312 Bericht: Spezielle analytische Methoden

Da iibliche l~iirbemethoden bei tier papierelektrophoretischen Serumprotein- bestimmung bei Gegenwart yon Fettemulsionen quantitativ nieht auswertbare Pherogramme liefern, haben K. 5I. FORMOSA, I~. I~. B;~E~ITO, W. S. SINOLETO_N und J. L. WroTE 1 folgende Nethode ausgearbeitet: Zungchst wird der 50 • 5 em grofle Whatman 3MM-Papierstreffen horizontal in der Anordnung naeh E.L. D v ~ u ~ 2 mit VeronalpufferlSsung yon p~8,6 (Ionenstgrke 0,05) 3 S~d ~qui- libriert. Zentral werden dalm 10--40#1 der Probe aufgegeben und 16--18 Std bei 25 ~ C mit 350 V in Heliumatmosphgre elektrolysiert. Der S~reifen wird 20 rain bei l10~176 getroeknet und 10 rain bei 70~ mi~ Bromphenolblaul6sung gef/irbt, die 1 g in 1 Liter 95~ ~thylalkohol enthglt, mit Sublimat gesgttigt und mit 5 ml Eisessig versetzt ist. AnsehlieBend wird 3real je 10 min in einer LOsung gewasehen, die 80 g wasserfreies Natriumaeetalb und 400 ml Eisessig je 4 1 enthM~. Der Untergrund wird dann farblos. Es wird 5 rain im Ofen getrocknet, mit Ammoniak bedgmpft und sehlieBlieh vollstgndig getroeknet (10 min). Zur Analyse wird der Streifen dureh Eintauehen in die LSsung yon 200 ml Xylol in 1 Liter ParafflnSI und 500 ml e-Bromnaphthalin, die mit 17 g Span-80-Emulgator versetzt ist, transparent gemaeht. Man lggt das Xylol verdunsten (20 min) und photometriert im Zweistrahl-Photometer (Analytrol R). Die an reinem Albumin, y-Globulin, an Serum und an vorfraktionierten Serumproben ausgeftihrten Test- analysen unter diesen standardisierten Bedingungen zeigen, dab die Farbstoff- aufnahme unabhgngig yon der Proteinart der Konzentration des Proteinstiekstoffs proportional ist. Auch zwisehen Absorption und Proteinstiekstoff besteht Propor- tionalitg~, sogar iiber einen gegeniiber bisherigen Methoden erweiterten Bereieh. Die Vortefle der einzelnen MaBnahmen werden ausfiihrlieh erSrtert.

Analyt. Chemistry ~9, 1816--1820 (1957). Dep. Agricult., New Orleans, La. (USA). - - ~ J. Amer. chem. Soc. 72, 2943 (1950); siehe aueh C~EME~, H. D., u. A. TrSEL~trS: Bioehem. Z. 8~0, 273 (1950); vgl. diese Z. 140, 294 (1953).

K. C~SE

In Versuehen zur Papierelektrophorese yon Serumprotelnen haben P. G. Mo> ~AT und E. F. TULLE~ 1 besonders auf den Einflug -con Temperatur und Span- nungsabfM1 hingewiesen. Gearbeitet wird am horizontal und frei hgngenden Streifen,

entsprechend Abb. 1, der t" z7

Eielrh,ode I I [le,~/p, ade

N E - Y - - - ~ [ ~ _ J u , , s / ~ / o r p ~ @ - - - - - ~ N- --~--JN aurlzye N L - J - - ~ I.,\\\\\\\\\\" .\\\\~.\\" ..\'..I ~,~,>~NNx" .\\',.\\\\'%x," .%" .,\ ,xl

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PufFePl~'sunff j

Abb. 1. Elektrophoresezelle fiir horizontM und frei hgngende Streifen nach lV[OINAT and TULZE~

15 Std bei 4 ~ C elektrolysiert wird and der in Veronal- Aee~at-PufferlSsung yore p~-Wer~ 8,6 (Ionenstiirke 0,1) taucht. 5--6 #l Serum werden als Querstreifen i n 2,5 em Abstand yon der

I Kathode (zur Vermeidung elektroosmotischer Effekte) aufgegeben. Der 4 Std bei Raumtemperatur getroek- nete Streifen wird 10 min

mit Amidosehw~rz t0B (400 ml Methanol + 50 ml Eisessig + 5 g Amido- schwarz zum Sieden erbitzt, warm filtriert, am folgenden Tag wiederum filtriert) gef~rbt und mit Phenol-Eisessig-Wasser-Mischung (100 g Phenol, 300 ml Eisessig, 3 1 Wasser) etwa 1,5--4 Std mehrfach gewaschen. Der mit a-Brom- naphthMin in 01 (1 : 5) getrgnkte Streifen wird densitometriseh bei 600 m# ausgewertet. - - Aus vergleichenden Messungen in versehiedenen Gergten ergibt sieh, dab die Trennung sogar unabh~ngig yon der Wahl der Papiersorte gleiehmgBig gut

4. Analyse yon biologischem Material 313

gelingt, werm mit konstantem Sparmungsgefglle elektrotysier~ wird, das abet un- bedingt zwischen den Punkten C und D in Abb. 1 gemessen werden muB (4,9 V/cm), damit Fehler vermieden werden, die durch Unterschiede der verwendeten Elektro- phoresekammern oder Streifenl~ngen auftreten kSnnen. R%chdriicklich wird fest- gestellt, dab die Angabe der verwendeten Gesamtspannung fiir die l~eproduzier- barkei~ der Versuche nicht ausreicht. Empfohlen wird auch die Naehpriifung des Spannungsabfalls C- -D wahrend der Elektrolyse, um notwendige Xorrekturen vornehmen zu kSnnen. Die Angabe der Stromsti~rke Ms BezugsgrS~e ftir die Re- produzierbarkeit yon Messungen wird verworfen. Eindrucksvoll sind weitere Ver- suche, an denen gezeigt wird, dab gquivalente Trennungen auch bei verschiedenen Temperaturen erhalten werden, wenn z. B. bei 4 ~ C mit 4,9 V/cm, bei 26 ~ C aber ant mit 2,2 V/cm elektrolysiert w/rd. Da die Zonen bei 37 ~ C stgrker verwaschen sind, sollte besser grundsgtzlich bei tieferen Temperatm'en getrennt werden.

Analyt. Chemistry 29, 1655--1658 (1957). New England Deaconess Hosp., Boston, Mass. (USA). K. CRVSE

Eine neue immuno-elektrophoretische Technik hat J. ](ottR ~1 angegeben. Sie lehnt sieh an die Methode yon P. G~_~BAR und C. A. WILLIAMS ~ an und besteht in einer Kombination der Celluloseacetat-Membranfilter-Elektrophorese a und der Agar-l~Iethode, ist besonders vorteilhaft zur Abtrennung der u~-Fraktion und ver- langt nur geringe Mengen Anti-Serum. Verwendet werden nach GR_4~An und WILLI• z gepufferte 2~ mm dieke Agarpla~ten (18• cm), auf entsprechenden Glasplatten gegossen, und mit unterlegter Planskizze naeh Abb. 2. Zun~ichst wird eine Elektrophorese des Serums anf 5 cm breiten l~embran- filters~reifen (Oxo Ltd., London) ausgefiihrt. Der feuehte Streifen wird der Lange nach halbiert und eine I-I~lfte sofort entsl0rechend Abb. 2 auf die Agarplatte auf- gelegt, aueh dermit 0,2--0,3 ml An tiserum versehene schmale Strei- fen, dessen Abstand (0,8 cm) sich

1 2,5 c~ Analyse-Stpeif'en

Iae lot5 AnlisePum-#tPelflen

I 2, s-cm YePglel"chs-Steeffen

7b' CT~

Abb..9 Anordnmlg zur Immuno-Elektrophorese n~ch KOHN

nach der QuMitat des Antiserums richtet. Die zweite S~reifenhMf~e wird ge~rocknet nnd gef~rbt und dient zur Indieierung der Zonen, die in der Agarp]atte nach I--4 Tagen als F~llung entstehen, wenn Serumproteine und Antiserum sich durch Dif- fusion begegnen, l~aeh Entfernen der Streifen wird mit einem passenden Blatt ab- gedeckt und bei 37 ~ C getrocknet. Die Agarfolie kann dann auf der Glasplatte 34 Std in 2% iger Essigs/iure fixiert werden. Dann wird mit 0,05% iger L6sung yon Azocarmin ]~ in 2% iger Essigsiiure oder mit MASSON'S Ponceau-Fuchsinfarb- 16sung (i : 4 mi~ 2% iger Essigs~ure in 20% igem Alkohol verdiinn~) gef~rbt (4 bis 6 Std). Mit 10% igem Glycerin in 2% iger Essigs~iure wh'd 30 rain naehbehandelt und schlieBlieh bei 37 ~ C getrocknet, l~ach dieser mit geringen Verbesserungen nach der Methode yon J. UmEL und P. G~ABAn 4 durchgefiihrten Farbung werden im Untergrund v611ig k]are ]~ilder erhalten.

i l~ature (London) 189, 986--987 (1957). Queen Mary'sHospital, London (Eng- land). -- e Bioehim. biophysica Acta (Amsterdam) 17, 67 (1955). -- 3 Kelly, J. Biochemie. J. 65/I, 9 (1957); Clin. chim. Aeta 2/4, 297 (1957). -- 4 Arm. Inst. Pasteur 90, 427 (1956). K. CRVSE