(Aus dem PreuBischen Institut fiir Infcktionskrankheiten ,,l~obert Koch", Berlin. Chemotherapeutische Abtcilung: Gchcimrat F. K. Kleine.)

Immunitiitsversuche mit dem tmnsplantablen Kaninchenepitheliom.

Von W. A. Collier und A. Cohn.

(Eingegangen am 9. Februar 1932.)

Im Verlauf verschiedener Untersuehungen fiber die Biologie des transplantablen, metastasierenden Kaninehenepithelioms haben wir Beobachtungen fiber die Immunit~tsverhEltnisse machen k6nnen, fiber die teilweise schon beriehtet ist (Cohn und Collier). Nunmehr seien weitere Befunde geschildert.

Rein/elctionsversuche.

Ehrlich kam schon frfih bei seinen Versuchen zu dem Schlul~, dal~ bei M~usen, die einen lebhaft wachsenden Tumor aufweisen, eine Superinfektion fiberhaupt nicht oder nut sehr verzSgert angeht. Sp~ter zeigte sieh, dab M~use, bei denen die ursprfingliehe Geschwulst nach mehr oder weniger ausgedehnter Entwieklung zurfiekgebildet war, sich gegen eine Nachinfektion immun verhielten. Allerdings sind auch M~usetumorst~mme bekannt (z. B. Tumor 180), bei denen eine l~einfek- tion fast s te ts angeht. Neuerdings berichteten Hamano, Raposo fiber erfolgreiche Mehrfaehimpfung yon M~usen. Beim Flexner-Jobling- Careinom der l~atte wies Takei bei wiederholter Exstirpation der sich entwiekelnden Tumoren naeh, da~ bei der 1. Impfung 82%, bei der 2. 48,2%, bei der 3. 13,6% und bei der 4. Impfung 0% angingen, dab bier also deutlieh eine Operationsimmunit~t (Uhlenhuth) vorlag.

Analoge l~einfektionsversuche wurden yon uns mit dem Kaninchen- epitheliom durchgeffihrt. Bei der fiblichen intratesticul~ren Impfung des Kaninchens mit dem Kaninehencarcinom kommt es Initunter - - wie bei der M~useimpfung - - zu einem nur vorfibergehenden Angehen der Infektion, indem sich der Tumor etwa bis zur ErbsengrSBe ent- wiekelt und dann sehnell resorbiert wird. Gelegentlich kommt es zur Ausbildung eines etwa haselnui~grol~en Prim~rtumors, der dann wieder verschwindet; andererseits aber kann die Tumorbildung fiberhaupt aus~

42*

642 W. A. Collier und A. Cohn:

bleiben. Derar t ige , ,Nul ler" ha t t en wi t gelegentl ich anderer Versuche,

besonders aber bei e inem solehen, bei dem die Impfung absieht l ich be- sonders schwach erfolgt war.

Ein Kaninehen wurde naeh 116 Tagen reinfiziert und erwies sieh bei der Sektion sparer als v611ig negativ, ebenso ein nach 44 Tagen reinfiziertes Tier.

4 Kaninchen wurden nach 51 Tagen reinfiziert. Von diesen blieben 2 v611ig negativ. Bei einem, das am 29. VI. infiziert und am 18. VIII. 1931 reinfiziert war, beobachtete man am 24. VIII., 31. VIII. und 7. IX. im rechten Hoden einen bohnengroBen, weiehen Tumor, der am 12. IX. haselnuBgroB war. Zugleich ~rat im linken Hoden ein haselnuBgro[~er, weicher Tumor ~uf. Am 16. IX. war nur noch der reehte Tumor, m~Big hurt, vorhanden, nnd vom 22. IX. ab liel] sieh nieht~s Deutliehes mehr erkennen. Bei der Sektion am 29. IX. waren die Hoden sehwaeh gesehwollen, wiesen ~ber keine Tumoren auf. Beim 4. Tier, dos ~m 29. VI. infiziert und am 18. VIII. reinfiziert war, kam es zu keiner Tumorbildung, doch fanden sich bei der am 28. IX. erfolgten Sektion gewaltige NIetastasen- massen im K6rper. Die fiberaus starke Me~astasenbildung lgl]t es abet als sicher erseheinen, dolt diese noch yon der Erstinfektion stammten, da ein der- artiger Verlauf - - starke Metastasenbildung ohne Ausbildung yon Primer- tumaren - - gelegentlich beobachte~ werden karm.

Von 6 Kaninchen, die aln 17. VII. 1931 infiziert und am 19. VIII., also am 34. Tage reinfiziert waren, zeigten 4 einen v611ig negativen Befund. Ein Tier blieb klinisch gesund0 zeigte aber bei der Sektion im Becken eine walnuBgroBe und eine bohnengroBe Metastase, die abet mSglieherweise auch yon der Erstinfektion stammen konnten. Das letzte Tier, dos bei der Reinfektion keinen deutlichen Be- fund im Hoden gezeigt hatte, entwickelte schnell beiderseits stark walnul]grol~e Hodentumoren, die am 29. IX. bei der Sektion doppeltwalnuBgroB waren. Meta- stasen fanden sich hier nieht.

l~berbliekt man diese Befunde, so sieht man, daf~ yon 12 reinf iz ier ten

Kan inehen 8 v611ig eindeut ig i m m u n waren, bei e inem Tier k a m es zur

vor i ibergehenden Tumorb i ldung mi t schneiler Resorpt ion, und bei

2 Tieren fehl te die Tumorb i ldung an der Impfstel le , doch fanden sich

bei der Sekt ion Metastasen im K6rper , die aber sicher yon der Ers t -

infekt ion s t ammten . "Man daf t also wohl annehmen, dab yon 12 Tieren

11 (also 92 %) bei der Reinfekt ion i m m u n waren. Nur ein Tier erwies sich als nicht immun.

Versuche mit kiinstlicher Immunisierung.

H a t t e sieh somit naeh Ri iekbi ldung einer Ers t in fek t ion beim Ka-

n inehen eine deut l ieh ausgesproehene I m m u n i t ~ t gegen eine t~einfek-

t ion gezeigt , so war es nunmehr yon Interesse, festzustellen, ob normale Kan inehen dureh in t raven6se Vorbehandlung mi t n ieh t mehr entwiek-

lungsf~higem Tumorma te r i a l ebenfalls eine I m m u n i t ~ t ausbildeten.

Zu diesem Zweeke wurden Extrakte aus Metastasenmassen des Kaninehen- tumors (mSgliehst frei yon Organzellen) hergestellt. Das Tumorma~eriul wurde fein lzerrieben, mit physiologiseher Koehsalzl6sung in der Verdfinnung 1 : 5 ver- dtinnt und naeh Zusatz yon 0,5proz. Phenol 3 Tage lung im Eissehrank und eben- solunge im Brutschr~nk bei 37 ~ gehalten und dann' durch Glas~volle filtriert.

Immunit~sversuche mit dem ~ransplantablen Kaninchenepitheliom. 643

Mit diesem Material wurden 3 Kaninchen mit steigenden Dosen (0,25--1,0 ccm) im Abstande yon 5--6 Tagen intravenSs behandelt, bis im Ganzen 15,5 ccm ge- geben worden w~ren.

Am 19. XI. wurden die 3 Kaninehen infiziert. Die Kontrollen zeigten eine typische Tumorentwicklung mit Metastasenbildung. Genau ebenso verlief die Infektion bei 2 der vorbehandelten Tiere. Das 3. Tier zeigte eine etwas verz6gerte Tumorentwicklung und wurde am 2. II. getStet. Bei der Sektion fanden sich nur in beiden Hoden haselnul3grol~e Tumoren, abet keine Metastasenbildung.

Es zeigte sieh also bei diesem Versueh, daI~ es selbst durch intensive Vorbehandlung mit Met~stasenmaterial nicht gelingt, normale Ka- ninehen gegen eine sp~tere Infektion mit dem Kaninehenepitheliom zu immunisieren.

Virulicidieversuche.

Unter Virulieidie soll in keiner Weise die AbtStung eines belebten Krebsvirus - - das ja bisher nieht erwiesen ist - - , sondern nur die Auf- hebung der Vermehrungsf~higkeit des t r a n s p l a n t a b l e n Tumorzell- materials verstanden werden, wobei es unentschieden bleiben soil, ob es sich um eine reine Cytolyse handelt oder nicht.

Die bisherigen Versuche, dutch Vorbehandlung mit Geschwulstzellen ein Serum zu gewinnen, das bei der Mischung mit Tumorzellmaterial diesem die Infektiositgt fiir die empfgngliche Tierspecies nimmt, haben keine eindeutigen Resultate ergeben. Wghrend beispielsweise v. Eisler und Silberstein ein wirkungsvolles Antiserum herstellten, kamen Yama- giwa und Kimura zu negativen Ergebnissen. Man n immt jetzt an, dab heterologe Antiseren, die bei der Immunisierung yon Schafen oder Kaninchen mit Rat ten- oder Mgusetumoren entstehen, AntikOrper gegen die Zellen des malignen Gewebes enthalten. Daneben finden sich aber in jedem Fa]l AntikOrper gegen die Mguse-Ratten-Gruppe. Da aber unter anderem nach Kohn-Speyer bei derartigen Antiseren der , ,Antimalignitgtsfaktor" den ,,Antispeciesfaktor" durch erhebliche Thermolabilitgt iibertrifft, ist es kaum mSglieh, vom Antispeciesfakt0r freie Antiseren herzustellen.

Es konnten also bisher keine rein careinolytisch wirkenden Seren hergestellt werden, wenn man yon der ,,Euglobulin-Fraktion" Lumsdens absieht, in der die Heterotoxine weitgehendst zerstOrt sein sollen. Da aber die Carcinomzel]e trotz morphologischer und biologiseher Unter- sehiede gegeniiber der normalen Specieszelle doch nicht ihre Artspezifitgt ver]oren hat, so ist bei allen diesbezfigliehen Virulicidieversuchen die Entseheidung sehwierig, in welchem Umfange der Antimalignitgtsfaktor und der Antispeeiesfaktor fiir die AbtOtung der Tumorzellen verantwort- lich zu m a e h e n ist.

Diese Sehwierigkeit war bei unseren Versuehen mit dem Kaninchen- epitheliom insofern aufgehoben, als bei der Immunisierung des Kanin- ehens mit Kaninehencareinomgewebe ein Serum gewonnen werden

64~ W.A. Collier und /~. Cohn:

konnte , das, abgesehen yon Isolys inen, frei vom ~n t i spec i e s f ak to r w~r und al lenfalls den An t ima l ign i t~ t s f ak to r en tha l t en mul~te.

Wi r un te r such ten zun~ehst die Fr~ge, ob sieh bei solchen Tieren, deren pr im~rer H o d e n t u m o r exs t i rp ie r t war und die a m Leben ge- b] ieben waren, ein An t ima l ign i t~ t s f ak to r im Serum oder in Organen naehweisen liel~, u m d a n n sparer k i ins t l ich immuni s i e r t e Tiere fiir d ie Versuehe heranzuziehen .

Ein Kaninehen, des einseitig intratesticul~ir infiziert, war und dessen Tumor am 3. V. 1930 exstirpiert worden war, wurde am 15. VIII. getStet. Von dem Blur wurde das Serum durch Zentrifugieren gewonnen, auBerdem wurde yon der Milz und yon dem 2. Hoden ein feiner Brei hergestellt. Des Serum und die beiden Organbreie wurden mit ~risehem Tumortriturat vermischt und ll/2 Stunde in den Thermostaten bei 37 o gebraeh~. Als Kontrolle diente Tumorbrei mit physio- logiseher KochsalzlSsung. ~ach der angegebenen Zeit wurden die Gemische je 3 Kaninchen intratestieul~r eingespritzt. Des Gemisch mit Milz und ttoden und die Kochsalzkontrolle wurde aulterdem je einem Tier intrakrani~l injiziert.

Es zeigte sich bei den mit den Gemischen geimpf~en Tieren ganz allgemein eine gewisse Absehw~ehung des Infektionsmaterials, die aber bei den Kontrollen ebenso zu beobaehten war. Es kam in der Regel zur Ausbildung der typisehen prim~ren Hodentumoren, doch war die Metastasenbildung nieht so stark, wie gewShnlich beobaeh~et werden konn~e. Diese Absehwaehung ist zweifellos auf den Brutsehrankaufenthalt zuriickzuf/ihren, denn bei einer Wiederholung des Versuehes, bei dem die Bindung der Gemisehe 2 S~unden bei 37 ~ vorgenommen wurde, war des gauze Verimpfungsmaterial abgestorben, aueh die .Kontrollen gingen nicht an. Die bei dem 1. Versuch intrakranial geimpften Tiere starben in typische r Weise unter Gehirnerscheinungen an der Infektion.

Es zeigte sich ~lso, dal~ selbst bei e iner wei tgehenden Seh~digung des Ver impfungsmate r ia ] s infolge ungeeigneter T e m p e r a t u r e n dureh des Serum, durch Milzbrei und durch t t o d e n b r e i eines nach e inmal igner In fek t ion immunen Tieres keiner le i Beeinflussung der In fek t ios i t~ t zu erzielen is~. Des naeh einer frf iheren Infek~ion immune K a n i n e h e n weist also keine oder n ieh t geni igende v i ru l ie iden Kr~f te (Ant imal igni- t~ t s fak tor ) in se inem Serum oder im Milz- oder Hodengewebe auf.

N u n m e h r ve r such ten wir, gesunde Tiere dureh wiederhol te in t ra - venSse I n j e k t i o n yon T u m 0 r m a t e r i a l zu immunis ie ren .

Zwei Kaninehen erhielten im Abstand yon 5--6 Tagen steigende Dosen einer aus Me~,astasenmaterial in oben angegebener Weise hergestellten KoehsMzsuspen- sion l :5 bis zur Gesamtmenge yon 5,5 und 6,5 ecru intravenSs injiziert. Am 4. VII. 1931 wurde den Tieren Blur, en~nommen. Des Serum wurde mit frisehem Tumorbrei versetzt und zur Vermeidung der W~rmeseh~digung bei et.wa 4 ~ ~m Eissehrank in Kontakt belassen. Als Kontrolle diente KochsalzlSsung. Dann wurde ~edes Gemiseh auf 2 Kaninehen intratestieul~r verimpft.

Die m i t d iesem Mater ia l inf iz ier ten K a n i n c h e n e r k r a n k t e n in gleicher Weise wie die Kon t ro l l t i e re t yp i sch a m Kan inchenk rebs . Es waren also durch die angegebene Vorbehand lung keine v i ru l ie iden Kr~f te (Anti- mal ign i t~ t s fak to r ) aufget re ten . Es wurde ~lso nunme hr die I m m u n i - s ierungsdosis gesteiger~.

Immunit~tsversuehe mit dem transplantablen Kaninehenepitheliom. 645

Drei Kaninchen wurden mit der aus Metastasenmassen hergestellten Tumor- suspension im Abstand yon 4--5--6 Tagen intraven6s behandelt, bis die Gesamt- menge der injizierten Suspension 15,5 cem betrug. Am 13. X. wurde den Tieren Blur entnommen. Das Serum wurde mit ~risehem Tumorbrei gemischt, wobei wieder KoehsalzlSsung als Kontrolle diente. Die Gemische wurden 2 Stunden fang im Eisschrank bei etwa 4 ~ in Kontakt belassen und dann auf Kaninchen intra- tes~icul~r verimpft.

Aueh die mi t diesem Material infizierten Kaninehen entwickelten ebenso wie die Kontrol len eine typische Krebsinfektion. Selbst nach einer so intensiven Vorbehand]ung zeigte sieh also nieht das Auft re ten virulicider Kr~fte (Antimalignit~tsfaktor).

Es geht somit aus diesen Versuehen hervor, dal~ man beim Kaninchen dutch Immunis ierung mit Kaninchenkrebsmater ia l nicht virulicide Kr~fte oder den Antimaligniti~tsfaktor gegen den Kaninchenkrebs er- zeugen kann. Es liegt daher die Vermutung n~he, dab in vielen F~llen positiver Virulicidieversuche mi t heterologen Antiseren - - abgesehen yon Versuehen mit Gewebekulturen - - der hypothet isehe Antimaligni- t~tsfaktor eine relat iv geringe und dafiir der Antispeciesfaktor eine grol~e, wenn nicht die einzige Rolle gespielt haben dfirfte.

Zusammen/assung.

Kaninehen, die nach einmaliger Infekt ion mi t dem metastasierenden Kaninchenepi thel iom gesund geworden sind, erweisen sieh in 92 % der Fi~lle einer Reinfekt ion gegenfiber als immun.

Durch In jek t ionen yon Tumormater ia l gelingt es nicht, normale Ka- n inehen gegen das Epithel iom zu immunisieren.

Durch In jek t ionen yon Tumormater ia l gelingt es nicht, im Serum der behandel ten Kaninchen virulieide K_r~fte gegen das Kaninchen- epitheliom ents tehen zu lassen. Die Rolle des hypothe t i sehen Anti- malignit~tsfaktors bei heterologen Antiseren wird hierdurch ffagwiirdig.

Literaturverzeichnis. Cohn, A., u. W. A~ ColhYr, Z. Immun.forsehg, im Druck, 1932. - - Ehrlich, P.,

Arb. Inst. exper. Ther. Franlrf. 2 ( 1 9 0 6 ) . - v. Eisler, M., u. F. Silberstein, Zbl. Bakter. I Orig. 81, 269 (1918). - - Hamono, J., Trans. jap. path. Soc. 20, 630 (1930). - - Kohn-Speyer, A. C., Lancet 192~(, 377. - - Raposo, S. L., C. r. Soc. Biol. Paris 105, 158 (1930). - - Takei, T., Trans. jap. path. Soc. 20, 634 (1930) . - Yamagiwa, K., u. T. Kimura, Gann (jap.) 16, 1 (1922).