezifität und Selektivität dieser Enzyme, bei Halogenierungsreaktionen in der biotechno-

logischen Anwendung zu nutzen. Pharmazeutika, Herbizide oder Pestizide können durch

enzymatische Katalysen energiesparend und hochspezifisch gewonnen werden; aber auch ein

Spektrum völlig neuer Verbindungen, die durch organische Synthese nicht darstellbar sind,

wird zugänglich sein.

Die kombinatorische Vielfalt dieser neuen Verbindungen mit neuen antibiotischen

Eigenschaften könnte dabei helfen, gegen die Selektion resistenter pathogener

Mikroorganismen wirksam vorzugehen.

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Anhang - XVII -

Anhang

Danksagung

Herrn Prof. Dr. rer. nat. habil. K.-H. van Pée danke ich für die Überlassung des interessantenThemas und die Bereitschaft, jederzeit bei der Lösung von Problemen hilfreich zur Seite zustehen.

Frau Dr. Sabine Tölzer danke ich für die Überlassung der PCR-Primer.

Ina und Susi möchte ich für die Bereitstellung von Literatur, ihrer tatkräftigen undmoralischen Unterstützung im Labor sowie ihrer ständigen Diskussionsbereitschaft herzlichdanken.

Allen Mitarbeitern des Instituts für Biochemie danke ich für das gute Arbeitsklima.

Besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mir durch ihre finanzielle Unterstützung diesesStudium ermöglicht haben.

Der größte Dank schließlich gilt meiner Frau Silke für ihre Liebe, die mir Motivation ist und

Kraft gibt, meine Ziele zu erreichen.

Anhang - XVIII -

Eidesstattliche Erklärung

Ich erkläre, daß ich die unter der Betreuung von Prof. Dr. rer. nat. habil. K.-H. van Pée

durchgeführte, vorliegende Arbeit selbstständig verfaßt habe. Andere als die angegebenen

Hilfsmittel wurden von mir nicht genutzt.

Alle angeführten Zitate wurden kenntlich gemacht.

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Identifizierung und Charakterisierung eines Gens in ...schnerr.net/diplom/diploma2.pdf · Inhaltsverzeichnis - III - 4.15 Dephosphorylierung von DNA 27 4.16 Ligation von DNA 27 4.17