In vivo Analyse der oralen Infektion mit biolumineszenten ... · FAE Follikel-assoziiertes Epithel Fd Kapazität (µFD) FKS Fötales Kälberserum (fetal calf serum) FbpA Eisenbindendes

Abteilung für Infektionsgenetik

Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, Braunschweig

und

Tierärztliche Hochschule Hannover

In vivo Analyse der oralen Infektion mit biolumineszenten

Listeria monocytogenes im Mausmodell

INAUGURAL – DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Naturwissenschaften

-Doctor rerum naturalium-

(Dr. rer. nat.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

von

Dipl. Biol. Silke Bergmann

aus Hohenmölsen

Hannover 2012

Wissenschaftliche Betreuung:

Prof. Dr. Klaus Schughart Abteilung für Infektionsgenetik Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, Braunschweig und Tierärztliche Hochschule Hannover Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand Institut für Mikrobiologie Tierärztliche Hochschule Hannover PD Dr. Eva Medina Abteilung für Infektionsimmunologie Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, Braunschweig PD Dr. Andreas Lengeling The Roslin Institute and Royal (Dick) School of Veterinary Studies, Universität Edinburgh, Großbritannien

1. Gutachter: Prof. Dr. Klaus Schughart

2. Gutachter: PD Dr. Andreas Lengeling

mündliche Prüfung (Disputation) am: 05.11.2012

Inhaltsverzeichnis

i

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis .............................................................................................................. i

Abkürzungsverzeichnis ...................................................................................................... vi

Tabellenverzeichnis .......................................................................................................... xi

Abbildungsverzeichnis ..................................................................................................... xii

Zusammenfassung ........................................................................................................... xv

Summary ....................................................................................................................... xvii

1 Einleitung .................................................................................................................. 1

1.1 Morphologie und Physiologie der Gattung Listeria ................................................ 1

1.2 Epidemiologie von Listeria monocytogenes ........................................................... 2

1.3 Humane Listeriose ................................................................................................ 4

1.4 Listeriose in domestizierten Tieren ....................................................................... 7

1.5 Wirtsspezifität und Wirtsinvasion ......................................................................... 9

1.5.1 Invasionsproteine und Speziesspezifität ............................................................................................. 9

1.5.2 Wirtsinvasion und intrazelluläre Lebensweise .................................................................................. 12

1.5.3 Überquerung epithelialer Barrieren im Wirt .................................................................................... 15

1.5.4 Grundlegende Mechanismen der Immunabwehr von Listeria monocytogenes ............................... 18

1.6 Studien der in vivo Infektion ................................................................................21

1.6.1 Tiermodelle zur Analyse listerialer Infektionsmechanismen ............................................................ 21

1.6.2 Mausmodelle zur Analyse listerialer Infektionsmechanismen ......................................................... 22

1.7 In vivo Imaging ....................................................................................................24

1.7.1 Das Prinzip der Biolumineszenz ........................................................................................................ 24

1.7.2 Die Technologie des in vivo Imaging ................................................................................................ 25

1.7.3 In vivo Imaging von Listeria monocytogenes Infektionen in der Maus ............................................. 26

1.8 Konzept und Fragestellung der vorliegenden Dissertation ....................................28

Inhaltsverzeichnis

ii

2 Ergebnisse ................................................................................................................31

2.1 Murinisierung der Listerienstämme Listeria monocytogenes 10403S Xen32

und LO28 .............................................................................................................31

2.1.1 Ergebnisse der Transformation ......................................................................................................... 32

2.1.2 Validierung der homologen Rekombination des murinisierten Internalin A .................................... 33

2.1.3 Analysen der Internalin A und Internalin B Expression in genetisch modifizierten

Listerienstämmen ............................................................................................................................. 35

2.1.4 Analyse der murinisierten Listerienstämme im Invasions-Assay ...................................................... 38

2.2 Vergleich der Wirtsspezifität und Virulenz des genetisch modifizierten

LmoXen32-mur mit dessen Wildtyp .....................................................................41

2.2.1 Überlebenszeiten nach der Infektion mit LmoXen32 und LmoXen32-mur in ausgewählten

Mausinzuchtstämmen....................................................................................................................... 41

2.2.2 Kinetik der in vivo Replikation von LmoXen32 und LmoXen32-mur in BALB/cJ Mäusen .................. 44

2.2.2.1 In vivo Imaging von LmoXen32 und LmoXen32-mur infizierten BALB/cJ Mäusen ..................... 45

2.2.2.2 Kinetik der bakteriellen Keimlast in den inneren Organen von LmoXen32 und

LmoXen32-mur infizierten BALB/cJ Mäusen .............................................................................. 48

2.2.2.3 Histopathologische Analyse von LmoXen32 und LmoXen32-mur infizierten BALB/cJ

Mäusen ....................................................................................................................................... 50

2.3 Vergleich der Wirtsspezifität und Virulenz des genetisch modifizierten

LmoEGDe-lux-mur mit dessen Wildtyp .................................................................52

2.3.1 Analyse der Stämme LmoEGDe-lux und LmoEGDe-lux-mur auf die Proteinexpression von

Internalin A und Internalin B sowie die Untersuchung der Invasionsrate in humanen und

murinen Colonkarzinom-Zellen. ........................................................................................................ 53

2.3.2 Charakterisierung und Vergleich der Virulenz verschiedener LmoEGDe Stämme in BALB/cJ

Mäusen ............................................................................................................................................. 55

2.3.3 Vergleich der Wirtsresistenz in ausgewählten Mausinzuchtstämmen nach der Infektion mit

LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux ............................................................................................... 61

2.3.4 Kinetik der in vivo Replikation von LmoEGDe-lux und LmoEGDe-lux-mur in ausgewählten

Mausinzuchtstämmen....................................................................................................................... 69

2.3.4.1 In vivo Imaging von LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux infizierten

Mausinzuchtstämmen ................................................................................................................ 69

2.3.4.2 Kinetik der bakteriellen Keimlast in den inneren Organen von LmoEGDe-lux und

LmoEGDe-lux-mur infizierten Mausinzuchtstämmen ................................................................ 73

Inhaltsverzeichnis

iii

2.3.4.3 Histopathologische Analyse von LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux infizierten

Mausinzuchtstämmen ................................................................................................................ 81

2.3.4.4 Analyse der Chemokin-Zytokin-Produktion von LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux

infizierten Mausinzuchtstämmen ............................................................................................... 82

2.4 Vergleich der Wirtsspezifität und Wirtsresistenz der Listerienstämme

LmoXen32-mur und LmoEGDe-mur-lux ................................................................85

2.5 Korrelation der bakteriellen Keimlast mit Biolumineszenzsignalen in den

inneren Organen von LmoXen32 und LmoXen32-mur infizierten

Mausinzuchtstämmen im Vergleich zu LmoEGDe-lux und LmoEGDe-lux-mur

infizierten Mausinzuchtstämmen .........................................................................86

2.6 Infektion des zentralen Nervensystems nach der Infektion mit LmoXen32,

LmoXen32-mur, LmoEGDe, LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux .........................89

2.7 Interferonproduktion und Listerieninfektion ........................................................91

2.7.1 Charakterisierung des Einflusses der Interferoninduktion auf die Listerieninfektion ...................... 91

2.7.2 Charakterisierung der Listerieninfektion in Bezug auf die Interferon-β Produktion ........................ 94

3 Diskussion.................................................................................................................97

3.1 Der Infektionsverlauf nach einer Listerieninfektion ist von der Virulenz des

Listeriensubtypes abhängig ..................................................................................98

3.2 Die Murinisierung des Internalin A resultiert in einem invasiveren

Krankheitsverlauf .............................................................................................. 102

3.3 Der Infektionsverlauf nach einer Listerieninfektion ist abhängig vom

genetischen Hintergrund des Wirtes .................................................................. 108

3.4 Infektion des zentralen Nervensystems zeigt keine Reproduzierbarkeit und

ist nicht von der Murinisierung des Internalin A abhängig .................................. 117

3.5 Die Detektion des Biolumineszenzsignals in Abhängigkeit verschiedener

Faktoren ............................................................................................................ 121

Inhaltsverzeichnis

iv

3.6 Reaktionen des angeborenen Immunsystems auf die Infektion mit Listeria

monocytogenes ................................................................................................. 124

4 Ausblick .................................................................................................................. 128

5 Material und Methoden .......................................................................................... 130

5.1 Generierung genetisch veränderter Listeria monocytogenes Stämme ................. 130

5.1.1 Generierung elektrokompetenter Listerien .................................................................................... 130

5.1.2 Transformation und Selektion rekombinanter Listeria monocytogenes Stämme .......................... 131

5.2 Molekularbiologische Methoden ....................................................................... 134

5.2.1 Präparation von Plasmid-DNA ........................................................................................................ 134

5.2.2 Präparation genomischer bakterieller DNA .................................................................................... 134

5.2.3 PCR .................................................................................................................................................. 134

5.2.4 Gelelektrische Auftrennung von DNA-Fragmenten ........................................................................ 136

5.2.5 Sequenzierung ................................................................................................................................ 136

5.2.6 Proteinpräparation und Western-Blot-Analyse .............................................................................. 137

5.2.6.1 Proteinextraktion...................................................................................................................... 137

5.2.6.2 Western-Blot-Analyse ............................................................................................................... 138

5.3 Invasions-Assay ................................................................................................. 141

5.4 In vivo Mausinfektionsexperimente ................................................................... 142

5.4.1 Kultivierung und Präparation von Listeria monocytogenes ............................................................ 143

5.4.2 Orale Infektion ................................................................................................................................ 144

5.4.3 Intravenöse Infektion ...................................................................................................................... 145

5.4.4 Biolumineszenz-Imaging ................................................................................................................. 145

5.4.4.1 In vivo Detektion der bakteriellen Luziferase ........................................................................... 146

5.4.4.2 Ex vivo Detektion der bakteriellen Luziferase .......................................................................... 147

5.4.4.3 Detektion der IFN-β-Produktion ............................................................................................... 147

5.4.5 Bestimmung der bakteriellen Keimlast ........................................................................................... 148

5.5 Luminex-Assay................................................................................................... 148

5.6 Histologische und immunhistologische Färbung ................................................. 149

5.7 Statistische Auswertung .................................................................................... 150

Inhaltsverzeichnis

v

6 Literaturverzeichnis ................................................................................................ 151

7 Eidesstattliche Erklärung ......................................................................................... 174

8 Danksagung ............................................................................................................ 175

Abkürzungsverzeichnis

vi


A Adenin

ActA Aktin-bindendes Protein A

ADI Arginindeiminase

AS Aminosäure

A Ala Alanin C Cys Cystein D Asp Aspartat E Glu Glutamat F Phe Phenylalanin G Gly Glycin H His Histidin I Ile Isoleucin K Lys Lysin L Leu Leucin M Met Methionin N Asn Asparagin P Pro Prolin Q Gln Glutamin R Arg Arginin S Ser Serin T Thr Threonin V Val Valin W Trp Tryptophan X beliebige Aminosäure Y Tyr Tyrosin

APS Ammoniumperoxodisulfat

ATP Adenosintriphosphat

betl Glycin - Betaine Aufnahmesystem I

bp Basenpaar

BHI Brain-Heart-Infusion

BLI Biolumineszenz-Imaging

BiLe Gallensaft Exklusionsprotein (bile exclusion protein)

BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumin)

BSH Gallensaft Hydrolase (bile salt hydrolase)

C Cytosin

°C Grad Celsius


vii

CaCO3 Calciumcarbonat

CCD coupled cooled device

CCL2 (MCP-1 alt) monocyte chemoattractant protein

CDC Center for Disease Control and Prevention

CSF-1 Monozyten koloniestimulierender Faktor (colony stimulating

factor 1)

CFU koloniebildende Einheiten (colony forming unit)

cm Zentimeter

c-Met mesenchymal epithelial transition factor / hepatocyte growth

factor receptor (HGFR)

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxynukleotidtriphosphatgemisch

EDTA Ethylendiamintetraazetat

EXIM Abteilung für Experimentelle Immunologie

FAE Follikel-assoziiertes Epithel

Fd Kapazität (µFD)

FKS Fötales Kälberserum (fetal calf serum)

FbpA Eisenbindendes Vorläuferprotein

flaA Flagellin A

x g Erdbeschleunigung; g = 9,81 m/s

g Gramm

G Guanin

GAD Glutamatedecarboxylase

gbu Glycin - Betaine Aufnahmesystem II

GM-CSF Granulozyten Monozyten koloniestimulierender Faktor

(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)

h Stunde

H2O2 Wasserstoffperoxid

HCI Salzsäure

hly Listeriolysin (Gen)

http://de.wikipedia.org/wiki/Dulbecco%E2%80%99s_Modified_Eagle_Medium


viii

i.p. intraperitoneal

i.v. intravenös

IFN-γ Interferon-gamma

IL Interleukin

Inl Internalin

Ipr1 Intracellular pathogen resistence 1

IR invertierte Sequenzwiederholung (inverted repeats)

K Kilo- (103)

kb Kilobasen

kDa kilo Dalton

KO knock-out

l Liter

LD50 mittlere lethale Dosis

LIPI-1 Listeria Pathogentätsinsel

LLO Listeriolysin (Protein)

Lmo Listeria monocytogenes

LRR leucinreiche Wiederholungen (Leucin-rich-repeats)

µ mikro- (10–6)

m milli- (10–3)

m Meter

M Molar (mol/l)

M-CSF Monozyten koloniestimulierender factor (macrophage colony

stimulating factor)

MALT Schleimhaut-assoziiertes lymphatisches Gewebe (mucosa

associated lymphoid tissue)

MAPK Mitogen-aktivierte Protein Kinase

MEM Minimal Eagle's Medium

MHC Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompability

complex)

mg Milligramm

MgCl2 Magnesiumchlorid


ix

min Minute

MIP Makrophagen inflammatorisches Protein (macrophage inflamma-

tory protein)

mLK mesenterische Lymphknoten

MLST Multi-Locus-Sequenz-Typisierung

MOI Multiplizität der Infektion (multiplicity of infection)

MOLI Abteilung für Molekulare Immunologie

Mol Mol (6,023 x 1023 Teilchen)

mpl/Mpl Metalloprotease

MyD88 myeloid differentiation primary response gene (88)

n nano- (10–9)

nM nano-molar (nmol/L)

NaCl Natriumchlorid

NaHCO3 natriumhydrogencarbonat

NaOH Natriumhydroxid

NALP3 NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3

NFκB nuclear factor “kappa-light-chain-enhancer” of activated B-cells

NLR NOD-like-Rezeptor

NOD Nukleotidbindungs- und Oligomerisierungsdomäne

OD Optische Dichte

opuC Carnitin Aufnahmesystem

p pico ( 10–12 )

PBS phospatgepufferte SalzLösung (Phosphate Buffered Saline)

PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)

PrfA Pleiotropisches Aktivatorprotein

PLC-A Phospholipase A

PLC-B Phospholipase B

pL-PLc Phosphatidylinositolspezifische Phospholipase C

PSA Prophage LmoScott A

PVDF Polyvinylidenfluorid

QTL quantitative trait loci

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7739595


x

rpm Umdrehungen je Minute

RT Raumtemperatur

SB Abteilung für Strukturbiologie

SDS Natriumdodecylsulfat

sec (s) Sekunde

SPF spezifisch Pathogen frei (specific pathogen free)

sr Steridian

T Thymin

TBE Tris-Borat-EDTA

TH-1, TH-2 T-Helfer-1, T-Helfer-2

TLR Toll-like Receptor

TGF transformierender wachstumsfaktor (transforming growth factor)

TNF Tumornekrosefaktor

Taq Thermus aquaticus

TE Tris-EDTA

Tris Tris (hydroxymethyl) aminoethan

U Einheit der Aktivität (Unit)

UV Ultraviolett

V Volt

Vip Lmo320, Virulenzprotein in Listeriavirulenz

Vol. Volumen

v/v Volumen pro Volumen

WT Wildtyp

w/v Gewicht pro Volumen

zLK zervikale Lymphknoten

http://library.enaca.org/Health/DiseaseLibrary/specific_pathogen_free_info.pdf

Tabellenverzeichnis

xi

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1-1: Die Arten der Gattung Listeria ............................................................................... 2

Tabelle 2-1: Zeitpunkt des Auftretens der Anzeichen einer Invasion des ZNS in

ausgewählten Mausinzuchtstämmen nach oraler Infektion mit Listeria monocytogenes ...... 90

Abbildungsverzeichnis

xii


Abbildung 1-1: Infektionsweg von Listeria monocytogenes .................................................... 7

Abbildung 1-2: Speziesspezifität von Listeria monocytogenes ..............................................11

Abbildung 1-3: Infektionszyklus von Listeria monocytogenes ...............................................13

Abbildung 2-1: Darstellung der Sequenzen des DNA Abschnittes von inlA und der

entsprechenden codierenden Proteinsequenzen in den genetisch modifizierten

Listerienstämmen. ................................................................................................................34

Abbildung 2-2: Ergebnis der Analyse der Proteinexpression von Internalin A und

Internalin B in genetisch veränderten Listerienstämmen. ......................................................36

Abbildung 2-3: Aufnahme genetisch veränderter Listerienstämme in Caco-2 Zellen. ...........39

Abbildung 2-4: Aufnahme genetisch veränderter Listerienstämme in CT-26 Zellen. .............40

Abbildung 2-5: Überlebensraten und Verlauf der Körpergewichte ausgewählter

Mausinzuchtstämme nach oraler Infektion mit LmoXen32-mur. ............................................42

Abbildung 2-6: In vivo Imaging von oral infizierten Mausinzuchstämmen mit LmoXen32-

mur. ......................................................................................................................................43

Abbildung 2-7: Biolumineszenz-Imaging oral infizierter BALB/cJ Mäuse mit LmoXen32

bzw. LmoXen32-mur. ...........................................................................................................46

Abbildung 2-8: Verlauf des Körpergewichtes von BALB/cJ Mäusen nach oraler

Infektion mit 5x109 CFU LmoXen32 und LmoXen32-mur......................................................47

Abbildung 2-9: Bakterielle Keimlasten in den inneren Organe von BALB/cJ Mäusen

nach der oralen Infektion mit LmoXen32 oder LmoXen32-mur. ............................................49

Abbildung 2-10: Histopathologische und immunhistologische Analyse der Leber von

oral infizierten BALB/cJ Mäusen mit LmoXen32 und LmoXen32-mur. ..................................51

Abbildung 2-11: Ergebnis der Analyse der Proteinexpression von Internalin A und

Internalin B in genetisch veränderten Listerienstämmen. ......................................................54

Abbildung 2-12: Aufnahme genetisch veränderter Listerienstämme in Caco-2 und CT-

26 Zellen. .............................................................................................................................55

Abbildung 2-13: Überlebensraten und Verlauf des Körpergewichtes von BALB/cJ

Mäusen nach oraler Infektion mit LmoEGDe, LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux. ..........56


xiii

Abbildung 2-14: Biolumineszenz-Imaging oral infizierter BALB/cJ Mäuse mit

LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-mur-lux. ...............................................................................58

Abbildung 2-15: Ex vivo Biolumineszenz-Imaging der inneren Organen oral infizierter

BALB/cJ mit LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux an Tag vier nach der Infektion. .............59

Abbildung 2-16: Histopathologische und immunhistologische Analyse von Leber von

oral infizierten BALB/cJ mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-mur-lux. ..................60

Abbildung 2-17: Überlebensraten von ausgewählten Mausinzuchtstämmen nach oraler

Infektion von 5x109 CFU LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux. .........................................62

Abbildung 2-18: Verlauf des Körpergewichtes ausgewählter Mausinzuchtstämme nach

oraler Infektion mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux oder LmoEGDe-mur-lux. ...............................64

Abbildung 2-19: Biolumineszenz-Imaging von mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux oral

infizierten Mausinzuchstämmen. ..........................................................................................67

Abbildung 2-20: Biolumineszenz-Imaging von mit 5x109 CFU LmoEGDe-mur-lux oral

infizierten Mausinzuchstämmen. ..........................................................................................68

Abbildung 2-21: Biolumineszenz-Imaging von oral infizierten Mausinzuchstämmen mit

5x109 CFU LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-mur-lux. .............................................................70

Abbildung 2-22: Verlauf des Körpergewichtes ausgewählter Mausinzuchtstämme nach

oraler Infektion mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-mur-lux. ...............................72

Abbildung 2-23: Ex vivo BLI der inneren Organe ausgewählter Mausinzuchtstämme

nach der oralen Infektion mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-mur-lux. ...............75

Abbildung 2-24: Bakterielle Keimlasten in den inneren Organe ausgewählter Maus-

inzuchtstämme nach der oralen Infektion mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux bzw.

LmoEGDe-mur-lux. ..............................................................................................................77

Abbildung 2-25: Bakterielle Keimlast in den inneren Organen ausgewählter Maus-

inzuchtstämme am Tag fünf nach der oralen Infektion mit 5x109 CFU LmoEGDe-mur-

lux. .......................................................................................................................................80

Abbildung 2-26: Histopathologische und immunhistologische Analyse der Leber von

oral infizierten C57BL/6J und C3HeB/FeJ Mäusen mit 5x109 CFU LmoEGDe-mur-lux. ........82

Abbildung 2-27: Chemokin- und Zytokinproduktion ausgewählter Mausinzuchtstämme

nach der oraler Infektion mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-mur-lux. ................84

Abbildung 2-28: Korrelation der bakteriellen Keimlast in den inneren Organe mit den

nachgewiesenen Biolumineszenzsignalen. ...........................................................................87

Abbildung 2-29: Korrelation der bakteriellen Keimlast in den inneren Organen mit den

nachgewiesenen Biolumineszenzsignalen. ...........................................................................88


xiv

Abbildung 2-30: Histopathologie und Immunhistologie des Gehirns einer „kreiselnden“

129P2/Ola Maus nach der oralen Infektion mit 5x109 CFU LmoXen32-mur. .........................91

Abbildung 2-31: Überlebensrate und der Verlauf des Körpergewichtes von Ifi27l2a-KO

und C57BL/6N Mäusen nach intravenöser Infektion mit 2x104 CFU LmoEGDe-mur-lux. ......92

Abbildung 2-32: Bakterielle Keimlast in Leber und Milz von Ifi27l2a-KO und C57BL/6N

Mäusen nach intravenöser Infektion mit 2x104 CFU LmoEGDe-mur-lux. ..............................93

Abbildung 2-33: IFN-β Induktion nach oraler Infektion mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux,

LmoEGDe-mur-lux, LO28 und LO28-mur in IFN-β-Reportermäusen BL6albino/IFN-

β+/Δβ-luc. .................................................................................................................................95

Abbildung 5-1: Transformationsstrategie zur Herstellung genetisch modifizierter

Listerienstämme. ................................................................................................................ 133

Abbildung 5-2: Prinzip des in vivo Imaging. ........................................................................ 146

Zusammenfassung

xv

Zusammenfassung

In vivo Analyse der oralen Infektion mit biolumineszenten

Listeria monocytogenes im Mausmodell

Silke Bergmann

Das Gram-positive Bakterium Listeria monocytogenes kann schwerwiegende

Infektionen in Mensch und Tier auslösen. Nach der oralen Aufnahme sind Listerien in

der Lage sowohl die Darmbarriere als auch die Blut-Hirn-Schranke und die

Plazentaschranke zu durchqueren.

Die Eintrittspforte für Listeria monocytogenes ist das intestinale Epithelium. Aufgrund

einer speziesspezifischen Interaktion des Oberflächenproteins Internalin A (InlA) mit

seinem Rezeptor E-Cadherin ist die Infektion muriner Epithelzellen und damit eine

Infektion der Maus über den oralen Infektionsweg nur schwer induzierbar. Zwei

Aminosäuresubstitutionen innerhalb des Internalin A erhöhen die Bindungsaffinität

zum murinem E-Cadherin und ermöglichen eine effizientere orale Infektion mit

Listeria monocytogenes im Mausmodell. Derart Internalin A modifizierte

Listerienstämme werden als murinisierte Listerienstämme bezeichnet.

In dieser Arbeit wurden verschiedene Mausinzuchtstämme (BALB/cJ, C57BL/6J,

A/JOlaHsd, C3HeB/FeJ) mit biolumineszenten Listerienstämmen oral infiziert, um

Infektionsverläufe in vivo nicht invasiv zu analysieren. Verglichen wurden

Infektionsverläufe mit dem biolumineszenten InlA-Wildtypstamm LmoEGDe-lux und

dem InlA-modifizierten, murinisierten Stamm LmoEGDe-mur-lux. Es konnte ein

invasiverer Krankheitsverlauf nach der Infektion mit den murinisierten Listerien im

Vergleich zu den isogenen Wildtypstämmen beobachtet werden. Dies resultierte in

einer reduzierten Überlebensrate und einer höheren bakteriellen Keimzahl in den

inneren Organen. Mit Hilfe des Biolumineszenz-Imaging konnten Unterschiede in der

Dissemination und Akkumulation von LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux

festgestellt werden. Weiterhin konnte mit Hilfe von IFN-β-Luziferase-Reportermäusen

Zusammenfassung

xvi

gezeigt werden, dass LmoEGDe-mur-lux eine stärkere IFN-β-Synthese in

verschiedenen Geweben im Vergleich zu seinem isogenen Wildtypstamm induziert.

Einen Einfluss des murinisierten InlA auf die Überwindung der Blut-Hirn-Schranke

konnte nicht gezeigt werden.

Weiter wurde beobachtet, dass die untersuchten Mausinzuchtstämme

unterschiedliche Wirtsresistenzen gegenüber oral vermittelter Listeriose aufwiesen.

C57BL/6J Mäuse zeigten eine ausgeprägte Resistenz gegenüber der oralen Infektion

mit Listeria monocytogenes. Im Vergleich dazu erwiesen sich C3HeB/FeJ und

A/JOlaHsd Mäuse als äußerst empfindlich, was in einer geringeren Überlebensrate

und einer erhöhten bakteriellen Keimlast resultierte. Parallel zeigte die Analyse der

Chemokine und Zytokine bei den empfindlichen C3HeB/FeJ Mäusen eine gesteigerte

Produktion von IFN-γ, CCL2, IL-6, IL-10 und TNF-α im Vergleich zu den resistenten

C57BL/6J Mäusen.

Im Rahmen dieser Dissertation wurde das biolumineszente Listerieninfektionsmodell

auch genutzt, um die Wirtsresistenz von Interferon-α inducible protein 27 like 2A

Knock-out Mäusen (Ifi27l2a-KO) zu untersuchen. Im Vergleich zur Wildtypmauslinie

C57BL/6N resultierte die Infektion mit LmoEGDe-mur-lux in einer signifikant höheren

bakteriellen Keimlast in der Leber und der Milz von Ifi27l2a-KO Mäusen. Jedoch

konnten keine signifikanten Unterschiede in der Überlebensrate beider Mausstämme

gezeigt werden.

Summary

xvii

Summary

In vivo analysis of orally infected mice using bioluminescent

Listeria monocytogenes

Silke Bergmann

The gram-positive bacterium Listeria monocytogenes causes invasive, often fatal

infections in humans and animals. After oral ingestion Listeria monocytogenes can

cross the intestinal, blood-brain, and placental barrier.

The intestinal epithelium is the primary site for Listeria monocytogenes infection. Due

to a species-specific interaction of the bacterial surface protein Internalin A (InlA) with

its receptor E-Cadherin, an infection of murine epithelial-cells, and hence an infection

of mice via the oral route of infection is less effective. Substitution of two amino acids

in Internalin A increased the affinity of the protein to the murine E-Cadherin receptor.

Such modified Listeria strains designated as murinized Listeria strains have the

capability to efficiently pass through the murine intestinal barrier and to induce

Listeriosis in mice after oral inoculation.

In this PhD thesis work, different inbred strains of mice (BALB/cJ, C57BL/6J,

A/JOlaHsd, and C3HeB/FeJ) were intragastrically infected with bioluminescent

Listeria strains to study bacterial dissemination by non-invasive imaging in vivo. The

course of infection was compared between mice infected with the InlA-wildtype

LmoEGDe-lux Listeria strain and mice infected with InlA-modified murinized Listeria

strain LmoEGDe-mur-lux. Infections with LmoEGDe-mur-lux resulted independent of

the host genetic background in more severe Listeriosis disease symptoms as

compared to infections with the wildtype LmoEGDe-lux strain, and mice infected with

LmoEGDe-lux displayed reduced survival and higher bacterial loads in internal

organs. Differences in the systemic dissemination and accumulation of both

bioluminescent Listeria monocytogenes strains in internal organs were detected by

Bioluminescence-Imaging (BLI). By using a luciferase tagged IFN-β-reporter mouse it

Summary

xviii

was shown that infections with the LmoEGDe-mur-lux strain were associated with a

stronger induction of the IFN-β response in several tissues as compared to infections

with the LmoEGDe-lux wild-type strain. Importantly, an influence of the murinized

Internalin A on listerial invasion of the blood-brain was not detected.

Furthermore, the phenotyping of different inbred mouse strains after oral inoculation

with murinized and non-murinized Listeria strains revealed genetic differences in host

resistance to orally acquired Listeriosis. C57BL/6J mice showed a greater resistance

to orally acquired Listeriosis as compared to the other strains. C3HeB/FeJ and

A/JOlaHsd mice showed a more pronounced host susceptibility after oral infection,

which was reflected by a slower bacterial clearance and reduced survival.

Furthermore, the analysis of chemokines and cytokines in the serum after oral

infection with Listeria monocytogenes revealed higher concentrations of IFN-γ,

CCL2, IL-6, IL-10 and TNF-α in susceptible C3HeB/FeJ mice as compared to

resistant C57BL/6J.

The bioluminescent Listeria infection challenge model was also employed to study

the host response of Interferon-α inducible protein 27 like 2A knock-out (Ifi27l2a-KO)

mice. The infection of Ifi27l2a-KO mice with LmoEGDe-mur-lux resulted in a

significantly higher bacterial load in the liver and spleen as compared to C57BL/6N

wildtyp mice. However, there were no significant differences in the survival rate of

both mouse strains detectable.

Einleitung

1

1 Einleitung

In der wissenschaftlichen Forschung existieren eine Vielzahl von Tiermodellen. Sie

spielen eine große Rolle in den verschiedensten Bereichen der Grundlagen- und

angewandten Forschung wie zum Beispiel in der Genetik, der Verhaltensforschung,

der medizinischen und pharmazeutischen Forschung, für das Verständnis bioche-

mischer Prozesse sowie für das Verstehen der Interaktion zwischen Wirt und Patho-

gen während einer infektiösen Erkrankung.

Wie sich eine Krankheit entwickelt, hängt von verschiedenen inneren und äußeren

Einflüssen ab. Die genetische Prädisposition ist eine der wichtigsten intrinsischen

Faktoren. Um die Ursachen genetischer Krankheitsprädisposition zu erforschen, wird

im Tiermodell Maus häufig die genetische Diversität zwischen Mausinzuchtstämmen

für genetische Analysen genutzt (O`Brien und Woychik, 2003). Mit Hilfe von In-

zuchtstämmen lassen sich auch komplexe Genotyp - Phänotyp Beziehungen erklä-

ren (Buer und Balling, 2003; Lengeling et al., 2001). Auch die Wirtsspezifität und

Virulenz eines Krankheitserregers beeinflusst die Entwicklung einer Erkrankung. Ein

viel studiertes Pathogen für den Infektionsprozess, die angeborene und erworbene

Immunabwehr, die intrazelluläre Lebensweise und die Wirtsspezifität ist Listeria

monocytogenes.

1.1 Morphologie und Physiologie der Gattung Listeria

Listerien sind Gram-positive, nicht sporenbildende, feine Stäbchenbakterien mit ge-

ringem GC-Gehalt im Genom. Sie sind peritrich begeißelt und zeichnen sich durch

eine Beweglichkeit bei 20°C aus, sind jedoch nur eingeschränkt beweglich ab 37°C

(Leifson und Palen, 1955; Peel et al., 1988). Eine Besonderheit ist ihre intrazelluläre

Lebensweise. Außerdem leben Listerien fakultativ anaerob, sind anspruchslos und in

der Umwelt weit verbreitet. Diese Eigenschaften haben alle Mitglieder der Gattung

Listeria - Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Listeria inocua, Listeria

welshimeri, Listeria seegligeri, Listeria grayi (Vazquez-Boland et al., 2001) sowie die

2010 neu beschriebenen Spezies Listeria marthii (Graves et al., 2010) und Listeria

rocourtiae (Leclercq et al., 2010) gemeinsam (Tabelle 1.1). Jedoch sind nur L.

Einleitung

2

monocytogenes und L. ivanovii von human- und tierpathogener Bedeutung (Glaser et

al., 2001). Sie können im Erdreich, im Wasser, auf Pflanzen und in Nahrungsmitteln

tierischen und pflanzlichen Ursprungs isoliert werden. Sie tolerieren extreme pH-

Werte (3,0 - 9,5), hohe Salzkonzentrationen (10%), einige Schwermetalle und

besitzen die Fähigkeit sich bei extremen Temperaturen (-0,1 - 45°C) zu vermehren

(Farber und Peterkin, 1991). Aufgrund dieser Eigenschaften stellen Listerien ein

großes Problem in der lebensmittelverarbeitenden Industrie dar. Der kulturelle

Nachweis erfolgt meist aerob auf Blut-Agarplatten. Es entstehen kleine graue

Kolonien, welche von einer leichten Hämolysezone umgeben sind. Dies ist Resultat

des Listeriolysin O (LLO), ein porenformendes Toxin, welches Erythrozyten lysieren

und Hämoglobin abbauen kann.

Tabelle 1-1: Die Arten der Gattung Listeria

Spezies Humanpathogen Serogruppen

L. monocytogenes ja 13

L. ivanovii (ja) 1

L. innocua nein (3)

L. seeligeri nein (4)

L. welshimeri nein 2

L. grayi nein

L. marthii (Graves et al., 2010) nein

L. rocourtiae (Leclercq et al., 2010) nein

1.2 Epidemiologie von Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes ist weltweit verbreitet und kann eine Listeriose bei Schafen

und Rindern auslösen. Es kann aber auch beim Menschen zu einer schweren loka-

len oder generalisierten Infektion führen (Swaminathan und Gerner-Smidt, 2007).

Erstmals wurde Listeria monocytogenes 1926 als Ursache einer Epidemie in Meer-

schweinchen und Kaninchen beschrieben (Murray et al., 1926). Rückblickend waren

einige Fälle von Listeriose in Menschen und Tieren schon in den 1920-ern bekannt.

Die ersten durch Listerien verseuchte Nahrungsmittel bedingte Infektionen im Men-

schen wurden 1979 mit 23 Fällen dokumentiert (Gellin und Broome, 1989). Ein weite-

Einleitung

3

res Beispiel für einen Ausbruch fand 1981 durch kontaminierten Krautsalat in den

Maritimprovinzen Kanadas statt (Schlech, 1983). Auch sind sporadische Fälle wie

zum Beispiel in Italien 1997, verursacht durch kontaminierten Maissalat, beschrieben

(Aureli et al. 2000). In Europa ist die Anzahl der Listerieninfektionen in den letzten

Jahren wieder angestiegen. Besonders bei den über 70-jährigen konnte ein Anstieg

beobachtet werden (Denny und McLauchlin, 2008; Epidemiologisches Bulletin, 2009

Robert-Koch-Institut (RKI)). Zu den weiteren diskutierten Hypothesen zählen der

demografische Wandel und der zunehmende Verzehr sogenannter „ready to eat“-

Produkte, welche einen günstigen Nährboden für Listerien darstellen. Meist werden

Listerien jedoch über kontaminierte Milchprodukte übertragen (Denny und

McLauchlin, 2008). Auch zeigten die in 2011 in den USA durch verseuchte

Cantaloupe-Melone hervorgerufenen Infektionen, dass Listerien immer wieder eine

wichtige Rolle bei epidemieartigen Ausbrüchen von Infektionskrankheiten spielen

(MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2011, Center for Disease Control and Prevention

(CDC)). Trotzdem sind Fälle von Listeriose selten, in Europa mit 0,3 Fällen auf

100.000 Einwohner (Denny und McLauchlin, 2008), bzw. 0,1-11,3 Fälle auf

1.000.000 Einwohner pro Jahr (Epidemiologisches Bulletin, 2006, RKI). Infektionen

betreffen meist Risikogruppen wie Schwangere, Patienten mit geschwächtem

Immunsystem, ältere Menschen und Neugeborene.

Neben dem oralen Übertragungsweg sind weitere Infektionswege möglich wie z.B.

Hautinfektionen nach intensivem Kontakt mit verseuchtem Wasser oder zu er-

krankten Tieren. Weiterhin können Übertragungen von Mensch zu Mensch als

intrauterine oder perinatale Infektionen erfolgen. Auch tragen 5% der Erwachsenen

symptomlos Listeria monocytogenes in ihrem Gastrointestinaltrakt und stellen somit

eine Infektionsquelle dar (Schuchat et al., 1991).

Listeria monocytogenes wird in verschiedene Serotypen unterteilt. Mit Hilfe der

Oberflächen- (O) und Flagellen- (H) Antigene konnten 13 unterschiedliche Serotypen

identifiziert werden (Donker-Voet et al., 1972; Paterson et al., 1940; Seeliger et al.,

1984), welche genetisch variieren. Nur 4 Serotypen, 1/2a, 1/2b, 1/2c und 4b, sind

human- und tierpathogen, wovon das Serovar 4b die Hauptquelle für epidemische

Ausbrüche darstellt (Gahan und Hill, 2005). Mit Hilfe weiterer Analysen wie

Einleitung

4

Pulsfeldgelelektrophorese, Ribotypisierung, DNA-Arrays und Multi-Locus-Sequenz-

Typisierungen (MLST) wurde gezeigt, dass Listeria monocytogenes Stämme in drei

separate Linien klassifiziert werden können (Ragon et al., 2008). Linie I enthält die

epidemischen Listeria monocytogenes Stämme mit höchster Pathogenität

(Serotypen: 4b, 1/2b, 3b, 4d, 4e und 7), Linie II die Typen, welche zu sporadischen

Erkrankungen im Menschen führen (Serotypen: 1/2a, 1/2c, 3a und 3c) und Linie III

enthält Typen niederer Pathogenität, welche bisher nicht aus humanen Proben

isoliert wurden (Serotypen: 4a und 4c) (Brosch et al., 1994; Graves et al., 1994;

Wiedmann et al., 1997b).

1.3 Humane Listeriose

Es existieren zwei pathogene Spezies der Gattung Listeria, Listeria monocytogenes

und Listeria ivanovii. Listeria monocytogenes ist human- und tierpathogen, wogegen

Listeria ivanovii hauptsächlich bei Wiederkäuern zu einer Listeriose führen kann.

Jedoch konnten auch Listeria ivanovii Infektionen beim Menschen beschrieben

werden (Guillet et al., 2010).

Die Infektion des Menschen mit Listeria monocytogenes erfolgt durch die Aufnahme

mit kontaminierten Nahrungsmitteln. Die Infektionsdosis kann von 10 bis 109 Colony

Forming Units (CFU) / mg Nahrungsmittel schwanken. Die Inkubationszeit liegt

zwischen 3-70 Tagen (Epidemiologisches Bulletin, 2006, RKI). Hauptansteckungs-

quelle sind hauptsächlich Rohmilchprodukte, Rohwürste, geräucherter Fisch und

vakuumverpackte, verzehrfertige Produkte. Trotz häufiger Exposition kommt es

selten zu einer beschriebenen Erkrankung, da im gesunden Menschen die Infektion

häufig symptomlos verläuft und eine höhere Infektionsdosis zum Auslösen einer

Erkrankung nötig ist. Selten können sich klinische Symptome einer nicht-invasiven

Gastroenteritis entwickeln, welche nach wenigen Tagen selbständig ausheilt. Risiko-

gruppen, für die Listeriose ein ernstes Problem darstellt, sind insbesondere schwan-

gere Frauen, Neugeborene, Ältere und immunsupprimierte Patienten z.B. nach

Organtransplantationen, Chemotherapie und AIDS Patienten. Hier ist eine geringere

Infektionsdosis ausreichend, um eine Erkrankung auszulösen.

Einleitung

5

Die häufigste Manifestationsform der Listeriose, bei nicht Schwangeren, betrifft das

zentrale Nervensystem, mit 55-70% der Fälle (Vazquez-Boland et al., 2001).

Bakterielle Meningitis und Enzephalitis resultieren in einer Mortalität von ca. 20%,

können aber im Falle von bestehenden schwächenden Vorerkrankungen eine

Sterblichkeit von 40-60% aufweisen (Lorber, 1997; Schuchat et al., 1997). Eine

weitere häufige Form der Listerieninfektion äußert sich in einer Sepsis (15-50% der

Fälle) und ist begleitet von einer Mortalitätsrate von bis zu 70% (Lorber, 1997).

Atypische Verläufe sind Pneumonie, Endokarditis und Hepatitis (Faber und Perterkin,

1991; Lorber 1997; McLauchlin, 1990). Weiterhin wird eine invasive Gastroenteritis

ebenfalls als Hauptmanifestationsform beschrieben, welche begleitet ist von Diarrhoe

und Fieber (Ho et al., 1986).

Bei der feto-maternalen und neonatalen Listeriose werden zwei Verlaufsformen

unterschieden: „early“ und „late onset“. Aufgrund einer physiologischen Suppression

der zellulär vermittelten Immunantwort während einer Schwangerschaft (Weinberg et

al., 1984) kann es zur Invasion der Plazenta und des Fetus kommen. In der Mutter

selbst verläuft die Infektion meist asymptomatisch. Die Infektion innerhalb der ersten

Schwangerschaftsmonate resultiert häufig in einer Früh- bzw. Totgeburt. Erfolgt eine

Infektion im letzten Drittel der Schwangerschaft entwickeln die Feten und Neu-

geborenen häufig schwerwiegende generalisierte Infektionen, wie Granulomatosis

infantiseptica („early onset“), verbunden mit einer Sterblichkeit von >50% (Klatt et al.,

1986; Schlech, 2000). Auch ist es möglich, dass sich die Neugeborenen während

des Geburtsvorgangs über infizierte maternale Exsudate mit Listeria monocytogenes

infizieren („late onset“) (Farber et al., 1991). Weiterhin ist bekannt, dass über

keimtragendes medizinisches Personal eine Ansteckung erfolgen kann. Symptome

sind häufig Meningitis, seltener Pneumonie oder Gastroenteritis. Die Mortalität liegt

hier bei ca. 5-10% (Lorber, 1997).

Seltener vorkommende Infektionen wie Dermatitis und Konjunktivitis können bei

Personen mit intensivem direktem Kontakt zu infizierten Tieren auftreten (McLauchlin

und Low, 1996).

Einleitung

6

Die Diversität der klinischen Symptome resultiert aus der Fähigkeit Listeria mono-

cytogenes drei Wirtsbarrieren zu durchqueren: die intestinale Barriere, die Plazenta-

schranke und die Blut-Hirn-Schranke (Vazquez-Boland et al., 2001). Nach Aufnahme

mit kontaminierten Lebensmitteln überleben Bakterien die Magensäure sowie allge-

meine Abwehrmechanismen und können die intestinale Barriere überqueren. Sie

infizieren sowohl die intestinalen Epithelzellen als auch die M-Zellen der Peyer´schen

Plaques. M-Zellen sind Bestandteile des Follikel-assoziierten Epithels (FAE). Sie

überdecken die Peyer-Plaques und spielen eine wichtige Rolle für die Funktion des

„Schleimhaut-assoziiertes lymphatisches Gewebe“ (MALT). M-Zellen nehmen Anti-

gene und Mikroorganismen über Endozytose auf und leiten sie an darunterliegende

lymphoide Zellen weiter, welche dann anschließend eine Immunantwort generieren

(Clark et al., 2000). Über das Blut- und Lymphsystem sowie die mesenterialen

Lymphknoten gelangen die Listerien zu Leber und Milz, den Hauptorganen der bak-

teriellen Kolonisation und Replikation (Vazquez-Boland et al., 2001). Über eine

erneute hämatogene Streuung gelangt Listeria monocytogenes zum Gehirn und zur

Plazenta und können auch dort die epithelialen Barrieren überqueren (Abbildung 1-

1).

Listeriose ist erfolgreich mit Antibiotika behandelbar. Auch sind bisher im klinischen

Bereich keine resistenten Stämme, im Gegensatz zu Isolaten aus Lebensmitteln,

aufgetreten. Die Dauer der Behandlung ist von der Wahl des Antibiotikums und den

klinischen Symptomen abhängig und kann bis zu sechs Wochen in Anspruch neh-

men. Gute Ergebnisse liefert eine Kombinationstherapie mit hoch dosiertem

Ampicillin und Gentamycin. Zusätzlich empfiehlt sich eine Gabe von Rifampicin zur

Inhibition des intrazellulären Lebenszyklus der Bakterien (Epidemilogisches Bulletin,

2006 (RKI)). Die beste Weise sich vor einer Listerieninfektion zu schützen, ist jedoch

die Vermeidung des Verzehrs kontaminierter Lebensmittel. Richtlinien in der

nahrungsmittelverarbeitenden Industrie sollen das Risiko einer Infektion reduzieren.

Trotz aller Verarbeitungsvorschriften sind Rohprodukte oder mangelnde Hygiene bei

der Verarbeitung potentiell kontaminierter Lebensmittel eine ständige Gefahr für

Listerieninfektionen. Besonders gefährdete Nahrungsmittel sind Rohmilchprodukte,

Weichkäse, rohes Fleisch, Räucherfisch und unsachgemäß gereinigtes Gemüse.

Einleitung

7

Ausnahmen bilden Äpfel, Karotten und Tomaten. Diese sind frei von Listerien

(Epidemiologisches Bulletin, 2006, RKI). Eine allgemeine Empfehlung zur Prävention

einer Listerieninfektion ist Fleisch vor dem Verzehr ausreichend zu erhitzen, pasteu-

risierte Milch und Milchprodukte zu verwenden und Gemüse ausgiebig zu waschen.

Abbildung 1-1: Infektionsweg von Listeria monocytogenes Nach Aufnahme über kontaminierte Nahrungsmittel überquert Listeria monocytogenes die intestinale Barriere und erreicht über das Lymph- und Blutsystem die Leber und Milz. Über eine erneute hämatogene Streuung erreichen die Listerien die Plazenta und das Gehirn und können sowohl die Plazentaschranke als auch die Blut-Hirn-Schranke überqueren (verändert nach Lecuit et al., 2007).

1.4 Listeriose in domestizierten Tieren

Listeria monocytogenes hat große Bedeutung in der Veterinärmedizin (Gray und

Killinger, 1966). Zudem tragen eine Vielzahl von Wild- und Nutztieren Listeria

monocytogenes asymptomatisch in ihrem Verdauungstrakt (Nightingale et al., 2004).

Listeriose, auch „circling disease“ oder „silage sickness“ genannt, betrifft meist

Wiederkäuer (Pfister et al., 2002; Wiedmann et al., 1997a). Auch sind Fälle von

Listeriose bei Kaninchen, Meerschweinchen, Schweinen, Hunden, Katzen und

Vögeln beschrieben wurden (Cooper, 1989; Decker et al., 1976; Long und Dukes,

1972; Murray, 1955). Ebenfalls ist Listeria ivanovii von Bedeutung eine Listeriose bei

Schafen auszulösen,

Bei Schafen und Rindern sind ca. 52% der Tiere mit Listeria monocytogenes infiziert

und alle Altersstufen sowie beide Geschlechter betroffen (Skovgaard und Morgen,

1988). Dennoch ist die Erkrankung selten. Tiere unter drei Jahren sind mehr

Einleitung

8

gefährdet als ältere. Jahreszeitlich häufen sich Fälle von Listeriose in den Winter-

und Frühlingsmonaten. Die Infektion erfolgt meist über kontaminiertes Futter wie

Silage oder verseuchte Weiden. Die Inkubationszeit variiert zwischen wenigen Tagen

bis zu mehreren Wochen (Low und Donachie, 1997). Nach der Aufnahme können

sich die Bakterien im Gastrointestinaltrakt anreichern und die intestinale Barriere

durchqueren. Weiterhin ist es möglich, dass Listeria monocytogenes über

Verletzungen der Mundschleimhaut eindringen kann und vom Rachenraum, entlang

der Hirnnerven, zum zentralen Nervensystem wandert und eine Meningoenzephalitis

verursacht (Barlow und McGorum, 1985).

Bei Wiederkäuern werden verschiedene Formen der Listeriose unterschieden. Adulte

Tiere erkranken gewöhnlich an der enzephalitischen Form. Hier kann die

Inkubationszeit zwei bis sechs Wochen andauern (Low und Donachie, 1997). Diese

ist anfangs gekennzeichnet durch Lethargie und Gewichtsverlust. Später folgen

neurologische Ausfallerscheinungen wie Gesichtslähmung, übermäßige

Speichelbildung, unkoordinierte Bewegungen und einer Torticollis. Innerhalb von 4 –

14 Tagen endet die Erkrankung tödlich, die Mortalität liegt bei Schafen bei 50% und

bei Rindern bei 71% (Czuprynski, 1993). Neugeborene oder junge Tiere erkranken

dagegen eher an der septischen oder viszeralen Form mit Fieber und Lethargie mit

späterer Todesfolge. Septische Verlaufsformen zeichnen sich durch eine

Inkubationszeit von zwei bis fünf Tagen aus und sind von der inokulierten

Listerienanzahl abhängig (Low und Renton, 1985). Ebenso kann es zu intrauterinen

Infektionen kommen, welche zu Frühgeburten und Aborten führen (Cooper und

Walker, 1998). Weitere Krankheitsbilder sind Keratokonjunktivitis oder Mastitis und

werden durch Fütterung mit kontaminierter Silage verursacht (Cooper und Walker,

1998). Die Diagnose wird meist über die klinischen Symptome gestellt. Die definitive

Diagnose erfolgt post-mortem mit Hilfe der histopathologischen Analyse. Die

Antibiotika der Wahl sind PenicillinG und Tetrazykline. Vorbeugende Maßnahmen um

eine Listeriose bei Nutztieren zu verhindern, liegt in der Fütterung von einer qualitativ

hochwertiger Silage mit geringem pH-Wert (≤5) (Fenlon, 1986).

Bei Vögeln, Hunden, Katzen, Kaninchen und Meerschweinen führt eine Infektion mit

Listeria monocytogenes zu Sepsis (Gray und Killinger, 1966). Vereinzelt kommt es

Einleitung

9

zum Auftreten einer Enzephalitis. Bei Kaninchen kann es zusätzlich zu Aborten oder

plötzlichem Tod kommen.

1.5 Wirtsspezifität und Wirtsinvasion

1.5.1 Invasionsproteine und Speziesspezifität

Die Aufnahme von Listeria monocytogenes über kontaminierte Nahrungsmittel macht

Listeriose zu einer wichtigen Zoonose-Erkrankung. Die Übertragung zwischen den

einzelnen Spezies sowie die Invasion und Replikation in der Zelle sind von der Inter-

aktion von Wirtsmolekülen mit Oberflächenproteinen des Pathogens abhängig. Die

Internaline von Listeria monocytogenes sind dafür von großer Bedeutung. Internaline

sind eine große Proteinfamilie, welche in zwei Genclustern auf dem Genom organi-

siert sind. Die Proteine sind gekennzeichnet über einen gleichen Aufbau. N-terminal

findet sich eine Signalsequenz, gefolgt von leucinreichen Wiederholungen (LRR-

Motiv). Weiter kann sich eine IR Region (inverted repeats) anschließen. Basierend

auf dem Aufbau und der bakteriellen Oberflächenbindungsdomäne werden die

Internaline in drei Familien unterteilt (Bierne et al., 2007; Cossart und Toledo-Anna,

2007): Internaline mit LPTXG- Motiv, wobei das X für jede beliebige Aminosäure

stehen kann, Internaline mit GW- oder WXL-Motiv und die dritte Gruppe sind

sekretierte Internaline (Hamon et al., 2006). Zu den LPTXG-Motiv Internalinen

gehören 19 Mitglieder darunter Internalin A (InlA), InlE, InlG, InlH, InlF, InlI und InlJ

(Sabet et al., 2005). Über dieses Motiv erfolgt eine kovalente Bindung an die

bakterielle Zellwand. Die zweite Klasse von Internalinen, GW oder WXL, beinhaltet

zwei Proteine, Internalin B (InlB) und Lmo0549. Über GW bzw. WXL Wiederholungen

erfolgt eine lockere Bindung des Proteins an die Lipoteichonsäuren der bakteriellen

Zellwand. In der dritten Gruppe der Internaline fehlt die zellwandverankernde

Domäne. Hierzu gehören vier Mitglieder darunter InlC, Lmo2445, Lmo2027 und

Lmo2470.

Die am besten charakterisierten Internaline sind InlA und InlB. Sie spielen die Haupt-

rolle bei der Invasion von Listeria monocytogenes in verschiedene Zelltypen. Der

Rezeptor für Internalin B ist die Rezeptor-Tyrosinkinase c-Met/HGF-R (mesenchymal

Einleitung

10

epithelial transition factor / hepatocyte growth factor Rezeptor) (Shen et al., 2000).

Dieser spielt eine Rolle während der Entwicklung, Geweberegeneration und Zell-

differenzierung und wird auf einer Vielzahl von Zellen exprimiert. InlB bindet an den

c-Met Rezeptor von Mensch und Maus (Met), erkennt aber nicht an das c-Met

Protein von Meerschweinchen und Kaninchen (Khelef et al., 2006). Internalin B kann

zusätzlich an die globuläre Kopfdomäne des Komplement C1q Moleküls (gC1qR)

binden (Braun et al., 2000) sowie über die GW-Domäne an Glukosaminoglykane

(Ebbes et al., 2011), was die InlB-c-Met Interaktion während der Zellinvasion

unterstützt. Internalin A spielt eine Rolle bei der Invasion von intestinalen

Epithelzellen, Endothelzellen und Hepatozyten. Es interagiert mit E-Cadherin, einem

calciumabhängigen Zell-Adhäsionsmolekül, welches während der Entwicklung, bei

der Polarisierung von Epithelien und in der Aufrechterhaltung der Gewebearchitektur

von Bedeutung ist (Mengaud et al., 1996b). E-Cadherin ist innerhalb der Familie der

Säugetiere hoch konserviert. Dabei sind 85% des humanen E-Cadherins mit dem

murinem E-Cadherin (Cdh1) identisch. Internalin A interagiert mit humanem E-

Cadherin, bindet aber auch E-Cadherin vom Kaninchen und vom Meerschweinchen,

ist jedoch nicht fähig mit Maus-E-Cadherin zu interagieren. Daraus folgt, dass Mäuse

nicht zum natürlichen Wirt von Listeria monocytogenes gehören (Abbildung 1-2). Der

wichtigste Unterschied für die Speziesspezifität liegt in der Aminosäureposition 16

des E-Cadherins. Humanes E-Cadherin sowie das vom Meerschweinchen und

Kaninchen tragen an dieser Position ein Prolin. Innerhalb des murinen E-Cadherins

ist dagegen ein Glutamin positioniert (Lecuit et al., 1999). Wird Glutamin mit Prolin an

der Position 16 ausgetauscht, ist das Internalin A fähig mit diesem humanisierten

Maus-E-Cadherin zu interagieren (Lecuit et al., 1999; Lecuit et al., 2005). Dies

resultiert in einer verstärkten Interaktion des Rezeptors mit seinem Liganden

(Schubert et al., 2002). Ein anderer Weg liegt in der Murinisierung des Internalin A.

Zwei Aminosäuresubstitutionen erhöhen die Affinität des Internalin A zum E-

Cadherin. Zum einen ein Austausch von Serin zu Asparagin an der

Aminosäureposition 192 und zum anderen der Austausch von Tyrosin zu Serin an

der Position 369 (Wollert et al., 2007b). Über die Bestimmung der

Dissoziationskonstanten von Proteinkomplexen konnte gezeigt werden, dass der

Austausch von Serin zu Asparagin an Position 192 des Internalin A die Affinität zu

Einleitung

11

humanen E-Cadherin um den Faktor 40 erhöht. Erfolgt der zusätzliche Austausch

vom Tyrosin zu Serin an der Aminosäureposition 369 des InlA, so erhöht sich die

Bindungsaffinität zum E-Cadherin erneut um den Faktor 170 (in Summe 6700-facher

Anstieg der Bindungsaffinität). Durch diese beiden Modifikationen wird auch die

Affinität des Internalin A zu Maus-E-Cadherin erhöht. Die Bindungsaffinität der

Proteinkomplexe von InlA S192N-Y369S zu murinem E-Cadherin wird um ein

vierfaches erhöht und ist vergleichbar mit der Bindungsaffinität der Proteinkomplexe

von Wildtyp InlA zu humanem E-Cadherin (Wollert et al., 2007a).

Abbildung 1-2: Speziesspezifität von Listeria monocytogenes InlA und InlB bindet an Zelloberflächenrezeptoren (E-Cadherin und c-Met) und induziert die Invasion von Listeria monocytogenes in humane Zellen. Ein Aminosäureaustausch an Posi-tion 16 des E-Cadherins verhindert die Bindung von InlA an Maus-E-Cadherin. InlB kann nicht an c-Met von Meerschweinchen und Kaninchen binden (verändert nach Bonazzi et al., 2009).

Einleitung

12

1.5.2 Wirtsinvasion und intrazelluläre Lebensweise

Invasive Bakterien haben verschiedene Strategien entwickelt um ihre eigene Auf-

nahme in nicht-phagozytierende Zellen zu induzieren, den Zipper- und Trigger-

Mechanismus. Die Aufnahme durch Trigger-Mechanismus benötigt keinen physio-

logischen Kontakt zur Wirtszelle. Bakterielle Induktoren werden sekretiert und indu-

zieren bei der Wirtszelle ein kräuseln der Membran, wobei das Pathogen in einer

Vakuole umschlossen wird. Listeria monocytogenes dringt in die Wirtszelle über

Zipper-Mechanismus ein. Invasionsproteine (InlA und InlB) binden an ihre Rezep-

tormoleküle und induzieren durch Umbau des Zytoskeletts Membranausstülpungen,

welche das Bakterium einschließen (Mostowy und Cossart, 2009).

Listeria monocytogenes kann über Makrophagen phagozytiert werden oder die

eigene Aufnahme in nicht-phagozytierende Zellen (Endothelzellen, intestinale

Epithelzellen, M-Zellen der Peyer’schen Plaque) induzieren. Bei letzterem spielen die

Oberflächenmoleküle Internalin A und Internalin B eine Schlüsselrolle (Pizzaro-Cerdà

et al., 2010). Internalin A erkennt und bindet über die LRR-Domäne an die Ekto-

domäne des E-Cadherins (Schubert et al., 2002). Dies führt zur Aktivierung von α-

und β-Catenin, welche dann mit dem Aktin des Zytoskeletts interagieren (Lecuit et

al., 2000) und durch Polarisierung und Umbau des Zytoskeletts eine Phagozytose-

vakuole bilden. Als zweites führt die Bindung des Internalin B an seinen Rezeptor c-

Met über GTPase-Aktivierung zur Polymerisierung und Verlängerung von Aktin-

molekülen und damit zur Ausbildung von Membranausstülpungen um das Bakterium

herum. Weitere Virulenzfaktoren, die bei der Invasion eine Rolle spielen, sind p60

und p104 (beides Adhäsionsproteine) sowie InlC, welches InlA und InlB bei der Inva-

sion in nicht-phagozytierende Zellen unterstützt (Bergmann et al., 2002, Rajabian et

al., 2009). Ist Listeria monocytogenes einmal phagozytiert, liegt es innerhalb eines

Phagolysosoms intrazellulär vor. Diese Vakuole wird durch Expression von Listerio-

lysin (LLO), Metalloprotease (Mpl) und einer Phosphatidylinositol-spezifischen Phos-

pholipase (PI-PLC) lysiert. Das Bakterium liegt dann frei im Zytoplasma und startet

mit der Replikation. Für die intrazelluläre Bewegung rekrutiert Listeria

monocytogenes Aktinfilamente und polymerisiert diese durch die Expression von

dem Aktin-bindenden Protein A (ActA). Die Bewegung von Listerien ist ungerichtet,

Einleitung

13

trifft aber ein Bakterium auf die Zellmembran induziert es an dieser Stelle ein

Pseudopodium, welches in Nachbarzellen vordringt und dort eine Doppelmembran-

vakuole bildet. Aus dieser befreit sich Listeria monocytogenes durch die Sekretion

von LLO und einer Lecithinase (Plc-B) und der Replikationszyklus kann von neuem

beginnen (Abbildung 1-3).

Abbildung 1-3: Infektionszyklus von Listeria monocytogenes Invasion in nicht-phagozytierende Zellen über die Oberflächenproteine InlA und InlB und nachfolgende Lyse der Vakuole über Listeriolysin (LLO) und PI-PLC (Phosphoinositol spezifische Phospholipase C). Intrazelluläre Bewegung und Zell-Zell-Ausbreitung über rekrutierte Aktinfilamente über ActA. Freiwerden aus der Doppelmembranvakuole über LLO und Phospholipase B (PlcB) (verändert nach Tilney und Portnoy, 1989).

Diese direkte Zell-Zell-Ausbreitung erlaubt zum einen die großflächige Infektion von

Geweben ohne mit der zellulären oder humoralen Immunantwort des Wirts in Kontakt

zu kommen und zum anderen die Durchquerung epithelialer Barrieren. Der Zugang

zum E-Cadherin erfolgt normalerweise an der basolateralen Seite der Enterozyten

unterhalb von Zell-Zell-Kontakten (Tight Junctions) und ist somit für Listerien von der

Darmlumenseite schwer zugänglich (Boller et al., 1985, Sousa et al., 2005). Durch

Extrusion apoptotischer Zellen im natürlichen Replikationszyklus der

Dünndarmzotten (Villi) wird E-Cadherin an der apikalen Seite von Enterozyten

Einleitung

14

kurzzeitig freigelegt und für Listeria monocytogenes zugängig (Pentecost et al., 2006;

Pentecost et al., 2010). Ebenso an Epithelfalten der Villi sowie um die schleim-

produzierenden Becherzellen kann E-Cadherin exprimiert sein (Nikitas et al., 2011).

Die meisten Gene, welche die verschiedenen Virulenzfaktoren kodieren, sind im

LIPI-1 (Listeria Pathogenitätsinsel) Cluster, einer 10 kb großen Region auf dem

Chromosom, vereint (Vazquez-Boland, et al., 2001). Hier werden die Gene prfA,

plcA, hly, mpl, actA und plcB kodiert. Dieses Gencluster fehlt bei nicht-pathogenen

Spezies (Gouin et al., 1994). Der inlAB Locus ist getrennt an einer anderen Region

des Chromosoms lokalisiert. Jedoch unterliegen alle bekannten Virulenzgene der

absoluten bzw. partiellen Kontrolle des PrfA Regulatorproteins (Pleiotropisches

Aktivatorprotein) (Mengaud et al., 1991). Befindet sich Listeria monocytogenes

außerhalb der Wirtszelle, liegt PrfA in geringer Konzentration vor. Nach der Adhäsion

von Listeria monocytogenes erfolgt eine verstärkte Expression von prfA. Auch der

Stressfaktor Sigma B wirkt wie PrfA regulierend (Kim et al., 2005), insbesondere bei

Einfluss von äußeren Faktoren wie z.B. Temperatur und pH-Wert.

Das Listeriolysin (LLO) von Listeria monocytogenes ist ein bedeutender Virulenz-

faktor und z.B. bei posttranslationalen Prozessen von infizierten Zellen beteiligt.

Diese posttranslationale Modifikation von Proteinen wird als SUMOylation bezeich-

net. Dabei erfolgt die kovalente Bindung des Zielproteins an ein Ubiquitin-ähnliches

Protein genannt SUMO (Small Ubiquitin-like Modifer). SUMOylation spielt eine Rolle

bei der Regulation der Transkription und der Stressantwort. Listeriolysin hat den

Effekt, dass es zu einer Degradation von SUMOylierten Proteinen in der Wirtszelle

führt und die bakterielle Infektion begünstigt (Ribet et al., 2010). Eine weitere Fähig-

keit des LLO ist die Histonmodifikation. In der Frühphase der Infektion induzieren

extrazellulär vorliegende Listerien die Dephosphorylierung von Serin 10 des H3 und

die Deacethylierung von H4 über sekretiertes LLO. Diese Modifikation resultiert in

der Repression der Expression verschiedener Gene, darunter auch Gene, die bei der

Immunantwort eine Rolle spielen (Hamon et al., 2007; Hamon et al., 2011). Ein

weiterer Virulenzmechanismus ist die Fähigkeit von Listeria monocytogenes sich der

Autophagozytose zu entziehen. Dies ist ein konservierter Prozess der Eukaryoten,

welcher erlaubt intrazelluläre Bestandteile innerhalb einer Doppelmembranvakuole

Einleitung

15

(Autophagosom) abzubauen oder zu recyceln. Über ActA wird die Umlagerung von

Listeria monocytogenes durch ubiquitinierte Proteine verhindert und dadurch die

Autophagosombildung unterdrückt (Birmingham et al., 2007; Yoshikawa et al.,

2009a; Yoshikawa et al., 2009b).

1.5.3 Überquerung epithelialer Barrieren im Wirt

Listeria monocytogenes besitzt die Fähigkeit aufgrund der intrazellulären Lebens-

weise epitheliale Barrieren zu durchqueren, die intestinale Barriere, die Plazenta-

schranke und die Blut-Hirn-Schranke. Der Gastrointestinaltrakt ist die Eintrittspforte,

wobei das Bakterium sich an verschiedene Lebensbedingungen im Organismus an-

passen muss. Bevor Listeria monocytogenes in den Darm übergeht, muss es dem

sauren Milieu des Magens widerstehen. Patienten welche Antazidum und H2-Blocker

einnehmen, haben ein größeres Risiko an einer Listeriose zu erkranken (Ho et al.,

1986; Schuchat et al., 1992). Dies zeigt, dass Magensäure einen Teil der Bakterien

abzutöten vermag. Jedoch ist Listeria monocytogenes in der Lage über die Expres-

sion der Glutamatdecarboxylase (GAD) (Cotter et al., 2001) und der Arginin-

deiminase (ADI) geringe pH-Werte zu tolerieren (Cotter und Hill, 2003). Beide

Systeme werden über den Stressfaktor Sigma B und den Hauptregulator der Viru-

lenzgene (PrfA) kontrolliert. Beim Übergang in den Dünndarm erfolgt aufgrund einer

hohen Salzkonzentration (0,3 M NaCl) ein Anstieg des osmotischen Drucks (Islam et

al., 1996). Durch die Expression von Osmoseregulatoren (betL, gbu und opuC)

erfolgt die Kompensation dieser erhöhten Salzkonzentration innerhalb von Listeria

monocytogenes (Sleator et al., 2003a; Sleator et al., 2003b) und somit die

Anpassung an die umgebenen Verhältnisse. Auch kann Listeria monocytogenes sek-

retiertem Gallensaft widerstehen. Durch die Mechanismen für Gallensaftresistenz,

BSH und BilE (Begley et al., 2002; Begley et al., 2005), ist es dem Bakterium möglich

innerhalb der Gallenblase zu überleben und sich zu vermehren (Hardy et al., 2004).

Die Resistenz gegenüber Gallensaft schwankt innerhalb der verschiedenen

Listerienstämme. So zeigte Listeria monocytogenes LO28 eine hohe Toleranz

gegenüber Gallensäure bis 5 M (Begley et al., 2002; Begley et al., 2005). Intestinales

Epithelium ist außerdem von einer Muzinschicht geschützt. Listeria monocytogenes

hat die Fähigkeit sich über die Oberflächenproteine InlB, InlC und InlJ an humanes

Einleitung

16

Muzin zu binden (Lindèn et al., 2008). Ebenso erhöhen die Flagellen die

Invasionseffizienz (Bigot et al., 2005; O´Neil und Marquis, 2006). Der Eintritt in die

intestinalen Epithelzellen erfolgt hauptsächlich über die InlA – E-Cadherin Interaktion.

InlB spielt keine direkte Rolle, kann aber die Funktion von InlA unterstützen (Disson

et al., 2008). Weitere für die Invasion unterstützende Faktoren sind das

Virulenzprotein in Listeriavirulenz (Vip), das eisenbindende Vorläuferprotein (FbpA)

und Internalin J (InlJ) (Cabanes et al., 2005; Dramsi et al., 2004; Lecuit et al., 2007).

Aufgrund der Speziesspezifität der Internalin A - E-Cadherin Interaktion sind Mäuse

resistent gegenüber einer oralen Listerieninfektion. Durch Generierung einer

transgenen Maus, welche humanes E-Cadherin auf der Oberfläche von Enterozyten

exprimiert, konnte die Rolle des InlA bei der Überquerung der intestinalen Barriere

bestätigt werden (Lecuit et al., 2001). Des Weiteren hat die Murinisierung des

Internalin A das invasive Potential von Listeria monocytogenes in oral infizierten

Mäusen erhöht (Wollert et al., 2007b). Listeria monocytogenes kann somit direkt in

Epithelzellen eintreten (InlA-abhängig) aber auch über die M-Zellen der Peyer´schen

Plaque (InlA-unabhängig) (MacDonald und Carter, 1980) die intestinale Barriere

durchqueren.

Listeria monocytogenes besitzt auch die Fähigkeit die Plazentaschranke zu passie-

ren. Während einer Schwangerschaft erhöht sich das Risiko einer Frau an einer

Listeriose zu erkranken um den Faktor 18 (Southwick und Purich, 1996). Dabei spielt

die physiologische Unterdrückung der zellulär vermittelten Immunantwort während

einer Schwangerschaft, durch die veränderte hormonelle Situation, eine entschei-

dende Rolle (Pung et al., 1985; Weinberg, 1984). Diese schützt den Fetus vor der

Abstoßung, erhöht aber auch die Anfälligkeit für intrauterine Infektionen (Redline et

al., 1988; Redline und Lu, 1987; Redline und Lu, 1988). Experimentell konnte gezeigt

werden, dass in der Endphase einer Schwangerschaft von Mäusen die T-Zell-

vermittelte Eliminierung von Listeria monocytogenes aus der Plazenta verzögert ist.

Dies korreliert mit einer Invasion der Plazenta und des fetalen Gewebes bedingt

durch eine geringere IFN-γ, IL-2 und TNF-α Produktion durch einen erhöhten Östro-

genspiegel (Nakane et al., 1985; Salem et al., 1999). Für die Überquerung der

Plazentaschranke spielen die Interaktionen der Oberflächenproteine InlA und InlB mit

Einleitung

17

ihren Rezeptoren E-Cadherin und c-Met eine entscheidende Rolle. In schwangeren

Meerschweinchen, welche für die InlB-c-Met-Interaktion defizient sind, konnte

demonstriert werden, dass die Durchquerung der plazentalen Barriere Internalin A

unabhängig erfolgen kann (Bakardjiev et al., 2004; Bakardjiev et al., 2005). Jedoch

sind für die effektive Invasion der humanen Plazenta beide intakte InlA- und InlB-

Wege nötig (Lecuit et al., 2004; Lecuit et al., 2009). Auch konnte in schwangeren

Mäusen, defiziente InlA – E-Cadherin – Interaktion, die Bedeutung des InlB für die

Invasion der Plazenta nach intravenöser und oraler Infektion mit Listeria

monocytogenes beschrieben werden (Abram et al., 1997; Abram et al., 2003;

LeMonnier et al, 2006; Poulsen et al., 2011). In in vitro Versuchen mit humanen

Trophoblasten, ein Modell mit intakten InlA und InlB Interaktionswegen, konnte

gezeigt werden, dass nach einer Infektion mit Listerienmutanten für InlA oder InlB

und für die Doppelmutante die Effizienz der Plazentainfektion verringert war (Lecuit

et al., 2004). Dies konnte in der Rennmaus (Gerbillinae), ein Tiermodell für intakte

InlA- und InlB-Wege, bestätigt werden (Disson et al., 2008).

Listeriose geht einher mit einer Infektion des zentralen Nervensystems (ZNS) beim

Menschen als auch bei Nutztieren. Dabei kann Listeria monocytogenes das Gehirn

auf vielfältige Weise erreichen. Beschrieben wurde die hämatogene Streuung der

Bakterien, welche dann direkt in die Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke

eindringen können (Drevets et al., 2004). Dabei wird eine Beteiligung von InlA und

InlB nicht ausgeschlossen. Obwohl Neuronen in der Regel N-Cadherin exprimieren,

welches nicht mit InlA interagiert, konnte exprimiertes E-Cadherin bei primären sen-

sorischen Mausneuronen nachgewiesen werden (Shimamura et al., 1992). InlA-

Mutanten sind ebenfalls weniger effizient bei der Infektion von kultivierten dorsalen

Wurzelganglion-Neuronen (Dons et al., 1999). Der InlB-Rezeptor c-Met wird auf einer

Reihe von Zellen des zentralen Nervensystems exprimiert (Jung et al., 1994; Maina

et al.; 1997). Es konnte gezeigt werden, dass über die InlB–c-Met–Interaktion Listeria

monocytogenes in humane mikrovaskuläre Hirnendothelzellen eindringen kann

(Greiffenberg et al., 1998). Eine Alternative zur Rezeptor-vermittelten Invasion ist die

Durchquerung der Blut-Hirn-Schranke innerhalb infizierter Makrophagen, dem

sogenannten „Trojanischen Pferd“-Modell (Drevets et al., 1993; Drevets, 1999;

Einleitung

18

Drevets et al., 2008; Drevets und Bronze, 2008). Es konnte in vitro nachgewiesen

werden, dass Listeria monocytogenes effizienter über Zell-Zell-Ausbreitung

Neuronen infizieren kann als über eine direkte Invasion (Dramsi et al., 1998). Auch

eine mögliche interne Infektionsquelle könnten persistierende infizierte Monozyten

aus dem Knochenmark sein. Nach intravenöser Infektion von BALB/c und CD1

Mäuse wurde beobachtet, dass listerieninfizierte Makrophagen im Knochenmark

persistieren können (Hardy et al., 2009). Eine weitere Möglichkeit das zentrale

Nervensystem zu infizieren, kann über den neuralen Transport von Listeria

monocytogenes erfolgen und wurde schon früh beschrieben (Asahi et al., 1952;

Dons et al., 2007). Der intraaxonale Transport von Listerien konnte in Schafen nach

der Infektion direkt in die Zahnpulpa bestätigt werden, als sechs von 21 Tieren

neurologische Zeichen entwickelten (Barlow und McGorum, 1985). In einem weiteren

Experiment wurden in die Kranialnerven oder in fasziale Muskeln von Mäusen

Listerien injiziert und klinische und histologische Zeichen einer Rhombenzephalitis

beobachtet (Antal et al., 2001). Eine mögliche natürliche Eintrittspforte für diese Art

der Infektion könnten, gerade bei Wiederkäuern, Verletzungen der Mundschleimhaut

sein, welche dann wiederholt durch kontaminierte Silage Listeria monocytogenes

ausgesetzt sind.

1.5.4 Grundlegende Mechanismen der Immunabwehr von Listeria

monocytogenes

Bevor Listeria monocytogenes in den Fokus geriet, über kontaminierte Nahrungs-

mittel Infektionen auszulösen, war es schon ein Modellorganismus zur Untersuchung

der angeborenen und erworbenen Immunantwort. Im Mausmodell konnte beschrie-

ben werden, dass das Pathogen innerhalb von Makrophagen überleben und sich

vermehren kann. Die primäre Infektion mit dem Bakterium induziert eine zellulär

vermittelte Immunantwort (Mackaness, 1962). Antikörper spielen dabei keine Rolle.

Von dieser Entdeckung ausgehend folgten weitere Studien, die den Mechanismus

der zellulär vermittelten Immunantwort weiter untersuchten (Mackaness, 1964;

Mackaness, 1969). Eine subletale Infektion der Maus löst eine starke Immunantwort

des angeborenen und erworbenen Immunsystems aus.

Einleitung

19

Die angeborene Immunantwort spielt in der frühen Phase der Listerieninfektion eine

entscheidende Rolle (Corr und O`Neill, 2009; Stavru et al., 2011). Gerade neutro-

phile Granulozyten sind wichtig, um die bakterielle Ausbreitung und Vermehrung

durch Produktion antimikrobieller Wirkstoffe zu kontrollieren (Rogers und Unanue

1993; Brinkmann et al., 2004). Sie werden schnell durch ausgestoßenes IL-6 zum

Infektionsherd rekrutiert und führen selbst durch die Produktion vom Monozyten

koloniestimulierenden Faktor (CSF-1) und dem Monozyten chemotaktischen Protein

(CCL2) zur Einwanderung von Makrophagen (Guleria und Pollard, 2001; Mandel und

Cheers, 1980). Als Antwort darauf produzieren diese TNF-α und IL-12, welche

Natürliche Killerzellen zur Freisetzung von Interferon-gamma (IFN-γ) anregen

(Havell, 1987; Tripp et al., 1993), was wiederum weitere Makrophagen aktiviert.

Durch die neutrophil bedingte Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies erfolgt die

durch Makrophagen bedingte Eliminierung von Listeria monocytogenes.

Inflammatorische Zytokine sind wichtig für die Kommunikation der beteiligten

Immunzellen. Besonders IFN-γ spielt eine Hauptrolle. So zeigten sich IFN-γ-

Rezeptor-defiziente (Ifngr1-KO) Mäuse als besonders empfindlich für eine

Listerieninfektion (Huang et al., 1993). Auch ist bekannt, dass Listeria

monocytogenes Typ-I-Interferone, welche bei der antiviralen Immunantwort beteiligt

sind, induzieren kann. Jedoch wirken IFN-Typ-I begünstigend auf die Listerien wäh-

rend einer Infektion ein. IFN-I-Rezeptor defiziente Mäuse zeigten sich resistent

gegenüber einer Listerieninfektion (Auerbuch et al., 2004; Carrero et al., 2004;

O`Connell et al., 2004).

Die listerielle Infektion von Makrophagen aktiviert zwei Wege der Genexpression

(McCaffrey et al., 2004). Zum einen die Gene der Typ-I-Interferone, wofür Listeria

monocytogenes frei im Zytoplasma vorliegen muss und zum anderen erfolgt über

Toll-like-Rezeptoren (TLR) die Aktivierung der NF-κB Kaskade mit nachfolgender

Genexpression von Zytokinen. TLRs sind auf der Oberfläche von Zellen und auf der

Membran endozytotischer Vesikel zu finden. Sie erkennen diverse Strukturen von

Listeria monocytogenes wie Flagellin (TLR-5), DNA (TLR-9), Lipoteichonsäure und

Peptidoglykan (TLR-2). TLRs rekrutieren Adaptermoleküle wie z.B. MyD88 (über

TLR-2), welches wiederum über weitere Signalwege den Transkriptionsfaktors NF-κB

Einleitung

20

aktiviert (Edelson und Unanue, 2002). Neben den Toll-like-Rezeptoren spielen auch

NOD-like-Rezeptoren (NLR) eine Rolle, wovon einige die Funktion als intrazelluläre

Erkennungsmoleküle für Listeria monocytogenes übernehmen (Warren et al., 2008).

Die am besten untersuchten NLRs sind NOD2 und NALP3. NOD2 führt zur

Aktivierung von NF-κB und des MAPK Signalweges. NALP3 aktiviert Kaspase-1 und

führt zur Sekretion von IL-1β und IL-18 (Bohn et al., 1998; Mariathasan et al., 2006).

Die Zellen des erworbenen Immunsystems bestehen aus B- und T-Zellen. Die adap-

tive Immunantwort bei Listeria monocytogenes Infektionen ist schnell und T-Zell

bedingt. CD4- sowie CD8-positive T-Zellen vermitteln eine schützende Immunität.

Beiden Zelltypen wird spezifisch über Wirtsmechanismen Listeria monocytogenes

Antigene präsentiert (Pamer, 2004; Zenewiez und Shen, 2007). Auf jeder kern-

haltigen Zelle sind MHC-Klasse-I Moleküle exprimiert. Während der Infektion mit

Listerien werden Listerien-spezifische Peptide auf MHC-Klasse-I Moleküle geladen

und den CD8+ T-Zellen präsentiert (Lara-Tejero und Pamer, 2004). Die sich daraus

ergebende Immunität erfolgt zum einen über die Sekretion von IFN-γ und führt

dadurch zur Aktivierung von Makrophagen und zum anderen zur Lyse infizierter

Zellen und der Freisetzung intrazellulärer Bakterien, welche dann von aktivierten

Makrophagen eliminiert werden. Antigenpräsentierende Zellen wie Dendritische

Zellen, B-Zellen und Makrophagen tragen dagegen MHC-Klasse-II-Moleküle auf ihrer

Oberfläche und präsentieren Bakterienantigene den CD4+ T-Zellen (Lara-Tejero und

Pamer, 2004). Diese differenzieren sich weiter zu TH-1 Zellen, welche mit der

Sekretion von TH-1 Zytokinen zur Eliminierung von Listeria monocytogenes

beitragen (Hsieh et al., 1993). Des Weiteren spielen regulatorische CD4+ T-Zellen

eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der CD8+ T-Zell Proliferation während einer

erneuten Listerieninfektion (Kursar et al., 2002). Die humoral vermittelte Immunität

durch B-Zellen ist von geringer Bedeutung. Nach einer Infektion mit Listerien erfolgt

nur eine schwache Antikörperproduktion gegen Listeriolysin. Diese schützt nicht vor

einer Reinfektion mit Listeria monocytogenes, kann aber in Interaktion mit

Makrophagen Listeriolysin neutralisieren (Edelson und Unanue, 2001).

Dendritische Zellen sind häufig Vermittler zwischen der angeborenen und erwor-

benen Immunantwort (Medzhitov, 2001). Sie induzieren eine starke CD4 und CD8 T-

Einleitung

21

Zell Antwort, welche dann auch eine stabile Population von listerienspezifischen Ge-

dächtnis-T-Zellen hervorbringt.

1.6 Studien der in vivo Infektion

1.6.1 Tiermodelle zur Analyse listerialer Infektionsmechanismen

Verschiedene Spezies sind empfänglich für die Infektion mit Listeria monocytogenes.

Nach der Entdeckung des Pathogen 1924, durch die Auslösung einer Monozytose

und bakteriellen Sepsis bei Labortieren, Meerschweinchen und Kaninchen (Murray et

al., 1926), konnte das Bakterium aus verschiedenen Wirten isoliert werden. So iso-

lierte nur ein Jahr später Pirie (Pirie, 1927) Listeria monocytogenes aus der Leber

von Rennmäusen. Die Listeriose als Erkrankung bei landwirtschaftlichen Nutzieren,

wie Schafen und Rindern, wurde ebenfalls schon früh als „circling disease“ beschrie-

ben (Gill, 1937; Mathews, 1928). Weiter folgten die Entdeckungen der perinatalen

Infektion beim Menschen sowie die Auslösung von Aborten bei Schafen und Rindern

als Folge einer Listerieninfektion (Burn, 1936; Biester et al., 1939; Biester und

Schwarte, 1940; Biester und Schwarte, 1941; Graham et al., 1943; Poppensiek,

1944). Verschiedene Versuchstiere wurden als Wirt für Listeria monocytogenes ver-

wendet. Kaninchen und Rennmäuse zeigten sich als sehr empfänglich für

Listerieninfektionen. Hier konnten nach der Infektion Sepsis und in schwangeren

Tieren Aborte festgestellt werden (Kautter et al., 1959; Kautter et al., 1963). Die In-

fektion von Ratten und Meerschweinchen über Aerosole zeigten letale Krankheits-

verläufe (Kautter et al., 1959). Die subkutane Infektion von Kaninchen führte zu

lokalen Abszessen (Bloom, 1928). Hamster (Nordland, 1960) und Ratten erwiesen

sich jedoch als resistent gegenüber einer Listerieninfektion (Gray, 1958) ebenso wie

Katzen und Hunde. Als Infektionsmodelle haben sich daher neben der Maus noch

Meerschweinchen, Kaninchen und Rennmäuse als geeignet erwiesen. Meer-

schweinchen und Kaninchen gehören zu den natürlichen Wirten (Murray et al.,

1926). Beim Meerschweinchen konnte zuerst die Invasion von Listeria mono-

cytogenes in nicht-phagozytierende Zellen, wie Enterozyten, gezeigt werden (Racz et

al., 1972). Aufgrund der speziesspezifischen InlA-E-Cadherin Interaktion sind sie

Einleitung

22

empfänglich für orale Infektionen. Ebenso können nach einer Infektion von schwan-

geren Tieren mit Listeria monocytogenes perinatale Infektionen und Aborte ausgelöst

werden. Jedoch zeigten sich Meerschweinchen resistenter eine effiziente Infektion

des ZNS zu generieren aufgrund des Mangel einer effizienten Interaktion von InlB mit

seinem Rezeptor c-Met (Khelef et al., 2006). Meerschweinchen und Kaninchen sind

als Model für die Überquerung der intestinalen Barriere sowie Plazentaschranke ge-

eignet (Bakardjiev et al., 2004). Die Rennmaus ist von Natur aus empfänglich für

beide Interaktionswege, InlA und InlB. Nach oraler Listerieninfektion konnte gezeigt

werden, dass beide Wege für die Überquerung der Plazentaschranke ein Rolle spie-

len (Disson et al., 2008; Disson et al., 2009). Auch gibt es Untersuchungen des

Infektionsprozesses von Listeria monocytogenes im Zebrafisch (Danio rerio). Die

intravenöse Injektion in die Larve resultiert in fatalen Infektionen (Levraud et al.,

2009). Untersuchungen der Listerieninfektion bei Insekten, z.B. Drosophila

melanogaster, erlaubt die Unterscheidung von pathogenen und nicht-pathogenen

Listerienstämmen (Jensen et al., 2007). Infektionen von Galleria mellonella dienten

der Charakterisierung der angeborenen Immunabwehr (Mukherjee et al., 2010).

1.6.2 Mausmodelle zur Analyse listerialer Infektionsmechanismen

Aufgrund einer ausgesprochenen Vielfalt diverser Mausstämme und der einfachen

und kostengünstigen Haltung als Labortier bleibt häufig die Maus das Versuchstier

der ersten Wahl. Frühe Experimente mit intraperitonealen Infektionen von Listeria

monocytogenes zeigten septische Verläufe (Seeliger und Plab, 1959). Zur Analyse

von ZNS Infektionen wurde die intrazerebrale Injektion etabliert (Kautter et al., 1959),

welche zu Meningitis und Enzephalitis führte. Weiter wurden Mäuse über Aerosole

infiziert, welches in einer hohen Sterblichkeit resultierte (Dediè, 1955). Das erste

Mausmodell zur Untersuchung der Immunantwort nach einer Listerieninfektion wurde

von Mackaness 1962 etabliert. Es wurde gezeigt, dass nach intravenöser Infektion

von Mäusen Listeria monocytogenes innerhalb von Makrophagen persistieren und

überleben kann. Außerdem induziert eine primäre Listerieninfektion eine schützende

zellulär vermittelte Immunität (Mackaness, 1962). Dies konnte über den Transfer

lymphoider Milzzellen einer mit Listeria monocytogenes infizierten Maus in eine

uninfizierte Maus demonstriert werden, welche vor einer nachfolgenden

Einleitung

23

Listerieninfektion geschützt war (Mackaness, 1969). Weitere Studien folgten, die die

Resistenz und Empfänglichkeit von Mausstämmen gegenüber intravenöser Listeria

monocytogenes Infektionen untersuchten (McKenzie und Cheers, 1978; Skamene

und Kongshavn, 1979). Sie zeigten, dass C57BL Mäuse und verwandte Unter-

stämme resistent gegenüber einer Listerieninfektion reagieren und andere Mausin-

zuchtstämme wie A/J, BALB/c, CBA, C3H und 129 sich empfindlich verhalten. Über

die Generierung rekombinanter Inzuchtlinien aus A/J und C57BL/6J konnten zwei

Regionen im Genom lokalisiert werden, welche das bakterielle Wachstum kontrollie-

ren (Gervais et al, 1984). Eine Defizienz für das C5 Komplementfaktorgen (Hc) in A/J

Mäusen erhöht ihre Empfindlichkeit gegenüber Infektionen mit Listeria mono-

cytogenes (Gervais et al, 1984). Die Suszeptibilität der A/J und Resistenz der

C57BL/6J Mäuse konnte auch nach intragastrischer Infektion bestätigt werden

(Czuprynski und Faith, 2002). Auch das Geschlecht der jeweiligen Versuchstiere hat

Einfluss auf den Ausgang einer Listerieninfektion. So konnte gezeigt werden, dass

weibliche Mäuse empfindlicher reagieren als männliche (Pasche et al., 2005). Die

Infektion von Mäusen mit Listeria monocytogenes kann intravenös, intraperitoneal,

subkutan und oral erfolgen. Jedoch sind für die orale Infektion von Mäusen hohe

Dosen erforderlich, um eine systemische Erkrankung auszulösen. Dies beruht auf

einer speziesspezifischen Bindung von Internalin A an E-Cadherin. (siehe Abschnitt

1.5.1.) Zur Untersuchung der Bedeutung der InlA-E-Cadherin-Interaktion bei der

Überquerung der intestinalen Barriere wurde eine transgene Maus generiert. Diese

exprimiert humanes E-Cadherin unter Kontrolle des Promotors für das intestinale

Fettsäurebindungsprotein neben murinem E-Cadherin auf den Enterozyten des

Dünndarms (Lecuit et al., 2001, Lecuit und Cossart, 2002). Mit Hilfe dieser Maus

konnte die Rolle des InlA bei der Überquerung der Darmbarriere geklärt werden.

Dieses Modell hat seine Grenzen, es kann nicht die Rolle des E-Cadherins bei ande-

ren Zelltypen, außer Enterozyten, und somit die Überquerung anderer epithelialer

Barriere beschreiben. Nachfolgend wurde die knock-in Maus „E16P“ generiert. Alle

Zellen dieser Maus exprimieren durch den Austausch von Glutamin zu Prolin an der

Position 16 des Maus-E-Cadherins humanes E-Cadherin anstelle von murinem E-

Cadherin (Disson et al., 2008). Weiter wurde die Rolle der InlA-E-Cadherin-Inter-

aktion bei der Überquerung der Plazentaschranke untersucht. Die Infektion von

Einleitung

24

schwangeren knock-in Mäusen zeigte eine Abhängigkeit von InlA und InlB (Disson et

al., 2008).

Die entgegengesetzte Möglichkeit zur humanen Maus ist die Murinisierung von

Listeria monocytogenes (Wollert et al., 2007b). Wie in Abschnitt 1.5.1 ausführlich

beschrieben, erhöht der Austausch der Aminosäuren S192N-Y369S innerhalb des

Internalins die Bindungsaffinität zu humanen und murinem E-Cadherin. Dieses Mo-

dell erlaubt die orale Infektion mit Listeria monocytogenes in den verschiedensten

Mausinzuchtstämmen und Maus-knock-out Linien.

1.7 In vivo Imaging

1.7.1 Das Prinzip der Biolumineszenz

Biolumineszenz ist ein lichtemittierender, chemischer Prozess und in einer Vielzahl

wirbelloser Tiere verbreitet. Verschiedene Reportergene wie die Glühwürmchen Lu-

ziferase (DeLuca und McElroy, 1974), Renilla Luziferase (Matthews et al., 1977) und

die Photorhabdus luminescens Luziferase (Hastings und Nealson, 1977) wurden

charakterisiert. Die am häufigsten für Biolumineszenz-Imaging verwendete Luzi-

ferase entstammt Photinus pyralis, dem Glühwürmchen (firefly Luziferase). Als Sub-

strat dient Luziferin, welches in Abhängigkeit von ATP und Sauerstoff und unter

Emission von Licht, mit einem Emissionsmaximum von 560 nm, zu Oxyluziferin oxi-

diert wird. Bei einigen Infektionsmodellen ist die Luziferase im Genom von Tieren

integriert und benötigt die Zugabe des Substrats von außen. Das emittierte Licht ist

von starker Intensität, jedoch ist die Lichtreaktion zeitlich limitiert und stark

sauerstoffabhängig. Fünf Gene in einem Operon codieren für Proteine die

gemeinsam an einem Biosyntheseweg beteiligt sind, der über enzymatische Katalyse

zur Freisetzung von Licht führt. Die Gene luxCDE codieren für eine

Fettsäurereduktase, welche in die Synthese von Fettaldehyd involviert ist. Dies dient

als Substrat für die Lichtreaktion, welche durch eine Luziferase, kodiert durch luxAB,

katalysiert wird. Reduziertes Flavinmononukleotid und langkettiges Fettsäurealdehyd

wird unter Emission von blau-grünem Licht (490 nm) oxidiert. Lux-Operons von

Bakterien codieren sowohl für das Enzym als auch für das Substrat für die

Einleitung

25

Lichtreaktion, Flavinmononukleotid und Sauerstoff sind in jedem aeroben Bakterium

enthalten. Dieses Reportersystem hat den Vorteil, dass es die Stabilität der

Lichtproduktion erhöht (Doyle et al., 2004).

1.7.2 Die Technologie des in vivo Imaging

Für in vivo Imaging sind verschiedene Systeme wie z.B. Computertomografie, Rönt-

genstrahlung, Ultraschall (MRT) und Positronen-Emissions-Tomografie (PET)

erhältlich. Biolumineszenz-Imaging ist eine weitere Alternative und dient im

Besonderen der Beobachtung infektiöser Prozesse. Mit der Isolierung und Charakte-

risierung diverser Luziferasen (DeLuca und McElroy, 1974; Gates und DeLuca, 1975;

Hastings und Nealson, 1977; Matthews et al., 1977; McElroy und DeLuca, 1983)

erfolgte auch deren Verwendung in der wissenschaftlichen Forschung. Erstmals

wurde E. coli 1985 mit dem Lux-Operon transformiert (Engebrecht et al., 1985). Für

die Markierung von Zellen und Geweben oder die Analyse von Genexpressionen und

der Untersuchung der Wirts-Pathogen-Interaktion wurden die Reportergene des

bakteriellen Luziferase Operons in das Genom von Bakterien, Zelllinien oder Tieren

integriert. Im Jahr 1995 wurde die photonische Detektion von mikrobiologischen

Krankheitserregern beschrieben (Contag et al., 1995). In den letzten Jahren wurde

diese Technik zur Herstellung rekombinanter Mikroorganismen, im Besonderen

Krankheitserreger, zur Untersuchung von Infektionsprozessen verwendet. Eine Viel-

zahl biolumineszenter Pathogene wie z.B. Salmonella enterica (Burns-Guydish et al.,

2005), Staphylococcus aureus (Francis et al., 2000), Streptococcus pneumonia

(Francis et al., 2001), Herpes-simplex-virus Typ I (Luker et al., 2002) und Listeria

monocytogenes (Hardy et al., 2004; Riedel et al., 2007; Monk et al., 2010) wurden

entwickelt, um den Verlauf einer Infektion im Versuchstier zu untersuchen.

Das in vivo Biolumineszenz-Imaging (BLI) ist eine nicht invasive, hochsensitive

Methode, welche Echtzeitaufnahmen zum Infektionsverlauf des ganzen lebenden

Tieres erlaubt (Contag et al., 2002; Contag et al., 2008). Die Methode wird ver-

wendet, um Pathogene in lebenden Organismen zu lokalisieren und ihre Ausbreitung

durch die inneren Organe des Versuchstiers zu dokumentieren. Das emittierte Licht

der Pathogene wird durch das Gewebe transmittiert und generiert Lichtpunkte auf

Einleitung

26

der Oberfläche des Tieres. Diese werden über eine CCD Kamera (cooled coupeld

device) detektiert. Aufgrund einer Kühlung der Kamera ist es möglich störendes

Wärmerauschen zu reduzieren. Das System analysiert die Werte und stellt mit Hilfe

von Falschfarben die Intensität des Lichtes in einem Bild dar. Die Daten werden als

Photonen/s/cm2/sr dargestellt, wobei sich sr (Steradian/Raumwinkel) auf die Pho-

tonen von einem festen Winkel der Sphäre beziehen. Die Sensitivität vom BLI ist von

verschiedenen Faktoren abhängig, von der Stärke des generierten Signals, der An-

zahl der Zellen, welche die Reportergene exprimieren, von der Effizienz der Re-

portergene und vom Gewebetyp sowie von der Gewebetiefe der biolumineszenten

Lichtquelle. Mittlerweile sind Biolumineszenz-Imaging Systeme mit weiteren

Methoden, z.B. CT, gekoppelt (CaliperLS).

1.7.3 In vivo Imaging von Listeria monocytogenes Infektionen in der Maus

Eine allgemeine Methode ist es Luziferasegene mit Hilfe von Transposons in das

Genom von Listerien zu integrieren. Dies erfordert daraufhin potenzielle Klone auf

ihre Biolumineszenzstärke zu untersuchen (Hardy et al., 2004). Jedoch kann die

Insertion des Lux-Operons andere Gene wie z.B. Virulenzgene inaktivieren. Zur

Beobachtung von Genexpressionen, wurde ein synthetisches Lux-Operon generiert,

welches über einen chromosomalen Integrationsvektor pPL2lux ins Genom von

Listerien integriert wurde (Riedel et al., 2007). Die Verwendung von BLI im Falle von

Listeria monocytogenes führte zu neuen Entdeckungen in dessen Pathogenese und

Wirts-Pathogen-Interaktion. Nach der Infektion von Mäusen mit biolumineszenten

Listeria monocytogenes in geringer und hoher Infektionsdosis konnte beobachtet

werden, dass diese innerhalb der Gallenblase persistieren und extrazellulär

replizieren (Hardy et al., 2004). Diese Beobachtung beschreibt eine Möglichkeit von

Listeria monocytogenes sich asymptomatisch und vom Immunsystem unerkannt im

Wirt zu vermehren. Über die Sekretion von Gallensäure kann sich das Pathogen in

den Darm ausbreiten und somit als Infektionsquelle für neue Wirte dienen oder zur

Reinfektion des alten Wirtes führen (Hardy et al., 2006). Eine andere Arbeit zeigte,

dass nach intravenöser Infektion von Listeria monocytogenes in Mäuse diese im

Knochenmark persistieren und eine Quelle für Infektionen des zentralen Nerven-

systems darstellen können (Hardy et al., 2009).

Einleitung

27

Einige verschiedene biolumineszente und auch fluoreszierende Listerienstämme sind

beschrieben worden, welche sich für ein Imaging von Infektionsprozessen in vivo

eignen (Andersen et al., 2006; Balestrino et al., 2010; Bron et al., 2008; Hardy et al.,

2004; Monk et al., 2010; Riedel et al., 2007). Zur Untersuchung der Invasion von

Listeria monocytogenes wurde der Lmo ScottA Stamm (Serovar 4b) mit verschie-

denen Fluoreszenzfarbstoffen markiert ohne die Virulenz der modifizierten Stämme

zu beeinflussen. Dies ermöglicht Co-Infektionen diverser markierter Listeria mono-

cytogenes Stämme und erlaubt die Visualisierung und Identifikation einzelner

Listerien auf zellulärer Ebene mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie (Andersen et al.,

2006). Zur Analyse des Infektionsprozesses unter dem Einfluss verschiedener Viru-

lenzfaktoren wurden diverse Mutanten von LmoEGDe mit verschiedenen Fluores-

zenzmarkern markiert, welche durch Integrationsvektoren in das Genom von Listeria

monocytogenes integriert wurden (Balestrino et al., 2010). Hardy et al. verwendeten

für Analysen den Listerienstamm LmoXen32 (als Serovar 2c klassifiziert), welcher

durch genetische Modifikation ausgehend von Listeria monocytogenes 10403S

(Serovar 1/2a) hergestellt worden war. Listeria monocytogenes 10403S wurde mit

dem Plasmid pAUL-A Tn4001 luxABCDE KmR transformiert. Hier erfolgte die chro-

mosomale Integration der lux-Kassette in den Promotor des Flagellin A Gens (flaA)

(Hardy et al., 2004).

Eine Alternative sind die biolumineszenten Abkömmlinge des LmoEGDe. Mit Hilfe

des Integrationsvektors pPL2, welcher ein PSA (Prophage LmoScott A) Listerio-

phagen Integrase Gen und eine DNA-Bindungsstelle enthält, kann die zielgerichtete

Integration einer einzelnen DNA-Kopie in das tRNAArg-Gen von Listeria mono-

cytogenes erfolgen (Lauer et al., 2002). Der Vektor pPL2lux, ein Abkömmling von

pPL2, enthält das synthetische Operon luxABCDE. Dies kodiert zum einen für einen

Fettsäurereduktasekomplex (LuxCDE) und zum anderen für eine Luziferase (LuxAB)

zur Katalyse der Biolumineszenzreaktion. Bron et al. fusionierten luxABCDE mit

secA- und hlyA-Promotoren und integrierte mit Hilfe des pPL2lux Vektors eine ein-

zelne Kopie ins tRNAArg-Gens des Chromosoms von Listeria monocytogenes zur

Generierung von LmoEGDe-lux (Bron et al., 2006). Nachfolgend testeten Riedel et

al. mit Hilfe des pPL2lux Vektors verschiedene Promotoren auf deren Bio-

Einleitung

28

lumineszenzexpressionrate in Listeria monocytogenes (Riedel et al., 2007). Der Lis-

terienstamm LmoEGDe-mur (Monk et al., 2010) wurde über die Einbringung von

zwei Internalin A Modifikationen (S192N, Y369S) murinisiert. Durch Integration des

Lux-Operons mit Hilfe des Integrationsvektors pIMK2lux in die 3`Region der tRNAArg

erfolgte die Generierung des LmoEGDe-lux-mur, welcher die orale Infektion im

Mausmodell für die Untersuchung der Wirt-Pathogen-Interaktion erlaubt (Monk et al.,

2010). Die genetische Modifikation erfolgte mit Hilfe des pIMK Vektors, ein Derivat

des pPL2 Vektors. Dieser erlaubt zielgerichtet die chromosomale Mutagenese über

Integration und Rekombination des gewünschten DNA-Abschnittes (Lauer et al.,

2002; Monk et al., 2008).

1.8 Konzept und Fragestellung der vorliegenden Dissertation

Zahlreiche vorherige Arbeiten konnten die wichtige Funktion des Internalin A für die

Invasion von Listeria monocytogenes in intestinale Epithelzellen und das Durch-

brechen der Darmbarriere nach der oralen Infektion zeigen. Zu Beginn dieser Arbeit

zeigten Wollert et al. (Wollert et al., 2007b), dass durch gezielte genetische Modi-

fikation des inlA-Locus von Listeria monocytogenes ein sogenannter „murinisierter“

Listerienstamm generiert werden kann, der ein modifiziertes Internalin A Protein

exprimiert, welches mit hoher Affinität an den murinen E-Cadherin Rezeptor binden

kann. Dieser modifizierte Listerienstamm (Lmo-InlAm) exprimiert ein Internalin A

(InlAS192N-Y369S) indem im Vergleich zum Wildtyp nur zwei Aminosäuren ausgetauscht

worden sind. Dieser Listerienstamm zeigte in vivo im Vergleich zum Wildtyp eine

wesentliche höhere Invasionseffizienz bei der Überquerung der intestinalen

Wirtsbarriere (Wollert et al., 2007b). Dadurch wurde ein neues orales

Listerieninfektionsmodell in der Maus etabliert, mit welchem Pathomechanismen der

Listeriose nach der Infektion von Mäusen über den natürlichen Infektionsweg studiert

werden können. Die Arbeit von Wollert et al. hat offen gelassen ob das modifizierte

Internalin A auch für die Überquerung anderer epithelialer Barrieren im Wirt wichtig

ist.

Einleitung

29

Ziel meiner Arbeit war es, basierend auf der Arbeit von Wollert et al. ein Mausmodell

zu generieren in dem mit Hilfe von Biolumineszenz-Imaging die Ausbreitung Inter-

nalin A modifizierter Listerien nach oraler Infektion genauer analysiert werden kann.

Folgende Fragestellungen lagen der Arbeit zugrunde:

1) Zeigen murinisierte Lmo-InlAm Bakterien eine veränderte Dissemination im Orga-

nismus nach oraler Inokulation im Vergleich zum nicht modifizierten, isogenen

Wildtyp?

2) Eignet sich das Verfahren des in vivo Biolumineszenz-Imaging (BLI) um die Aus-

breitung Lux-Operon exprimierender Listerien im Wirtsorganismus der Maus nicht

invasiv zu analysieren? Wie sensitiv ist dieses Verfahren und welche Bakterien-

konzentrationen müssen in verschiedenen Organen erreicht werden um eine

Infektion über BLI zu delektieren?

3) Spielt das veränderte (murinisierte) Internalin A eine Rolle bei der Überquerung

der Blut-Hirn-Schranke? Vorangegangene Arbeiten haben spekuliert, dass die

Interaktion von Internalin A mit E-Cadherin auch für das Eindringen von Listerien

in das zentrale Nervensystem wichtig sein könnten. Der murinisierte Listerien-

stamm erlaubt es diese Fragestellung in verschiedenen Mausinzuchtstämmen

nachzugehen.

4) Spielt der genetische Hintergrund des Wirts eine Rolle für die Empfindlichkeit

gegenüber der oralen Listerieninfektion und Ausprägung der Listeriose? Dieser

Fragestellung kann durch gezielte Analyse verschiedener Mausinzuchtstämme

im oralen Listerieninfektionsmodell nachgegangen werden. Murinisierte Listerien-

stämme erlauben es Mausinzuchtstämme unabhängig von der Präsenz eines

transgenen, humanisierten E-Cadherin Alleles zu untersuchen. Verschiedene

Mausinzuchtstämme könnten auch unterschiedliche Resistenzen für die Trans-

mission der Listerien in das zentrale Nervensystem zeigen. Falls es hier Unter-

schiede zwischen Mausstämmen gibt, wäre ein resistenter und empfindlicher

Mausstamm für ein weiteres Studium von Mechanismen zerebraler Listeriose

und der damit verbundenen Meningoenzephalitis sehr wichtig.

Einleitung

30

Im Detail sollten die Mausinzuchtstämme BALB/cJ, C57BL/6J, C3HeB/FeJ und

A/JOlaHsd auf die Wirt-Pathogen-Interaktion untersucht werden, um Einblicke in die

genetisch kontrollierte Resistenz zu erhalten. Dabei soll zum einen die Virulenz der

Listerienstämme berücksichtigt werden und zum anderen der genetische Hintergrund

der verschiedenen Mausinzuchtlinien. Für die BLI-Analysen mit dem Xenogen IVIS

200 System wurden die Listerienstämme LmoXen32, LmoXen32-mur, LmoEGDe-lux

und LmoEGDe-lux-mur verwendet, wobei die Stämme LmoXen32-mur und

LmoEGDe-lux-mur die Internalin A S192N-Y369S optimierten Mutanten darstellen.

Der Stamm LmoXen32-mur wurde von mir selbst genetisch verändert werden, um

eine murinisierte Variante zu generieren. Die schon biolumineszenten Listerien-

stämme LmoEGDe-lux und LmoEGDe-lux-mur wurden von Dr. Gahan Cormac

(University College Cork, Cork, Irland) freundlicherweise für die Analysen zur Verfü-

gung gestellt.

Ergebnisse

31

2 Ergebnisse

2.1 Murinisierung der Listerienstämme Listeria monocytogenes 10403S

Xen32 und LO28

Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein Mausmodell für das in vivo Bio-

lumineszenz-Imaging (BLI) oraler Infektionen mit Listeria monocytogenes etabliert.

Grundlage war die Generierung eines murinisierten und biolumineszenten Listerien-

stamms. Die Infektion mit Listeria monocytogenes beruht auf einer ausgeprägten

Speziesspezifität (Lecuit et al., 1999). Somit entsprechen Mäuse nicht dem natür-

lichen Wirt von Listerien und sind für die orale Infektion nicht geeignet. Die voran-

gegangene Arbeit von Wollert et al. zeigte, dass der Aminosäureaustausch an den

Positionen S192N-Y369S des Oberflächenproteins Internalin A von Listeria mono-

cytogenes die Bindungsaffinität zu seinem Rezeptor E-Cadherin erhöht (Wollert et

al., 2007b). Weiter resultierten diese Modifikationen in der Aminosäuresequenz

ebenfalls in einer Verstärkung der Bindungsaffinität zu Maus-E-Cadherin. Dies

erhöhte die Empfänglichkeit von Mäusen für die orale Infektion mit diesem genetisch

modifizierten Listerienstamm. Ausgehend vom kommerziell zu erwerbenden bio-

lumineszenten Listerienstamm LmoXen32 (CaliperLS; Hardy et al., 2004) erfolgte die

genetische Modifikation (Murinisierung) des Internalin A über den Austausch von

Wildtyp Internalin A mit murinisierten Internalin A (Codon 192: TCT → AAC; Codon

369: TAT → TCA).

Im Rahmen einer Kooperation mit der Abteilung für Molekulare Immunologie (MOLI,

Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung) erfolgte die Murinisierung des Listerien-

stamms LO28, Serotyp 1/2c (Vicente et al., 1985). Listeria monocytogenes LO28

exprimiert aufgrund einer „nonsense“ Mutation im inlA Gen ein verkürztes Internalin

A von 63 kilo Dalton (kDa) (Jonquieres et al., 1998). Als Folge dieser Mutation wird

Internalin A nicht auf der Zellwandoberfläche von LO28 exprimiert, sondern das

Protein unter Zellkulturbedingungen in den Zellüberstand sekretiert (Jonquieres et

al., 1998). Eine weitere Konsequenz des verkürzten Internalin A ist die geringere

Invasionsrate von LO28 in epitheliale Zelllinien im Vergleich zu anderen Listerien-

Ergebnisse

32

stämmen, welche funktionsfähiges Internalin A exprimieren (Roldgaard et al., 2009).

Jedoch konnte gezeigt werden, dass während der Infektion von Makrophagen mit

LO28 eine erhöhte IFN-β-Synthese induziert wurde im Vergleich zur Infektion mit

Listeria monocytogenes EGDe (Reutterer et al., 2008). Dieser Befund konnte in vivo

im Mausmodell bestätigt werden (Solodova et al., 2011). Um der Fragestellung

nachzugehen ob eine „Murinisierung“ des Internalin A von LO28 mit einer zusätzlich

erhöhten IFN-β-Produktion im Wirt verbunden ist, wurde auch ein murinisierter LO28

Stamm hergestellt (LO28-mur).

Die generierten Listerienstämme LmoXen32-mur und LO28-mur wurden auf die

genetische Veränderung des inlA-Locus, die Expression der Oberflächenproteine

Internalin A und Internalin B und auf die Invasion in humanen und murinen Zellen in

vitro analysiert. Dies diente als Voraussetzung für dann später erfolgte Analysen im

Mausmodell.

2.1.1 Ergebnisse der Transformation

Der Listerienstamm LO28 sowie der biolumineszente Stamm Listeria monocytogenes

Xen32 (CaliperLS) wurden mit dem Plasmid pAUL-A-inlAm-inlB (S192N: TCT →

AAC; Y369S: TAT → TCA) (freundlicherweise von Dr. Wolf-Dieter Schubert, Ab-

teilung der Strukturbiologie, Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, zur Ver-

fügung gestellt) transformiert. Aufgrund eines aus Bacillus subtilis stammenden

temperatursensitiven Replikationsoperons (ts rep) (Gryczan et al., 1982; Youngman

et al., 1983) kann keine extrachromosomale Replikation des Plasmides bei 42°C

erfolgen (Chakraborty et al., 1992). Nach der Transformation des Plasmids in

Listerien integrieren homologe Sequenzen des Vektors über Rekombination in das

Genom von LmoXen32 und LO28 und es erfolgte der Austausch der DNA-Abschnitte

von Wildtyp InlA mit dem murinisierten InlA. Eine erfolgreiche Transformation konnte

mittels Erythromycin selektioniert werden. Mit Verlust der vektorcodierten

Antibiotikaresistenz wurde die homologe Rekombination angezeigt. Von den nach

der Transformation und induzierten Integration erhaltenen Klonen zeigten ca. 1/10

einen Verlust der Antibiotikaresistenz (siehe Material/Methoden 5.1.2). Um zu

analysieren ob in diesen Fällen eine homologe Rekombination erfolgte, wurden

Ergebnisse

33

jeweils acht Klone ausgewählt und auf Sequenzunterschiede der genomischen DNA

in den modifizierten Listerienstämmen untersucht.

2.1.2 Validierung der homologen Rekombination des murinisierten Internalin A

Jeweils acht Klone wurden auf die korrekte Integration von inlAm-inlB ins Genom von

LmoXen32-mur und LO28-mur über die Bestimmung der inlA-Sequenz untersucht.

Über Amplifizierung mittels PCR und anschließender Sequenzierung des kompletten

inlA-Locus konnte die homologe Rekombination und damit die gewünschte Verände-

rung des inlA Leserasters bestätigt werden. Ein Repräsentant der erfolgreich modi-

fizierten Listeria monocytogenes Stämme LmoXen32-mur und LO28-mur ist in Ab-

bildung 2-1 dargestellt.

Die Untersuchung der inlA-Sequenz, des in der vorangegangenen Arbeit von Wollert

et al. generierten murinisierten Listerienstamms LmoEGDe S192N-Y369S

(LmoEGDe-mur) (Wollert et al., 2007b) sowie dessen Wildtyp LmoEGDe, diente zum

Vergleich der DNA- und Proteinsequenz. An Condonposition 192 des murinisierten

Internalin A erfolgte die Substitution des Tripletts TCT zu AAC. Dies führte in der

Proteinsequenz zum Austausch der Aminosäure Serin zu Asparagin an der Position

192 (Abbildung 2-1 A). An Codonposition 369 des inlA erfolgte die Substitution des

Tripletts TAT zu TCA, welches innerhalb der Proteinsequenz an Position 369 zum

Austausch von Tyrosin zu Serin führte (Abbildung 2-1 B). Parallel erfolgte die

Analyse der Sequenz des kompletten inlA-Locus der Wildtypstämme LmoXen32 und

LO28 zur Überprüfung der korrekten Integration über homologe Rekombination von

inlAm-inlB ins Genom von LmoXen32-mur und LO28-mur.

Ergebnisse

34

A

B

Abbildung 2-1: Darstellung der Sequenzen des DNA Abschnittes von inlA und der ent-sprechenden codierenden Proteinsequenzen in den genetisch modifizierten Listerien-stämmen. (A) DNA-Sequenzen des inlA-Locus an der Codon-Position 192 und die entsprechende Proteinsequenz der Listerienstämme LmoEDGe, LmoEGDe S192N-Y369S (LmoEGDe-mur) (Wollert et al., 2007b), LmoXen32, LmoXen32 InlA S192N-Y369S (LmoXen32-mur), LO28 und LO28 S192N-Y369S (LO28-mur). In den murinisierten Varianten erfolgte im Genom der Austausch des Codons TCT zu AAC (orange). Dies führte innerhalb des Proteins zur Amino-säuresubstitution von Serin (S) zu Asparagin (N) an der Position192 (blau). (B) DNA-Sequenzen des inlA-Locus an Codon-Position 369 und die entsprechende Proteinsequenz der Listerienstämme LmoEDGe, LmoEGDe S192N-Y369S (LmoEGDe-mur), LmoXen32, LmoXen32 InlA S192N-Y369S (LmoXen32-mur), LO28 und LO28 S192N-Y369S (LO28-mur). In den murinisierten Varianten erfolgte im Genom der Austausch des Codons TAT zu TCA (orange) und führte innerhalb des Proteins zur Aminosäuresubstitution von Tyrosin (Y) zu Serin (S) an Position 369 (blau). Symbollegende: * konservierte Bereiche; . und : zeigen erfolgte Substitutionen; : an den Codon-Positionen 192 und 369.

Proteinsequenz

Listerienstamm

LmoEGDe 180 ALSGLTSLQQ LSFGNQVTDL KPLANLTTLE RLDISSNKVS DISVLAKLTN LmoXen32 180 ALSGLTNLQQ LSFGNQVTDL KPLANLTTLE RLDISSNKVS DISVLAKLTN LO28 180 ALSGLTSLQQ LSFGNQVTDL KPLANLTTLE RLDISSNKVS DISVLAKLTN LmoEGDe-mur 180 ALSGLTSLQQ LNFGNQVTDL KPLANLTTLE RLDISSNKVS DISVLAKLTN LmoXen32-mur 180 ALSGLTSLQQ LNFGNQVTDL KPLANLTTLE RLDISSNKVS DISVLAKLTN LO28-mur 180 ALSGLTSLQQ LNFGNQVTDL KPLANLTTLE RLDISSNKVS DISVLAKLTN ******.*** *:******** ********** ********** **********

Proteinsequenz

Listerienstamm

LmoEGDe 350 ISDISPVSSL TKLQRLFFYN NKVSDVSSLA NLTNINWLSA GHNQISDLTP LmoXen32 350 ISDISPVSSL TKLQRLFFYN NKVSDVSSLA NLTNINWLSA GHNQISDLTP LO28 350 ISDISPVSSL TKLQRLFFYN NKVSDVSSLA NLTNINWLSA GHNQISDLTP LmoEGDe-mur 350 ISDISPVSSL TKLQRLFFSN NKVSDVSSLA NLTNINWLSA GHNQISDLTP LmoXen32-mur 350 ISDISPVSSL TKLQRLFFSN NKVSDVSSLA NLTNINWLSA GHNQISDLTP LO28-mur 350 ISDISPVSSL TKLQRLFFSN NKVSDVSSLA NLTNINWLSA GHNQISDLTP ********** ********:* ********** ********** **********

DNA-Sequenz

Listerienstamm

LmoEGDe 550 GTTTAACTAG TCTACAGCAA TTATCTTTTG GTAATCAAGT GACAGATTTA LmoXen32 550 GTTTAACTAA TCTACAGCAA TTATCTTTTG GTAATCAAGT GACAGATTTA LO28 550 GTTTAACTAG TCTACAGCAA TTATCTTTTG GTAATCAAGT GACAGATTTA LmoEGDe-mur 550 GTTTAACTAG TCTACAGCAA TTAAACTTTG GTAATCAAGT GACAGATTTA LmoXen32-mur 550 GTTTAACTAG TCTACAGCAA TTAAACTTTG GTAATCAAGT GACAGATTTA LO28-mur 550 GTTTAACTAG TCTACAGCAA TTAAACTTTG GTAATCAAGT GACAGATTTA *********. ********** ***:::**** ********** **********

DNA-Sequenz

Listerienstamm

LmoEGDe 1090 AAAGATTATT TTTCTATAAT AACAAGGTAA GTGACGTAA GCTCACTTGCG LmoXen32 1090 AAAGATTATT TTTCTATAAT AACAAGGTAA GTGACGTAA GCTCACTTGCG LO28 1090 AAAGATTATT TTTCTATAAT AACAAGGTAA GTGACGTAA GCTCACTTGCG LmoEGDe-mur 1090 AAAGATTATT TTTCTCAAAT AACAAGGTAA GTGACGTAA GCTCACTTGCG LmoXen32-mur 1090 AAAGATTATT TTTCTCAAAT AACAAGGTAA GTGACGTAA GCTCACTTGCG LO28-mur 1090 AAAGATTATT TTTCTCAAAT AACAAGGTAA GTGACGTAA GCTCACTTGCG ********** *****::*** ********** ********* ***********

Ergebnisse

35

2.1.3 Analysen der Internalin A und Internalin B Expression in genetisch modi-

fizierten Listerienstämmen

Die Oberflächenproteine InlA und InlB sind gemeinsam innerhalb eines Genclusters

im Genom von Listeria monocytogenes codiert und unterliegen beide der Kontrolle

des Regulatorproteins PrfA (de las Heras et al., 2011). Aufgrund der Hauptfunktion

von Internalin A und Internalin B bei der Invasion nicht-phagozytierender Zellen

(Seveau et al., 2007) ist die korrekte Expression beider Oberflächenproteine von

großer Bedeutung. Durch genetische Veränderung von inlA könnte die Expression

beider Invasionsproteine betroffen sein, da die Expression beider Gene von einem

gemeinsamen Operon gesteuert ist. Nachdem die korrekte Intergration des Plas-

mides pAUL-A-inlAm-inlB ins Genom von LmoXen32 und LO28 und damit die Gene-

rierung des genetisch modifizierten Listerienstamms LmoXen32-mur sowie LO28-

mur bestätigt werden konnte, erfolgte die Analyse der Expression der Oberflächen-

proteine InlA und InlB in den genetisch veränderten Listerienstämmen über die

Durchführung eines Western-Blots. Internalin A ist im Falle von LmoXen32 über eine

kovalente Bindung in der Zellwand verankert, während Internalin B nicht-kovalent

über Lipoteichonsäure an die bakteriellen Zellwand gebunden ist. Aus diesem Grund

erfolgte die Analyse von InlA in Trichloressigsäure präzipitierten Zellwandextrakt und

der Nachweis von InlB im Zellkulturüberstand. Der Nachweis beider Proteine erfolgte

über Western-Blot-Analyse mit monoklonalen Antikörpern gegen InlA und InlB (Ab-

bildung 2-2). Das Aktin-bindende Protein A (ActA) wird von einem anderen Operon

im Listeriengenom codiert. Seine Expression erfolgt unabhängig von inlA und inlB

(Vazquez-Boland et al., 2001) wird aber auch in vivo über das Regulatorprotein PrfA

kontrolliert (Mengaud et al., 1991). Daher erfolgte der Nachweis der Protein-

expression des Aktin-bindenden Protein A als Ladekontrolle.

Ergebnisse

36

Abbildung 2-2: Ergebnis der Analyse der Proteinexpression von Internalin A und Inter-nalin B in genetisch veränderten Listerienstämmen. Proteinextrakte nach Trichloressigsäurepräzipitation der murinisierten Listerienstämme und ihre isogenen Wildtyp-Ausgangsstämme wurden in einem 10%igen Polyacrylamidgel aufge-trennt und über Immunoblot analysiert. Westernblotanalyse für Internalin A zeigt die Position (Pfeil) von InlA mit einer erwarteten Fragmentgröße von 88 kDa. Westernblotanalyse für Internalin B zeigt die Position (Pfeil) von InlB mit einer erwarteten Fragmentgröße von 65 kDa. Westernblotanalyse für ActA zeigt die Position (Pfeil) von ActA mit einer erwarteten Fragmentgröße von 90 kDa. Gel gefärbt mit Comassie Blue. M = Molekulargewichtsmarker (97, 66, 45, 31, 21 und 14 kDa). LmoXen32 = Wildtyp L. monocytogenes Xenogen Stamm, LmoXen32-mur = murinisierter L. monocytogenes Xenogen Stamm, LmoEGDe = Wildtyp L. monocytogenes Stamm, LmoEGDe-mur = murinisierter L. monocytogenes Stamm (Wollert et al., 2007b). Je ein repräsentatives aus mindestens zwei durchgeführten Experimenten ist dargestellt.

Ergebnisse

37

Zum einen wurde der murinisierte Listerienstamm LmoXen32-mur und der ent-

sprechende isogene Wildtyp LmoXen32 auf die Expression von InlA, InlB und ActA

untersucht und zum anderen erfolgte zusätzlich die Analyse der Proteinexpression

des in der vorangegangenen Arbeit von Wollert et al. generierten murinisierten

Listerienstamms LmoEGDe S192N-Y369S (LmoEGDe-mur) (Wollert et al., 2007b)

sowie dessen Wildtyp LmoEGDe im Vergleich. Die erwarteten Molekulargewichte

lagen bei InlA bei 88 kDa, bei InlB 65 kDa und bei ActA 90 kDa (Lingenau et al.,

1995). Die Analyse der Proteinexpression zeigte, dass sämtliche getesteten

Listerienstämme InlA in der Zellwand exprimieren. Jedoch ist InlA in den ver-

schiedenen Listerienstämmen unterschiedlich stark exprimiert. LmoXen32 und

LmoXen32-mur zeigten eine schwächere Expression als LmoEGDe und LmoEGDe-

mur. Ebenso konnte die Expression von InlB in den Zellüberständen aller Listerien-

stämmen nachgewiesen werden, zeigte aber ebenfalls eine schwächere Expression

in LmoXen32 und LmoXen32-mur im Vergleich zu den EGDe-Listerienstämmen. Als

Kontrolle für die Proteindegradation und die relativ geladene Proteinkonzentration

wurde ein Western-Blot für das Aktin-bindende Protein A durchgeführt. Die Ex-

pression des Proteins ActA erfolgt unabhängig von der Expression der Invasions-

proteine InlA und InlB. Jedoch unterliegen alle der Regulation durch PrfA (de las

Heras et al., 2011). Es wurde jedoch beobachtet, dass ActA in LmoXen32 und

LmoXen32-mur stärker exprimiert wurde. Die korrekte Expression beider Internaline

diente als Voraussetzung für den späteren in vivo Vergleich von murinisierten

Listerienstämmen mit ihrem isogenen Wildtyp im Mausmodell.

Die Expression der Proteine Internalin B und ActA konnte im generierten Listerien-

stamm LO28-mur sowie dessen Wildtyp LO28 ebenfalls nachgewiesen werden.

Während der Murinisierung des LO28 Stammes erfolgt die homologe Rekombination

des inlA-Locus und es kommt somit zum Austausch des verkürzten InlA mit einem

murinisierten funktionsfähigen InlA. Die Expression des Oberflächenproteins Inter-

nalin A konnte weder in LO28 noch LO28-mur nachgewiesen werden (Daten nicht

gezeigt).

Ergebnisse

38

2.1.4 Analyse der murinisierten Listerienstämme im Invasions-Assay

Wie bereits beschrieben, erhöht die Murinisierung des InlA die Bindungsaffinität zu

humanen und murinen E-Cadherin (Wollert et al., 2007b). Durch die Interaktion

beider Moleküle wird die Invasion in nicht-phagozytierende Zellen induziert. Zur

Analyse ob eine verstärkte Aufnahme der murinisierten Listerienstämme aufgrund

einer erhöhten Bindungsaffinität zum Rezeptor erfolgt, wurde ein Gentamycin-

Invasions-Assay (Elsinghorst, 1994) zum einen in Caco-2 Zellen (Abbildung 2-3) und

zum anderen in CT-26 Zellen (Abbildung 2-4) durchgeführt (siehe Material/Methoden

5.3). Die humane Colonkarzinom-Zelllinie Caco-2 zeigt unter Zellkulturbedingungen

ähnliche Eigenschaften wie Enterozyten (Rousset, 1986). Es erfolgt die für intestinale

Epithelzellen typische Polarisierung in eine apikale und basolaterale Domäne,

welche über die Expression von E-Cadherin auf der Zelloberfläche gekennzeichnet

ist. Somit sind Caco-2 Zellen für die Analyse der Internalisation von Listeria mono-

cytogenes geeignet (Mengaud et al., 1996b). Für die Untersuchung der Invasion in

murinen Zellen wurde die Colonkarzinom-Zelllinie CT-26 verwendet. CT-26 Zellen

wurden erstmals aus BALB/c Mäusen isoliert, welche zur Tumorinduktion

chemotherapeutisch behandelt wurden (Corbett et al., 1975). Sie haben das

Erscheinungsbild undifferenzierter Fibroblasten und zeigen unter Kulturbedingungen

keine Kontakt-Wachstumshemmung (Brattain et al., 1980). In Studien konnte jedoch

gezeigt werden, dass sie als Invasionsmodell für die Aufnahme von Listerien in nicht-

phagozytierende murine Zellen geeignet sind (Monk et al., 2010).

Untersucht wurde die Invasionsrate der murinisierten Listerienstämme LmoXen32-

mur und LO28-mur sowie von deren unmodifizierten Wildtyp-Stämmen LmoXen32

und LO28 in Caco-2 und CT-26 Zellen. Parallel erfolgte die Analyse der von Wollert

et al. generierten murinisierten Listerien LmoEGDe S192N-Y369S (LmoEGDe-mur)

(Wollert et al., 2007b) sowie dessen Wildtyps LmoEGDe im Invasions-Assay zum

Vergleich. Eine Stunde nach der Infektion mit 2x106 koloniebildenden Einheiten

(CFU) Listerien (MOI 10:1) erfolgte die Behandlung mit Gentamycin zur Abtötung

aller extrazellulär vorliegender Bakterien. Somit wurden nur die intrazellulär vorhan-

denen und replizierenden Listerien erfasst. Die Invasion der murinisierten Varianten

Ergebnisse

39

von LmoXen32, LO28 und LmoEGDe in Caco-2 Zellen sind in Abbildung 2-3 im

Vergleich zum entsprechenden Wildtyp dargestellt.

Es konnten keine signifikanten Unterschiede in der Invasion von Caco-2 Zellen nach

der Infektion von LmoXen32 und LmoXen32-mur sowie nach der Infektion von

LmoEGDe und LmoEGDe-mur festgestellt werden. Die Invasion von LO28-mur

zeigte eine deutliche Erhöhung der Invasionsrate in Caco-2 Zellen um das Zehn- bis

Hundertfache im Vergleich zum Wildtyp LO28. Die natürliche Mutation im inlA Gen

von LO28 führt zu einer Verschiebung im Leserahmen und zu einem „nonsense“

Codon an Position 575. Daraus resultiert eine eingeschränkte Funktion des InlA

(Jonquieres et al., 1998). Die Invasion in epitheliale Zellen ist demnach geringer als

die anderer Listerienstämme, welche ein funktionsfähiges InlA exprimieren. Während

der Murinisierung des LO28 Stammes erfolgt die homologe Rekombination des

kompletten inlA-Locus und es kommt somit zum Austausch des verkürzten InlA mit

murinisiertem funktionsfähigen InlA.

Abbildung 2-3: Aufnahme genetisch veränderter Listerienstämme in Caco-2 Zellen. Die Aufnahme von (A) LmoXen32 und LmoXen32-mur, (B) LO28 und LO28-mur sowie (C) LmoEGDe und LmoEGDe-mur in Caco-2 Zellen nach der Infektion mit einer Dosis von 2x106 CFU Bakterien (MOI 10:1). Nach einer Stunde wurden extrazellulär vorliegende Bakterien mit einer Gentamycinbehandlung (100 µg/ml) abgetötet. Die Anzahl intrazellulärer Bakterien wurde stündlich über das Ausplattieren von Zelllysaten auf BHI-Agarplatten quantifiziert. Die Invasion von LO28 im Vergleich zur murinisierten Variante LO28-mur zeigte signifikante Un-terschiede. Die Bestimmung der intrazellulären Listerien erfolgte in Triplikaten und ist als Mittelwert mit Standardfehler (SEM) dargestellt. Statistische Signifikanzen zwischen murinisierten und den entsprechende nicht-murinisierten Stämmen sind abgebildet (***p<0.001, ****p<0,0001; nicht-parametrischer Mann-Whitney-U-Test). Gezeigt ist ein repräsentatives Ergebnis aus drei durchgeführten Experimenten.

Ergebnisse

40

Dieser Funktionszugewinn („gain of function“) resultiert in einer signifikant höheren

Invasionsrate des LO28-mur im Vergleich zu seinem Wildtyp LO28.

Die Infektion von CT-26 Zellen erfolgte ebenfalls mit LmoXen32, LmoXen32-mur,

LO28, LO28-mur, LmoEGDe und LmoEGDe-mur (Abbildung 2-4). Die Aufnahme von

LmoXen32 und LmoXen32-mur in CT26-Zellen ergab, wie schon bei der Invasion

von Caco-2 Zellen, keine signifikanten Unterschiede (Abbildung 2-4 A). Bei der In-

fektion mit den Listerienstämmen LmoEGDe und LmoEGDe-mur zeigte die murini-

sierte Variante eine höhere Invasionsrate im Vergleich zum unveränderten Wildtyp-

stamm (Abbildung 2-4 C). Hier konnte eine Verstärkung der Aufnahme um den Fak-

tor zehn beobachtet werden. Die Invasion von LO28-mur in CT-26 Zellen resultierte

ebenfalls in einer zehnfach höheren Rate im Vergleich zum Wildtyp LO28.

Abbildung 2-4: Aufnahme genetisch veränderter Listerienstämme in CT-26 Zellen. Die Aufnahme von (A) LmoXen32 und LmoXen32-mur, (B) LO28 und LO28-mur sowie (C) LmoEGDe und LmoEGDe-mur in CT-26 Zellen nach der Infektion mit einer Dosis von 2x106 CFU Bakterien (MOI 10:1). Nach einer Stunde wurden extrazellulär vorliegende Bakterien mit einer Gentamycinbehandlung (100 µg/ml) abgetötet. Die Anzahl intrazellulärer Bakterien wurde stündlich über das Ausplattieren von Zelllysaten auf BHI-Agarplatten quantifiziert. Die Invasion von LO28-mur und LmoEGDe-mur im Vergleich zu den nicht-murinisierten Wild-typen zeigte signifikante Unterschiede. Die Bestimmung der intrazellulären Listerien erfolgte in Triplikaten und ist als Mittelwert mit Standardfehler (SEM) dargestellt. Statistische Signifikanzen zwischen murinisierten und den entsprechende nicht-murinisierten Stämmen sind dargestellt (*p<0,05. **p<0,01, ***p<0.001, ****p<0,0001; nicht-parametrischer Mann-Whitney-U-Test). Gezeigt ist ein repräsentatives Ergebnis aus drei durchgeführten Experimenten.

Ergebnisse

41

Es konnte gezeigt werden, dass die Invasionsrate des murinisierten Listerienstamms

LO28-mur in die humane Zelllinie Caco-2 sowie in die murine Colonkarzinom-Zelllinie

CT-26 im Vergleich zu LO28 signifikant erhöht sind. LmoEGDe-mur zeigte nur bei

der Invasion in murine Zellen einen deutlichen Unterschied im Vergleich zum

isogenen Wildtyp.

2.2 Vergleich der Wirtsspezifität und Virulenz des genetisch modi-

fizierten LmoXen32-mur mit dessen Wildtyp

Aufgrund der Anpassung des Internalin A an seinen murinen Rezeptor sollte jeder

Mausstamm für die orale Infektion mit murinisierten Listerien empfänglich sein. Zur

Beurteilung der Virulenz des generierten murinisierten Listerienstamms LmoXen32-

mur wurde im in vivo Mausmodell die Überlebensrate nach oraler Infektion in aus-

gewählten Mausinzuchtstämmen untersucht. Des Weiteren erfolgte die Bestimmung

der bakteriellen Keimlast in den inneren Organen nach der Infektion von LmoXen32-

mur für die Analyse der Invasionseffizienz und Replikation im Vergleich zum Wildtyp

LmoXen32.

2.2.1 Überlebenszeiten nach der Infektion mit LmoXen32 und LmoXen32-mur

in ausgewählten Mausinzuchtstämmen

Für die Bestimmung der Überlebensrate wurden die Mausinzuchtstämme C57BL/6J,

129P2/Ola, BALB/cJ und C3HeB/FeJ verwendet. In vorangegangenen Studien der

intravenösen und oralen Infektion mit Listeria monocytogenes konnte gezeigt wer-

den, dass sich C57BL/6J Mäuse resistent gegenüber einer Listerieninfektionen ver-

halten (Cheers et al., 1978; Cheers und McKenzie, 1978; Czuprynski et al., 2002,

Czuprynski et al., 2003; Iizawa et al., 1994). Dagegen zeigten sich andere Mausin-

zuchtstämme, darunter BALB/cJ und C3HeB/FeJ, empfänglicher für eine Infektion

mit Listeria monocytogenes (Archinal und Wilder, 1988; Cheers und Stanley, 1988:

Mainou-Fowler, 1988; Munder et al., 2005). Die Ursachen für eine gesteigerte Sus-

zeptibilität betreffen meist Komponenten des angeborenen und erworbenen Immun-

systems (Zenewicz und Shen, 2007).

Ergebnisse

42

Je zehn Weibchen von C57BL/6J, 129P2/Ola, BALB/cJ und C3HeB/FeJ wurden im

Alter von zehn Wochen mit einer Infektionsdosis von 1x1010 CFU LmoXen32-mur

oral infiziert. Über einen Zeitraum von zehn Tagen erfolgte täglich die Dokumentation

des Gesundheitszustandes, der Überlebensrate und des Körpergewichtes als

Indikator für den Verlauf der Infektion (Abbildung 2-5 A, B).

Abbildung 2-5: Überlebensraten und Verlauf der Körpergewichte ausgewählter Mausinzuchtstämme nach oraler Infektion mit LmoXen32-mur. Je zehn C57BL/6J, 129P2/Ola, BALB/cJ und C3HeB/FeJ Weibchen wurden im Alter von zehn Wochen mit 1x1010 CFU LmoXen32-mur oral infiziert. (A) Die Analysen der Über-lebensraten zeigten bei 129P2/Ola eine Überlebensrate von 90%, während bei C57BL/6J, BALB/cJ und C3HeB/FeJ alle Tiere überlebten. Insgesamt zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in der Überlebensrate (Logrank Test p=0,6566). (B) Darstellung der Mittelwerte der Körpergewichte von C57BL/6J, 129P2/Ola, BALB/cJ und C3HeB/FeJ Mäusen in Prozent und deren Standardfehler (SEM). Der Verlauf des Körpergewichtes zeigte bei den C3HeB/FeJ Mäusen eine erhöhte Infektionssuszeptibilität im Vergleich zu den anderen analysierten Mausinzuchtstämmen. Der Gewichtsverlust am Tag 0 der Infektion resultierte durch Futterentzug am vorangegangenen Tag als Vorbehandlung für die nachfolgenden oralen Infektionen. Nach intragastraler Inokulation mit LmoXen32-mur hatten die Mäuse wieder uneingeschränkten Futterzugang.

Die Mausinzuchtstämme C57BL/6J, BALB/cJ und C3HeB/FeJ zeigten eine Über-

lebensrate von 100%, während 129P2/Ola Mäuse eine Überlebensrate von 90%

aufwiesen (Abbildung 2-5 A). Es konnten keine signifikanten Unterschiede der Über-

lebensraten festgestellt werden (Logrank-Test, p=0,6566). Die Analyse des Verlaufs

des Körpergewichtes ergab bei den C3HeB/FeJ Mäusen die größte Änderung. Die

Zunahme des Körpergewichtes erfolgte erst ab Tag sechs nach der Infektion,

während die C57BL/6J, 129P2/Ola und BALB/cJ Mäuse bereits ab Tag vier nach der

Infektion wieder Gewicht zunahmen. Parallel zur Dokumentation von Körpergewicht

und Überlebensrate erfolgte täglich das in vivo Imaging auf die emittierten Signale

Ergebnisse

43

des biolumineszenten Listerienstamms LmoXen32-mur in den infizierten Mäusen mit

Hilfe des Xenogen in vivo Imaging System (IVIS) 200 (Abbildung 2-6).

Abbildung 2-6: In vivo Imaging von oral infizierten Mausinzuchstämmen mit LmoXen32-mur. Je zehn C57BL/6J, 129P2/Ola, BALB/cJ und C3HeB/FeJ Weibchen wurden im Alter von zehn Wochen mit 1x1010 CFU LmoXen32-mur oral infiziert. Das Biolumineszenz-Imaging (BLI) erfolgte zwei Stunden (h) bis zehn Tage (d) nach der Infektion mit Hilfe des Xenogen IVIS 200 Imaging System. C3HeB/FeJ, BALB/cJ und 129P2/Ola Mäuse zeigten Signale in der Gallenblase und im Darmbereich. Je ein repräsentatives Tier jedes Mausinzucht-stammes ist über den Zeitraum von zehn Tagen abgebildet. Als Kontrolle erfolgte das BLI eines uninfizierten Tieres. Falschfarbenüberlagerung repräsentiert das emittierte Signal von LmoXen32-mur in vivo nach 4 min Integrationszeit in Photonen/s/cm2/sr, Skala rechts.

Als repräsentatives Tier jedes Inzuchtstammes wurde ein Individuum der Gruppe

(n=10) über den Versuchszeitraum von zehn Tagen dargestellt. Zwei Stunden nach

der Infektion konnten inokulierte Listerien im Magen-Darm-Bereich detektiert werden.

An den Tagen eins und zwei nach der Infektion war aufgrund der Ausbreitung der

Bakterien über den Darm, durch partielle Ausscheidung der Listerien oder durch die

Elimination über die Immunabwehr keine Detektion von LmoXen32-mur möglich. Am

Tag drei und vier post Infektion wurden Listerien im Darmbereich und in der Gallen-

Ergebnisse

44

blase von BALB/cJ und 129P2/Ola Mäusen nachgewiesen. Ab Tag fünf nach der

Infektion konnte auch in der Gallenblase und im abdominalen Bereich der

C3HeB/FeJ Mäuse Listerien detektiert werden. Innerhalb dieser Organe waren die

Bakterien bis Tag sechs und sieben, in C3HeB/FeJ Mäusen bis zum Tag acht, nach

der Infektion detektierbar. In C57BL/6J Mäusen konnten ab dem Tag eins nach der

Infektion keine spezifischen Biolumineszenzsignale nachgewiesen werden. Durch

Einsetzen der adaptiven Immunantwort ab Tag sieben nach der Infektion erfolgte die

Rekonvaleszenz und die Biolumineszenz konnte nachfolgend nicht mehr detektiert

werden. Die einzelnen Inzuchtstämme wiesen Unterschiede in der Detektierbarkeit

der Biolumineszenzsignale von LmoXen32-mur auf. In unpigmentierten bzw. wenig

pigmentierten Mäusestämmen wie BALB/cJ und 129P2/Ola waren die

Biolumineszenzsignale der Listerien gut detektierbar. Dagegen war in pigmentierten

Mäusen, wie C3HeB/FeJ und C57BL/6J, aufgrund der dunklen Fellfärbung und der

Pigmentierung der Haut die Detektion der Biolumineszenz reduziert.

Die orale Infektion der Mausinzuchtstämme C57BL/6J, 129P2/Ola, BALB/cJ und

C3HeB/FeJ mit LmoXen32-mur resultierte in geringen Unterschieden in der Infek-

tionssuszeptibilität. C57BL/6J erwiesen sich als resistent, dagegen zeigten sich die

C3HeB/FeJ aufgrund eines starken Gewichtsverlustes und 129P2/Ola durch eine

geringere Überlebensrate empfindlicher für die Listerieninfektion. Jedoch resultierte

die LmoXen32-mur Infektion in einer geringen Pathologie mit geringerer Mortalitäts-

rate. Wie bei Hardy et al. beschrieben, war die Detektion der Biolumineszenzsignale

auf die Gallenblase und den Abdominalbereich begrenzt (Hardy et al., 2004). Somit

wird deutlich, dass aufgrund der attenuierten Virulenz des LmoXen32-mur ein Ver-

gleich der Wirtsresistenz ausgewählter Mausinzuchtstämme nur bedingt möglich ist,

da alle Mausstämme kaum von der Infektion betroffen waren und LmoXen32-mur gut

abwehren konnten.

2.2.2 Kinetik der in vivo Replikation von LmoXen32 und LmoXen32-mur in

BALB/cJ Mäusen

Die Analyse des BLI in ausgewählten Mausinzuchtstämmen ergab, dass LmoXen32-

mur ein attenuierter Listerienstamm ist und Unterschiede der Suszeptibilität

Ergebnisse

45

ausgewählter Mausinzuchtstämme im in vivo Modell schwer erkennbar sind.

Aufgrund dieser Beobachtung erfolgte die Analyse der bakteriellen Keimlast in den

inneren Organen von BALB/cJ Mäusen (Gruppengröße n=8) nach oraler Infektion mit

LmoXen32-mur im Vergleich zum Wildtypstamm LmoXen32. An den Tagen eins,

drei, fünf und sieben nach der Infektion wurden jeweils acht Tiere für die Analyse

verwendet. Parallel erfolgte die histopathologische Untersuchung der Organe Milz,

Leber und Dünndarm sowie täglich die Dokumentation der Änderungen im Verlauf

des Körpergewichtes und die Detektion der Biolumineszenz aller infizierten Tiere

über das in vivo Imaging.

2.2.2.1 In vivo Imaging von LmoXen32 und LmoXen32-mur infizierten BALB/cJ

Mäusen

Je 36 BALB/cJ Weibchen wurden im Alter von zehn Wochen mit einer Infektions-

dosis von 5x109 CFU LmoXen32 bzw. LmoXen32-mur oral infiziert. Über den Ver-

suchszeitraum von sieben Tagen erfolgte das tägliche Biolumineszenz-Imaging der

BALB/cJ Mäuse mit dem IVIS 200 System (Abbildung 2-7). Eine Stunde nach der

Infektion sind beide Listerienstämme im Magen der Tiere detektierbar. An den Tagen

eins und zwei nach der Infektion war die Detektion des Signals aufgrund der

Dissemination der Bakterien über den Darm und deren Ausscheidung reduziert. Am

Tag drei post Infektion konnten Listerien wieder im Abdominalbereich von

LmoXen32-mur infizierten Tieren nachgewiesen werden. Ab diesem Zeitpunkt sind

Unterschiede zwischen LmoXen32 und LmoXen32-mur erkennbar. LmoXen32 war

weniger detektierbar als die murinisierte Variante und die messbare Verbreitung

begrenzt sich nur auf den Darmbereich. Ab Tag drei nach der Infektion zeigten

LmoXen32-mur infizierte BALB/cJ Mäuse eine stärkere Biolumineszenz im

abdominalen Bereich, im Vergleich zu LmoXen32 infizierten Mäusen. Zusätzlich

konnten an Tag vier und fünf nach der Infektion mit LmoXen32-mur deutliche

Biolumineszenzsignale in der Gallenblase detektiert werden, was eine Akkumulation

und Replikation der Listerien innerhalb des Organs anzeigte. LmoXen32-mur war bei

einzelnen Tieren bis zum Tag sieben nach der Infektion in der Gallenblase und im

Darmbereich detektierbar.

Ergebnisse

46

Abbildung 2-7: Biolumineszenz-Imaging oral infizierter BALB/cJ Mäuse mit LmoXen32 bzw. LmoXen32-mur. Je 36 BALB/cJ Weibchen wurden im Alter von zehn Wochen mit 5x109 CFU LmoXen32-mur oder LmoXen32 oral infiziert. Das BLI erfolgte eine Stunde (h) bis sieben Tage (d) nach der Infektion mit Hilfe des Xenogen IVIS 200 Imaging System. Fünf repräsentative Tiere sind über den Infektionszeitraum von sieben Tagen dargestellt. LmoXen32-mur infizierte Mäuse zeigten Signale in der Gallenblase und im Darmbereich. In LmoXen32 infizierten Mäusen war dieses Signal reduziert. Falschfarbenüberlagerung repräsentiert das emittierte Signal von LmoXen32-mur und LmoXen32 in vivo nach 4 min Integrationszeit in Photonen/s/cm2/sr, Skala rechts.

Ergebnisse

47

Parallel erfolgte die Dokumentation des Körpergewichts von LmoXen32 und

LmoXen32-mur infizierten BALB/cJ Mäusen über den Versuchszeitraum von sieben

Tagen (Abbildung 2-8). Die Analyse des Verlaufs des Körpergewichtes zeigte nach

der Infektion mit LmoXen32-mur signifikante Unterschiede in der Änderung der

Körpermasse der BALB/cJ Mäuse an Tagen drei und vier post Infektion im Vergleich

zur Infektion mit LmoXen32. Eine Zunahme des Körpergewichtes erfolgte ab Tag

drei nach der Infektion sowohl bei den LmoXen32-mur als auch bei den LmoXen32

infizierten BALB/cJ Mäusen. Im folgenden Infektionsverlauf sind keine signifikanten

Unterschiede im Körpergewicht zwischen beiden experimentellen Gruppen mehr

messbar gewesen.

Abbildung 2-8: Verlauf des Körpergewichtes von BALB/cJ Mäusen nach oraler Infek-tion mit 5x109 CFU LmoXen32 und LmoXen32-mur. Zehn Wochen alte BALB/cJ Mäuse wurden mit einer Infektionsdosis von 5x109 CFU LmoXen32 oder LmoXen32-mur oral infiziert. Die Dokumentation des Körpergewichtes er-folgte täglich über den Versuchszeitraum von sieben Tagen. Der Mittelwert der Körper-gewichte (n=8) in Prozent und deren Standardfehler (SEM) sind abgebildet. Die statistischen Signifikanzen im Gewichtsverlauf zwischen murinisierten und den entsprechenden nicht-murinisierten Stämmen sind dargestellt (*p<0.05, nicht-parametrischer Mann-Whitney-U-Test). Der Gewichtsverlust am Tag 0 der Infektion resultierte durch Futterentzug am vorangegangenen Tag als Vorbehandlung für die nachfolgenden oralen Infektionen. Nach intragastraler Inokulation mit LmoXen32-mur hatten die Mäuse wieder uneingeschränkten Futterzugang.

Ergebnisse

48

2.2.2.2 Kinetik der bakteriellen Keimlast in den inneren Organen von LmoXen32 und

LmoXen32-mur infizierten BALB/cJ Mäusen

Zur Untersuchung des Infektionsverlaufs und der Dissemination von Listeria mono-

cytogenes zu den inneren Organen wurden BALB/cJ Mäuse mit jeweils 5x109 CFU

LmoXen32 oder LmoXen32-mur oral infiziert. An den Tagen eins, drei, fünf und sie-

ben nach der Infektion wurden die Organe Milz, Leber, mesenterische Lymphknoten

(mLK), Dünndarm, Gallenblase und Gehirn entnommen und auf die bakterielle

Keimlast untersucht. Zur Bestimmung der Listerienanzahl wurden die Organe in PBS

homogenisiert und serielle Verdünnungen auf BHI-Agarplatten ausgestrichen. In

Abbildung 2-9 sind die Keimlasten der verschiedenen Organe für die Tage drei (A),

fünf (B) und sieben (C) dargestellt. Am Tag drei nach der Infektion zeigten sich nur

geringe Unterscheide in den Keimlasten von LmoXen32 und LmoXen32-mur in den

Organen Milz, Dünndarm, Gehirn und mLK. Signifikante Unterschiede konnten in der

Leber und der Gallenblase nachgewiesen werden. Die Keimlasten von LmoXen32-

mur waren um den Faktor zehn höher als die Keimlasten der LmoXen32 infizierten

Organe (Abbildung 2-9 A). Im Verlauf der Infektion sank die Listerienanzahl in den

inneren Organen Milz, Leber, mLK, Gehirn und Dünndarm von Tag drei auf Tag fünf

um den Faktor zehn, unabhängig vom Listerienstamm. In der Gallenblase erfolgte

dagegen die Zunahme der Listerienanzahl von Tag drei auf Tag fünf nach der

Infektion mit LmoXen32 und LmoXen32-mur um das Zehnfache. Am Tag fünf nach

der Infektion waren signifikante Unterschiede in der Keimlast der mesenterischen

Lymphknoten zwischen LmoXen32-mur und LmoXen32 infizierten Tieren erkennbar

(Abbildung 2-9 B). Alle anderen Organe wiesen keine Unterschiede in der

Listerienanzahl auf. Von Tag fünf auf Tag sieben nach der Infektion reduzierte sich

die Bakterienanzahl im Dünndarm sowie in der Milz und den mLK der LmoXen32

infizierten Mäuse um den Faktor 100. Dagegen konnte keine Reduktion der

bakteriellen Keimlast in den Organen Milz und mLK der LmoXen32-mur infizierten

Tieren festgestellt werden. So konnten am Tag sieben nach der Infektion signifikante

Unterschiede zwischen den Keimlasten beider Bakterienstämme in den mLK und in

der Milz beobachtet werden.

Ergebnisse

49

Abbildung 2-9: Bakterielle Keimlasten in den inneren Organe von BALB/cJ Mäusen nach der oralen Infektion mit LmoXen32 oder LmoXen32-mur. BALB/cJ Mäuse wurden im Alter von zehn Wochen mit 5x109 CFU LmoXen32 und LmoXen32-mur oral infiziert. Die Analyse des bakteriellen Wachstums in den inneren Organen sind für die Tage drei (A), fünf (B) und sieben (C) nach der Infektion für dargestellt (n=8). Die Organe wurden in PBS homogenisiert und in seriellen Verdünnungsstufen auf BHI-Agarplatten ausgestrichen. Die Mittelwerte der bakteriellen Keimlasten und deren Standardfehler (SEM) sind dargestellt. Die statistischen Signifikanzen zwischen LmoXen32 und LmoXen32-mur sind abgebildet (*p<0.05, **p<0.01; nicht-parametrischer Mann-Whitney-U-Test).

Ergebnisse

50

2.2.2.3 Histopathologische Analyse von LmoXen32 und LmoXen32-mur infizierten

BALB/cJ Mäusen

Neben der Analyse der bakteriellen Keimlast erfolgte parallel die histopathologische

und immunhistologische Untersuchung der Organe Milz, Leber und Dünndarm.

Hierzu wurden die Organe an Tag eins, drei, fünf und sieben nach der Infektion prä-

pariert, in Formaldehyd fixiert und mit Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbt. Weiterhin

wurde mit Hilfe immunhistologischer Verfahren versucht Listeria monocytogenes

innerhalb der Gewebe nachzuweisen. Abbildung 2-10 zeigt die histopathologische

Analyse der Leber an Tag fünf nach der oralen Infektion mit 5x109 CFU LmoXen32

und LmoXen32-mur. Sowohl die orale Infektion des Listerienstamms LmoXen32 als

auch von LmoXen32-mur führte zu moderaten Schädigungen des Gewebes mit

Nekrosen und Infiltrationen von Granulozyten und Makrophagen innerhalb des

Leberparenchyms. Der Vergleich der LmoXen32 und der LmoXen32-mur infizierten

Organen wies nur geringe Unterschiede im Schweregrad der Pathologie auf. Die

orale Infektion mit LmoXen32-mur führte vermehrt zu Infiltrationen von Granulozyten

und Makrophagen in der Leber als die Infektion mit LmoXen32. An Tag fünf post

Infektion konnte das größte Ausmaß der Schädigung des Gewebes, in Anzahl der

Nekrosen und Infiltration von Immunzellen, festgestellt werden. Ab Tag sieben nach

der Infektion war sowohl in den LmoXen32 als auch in den LmoXen32-mur infizierten

Organen eine Verringerung der entzündlichen Läsionen aufgrund der geringeren

Anzahl von Nekrosen und Zellinfiltrationen zu beobachten. Mit Hilfe der immun-

histologischen Analyse konnte der Nachweis von LmoXen32-mur und LmoXen32

innerhalb der entzündlichen Infiltrate des Leberparenchyms erbracht werden. Die

histopathologische Analyse der Milz an Tag fünf nach der Infektion führte ebenfalls

zum Nachweis inflammatorischer Läsionen mit Infiltrationen von Makrophagen und

Granulozyten sowohl in den LmoXen32 als auch in den LmoXen32-mur infizierten

Tieren (Daten nicht gezeigt).

Ergebnisse

51

Abbildung 2-10: Histopathologische und immunhistologische Analyse der Leber von oral infizierten BALB/cJ Mäusen mit LmoXen32 und LmoXen32-mur. Zehn Wochen alte BALB/cJ Mäuse wurden mit 5x109 CFU LmoXen32 und LmoXen32-mur oral infiziert. Am Tag fünf nach der Infektion erfolgte die Präparation der Leber und die histologische und immunhistologische Analyse. Die Anzahl der Nekrosen und Infiltrationen von Granulozyten zeigten geringe Unterschiede zwischen den LmoXen32 und den LmoXen32-mur infizierten Organen. (A, B) HE-Färbung und (C, D) anti-Listeria-Färbung der Leber; Pfeile in A und B zeigen Nekrosen und Infiltrationen von Granulozyten, Pfeile in C und D weisen auf Listerien (braun). Balkengröße für alle Abbildungen = 50 µm.

Aufgrund der deutlich attenuierten Virulenz des Listerienstamms LmoXen32-mur

sowie dessen Wildtyps LmoXen32 und der daraus folgenden Schwierigkeit Unter-

schiede in der Wirtsresistenz verschiedener Mausinzuchtstämme nach einer

Listerieninfektion messen zu können, wurden im Folgenden die biolumineszenten

Listerienstämme LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux verwendet.

Ergebnisse

52

2.3 Vergleich der Wirtsspezifität und Virulenz des genetisch

modifizierten LmoEGDe-lux-mur mit dessen Wildtyp

Die Listerienstämme LmoXen32 und LmoXen32-mur zeigten in den voran-

gegangenen Experimenten eine deutlich attenuierte Virulenz. Dies resultierte in einer

Überlebensrate von 100% in BALB/cJ, C3HeB/FeJ und C57BL/6J Mäusen nach

einer oralen Infektion mit 1x1010 CFU sowie bei BALB/cJ Mäusen in einer geringen

Invasion der inneren Organe. Der Stamm LmoXen32 ist ein Derivat des Lmo

10403S. Bei der Generierung von LmoXen32 erfolgte die Integration des Luziferase-

Operons mittels Transposonmutagenese in die Promotorregion des Flagellin A (flaA)

Gens. Dies resultierte in einer vierfach höheren LD50 des LmoXen32 als im Ver-

gleich zu seinem Ursprungsstamm Lmo 10403S (Hardy et al., 2004). Aufgrund dieser

deutlichen Attenuierung wurden die folgenden Experimente mit den Listerien-

stämmen LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux durchgeführt. Diese Listerien-

stämme wurden freundlicherweise von Dr. Gahan Cormac bereitgestellt (Department

of Microbiology, University College Cork, Irland). Zur Generierung des biolumines-

zenten Listerienstamms LmoEGDe-lux erfolgte die Integration einer einzelnen Kopie

der luxABCDE Gene mit Hilfe des pPL2lux Vektors in die 3`Region des tRNAArg-

Gens des Chromosoms von Listeria monocytogenes (Bron et al., 2006; Riedel et al.,

2007). LmoEGDe-mur-lux wurde ausgehend von murinisierten Listerienstamm

LmoEGDe-mur (S192N-Y369S) über die Integration des Lux-Operons mit Hilfe des

Listeriophagen Integrationsvektors pIMK2lux generiert (Monk et al., 2010). Dies er-

möglicht die direkte Interaktion von Internalin A mit seinem murinem Rezeptor E-

Cadherin und erlaubt somit Untersuchung der Wirt-Pathogen-Interaktion im Maus-

modell nach oraler Infektion. Beide zur Verfügung gestellten Stämme, LmoEGDe-lux

und LmoEGDe-lux-mur, wurden auf die Expression der Oberflächenproteine Inter-

nalin A und Internalin B untersucht sowie auf das Invasionsverhalten in die humane

Colonkarzinom-Zelllinie Caco-2 und in die murinen Colonkarzinom-Zellen CT-26.

Dies diente als Vorrausetzung für die in vivo Analyse der oralen Infektion in

ausgewählten Mausinzuchtstämmen.

Ergebnisse

53

2.3.1 Analyse der Stämme LmoEGDe-lux und LmoEGDe-lux-mur auf die

Proteinexpression von Internalin A und Internalin B sowie die Unter-

suchung der Invasionsrate in humanen und murinen Colonkarzinom-

Zellen.

Wie bereits unter Punkt 2.1.3 beschrieben, erfolgte die Analyse der Expression der

Oberflächenproteine InlA und InlB in den genetisch veränderten Listerienstämmen

LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux über die Durchführung eines Western-Blots.

Die kompletten Proteinlysate wurden auf einem Polyacrylamidgel aufgetragen und

über das Immunoblotverfahren mit monoklonalen Antikörpern gegen InlA und InlB

nachgewiesen (Abbildung 2-11). Als Ladekontrolle für die relativ geladenen Protein-

konzentration und die Proteindegradation diente wie bereits in Abschnitt 2.1.3 be-

schrieben der Nachweis des Aktin-bindenden Proteins A. Die erwarteten Mole-

kulargewichte lagen bei InlA bei 88 kDa, bei InlB 65 bei kDa und bei ActA bei 90 kDa

(Lingenau et al., 1995). Die Analyse der Proteinexpression zeigte, dass sämtliche

getesteten Listerienstämme InlA, InlB und ActA exprimieren.

Mit Hilfe des Gentamycin-Invasions-Assays wurde analysiert, ob eine verstärkte Auf-

nahme der murinisierten Listerienstämme aufgrund einer erhöhten Bindungsaffinität

zum Rezeptor in humane Caco-2 und murine CT-26 Zellen erfolgte. Untersucht

wurde die Invasionsrate des murinisierten Listerienstamms LmoEGDe-mur-lux und

von dessen unmodifizierten Wildtyps LmoEGDe-lux in Caco-2 und CT-26 Zellen

(Abbildung 2-12). Eine Stunde nach der Infektion mit 2x106 CFU Listerien erfolgte die

Behandlung mit Gentamycin zur Abtötung aller extrazellulär vorliegenden Bakterien.

Somit wurden nur die intrazellulär vorhandenen und replizierenden Listerien erfasst.

Die murinisierte Variante von LmoEGDe-lux zeigte im Caco-2 Invasions-Assay keine

signifikanten Unterschiede zu dem entsprechenden nicht-murinisierten Listerien-

stamm (Abbildung 2-12 A). Die Infektion von CT-26 Zellen ergab signifikante Unter-

schiede zwischen der Invasion von LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux (Abbildung

2-12 B).

Ergebnisse

54

Abbildung 2-11: Ergebnis der Analyse der Proteinexpression von Internalin A und Internalin B in genetisch veränderten Listerienstämmen. Proteinlysate nach Trichloressigsäurepräzipitation der murinisierten Listerienstämme und ihre isogenen Wildtyp-Ausgangsstämme wurden in einem 10%igen Polyacrylamidgel auf-getrennt und über Immunoblot analysiert. Die Westernblotanalyse für Internalin A zeigt die Position (Pfeil) von InlA mit einer erwarteten Fragmentgröße von 88 kDa. Die Western-blotanalyse für Internalin B zeigt die Position (Pfeil) von InlB mit einer erwarteten Fragment-größe von 65 kDa. Westernblotanalyse für ActA zeigt die Position (Pfeil) von ActA mit einer erwarteten Fragmentgröße von 90 kDa. Gel gefärbt mit Comassie Blue. M = Molekular-gewichtsmarker (97, 66, 45, 31, 21 und 14 kDa). LmoXen32 = Wildtyp L. monocytogenes Xenogen Stamm, LmoXen32-mur = murinisierter L. monocytogenes Xenogen Stamm, LmoEGDe = Wildtyp L. monocytogenes Stamm, LmoEGDe-mur = murinisierter L. mono-cytogenes Stamm (Wollert et al., 2007b). Je ein repräsentatives aus mindestens zwei durch-geführten Experimenten ist dargestellt.

Ergebnisse

55

Abbildung 2-12: Aufnahme genetisch veränderter Listerienstämme in Caco-2 und CT-26 Zellen. Die Bestimmung des intrazellulären Wachstums verschiedener Listerienstämme (LmoEGDe-lux, LmoEGDe-mur-lux) in (A) Caco-2 Zellen und (B) CT-26 Zellen. Alle Infektionen erfolgten mit einer Infektionsdosis von 2x106 CFU Bakterien (MOI 10:1). Nach einer Stunde wurden extrazellulär vorliegende Bakterien mit einer Gentamycinbehandlung (100 µg/ml) abgetötet. Die Anzahl intrazellulärer Bakterien wurde stündlich über das Ausplattieren von Zelllysaten auf BHI-Agarplatten quantifiziert. (A) Die Invasion von LmoEGDe-lux im Vergleich zur muri-nisierten Variante LmoEGDe-mur-lux in Caco-2 Zellen zeigte keine signifikanten Unter-schiede. (B) Die Invasion von LmoEGDe-lux im Vergleich zur murinisierten Variante LmoEGDe-mur-lux in CT-26 Zellen zeigte dagegen signifikante Unterschiede. Die Bestim-mung der intrazellulären Listerien erfolgte in Triplikaten und ist als Mittelwert und Standard-fehler (SEM) dargestellt. Statistische Signifikanzen sind angezeigt zwischen murinisierten und den entsprechenden nicht-murinisierten Stämmen (*p<0.05, ***p<0.001; nicht-parametrischer Mann-Whitney-U-Test). Gezeigt ist ein repräsentatives Ergebnis aus drei durchgeführten Experimenten.

Die Infektion mit LmoEGDe-mur-lux resultierte in einer höheren Invasionsrate im

Vergleich zu dessen unveränderten Wildtypstamm. Die gesteigerte Invasion von

LmoEGDe-mur-lux in CT-26 Zellen diente als Vorrausetzung für die in vivo Analyse

in ausgewählten Mausinzuchtstämmen.

2.3.2 Charakterisierung und Vergleich der Virulenz verschiedener LmoEGDe

Stämme in BALB/cJ Mäusen

Der Listerienstamm LmoEGDe führt in C57BL/6J Mäusen nach oraler Infektion mit

5x1010 CFU zu einer Überlebensrate von ca. 60% (Wollert et al., 2007b). Daher

Ergebnisse

56

wurde zunächst untersucht, welchen Einfluss die Integration des Lux-Operons auf

die Mortalitätsrate von LmoEGDe-lux im Vergleich zum Wildtyp LmoEGDe nach der

oralen Infektion aufweist. Parallel erfolgte die Analyse der Überlebensrate des muri-

nisierten Stammes LmoEGDe-mur-lux im Mausmodell. Für die Durchführung des

Experiments wurden unpigmentierte zehn Wochen alte BALB/cJ Mäuse verwendet,

da sie für die Messung der Biolumineszenz gut geeignet sind und sich für die Infek-

tion mit Listerien empfänglicher als C57BL/6J erweisen (Archinal und Wilder, 1988;

Cheers et al., 1978; Cheers und McKenzie, 1978; Cheers und Stanley, 1988;

Mainou-Fowler, 1988). Je zehn weibliche Tiere wurden mit einer Infektionsdosis von

1x1010 CFU LmoEGDe, LmoEGDe-lux oder LmoEGDe-mur-lux oral infiziert und über

einen Versuchszeitraum von elf Tagen die Überlebensrate und der Verlauf des Kör-

pergewichtes bestimmt (Abbildung 2-13). Während der Dauer des Experiments wur-

den die Tiere täglich auf ihren Gesundheitszustand untersucht und bei drastischer

Verschlechterung euthanisiert.

Abbildung 2-13: Überlebensraten und Verlauf des Körpergewichtes von BALB/cJ Mäusen nach oraler Infektion mit LmoEGDe, LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux. Je zehn BALB/cJ Weibchen wurden im Alter von zehn Wochen mit 1x1010 CFU LmoEGDe, LmoEGDe-lux oder LmoEGDe-mur-lux oral infiziert. (A) Im Verlauf des Körpergewichtes ergaben sich keine signifikanten Unterschiede. Es sind die Mittelwerte der Körpergewichte in Prozent und deren Standardfehler (SEM) dargestellt. Der Gewichtsverlust an Tag 0 resultiert durch Futterentzug am vorangegangenen Tag als Voraussetzung für die orale Infektion. Nach Inokulieren der Listerien direkt in den Magen hatten die Mäuse wieder uneingeschränkten Futterzugang. (B) Die Analyse der Überlebensraten von BALB/cJ Mäusen zeigte nach der Infektion mit LmoEGDe eine Überlebensrate von 30%, bei LmoEGDe-lux 40% und bei LmoEGDe-mur-lux 26,7%. Insgesamt zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in der Überlebensrate (Logrank-Test, p=0,5256).

Ergebnisse

57

Die Resultate der Körpergewichtsänderung sind in Abbildung 2-13 A dargestellt und

zeigten keine signifikanten Unterschiede. Die Gewichtsabnahme der BALB/cJ Mäuse

infiziert mit LmoEGDe bzw. LmoEGDe-mur-lux erfolgte bis zum Tag vier nach der

Infektion und anschließend ab Tag fünf war die Gewichtszunahme bis zum Ende des

Beobachtungszeitraums zu beobachten. BALB/cJ Mäuse infiziert mit LmoEGDe-lux

zeigten dagegen einen Gewichtsverlust bis zum Tag sieben nach der Infektion

gefolgt von einer kontinuierlichen Gewichtszunahme bis zum Versuchsende. Die

Infektion mit LmoEGDe resultierte in einer Überlebensrate von 30%. Bis zum Tag

fünf nach der Infektion verstarb die Hälfte der mit LmoEGDe infizierten BALB/cJ. Die

Mäuse infiziert mit LmoEGDe-lux zeigten eine Überlebensrate von 40% und von den

LmoEGDe-mur-lux infizierten BALB/cJ überlebten 26,7% (Abbildung 2-13 B). Die

Auswertung der Überlebensrate ergab keine signifikanten Unterschiede (p=0,5256,

Logrank-Test).

Parallel zur Dokumentation von Körpergewicht und Überlebensrate erfolgte täglich

das in vivo Imaging auf die emittierten Signale der biolumineszenten Listerien-

stämme LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux in den infizierten Mäuse mit Hilfe des

Xenogen IVIS (Abbildung 2-14). Als repräsentatives Tier jede Gruppe (n=10) wurde

ein Individuum über den gesamten Versuchszeitraum dargestellt. Eine Stunde nach

der oralen Infektion konnten inokulierte Listerien im Magen-Darm-Trakt detektiert

werden. Am Tag eins und zwei nach der Infektion war aufgrund der Ausbreitung der

Bakterien über den Darm, durch deren partielle Ausscheidung oder durch die Elimi-

nation über die Immunabwehr keine bzw. nur eine geringe Detektion von LmoEGDe-

lux und LmoEGDe-mur-lux möglich. Deutliche Unterschiede in der Messung der

Biolumineszenzsignale von LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux waren im Laufe

des Versuches erkennbar. BALB/cJ Mäuse infiziert mit LmoEGDe-lux zeigten über

die Dauer des Versuches geringere Signale als die mit LmoEGDe-mur-lux infizierten

Tiere, ein Resultat, welches die Ergebnisse von Monk et al. bestätigt (Monk et al.,

2010). Biolumineszenzsignale in der Leber konnten ab Tag fünf nach der Infektion in

LmoEGDe-mur-lux Tieren detektiert werden. Das in Abbildung 2-14 dargestellte Tier

verstarb innerhalb von sechs Tagen. Eine Akkumulation in den inneren Organen von

LmoEGDe-lux infizierten Mäusen wurde nur selten beobachtet. Jedoch führt auf-

Ergebnisse

58

grund der Überlebensrate von 40% die Infektion mit LmoEGDe-lux zu ebenfalls

schwerwiegenden Krankheitsverläufen. Das in Abbildung 2-14 dargestellte Tier ver-

starb innerhalb von acht Tagen nach der Infektion.

Abbildung 2-14: Biolumineszenz-Imaging oral infizierter BALB/cJ Mäuse mit LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-mur-lux. Je zehn BALB/cJ Weibchen wurden im Alter von zehn Wochen mit 1x1010 CFU LmoEGDe-lux oder LmoEGDe-mur-lux oral infiziert. Das BLI erfolgte eine Stunde (h) bis elf Tage nach der Infektion mit Hilfe des Xenogen IVIS 200 Imaging System. Je ein repräsentatives Tier ist über den Infektionszeitraum dargestellt. Als Kontrolle erfolgte das BLI eines uninfizierten Tieres. Falschfarbenüberlagerung repräsentiert das emittierte Signal von LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux in vivo nach 4 min Integrationszeit in Photonen/s/cm2/sr, Skala rechts. Die dargestellten Tiere verstarben innerhalb der angezeigten Zeiträume.

Die Analyse des in vivo Biolumineszenz-Imaging zeigte detektierbare Signale inner-

halb der Leber und im Darmbereich LmoEGDe-mur-lux infizierter BALB/cJ Mäuse.

Daraufhin sollte untersucht werden, ob die Detektion der Signale in vivo auch ex vivo

nach der Organpräparation von Leber, Milz, Dünndarm, mesenterischen Lymph-

knoten und Gehirn bestätigt werden kann. Mit Hilfe der histopathologischen Analyse

der Leber sollte zusätzlich die Invasion von Listeria monocytogenes in der Leber

nachgewiesen werden. Hierzu wurden zehn Wochen alte BALB/cJ mit LmoEGDe-lux

oder LmoEGDe-mur-lux oral infiziert. Aufgrund der hohen Sterblichkeit im voran-

gegangenen Experiment wurde die Infektionsdosis auf 5x109 CFU reduziert. Am Tag

vier nach der Infektion erfolgte die Präparation der Organe Milz, Leber, Dünndarm,

Ergebnisse

59

mesenterischen Lymphknoten und Gehirn. Diese wurden dann ex vivo auf die De-

tektion von Biolumineszenz untersucht (Abbildung 2-15).

Abbildung 2-15: Ex vivo Biolumineszenz-Imaging der inneren Organen oral infizierter BALB/cJ mit LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux an Tag vier nach der Infektion. Zehn Wochen alte BALB/cJ Mäuse wurden oral mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux infiziert. Am Tag vier nach der Infektion erfolgte die Präparation der Or-gane Milz, Leber, Dünndarm, mesenterische Lymphknoten und Gehirn. Mit Hilfe des Xeno-gen IVIS 200 Imaging System erfolgte die Detektion der Biolumineszenz ex vivo. Bei LmoEGDe-lux (links) infizierten Tieren konnten Signale in der Gallenblase detektiert werden, wogegen nach der Infektion mit LmoEGDe-mur-lux (rechts) Signale in der Leber, im Dünn-darm und in den mesenterischen Lymphknoten gemessen worden. Die Falschfarben-überlagerung repräsentiert das emittierte Licht von LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux nach 4 min Integrationszeit in Photonen/s/cm2/sr, Skala Mitte.

Die Organe der LmoEGDe-lux infizierten BALB/cJ zeigten in der Gallenblase starke

Signale, was auf eine Anreicherung der Listerien in der Gallenblase hinwies (Hardy

et al., 2004). Ebenfalls konnten Signale im Darm und in den mesenterischen Lymph-

knoten festgestellt werden. Im Gegensatz dazu zeigte die Infektion mit LmoEGDe-

mur-lux häufig Signale in der Leber. Des Weiteren konnte die Biolumineszenz der

Listerien in Milz, Gallenblase, Darm und mesenterischen Lymphknoten nach-

gewiesen werden. Parallel zur Untersuchung des ex vivo Biolumineszenz-Imaging

wurden Teile der Leber für die histopathologische und immunhistologische Analyse

präpariert, in Formaldehyd fixiert und in Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Weiterhin wurden

Ergebnisse

60

mit Hilfe immunhistologischer Verfahren die Gewebe auf den Nachweis von Listeria

monocytogenes untersucht (Abbildung 2-16).

Abbildung 2-16: Histopathologische und immunhistologische Analyse von Leber von oral infizierten BALB/cJ mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-mur-lux. Zehn Wochen alte BALB/cJ Mäuse wurden mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux oral infiziert. An Tag vier nach der Infektion erfolgte die Präparation der Leber und die histologische und immunhistologische Analyse. (A, B) HE-Färbung und (C, D) anti-Listeria-Färbung der Leber; Pfeile in A und B zeigen Nekrosen und Infiltrationen von Granulozyten, Pfeile in C und D weisen auf Listerien (braun). Balkengröße (A, B) 200µm. Balkengröße (C, D) 50µm.

Sowohl die orale Infektion mit LmoEGDe-mur-lux als auch die Infektion mit

LmoEGDe-lux führte zu Nekrosen und zu Infiltrationen von Granulozyten und

Makrophagen in das Leberparenchym. Jedoch führte die Infektion mit LmoEGDe-

mur-lux vermehrt zu entzündlichen Infiltrationen von Granulozyten und Makrophagen

in der Leber als die Infektion mit LmoEGDe-lux. Mit Hilfe der immunhistologischen

Analyse konnten Listerien, in Abhängigkeit des infizierten Listerienstamms mit

deutlichen Unterschieden innerhalb der Nekrosen und Zellinfiltrationen nach-

gewiesen werden. Die Infektion mit LmoEGDe-mur-lux resultierte in einer massiven

Ergebnisse

61

Invasion von Bakterien innerhalb des entzündlichen Gewebes, wogegen die Invasion

des Gewebes von Listerien in LmoEGDe-lux infizierten Mäusen deutlich geringer

ausfiel.

2.3.3 Vergleich der Wirtsresistenz in ausgewählten Mausinzuchtstämmen

nach der Infektion mit LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux

Frühere Analysen zeigten eine genetische Regulation der angeborenen Resistenz

von Mäusen nach der intravenösen oder intraperitonealen Infektion mit Listeria

monocytogenes über den Hc (hämolytisches Komplement) Locus (kontrolliert die

Konzentration des Komplementfaktors C5) der sich auf dem Mauschromosom 2

kartiert (Cheers und McKenzie, 1978; Czuprynski et al., 1985; Gervais et al, 1984;

Skamene et al., 1979). Ein Mangel an Komplementfaktor C5 resultiert in einer er-

höhten Suszeptibilität von A/J Mäusen auf die Infektion mit Listeria monocytogenes

(Gervais et al, 1984; Ooi und Colten, 1979). Ebenso zeigten sich BALB/cJ und

C3HeB/FeJ Mäuse empfänglich für eine Listerieninfektion (Archinal und Wilder,

1988; Cheers und Stanley, 1988; Mainou-Fowler, 1988; Munder et al., 2005). Im Ge-

gensatz dazu konnte gezeigt werden, dass C57BL/6J Mäuse einen resistenten Phä-

notyp in Bezug auf die Infektion mit Listeria monocytogenes aufwiesen (Cheers et al.,

1978; Cheers und McKenzie, 1978; Czuprynski et al., 2002; Czuprynski et al., 2003;

Iizawa et al., 1994).

Wie im vorangegangenen Versuch gezeigt werden konnte, führte aufgrund der An-

passung des Internalin A an seinen murinen Rezeptor die orale Infektion von

BALB/cJ Mäusen mit LmoEGDe-mur-lux zu einem virulenteren Krankheitsgeschehen

mit Infiltrationen von Listeria monocytogenes in der Leber im Vergleich zu der

Infektion mit LmoEGDe-lux. Zur Beurteilung der Virulenz des murinisierten

Listerienstamms LmoEGDe-mur-lux und für den Vergleich der Wirtsresistenz

ausgewählter Mausinzuchtstämme erfolgte die Infektion von BALB/cJ, A/JOlaHsd,

C3HeB/FeJ und C57BL/6J Mäusen mit LmoEGDe-mur-lux im Vergleich zum

isogenen Wildtyp LmoEGDe-lux. Je zehn Weibchen von C57BL/6J, A/JOlaHsd,

BALB/cJ und C3HeB/FeJ wurden im Alter von zehn Wochen mit einer Infektionsdosis

von 5x109 CFU LmoEGDe-mur-lux bzw. LmoEGDe-lux oral infiziert. Über den

Ergebnisse

62

Versuchszeitraum von 17 Tagen erfolgte täglich die Dokumentationen des

Gesundheitszustandes, der Körpergewichte, der Überlebensrate und die Detektion

der Biolumineszenz der Listerien. Die Überlebensraten der ausgewählten Mausin-

zuchtstämme nach der Infektion von 5x109 CFU LmoEGDe-mur-lux bzw. LmoEGDe-

lux sind in Abbildung 2-17 dargestellt.

Abbildung 2-17: Überlebensraten von ausgewählten Mausinzuchtstämmen nach oraler Infektion von 5x109 CFU LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux. Je zehn C57BL/6J, A/JOlaHsd, BALB/cJ und C3HeB/FeJ Weibchen wurden im Alter von zehn Wochen mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-mur-lux oral infiziert. (A) Die Analysen der Überlebensraten nach der Infektion mit LmoEGDe-lux zeigten bei C3HeB/FeJ eine Überlebensrate von 40%, A/JOlaHsd 50%, BALB/cJ 70% und C57BL/6J 90%. Ins-gesamt ergaben sich keine signifikanten Unterschiede in der Überlebensrate (Logrank-Test, p=0,0621). (B) Nach der Infektion von LmoEGDe-mur-lux lag die Überlebensrate bei C3HeB/FeJ bei 0%, A/JOlaHsd bei 20%, BALB/cJ bei 60% und C57BL/6J bei 100%. Es zeigten sich signifikante Unterschiede im Verlauf der Überlebenskurven (Logrank-Test, p<0,0001).

Die orale Infektion mit LmoEGDe-lux resultierte in einer Überlebensrate von 40% bei

C3HeB/FeJ, 50% bei A/JOlaHsd, 70% bei BALB/cJ und 90% bei C57BL/6J Mäusen.

Der Mausinzuchtstamm C3HeB/FeJ zeigte eine ausgeprägte Suszeptibilität,

A/JOlaHsd und BALB/cJ Mäuse zeigten einen intermediären Verlauf der Infektion

und der Mausinzuchtstamm C57BL/6J wies die deutlichste Resistenz auf (Abbildung

2-17 A). Die Infektion von C57BL/6J, A/JOlaHsd, BALB/cJ und C3HeB/FeJ mit

LmoEGDe-mur-lux resultierte in reduzierten Überlebensraten von A/JOlaHsd,

BALB/cJ und C3HeB/FeJ Mäusen im Vergleich zur Infektion mit LmoEGDe-lux. Alle

der infizierten C3HeB/FeJ Mäuse verstarben innerhalb von sechs Tagen nach der

Ergebnisse

63

Infektion. Die A/JOlaHsd Mäuse wiesen eine Überlebensrate von 20% auf, die

BALB/cJ zeigten eine Überlebensrate von 60% und 100% der C57BL/6J überlebten.

Die C3HeB/FeJ erwiesen sich als empfindlichster Stamm, A/JOlaHsd und BALB/cJ

zeigten eine intermediäre Suszeptibilität und als Mausstamm mit der aus-

geprägtesten Resistenz erwies sich C57BL/6J (Abbildung 2-17 B). Die deutliche

Reduzierung der Überlebensraten von A/JOlaHsd, BALB/cJ und C3HeB/FeJ Mäusen

nach der Infektion mit dem murinisierten Listerienstamm LmoEGDe-mur-lux im

Vergleich zu LmoEGDe-lux ist das Resultat einer gesteigerten Virulenz von

LmoEGDe-mur-lux aufgrund der Murinisierung des Internalin A.

Parallel zur Bestimmung der Überlebensrate erfolgte die Dokumentation des Körper-

gewichts der mit LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-mur-lux infizierten C57BL/6J,

A/JOlaHsd, BALB/cJ und C3HeB/FeJ Mäuse über den Versuchszeitraum von 14

Tagen (Abbildung 2-18). Die Analyse des Verlaufs des Körpergewichtes der

C3HeB/FeJ Mäusen (Abbildung 2-18 A) zeigte nach der Infektion mit LmoEGDe-lux

und LmoEGDe-mur-lux keinen signifikanten Unterschied. Die C3HeB/FeJ Mäuse

reagierten auf die Infektion mit LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux gleichermaßen

mit Gewichtsverlust. Bis zum Tag sechs waren alle mit LmoEGDe-mur-lux infizierten

C3HeB/FeJ verstorben. Die mit LmoEGDe-lux infizierten Tiere zeigten eine Ge-

wichtsabnahme bis zum Tag sechs nach der Infektion gefolgt von einer kontinuier-

lichen Gewichtszunahme bis zum Versuchsende. Im Verlauf der Änderung des Kör-

pergewichtes von A/JOlaHsd Mäusen ergaben sich signifikante Unterscheide an Tag

drei, vier und fünf nach der Infektion mit LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux

(Abbildung 2-18 B). Die Gewichtsabnahme der mit LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-

mur-lux infizierten A/JOlaHsd erfolgte jeweils bis zum Tag sechs post Infektion. Im

Fall der LmoEGDe-lux infizierten Tiere konnte ab Tag sechs nach der Infektion eine

kontinuierliche Gewichtszunahme bis zum Versuchsende beobachtet werden. Die

LmoEGDe-mur-lux infizierten A/JOlaHsd Mäuse verzeichneten ab Tag sechs eine

Gewichtszunahme bis zum Tag elf nach der Infektion, gefolgt von einer erneuten

Gewichtsabnahme bis zum Tag 13. Ab Tag 13 nach der Infektion bis zum Ende des

Versuchszeitraums konnte eine Gewichtzunahme beobachtet werden. Im Verlauf der

Änderung des Körpergewichtes von BALB/cJ Mäusen ergab sich ein signifikanter

Ergebnisse

64

Unterschied an Tag sechs nach der Infektion mit LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-mur-

lux (Abbildung 2-18 C).

Abbildung 2-18: Verlauf des Körpergewichtes ausgewählter Mausinzuchtstämme nach oraler Infektion mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux oder LmoEGDe-mur-lux. Je zehn (A) C3HeB/FeJ, (B) A/JOlaHsd, (C) BALB/cJ und (D) C57BL/6J Mäuse wurden im Alter von zehn Wochen mit einer Infektionsdosis von 5x109 CFU LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-mur-lux oral infiziert und täglich auf die Änderung im Verlauf des Körpergewichts kontrolliert. Der Gewichtsverlust an Tag 0 entstand durch Futterentzug am vorangegangenen Tag als Voraussetzung für die orale Infektion. Nach intragastraler Inokulation der Listerien hatten die Mäuse wieder uneingeschränkten Futterzugang. Der Mittelwert der Körper-gewichte (n=10) in Prozent und deren Standardfehler (SEM) sind abgebildet. Die statistischen Signifikanzen im Gewichtsverlauf zwischen murinisierten und den entsprechenden Wildtyp-Stämmen sind dargestellt (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, nicht-parametrischer Mann-Whitney-U-Test).

Die Gewichtsabnahme erfolgte bei LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux infizierten

Tieren bis zum Tag sieben nach der Infektion. Danach folgte die kontinuierliche Ge-

wichtszunahme bis zum Ende des Experiments. Die Änderung der Gewichtsverläufe

von C57BL/6J Mäusen infiziert mit LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-mur-lux ergab an

den Tagen drei, vier, und fünf nach der Infektion deutliche Unterschiede (Abbildung

2-18 D). Die Gewichtsabnahme der mit LmoEGDe-lux infizierten Tiere erfolgte bis

zum Tag drei nach der Infektion. Ab Tag drei post Infektion konnte bis zum Ver-

suchsende eine kontinuierliche Gewichtszunahme beobachtet werden. Im Gegensatz

Ergebnisse

65

zu den LmoEGDe-lux infizierten C57BL/6J erfolgte bei den LmoEGDe-mur-lux infi-

zierten C57BL/6J eine Gewichtsabnahme bis zum Tag vier nach der Infektion, ge-

folgt von der kontinuierlichen Gewichtszunahme bis zum Abschluss des Experi-

ments. Die orale Infektion von C57BL/6J, A/JOlaHsd, BALB/cJ Mäusen mit

LmoEGDe-mur-lux resultierte somit in einer größeren Änderung im Verlauf des Kör-

pergewichtes im Vergleich zur Infektion mit LmoEGDe-lux.

Über den Versuchszeitraum von 14 Tagen erfolgte das tägliche Biolumineszenz-

Imaging aller infizierten C57BL/6J, A/JOlaHsd, BALB/cJ und C3HeB/FeJ Mäuse zur

Analyse der Dissemination der Listerien in vivo. Eine repräsentative Gruppe von fünf

Tieren jedes Mausinzuchtstammes ist in Abbildung 2-19 (infiziert mit LmoEGDe-lux)

und Abbildung 2-20 (infiziert mit LmoEGDe-mur-lux) dargestellt. Eine Stunde nach

der intragastralen Inokulation von 5x109 CFU LmoEGDe-lux konnten Listerien

innerhalb des Magen-Darm-Traktes detektiert werden (Abbildung 2-19). Im Verlauf

der Infektion mit LmoEGDe-lux konnten die Listerien an Tag eins nach der Infektion

nur in C57BL/6J nachgewiesen werden. Bis zum Versuchsende war eine Detektion

von Listerien in C57BL/6J nicht mehr möglich. In den A/JOlaHsd, BALB/cJ und

C3HeB/FeJ Mäuse war eine Detektion der Listerien an Tag eins bis zum Tag zwei

nach der Infektion nicht messbar. Erst ab Tag drei nach der Infektion konnten

Listerien in der Gallenblase und im Abdominalbereich von einzelnen C3HeB/FeJ,

BALB/cJ und A/JOlaHsd Mäusen detektiert werden. Ab Tag vier nach der Infektion

konnte eine Zunahme des Biolumineszenzsignals im Darmbereich von A/JOlaHsd,

BALB/cJ und C3HeB/FeJ Mäusen beobachtet werden. Vereinzelt war, wie im Fall

von BALB/cJ und C3HeB/FeJ Mäusen, die Detektion von Listerien in der Leber mög-

lich. Ab Tag sechs nach der Infektion erfolgte eine kontinuierliche Reduzierung der

Detektion der Biolumineszenz in vivo, welche ab Tag acht nach der Infektion nicht

mehr nachgewiesen werden konnte.

Im Fall der intragastralen Inokulation von 5x109 CFU LmoEGDe-mur-lux waren

ebenfalls eine Stunde nach der Infektion Listerien innerhalb des Magen-Darm-

Traktes detektierbar (Abbildung 2-20). An den Tagen eins und zwei nach der Infek-

tion war die Detektion des Signals aufgrund der Dissemination der Bakterien über

den Darm und deren Ausscheidung reduziert. Am Tag zwei nach Infektion konnten

Ergebnisse

66

Listerien im Abdominalbereich von C3HeB/FeJ detektiert werden. Ab Tag drei nach

der Infektion waren Biolumineszenzsignale im abdominalen Bereich von BALB/cJ

und einzelnen A/JOlaHsd Mäusen messbar. Ein Anstieg der Biolumineszenz im

Darmbereich der A/JOlaHsd, BALB/cJ und C3HeB/FeJ Mäusen konnte ab Tag vier

nach der Infektion beobachtet werden. Zusätzlich konnte in allen C3HeB/FeJ

Mäusen sowie in je einer BALB/cJ und A/JOlaHsd Maus die Biolumineszenz der

Listerien innerhalb der Leber nachgewiesen werden. Bis zum Tag fünf nach der

Infektion konnte in BALB/cJ und A/JOlaHsd Mäusen die Persistenz der

Biolumineszenz innerhalb des abdominalen Bereiches festgestellt werden. Ab Tag

sechs nach der Infektion erfolgte kontinuierlich die Reduzierung der Detektion der

Biolumineszenz in vivo. Ab Tag acht nach der Infektion waren keine

Biolumineszenzsignale mehr nachweisbar. Im Vergleich der LmoEGDe-lux und

LmoEGDe-mur-lux infizierten Tieren waren Unterschiede in der Stärke der

Biolumineszenz erkennbar. Die Biolumineszenz war in LmoEGDe-mur-lux infizierten

Mäusen ausgeprägter nachweisbar. Auch sind Unterschiede in Lokalisation der

Signale erkennbar. Die Mausinzuchtstämme C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd und BALB/cJ,

infiziert mit LmoEGDe-lux, zeigten eine Akkumulation von Signalen in der

Gallenblase und im Darmbereich. Bei zwei C3HeB/FeJ Tieren konnten

Biolumineszenzsignale auch in der Leber detektiert werden. Im Gegensatz dazu

konnte nach der Infektion mit LmoEGDe-mur-lux in der Leber und im Darmbereich

einer Vielzahl der Individuen der Mausinzuchtstämme C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd und

BALB/cJ Biolumineszenz nachgewiesen werden. C57BL/6J Mäuse erwiesen sich als

sehr resistent sowohl bei der Infektion mit LmoEGDe-lux als auch LmoEGDe-mur-

lux. Jedoch sind C57BL/6J Mäuse aufgrund ihrer pigmentierten Haut und der

schwarzen Fellfarbe für die Messung der Biolumineszenz ungeeignet.

Ergebnisse

67

Abbildung 2-19: Biolumineszenz-Imaging von mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux oral infizierten Mausinzuchstämmen. Je zehn C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd, BALB/cJ und C57BL/6J Weibchen wurden im Alter von zehn Wochen mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux oral infiziert. Darstellung des BLI ab einer Stunde (h) bis acht Tage nach der Infektion erfolgte mit Hilfe des Xenogen IVIS. C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd und BALB/cJ Mäuse zeigten Signale in der Gallenblase und im Darmbereich an den Tagen drei, vier und fünf nach der Infektion. Je fünf repräsentative Tiere jedes Mausin-zuchtstammes (n=10) sind über den Zeitraum von acht Tagen abgebildet. Die Falschfarben-überlagerung repräsentiert das emittierte Signal von LmoEGDe-lux in vivo nach 4 min Integrationszeit in Photonen/s/cm2/sr, Skala rechts.

Ergebnisse

68

Abbildung 2-20: Biolumineszenz-Imaging von mit 5x109 CFU LmoEGDe-mur-lux oral infizierten Mausinzuchstämmen. Je zehn C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd, BALB/cJ und C57BL/6J Weibchen wurden im Alter von zehn Wochen mit 5x109 CFU LmoEGDe-mur-lux oral infiziert. Darstellung des BLI ab einer Stunde (h) bis acht Tage nach der Infektion erfolgte mit Hilfe des Xenogen IVIS. C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd und BALB/cJ Mäuse zeigten Signale im Abdominalbereich und Leber an den Tagen vier und fünf post Infektion. Je fünf repräsentative Tiere jedes Mausinzuchtstammes (n=10) sind über den Zeitraum von acht Tagen abgebildet. Die Falschfarbenüberlagerung repräsentiert das emittierte Signal von LmoEGDe-mur-lux in vivo nach 4 min Integrationszeit in Photonen/s/cm2/sr, Skala rechts.

Ergebnisse

69

2.3.4 Kinetik der in vivo Replikation von LmoEGDe-lux und LmoEGDe-lux-mur

in ausgewählten Mausinzuchtstämmen

Die Analyse der Überlebensrate sowie das Biolumineszenz-Imaging in ausgewählten

Mausinzuchtstämmen nach der Infektion von LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux

zeigte Unterschiede in der Suszeptibilität von C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd, BALB/cJ und

C57BL/6J Mäusen auf. Aufgrund dieser Beobachtung erfolgte die Untersuchung der

bakteriellen Keimlast in den inneren Organen Milz, Leber, Gallenblase, mesen-

terischen Lymphknoten, Dünndarm und Gehirn von C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd,

BALB/cJ und C57BL/6J Mäusen nach oraler Infektion mit LmoEGDe-mur-lux im Ver-

gleich zum isogenen Wildtypstamm LmoEGDe-lux. An den Tagen eins, drei, fünf und

sieben nach der Infektion wurden jeweils acht Tiere für die Analyse verwendet.

Parallel erfolgte die histopathologische Untersuchung der Organe Milz, Leber und

Dünndarm. Ergänzend wurden die präparierten Organe ex vivo sowie täglich alle

infizierten Tiere in vivo auf die Detektierbarkeit von Biolumineszenzsignalen unter-

sucht. Weiter erfolgte täglich die Dokumentation der Änderungen im Verlauf des Kör-

pergewichtes.

2.3.4.1 In vivo Imaging von LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux infizierten

Mausinzuchtstämmen

Je 40 Weibchen der Mausstämme C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd, BALB/cJ und C57BL/6J

wurden im Alter von zehn Wochen mit einer Infektionsdosis von 5x109 CFU

LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-mur-lux oral infiziert und über den Versuchszeitraum

von sieben Tagen erfolgte das tägliche Biolumineszenz-Imaging aller infizierten Tiere

mit Hilfe des IVIS 200 System (Abbildung 2-23). Eine Stunde nach der Infektion

waren beide Listerienstämme im Magen der Tiere detektierbar. Am Tag eins nach

der Infektion war keine Detektion der Signale in C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd und

BALB/cJ Mäusen aufgrund der Dissemination der Bakterien über den Darm und

deren Ausscheidung möglich. Nur in C57BL/6J Mäusen konnte einen Tag nach der

Infektion Biolumineszenzsignale im Abdominalbereich nachgewiesen werden.

Ergebnisse

70

Abbildung 2-21: Biolumineszenz-Imaging von oral infizierten Mausinzuchstämmen mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-mur-lux. Je 40 C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd, BALB/cJ und C57BL/6J Weibchen wurden im Alter von zehn Wochen mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-mur-lux oral infiziert. Darstellung des BLI ab einer Stunde (h) bis sieben Tage nach der Infektion mit Hilfe des Xenogen IVIS 200 Imaging System. (A) Je ein repräsentatives Tier jedes Mausinzuchtstammes infiziert mit LmoEGDe-lux ist über den Versuchszeitraum von sieben Tagen abgebildet. (B) Je ein reprä-sentatives Tier jedes Mausinzuchtstammes infiziert mit LmoEGDe-mur-lux ist über den Ver-suchszeitraum von sieben Tagen abgebildet. Die Falschfarbenüberlagerung repräsentiert das emittierte Signal von LmoEGDe-mur-lux in vivo nach 4 min Integrationszeit in Photonen/s/cm2/sr, Skala rechts. Abgebildet ist jeweils ein repräsentatives Ergebnis von zwei Experimenten.

Ergebnisse

71

Nach der Infektion mit LmoEGDe-lux wurden Signale im Darmbereich und in der

Gallenblase von C3HeB/FeJ und A/JOlaHsd Mäusen am Tag vier post Infektion

lokalisiert. Bei den infizierten C3HeB/FeJ Mäusen konnten zusätzlich noch Bio-

lumineszenzsignale in der Leber nachgewiesen werden. In infizierten C57BL/6J

Mäusen konnten keine spezifischen Signale in vivo detektiert werden. Auch bei

infizierten BALB/cJ Mäusen erfolgte die Detektion der biolumineszenten Listerien im

Darmbereich am Tag sechs nach der Infektion. Im Gegensatz zur Infektion mit

LmoEGDe-lux war die Detektion der Biolumineszenz in mit LmoEGDe-mur-lux

infizierten C3HeB/FeJ Mäusen im Abdominalbereich ab Tag zwei nach der Infektion

möglich. Ab Tag drei konnten die Listerien auch in Darmbereich der A/JOlaHsd und

BALB/cJ Mäusen nachgewiesen werden. Am Tag vier nach der Infektion erfolgte

zusätzlich die Detektion der Signale in der Leber von C3HeB/FeJ und A/JOlaHsd

Mäusen. In infizierten C57BL/6J Mäusen konnte die Detektion von biolumineszenten

Listerien innerhalb der Gallenblase ab Tag vier bis sieben nach der Infektion

beobachtet werden. Es wird deutlich, dass die Detektion der Biolumineszenzsignale

in LmoEGDe-lux infizierten im Vergleich zu LmoEGDe-mur-lux infizierten Tieren

verringert ist, was die Resultate von Monk et al. bestätigte (Monk et al., 2010).

Weiterhin wiesen Mausinzuchtstämme, welche empfindlich auf eine Infektion mit

Listerien reagieren (C3HeB/FeJ) ein ausgeprägteres Biolumineszenzsignal in der

Leber auf, während in resistenten Mausstämmen (C57BL/6J) eine Anreicherung in

der Gallenblase zu beobachten war.

Ergänzend zum in vivo Biolumineszenz-Imaging erfolgte die Messung der Verläufe

der Körpergewichte über den gesamten Zeitraum des Experimentes. In Abbildung 2-

22 sind die Änderungen im Gewichtsverlauf von LmoEGDe-lux infizierten im

Vergleich zu den LmoEGDe-mur-lux infizierten C57BL/6J, A/JOlaHsd, BALB/cJ und

C3HeB/FeJ Mäusen dargestellt. Die Analyse des Verlaufs des Körpergewichtes der

C3HeB/FeJ Mäuse (Abbildung 2-22 A) zeigte eine kontinuierliche Gewichtsabnahme

nach der Infektion mit LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux bis zum Tag fünf nach

der Infektion. LmoEGDe-mur-lux infizierte C3HeB/FeJ verstarben bis zum Tag sechs

nach der Infektion. Am Tag drei nach der Infektion wurde ein signifikanter

Unterschied im Gewichtsverlauf LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux infizierter

Ergebnisse

72

C3HeB/FeJ Mäuse angezeigt. An allen anderen Zeitpunkten konnten keine

Unterschiede im Gewichtsverlauf der C3HeB/FeJ Mäuse festgestellt werden. Im

Verlauf der Änderung des Körpergewichtes von LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-

lux infizierter A/JOlaHsd Mäuse ergaben sich keine signifikante Unterscheide über

den Versuchszeitraum von sieben Tagen und es war eine kontinuierliche

Gewichtsabnahme zu beobachten (Abbildung 2-22 B).

Abbildung 2-22: Verlauf des Körpergewichtes ausgewählter Mausinzuchtstämme nach oraler Infektion mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-mur-lux. Je acht (A) C3HeB/FeJ, (B) A/JOlaHsd, (C) BALB/cJ und (D) C57BL/6J Mäuse wurden im Alter von zehn Wochen mit einer Infektionsdosis von 5x109 CFU LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-mur-lux oral infiziert und täglich die Änderung des Körpergewichtes kontrolliert. Der Gewichtsverlust an Tag 0 entstand durch Futterentzug am vorangegangenen Tag als Voraussetzung für die orale Infektion. Nach intragastraler Inokulation der Listerien hatten die Mäuse wieder uneingeschränkten Futterzugang. Der Mittelwert der Körpergewichte (n=8) in Prozent und deren Standardfehler (SEM) sind abgebildet. Die statistischen Signifikanzen im Gewichtsverlauf zwischen murinisierten und den entsprechenden Wildtyp-Listerienstämmen sind abgebildet (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0,0001; nicht-parametrischer Mann-Whitney-U-Test). Dargestellt ist jeweils ein repräsentatives Ergebnis von zwei Experimenten.

Im Verlauf der Änderung des Körpergewichtes von LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-

mur-lux infizierten BALB/cJ Mäusen konnten signifikante Unterschiede an den Tagen

eins bis fünf nach der Infektion beobachtet werden (Abbildung 2-22 C). Die

Ergebnisse

73

Gewichtsabnahme erfolgte bei LmoEGDe-mur-lux infizierten Tieren bis zum Tag

sieben nach der Infektion. Bei LmoEGDe-lux infizierten BALB/cJ Mäusen erfolgte die

Gewichtsabnahme bis zum Tag zwei nach der Infektion, gefolgt von einer Gewicht-

zunahme zum Tag drei und einer erneuten Gewichtsabnahme bis zum Tag sechs

nach der Infektion. Ab Tag sieben war eine erneute Gewichtszunahme zu beobach-

ten. Die Änderung der Gewichtsverläufe von C57BL/6J Mäusen infiziert mit

LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-mur-lux zeigte an den Tagen drei, vier, fünf und

sechs nach der Infektion signifikante Unterschiede (Abbildung 2-22 D). Die

Gewichtsabnahme der mit LmoEGDe-lux infizierten Tiere erfolgte bis zum Tag zwei

nach der Infektion. Ab Tag drei post Infektion konnte bis zum Versuchsende eine

kontinuierliche Gewichtszunahme beobachtet werden. Im Gegensatz zu den

LmoEGDe-lux infizierten C57BL/6J erfolgte bei den LmoEGDe-mur-lux infizierten

C57BL/6J eine Gewichtsabnahme bis zum Tag fünf nach der Infektion, gefolgt von

der kontinuierlichen Gewichtszunahme bis zum Abschluss des Experiments.

2.3.4.2 Kinetik der bakteriellen Keimlast in den inneren Organen von LmoEGDe-lux

und LmoEGDe-lux-mur infizierten Mausinzuchtstämmen

Listeria monocytogenes besitzt die Fähigkeit die intestinale Barriere zu durchqueren.

Sie infizieren sowohl die intestinalen Epithelzellen als auch die M-Zellen der

Peyer´schen Plaques (Clark et al., 2000). Über das Blut- und Lymphsystem sowie

die mesenterialen Lymphknoten gelangen die Listerien zu Leber und Milz, den

Hauptorganen der bakteriellen Kolonisation und Replikation (Lecuit et al., 2001). Der

Nachweis detektierbarer Biolumineszenzsignale in infizierten C57BL/6J, A/JOlaHsd,

BALB/cJ und C3HeB/FeJ Mäusen in vivo weist auf die Akkumulation von Listerien in

den inneren Organen hin. Im weiteren Verlauf erfolgte die Detektion der

Biolumineszenzsignale auch ex vivo nach der Organpräparation von Leber, Milz,

Dünndarm, mesenterischen Lymphknoten und Gehirn. Zusätzlich wurde die

bakterielle Keimlast in den präparierten Organen Milz, Leber, Dünndarm, mLK,

Gallenblase und dem Gehirn bestimmt. Weiterhin sollte mit Hilfe der

histopathologischen Analyse der Leber die Invasion der Leber mit Listeria

monocytogenes beobachtet werden. An den Tagen eins, drei, fünf und sieben nach

der oralen Infektion mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux wurden

Ergebnisse

74

jeweils acht Tiere von C57BL/6J, A/JOlaHsd, BALB/cJ und C3HeB/FeJ Mäusen für

die Analyse verwendet. Nach der Präparation der Organe wurden diese zunächst ex

vivo auf die Detektion von Biolumineszenzsignalen und somit auf das Vorkommen

von Listerien mit Hilfe des Xenogen IVIS untersucht (Abbildung 2-23). Erst am Tag

drei nach der oralen Infektion mit LmoEGDe-lux war ein deutliches Signal innerhalb

der mesenterischen Lymphknoten (mLK) infizierter A/JOlaHsd und C3HeB/FeJ

Mäuse sowie in den mLK LmoEGDe-mur-lux infizierter C57BL/6J, A/JOlaHsd,

BALB/cJ und C3HeB/FeJ Mäuse messbar. Während bei LmoEGDe-lux infizierten

C3HeB/FeJ Mäusen am Tag fünf nach der Infektion Signale in der Leber, Milz, mLK

sowie im Darm detektierbar waren, konnten bei den A/JOlaHsd und BALB/cJ

Mäusen Biolumineszenzsignale nur in mLK und in der Gallenblase nachgewiesen

werden. Die detektierbaren Biolumineszenzsignale am Tag sieben nach der Infektion

mit LmoEGDe-lux begrenzten sich bei A/JOlaHsd Mäusen auf die Gallenblase. Bei

den infizierten C57BL/6J Mäusen war keine Biolumineszenz innerhalb der Organe

über den gesamten Zeitraum nachweisbar. Im Dünndarm der LmoEGDe-mur-lux

infizierten C57BL/6J und A/JOlaHsd Mäuse konnten Signale am Tag eins nach der

Infektion nachgewiesen werden (Abbildung 2-23 B). Am Tag drei nach der oralen

Infektion mit LmoEGDe-mur-lux wurden Signale in den mLK aller analysierten

Mausinzuchtstämme beobachtet. Bis zum Tag fünf nach der Infektion mit LmoEGDe-

mur-lux konnten Biolumineszenzsignale in der Leber, im Dünndarm und in den mLK

von C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd und BALB/cJ Mäusen detektiert werden. Im Falle der

C57BL/6J Mäuse begrenzte sich der Nachweis der Biolumineszenz auf die Gallen-

blase. Am Tag sieben nach der Infektion mit LmoEGDe-mur-lux konnten in den Gal-

lenblasen der A/JOlaHsd, BALB/cJ und C57BL/6J Mäusen Listerien nachgewiesen

werden. Der Vergleich von LmoEGDe-lux mit LmoEGDe-lux-mur zeigte Unterschiede

in der Biolumineszenzstärke besonders an Tag drei und fünf nach der Infektion auf.

LmoEGDe-lux-mur zeigte deutlichere Signale in den mLK an Tag drei nach der

Infektion in allen analysierten Mausinzuchtstämmen und in der Leber von

C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd und BALB/cJ Mäusen an Tag fünf nach der Infektion. Auch

sind empfindliche und resistente Mausinzuchtstämme deutlich voneinander differen-

zierbar.

Ergebnisse

75

Abbildung 2-23: Ex vivo BLI der inneren Organe ausgewählter Mausinzuchtstämme nach der oralen Infektion mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-mur-lux. Zehn Wochen alte C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd, BALB/cJ und C57BL/6J Mäuse wurden oral mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux infiziert. An den Tagen eins, drei, fünf und sieben nach der Infektion erfolgte die Präparation der Organe Milz, Leber, Dünndarm, mesenterische Lymphknoten (mLK) und Gehirn. Mit Hilfe des Xenogen IVIS erfolgte die Detektion der Biolumineszenz ex vivo. (A) Bei LmoEGDe-lux infizierten Tieren konnten am Tag fünf nach der Infektion Signale in der Gallenblase von A/JOlaHsd und BALB/cJ sowie in der Leber von C3HeB/FeJ Mäusen detektiert werden. (B) Am Tag drei nach der Infektion mit LmoEGDe-mur-lux wurden Signale in mLK aller analysierten Mausinzuchtstämme nach-gewiesen. Am Tag fünf nach der Infektion wurden Biolumineszenzsignale in der Leber, im Dünndarm und in den mLK von C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd, BALB/cJ Mäusen detektiert. Die Falschfarbenüberlagerung repräsentiert das emittierte Licht von LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux nach 4 min Integrationszeit in Photonen/s/cm2/sr, Skala rechts. Dar-gestellt sind jeweils repräsentative Ergebnisse aus zwei Experimenten.

Ergebnisse

76

Mit zunehmender Resistenz sinkt die Detektierbarkeit der Biolumineszenz. In den

inneren Organen der für die Listerieninfektion empfänglichen C3HeB/FeJ Mäuse

konnten starke Biolumineszenzsignale in der Leber, in der Milz und in den mLK

nachgewiesen werden. Dagegen waren in den resistenten C57BL/6J Mäusen nur

schwache Biolumineszenzsignale detektierbar.

Für die weitere Analyse der bakteriellen Keimlast wurden die präparierten Organe

Leber, Milz, Dünndarm, mLK und Gehirn in PBS homogenisiert und in Verdünnungs-

stufen auf BHI-Agarplatten ausgestrichen. Nach 24 Stunden wurden die gewach-

senen Kolonien gezählt und die bakterielle Keimlast pro Milligramm Organ berech-

net. In Abbildung 2-24 sind die bakteriellen Keimlasten der Organe Milz, Leber,

Dünndarm, mLK und Gehirn der Mausinzuchtstämme C57BL/6J, A/JOlaHsd,

BALB/cJ und C3HeB/FeJ an Tag drei und fünf nach der Infektion mit LmoEGDe-lux

und LmoEGDe-lux-mur dargestellt. Die bakterielle Keimlast in LmoEGDe-lux und

LmoEGDe-lux-mur infizierten C3HeB/FeJ Mäusen weiste nur an Tag drei nach der

Infektion einen signifikanten Unterschied in der Milz auf. In allen anderen analy-

sierten Organen war kein Unterschied in der Listerienanzahl zu beobachten. Im wei-

teren Infektionsverlauf war ein Anstieg der Bakterienanzahl in der Milz, der Gallen-

blase und im Gehirn von Tag drei auf Tag fünf um das Zehnfache, in der Leber sogar

um das Hundertfache, zu beobachten (Abbildung 2-24 A). Eine Änderung der Bakte-

rienlast im Dünndarm und in mLK war von Tag drei auf Tag fünf nach der Infektion

nicht nachzuweisen. Jedoch konnte ein signifikanter Unterschied der Listerienanzahl

an Tag fünf nach der Infektion, im Vergleich von LmoEGDe-lux zu LmoEGDe-lux-

mur, im Dünndarm bestimmt werden. Die Unterschiede der bakteriellen Keimlasten

in den analysierten Organe der C3HeB/FeJ Mäusen, nach der Infektion mit murini-

sierten und nicht-murinisierten Listerienstämmen, zeigten nur in Milz (3d pi) und

Dünndarm (5d pi) signifikante Unterschiede. C3HeB/FeJ Mäuse reagierten auf die

Infektion mit beiden Listerienvarianten sehr empfindlich. Im Fall der A/JOlaHsd

Mäuse zeigte eine Infektion mit LmoEGDe-lux-mur an Tag drei nach der Infektion nur

in der Leber einen signifikanten Unterschied in der Listerienanzahl im Vergleich zu

einer Infektion mit LmoEGDe-lux.

Ergebnisse

77

Abbildung 2-24: Bakterielle Keimlasten in den inneren Organe ausgewählter Maus-inzuchtstämme nach der oralen Infektion mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-mur-lux. Zur Analyse wurden für jeden Zeitpunkt acht Weibchen von (A) C3HeB/FeJ, (B) A/JOlaHsd, (C) BALB/cJ und (D) C57BL/6J im Alter von zehn Wochen mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux oral infiziert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Organe homogenisiert und in Verdünnungsstufen auf BHI-Agarplatten ausgestrichen. Die Analyse des bakteriellen Wachstums in den inneren Organen ist für die Tage drei und fünf nach der Infektion für die Mittelwerte und deren Standardfehler (SEM) dargestellt. Statistische Signifikanzen zwischen LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux sind angezeigt (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0,001; nicht-parametrischer Mann-Whitney-U-Test). Dargestellt ist jeweils ein repräsentatives Ergebnis aus zwei durchgeführten Experimenten.

Ergebnisse

78

Im Verlauf der Infektion konnte ein Anstieg der Listerienanzahl in der Milz und in der

Gallenblase der LmoEGDe-lux-mur infizierten A/JOlaHsd Mäuse um das Zehnfache,

in der Leber, im Gehirn und im Dünndarm um das Hundertfache beobachtet werden.

Während die orale Infektion mit LmoEGDe-lux in einem geringen Anstieg der

Listerienanzahl in Milz, Leber, Dünndarm und Gehirn resultierte, sank die bakterielle

Keimlast in den mLK von Tag drei auf Tag fünf nach der Infektion um den Faktor

zehn. Die Unterschiede der bakteriellen Keimlasten in den analysierten Organe der

A/JOlaHsd Mäuse, im Vergleich der Infektion murinisierter mit nicht-murinisierten

Listerienstämme, zeigte an Tag fünf nach der Infektion signifikante Unterschiede in

der Milz, in der Leber, in der Gallenblase, im Dünndarm und in den mLK (Abbildung

2-24 B). Die bakterielle Keimlast in den analysierten Organen bei LmoEGDe-lux im

Vergleich zu LmoEGDe-lux-mur infizierten BALB/cJ Mäusen wies am Tag drei nach

der Infektion signifikante Unterschiede in der Leber, in der Gallenblase und im Gehirn

auf. Im weiteren Infektionsverlauf war ein Anstieg der Bakterienanzahl in der Gallen-

blase bei LmoEGDe-lux-mur infizierten BALB/cJ Mäusen, von Tag drei auf Tag fünf,

um das Zehnfache, in der Leber und der Milz sogar um das Hundertfache, zu

beobachten. Nach der Infektion mit LmoEGDe-lux konnte in BALB/cJ Mäusen eine

Zunahme der Listerienanzahl in der Gallenblase, von Tag drei auf Tag fünf nach der

Infektion, nachgewiesen werden. Die bakterielle Keimlast in den mLK reduzierte sich

von Tag drei auf Tag fünf, sowohl bei der Infektion mit LmoEGDe-lux als auch bei der

Infektion mit LmoEGDe-lux-mur um den Faktor zehn. Signifikante Unterschiede

konnten beim Vergleich der bakteriellen Keimlasten der LmoEGDe-lux zu LmoEGDe-

lux-mur infizierten BALB/cJ Mäusen, an Tag fünf nach der Infektion, in der Milz, in

der Leber und im Dünndarm nachgewiesen werden. Die Listerienanzahl in den

analysierten Organen von LmoEGDe-lux im Vergleich zu LmoEGDe-lux-mur infizier-

ten C57BL/6J Mäusen wies am Tag drei nach der Infektion einen signifikanten

Unterschied in der Gallenblase auf. Von Tag drei auf Tag fünf nach der Infektion war

ein Anstieg der Bakterienanzahl in der Leber und im Gehirn bei LmoEGDe-lux-mur

infizierten C57BL/6J Mäusen, um das Zehnfache, in der Gallenblase um das

Hundertfache, zu beobachten. Die Infektion mit LmoEGDe-lux führte in C57BL/6J

Mäusen von Tag drei auf Tag fünf nach der Infektion zu einer Zunahme der

Ergebnisse

79

Listerienanzahl im Gehirn um den Faktor zehn. Die bakterielle Keimlast in den mLK

reduzierte sich von Tag drei auf Tag fünf, sowohl bei der Infektion mit LmoEGDe-lux

als auch bei der Infektion mit LmoEGDe-lux-mur um den Faktor zehn. Ebenso sank

die Listerienanzahl in der Milz LmoEGDe-lux infizierter C57BL/6J sowie im Dünn-

darm LmoEGDe-lux-mur infizierter C57BL/6J Mäuse, von Tag drei auf Tag fünf, um

den Faktor hundert. Signifikante Unterschiede konnten beim Vergleich der bakteriel-

len Keimlasten der LmoEGDe-lux zu LmoEGDe-lux-mur infizierten C57BL/6J Mäuse,

am Tag fünf nach der Infektion, in der Milz, in der Leber und in den mLK nach-

gewiesen werden.

Die Analyse der bakteriellen Keimlasten zeigten die deutlichsten Änderungen der

Listerienanzahl in den untersuchten Organen von Tag drei auf Tag fünf nach der

Infektion. Für die Analyse der Wirtsresistenz von C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd, BALB/cJ

und C57BL/6J wurden die Bakterienlasten der Organe der LmoEGDe-lux-mur

infizierten Mausinzuchtstämme am Tag fünf nach der Infektion miteinander ver-

glichen (Abbildung 2-25). Die C3HeB/FeJ Mäuse wiesen am Tag fünf nach der Infek-

tion mit LmoEGDe-lux-mur die höchste Anzahl an Listerien im Dünndarm, in den

mLK, in der Milz, in der Leber und in der Gallenblase auf, gefolgt von A/JOlaHsd und

BALB/cJ Mäusen. Dabei konnte eine hundertfach höhere Listerienanzahl in den

Organen der C3HeB/FeJ Mäuse im Vergleich zu C57BL/6J Mäuse festgestellt

werden. Die A/JOlaHsd Mäuse zeigten eine zehnfach höhere bakterielle Keimlast in

den mLK und der Gallenblase und eine bis zu hundertfach höhere Listerienanzahl im

Dünndarm, der Milz und der Leber im Vergleich zu C57BL/6J Mäusen. Die Infektion

der BALB/cJ Mäuse resultierte an Tag fünf nach der Infektion mit LmoEGDe-lux-mur

in einer zehnfach höheren Listerienanzahl in den mLK, der Leber und der Milz im

Vergleich zu C57BL/6J Mäusen. Die signifikanten Unterschiede in den Bakterien-

lasten von Dünndarm, mLK, Milz, Leber und Gallenblase zwischen den

ausgewählten Mausinzuchtstämmen sind in der Abbildung 2-25 dargestellt. Die

Anzahl der Listerien im Gehirn der C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd, BALB/cJ und C57BL/6J

Mäuse zeigten keine signifikanten Unterschiede.

Ergebnisse

80

Abbildung 2-25: Bakterielle Keimlast in den inneren Organen ausgewählter Maus-inzuchtstämme am Tag fünf nach der oralen Infektion mit 5x109 CFU LmoEGDe-mur-lux. Zur Analyse der bakteriellen Keimlast in (A) Dünndarm, (B) mLK, (C) Milz, (D) Leber, (E) Gallenblase und (F) Gehirn in ausgewählten Mausinzuchtstämmen. Für jeden Zeitpunkt wurden acht Weibchen von C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd, BALB/cJ und C57BL/6J im Alter von zehn Wochen mit 5x109 CFU LmoEGDe-mur-lux oral infiziert. An Tag fünf nach der Infektion wurden die Organe homogenisiert und in Verdünnungsstufen auf BHI-Agarplatten aus-gestrichen. Die Analyse des bakteriellen Wachstums in den inneren Organen ist für den Tag fünf nach der Infektion für die Mittelwerte und deren Standardfehler (SEM) dargestellt. Statistische Signifikanzen zwischen C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd, BALB/cJ und C57BL/6J sind angezeigt (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0,001; nicht-parametrischer Mann-Whitney-U-Test). Dargestellt ist jeweils ein repräsentatives Ergebnis aus zwei durchgeführten Experimenten.

Ergebnisse

81

Somit lässt sich die Suszeptibilität eines Mausstammes an der bakteriellen Keimlast

beurteilen. Je empfindlicher ein Mausstamm, desto höher die Bakterienlast in den

inneren Organen.

2.3.4.3 Histopathologische Analyse von LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux

infizierten Mausinzuchtstämmen

Parallel zur Analyse der bakteriellen Keimlast erfolgte die histopathologische und

immunhistologische Analyse in den Organen Milz, Leber und Dünndarm. Die Organe

Milz, Leber und Dünndarm wurden an Tag eins, drei, fünf und sieben nach der Infek-

tion präpariert, in Formaldehyd fixiert und mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Weiterhin

erfolgte mit Hilfe immunhistologischer Verfahren die Analyse zum Nachweis auf

Listeria monocytogenes innerhalb des Gewebes. Abbildung 2-26 zeigt die histo-

pathologische Analyse der Leber von C3HeB/FeJ und C57BL/6J am Tag fünf nach

der oralen Infektion mit 5x109 CFU LmoEGDe-mur-lux. Die orale Infektion von

C57BL/6J Mäusen mit dem Listerienstamm LmoEGDe-mur-lux führte zu moderaten

Schädigungen des Leberparenchyms mit vereinzelten Nekrosen und Infiltrationen

von Granulozyten und Makrophagen. Im Vergleich dazu zeigte die infizierte Leber

der C3HeB/FeJ Mäuse eine massivere Schädigung des Lebergewebes mit entzünd-

lichen Läsionen. Es konnten vermehrt Nekrosen und Infiltrationen von Granulozyten

und Makrophagen nachgewiesen werden. Mit Hilfe der immunhistologischen Analyse

sollte der Nachweis der Listerien innerhalb des Gewebes über die immun-

histologische Färbung unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen

Listeria monocytogenes erfolgen (Abbildung 2-26 C und D). Listerien konnten

innerhalb der Infiltrate und Nekrosen des Leberparenchyms der infizierten

C3HeB/FeJ Mäuse reichlich nachgewiesen werden. Auch konnten in den

histologischen Präparaten der Leber von C57BL/6J Mäusen Listerien nachgewiesen

werden. Jedoch war die Anzahl der dokumentierten Bakterien in C57BL/6J Mäusen

deutlich geringer im Vergleich zu den nachgewiesenen Listerien in C3HeB/FeJ

Mäusen.

Ergebnisse

82

Abbildung 2-26: Histopathologische und immunhistologische Analyse der Leber von oral infizierten C57BL/6J und C3HeB/FeJ Mäusen mit 5x109 CFU LmoEGDe-mur-lux. Zehn Wochen alte C57BL/6J und C3HeB/FeJ Mäuse wurden mit 5x109 CFU LmoEGDe-mur-lux oral infiziert. Am Tag fünf nach der Infektion erfolgte die Präparation der Leber und die histologische und immunhistologische Analyse. (A, B) HE-Färbung und (C, D) anti-Listeria-Färbung der Leber; Pfeile in A und B zeigen Nekrosen und Infiltrationen von Granulozyten, Pfeile in C und D weisen auf Listerien (braun). Balkengröße (A, B) 200µm. Balkengröße (C, D) 50µm. Dargestellt sind repräsentative histologische Präparate (n=8) von zwei durchgeführten Experimenten.

2.3.4.4 Analyse der Chemokin-Zytokin-Produktion von LmoEGDe-lux und

LmoEGDe-mur-lux infizierten Mausinzuchtstämmen

Im Verlauf einer Listerieninfektion erfolgt frühzeitig eine Antwort des angeborenen

Immunsystems. Neutrophile Granulozyten spielen eine wichtige Rolle, die bakterielle

Ausbreitung und Vermehrung durch Produktion antimikrobieller Wirkstoffe zu kontrol-

lieren (Rogers und Unanue, 1993). Für die Aktivierung und Regulierung der ange-

borenen Immunantwort dienen Chemokine und Zytokine als Vermittler zwischen den

Zellen. Sekretiertes IL-6 aus infizierten Zellen rekrutiert Granulozyten, welche selbst

durch Produktion von CSF-1 und CCL2 die Einwanderung von Makrophagen indu-

zieren (Guleria und Pollard, 2001; Mandel und Cheers, 1980). Diese produzieren

TNF-α und IL-12, welche natürliche Killerzellen zur Freisetzung von IFN-γ anregen

Ergebnisse

83

(Havell, 1987; Tripp et al., 1993), was wiederum weitere Makrophagen aktiviert.

Durch die neutrophil bedingte Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies erfolgt die

durch Makrophagen bedingte Eliminierung von Listeria monocytogenes.

Inflammatorische Zytokine sind wichtig für die Kommunikation der beteiligten Immun-

zellen. Zur Analyse des Effektes einer Infektion mit Listeria monocytogenes auf die

angeborene Immunabwehr wurden am Tag drei und fünf nach der Infektion mit

LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux Serumproben von C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd,

BALB/cJ und C57BL/6J Mäusen entnommen und die Konzentration verschiedener

Chemokine und Zytokine mit Hilfe eines Multi-Bead-Immunoassays untersucht.

Spektral kodierte Kügelchen dienen als Träger für die Antikörper gegen ausgewählte

Chemokine und Zytokine. Die unterschiedlichen spektralen Eigenschaften der Beads

erlauben die quantitative Analyse der chemotaktischen Stoffe. In Abbildung 2-27 sind

Konzentration von IFN-γ, IL-10, TNF-α, IL-6, CCL2, IL-5 und IL-1β in den

Mausinzuchtstämmen C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd, BALB/cJ und C57BL/6J an Tag drei

und fünf nach der Infektion mit LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-mur-lux dargestellt. In

C3HeB/FeJ resultierte sowohl die Infektion mit LmoEGDe-lux als auch mit

LmoEGDe-mur-lux in einen Anstieg der dargestellten Zytokine von Tag drei auf Tag

fünf nach der Infektion (Abbildung 2-27 A). Es konnten signifikante Unterschiede bei

der Konzentration von IFN-γ, TNF-α und CCL2 von Tag drei auf Tag fünf nach der

Infektion sowohl bei LmoEGDe-lux infizierten als auch bei LmoEGDe-mur-lux infi-

zierten C3HeB/FeJ Mäusen nachgewiesen werden. Ebenfalls konnte eine signifi-

kante Erhöhung von IL-10 und IL-6 bei LmoEGDe-mur-lux infizierten C3HeB/FeJ

Mäusen festgestellt werden. Bei IL-5 und IL-1β war dagegen nur ein geringer Anstieg

nachzuweisen. Die Infektion von A/JOlaHsd Mäusen mit LmoEGDe-lux bzw.

LmoEGDe-mur-lux resultierte ebenfalls in einem Anstieg von IFN-γ, TNF-α, IL-6,

CCL2, IL-5 und IL-1β von Tag drei auf Tag fünf nach der Infektion. Dabei konnte ein

signifikanter Unterschied von Tag drei auf Tag fünf nach der Infektion mit LmoEGDe-

mur-lux bei TNF-α, IL-6 und CCL2 beobachtet werden. Weiterhin zeigten sich Unter-

schiede in der Produktion der Chemokine und Zytokine in Abhängigkeit von der

Infektion mit LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux.

Ergebnisse

84

Abbildung 2-27: Chemokin- und Zytokinproduktion ausgewählter Mausinzuchtstämme nach der oraler Infektion mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-mur-lux. Die Analyse der Chemokin- und Zytokinproduktion erfolgte mit Hilfe eines Luminex-Assay. (A) C3HeB/FeJ, (B) A/JOlaHsd, (C) BALB/cJ und (D) C57BL/6J wurden im Alter von zehn Wochen mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux (3d, 5d) und LmoEGDe-mur-lux (3d mur, 5d mur) oral infiziert. Nach drei bzw. fünf Tagen erfolgte die Serumentnahme (LmoEGDe-lux (3d, 5d) und LmoEGDe-mur-lux (3d mur, 5d mur)). Je Zeitpunkt, Mausstamm und Listerienstamm erfolgte die Analyse in Triplikaten. Mittelwerte und deren Standardfehler (SEM) sind dargestellt. Sta-tistische Signifikanzen zwischen LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux sowie zwischen Tag drei und Tag fünf nach der Infektion sind angezeigt (*p<0.05; nicht-parametrischer Mann-Whitney-U-Test).

Ergebnisse

85

So konnte am Tag drei nach der Infektion ein signifikanter Unterschied der CCL2

Synthese zwischen LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux infizierten A/JOlaHsd

Mäusen festgestellt werden. Weiter resultierte die Infektion mit LmoEGDe-mur-lux

am Tag fünf nach der Infektion in einer signifikant höheren Produktion von TNF-α, IL-

6, CCL2 und IL-5 als im Vergleich zur Infektion mit LmoEGDe-lux (Abbildung 2-27 B).

In BALB/cJ Mäusen konnte sowohl nach der Infektion mit LmoEGDe-lux als auch mit

LmoEGDe-mur-lux eine Zunahme der Konzentration von IL-10, TNF-α, IL-6, IL-5 und

IL-1β von Tag drei auf Tag fünf nach der Infektion im Serum nachgewiesen werden.

Signifikante Unterschiede wurden jedoch nicht festgestellt. Ein Anstieg der Kon-

zentration von CCL2 konnte nur nach der Infektion von LmoEGDe-mur-lux

beobachtet werden. Dagegen konnte eine Zunahme der Konzentration von IFN-γ

nach der Infektion mit beiden Listerienvarianten nicht belegt werden (Abbildung 2-27

C). Nach der Infektion von C57BL/6J Mäusen mit LmoEGDe-lux bzw. LmoEGDe-

mur-lux waren nur geringe Mengen von Chemokinen und Zytokinen messbar, die

Konzentrationen von IFN-γ, IL-10, TNF-α, IL-5 und IL-1β lagen an Tag drei nach der

Infektion mit LmoEGDe-mur-lux unter der Nachweisgrenze. Es konnten bei

C57BL/6J Mäusen keine signifikanten Veränderungen in der Produktion der

chemotaktischen Stoffe nachgewiesen werden (Abbildung 2-27 D).

2.4 Vergleich der Wirtsspezifität und Wirtsresistenz der Listerien-

stämme LmoXen32-mur und LmoEGDe-mur-lux

Die vorangegangenen Infektionen mit LmoXen32-mur und LmoEGDe-mur-lux

resultierten in unterschiedlichen Ergebnissen der Wirtsresistenz von C3HeB/FeJ,

A/JOlaHsd, BALB/cJ und C57BL/6J Mäusen. Die Infektion mit den attenuierten

Listerienstämmen LmoXen32 und LmoXen32-mur resultierte in einer geringeren

Mortalitätsrate als die Infektionen mit LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux (siehe

Abbildungen 2-5 und 2-17). Die Ergebnisse des in vivo Imaging zeigten, dass

LmoEGDe-mur-lux in der Leber und Abdominalbereich detektierbar war, wogegen

nach der Infektion mit LmoXen32-mur Biolumineszenzsignale in der Gallenblase

oder im Darm nachgewiesen werden konnte (Vergleich Abbildung 2-6 und Abbildung

2-20). Die Untersuchung der bakteriellen Keimlast ergab eine höhere Listerienanzahl

Ergebnisse

86

in den Organen LmoEGDe-mur-lux infizierter BALB/cJ Mäuse als in den Organen

LmoXen32-mur infizierter BALB/cJ Mäuse (Vergleich Abbildung 2-9 und Abbildung 2-

24). Auch konnten während der histopathologischen und immunhistologischen

Analyse der Leber von BALB/cJ Mäusen massive Infiltrationen von neutrophilen

Granulozyten, Makrophagen und Listerien nach der Infektion mit LmoEGDe-mur-lux

(Abbildung 2-16) nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu führte die Infektion mit

LmoXen32-mur zu moderaten Schädigungen des Gewebes mit weniger

entzündlichen Läsionen innerhalb des Leberparenchyms (Abbildung 2-10). Die

Ursache der deutlichen Attenuierung des Listerienstamms LmoXen32-mur liegt in der

genetischen Modifikation über die Integration des luxABCDE Operons in das Genom

von Listeria monocytogenes Lmo 10403S (Hardy et al., 2004). Diese Integration

resultierte in einer viermal höheren LD50 im Vergleich zum ausgehenden

Wildtypstamm Lmo 10403S (Hardy et al., 2004).

Die Infektion mit LmoEGDe-mur-lux zeigte deutliche Unterschiede im Verlauf der

Listerieninfektion der Mausinzuchtstämme C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd, BALB/cJ und

C57BL/6J. Die Infektion mit LmoEGDe-mur-lux resultierte bei C3HeB/FeJ Mäuse in

einer ausgeprägten Suszeptibilität mit einer geringeren Überlebensrate (Abbildung 2-

17). Die Infektion von A/JOlaHsd und BALB/cJ Mäusen zeigte intermediäre Infek-

tionsverläufe. In C57BL/6J konnte eine deutliche Resistenz gegenüber einer

Listerieninfektion nachgewiesen werden. Die Infektion mit LmoEGDe-mur-lux erlaubt

die Abhängigkeit der genetischen Prädisposition im Mausmodell zu untersuchen.

2.5 Korrelation der bakteriellen Keimlast mit Biolumineszenzsignalen in

den inneren Organen von LmoXen32 und LmoXen32-mur infizierten

Mausinzuchtstämmen im Vergleich zu LmoEGDe-lux und LmoEGDe-

lux-mur infizierten Mausinzuchtstämmen

Das Biolumineszenz-Imaging erlaubt, den Infektionsverlauf in vivo zu verfolgen und

Aussagen über Dissemination und Krankheitsentwicklung nach einer oralen

Listerieninfektion zu treffen. Für die Analyse, erfolgte mit Hilfe des Xenogen IVIS, die

Messung der Signalstärke der Biolumineszenz in den inneren Organen. Diese

Ergebnisse

87

wurden mit den entsprechenden bakteriellen Keimlasten in Beziehung gesetzt. Es

erfolgte daraufhin die Korrelation der nachgewiesenen Biolumineszenzsignale mit

der entsprechenden Listerienanzahl in den inneren Organen. Abbildung 2-28 zeigt

die Analyse der Korrelation für die Infektion mit LmoXen32 und LmoXen32-mur in

BALB/cJ Mäusen und in Abbildung 2-29 die Korrelation der Biolumineszenzsignale

für die Infektion mit LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux in den Maus-

inzuchtstämmen C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd, BALB/cJ und C57BL/6J. Die Infektion mit

LmoXen32 und LmoXen32-mur zeigte geringere bakterielle Keimlasten und somit

auch geringere Biolumineszenzsignale. Als Folge zeigten die ermittelten

Regressionsgeraden einen geringeren Anstieg. Die Regressionsgerade in

LmoXen32 infizierten Organen zeigte einen Anstieg von m=0,24 und in LmoXen32-

mur infizierten Organen von m=0,02793.

Abbildung 2-28: Korrelation der bakteriellen Keimlast in den inneren Organe mit den nachgewiesenen Biolumineszenzsignalen. Zehn Wochen alte BALB/cJ Mäuse wurden mit 5x109 CFU LmoXen32 oder LmoXen32-mur oral infiziert. An den Tagen eins, drei, fünf und sieben erfolgte die Organpräparation von je acht Tieren sowie die Messung der Biolumineszenz und die Analyse der bakteriellen Keim-last der inneren Organe. Auf der x-Achse sind die Keimlasten in CFU/mg Organ und auf der y-Achse die emittierten Lichtsignale der Listerien in Photonen/s/cm2/sr dargestellt. Die Re-gressionsgerade zeigt einen Anstieg von 0,24 bei LmoXen32 und 0,02793 bei LmoXen32-mur.

Die gemessenen Biolumineszenzsignale von LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux

infizierten Organen mit den entsprechenden bakteriellen Keimlasten sind in Ab-

bildung 2-29 dargestellt.

Ergebnisse

88

Abbildung 2-29: Korrelation der bakteriellen Keimlast in den inneren Organen mit den nachgewiesenen Biolumineszenzsignalen. Zehn Wochen alte (A) C3HeB/FeJ, (B) A/JOlaHsd, (C) BALB/cJ und (D) C57BL/6J Mäuse BALB/cJ Mäuse wurden mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux oder LmoEGDe-mur-lux-mur oral infiziert. An den Tagen eins, drei, fünf und sieben erfolgte die Organpräparation von je acht Tieren und die Messung der Biolumineszenz sowie die Analyse der bakteriellen Keimlast in den inneren Organen. Auf der x-Achse sind die Keimlasten in CFU/mg Organ und auf der y-Achse die ausgesendeten Lichtsignale der Listerien in Photonen/s/cm2/sr dargestellt. Die Regressionsgerade zeigt einen Anstieg von m=0,1824 in C3HeB/FeJ, m=0,0989 in A/JOlaHsd, m=0,0559 in BALB/cJ und m=0,04866 in C57BL/6J nach der Infektion mit LmoEGDe-lux. Nach der Infektion mit LmoEGDe-mur-lux einen Anstieg von m=0,5802 in C3HeB/FeJ, m=0,3575 in A/JOlaHsd, m=0,1301 in BALB/cJ und m=0,0816 in C57BL/6J.

Ergebnisse

89

Die Korrelation der Biolumineszenzstärke mit der Listerienanzahl ergab Re-

gressionsgeraden mit einer größeren Steigung in LmoEGDe-mur-lux infizierten

Organen im Vergleich zu LmoEGDe-lux infizierten Organen. Die Regressions-

geraden nach der Infektion mit LmoEGDe-lux zeigten einen Anstieg von m=0,1824 in

C3HeB/FeJ, m=0,0989 in A/JOlaHsd, m=0,0559 in BALB/cJ und m=0,04866 in

C57BL/6J. Nach der Infektion mit LmoEGDe-mur-lux konnte ein Anstieg von

m=0,5802 in C3HeB/FeJ, m=0,3575 in A/JOlaHsd, m=0,1301 in BALB/cJ und

m=0,0816 in C57BL/6J Mäusen festgestellt werden. In den Mausstämmen

C3HeB/FeJ und A/JOlaHsd war eine Korrelation zwischen der Biolumineszenz und

der Listerienanzahl in den inneren Organen erkennbar. Ab einer Bakterienlast von

ca. 104 CFU/mg Organ war ein linearer Anstieg von bakterieller Keimlast zu der

Stärke des Biolumineszenzsignals nachweisbar. Bei BALB/cJ Mäusen zeigte sich ein

geringerer Anstieg der Regressionsgerade. Die Infektion von C57BL/6J Mäusen

resultierte aufgrund ihrer ausgeprägten Resistenz in einer geringeren Bakterienlast.

Dadurch waren nur wenige schwache Biolumineszenzsignale detektierbar und nur

ein geringer Anstieg erkennbar.

2.6 Infektion des zentralen Nervensystems nach der Infektion mit

LmoXen32, LmoXen32-mur, LmoEGDe, LmoEGDe-lux und

LmoEGDe-mur-lux

Listeria monocytogenes besitzt die Fähigkeit epitheliale Barrieren zu überqueren.

Neben der intestinalen Barriere und der Plazentaschranke besitzen sie auch die

Fähigkeit die Blut-Hirn-Schranke zu durchqueren, welches zu Meningitis und Enze-

phalitis führen kann. Während der vorangegangenen Experimente zur Analyse des

Infektionsprozesses in vivo nach oraler Infektion mit 5x109 CFU Listeria mono-

cytogenes zeigten acht Tiere neurologische Ausfallerscheinungen. Diese waren zu

Beginn gekennzeichnet durch Torticollis, später gefolgt von „kreiselnden“ Bewe-

gungen um die Längsachse und dem Verweilen am Käfigboden. Die Zeitpunkte des

Auftretens dieser Symptome konnten sieben bis acht Tage nach der oralen Infektion

beobachtet werden und sind in Tabelle 2-1 zusammengefasst.

Ergebnisse

90

Tabelle 2-1: Zeitpunkt des Auftretens der Anzeichen einer Invasion des ZNS in ausge-wählten Mausinzuchtstämmen nach oraler Infektion mit Listeria monocytogenes.

Listerienstamm Mausinzuchtstamm Zeitpunkt des Auftretens nach der Infektion [Tage]

LmoXen32-mur 129P2/Ola 7

LmoXen32-mur BALB/cJ 8

LmoEGDe BALB/cJ 8

LmoEGDe-mur-lux A/JOlaHsd 7

LmoEGDe-mur-lux BALB/cJ 7

LmoEGDe-mur-lux C57BL/6J 7

LmoEGDe-lux BALB/cJ 7

LmoEGDe-lux C57BL/6J 7

Das Auftreten neurologischer Ausfallerscheinungen war ein seltenes Ereignis. Nach

der oralen Infektion mit verschiedenen Listerienstämmen (LmoXen32-mur,

LmoEGDe, LmoEGDe-lux und LmoEGDe-lux-mur) konnte der neurologische

Phänotyp in den Mausinzuchtstämmen 129P2/Ola, A/JOlaHsd, BALB/cJ und

C57BL/6J nachgewiesen werden. Von 600 Versuchstieren, welche über einen Ver-

suchszeitraum von mindestens sieben Tagen beobachtet werden konnten, zeigten

nur acht Tiere neurologische Symptome.

In Abbildung 2-30 ist ein histopathologischer und immunhistologischer Befund des

Gehirns einer 129P2/Ola Maus, mit neurologischen Symptomen, an Tag sieben nach

der oralen Infektion mit LmoXen32-mur dargestellt. Es sind deutliche Infiltrationen

von Granulozyten in die Meningen erkennbar. Die immunhistologische Analyse auf

Listeria monocytogenes konnte intrazellulär vorliegende Bakterien nachweisen. Der

neurologische Phänotyp konnte nur zufällig beobachtet werden und war nicht repro-

duzierbar.

Ergebnisse

91

Abbildung 2-30: Histopathologie und Immunhistologie des Gehirns einer „kreiselnden“ 129P2/Ola Maus nach der oralen Infektion mit 5x109 CFU LmoXen32-mur. Zehn 129P2/Ola Mäuse wurden im Alter von zehn Wochen oral mit 5x109 CFU LmoXen32-mur oral infiziert. Mit dem Auftreten neurologischer Symptome wurde an Tag sieben nach der Infektion das Gehirn des auffälligen Tieres präpariert, in Formaldehyd fixiert und mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt des Weiteren erfolgte die immunhistologische Analyse auf Listeria monocytogenes. (A, B) HE-Färbung des Gehirns mit erkennbaren Infiltrationen von neutro-philen Granulozyten. (C) Anti-Listeria Färbung des gleichen Areals wie in Abbildung A und B Listerien (braun). Balken in A 200 µm. Balken in B und C 50 µm.

2.7 Interferonproduktion und Listerieninfektion

2.7.1 Charakterisierung des Einflusses der Interferoninduktion auf die

Listerieninfektion

Die Familie der Typ-I-Interferone (IFN), bestehend aus verschiedenen IFN-α Sub-

typen und IFN-β, werden nicht nur nach der Infektion mit Viren, sondern auch nach

der Infektion mit nicht-viralen Pathogenen induziert. Interferone aktivieren weiter eine

Vielzahl von Genen, welche wiederum in den Prozessen der angeborenen und

erworbenen Immunabwehr von Bedeutung sind (Petska et al., 2004). Die Synthese

von Typ-I-Interferonen wird ebenfalls nach der Infektion mit Listeria monocytogenes

induziert (O´Riordan et al., 2002). Im Rahmen der Phänotypisierung von Maus-

mutanten erfolgte die Infektion von Interferon-α inducible protein 27 like 2A knock-out

(Ifi27l2a-KO) Mäusen. Das Gen Ifi27l2a (lSG12b1) gehört zu einer großen Familie

der über die Interferone stimulierten Gene und wird vor allem in Makrophagen und

Fettgewebe exprimiert (Ohgaki et al., 2007). Ifi27l2a-KO Mäuse wurden im Alter von

zehn Wochen intravenös, damit ohne Berücksichtigung der intestinalen Barriere, mit

Ergebnisse

92

2x104 CFU LmoEGDe-lux-mur infiziert und auf die Änderung im Verlauf des Körper-

gewichtes und die Überlebensrate untersucht. Weiterhin erfolgte die Analyse der

bakteriellen Keimlast in der Leber und der Milz am Tag drei nach der Infektion.

Parallel erfolgte die Infektion der entsprechenden Wildtyp Mäuse, C57BL/6N, zur

Kontrolle und Beurteilung des Infektionsverlaufs. Der Verlauf der Körpergewichte und

die Überlebensraten der infizierten Ifi27l2a-KO und C57BL/6N Mäuse sind über den

Versuchszeitraum von 15 Tagen in der Abbildung 2-31 dargestellt. Die Infektion mit

LmoEGDe-mur-lux resultierte bei Ifi27l2a-KO Mäusen in einer Überlebensrate von

33% und bei C57BL/6N Mäusen in 30%. Es konnte jedoch kein signifikanter Unter-

schied zwischen den Überlebensraten beider Mausstämme festgestellt werden

(Logrank Test: p=0,8894).

Abbildung 2-31: Überlebensrate und der Verlauf des Körpergewichtes von Ifi27l2a-KO und C57BL/6N Mäusen nach intravenöser Infektion mit 2x104 CFU LmoEGDe-mur-lux. Zehn Wochen alte Weibchen von Ifi27l2a-KO und C57BL/6N Mäusen wurden mit 2x104 CFU LmoEGDe-mur-lux intravenös infiziert. (A) Überlebensrate und (B) Verlauf des Körper-gewichtes von Ifi27l2a KO (rot) und C57BL/6N (schwarz) in Prozent und deren Standardfehler (SEM). Statistische Signifikanzen des Verlaufes der Körpergewichte zwischen Ifi27l2a-KO und C57BL/6N sind dargestellt (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; nicht-parametrischer Mann-Whitney-U-Test).

Im Verlauf der Änderung des Körpergewichtes konnten bei der Infektion von Ifi27l2a-

KO Mäusen signifikante Unterschiede im Vergleich zu den infizierten C57BL/6N

Mäusen an den Tagen zwei, drei und vier nach der Infektion nachgewiesen werden.

Eine Abnahme des Körpergewichtes bei infizierten Ifi27l2a-KO Mäusen konnte bis

zum Tag fünf nach der Infektion beobachtet werden. Mit Tag sechs nach der Infek-

Ergebnisse

93

tion konnte eine Gewichtszunahme bei Ifi27l2a-KO Mäusen bis zum Tag sieben nach

der Infektion nachgewiesen werden, gefolgt von einer erneuten Reduktion des Ge-

wichtes bis zum Tag neun nach der Infektion. Ab Tag zehn nach der Infektion er-

folgte die kontinuierliche Gewichtszunahme bis zum Ende des Versuches. Im Ver-

gleich zu den Ifi27l2a-KO Mäusen zeigten die C57BL/6N Mäuse eine Gewichtsab-

nahme bis zum Tag neun nach der Infektion, gefolgt von einer kontinuierlichen Ge-

wichtszunahme bis zum Ende des Beobachtungszeitraum.

Die Analyse der bakteriellen Keimlast von Ifi27l2a-KO und C57BL/6N Mäusen

erfolgte in der Leber und der Milz am Tag drei nach der Infektion mit 2x104 CFU

LmoEGDe-mur-lux. Die Organe wurden in PBS homogenisiert und in Verdünnungs-

stufen auf BHI-Agarplatten ausgestrichen. Am folgenden Tag wurden die gewach-

senen Kolonien gezählt und die bakterielle Keimzahl in CFU/mg Organ berechnet

(Abbildung 2-31). Die intravenöse Infektion von Ifi27l2a-KO Mäusen mit LmoEGDe-

mur-lux resultierte am Tag drei nach der Infektion in einer signifikant höheren bak-

teriellen Keimlast in der Milz und in der Leber im Vergleich zu den infizierten

C57BL/6N Mäusen.

Abbildung 2-32: Bakterielle Keimlast in Leber und Milz von Ifi27l2a-KO und C57BL/6N Mäusen nach intravenöser Infektion mit 2x104 CFU LmoEGDe-mur-lux. Zehn Wochen alte Weibchen von Ifi27l2a-KO und C57BL/6N Mäusen wurden mit 2x104 CFU LmoEGDe-mur-lux intravenös infiziert. (A) Bakterielle Keimlast in der Leber und (B) in der Milz von Ifi27l2a-KO (rot) und C57BL/6N Mäusen (schwarz). Statistische Signifikanzen der Bakterienanzahl zwischen Ifi27l2a-KO und C57BL/6N Mäusen sind dargestellt (*p<0.05, ****p<0.0001; nicht-parametrischer Mann-Whitney-U-Test).

Ergebnisse

94

2.7.2 Charakterisierung der Listerieninfektion in Bezug auf die Interferon-β

Produktion

Interferon-β spielt bei der Infektion mit Viren und intrazellulären Mikroorganismen

eine wichtige Rolle für die Regulierung der Immunantwort (Stockinger und Decker,

2008; Stockinger et al., 2009). Mit Etablierung einer Interferon-β-Reportermaus war

es möglich, die gewebespezifische Interferon-β-Produktion aufzuzeigen. So konnte

die Visualisierung der IFN-β-Produktion in verschiedenen Geweben nach der

Infektion mit Influenza A oder La Crosse Virus in vivo beobachtet werden

(Lienenklaus et al., 2009). In dieser Maus ist ein Luziferase-Reportergen unter

Kontrolle des IFN-β-Promoters in den Interferon-β1 Locus (Ifnb1) über Gen-Targeting

eingebracht worden. Somit erfolgt eine Expression der Luziferase nach Induktion des

Ifnb1 Promoters in vivo innerhalb der Organe und kann durch die Injektion von D-

Luziferin visualisiert werden. Zur Analyse der IFN-β-Produktion nach der Infektion mit

Listeria monocytogenes unter Einfluss der Internalin A Murinisierung, wurden IFN-β-

Reportermäuse (BL6albino/-β+/Δβ-luc) mit LmoEGDe-lux, LmoEGDe-mur-lux, LO28

und LO28-mur oral infiziert. Die Listerienstämme EGDe und LO28 unterscheiden

sich in ihrer Fähigkeit eine IFN-β-Synthese zu induzieren. Der Stamm LO28 induziert

im Vergleich zu LmoEGDe eine stärkere IFN-β-Produktion (Reutterer et al., 2008).

Zur Analyse der IFN-β-Synthese nach einer Infektion mit Listeria monocytogenes

wurden je fünf Weibchen der IFN-β-Reportermäuse im Alter von zehn bis zwölf

Wochen mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux, LmoEGDe-mur-lux, LO28 und LO28-mur oral

infiziert und täglich auf die IFN-β-Produktion untersucht (Abbildung 2-33). An Tag

eins nach der Infektion waren Signale in den zervikalen Lymphknoten (zLK) einzelner

Tiere unabhängig vom infizierten Listerienstamm erkennbar. Ab Tag zwei nach der

Infektion zeigten die LO28-mur infizierten Mäuse die deutlichste Induktion der IFN-β-

Produktion in den zervikalen Lymphknoten (zLK), im Darmbereich und teilweise in

der Leber.

Ergebnisse

95

Abbildung 2-33: IFN-β Induktion nach oraler Infektion mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux, LmoEGDe-mur-lux, LO28 und LO28-mur in IFN-β-Reportermäusen BL6albino/IFN-β+/Δβ-

luc. Je fünf Weibchen BL6albino/IFN-β+/Δβ-luc wurden im Alter von zehn bis zwölf Wochen mit 5x109 CFU LmoEGDe-lux, LmoEGDe-mur-lux, LO28 und LO28-mur oral infiziert. Es erfolgte das BLI auf die IFN-β Induktion nach angezeigten Zeitpunkten. Zur Visualisierung der IFN-β-Produktion wurden den Mäuse D-Luziferin 150mg/kg intravenös injiziert. Die Falschfarben-überlagerung repräsentiert die IFN-β Induktion nach 4 min Integrationszeit in Photonen/s/cm2/sr, Skala rechts.

Die Signalstärke der Biolumineszenz in den Tieren infiziert mit LmoEGDe-lux,

LmoEGDe-mur-lux und LO28 war deutlich geringer als in den LO28-mur infizierten

Mäusen. Eine Induktion der IFN-β-Synthese konnte in den zervikalen Lymphknoten,

im Darm und in der Leber der LmoEGDe-lux, LmoEGDe-mur-lux und LO28 infizierten

Ergebnisse

96

Tiere beobachtet werden. Am Tag drei nach der Infektion war eine Detektion der

Biolumineszenz in LmoEGDe-lux und LO28 infizierten Tieren in den zervikalen

Lymphknoten und vereinzelt im Darmbereich messbar. Ein Tier der mit LO28

infizierten Mäuse zeigte zusätzlich ein Signal in der Leber und in den inguinalen

Lymphknoten. Dagegen konnte bei den LmoEGDe-mur-lux und LO28-mur infizierten

Mäusen an Tag drei nach der Infektion zusätzlich Biolumineszenzsignale in der

Leber nachgewiesen werden. Am Tag vier nach der Infektion zeigten die Tiere

infiziert mit LmoEGDe-mur-lux die deutlichsten Biolumineszenzsignale, vor allem in

der Leber, im Abdominalbereich und in den zervikalen Lymphknoten. Im Vergleich

dazu konnten bei den LmoEGDe-lux infizierten Mäusen nur Signale in den zervikalen

Lymphknoten und vereinzelt im Darmbereich detektiert werden. Die Mäuse infiziert

mit LO28 zeigten an Tag vier nach der Infektion eine gesteigerte Induktion der IFN-β-

Synthese in der Leber, im Darmbereich und in den zervikalen sowie inguinalen

Lymphknoten im Vergleich zu Tag drei nach der Infektion. Bei den LO28-mur

infizierten Tieren verringerte sich dagegen die Detektierbarkeit der Biolumineszenz

von Tag drei auf Tag vier nach der Infektion und konnte in die zervikalen und

inguinalen Lymphknoten sowie vereinzelt in der Leber und im Darmbereich lokalisiert

werden. An Tag fünf konnte eine Zunahme der IFN-β-Produktion in den LmoEGDe-

lux infizierten Tieren von Tag vier nach der Infektion in den zLK und im Darmbereich

beobachtet werden. Ab Tag fünf reduzierte sich die IFN-β-Synthese in der Leber im

Darmbereich und in den zervikalen Lymphknoten der LmoEGDe-mur-lux, LO28 und

LO28-mur infizierten Mäusen. Ab Tag sechs nach der Infektion konnte nur noch ver-

einzelt in den LO28 infizierten Mäusen eine schwache Biolumineszenz nach-

gewiesen werden. Diese Ergebnisse bestätigen die Resultate von Reutterer et al.,

dass LO28 eine stärkere IFN-β-Synthese induziert als LmoEGDe (Reutterer et al.,

2008). Eine IFN-β-Produktion in der Milz, wie bei Solodova et al. nach intravenöser

Infektion beschrieben, konnte nicht nachgewiesen werden (Solodova et al., 2011).

Diskussion

97

3 Diskussion

Die Infektion des Menschen mit Listeria monocytogenes erfolgt über die orale Auf-

nahme von kontaminierten Lebensmitteln. Die Maus als Tiermodell ist jedoch für die

Infektion über den oralen Infektionsweg wenig empfänglich. Durch neue detaillierte

Beschreibungen der speziesabhängigen Interaktion des bakteriellen Oberflächen-

proteins Internalin A und seinem Rezeptor E-Cadherin sind in den letzten Jahren

große Fortschritte im Verständnis des Wirtstropismus erzielt worden. Neue Erkennt-

nisse, welche die molekularen Grundlagen bei der Überquerung der Darmbarriere

beschreiben und die bakterielle Invasion nach der oralen Infektion mit Listeria mono-

cytogenes ermöglichten, konnten gewonnen werden. Der entscheidendste Faktor für

die Speziesspezifität einer Listerieninfektion liegt in der Aminosäureposition 16 des

E-Cadherins. Innerhalb des Mäuse-E-Cadherins ist ein Glutamin an dieser Stelle

positioniert (Lecuit et al., 1999). Humanes E-Cadherin sowie das von Meerschwein-

chen und Kaninchen tragen dagegen an dieser Position ein Prolin. Erfolgt ein Aus-

tausch von Glutamin mit Prolin an der Position 16 des Maus-E-Cadherins, ist das

Internalin A fähig mit diesem humanisierten Rezeptor zu interagieren (Lecuit et al.,

1999; Lecuit et al., 2005). Eine Alternative bildet die Generierung eines murinisierten

Internalin A. Die Substitutionen zweier Aminosäuren resultieren in einer erhöhten

Affinität des Internalin A zum E-Cadherin. Zum einen der Austausch von Serin zu

Asparagin an der Aminosäureposition 192 und zum anderen der Austausch von

Tyrosin zu Serin an der Position 369 (Wollert et al., 2007a). Somit konnte diese

Speziesbarriere im Tiermodell durch Generierung transgener Mäuse bzw. genetisch

modifizierter Listerienstämme überbrückt werden (Disson et al., 2008; Lecuit et al.,

2002; Monk et al., 2010; Wollert et al., 2007b).

Über den Einsatz neuer bildgebender Verfahren, wie das auch in dieser Arbeit be-

nutzte in vivo Biolumineszenz-Imaging (BLI), kann die Ausbreitung und der

Infektionsverlauf nach der oralen Infektion mit biolumineszenten Listerien, im Tier-

modell, direkt verfolgt werden (Hardy et al., 2004; Riedel et al., 2007).

Diskussion

98

Ziel dieser Dissertation war die Etablierung eines in vivo Mausmodells für die orale

Infektion mit biolumineszenten Listeria monocytogenes Stämmen. Dabei sollte unter

Verwendung des in vivo BLI die Dissemination von Lux-Operon exprimierenden

Listerien im Wirtsorganismus der Maus nicht invasiv und unabhängig von der

Präsenz eines transgenen, humanisierten E-Cadherins analysiert werden. Weiter

stand die Fragestellung im Vordergrund, in wieweit der genetische Hintergrund des

Wirts den Krankheitsverlauf verschiedener Mausinzuchtstämme nach oraler Infektion

mit Listeria monocytogenes beeinflusst. Im Detail wurde erstmals die Wirtsresistenz

der Mausinzuchtstämme BALB/cJ, C57BL/6J, C3HeB/FeJ und A/JOlaHsd nach

oraler Infektion mit den Listerienstämmen LmoXen32, LmoXen32-mur, LmoEGDe-lux

und LmoEGDe-lux-mur analysiert. Die Analyse der Dissemination murinisierter

Listerien im Vergleich zu ihren isogenen Wildtypstämmen zu den inneren Organen

erfolgte über die Bestimmung der bakteriellen Keimlast. In diesem Zusammenhang

wurde auch untersucht, ob das veränderte (murinisierte) Internalin A einen Einfluss

auf die Überquerung der Blut-Hirn-Schranke hat und ob die Interaktion von Internalin

A mit E-Cadherin für das Eindringen von Listerien in das zentrale Nervensystem

wichtig sein könnte.

3.1 Der Infektionsverlauf nach einer Listerieninfektion ist von der

Virulenz des Listeriensubtypes abhängig

Das fakultativ intrazelluläre Bakterium Listeria monocytogenes ist in der Umwelt weit

verbreitet und kann schwerwiegende Infektionen auslösen. Innerhalb von Listeria

monocytogenes sind eine Reihe von Serotypen charakterisiert, welche sich

genetisch unterscheiden (Piffaretti et al., 1989) sowie unterschiedliche

Virulenzpotentiale aufzeigen eine Erkrankung auszulösen (Buchrieser et al., 1993;

Jacquet et al., 2004; Pohl et al., 2006). Über den Nachweis der Oberflächen-

Antigene und Flagellen-Antigene konnten 13 verschiedene Serotypen bestimmt

werden (Seeliger und Höhne, 1979), welche in drei phylogenetische Linien

unterschieden werden. Mit Hilfe der Multi-Locus-Enzym-Elektrophorese und

Pulsfeldgelelektrophorese konnten zwei Hauptlinien identifiziert werden (Brosch et

al., 1994; Graves et al., 1994; Piffaretti et al., 1989; Rasmussen et al., 1991). Eine

Diskussion

99

dritte Linie konnte über die Verwendung von Ribotypisierung und DNA-Arrays

charakterisiert werden (Doumith et al., 2004; Wiedmann et al., 1997b). Linie I

beinhaltet die Isolate der Serotypen 4b, 1/2b, 3b, 4d und 4e, Linie II die

Listerienisolate vom Serotyp 1/2a, 1/2c, 3a und 3c und in Linie III werden die Isolate

4a und 4c eingeordnet. Mittels Multi-Locus-Sequenz-Typisierung (MLST), eine

Methode die Sequenzvariationen in Genfragmenten von Haushaltsgenen analysiert,

können Allelprofile verschiedener Bakterienisolate bestimmt und für

Verwandtschaftsanalysen genutzt werden (Maiden et al., 1998; Salcedo et al., 2003).

Über die Verwendung von MLST zur Analyse der verschiedenen Listeria mono-

cytogenes Isolate wurde die phylogenetische Verwandtschaft verschiedener klonaler

Listerienkomplexe, der evolutionären Ursprung der Serotypen sowie Internalin A

Polymorphismen beschrieben (Ragon et al., 2008). Für epidemiologische Studien

von Listerien-Infektionsausbrüchen in Mensch und Tier ist es sehr wichtig, dass

Genotypen verschiedener Substämme mit dem pathologischen Erscheinungsbild und

den Schweregrad von Erkrankungen korreliert werden können (Buchrieser, 2007;

Chen et al., 2007).

Die im Verlaufe dieser Arbeit durchgeführten oralen Infektionen von BALB/cJ Mäuse

mit je einer Infektionsdosis von 5x109 CFU LmoXen32-mur bzw. LmoEGDe-lux-mur,

resultierten in Unterschieden verschiedener analysierter Parameter wie der Über-

lebensrate, dem Gewichtsverlauf nach der Infektion, der bakteriellen Keimlast, der

Histopathologie und dem BLI. Nach der Infektion mit LmoXen32-mur zeigte sich ein

stark abgeschwächter Infektionsverlauf in BALB/cJ Mäusen, was im Vergleich zu

LmoEGDe-mur-lux infizierten Tieren in einer geringeren Mortalitätsrate resultierte

(Abschnitt 2.4). Weiterhin zeigte sich die attenuierte Virulenz der Stämme LmoXen32

und LmoXen32-mur im Nachweis einer geringeren bakteriellen Keimlast in den

inneren Organe Leber, Milz, Dünndarm und mesenterischen Lymphknoten (mLK)

(Abschnitt 2.2.2 und Abschnitt 2.3.4). Die histopathologische Analyse ergab nach der

Infektion mit LmoXen32 und LmoXen32-mur nur moderate Schädigungen des

Leberparenchyms mit einer nachweislich geringeren Anzahl an entzündlichen

Läsionen und weniger Infiltrationen von Granulozyten im Vergleich zu einer Infektion

mit LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux (Abschnitt 2.2.2 und Abschnitt 2.3.2).

Diskussion

100

Zudem zeigten LmoXen32-mur eine geringere Invasionseffizienz in die murinen

Kolonkarzinom CT-26 Zellen im Vergleich zu LmoEGDe-mur (Abschnitt 2.1.4).

Obwohl beide Stämme, LmoXen32 (Serotyp 1/2c; Derivat von Lmo 10403S, Serotyp

1/2a) und LmoEGDe-lux (LmoEGDe, Serotyp 1/2a) in die gleiche phylogenetische

Linie II eingeordnet werden, weisen sie jedoch unterschiedliche Virulenzen auf

(Ragon et al., 2008). Eine Ursache für diese Pathogenitätsunterschiede liegt in der

Integrationsstelle des Lux-Operons innerhalb des Listeria Genoms von LmoXen32

und LmoEGDe-lux. Die Integration des synthetischen Operons luxABCDE erfolgte

bei LmoEGDe-lux in die 3´Region eines tRNAArg Gens (lmot17) mit Hilfe des

Integrationsvektors pPL2lux (Bron et al., 2006; Riedel et al., 2007). Der Vektor

pPL2lux ist ein Derivat des Integrationsvektors pPL2. Dieser kann bei verschiedenen

Listeria monocytogenes Stämmen unabhängig von ihrem Serotyp eingesetzt werden

(Lauer et al., 2002). Der Vektor pPL2 enthält ein PSA (Phage aus LmoEGDe ScottA)

Listeriophagen Integrase-Gen sowie eine DNA-Erkennungssequenz für die

zielgerichtete Integration ins listerielle Chromosom. Innerhalb der 3`Region des

tRNAArg Gens (lmot17) sowie in der Listeriophagensequenz des pPL2 Vektors sind

17 bp eines Sequenzabschnitt identisch, über welche die Integration erfolgt. Nach

erfolgter Insertion ist ein Teil der tRNAArg Gensequenz unterbrochen. Diese wird

jedoch über die identische 17 bp lange PSA-Sequenz komplettiert und somit das

Leseraster und damit die volle Funktionsfähigkeit des tRNAArg Gens beibehalten

(Lauer et al., 2002). Des Weiteren codieren 67 Gene im Genom von Listeria

monocytogenes für tRNAs, davon fünf Gene für tRNAArg Moleküle (Glaser et al.,

2001). Die genetische Modifikation von LmoEGDe zu LmoEGDe-lux sollte daher

keinen Einfluss auf die Expression von tRNAArg haben und die Pathogenität von

LmoEGDe-lux nicht beeinträchtigen. Der Vorteil des auf Phagen basierenden

Integrationsvektors besteht in der Integration einer einzelnen Kopie ins Genom sowie

in dessen Stabilität in Abwesenheit von Selektionsmarkern.

LmoEGDe-mur-lux wurde ausgehend von murinisierten Listerienstamm LmoEGDe-

mur (Monk et al., 2010) über die Integration des Lux-Operons mit Hilfe des Listerio-

phagen Integrationsvektors pIMK2lux generiert. Das Plasmid pIMK2lux ist ein Derivat

des Integrationsvektors pPL2 (siehe oben), mit reduzierter Plasmidgröße und

Diskussion

101

Kanamycinresistenz (Monk et al., 2008). Wie schon bei der Generierung von

LmoEGDe-lux erfolgt die Integration des Operons luxABCDE ins tRNAArg Gen

(lmot17) von Listeria monocytogenes ohne Einschränkung der Genfunktion und sollte

die Virulenz von LmoEGDe-mur-lux ebenfalls nicht beeinflussen. Weiterhin konnte

gezeigt werden, dass die Luziferaseaktivität von LmoEGDe-lux (Integration mittels

pPL2lux) äquivalent zur Aktivität von LmoEGDe-mur-lux (Integration mittels

pIMK2lux) ist und somit beide Stämme eine vergleichbare Biolumineszenz-

signalstärke erzeugen (Monk et al., 2008).

Im Gegensatz zu den LmoEGDe Stämmen wurden bei der Generierung von

LmoXen32 das Luziferase-Operon mittels Transposonmutagenese zufällig in die

Promotorregion des Flagellin A (flaA) Gens integriert (Hardy et al., 2004). Diese

Modifikation resultierte im Vergleich zum Ursprungsstamm Lmo 10403S in einer

vierfach höheren LD50 des LmoXen32 im Mausinfektionsmodell. Bereits publizierte

Arbeiten konnten zeigen, dass die Expression von flaA in LmoEGDe bei 37°C verrin-

gert ist und Flagellenstrukturen nicht nachweisbar waren (Gründling et al., 2004).

Dagegen zeigten 2% von Lmo 10403S (Ausgangsstamm für LmoXen32) Flagellen

auf der Oberfläche und es konnte außerdem eine Expression von flaA Transkripten

bei Temperaturen von 37°C nachgewiesen werden (Gründling et al., 2004). Andere

Studien bestätigten eine Mobilität von Lmo 10403S bei höheren Temperaturen (Way

et al., 2004). Trotz Repression der Expression von flaA bei 37°C ist Flagellin A zu

Beginn einer Infektion während des extrazellulären Wachstums und der intra-

zellulären Infektion von Bedeutung (Peel et al., 1988). Bewegliche Listerien besitzen

bei der initialen Kolonisation von Dünndarm und Leber im Vergleich zu unbe-

weglichen Listerien einen Vorteil für die optimale Invasion in Zellen (O’Neil und

Marquis, 2006). Dabei spielt die Fähigkeit zur Mobilität eine entscheidende Rolle. Es

konnte gezeigt werden, dass flagellentragende aber unbewegliche Bakterien keine

verstärkte Adhärenz bzw. Invasion in humane Epithelzellen aufweisen als

flagellenlose Listerien (O’Neil und Marquis, 2006). Dies weist darauf hin, dass Fla-

gellen eine geringe Funktion als Adhäsine während der Invasion haben, jedoch die

Mobilität ein entscheidender Faktor für die Invasion in humane Zellkulturen ist. Somit

könnte die Integration des Lux-Operons in das flaA Gen von LmoXen32 zu einer

Diskussion

102

Funktionseinschränkung der Flagellen führen und die sich daraus resultierende

Mobilitätsminderung in einer geringeren Virulenz von LmoXen32 auswirken.

3.2 Die Murinisierung des Internalin A resultiert in einem invasiveren

Krankheitsverlauf

Die Fähigkeit epitheliale Barrieren zu überqueren, ist eine wichtige Virulenzeigen-

schaft von Listeria monocytogenes. Viele Studien konnten die Bedeutung der Ober-

flächenproteine InlA und InlB während der zellulären Invasion und der Passage

epithelialer Barrieren aufschlüsseln (Disson et al., 2008; Khelef et al., 2006).

Internalin A weist in Abhängigkeit seines Rezeptors E-Cadherin eine

Speziesspezifität auf, wie schon in Abschnitt 1.5.1 beschrieben (Lecuit et al., 1999).

Die Überquerung der intestinalen Barriere kann Internalin A abhängig über die

Invasion der Enterozyten erfolgen und Internalin A unabhängig über die M-Zellen der

Peyer´schen Plaque (Lecuit et al., 2001; Marco et al., 1997). Die InlA-abhängige

Überquerung der Darmbarriere erfolgt über die Interaktion mit E-Cadherin, welches

an der basolateralen Seite der intestinalen Epithelzellen exprimiert wird. Somit ist der

Zugang für Listeria monocytogenes zum E-Cadherin erschwert (Boller et al., 1985,

Sousa et al., 2005). Jedoch kann kurzzeitig E-Cadherin an der Darmlumenseite

zugängig sein. Während des Zellzyklus und natürlicher Apoptose der Enterozyten an

den Villi erfolgt die Extrusion abgestorbener Zellen und eine Exposition von E-

Cadherin an der apikalen Seite der Darmvilli (Pentecost et al., 2006; Pentecost et al.,

2010). Ebenso wurde beschrieben, dass an Epithelfalten der Villi sowie um

schleimproduzierende Becherzellen E-Cadherin frei zugängig ist und somit Listeria

monocytogenes die Interaktion von InlA mit E-Cadherin ermöglicht (Nikitas et al.,

2011).

In vorangegangen Arbeiten erfolgte die orale Infektion von Mäusen ohne Berück-

sichtigung einer intakten E-Cadherin - Internalin A - Interaktion (Czuprynski et al.,

2002; Czuprynski et al., 2003; Daniels et al., 2000; LeMonnier et al., 2006). Studien

unter Verwendung anderer Tiermodelle, wie dem Meerschweinchen, konnten die

Bedeutung des InlA während einer Infektion beschreiben. Aufgrund der nicht

Diskussion

103

funktionellen InlB-c-Met-Interaktion im Meerschweinchen konnten Mechanismen

listerialer Invasion in diesem Tiermodell jedoch nur begrenzt untersucht werden

(Bakardjiev et al., 2006). Mit der Murinisierung des listeriellen Internalin A durch den

Austausch der Aminosäuren Ser192Asn und Tyr369Ser konnte die Affinität des

Internalin A zu murinen E-Cadherin gesteigert werden (Wollert et al., 2007b). Zur

Etablierung eines oralen Infektionsmodells erfolgte in dieser Arbeit die ausführliche

Analyse der Infektionsprozesse von LmoEGDe-lux im Vergleich zu LmoEGDe-mur-

lux bei oral infizierten Mäusen. Mit Hilfe der erzielten Resultate lassen sich Aussagen

über die Verbreitung von Listerien in Abhängigkeit von funktionalem Internalin A

treffen. Die InlA-abhängige Invasion in Enterozyten und somit die Überquerung der

intestinalen Barriere ermöglicht den schnellen und direkten Zugang zum Lymph- und

Blutsystem und führt folglich zu einer schnelleren Dissemination des Pathogens in

die Leber. Bezugnehmend auf die Ergebnisse von Wollert et al. resultiert die

Murinisierung des Internalin A in einer 6700-fachen Erhöhung der Affinität der

Proteinkomplexe von Internalin A zu humanem E-Cadherin (Wollert et al., 2007b).

Dagegen zeigten die murinisierten Listerien in vitro nur eine Verdopplung der

Invasionsrate in die humanen intestinalen Colonkarzinom-Zellen (Caco-2) (Wollert et

al., 2007b).

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit ergaben ebenfalls nur eine geringe

Steigerung der Invasionsrate der murinisierten Listerienstämme LmoXen32-mur,

LmoEGDe-mur und LmoEGDe-mur-lux im Vergleich zu ihren nicht-murinisierten

isogenen Wildtypstämmen LmoXen32, LmoEGDe und LmoEGDe-lux in Caco-2

Zellen (Abschnitt 2.1.4). Dagegen resultierte die Infektion von murinen

Colonkarzinom-Zellen (CT-26) in einer signifikanten Erhöhung und damit in einer

gesteigerten Invasionsrate der murinisierten Listerienstämme LmoEGDe-mur und

LmoEGDe-mur-lux, im Vergleich zu ihren isogenen Wildtypstämmen. Dies bestätigt

die gesteigerte Affinität des murinisierten Internalin A zu dem murinen E-Cadherin,

wie von Wollert et al. anhand der Dissoziationskonstanten der Proteinkomplexen

nachgewiesen werden konnte (Wollert et al., 2007b). Die Murinisierung des

Listerienstamms LO28 resultierte sowohl in humanen als auch in murinen Colon-

karzinom-Zellen in einer signifikanten Erhöhung der Invasionsrate. Aufgrund einer

Diskussion

104

„nonsense“ Mutation im inlA Gen exprimiert Listeria monocytogenes LO28 ein

verkürztes Internalin A (Jonquieres et al., 1998). Folglich resultierte die Infektion von

epithelialen Zelllinien in einer geringeren Invasionsrate von LO28 im Vergleich zu

anderen Listerienstämmen, welche funktionsfähiges Internalin A exprimieren

(Roldgaard et al., 2009). LO28 exprimiert InlA nicht auf der Zellwandoberfläche,

sondern sekretiert es unter Zellkulturbedingungen in den Zellüberstand (Jonquieres

et al., 1998). Durch die Murinisierung des LO28-Stammes erfolgt der Austausch des

verkürzten InlA mit murinisierten funktionsfähigen InlA über homologe Rekombination

des kompletten inlA-Locus. Dies führt zu einem Funktionszugewinn („gain of

function“), welcher in einer signifikant höheren Invasionsrate des LO28-mur resultiert

und im in vitro Invasions-Assay erkennbar war.

Im in vivo Mausmodell resultierte die Infektion ausgewählter Mausinzuchtstämme mit

LmoEGDe-mur-lux in einer höheren Mortalitätsrate als die Infektion mit LmoEGDe-

lux (Abschnitt 2.3.3). Über die Änderungen im Verlauf des Körpergewichtes konnten

signifikante Unterschiede zwischen murinisierten und den entsprechenden nicht-

murinisierten Listerien beobachtet werden, welche in einer größeren Änderung des

Gewichtsverlusts bei A/JOlaHsd, BALB/cJ und C57BL/6J Mäusen nach der oralen

Infektion mit LmoEGDe-mur-lux resultierte. Weiterhin zeigte die Analyse der

bakteriellen Keimlast der inneren Organe nach der Infektion mit murinisierten

Listerien eine zehn- bis hundertfach höhere Anzahl von Bakterien im Vergleich zu

der Infektion mit nicht-murinisierten Listerien (Abschnitt 2.3.4.2). In BALB/cJ Mäusen

konnte an Tag drei nach der Infektion mit LmoEGDe-mur-lux zudem eine signifikante

Erhöhung der Listerienanzahl in der Leber im Vergleich zu LmoEGDe-lux

nachgewiesen werden, was die Ergebnisse von Monk et al. sowie die publizierten

Resultate im humanisierten Mausmodell von Lecuit et al. bestätigte (Lecuit et al.,

2001; Monk et al., 2010). Der in dieser Arbeit durchgeführte immunhistologische

Nachweis von Listerien konnte nach der Infektion mit LmoEGDe-mur-lux im

Vergleich zu LmoEGDe-lux am Tag vier nach der Infektion vermehrte Infiltrationen

von Listerien und Granulozyten im Leberparenchym nachweisen (Abschnitt 2.3.2).

Diese Ergebnisse zeigten, dass Infektionen mit InlA-murinisierten Listerien in einem

verstärkten Krankheitsverlauf resultierten. Somit lässt sich weiter schlussfolgern,

Diskussion

105

dass die Murinisierung des Internalin A mit einer gesteigerten Invasion der Organe

einhergeht. Auch konnte mit Hilfe des in vivo Biolumineszenz-Imaging gezeigt

werden, dass die Infektion mit LmoEGDe-mur-lux in einer verstärkten Invasion der

inneren Organe, speziell in der Leber, resultierte (Abschnitt 2.3.3 und Abschnitt

2.3.4.3). Diese Ergebnisse sind vergleichbar mit den Resultaten von Monk et al. in

welchen ebenfalls eine Akkumulation von murinisierten Listerien in der Leber

festgestellt werden konnte (Monk et al., 2010). Aufgrund der Murinisierung des

Internalin A erfolgt die verstärkte Infektion von intestinalen Epithelzellen. Murinisierte

Listerien gelangen somit in einer größeren Anzahl über die Darmbarriere ins Blut-

und Lymphsystem und führen zu einer vermehrten Invasion der inneren Organe. In

oral infizierten Meerschweinchen konnte gezeigt werden, dass die Ausbreitung der

Listerien zur Leber direkt über den Dünndarm und weiter über das Pfortadersystem

erfolgen kann sowie indirekt über die mLK und die anschließende lymphatische und

hämatogene Dissemination (Melton-Witt et al., 2011). Somit ist die Anzahl der

Listerien, welche zu Leber gelangen prozentual höher, als im Vergleich zu den

weiteren inneren Organen Milz und Gehirn, welche nur über den indirekten

Disseminationsweg besiedelt werden. Jedoch zeigte die intravenöse Infektion von

C57BL/6J Mäusen, dass in der frühen Phase der Infektion Listeria monocytogenes

innerhalb von CD8α+ dendritische Zellen vom Darm zu der Milz transportiert werden

(Neuenhahn et al., 2006) und diese damit an der frühen Dissemination von Listerien

involviert sind.

All diese Resultate konnten die Bedeutung der Internalin A - E-Cadherin - Interaktion

während der Überquerung der intestinalen Barriere bestätigen. Für die weitere

Dissemination und die systemische Infektion im weiteren Krankheitsverlauf sind

weitere Faktoren von Bedeutung. Die Ausbreitung von Zelle zu Zelle erfolgt unter

Beteiligung weiterer Virulenzfaktoren. Internalin C (InlC) und das Aktin-bindende

Protein A (ActA) sind für die Zell-Zell-Ausbreitung von Wichtigkeit. So zeigten sich

jeweilige Deletionsmutanten ineffizient in der Ausbildung von

Membranausstülpungen zur Invasion benachbarter Zellen in vitro (Domann et al.,

1992; Rajabian et al., 2009). Auch unterstützt das Virulenzprotein Vip über die

Interaktion mit seinem Rezeptor Gp-96 („endoplasmatische Retikulum ansässiges

Diskussion

106

Chaperon“) die Invasion in Säugetierzellen (Cabenes et al., 2002). Listerielle

Deletionsmutanten für Vip zeigten eine zehnfach geringere Invasionsrate in Caco-2

Zellen als die isogenen Wildtypstämme. Ebenfalls spielt Phospholipase C (PlcB) bei

der Zell-Zell-Ausbreitung eine wichtige Rolle. Listeria monocytogenes befreit sich

durch die Sekretion von PlcB aus einer Doppelmembranvakuole als Voraussetzung

für die intrazelluläre Replikation. Nach intrazerebraler Injektion von Listeria

monocytogenes bei Mäusen konnte die Bedeutung von PlcB bei der Zell-Zell-

Ausbreitung demonstriert werden. Deletionsmutanten für PlcB wiesen im Vergleich

zum Wildtyp einen weniger virulenten Krankheitsverlauf auf (Schlüter et al., 1998).

Ein weiterer Faktor für die systemische Ausbreitung von Listerien ist InlB, welcher

über die Interaktion mit dem c-Met-Rezeptor die Internalisation in eine Vielzahl von

Säugetierzellen induziert (Braun et al., 1998).

Neben Internalin A vermittelter Invasion von Epithelzellen können Listerien InlA-

unabhängig über M-Zell-vermittelte Phagozytose die intestinale Barriere überqueren.

M-Zellen sind innerhalb des Follikel-assozierten Epithels (FAE) eingebettet, welches

die lymphoiden Follikel (Peyer´sche Plaque) der Darmmukosa überdeckt (Clark und

Jepson, 2003). Sie sind somit Bestandteile des „Mukosa-assoziiertes lymphatisches

Gewebe“ (MALT) (Kraehenbuhl und Neutra, 2000). M-Zellen sind auf transepithelia-

len Antigentransport spezialisiert. Sie sind charakterisiert über das Vorhandensein

unregelmäßiger Mikrovilli auf der Zelloberfläche sowie finden sich an der

basolateralen Seite zytoplasmatische Invaginationen, welche Lymphozyten und

Makrophagen enthalten (Clark und Jepson, 2003). Aufgrund der reduzierten Anzahl

der Mikrovilli und einer vorhandenen Glykokalyx auf der Zelloberfläche der M-Zellen

erfolgt die Exposition zu den im Darmlumen vorliegenden Antigenen. M-Zellen

können Makromoleküle und Mikroorganismen über Phagozytose, Endozytose und

rezeptorvermittelte Endozytose aufnehmen (Clark und Jepson, 2003). Nach

Aufnahme in die M-Zellen werden Antigene und Bakterien aktiv vom intestinalen

Lumen zu den lymphoiden Zellen der intraepithelialen Zellinvagination transportiert.

Der weitere Transport der Pathogene erfolgt innerhalb von Makrophagen zu

Antigenpräsentierenden Zellen im germinalen Zentrum der lymphoiden Follikel

(Sansonetti und Phalipon, 1999). Durch diesen Prozess kann die Induktion der

Diskussion

107

spezifischen und adaptiven Immunantwort erfolgen. Die Rolle der M-Zellen bei der

Überquerung der intestinalen Barriere ist noch nicht vollständig geklärt. So zeigten

Untersuchungen, dass Listerien auch in Abwesenheit von intakten Peyer´schen

Plaque das Intestinum durchqueren können (Havell et al., 1999). Einen Tag nach der

intragastralen Infektion von immundefizienten SCID Mäusen wurden Listerien in den

Mesenterien, der Milz und der Leber beobachtet (Havell et al., 1999). Jedoch konnte

bei Wollert et al. gezeigt werden, dass Listeria monocytogenes sehr wohl Internalin A

unabhängig die Darmbarriere durchqueren können. So wurden in den Peyer´schen

Plaque von C57BL/6J Mäusen nach oraler Infektion von nicht-murinisierten Listerien

gleichermaßen Listerien nachgewiesen wie nach der Infektion von murinisierten

Listerien (Wollert et al., 2007b).

Die in dieser Arbeit durchgeführten Analysen zur bakteriellen Keimlast bestätigen die

InlA-unabhängige Durchquerung der intestinalen Barriere, da nicht-murinisierte

Listerien bereits einen Tag nach der oralen Infektion in den inneren Organen Leber,

Milz, mLK, Dünndarm und Gehirn nachgewiesen werden konnten (Daten nicht

gezeigt). Dies deutet darauf hin, dass nicht nur Enterozyten als Haupteintrittspforte

dienen. Corr et al., konnten mit Hilfe eines in vitro Zellkulturmodells, welches die M-

Zell-Aktivität imitiert, nachweisen, dass Listeria monocytogenes vermehrt über M-

Zellen transportiert werden. In diesem Modell erfolgte eine Kombinationszellkultur

von murinen Peyer'schen Plaque Lymphozyten mit C2Bbe1 epithelialen Enterozyten

(Derivate von Caco-2 Zellen), welche daraufhin einen M-Zell-Phänotyp entwickelten

(Corr et al., 2006). Typische Eigenschaften der M-Zellen sind ein unregelmäßiger

Mikrovillisaum, die Präsenz der basolateralen Zellinvagination sowie die Expression

des aktinassoziierten Protein Villin. Die Infektion dieses Zellkulturmodells mit Listeria

monocytogenes zeigte, dass die Listerien vermehrt über diese M-Zellen InlA-

unabhängig transportiert werden als im Vergleich zu C2Bbe1 Monozellkulturen (Corr

et al., 2006).

Auch andere Pathogene nutzen die M-Zellen als Route für die intestinale Invasion.

Neuere Forschungsergebnisse konnten zeigen, dass auch andere Gram-negative

Pathogene wie Yersinia enterocolitica und pseudotuberculosis, Shigella flexneri und

verschiedene Salmonella Pathovare wie Salmonella enterica Serovar Typhimurium

Diskussion

108

M-Zellen als Eintrittspforte in den Organismus nutzen (Clark und Jepson, 2001;

Grützkau et al., 1990; Hanski et al., 1989; Jenson et al., 1998; Jepson und Clark,

2001; Sansonetti und Phalipon, 1999; Sansonetti, 2001). Die Invasion in M-Zellen

von Salmonella typhimurium und Shigella flexneri erfolgt über einen Trigger-

Mechanismus, vermittelt über das Typ-III-Sekretionssystem (Cossart und Sansonetti,

2004). Die Infektion mit Salmonellen führt innerhalb von 30 Minuten zu massiven

Änderungen in der Aktinpolymerisation des Zytoskeletts der M-Zellen und zur Auf-

nahme der Salmonellen. Dies hat letztendlich die Zerstörung der M-Zellen zur Folge

und resultiert in einer ausgeprägten Schädigung des FAE (Jensen et al., 1998).

Dagegen führt die Infektion mit Shigellen indirekt durch Induktion einer massiven

inflammatorischen Antwort zur Schädigung des intestinalen Epithels (Sansonetti et

al., 1996). Die Infektion muriner M-Zellen mit Yersinia pseudotuberculosis führt

dagegen nur zu geringen Veränderungen des M-Zell-Aktins. Die Invasion der M-

Zellen erfolgt über einen Zipper-ähnlichen Mechanismus an dem mehrere Yersinien

beteiligt sind, welche dann in einer Vielzahl intrazellulär im Zytoplasma vorliegen

(Clark und Jepson, 2001). In vitro Studien konnten zeigen, dass Yersinia Spezies

über das Zelloberflächenmolekül β1-Integrin binden und ihre eigene Aufnahme

induzieren (Isberg und Leong, 1990).

Zusammenfassend betrachtet, erlaubt die Murinisierung des Internalin A die Invasion

der murinen intestinalen Epithelzellen über die Interaktion mit E-Cadherin und somit

eine systemische Infektion im Mausmodell über die orale Infektionsroute verbunden

mit klinischen Symptomen einer Listeriose. Die in dieser Arbeit durchgeführten

Analysen bestätigen, dass Listeria monocytogenes InlA-abhängig über die Entero-

zyten und zusätzlich InlA-unabhängig über die M-Zellen die intestinale Barriere über-

queren kann.

3.3 Der Infektionsverlauf nach einer Listerieninfektion ist abhängig vom

genetischen Hintergrund des Wirtes

Infektionskrankheiten gehören weltweit, neben Herz-Kreislauf-Erkrankungen, immer

noch zu den Erkrankungen mit der höchsten Mortalität (Daten 2008, The World

Diskussion

109

Health Report, 2011). Welchen Verlauf eine Infektion nimmt, hängt zum einen von

verschiedenen äußeren Einflüssen ab wie zum Beispiel der Umwelt und dem Patho-

gen selbst, zum anderen spielen eine Reihe innerer Faktoren eine Rolle, wie die

genetisch bedingte Prädisposition eines Wirtes, an einer Infektion zu erkranken. Die

genetische Prädisposition ist eine der wichtigsten intrinsischen Faktoren und resul-

tiert in verschiedenen Variationen des Phänotyps einer Erkrankung. Die große

Herausforderung der Infektionsforschung liegt daher in der Etablierung eines

passenden Tiermodells für das Verständnis von Wirt-Pathogen-Beziehungen. Die

Maus ist häufig Tiermodell der ersten Wahl. Sie hat den Vorteil, dass eine Vielzahl an

gut charakterisierten Mausinzuchtstämmen existieren, sie eine kurze Generations-

folge aufweisen und die Haltung relativ unkompliziert erfolgen kann. Auch erlaubt die

große genetische Diversität von Mausinzuchtstämmen die Untersuchung komplexer

Genotyp - Phänotyp Beziehungen und die Analyse der genetischen Krankheits-

prädisposition im Tiermodell.

Im Rahmen dieser Arbeit konnten Unterschiede in den Resistenzen der Mausin-

zuchtstämme C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd, BALB/cJ und C57BL/6J nach der oralen

Infektion mit Listeria monocytogenes aufgezeigt werden. Wie über die Analyse der

Überlebensrate erkennbar (Abschnitt 2.3.3) zeigten C3HeB/FeJ Mäuse eine ausge-

prägte Suszeptibilität gegenüber der oralen Infektion mit Listeria monocytogenes,

was in einer reduzierten Überlebensrate resultierte. Bei A/JOlaHsd und BALB/cJ

Mäusen konnte eine intermediäre Resistenz beobachtet werden. Dagegen erwiesen

sich C57BL/6J Mäuse als äußerst resistent und eine Überlebensrate von 90-100%

konnte beobachtet werden.

Die Ursachen einer gesteigerten Suszeptibilität gegenüber einer Listerieninfektion

liegen zum einen in der Eigenschaft von Listeria monocytogenes sich der

Immunantwort aufgrund der intrazellulären Lebensweise zu entziehen und zum

anderen in der Fähigkeit des Immunsystems intrazelluläre Listerien zu erkennen und

zu eliminieren. Somit resultiert der genetische Hintergrund von C3HeB/FeJ,

A/JOlaHsd, BALB/cJ und C57BL/6J Mäusen nicht nur in Variationen des

biochemischen und metabolischen Phänotyps (Champy et al., 2008), sondern hat

Diskussion

110

auch Einfluss auf die Immunantwort nach oraler Infektion mit Listeria mono-

cytogenes.

In der Vergangenheit konnten mit Hilfe von Listeria monocytogenes Infektionen

wichtige Erkenntnisse über die angeborene und erworbene Immunantwort erzielt

werden, wie der Nachweis der zellulär vermittelten Immunantwort nach erfolgter

Listerieninfektionen (Mackaness, 1962; Mackaness, 1969; Pamer, 2004). Die

Infektion verschiedener Mausinzuchtstämme mit Listeria monocytogenes resultierte

des Weiteren in unterschiedlicher Resistenz und Suszeptibilität in Abhängigkeit des

gewählten Mausinzuchtstammes (Cheers et al., 1978; Czuprynski et al., 1985;

Mainou-Fowler et al., 1988) und führte zur Identifizierung von Faktoren für die

genetische Kontrolle der Immunantwort im Verlauf einer Listerieninfektion (Cheers

und McKenzie, 1978; Gervais et al., 1984; Skaneme et al., 1979).

Die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente zeigten, dass C57BL/6J Mäuse

resistent gegenüber einer oralen Infektion mit dem murinisierten Listerienstamm

LmoEGDe-mur-lux reagierten. Die ausgeprägte Resistenz von C57BL/6J Mäusen

konnte schon gegenüber der intravenösen oder intraperitonealen Listerieninfektion

beobachtet werden (Cheers et al,. 1978; Cheers und McKenzie, 1978; Czuprynski et

al., 1985; Mainou-Fowler et al., 1988). Wie im Abschnitt 2.3.3 ausführlich

beschrieben, zeigten C57BL/6J Mäuse nach der oralen Listerieninfektion die

geringste Veränderung im Körpergewichtsverlauf. Auch war mit Hilfe des BLI der

ausgewählten Mausinzuchtstämme erkennbar, dass die Infektion mit LmoEGDe-mur-

lux in den resistenteren C57BL/6J Mäusen zu einer Akkumulation der Listerien in der

Gallenblase führte. Dagegen zeigten A/JOlaHsd und BALB/cJ Mäuse nach der

Infektion mit LmoEGDe-mur-lux eine verstärkte Ansammlung der Listerien in der

Leber und den mLK (Abschnitt 2.3.4.2). A/JOlaHsd Mäuse reagierten zudem

empfindlicher als BALB/cJ Mäuse, was in einer geringeren Überlebensrate resul-

tierte. Frühere Arbeiten konnten zeigen, dass die intravenöse Infektion von

A/JOlaHsd Mäusen mit LmoEGDe in einer hundertfach höheren bakteriellen Keimlast

in der Milz und Leber resultierte sowie in einer drastisch reduzierten Anzahl der

peripheren Monozyten 24 Stunden nach der Infektion im Vergleich zu C57BL/6J

Mäusen (Sadarangani et al., 1980).

Diskussion

111

Die Infektion mit Listeria monocytogenes induziert frühzeitig eine Monozytose

(Murray et al., 1926). Molekulares Material von geringem Molekulargewicht, welches

mit der bakteriellen Zellwand assoziiert ist, wie Peptidoglykan und Lipoteinonsäuren,

führt 48 Stunden nach der Infektion zu einer drei- bis sechsfachen Erhöhung der

Monozyten im peripheren Blut (Galsworthy and Fewster, 1988; Paquet et al., 1986).

Diese Monozytose, aufgrund der inflammatorischen Immunantwort, vermittelt eine

Resistenz gegenüber der Listerieninfektion. Bei A/JOlaHsd Mäusen konnte jedoch

keine Erhöhung der Monozytenanzahl nach der intraperitonealen Injektion mit dem

eine Monozytose induzierenden Zellwandextrakt von Listeria monocytogenes

nachgewiesen werden (Galsworthy and Fewster, 1988).

Eine weitere mögliche Ursache für die gesteigerte Suszeptibilität der A/JOlaHsd

gegenüber der C57BL/6J Mäuse wird der reduzierten Menge an Gamma-Interferon

(IFN-γ) und des Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierenden Faktors (GM-

CSF) zugeschrieben (Iizawa et al., 1993). IFN-γ spielt eine Rolle bei der

angeborenen sowie erworbenen Immunantwort und dient der Makro-

phagenaktivierung. GM-CSF stimuliert die Reifung von Monozyten und

Granulozyten. In vitro konnte beobachtet werden, dass Makrophagen in Gegenwart

von IFN-γ effizienter bei der Eliminierung intrazellulärer Listerien reagieren (Portnoy

et al., 1989). Frühere Studien zeigten, dass eine verstärkte Infiltration von

neutrophilen Granulozyten und Monozyten im infizierten Gewebe die Resistenz

gegenüber Listeria monocytogenes erhöhen. Bei A/J Mäusen konnte diesbezüglich

eine geringere Infiltration von Phagozyten im infizierten Gewebe nach intra-

peritonealer Infektion mit LmoEGDe nachgewiesen werden, als im Vergleich zu

C57BL/6J Mäusen (Czuprynski et al., 1985). Die verminderte Sekretion von GM-SCF

und IFN-γ kann somit die Empfindlichkeit von A/JOlaHsd Mäusen gegenüber einer

Listerieninfektion erhöhen.

Weiterhin wurden A/J Mäuse im Gegensatz zu C57BL/6J Mäuse als defizient für die

C5 Komponente des Komplementsystems charakterisiert. Eine 2 bp Deletion des Hc

(hämolytisches Komplement) Gens auf Chromosom 2 resultiert in einer

Verschiebung des Leserasters und damit in einem defizienten Protein, was in einer

Störung der Rekrutierung von inflammatorischen Zellen führt (Cheers und McKenzie,

Diskussion

112

1978; Gervais et al., 1984; Czuprynski et al., 1985). Der C5-Komplementfaktor ist

Bestandteil des Membranangriffskomplexes und führt zusammen mit weiteren

Faktoren des Komplementsystems zur Formation einer Pore und zur anschließenden

Lyse der Bakterienzelle. Die C5-Defizienz kann daher in einer weniger effektiven

Immunantwort und einer gesteigerten Suszeptibilität der A/JOlaHsd Mäuse in der

fortgeschrittenen Phase der Infektion resultieren.

Somit konnte gezeigt werden, dass genetische Defekte von wichtigen Komponenten

des Immunsystems, wie die C5-Defizienz, die Reduktion von GM-CSF und IFN-γ

sowie eine reduzierte Monozytose zur erhöhten Suszeptibilität der A/JOlaHsd Mäuse

beitragen.

BALB/cJ Mäuse sind im Gegensatz zu A/JOlaHsd Mäusen C5 suffizient. Jedoch

ergab sich aus den hier durchgeführten Untersuchungen, dass BALB/cJ Mäuse, im

Vergleich zu C57BL/6J Mäusen, ebenfalls empfindlich auf eine Listerieninfektion

reagierten. So zeigten BALB/cJ Mäuse eine geringere Überlebensrate als C57BL/6J

Mäuse und größere Gewichtsverluste im Verlauf der Infektion (Abschnitt 2.3.3).

Ebenfalls konnte über BLI in vivo und ex vivo eine vermehrte Detektion von

murinisierten Listerien nach der oralen Infektion von LmoEGDe-mur-lux in der Leber

und im Darmbereich von BALB/cJ Mäusen im Vergleich zu C57BL/6J Mäusen

nachgewiesen werden (Abschnitt 2.3.3 und Abschnitt 2.3.4.2). Weiter zeigte sich die

Suszeptibilität der BALB/cJ Mäuse in einer erhöhten bakteriellen Keimlast in den

inneren Organen Dünndarm, mLK, Milz und Leber am Tag fünf nach der Infektion im

Vergleich zu C57BL/6J Mäusen (Abschnitt 2.3.4.2).

Die gesteigerte Suszeptibilität von BALB/cJ Mäusen konnte ebenfalls in früheren

Studien beobachtet werden. In BALB/cJ Mäusen war nach der intravenösen Infektion

mit verschiedenen Serotypen von Listeria monocytogenes (Serotyp 1/2a, 3b und 4b)

eine zehn- bis zwanzigfach geringere LD50 feststellbar als im Vergleich zu C57BL/6J

Mäusen (Mainou-Fowler et al., 1988). Eine genetische Kartierung von Quantitativen

Trait Loci (QTL) identifizierte in einer F2-Population der parentalen Inzuchtstämme

BALB/cJ und C57BL/6J zwei Listeria-Suszeptibilitätsloci auf den Chromosomen 5

und 13, welche die systemische Infektion von Listeria monocytogenes kontrollieren

Diskussion

113

und die Ursache der Suszeptibilität von BALB/cJ Mäusen kennzeichnen (Boyartchuk

et al., 2001).

Andere Studien zur Resistenz von Mausinzuchstämmen gegenüber einer Infektion

mit Listeria monocytogenes zeigten, dass Makrophagen von BALB/cJ Mäusen in

ihrer Fähigkeit das Wachstum von Listerien zu inhibieren, eingeschränkt sind

(Cheers et al., 1978). Nach der intravenösen Infektion mit Listeria monocytogenes

wurde eine höhere bakterielle Keimlast in der Leber und der Milz von BALB/cJ

Mäusen festgestellt als im Vergleich zu C57BL/6 Mäusen. Weiterhin resultierte die

Transplantation von Milzzellen aus intravenös infizierten BALB/cJ und C57BL/6

Mäusen in entsprechend syngenetische Mausstämme nur bei C57BL/6 Mäusen in

einer schützenden zellulär vermittelten Immunantwort (Cheers et al., 1978).

Die Infektion mit Listeria monocytogenes führt zu einer deutlichen Produktion von

IFN-γ, IL-10, TNF-α, IL-6 und CCL2. Besonders in den empfindlichen Mausstämmen

C3HeB/FeJ, A/JOlaHsd und BALB/cJ konnte eine Erhöhung an Tag drei und fünf

nach der oralen Infektion beobachtet werden (Abschnitt 2.3.4.4). Der Nachweis der

Chemokine und Zytokine weist darauf hin, dass mit zunehmender Suszeptibilität der

Mausinzuchstämme eine vermehrte Sekretion der chemotaktischen Stoffe erfolgt.

CCL2 wird von eingewanderten Granulozyten sekretiert, was die Immigration von

Makrophagen induziert (Guleria und Pollard 2001; Mandel und Cheers 1980). Diese

produzieren TNF-α und IL-12, welche natürliche Killerzellen zur Freisetzung von IFN-

γ anregen (Havell, 1987; Tripp et al., 1993). IFN-γ selbst ist von großer Bedeutung

und essentiell für die Resistenz gegenüber Listeria monocytogenes. So konnte

gezeigt werden, dass IFN-γ eine wichtige Funktion bei der Aktivierung von

Makrophagen einnimmt (Buchmeier und Schreiber, 1985). Die intraperitoneale

Infektion von C3HeB/FeJ Mäusen resultierte in einem Anstieg der IFN-γ Produktion

in der Milz an Tag sechs nach der Infektion. Die Neutralisierung des IFN-γ mit Hilfe

monoklonaler Antikörper verhinderte jedoch die Aktivierung von Makrophagen und

somit die Eliminierung der Listerien (Buchmeier und Schreiber, 1985). Auch erwiesen

sich IFN-γ-defiziente (GKO-/-BALB/cJ) Mäuse als besonders empfindlich für eine

intravenöse Listerieninfektion, was nach der Infektion in einer geringeren LD50 der

KO-Mäuse resultierte im Vergleich zu den Wildtyp BALB/cJ Mäusen (Harty und

Diskussion

114

Bevan, 1995). Die Sekretion von IL-6 führt im Besonderen zur Aktivierung von

Immunzellen und systemischen Inflammationsantworten (Jones, 2005). IL-10 wirkt

anti-inflammatorisch und inhibiert inflammatorisch bedingte Gewebeschäden (Moore

et al., 2001). In Studien der Sepsis und systemischen Infektion im Menschen konnten

ebenfalls erhöhte Konzentrationen von IFN-γ, IL-10, IL-6 und CCL2 im Serum

festgestellt werden (Murdoch und Finn, 2003; Tamayo et al., 2011). Schon 24

Stunden nach der gestellten Diagnose konnte der Anstieg der pro- und anti-

inflammatorischen Zytokine festgestellt werden, was darauf hinweist, dass sehr

frühzeitig im Verlauf einer Erkrankung die Immunantwort eingeleitet wird.

Für die in dieser Dissertation analysierten C3HeB/FeJ Mäuse konnte bereits in

früheren Arbeiten eine ausgeprägte Suszeptibilität nach einer intravenösen und

oralen Listerieninfektion gezeigt werden (Cheers und McKenzie, 1978; Park et al.,

2004). Auch nach der oralen Infektion sowohl mit murinisierten als auch mit nicht-

murinisierten Listeria monocytogenes konnte in dieser vorliegenden Arbeit eine

ausgeprägte Suszeptibilität nachgewiesen werden. Wie in Abschnitt 2.3.3 erkennbar,

resultierte die orale Listerieninfektion von C3HeB/FeJ Mäusen in einer stark

reduzierten Überlebensrate sowie in einem ausgeprägten Gewichtsverlust. Mit Hilfe

des BLI war in vivo und ex vivo eine vermehrte Ansammlung der Listerien in der

Leber der empfindlichen C3HeB/FeJ Mäuse zu beobachten (Abschnitt 2.3.4.2).

Weiterhin ergab die Analyse der bakteriellen Keimlast eine deutlich erhöhte Anzahl

von Listerien in den präparierten Organen Leber, Milz, Gallenblase, mLK und

Dünndarm. Auch konnten mit Hilfe der histopathologischen Analyse der Leber von

C57BL/6J und C3HeB/FeJ Mäusen vermehrt nekrotische Läsionen und Infiltrationen

von neutrophilen Granulozyten im Leberparenchym der C3HeB/FeJ Mäuse nach-

gewiesen werden (Abschnitt 2.3.4.3).

Frühere publizierte Arbeiten zeigten, dass C3HeB/FeJ Mäuse sehr empfindlich auf

die Infektion mit Mycobacterium tuberculosis reagierten (Kramnik et al., 2000;

Medina und North, 1998). Ein neuer Locus auf Chromosom 1 (Sst1) konnte dadurch

identifiziert werden, welcher die Suszeptibilität gegenüber Tuberkulose reguliert. So

reagierten C3HeB/FeJ Mäuse sehr empfindlich und C57BL/6J Mäuse resistent auf

die intravenöse Infektion mit Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium bovis

Diskussion

115

(Kramnik et al., 2000). Der Sst1 Wirtsresistenzlocus ist ebenfalls von Bedeutung die

angeborene Immunantwort nach einer Infektion mit Listeria monocytogenes zu

kontrollieren (Boyatrschuk et al., 2004). Über eine Generierung von kongenen

Mausstämmen, die das Sst1 C57BL/6J Resistenzallele im C3HeB/FeJ Rezipienten-

genom tragen, konnte gezeigt werden, dass dieser Locus zur Wirtsresistenz

gegenüber einer Listerieninfektion beiträgt. Der resistente Sst1 Locus der C57BL/6J

(B6) Mäuse korreliert des Weiteren mit einer höheren Produktion von reaktiven

Sauerstoffspezies in Sst1B6 Makrophagen, was daraufhin in der Eliminierung von

Listeria monocytogenes resultierte (Boyatrschuk et al., 2004). Innerhalb des Sst1

Locus konnte das Gen Ipr1 (Intracellular pathogen resistence 1) identifiziert werden,

welches die Resistenz gegenüber einer intravenösen Mycobacterium tuberculosis

Infektion erhöht (Pan et al., 2005). Ipr1 wird im Sst1 Resistenzallel exprimiert, auch in

Makrophagen von C57BL/6J Mäusen, jedoch aber nicht im Sst1 Locus von

C3HeB/FeJ Mäusen. Die Generierung einer Ipr1 transgenen C3HeB/FeJ Maus,

welche das Ipr1 Resistenzallel in gesamter Länge exprimiert, konnten statistisch

signifikante Unterschiede in den bakteriellen Keimlasten in der Lunge nach einer

Mycobacterium tuberculosis Infektion beobachtet werden. Ebenso konnte in vitro

gezeigt werden, dass Ipr1 transgene Makrophagen die Multiplikation von

Mycobacterium tuberculosis effizienter kontrollieren konnten (Pan et al., 2005). Ipr1

vermittelt zusätzlich die Resistenz von Makrophagen gegenüber weiteren

intrazellulären Pathogenen wie Listeria monocytogenes. Mit Hilfe der

Durchflußzytometrie konnte nach der Infektion von Sst1 sensitiven Makrophagen mit

Listeria monocytogenes Merkmale nekrotischer Zellen (Ethidiumbromidpos und

Annexin Vneg) erbracht werden, wogegen die Infektion von Irp1 transgenen

Makrophagen Merkmale einer Apoptose (Annexin Vpos und Ethidiumbromidneg)

aufwiesen (Pan et al., 2005). Somit trägt der empfindliche Sst1 Locus von

C3HeB/FeJ dazu bei, die Suszeptibilität gegenüber einer Infektion mit Listeria

monocytogenes zu erhöhen.

Ein weiterer genetischer Faktor, welcher für die Empfindlichkeit gegenüber einer

Listerieninfektion von Bedeutung ist, liegt im Genotyp des Haupthistokompatibilitäts-

komplex (MHC) Haplotyps. Der H-2 Locus von Mäusen kontrolliert während einer

Diskussion

116

Infektion die Eliminierung von Pathogenen, darunter auch von Bakterien (Nauciel et

al., 1990). Es konnten viele verschiedene Haplotypen identifiziert werden

(C3HeB/FeJ: H-2k, A/JOlaHsd: H-2a, BALB/cJ: H-2d und C57BL/6J: H-2b), welche in

der Resistenz oder Suszeptibilität gegenüber einer Listerieninfektion von Bedeutung

sind (Cheers und McKenzie, 1978). Die Auswirkungen des Haplotyps auf die Infek-

tion mit Gruppe A Streptokokken konnte auch in vivo beschrieben werden

(Goldmann et al., 2005). Mäuse des Haplotyps H-2k (BALB/k) und H-2d (BALB/c)

wurden intravenös mit Streptococcus pyogenes infiziert. Die Analyse der

Überlebensrate ergab eine Mortalitätsrate von 100% bei BALB/k Mäusen vergleich-

bar mit C3H/HeN (H-2k). Dagegen zeigten BALB/c (H-2d) eine Überlebensrate von

100%. Der Haplotyp des MHC-Locus hat somit entscheidenden Einfluss auf die aus-

geprägte Suszeptibilität gegenüber einer Infektion mit Gruppe A Streptokokken und

könnte auch Einfluss auf die Erregerabwehr von Listeria monocytogenes haben.

C3HeB/FeJ Mäuse (Haplotyp H-2k) zeigten nach der oralen Infektion mit Listeria

monocytogenes die ausgeprägteste Suszeptibilität. Dies lässt schlussfolgern, dass

der Haplotyp H-2k auch zu einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber einer

Listerieninfektion beitragen kann.

C3HeB/FeJ Mäuse weisen darüber hinaus eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber

einer Narkose mit Isofluran auf (Champy et al., 2008). Während des täglichen BLI

waren die Tiere der Isofluran-Narkose repetitiv exponiert, was weiteren Einfluss auf

den Verlauf einer Listerieninfektion haben könnte. Zudem wird Isofluran eine leber-

toxische Wirkung zugeschrieben. Dies könnte im Zusammenhang mit einer

Listerieninfektion und der damit verbundenen Invasion der Leber mit Listeria mono-

cytogenes zu einer zusätzlichen Funktionseinschränkung der Leber von C3HeB/FeJ

Mäusen zur Folge haben und sich auf den Infektionsverlauf zusätzlich negativ aus-

wirken.

Diskussion

117

3.4 Infektion des zentralen Nervensystems zeigt keine Reproduzier-

barkeit und ist nicht von der Murinisierung des Internalin A ab-

hängig

Die Fähigkeit von Listeria monocytogenes epitheliale Barrieren zu durchqueren,

ermöglicht auch die Invasion des zentralen Nervensystems (ZNS). Durch die

Überquerung der Blut-Hirn-Schranke kann es zur Auslösung einer Meningitis und

Enzephalitis kommen. Auf welchem Weg Listeria monocytogenes das Gehirn infiziert

ist noch nicht vollständig geklärt. Es liegen verschiedene Untersuchungen vor, die

beschreiben, dass Listerien die Blut-Hirn-Schranke intra- oder interzellulär durch-

queren können (Drevets et al., 2004). Weiterhin sind Listerien fähig, über infizierte

Makrophagen oder entlang von Neuronen ins Gehirn einzudringen (Antal et al., 2001;

Antal et al., 2005; Drevets, 1999; Drevets et al., 2001; Drevets et al., 2004; Huang et

al., 2001; Jin et al., 2001). Während einer Infektion mit Listeria monocytogenes

überqueren die Listerien zunächst die intestinale Barriere und gelangen über das

Blut- und Lymphsystem zur Leber und Milz (Vazquez-Boland et al., 2001). Aufgrund

der Replikation und starker Vermehrung der Listerien mit Zugang zu Blutgefäßen

erfolgt dann eine sekundäre Bakteriämie und die weitere Ausbreitung über den

Organismus zum Gehirn.

Die epitheliale Barriere der Blut-Hirn-Schranke besteht aus Endothelzellen, welche

von einer Basallamina umgeben sind. An diese lagern sich Astrozyten und Perizyten

an. Letztere sind mit den Endothelzellen fest über Zell-Zell-Kontakte verankert und

bilden eine physiologische Barriere (Staddon und Rubbin, 1996). Diese erlaubt

jedoch den kontrollierten Transport von Substanzen mittels Transzytose (Tuma und

Hubbard, 2003) und stellt eine Möglichkeit der Invasion für Listeria monocytogenes

dar. Somit könnte die Interaktion der Oberflächenproteine InlA und InlB mit ihren

Rezeptoren E-Cadherin und c-Met die Überquerung der Blut-Hirn-Schranke über den

rezeptorabhängigen Transport in Endothelzellen der Blut-Hirn-Barriere ermöglichen.

Es konnte gezeigt werden, dass E-Cadherin an primären sensorischen Neuronen

exprimiert ist und die Interaktion mit Internalin A erlaubt (Shimamura et al., 1992).

Ebenso wird der Rezeptor c-Met auf einer Reihe von Zellen des zentralen

Diskussion

118

Nervensystems exprimiert und ermöglicht die Interaktion mit Internalin B (Jung et al.,

1994; Maina et al., 1997). In vitro Arbeiten zeigten, dass über die InlB-c-Met-Inter-

aktion Listeria monocytogenes in humane mikrovaskuläre Hirnendothelzellen ein-

dringen kann (Greiffenberg et al., 1998). Die Infektion mit Listerienmutanten für InlA

und InlB ergab, dass die Deletion des InlB in einer Reduzierung der Invasionrate

resultierte. Die InlA-Deletion zeigte dagegen keine signifikante Reduktion der

Invasionsrate, was darauf hinweist, dass InlA für die Invasion in vaskuläre

Hirnendothelien keine Rolle spielt (Greiffenberg et al., 1998).

In dieser Arbeit wurden ausgewählte Mausinzuchtstämme (A/JOlaHsd, BALB/cJ,

C3HeB/FeJ, C57BL/6J und 129P2/Ola) mit murinisierten Listerienstämmen

(LmoXen32-mur, LmoEGDe-mur-lux) und ihren isogenen Wildtypstämmen

(LmoXen32, LmoEGDe-lux und LmoEGDe) oral infiziert. Sowohl die Infektion mit

murinisierten Listerienvarianten als auch die Infektion mit den nicht-murinisierten

Wildtypstämmen führte zu neurologischen Ausfallserscheinungen wie Torticollis und

„kreiselnde“ Bewegungen um die Längsachse. Das Auftreten dieser neurologischen

Ausfallerscheinung konnte als Invasion des ZNS durch Listeria monocytogenes

gewertet werden. Der Zeitpunkt des Auftretens der klinischen Symptome einer ZNS-

Infektion war am Tag sieben bis Tag acht nach der oralen Infektion zu beobachten.

Klinische Symptome konnten in den Mausinzuchtstämmen 129P2/Ola, A/JOlaHsd,

BALB/cJ und C57BL/6J nachgewiesen werden (Abschnitt 2.6). Die histologische

Analyse des Gehirns zeigte Infiltration von Granulozyten und Makrophagen im

Bereich der Meningen sowie konnte mit Hilfe der immunhistologischen Analyse der

Nachweis von Listeria monocytogenes innerhalb dieser Inflitrationen erbracht

werden. Der neurologische Phänotyp wurde insgesamt nur in acht von 600 Tieren,

welche über den Versuchszeitraum von über sieben Tagen beobachtet worden sind,

nachgewiesen. Drei Mäuse entwickelten nach der Infektion mit nicht-murinisierten

Listerienstämmen und fünf Mäuse nach der Infektion mit murinisierten

Listerienstämmen klinische Symptome einer ZNS Infektion. Das Auftreten der

neurologischen Symptome war somit nur in einzelnen Tieren zu beobachten und es

konnte keine Reproduzierbarkeit der Ergebnisse erreicht werden. Die gewonnenen

Ergebnisse bestätigen, dass eine intakte Internalin A - E-Cadherin Interaktion nicht

Diskussion

119

Voraussetzung für die Überquerung der Blut-Hirn-Barriere ist und die Murinisierung

des Internalin A keinen Einfluss dabei hat. Da neurologische Symptome sowohl bei

intakter InlA - E-Cadherin - Interaktion (murinisierte Listerien) als auch bei

ineffizienter InlA - E-Cadherin - Interaktion (nicht-murinisierte Listerien) beobachtet

werden konnten, lässt sich schlussfolgern, dass die Murinisierung des Internalin A

nicht zu einer verstärkten Invasion des ZNS beiträgt. Auch die Generierung der

knock-in Maus „E16P“, welche durch den Austausch von Glutamin zu Prolin an der

Position 16 des Maus-E-Cadherins humanes E-Cadherin anstelle von murinem E-

Cadherin exprimiert, konnte die Rolle des InlA bei der Überquerung Blut-Hirn-

Schranke ebenfalls nicht aufzeigen (Disson et al., 2008).

Weitere diskutierte Infektionswege für die Invasion des Gehirns und die Durch-

querung der Blut-Hirn-Schranke ist der Transport der Listerien innerhalb infizierter

Makrophagen. Dieser Infektionsweg ist auch als sogenannte „Trojanisches Pferd“

Hypothese beschrieben worden (Drevets, 1999; Drevets et al., 2001). In der

Frühphase der Infektion wurde der intrazelluläre Transport von Listeria mono-

cytogenes innerhalb von Makrophagen und dendritischen Zellen zur Milz beobachtet

(Neuenhahn et al., 2006; Neuenhahn et al., 2010; Pron et al., 2001).

Listerieninfizierte Makrophagen konnten im peripheren Blut und im Gefäßsystem des

Gehirns von infizierten Mäusen nachgewiesen werden (Drevets, 1999; Prats et al.,

1992). Die Isolierung dieser infizierten peripheren Leukozyten und die anschließende

intravenöse Injektion in Mäuse resultierte in einer Organinfektion von Leber, Milz und

Gehirn, was mit Hilfe der Analyse der bakteriellen Keimlast in diesen Organen

aufgezeigt werden konnte (Drevets, 1999). Infolge einer Infektion mit Listeria

monocytogenes mit anschließender systemischer Dissemination kann eine Invasion

des Knochenmark erfolgen. So konnte nach der intravenösen Infektion mit Listeria

monocytogenes infizierte myeloide Knochenmarkszellen nachgewiesen werden,

welche nach intravenöser Transplantation in C57BL/6J Mäuse zu einer Invasion des

Gehirns führten (Join-Lambert et al., 2005). Ebenso zeigten BALB/c Mäuse nach

oraler und CD1 Mäuse nach intravenöser Infektion mit biolumineszenten Listerien

eine Invasion des Knochenmarks, welche über die Detektion der Biolumineszenz in

der Tibia nachgewiesen werden konnte (Hardy et al., 2009). Über infizierte

Diskussion

120

Makrophagen kann zudem die weitere Zell-Zell-vermittelte Ausbreitung in

Hirnendothelien erfolgen. In vitro Arbeiten zeigten, dass Listeria monocytogenes über

Zell-Zell-vermittelte Dissemination Endothelien und Neuronen effizient infizieren kann

(Dramsi et al., 1998; Drevets, 1999). Ebenso weisen infizierte Phagozyten eine

ausgeprägte Adhärenz zu epithelialen Zellen auf, was eine Zell-zu-Zell Ausbreitung

begünstigt und intrazellulären Listerien die Infektion von endothelialen Zellen

ermöglicht (Drevets, 1999; Drevets et al., 2001; Greiffenberg et al., 1998). Somit

stellen infizierte Monozyten eine mögliche Infektionsquelle für die Invasion des ZNS

dar. Die weitere Ausbreitung der Listerien in tiefere Gewebeschichten des ZNS-

Parenchyms erfolgt über eine Zell-Zell-vermittelte Ausbreitung. Ein wichtiger

Virulenzfaktor für die weitere Zell-Zell-vermittelte Invasion ist die Phosphatidylcholin-

spezifische Phospholipase C (PlcB). Listerienmutanten, welche defizient für PlcB

sind, zeigten eine reduzierte Virulenz nach intrazerebrale Injektion in C57BL/6J

Mäusen, was in einer geringeren bakteriellen Keimlast und Mortalitätsrate resultierte

(Schlüter et al., 1998).

Eine weitere Alternative für die Invasion des zentralen Nervensystems liegt im

Transport von Listeria monocytogenes entlang von Neuronen. Schon früh wurde

beobachtet, dass die Injektion von Listerien in die Mundschleimhaut von Mäusen und

Ziegen zu klinischen Symptome einer Hirnstammenzephalitis führte (Asahi et al.,

1952). Die Präparation des Gehirns und der kranialen Nerven ergab Infiltrationen von

mononukleären Zellen entlang des Nervus trigeminus und im Hirnstamm. In Fällen

einer spontanen Enzephalitis in Schafen konnten ebenfalls intraaxonal Listerien

elektronenmikroskopisch nachgewiesen werden (Charlton, 1977; Otter und

Blakemore, 1989). Der intraaxonale Transport wurde bestätigt als sechs von

21Schafe, welche direkt in die Zahnpulpa mit Listerien infiziert wurden waren

neurologische Symptome entwickelten (Barlow und McGorum, 1985). Der

Zusammenhang zwischen einer neuronalen Infektion und dem Auftreten einer

Erkrankung des ZNS wurde im Mausmodell bestätigt. So führte die Injektion von

Listerien in die Kranialnerven oder in die faszialen Muskeln von Hsd/ICR Mäusen zu

klinischen Symptomen einer Rhombenzephalitis (Antal et al., 2001). Die Infektionen

von Neuronen mit extrazellulär vorliegenden Listeria monocytogenes ist jedoch in

Diskussion

121

vitro selten zu beobachten. So resultierte die Infektion von murinen fetalen

Gehirnzellen mit Listeria monocytogenes in einer geringeren Invasionsrate (3,5%) im

Vergleich zu der Infektion von Makrophagen (56,6%) (Peters und Hewicker-

Trautwein, 1994).

Ein nicht zu vernachlässigender Faktor für eine Infektion des ZNS mit Listeria mono-

cytogenes ist zusätzlich die Lebensweise des Wirtes. Gerade bei Wiederkäuern kann

die Nahrungsaufnahme von Silage zu Verletzungen der Mundschleimhaut führen,

welche dann Listerien aus kontaminierter Silage die Infektion der in der Mund-

schleimhaut vorliegenden Nerven ermöglichen. Im Menschen ist dieser neuronale

Infektionsweg nicht vollständig geklärt, da die Risikolebensmittel, wie Salate und

Käse, keine abrasiven Eigenschaften aufweisen und die Mundschleimhaut wenig

verletzen, ähnliche Voraussetzungen wie im Mausmodell mit murinisierten Listerien.

Somit lässt sich vermuten, dass die Infektion des Gehirns am wahrscheinlichsten

über infizierte Makrophagen und über eine anschließende Zell-Zell-vermittelte

Ausbreitung erfolgt. Dies bedarf jedoch weiterer Analysen und könnte unter

Verwendung der murinisierten Listerien LmoEDGe-mur-lux im Mausmodell zum

Beispiel mit Hilfe von Zweiphotonenmikroskopie im Detail erfolgen.

3.5 Die Detektion des Biolumineszenzsignals in Abhängigkeit verschie-

dener Faktoren

Die in vivo Analyse von Infektionsprozessen mit Hilfe des Biolumineszenz-Imaging

ermöglicht die Lokalisation von Pathogenen im lebenden Organismus und die

Beobachtung ihrer Dissemination zu den inneren Organen des Versuchstiers.

Basierend auf der Eigenschaft von Lichtphotonen durch Gewebe transmittiert zu

werden, wurden verschiedene Systeme etabliert, die emittiertes Licht aus einer

internen biologischen Quelle detektieren können.

Biolumineszenz ist ein lichtemittierender chemischer Prozess, welcher über Luzi-

ferasen katalysiert wird. Mit Hilfe verschiedener Luziferasen (DeLuca und McElroy,

1974; Hastings und Nealson 1977; Matthews et al., 1977) erfolgte die Generierung

Diskussion

122

von biolumineszenten Pathogenen wie Staphylococcus aureus (Francis et al., 2000),

Streptococcus pneumonia (Francis et al., 2001), Herpes-simplex-virus Typ I (Luker et

al., 2002), Salmonella enterica (Burns-Guydish et al., 2005) und Listeria

monocytogenes (Hardy et al, 2004; Monk et al., 2010; Riedel et al., 2007), um Infek-

tionsprozesse im Versuchstier direkt zu beobachten.

Das in vivo Biolumineszenz-Imaging erlaubt die nicht invasive und hochsensitive

Echtzeitaufnahme des Infektionsverlauf des ganzen lebenden Tieres nach der Infek-

tion mit biolumineszenten Pathogenen. Die Tiere werden in einer lichtdichten

Kammer platziert und das emittierte Licht über eine CCD Kamera (cooled coupeld

device) detektiert. Aufgrund einer Kühlung der Kamera kann störendes Wärme-

rauschen reduziert werden. Die Messung der Tiere erfolgt unter Narkose, um die

Biolumineszenzsignale anatomisch zuordnen zu können. Dabei werden die Mäuse

auf einer Wärmeplatte platziert, um sie vor einer nakosebedingten Auskühlung zu

schützen. Die Signalintensität der Biolumineszenz wird mit Hilfe des Systems in

Falschfarben dargestellt (Abschnitt 5.4.4).

Die in dieser Arbeit durchgeführten Analysen des in vivo Biolumineszenz-Imaging

ergaben nach der Infektion ausgewählter Mausinzuchstämme mit biolumineszenten

Listerien verschiedene Intensitäten. A/JOlaHsd und BALB/cJ Mäuse eigneten sich

aufgrund ihrer unpigmentierten Haut und Fellfarbe gut für die Detektion der

Biolumineszenz. Ebenso zeigten C3HeB/FeJ Mäuse intensive Bio-

lumineszenssignale, was über deren ausgeprägte Suszeptibilität zu erklären ist. Je

empfindlicher ein Mausstamm reagiert, desto höher ist die Invasions- und Repli-

kationsrate der Listerien in vivo und dementsprechend kann die Detektion inten-

sitätsstarker Biolumineszenzen erfolgen (siehe Abschnitt 2.3.3 und Abschnitt 3.3).

Ergebnisse der in dieser Arbeit durchgeführten Experimente ergaben direkt nach der

Infektion detektierbare biolumineszente Listerien im Magen-Darm-Trakt. An den

Tagen eins und zwei nach der Infektion war keine oder nur eine sehr geringe

Biolumineszenzen nachweisbar (Abschnitt 2.3.4.2). Die geringe Biolumineszenz im

Darmbereich in der frühen Phase der Infektion resultierte aus der Dissemination der

Listerien über den Darm und infolge dessen mit deren partiellen Ausscheidung.

Diskussion

123

Jedoch kann zusätzlich der physiologische Sauerstoffmangel innerhalb des Darms

die Biolumineszenzreaktion reduziert haben. Die Biolumineszenzreaktion ist

sauerstoffabhängig, wobei Luziferasen die Oxidation ihres spezifischen Substrates in

Abhängigkeit von Sauerstoff und ATP unter Freisetzung von Lichtphotonen

katalysieren (Greer und Szalay, 2002). So konnte nach der oralen Infektion von

BALB/c Mäusen mit luziferaseexprimierenden Salmonellen keine Biolumineszenz im

Dünndarm detektiert werden. Erst nach Injektion von Luft in den Darm konnten

Photonen in der Nähe der Injektionsstelle nachgewiesen werden (Contag et al.,

1995).

Weiterhin wird die Transmission von Licht durch das Gewebe über die Absorption

und Streuung des Lichtes abgeschwächt (Tuchin, 2000; Rice et al., 2001). Streuung

von Licht erfolgt an allen Zell- und Organellmembranen. Dies hat zur Folge, dass

emittiertes Licht abgelenkt und die räumliche Auflösung reduziert wird. Je tiefer im

Gewebe sich die Listerien befinden, desto größer ist die Streuung und geringer die

Detektion der Biolumineszenz. Die Absorption von Licht ist abhängig vom Zell- oder

Gewebetyp sowie von der Anwesenheit des Hämoglobins oder Melanins (Tromberg

et al., 2000). Hämoglobin absorbiert Licht in einer Wellenlänge von 400-600 nm.

Während der Biolumineszenzreaktion wird Licht mit einer Wellenlänge von 490 nm

emittiert somit kann speziell in den gut durchbluteten Organen wie Milz und Leber,

ebenfalls Zielorgane der Listerien (Lecuit et al., 2001), das emittierte Licht der

biolumineszenten Listerien abgeschwächt werden.

Weitere Faktoren, welche die Detektion der Biolumineszenz beeinflussen, sind die

Anzahl der biolumineszenten Zellen, welche die Reportergene exprimieren und die

Stärke des generierten Signals. Einen weiteren Einfluss auf die Detektion der

Biolumineszenz hat das Luziferase-Reportersystem. Mit der Integration des

kompletten Lux-Operons, welches sowohl für das Enzym als auch für das Substrat

der Lichtreaktion codiert, ins Genom von z.B. Bakterien, wird eine stabilere Licht-

produktion erreicht (Doyle et al., 2004). Bei anderen Reportersystemen, bei denen

nur die Luziferasegene ins Genom von Tieren integriert sind, muss die Zugabe des

Substrats für die Biolumineszenzreaktion zusätzlich von außen erfolgen. Die Injektion

Diskussion

124

des Substrates ermöglicht die Detektion intensitätsstarker Biolumineszenzen, jedoch

ist dieses Signal nur über einen kurzen Zeitraum stabil.

Wie diese Arbeit anschaulich demonstriert, ist eine bestimmte Anzahl von bio-

lumineszenten Listerien nötig, um spezifische Biolumineszenzsignale zu erhalten. Ab

einer Bakterienlast von 104 CFU / mg Organ war eine Korrelation der Bakterienlast

mit der Biolumineszenz erkennbar (Abschnitt 2.5). Hier liegt auch die Limitation des

BLI. Eine geringere Anzahl von Listerien ist nicht detektierbar. Wie die Analyse der

bakteriellen Keimlast zeigte, lag die Anzahl der Listerien in den inneren Organen

Milz, Leber, mLK, Dünndarm und Gehirn von C57BL/6J Mäusen an Tag drei und fünf

nach der Infektion zwischen 103-104 CFU / mg Organ. Es konnten jedoch in vivo und

ex vivo keine Biolumineszenzsignale in diesen Organen detektiert werden (Abschnitt

2.4.3.1 und Abschnitt 2.3.4.2). Spezifische Biolumineszenzsignale der Listerien

waren erst ab einer bakteriellen Keimlast größer als 104 CFU/mg Organ möglich.

Ebenfalls von wichtiger Bedeutung für die Analyse über BLI ist die Wahl des

Mausstamms. Dunkles Fell und eine dunkle Pigmentierung der Haut absorbieren

mehr Licht als Tiere mit weißem Fell und nicht pigmentierter Haut. Daher erwiesen

sich BALB/cJ und A/JOlaHsd Mäusen eher als geeignet für das in vivo Imaging als

C57BL/6J Mäuse. Die Detektion der Biolumineszenz kann zusätzlich über eine Rasur

des Fells erleichtert werden.

Ein großer Vorteil des in vivo Biolumineszenz-Imaging ist die Möglichkeit der wieder-

holten Messung individueller Tiere über den gewünschten Versuchszeitraum. Dieses

nicht invasive Verfahren ermöglicht die Anzahl der Versuchstiere zu reduzieren.

Jedoch sollten die Ergebnisse des BLI mit Endpunktprotokollen, wie der Bestimmung

der bakteriellen Keimlast, bestätigt werden.

3.6 Reaktionen des angeborenen Immunsystems auf die Infektion mit

Listeria monocytogenes

Die angeborene Immunantwort stellt die erste Verteidigungslinie nach der Infektion

mit pathogenen Mikroorganismen dar. Phagozytierende Zellen wie Makrophagen,

Diskussion

125

neutrophile Granulozyten und dendritische Zellen sind von Bedeutung, um die bakte-

rielle Ausbreitung und Vermehrung durch die Produktion antimikrobieller Wirkstoffe

zu hemmen (Rogers und Unanue, 1993). Intrazelluläre Bakterien wie Listeria mono-

cytogenes haben Strategien entwickelt, um innerhalb dieser Phagozyten zu über-

leben und zu replizieren (Flannagan et al., 2009; Ray et al., 2009). Dazu gehören die

Fähigkeit zur Lyse der Invasionsvakuole, die intrazelluläre Replikation und die Aus-

breitung von Zelle zu Zelle. Die Detektion von bakteriellen Komponenten über die

Zellen des Immunsystems führt zur Sekretion von inflammatorischen Zytokinen,

welche wichtig für die Kommunikation der beteiligten Immunzellen sind (Leber et al.,

2008). Listeria monocytogenes induziert die Synthese von Typ-I-Interferonen,

bestehend aus IFN-β und 13 verschiedenen IFN-α Subtypen (O´Riordan et al., 2002;

Perry et al., 2005; Petska et al., 2004). Interferone aktivieren weiter eine Vielzahl von

Genen, welche wiederum in den Prozessen der angeborenen und erworbenen

Immunabwehr von Bedeutung sind. Die Sekretion von IFN-αβ wirkt sich jedoch

begünstigend auf eine Listerieninfektion aus. Mäuse, welche für den Interferon-I-

Rezeptor defizient sind, zeigten sich resistent gegenüber der Infektion mit Listeria

monocytogenes (Auerbuch et al., 2004). So resultierte die intravenöse Infektion von

IFN-α/βR-/- Mäusen in einer geringeren bakteriellen Keimlast in der Leber und der

Milz als die Infektion von BALB/cJ Wildtypmäusen.

Im Rahmen der Phänotypisierung von Mausmutanten erfolgte in dieser Arbeit die

Infektion von Interferon-α inducible protein 27 like 2A knock-out (Ifi27l2a-KO)

Mäusen. Das Gen Ifi27l2a (lSG12b1) wird von Typ-I-IFN stimuliert und gehört zu

einer großen Familie der über Interferone aktivierten Gene und wird vor allem in

Makrophagen und im Fettgewebe exprimiert (Li et al., 2009, Ohgaki et al., 2007). Die

Analyse der Überlebensrate der Ifi27l2a-KO Mäuse im Vergleich zu den

entsprechenden Wildtypkontrollen, C57BL/6N, ergab keine signifikanten

Unterschiede (Abschnitt 2.7.1). Jedoch zeigte die Analyse der bakteriellen Keimlast

eine signifikant höhere Listerienanzahl in Ifi27l2a-KO Mäusen in der Leber und Milz

an Tag drei nach der intravenösen Infektion im Vergleich zu C57BL/6N Mäusen.

Ebenso zeigten die Kurvenverläufe der Körpergewichte signifikante Unterschiede

von Ifi27l2a-KO Mäusen im Vergleich zu den infizierten C57BL/6N Mäusen an den

Diskussion

126

Tagen zwei, drei und vier nach der Infektion. Die Ifi27l2a-KO Mäuse reagierten mit

größeren Gewichtsverlusten als die C57BL/6N Mäuse. Der Genverlust von Ifi27l2a

könnte dazu beitragen, dass in den ersten Tagen nach der Infektion ein größerer

Gewichtsverlust bei Ifi27l2a-KO Mäusen nachzuweisen war. Jedoch erfolgte die

Gewichtszunahme zu einem früheren Zeitpunkt in Ifi27l2a-KO Mäusen (Tag fünf

nach der Infektion) im Vergleich zu C57BL/6N (Tag neun nach der Infektion). Dies

könnte die Möglichkeit der Kompensation des Ifi27l2a-KO im Verlauf der Infektion

demonstrieren. Ifi27l2a ist nur ein Gen aus einer ganzen Gruppe von Genen, welche

über IFN stimuliert werden. Somit ist anzunehmen, dass die fehlende über Ifi27l2a

vermittelte Funktion über andere IFN-stimulierte Gene kompensiert wird. Zur

weiteren Analyse Ifi27l2a-KO wäre es hilfreich, die bakterielle Keimlast an zusätz-

lichen Zeitpunkten nach der Infektion zu untersuchen.

Der Nachweis von IFN-β war aufgrund fehlender effektiver Detektionssysteme in

vorangegangenen Arbeiten begrenzt möglich. Mit Hilfe der von Lienenklaus et al.,

etablierten Interferon-β-Reportermaus (Lienenklaus et al., 2009) konnte in dieser

Arbeit die Visualisierung der IFN-β-Produktion in verschiedenen Geweben nach der

Infektion mit Listeria monocytogenes in vivo beobachtet werden. Untersucht wurde

die IFN-β-Produktion nach der Infektion mit den murinisierten Listerienstämmen

LmoEGDe-mur-lux und LO28-mur, im Vergleich mit ihren isogenen Wildtypstämmen

LmoEGDe-lux und LO28 (Abschnitt 2.7.2). Die Listerienstämme EGDe und LO28

unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit eine IFN-β-Synthese zu aktivieren. Der

Listerienstamm LO28 induziert im Vergleich zu LmoEGDe eine stärkere IFN-β-

Produktion (Reutterer et al., 2008).

Wie in dieser vorliegenden Arbeit gezeigt werden konnte, resultierte die

Murinisierung des Internalin A zusätzlich in einer Erhöhung der Interferon-β-Synthese

in den verschiedenen Geweben (Abbildung 2-33). So zeigte die Infektion mit LO28-

mur und LmoEGDe-mur-lux eine erhöhte IFN-β-Produktion als die Infektion mit den

isogenen Wildtypstämmen LO28 und LmoEGDe-lux. Weiterhin konnten am Tag zwei

nach der oralen Infektion mit Listeria monocytogenes die Produktion von IFN-β in

den zervikalen Lymphknoten, der Leber und im Darm nachgewiesen werden. Die

Detektion von Listerien nach oraler Infektion in den Lymphknoten wurde bereits in

Diskussion

127

früheren Arbeiten gezeigt (Tam und Wick, 2006). Ebenso konnten Listerien nach

intravenöser Infektion in den zervikalen und inguinalen Lymphknoten nachgewiesen

werden (Solodova et al., 2011). Wie bei Solodova et al., beschrieben, wurde nach

der intravenösen Infektion mit LO28 die IFN-β-Synthese in der Milz jedoch nicht in

der Leber beobachtet. (Solodova et al., 2011). In der vorliegenden Arbeit war eine

IFN-β-Produktion in der Milz nach oraler Infektion nicht nachweisbar. Hier scheint die

Infektionsroute eine wichtige Rolle zu spielen. Nach intravenöser Infektion erfolgt die

systemische Ausbreitung sofort und ist nicht wie nach der oralen Infektion von der

Passage durch die intestinale Barriere abhängig. Im Meerschweinchenmodell konnte

nachgewiesen werden, dass die Ausbreitung von Listerien zur Leber nach der oralen

Infektion zum einen direkt vom Dünndarm aus über die Pfortader erfolgen oder

indirekt über die mLK (Melton-Witt et al., 2011). Die Ausbreitung zur Milz erfolgt

dagegen nur über den indirekten Weg. Dies führte nach der oralen Infektion zu

einem höheren Prozentsatz von Listerien in der Leber im Vergleich zur Milz (Melton-

Witt et al., 2011). Dies könnte erklären, warum im murinisierten Listerienmodell in der

Maus nur eine IFN-β-Produktion in der Leber und nicht in der Milz detektiert wurde,

da die Invasion von einer höheren Anzahl Listerien in die Leber eine verstärkte IFN-

β-Synthese induziert.

Ausblick

128

4 Ausblick

Mit Hilfe der generierten murinisierten Listerienstämme wird die Induzierung einer

humanen Listeriose im Mausmodell möglich. Durch die zusätzliche Integration des

Lux-Operons in das Genom von Listeria monocytogenes kann der Krankheitsverlauf

zusätzlich in vivo verfolgt werden. So können individuelle Tiere über den gesamten

Versuchszeitraum täglich untersucht werden. Die nicht invasive Analyse der

Listerieninfektion über Biolumineszenz-Imaging erlaubt daher, die Menge der

eingesetzten Versuchstiere erheblich zu reduzieren.

Das in vivo Imaging von Listeria monocytogenes erbrachte in den letzten Jahren

neue Erkenntnisse über deren Pathophysiologie und Invasion. Die Beschreibung der

Fähigkeit extrazellulär in der Gallenblase zu replizieren, erbrachte neue Einsichten in

die Lebensweise von Listerien (Hardy et al., 2004).

Die Etablierung des murinisierten Listerienmodells erlaubt die Infektion jedes belie-

bigen Mausstammes und somit die Untersuchung der Listerieninfektion in Abhängig-

keit des genetischen Hintergrund des Wirtes. Es wird damit auch gezielt möglich

sein, knock-out- bzw. knock-in-Mausmutanten zu phänotypisieren. Die Auswirkung

einzelner Gene auf die angeborene und erworbene Immunantwort bei einer

Listerieninfektion über die natürliche orale Infektionsroute kann somit analysiert

werden. Zusätzlich kann mit Hilfe des in vivo Imaging die Dissemination der Listerien

über den Organismus verfolgt werden. Es könnten Erkenntnisse gewonnen werden,

welche weiteren bisher nicht identifizierten Virulenzfaktoren eine Rolle bei der Über-

querung epithelialer Barrieren wie der Plazentaschranke, der Blut-Hirn-Schranke und

der intestinalen Barriere sowie bei der Interaktion mit der Immunabwehr spielen.

Wie Listeria monocytogenes die Plazentaschranke überquert, ist noch nicht voll-

ständig verstanden und wird kontrovers diskutiert. Viele verschiedene Faktoren

spielen dabei eine Rolle. Zum einen erfolgt während der Schwangerschaft, infolge

einer veränderten hormonellen Situation, eine physiologische Suppression der T-

Zell-vermittelten Immunantwort (Pung et al., 1985; Weinberg, 1984). Diese schützt

Ausblick

129

zwar den Fetus vor der Abstoßung, erhöht aber auch die Anfälligkeit für intrauterine

Infektionen (Redline et al., 1988; Redline und Lu, 1987; Redline und Lu, 1988).

Weiterhin führt aufgrund einer geringeren IFN-γ, IL-2 und TNF-α Produktion, bedingt

durch einen erhöhten Östrogenspiegels während einer Schwangerschaft, die Infek-

tion mit Listerien zur Invasion der Plazenta und des fetalen Gewebes (Nakane et al.,

1985; Salem et al., 1999). Auch resultierte, nach der oralen Infektion von

schwangeren C57BL/6J Mäusen mit Listeria monocytogenes, diese physiologische

Immunsuppression in einer reduzierten Resistenz und führte zu schwerwiegenden

fetalen Infektionen mit Aborten (Poulsen et al., 2011). Die Oberflächenproteine InlA

und InlB und deren Interaktion mit ihren Rezeptoren E-Cadherin und c-Met sind bei

der Überquerung der Plazentaschranke mit involviert. Für die effektive Invasion der

humanen Plazenta mit Listeria monocytogenes sind beide intakten InlA- und InlB-

Wege nötig. Nach einer Infektion mit Deletionsmutanten für InlA oder InlB sowie für

die Doppelmutante war die Effizienz der Plazentainfektion deutlich verringert (Lecuit

et al., 2004). Die Etablierung der murinisierten Listerienvarianten (Monk et al., 2010;

Wollert et al., 2007b) könnte zu weiteren Untersuchungen der Rolle des Internalin A

beim Überqueren der Plazentaschranke im Mausmodell genutzt werden. Beide

Interaktionswege, InlA und InlB, sind funktionsfähig und die orale Infektion von

schwangeren Mäusen kann als Modell für die Infektion im Menschen hilfreich sein.

Eine weitere diskutierte Hypothese für die Überquerung der Plazentaschranke ist,

wie bei der Überquerung der Blut-Hirn-Schranke, die Invasion über infizierte

Phagozyten („Trojanisches Pferd“) (Bakardjiev et al., 2005; Bakardjiev et al., 2006;

LeMonnier et al., 2007). Listerien erreichen über infizierte Monozyten die Plazenta.

Durch eine nachfolgende Zell-Zell-Ausbreitung über die Trophoblasten können die

Listerien das fetale Gewebe erreichen. Dies könnte unter Verwendung der

murinisierten und biolumineszenten Listerien LmoEDGe-mur-lux im Mausmodell in

vivo und nicht invasiv mittels BLI erfolgen.

Zudem ist die Etablierung von Tiermodellen der initiale Schritt Krankheitsgeschehen

zu verstehen, welche am Ende mit der Entwicklung von wirksamen Therapeutika

einhergehen.

Material und Methoden

130

5 Material und Methoden

Die im Verlauf dieser Arbeit verwendeten Reagenzien und Chemikalien wurden,

soweit nicht an anderer Stelle erwähnt, von den Firmen Applichem GmbH, Becton &

Dickinson, BioRad, Gibco, Invitrogen, J.T. Baker, Macherey & Nagel, Merck, New

England Biolabs, PAA, Qiagen, Roche, Roth, Serva und Sigma bezogen. Die

Herstellung sowie Verwendung der verschiedenen Pufferlösungen und Medien sind

bei den entsprechenden Methoden vermerkt. Generell wurden alle Lösungen unter

Verwendung von Wasser aus einer Millipore-MilliQ-Anlage angesetzt. Bei Bedarf

erfolgte die Sterilisation der Lösungen durch 20-minütiges Autoklavieren bei 121°C

und 2 bar oder über Filtration. War steriles Arbeiten erforderlich wurden sterilisierte

Gefäße und Verbrauchsmaterialien verwendet. Soweit nicht an anderer Stelle

erwähnt, erfolgte die Nutzung in molekularbiologischen Laboren allgemein gebräuch-

lichen Gerätschaften und Materialien. Der Einsatz kommerzieller Kitsysteme sowie

deren Versuchsdurchführung erfolgte nach Vorschrift und wird bei Abweichungen im

Versuchsablauf an entsprechender Stelle der Methoden erwähnt.

5.1 Generierung genetisch veränderter Listeria monocytogenes Stämme

5.1.1 Generierung elektrokompetenter Listerien

Als Voraussetzung für die Transformation von Listeria monocytogenes mit dem

Integrationsvektor pAUL-A-inlAm-inlB wurden elektrokompetente Listerienzellen

benötigt. Die Stämme LO28 und LmoXen32 wurden über Nacht in einer Flüssigkultur

von Brain-Heart-Infusion (BHI) bei 37°C angezogen und am nächsten Morgen 1:50 in

500 ml BHI-Medium mit 0,5 M Sucrose überimpft. Es folgte die Inkubation bei 37°C

im Schüttelinkubator bei 120 Umdrehungen pro Minute (rpm) bis die optische Dichte

600 (OD600) bei 0,2 lag (ca. 3 h). Danach erfolgte die Zugabe von PenicillinG zur

Unterdrückung der Zellwandsynthese in der Endkonzentration 10 µg/ml und die

weitere Inkubation bei 37°C bis zur OD600 von 0,5-0,7. Die Zellen wurden bei 3.000 x

g und 4°C für 20 min abzentrifugiert und anschließend dreimal in einem sich redu-

zierendem Volumen von 1 mM HEPES mit 0,5 M Sucrose gewaschen. Nach dem


131

letzten Waschschritt erfolgte die erneute Zentrifugation und die Aufnahme des

Zellsediments in 500 µl eiskaltem 1 mM HEPES mit 0,5 M Sucrose und 15% Gly-

cerin. Aliquots von 50 µl wurden bei -70°C gelagert (Park und Stewart, 1990).

Materialen: LmoXen32 CaliperLS LO28 Abteilung für

Molekulare Immunologie (MOLI), HZI

Plasmid pAUL-A-inlAm-inlB Abteilung für

Strukturbiologie (SB), HZI

BHI (Brain-Heart-Infusion) - Medium Becton & Dickinson

BHI + 0,5 M Sucrose:

2 x BHI (500ml) Becton & Dickinson 1 M Sucrose (500ml) Invitrogen Penicillin G USB

Waschpuffer: 1 mM HEPES + 0,5 M Sucrose

1 mM HEPES Roth 0,5 mM Sucrose Invitrogen

Aufnahmepuffer: 1 mM HEPES + 0,5 M Sucrose + 15% Glycerin (v/v) in Aquadest

1 mM HEPES Roth 0,5 mM Sucrose Invitrogen 15% (v/v) Glycerin Roth

Geräte: Zentrifuge Eppendorf 5804R Photometer Gene Quant pro Amersham Bioscience

5.1.2 Transformation und Selektion rekombinanter Listeria monocytogenes

Stämme

Die elektrokompetenten Listerien (50 µl) wurden mit 1 µg Vektor-DNA (eluiert in

Trispuffer) pAUL-A-inlAm-inlB über Elektroporation (2,5 kV, 25 µFd und 100 Ohm)

transformiert. Danach erfolgte die Zugabe von 1 ml BHI-Medium mit 0,5 M Sucrose

und die Inkubation bei 37°C für drei Stunden. Anschließend wurden Aliquots auf BHI-

Agarplatten mit 2 µg/ml Erythromycin (Ery) ausplattiert und über Nacht bei

Raumtemperatur (RT) kultiviert (Abbildung 5-1 (1)). Gewachsene Klone wurden auf


132

die erfolgreiche Transformation über den Nachweis der Erythromycinresistenz

selektioniert. Die plasmidtragenden Klone wurden erneut auf BHI-Agarplatten 2 µg/ml

Ery ausgestrichen und bei 42°C über Nacht kultiviert. Bei 42°C kann keine

extrachromosomale Replikation des Plasmides erfolgen und er kommt zur Integration

des Plasmides ins listerielle Genom (Abbildung 5-1 (2)). Eine erneute Anzucht auf

BHI-Ery-Agarplatten der gewachsen Klone diente der erneuten Selektion der

plasmidtragenden Klone. Im Anschluss erfolgte die Analyse der Integration in die

chromosomale DNA von Listeria monocytogenes mittels Präparation der

genomischen DNA, PCR und Sequenzierung des murinisierten inlA-Locus (siehe

Abschnitt 5.2). Zur Induzierung des Rekombinationsereignisses und Reversion des

Vektors wurde eine einzelne Kolonie in BHI-Flüssigkultur ohne Selektionsmarker bei

25°C angezogen. Anschließend sind 10 µl der Übernachtkultur in 50 ml frisches BHI-

Medium überimpft wurden und erneut bei 25°C kultiviert. Dieser Versuchsschritt

wurde dreimal wiederholt. Verdünnungen wurden auf BHI-Platten ausplattiert und

über Nacht ohne Selektionsmarker inkubiert. Ein Kolonie-Lift-up Assay wurde

durchgeführt und die gewachsenen Klone mittels sterilem Whatman-Filter auf BHI-

Ery-Agarplatten (2 µg/ml) überimpft. Nach dem Wachstum über Nacht erfolgte der

Vergleich der Platten mit und ohne Erythromycin. Klone, welche ihre

Erythromycinresistenz verloren hatten, zeigten ein Integrationsereignis über

homologe Rekombination mit Reversion des Vektors an (Abbildung 5-1 (3)). Zur

Analyse des Rekombinationsereignisses erfolgte die Präparation der chromosomale

DNA von Listeria monocytogenes und anschließender Validierung des murinisierten

Internalin A mittels PCR, Sequenzierung des inlA-Locus und der Western-Blot-

Analyse (siehe Abschnitt 5.2). Die Transformationsdurchführung zur Herstellung

genetisch modifizierter Listerienstämme ist in Abbildung 5-1 dargestellt.


133

Abbildung 5-1: Transformationsstrategie zur Herstellung genetisch modifizierter Listerienstämme. (1) Kompetente Listerien wurden mit dem Vektor pAULA-A-inlAm-inlB über Elektroporation (2,5 kV, 25 µFd und 100 Ohm) transformiert und auf Erythromycin-BHI-Agarplatten (2 µg/ml) selektioniert. (2) Integration des Plasmides bei plasmidtragenden Klonen erfolgte über die Kultivierung bei 42°C. (3) Zur Induzierung des Rekombinationsereignisses und Reversion des Vektors wurde eine einzelne Kolonie in BHI-Flüssigkultur ohne Selektionsmarker bei 25°C angezogen. 10 µl einer Übernachtkultur wurden in 50 ml frisches BHI-Medium überimpft und erneut bei 25°C kultiviert. Dieser Versuchsschritt wurde dreimal wiederholt. Verlust der Erythromycinresistenz diente als Indikator der erfolgreichen homologen Rekombination.

Reagenzien: BHI-Medium Becton & Dickinson BHI-Platten: BHI Becton & Dickinson

1,5% BactoTM Agar Becton & Dickinson 2 µg/ml Erythromycin Applichem

Materialien: Whatman Filter steril Whatman

Pinzette Geräte: Gene Pulser Xcell BioRad Inkubator Binder


134

5.2 Molekularbiologische Methoden

5.2.1 Präparation von Plasmid-DNA

Die Präparation der Plasmid-DNA von transformierten Listerien erfolgte mit Hilfe des

Nucleo Spin® Plasmid Mini Kits von Macherey & Nagel. Dafür wurden 2 ml einer

Übernachtkultur 30 sec bei 13.000 x g zentrifugiert. Das Zellsediment wurde in Puffer

A1 mit 2 mg/ml Lysozym für 30 min bei 37°C inkubiert zur Lyse der Gram-positiven

Zellwand. Alle anschließenden Arbeitsschritte wurden gemäß des im Plasmid Mini Kit

mitgelieferten Versuchsprotokoll durchgeführt.

Materialien: Nucleo Spin® Plasmid Mini Kit Macherey & Nagel Lysozym Serva

5.2.2 Präparation genomischer bakterieller DNA

Die Präparation der genomischen DNA von Listeria monocytogenes erfolgte unter

Verwendung des Nucleo-Spin® Tissue Kit von Macherey & Nagel. Dafür wurden 2 ml

einer Übernachtkultur 5 min bei 8.000 x g zentrifugiert. Das Zellsediment wurde in

Lysepuffer mit 2 mg/ml Lysozym für 60 min bei 37°C inkubiert zur Lyse der Gram-

positiven Zellwand. Danach erfolgte die Zugabe von Proteinase K und die Inkubation

bei 56°C für 1-3 h. Alle anschließenden Arbeitsschritte erfolgten gemäß der im Kit

mitgelieferten Produkt- und Versuchsbeschreibung.

Materialien: Nucleo Spin® Tissue Kit Macherey & Nagel Lysepuffer: 20 mM Tris-HCl Sigma 2 mM EDTA Roth 1% Triton X-100 Applichem

2 mg/ml Lysozym Serva

5.2.3 PCR

Der Nachweis der homologen Rekombination des inlA-inlB Locus erfolgte über PCR.

Die PCR-Reaktionen wurden in dünnwandigen 0,2 ml Reaktionsgefäßen und auf Eis


135

durchgeführt. Die PCR-Bedingungen waren für alle durchgeführten PCR-Reaktionen

identisch.

Für die Amplifikation wurde folgender Reaktionsansatz verwendet:

H2O 1 x Reaktionspuffer (10 x, mit MgCl2) 10 mM dNTP-Mix 10 pmol/µl Primer 1 10 pmol/µl Primer 2 2 Unit (U) Taq Polymerase 200 ng DNA

Für die Amplifikation der Fragmente wurden folgende Oligonukleotide eingesetzt:

inlA int for 5`-GTG GAA CCG GTG ACG CAG-3´

inlA for 5`-ACG AGA TGA AGG ATA TCA CTA AAC G-3´

inlA 446 for 5`-TGT TCA ACA ATC AGA TAA CGG ATA TAG-3´

inlA 1356 rev 5´-TAC CGC CAT CGC TAA TAG TAG CTG-3´

inlB for 5`-AGC TAG ATG TGG TTT TCG GAC TAT ATC TAG-3´

inlB 3500 for 5`-ATG GCA TTT ACC AGA ATT TAC AAA TGA AG-3´

inlB 3670 rev 5`-AGT CGG AGG TTT AGG TGC AGT TAT CCG-3´

inlB rev 5`-CGC GGG AAT GCA GGC ATC TAC -3´

inlB rev-2 5`-GCA CCT ATA TTA GTC CGA TAT AGT TCT TG -3´

PCR-Bedingungen zur Amplifikation von genomischen DNA-Fragmenten:

95°C 5 min 95°C 1 min 58°C 1 min 35 Zyklen 72°C 1 min 72°C 10 min

Materialien: High Fidelity Taq Polymerase Roche 10 mM dNTP-Mix Invitrogen Primer 10mM MWG Operon Geräte: Thermocycler Biometra


136

5.2.4 Gelelektrische Auftrennung von DNA-Fragmenten

Die Auftrennung von PCR-Produkten erfolgte mittels Gelelektrophorese. Agarose-

gele und Puffer wurden mit TBE-Puffer hergestellt. Je nach Fragmentgröße sind 1-2

%ige Agarosegele mit 0,2 µg/ml Ethidiumbromid eingesetzt worden. Für die

Beladung des Geles wurden die Proben mit (6:1) Probenpuffer versetzt. Zusätzlich

wurde ein Größenmarker aufgetragen zur späteren Abschätzung der Fragment-

größe.

Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte bei konstant gehaltener Spannung von 5

Volt / cm. Die Auswertung wurde mit Hilfe eines UV-Transilluminator Geldokumen-

tationsgerätes durchgeführt.

Materialien: TBE Puffer (10x): 89 mM Tris Sigma 89 mM Borsäure Roth 2 mM NaEDTA Roth Agarose Invitrogen Ethidiumbromid Serva Probenpuffer: in 1x TBE 50% Glycerin Roth 2% (w/v) Bromphenolblau Serva 2log DNA Leiter New England Biolabs Geräte: Gelelektrophorese Biometra Geldokumentationsgeräte Intas

5.2.5 Sequenzierung

Die Ausführung der Sequenzierungsreaktion erfolgte über den Service der Abteilung

Genomanalyse des Helmholtz-Zentrums für Infektionsforschung (HZI). Die zu

sequenzierenden Fragmente wurden aus dem Agarosegel präpariert und über

Gelextraktion aufgereinigt. Die aufgearbeiteten PCR-Produkte und entsprechende

Primer wurden an die Abteilung Genomanalyse, HZI weitergeleitet. Die erhaltenen

Sequenzen wurden dann mit Hilfe der Software MEGA 4.1 ausgewertet.


137

5.2.6 Proteinpräparation und Western-Blot-Analyse

5.2.6.1 Proteinextraktion

Die Expression der Oberflächenproteine Internalin A und Internalin B der murini-

sierten Listerienstämme wurden im Vergleich zu ihren isogenen Wildtyp-Stämmen

analysiert. Internalin A ist über eine kovalente Bindung in der Zellwand verankert,

während Internalin B nicht-kovalent über Lipoteichonsäuren an die bakterielle Zell-

wand gebunden ist. Aus diesem Grund erfolgte die separate Analyse von InlA im

Zellwandextrakt und der Nachweis von InlB im Zellkulturüberstand. Eine Übernacht-

kultur von Listeria monocytogenes wurde in 50 ml frisches BHI-Medium überimpft

und bei 37°C und 120 rpm bis zur OD600 von 1,0 kultiviert. Anschließend erfolgte die

Zentrifugation der Kultur bei 3500 x g für 30 min. Der Überstand diente für die

Extraktion der Proteine des Zellkulturüberstandes und das Zellsediment für die

Extraktion der Zellwandproteine. Der Überstand wurde in ein neues 50 ml Röhrchen

transferiert und 4,5 ml 100% Trichloressigsäure (w/v) und 4 ml Desoxycholat (1

mg/ml) zugegeben. Zur Präzipitation wurde der Überstand bei 4°C und über Nacht

inkubiert und dann am nächsten Tag bei 5500 x g für 60 min abzentrifugiert. Die

überstehende Flüssigkeit wurde entfernt und das Zellsediment in 2 ml Aceton

gewaschen, luftgetrocknet und in 200 µl SDS-Puffer resuspendiert. Anschließend

wurde das Proteinlysat mit Tris-HCl (1 M) pH 8.0 Puffer neutralisiert. Für die

Extraktion der Zellwandproteine wurde das nach der Zentrifugation der 50 ml

Flüssigkultur abgesetzte Zellsediment in 1,4 ml PBS mit 2% SDS resuspendiert und

eine Stunde bei 37°C und 300 rpm inkubiert. Anschließend erfolgte die Zentrifugation

der Zellen für 15 min bei 13000 x g. Der Überstand mit löslichen Bestandteilen wurde

in ein 2 ml Reaktionsgefäß transferiert. Durch Zugabe von 140 µl 100%

Trichloressigsäure (w/v) und 140 µl Desoxycholat (1 mg/ml) und der Inkubation über

Nacht bei 4°C erfolgte die Präzipitation der Proteine. Diese wurden am

darauffolgenden Tag 30 min bei 13000 x g abzentrifugiert, in 1 ml Aceton

gewaschen, luftgetrocknet und in 100 µl SDS-Puffer resuspendiert. Das Proteinlysat

wurde mit 1 M Tris-HCl pH 8.0 auf einen neutralen pH-Wert eingestellt.


138

Materialien: BHI-Medium Becton & Dickinson Trichloressigsäure (100% w/v) Roth

Desoxycholat Roth Aceton J.T. Baker

SDS-Puffer: 1% SDS Roth Tris-HCl pH 8.0: Tris Sigma HCl Merck

Listerienstämme: LmoEGDe (Serotyp 1/2a) Leibniz-Institut Deutsche Sammlung von Mikroorgansimen und

Zellkulturen GmbH (DSMZ)

LmoEGDe-mur Wollert et al., 2007 LmoXen32 Caliper LmoXen32-mur diese Arbeit LO28 MOLI, HZI LO28-mur diese Arbeit LmoEGDe-lux Riedel et al., 2007 LmoEGDe-mur-lux Monk et al., 2010

5.2.6.2 Western-Blot-Analyse

Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte unter Verwendung des Nanodrop

UV Spektrophotometer (Peqlab). Die Proteinextrakte wurden zunächst mit reduzie-

rendem Probenpuffer 1:1 versetzt und 5 min bei 95°C inkubiert. Anschließend

erfolgte die Auftrennung der Proteine über ein 10% SDS-Polyacrylamidgel in

Abhängigkeit von der Molekülgröße. Eine bessere Auftrennung wurde durch die

Verwendung eines zusätzlichen Sammelgels (5%) erreicht. Die Proteinproben und

ein Molekulargewichtsmarker wurden auf das Gel aufgetragen und bei 100 V für 90

min aufgetrennt.

Materialien: Probenpuffer 50 ml: 0,1 M Tris-HCl pH 6.8 Sigma

10% (w/v) Gycerin Roth 4% (w/v) SDS Roth 50 mg Bromphenolblau Serva 8% (v/v) β-Mercaptoethanol Sigma bei Bedarf frisch zugeben


139

Trenngel 10%: 10% Acrylamid-bis Roth

380 mM Tris pH 8.8 Sigma 0,1% (w/v) SDS Roth 0,1% (w/v) Ammoniumpersulfat Euroclone 0,04% (v/v) TEMED BioRad

Sammelgel: 5% Acrylamid-bis Roth

62 mM Tris pH 6.8 Sigma 0,1% (w/v) SDS Roth 0,1% (w/v) Ammoniumpersulfat Euroclone 0,1% (v/v) TEMED BioRad 10 x Laufpuffer pH 8.2:

250 mM Tris Sigma 2,5 M Glycin Roth 1% SDS Roth Molekulargewichtsmarker BioRad Geräte: Gelelektrophorese BioRad

Nach der gelelektrophoretischen Auftrennung wurden die Proteine für den Nachweis

der Expression von Internalin A (InlA), Internalin B (InlB) und dem Aktin-bindenden

Protein A (ActA) auf eine Immun-Blot Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membran

transferiert. Dafür wurden die Polyacrylamidgele aus der Elektrophoreseapparatur

entfernt und auf, in Blotpuffer getränkte, Filterpapiere gelegt. Die im absoluten

Methanol aktivierte Immun-Blot PVDF Membran wurde luftblasenfrei auf das Gel

gebracht und diese erneut von einer Lage Filterpapier bedeckt. Der gesamte Aufbau

wurde in eine mit Transferpuffer gefüllte Blotkammer gebracht und die Proteine 3 h

bei 60 V elektrophoretisch auf die Membran transferiert. Nach dem Blotten wurde die

Membran zunächst zweimal in PBS-T (PBS mit 0,3% Tween 20) gewaschen und

anschließend in PBS-T mit 1% BSA zur Blockierung unspezifischer Bindungsstellen

2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Es schlossen sich drei Waschschritte zu je 5 min

mit PBS-T und ein Waschschritt mit PBS für 5 min an. Danach erfolgte die Zugabe

der primären Antikörper (α-InlA, α-InlB und α-ActA) in der Verdünnung 1:1000 in PBS

und die Inkubation für 2 h bei Raumtemperatur bzw. über Nacht bei 4°C. Nicht

gebundene Antikörper würden über dreimaliges Waschen für 5 min mit PBS-T und

einem Waschschritt mit PBS für 5 min entfernt. Im Anschluss erfolgte die Zugabe des


140

Sekundärantikörpers (Anti-Maus Peroxidase konjugierter IgG(γ) polyklonal Anti-

körper) 1:2000 in PBS verdünnt und die Inkubation für 2 h bei Raumtemperatur.

Daraufhin wurde die Membran dreimal 5 min mit PBS-T und einmal mit PBS für 5

min gewaschen. Die Entwicklung der Membran erfolgte über die Umsetzung von

Diaminobenzidin unter Zugabe von Wasserstoffperoxid durch die Peroxidase zu

einer Braunfärbung.

Materialien: Transferpuffer: 1,25 mM Tris Sigma 192 mM Glycin Roth 20% (v/v) Methanol J.T. Baker PBS-T: PBS Gibco 0,3% (v/v) Tween 20 Sigma PBS-T BSA: PBS Gibco 0,3% (v/v) Tween 20 Sigma 1% (w/v) BSA Sigma

Antikörper: Anti-Internalin A (M160DbF11) Abteilung für Mouse monoclonal (IgG1) Experimentelle Immunologie

(EXIM), HZI Dr. Christian Erck

Anti-Internalin B (IC100F4) Lingnau et al., 1995 Mouse monoclonal (IgG1) EXIM, HZI

Anti-Lmo ActA (44g6s) Abnova Mouse monoclonal (IgG2b) Peroxidase-konjugiert Ziege KPL Anti-Maus IgG(γ) polyclonal Entwicklerlösung:

PBS Gibco 0,005% (w/v) Diaminobenzidin Sigma 0,0003% (v/v) Wasserstoffperoxid Merck Immun-Blot PVDF Membran BioRad Geräte: Blotkammer BioRad


141

5.3 Invasions-Assay

Zur Analyse ob eine verstärkte Aufnahme der murinisierten Listerienstämme

aufgrund einer erhöhten Bindungsaffinität vom murinisierten Internalin A zum

Rezeptor E-Cadherin erfolgt, wurde ein Gentamycin-Invasions-Assay durchgeführt

(Elsinghorst, 1994). Untersucht wurde die Aufnahme von LmoEGDe, LmoEGDe-mur,

LmoXen32, LmoXen32-mur, LO28, LO28-mur, LmoEGDe-lux und LmoEGDe-mur-lux

in humane Colonkarzinom-Zellen (Caco-2 Zellen) und in murine Colonkarzinom-

Zellen (CT-26 Zellen). Die Zellen wurden in MEM mit Earls´s Salz und fötales

Kälberserum (FKS), L-Glutamin, Natriumpyrovat und nichtessentieller Aminosäuren

bei 37°C und 7% CO2 kultiviert. Zwei Tage vor der Infektion wurden je 2 x 105 Zellen

pro Vertiefung einer 24-well-Platte ausgesät. Eine Übernachtkultur von Listeria

monocytogenes wurde 1:50 in frisches BHI-Medium überimpft und bei 37°C und 120

rpm bis zur mittleren Log-Wachstumsphase kultiviert. Die Listerien wurden zweimal

in MEM mit Earls´s Salz ohne FKS gewaschen und der konfluente Zellrasen mit 2 x

106 Bakterien pro Vertiefung infiziert. Die Platten wurden für 5 min bei 500 x g

zentrifugiert und 1 h bei 37°C und 7% CO2 inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS

gewaschen und es erfolgte die Zugabe von Medium mit 100 µg/ml Gentamycin zur

Abtötung extrazellulär vorliegender Bakterien. Jeweils nach 1, 2, 3, und 4 h wurden

die Zellen mit PBS gewaschen und die Zellen unter Zugabe von sterilem H2O mit 0,2

% TritonX-100 lysiert. Serielle Verdünnungen wurden auf BHI-Platten ausplattiert und

für 24 h bei 37°C kultiviert. Gewachsenen Kolonien wurden gezählt und die Zellzahl

je „well“ berechnet. Die Bestimmung der Keimzahl erfolgte je Zeitpunkt in Triplikaten

und wurde dreimal wiederholt.

Materialien: Listerienstämme: LmoEGDe (Serotyp 1/2a) DSMZ LmoEGDe-mur Wollert et al., 2007 LmoXen32 Caliper LmoXen32-mur diese Arbeit LO28 MOLI, HZI LO28-mur diese Arbeit LmoEGDe-lux Riedel et al., 2007 LmoEGDe-mur-lux Monk et al., 2010

Zellen: Caco-2 ATCC HTB-37


142

CT-26 ATCC CRL-2638 Zellkulturmedium: MEM + Earle´s Gibco 20% FKS PAA 1% nicht-essentielle AS Gibco 2 mM Glutamin Gibco 1 mM Natriumpyrovat Gibco MEM + Earle´s Gibco 1% nicht-essentielle AS Gibco 2 mM Glutamin Gibco 1 mM Natriumpyrovat Gibco Lyse: H2O steril 0,2% Triton X-100 Applichem BHI-Platten: BHI Becton &Dickinson

1,5 % BactoTM Agar Becton &Dickinson 24-well-Platten TPP Geräte: Zentrifuge 5804R Eppendorf Zellkulturinkubator Heareus Inkubator Binder

5.4 In vivo Mausinfektionsexperimente

Alle Tierexperimente sowie die Tierhaltung und –zucht sind in den Einrichtungen des

Helmholtz-Zentrums für Infektionsforschung in Braunschweig unter SPF (specific

pathogen free) Bedingungen gemäß Tierversuchsantrag und der behördlichen

Genehmigung durchgeführt worden. Die Haltung der Tiere erfolgte mit Haltungsfutter

(sniff) auf Espe-Granulat-Einstreu mit Zugabe von Zellstoff als Nestbaumaterial.

Mausstämme: 129P2/Ola Harlan A/JOlaHsd Harlan BALB/cJ Janvier C3HeB/FeJ Charles River

C57BL/6J Janvier C57BL/6N Taconic Ifi27latm1(KOMP)Vlcg (Ifi27l2a-KO) Zucht, INFG BL6white/IFN-β+/Δβ-luc Zucht, MOLI, Dr. Stefan Lienenklaus


143

Listerienstämme: LmoXen32 CaliperLS LmoXen32-mur diese Arbeit

LO28 MOLI, HZI LO28-mur diese Arbeit LmoEGDe-lux Riedel et al., 2007 LmoEGDe-mur-lux Monk et al., 2010

5.4.1 Kultivierung und Präparation von Listeria monocytogenes

Von allen gentechnisch modifizierten oder bereitgestellten Listerienstämmen wurden

zunächst Glycerolstocks angefertigt. Dafür wurde von den Bakterien zunächst eine

Übernachtkultur in BHI-Medium angefertigt. Die Listerien wurden dann 1:10 in

frisches BHI-Medium überimpft und bis zu einer OD600 von 1,0 kultiviert. Hiervon

erfolgte die Präparation der Glycerolstocks. Dafür sind 430 µl Listerienkultur mit 570

µl sterilem Glycerin vermischt und anschließend bei -70°C gelagert worden.

Die Durchführung der Präparation der Listerien für die Infektion erfolgte nach

Vorschrift SOP (Standard Operating Procedure) LM-0007. Für die Infektion wurden

die Listerien aus einem aufgetauten Glycerolstock auf eine BHI-Platte ausgestrichen

und über Nacht bei 37°C kultiviert. Am nächsten Tag erfolgte die Anfertigung einer

Übernachtkultur von einer Kolonie in frischem BHI-Medium. Zur Animpfung der

Hauptkultur wurde die Übernachtkultur 1:10 in frisches BHI-Medium überimpft und

bis zum Erreichen der mittleren logarithmischen Wachstumsphase kultiviert. Die

Listerienkultur wurde für 5 min bei 1600 x g zentrifugiert, in vorgewärmten PBS

resuspendiert und erneut abzentrifugiert. Das Zellsediment wurde in 10 ml

vorgewärmten PBS vorsichtig resuspendiert und die Zellzahl über Auszählen

bestimmt.

Die Bestimmung der Listerienanzahl erfolgte nach dem Standardprotokoll SOP STD-

0002 über direktes Auszählen. Hierfür wurde von den resuspendierten Listerien eine

serielle Verdünnung angefertigt. Von einer Verdünnungsstufe ausgehend erfolgte die

Auszählung der Listerien in 5 x 16 Kleinquadraten einer THOMA Zählkammer (Tiefe

0,02 mm) mit vierhundertfacher Vergrößerung.

Die Berechnung erfolgte unter Nutzung der folgenden Formel:


144

Nachfolgend konnte die gewünschte Konzentration der Listeriensuspension mit PBS

eingestellt werden. Zur Bestimmung der tatsächlich verabreichten Infektionsdosis

wurden 50 µl der seriellen Verdünnungsstufen (1:10) auf BHI-Agarplatten aus-

plattiert, 24 h bei 37°C kultiviert, die gewachsenen Kolonien ausgezählt und die

CFU/ml berechnet.

Listerien: LmoXen32 CaliperLS LmoXen32-mur diese Arbeit LO28 MOLI, HZI LO28-mur diese Arbeit

LmoEGDe-lux Riedel et al., 2007 LmoEGDe-mur-lux Monk et al., 2010 Materialien: PBS Gibco

BHI-Medium: Becton & Dickinson

BHI-Platten: BHI Becton & Dickinson

1,5% BactoTM Agar Becton & Dickinson THOMA-Zählkammer (0,02) Karl Hecht - Assistent Geräte: Zentrifuge 5804R Eppendorf Zellkulturinkubator Heareus Inkubator Binder

5.4.2 Orale Infektion

Die Präparation der Listerien erfolgte wie in Punkt 5.4.1. beschrieben. Die

Durchführung der oralen Infektion erfolgte gemäß der Vorschrift SOP LM-0006. Nach

dem letzten Waschschritt wurden die Bakterien auf die gewünschte Infektionsdosis in

200 µl PBS verdünnt und 300 µl PBS mit 50 mg CaCO3 zugegeben (Lecuit et al.,

2001). Die Gesamtmenge des Inokulums betrug somit 500 µl und wurde den Mäusen

direkt über eine Schlundsonde (21G) in den Magen verabreicht. Als Voraussetzung

für die orale Infektion erfolgte ein Futterentzug in der vorangegangenen Nacht sowie

der Austausch des Trinkwassers mit gepuffertem Wasser (26 g NaHCO3 pro Liter


145

H2O, pH 8.0). Nach der Infektion hatten die Tiere wieder vollständigen Futterzugang.

Im weiteren Infektionsverlauf wurde täglich der Gesundheitszustand der Mäuse

protokolliert und bei einer drastischen Verschlechterung die Tiere gegebenenfalls

euthanisiert. Je nach Aufbau des Experimentes erfolgte zudem das tägliche Bio-

lumineszenz-Imaging (Abschnitt 5.4.4) bzw. die Präparation der Organe zur Bestim-

mung der bakteriellen Keimlast (Abschnitt 5.4.5).

Materialien: PBS Gibco CaCO3 Roth

NaHCO3 Roth

Knopfkanüle 1,0 x 40 mm (21G) Heiland 1 ml Insulinspritzen Therumo

5.4.3 Intravenöse Infektion

Die intravenöse Infektion erfolgte in Kooperation mit Dr. Bastian Pasche, Tierex-

perimentelle Einheit am Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung. Die Präparation

der Listerienzellen erfolgte wie in Punkt 5.4.1. beschrieben. Nach dem letzten

Waschschritt wurden die Bakterien auf die gewünschte Infektionsdosis in 100 µl PBS

verdünnt und in die laterale Schwanzvene verabreicht. Wie schon nach bei der

oralen Infektion beschrieben, erfolgte täglich die Protokollierung des Gesund-

heitszustandes, die Biolumineszenz-Messung und zu den gewünschten Zeitpunkten

die Präparation der Organe.

Materialien: 1 ml Einmalspritzen Braun Rotlichtquelle Philips

5.4.4 Biolumineszenz-Imaging

Das in vivo Biolumineszenz-Imaging (BLI) erlaubt eine nicht invasive Detektion von

emittierten Lichtsignalen. Photonen werden durch das Gewebe transmittiert und

generieren Lichtpunkte auf der Oberfläche des Tieres. Diese werden über eine CCD

Kamera (cooled coupeld device) detektiert und durch die Analyse des Systems wird

mit Hilfe von Falschfarben die Intensität des Lichtes in einem Bild dargestellt


146

(Abbildung 5-2). Die Daten werden als Photonen je Sekunde je Quadratzentimeter

und festem Raumwinkel (Photonen/s/cm2/sr) dargestellt.

Abbildung 5-2: Prinzip des in vivo Imaging. Photonen einer biolumineszenten Lichtquelle werden durch das Gewebe transmittiert und generieren ein diffuses Signal auf der Oberfläche des Tieres, welches über das Imaging System detektiert wird. Über die Analyse des Systems wird ein Bild generiert, welches unter Verwendung von Farben die Intensität des emittierten Lichtes darstellt.

5.4.4.1 In vivo Detektion der bakteriellen Luziferase

Für die Detektion der Biolumineszenz erfolgte eine Immobilisierung der Mäuse über

Narkotisierung mit Isofluran. Die Mäuse (max. 5) wurden in einer Narkosekammer

unter Verwendung eines Isofluranzerstäubers mit 2% des Anästhetikums in reinem

Sauerstoff narkotisiert. In die Narkosekammer strömten 2 l/min Sauerstoff, wobei die

Endkonzentration von Isofluran zur Einleitung der Narkose 6 ml/h betrug. Die narko-

tisierten Mäuse wurden in die Dunkelkammer des IVIS 200 Systems auf eine

Wärmeplatte gelegt, um sie vor einer narkosebedingten Auskühlung zu schützen.

Während der gesamten Biolumineszenzmessung wurde die Narkose unter der

Einleitung von 3 ml/h Isofluran und die Positionierung der Mäuse in Narkoseröhrchen

aufrechterhalten. Die Integrationszeit der Biolumineszenzmessung betrug 4 min

unter mittlerem „Binning“ (mittlere Sensitivität und mittlere Auflösung) und offener

Linse. Nach abgeschlossener Messung wurden die Mäuse wieder in einen Käfig

überführt. Die Auswertung erfolgte unter Verwendung der Living Image 3.2 Software

(CaliperLS).

Biolumineszente Lichtquelle

CCD

Imaging System


147

Material: Isofluran Abbott Animal Health Geräte: Xenogen IVIS 200 System CaliperLS Gas Anesthesia System Caliper LS Software: Living Image 3.2 Software CaliperLS

5.4.4.2 Ex vivo Detektion der bakteriellen Luziferase

Die für die Bestimmung der bakteriellen Keimlast wurden die präparierten Organe ex

vivo auf vorhandene Biolumineszenz untersucht. Die Organe wurden innerhalb von

Petrischalen in die Dunkelkammer des IVIS 200 Systems gelegt. Die Detektion der

Biolumineszenz erfolgte über eine Integrationszeit von 4 min, bei offener Linse und

mittleren „Binning“. Die Auswertung erfolgte mit der Living Image 3.2 Software

(CaliperLS).

Geräte: Xenogen IVIS 200 System CaliperLS Gas Anesthesia System Caliper LS Software: Living Image 3.2 Software CaliperLS

5.4.4.3 Detektion der IFN-β-Produktion

Das in vivo Imaging der IFN-β-Produktion erfolgte über die Luziferaseexpression als

Indikator. Den Mäusen wurde intravenös das Substrat D-Luziferin in PBS 150 mg/kg

Körpergewicht in die laterale Schwanzvene injiziert. Die Tiere wurden anschließend

mittels Isofluran-Narkose anästhesiert. Das in vivo Imaging erfolgte wie unter

Abschnitt 5.4.4.1 beschrieben.

Material: Isofluran Abbott Animal Health D-Luziferin 150 mg/kg in PBS Synchem 1 ml Einmalspritzen Braun Geräte: Xenogen IVIS 200 System CaliperLS Gas Anesthesia System Caliper LS Rotlichtquelle Philips Software: Living Image 3.2 Software CaliperLS


148

5.4.5 Bestimmung der bakteriellen Keimlast

Die Durchführung der Quantifizierung der Listerienanzahl erfolgte nach der SOP

Vorschrift LM-0003. Die Tiere wurden zu den entsprechenden Zeitpunkten mit CO2

(bei zusätzlicher Herzblutentnahme) oder durch zervikale Dislokation getötet und die

inneren Organe Milz, Leber, Dünndarm, mesenterische Lymphknoten und Gehirn

entnommen. Zunächst erfolgte die Detektion der Biolumineszenz ex vivo (siehe

Abschnitt 5.4.4). Der Dünndarm wurde über Ausstreichen entleert und 2 h in DMEM

mit 100 µg/ml Gentamycin zur Abtötung extrazellulär vorliegender Bakterien

inkubiert. Alle Organe wurden gewogen und in 5 ml vorgekühltem PBS (4°C) mit Hilfe

eines Stabhomogenisators zerkleinert. Zwischen der Homogenisierung der einzelnen

Organen erfolgte die Reinigung des Homogenisators in 2 x PBS, 1 x 70% Ethanol

und abschließend 1 x PBS für je 5 Sekunden (sec). Anschließend wurde von den

Homogenisaten eine serielle Verdünnungsreihe (1:10) angefertigt und 50 µl auf BHI-

Agarplatten ausgestrichen und 24 h bei 37°C kultiviert. Die gewachsenen Kolonien

wurden ausgezählt und die bakterielle Keimlast in Colony Forming Units (CFU) je

Milligramm Organ berechnet.

Materialien: PBS Gibco BHI-Platten: BHI Becton & Dickinson

BactoTM Agar Becton & Dickinson DMEM Gibco 100 µg/ml Gentamycin Serva Geräte: Waage Heareus

Stabhomogenisator Polytron Inkubator Binder

5.5 Luminex-Assay

Die Analyse der Chemokin- und Zytokinproduktion im Serum erfolgte mit Hilfe des

Invitrogen Multiplex-Bead-Immunoassay-Kits (Mouse Cytokine 20-Plex Panel).

Spektral kodierte Kügelchen dienen als Träger für die Antikörper gegen ausgewählte

Chemokine und Zytokine. Diese unterschiedlichen spektralen Eigenschaften der


149

Beads erlaubt die Unterscheidung und Quantifizierung der einzelnen chemotak-

tischen Stoffe.

Die Entnahme des Blutes zur Serumgewinnung erfolgte direkt aus dem Herzen der

zuvor mit CO2 getöteten Mäuse. Die entnommene Menge von 0,5 ml Blut wurde in

Serumröhrchen (Microtainer) überführt und mindestens 30 min bei Raumtemperatur

inkubiert. Anschließend erfolgte die Zentrifugation bei 13.000 x g für 2 min und die

Abnahme des Serums und Lagerung bei -70°C bis zur Versuchsdurchführung. Alle

weiteren Schritte sind anhand der Versuchsbeschreibung durchgeführt worden. Die

Messung und Auswertung erfolgte mit Hilfe des Luminex® xMAP® Systems.

Materialien: 1 ml Tuberkulinspritzen Braun Mircotainer Becton & Dickinson

Mouse Cytokine 20-Plex Panel Invitrogen Geräte: Ultraschallbad Elma Elmasonic Vortexer IKA Orbitalschüttler Polymax 1040 Heidolph Vakuumfiltrationseinheit BioRad Luminex® xMAP® Systems Invitrogen

5.6 Histologische und immunhistologische Färbung

Die Anfertigung der histologischen und immunhistologischen Präparate erfolgte über

die Histologieplattform des Helmholtz-Zentrums für Infektionsforschung. Die Prä-

paration der Organe erfolgte zu den gewünschten Zeitpunkten nach Tötung der

Mäuse über zervikale Dislokation bzw. CO2 Inhalation. Die Fixierung der Gewebs-

proben wurde für 24 h in 4% Formaldehyd durchgeführt. Anschließend erfolgte die

Entwässerung und Einbettung in Paraffin. Die Färbung der histologischen Schnitte

(Dicke 2 µm) erfolgte mit Hämatoxylin-Eosin. Für den immunhistologischen Nachweis

von Listeria monocytogenes wurden die Schnitte mit Hilfe des L. monocytogenes

Listeria-O-Antiserums (polyklonal Kaninchen) behandelt. Als Sekundärantikörper

wurde der Ziege-anti-Kaninchen-IgG genutzt. Die Gegenfärbung erfolgte mit Häma-

toxylin.

Materialien: L. monocytogenes Listeria-O-Antiserums Becton & Dickinson Ziege-anti-Kaninchen IgG (Biotin markiert) Thermo-Scientific


150

5.7 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung der Überlebensraten erfolgte über Kaplan-Meier und

Logrank Analyse. Die bakterielle Keimlast, Verlauf der Gewichtskurven und Kon-

zentration der Chemokine wurden als Mittelwert mit Standardfehler (SEM) dargestellt

und mit Hilfe des nicht-parametrischen Mann-Whitney-U-Tests analysiert. Die

Berechnungen erfolgten unter Nutzung des GraphPadPrism5 (GraphPad Software

Inc., San Diego, USA).

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YOSHIKAWA, Y., OGAWA, M., HAIN, T., YOSHIDA, M., FUKUMATSU, M., KIM, M., MIMURO, H., NAKAGAWA, I., YANAGAWA, T., ISHII, T. (2009b). Listeria monocytogenes ActA-mediated escape from autophagic recognition. Nat. Cell Biol. 11, 1233–1240.

YOUNGMAN, P.J., PERKINS, J.B., and LOSICK, R. (1983). Genetic transposition and insertional mutagenesis in Bacillus subtilis with Streptococcus faecalis transposon Tn917. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 2305–2309.

ZENEWICZ, L.A., and SHEN, H. (2007). Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: A short overview. Microbes Infect 9, 1208–1215.

Eidesstattliche Erklärung

174

7 Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation:

„In vivo Analyse der oralen Infektion mit biolumineszenten Listeria

monocytogenes im Mausmodell“,

selbständig verfasst habe.

Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten in

Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche

Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der

vorgelegten Dissertation stehen.

Ich habe die Dissertation an folgenden Institutionen angefertigt:

Abteilung für Infektionsgenetik, Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung,

Braunschweig und Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen

ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht.

Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig

und der Wahrheit entsprechend gemacht habe.

................................................... Ort, Datum ..................................................... Unterschrift

Danksagung

175

8 Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Dr. Andreas Lengeling für die Übernahme der Betreuung

meines Projektes. Seine ständige Unterstützung, sein überaus großes Interesse an

meiner Arbeit sowie sein Engagement und seine Diskussionsanstöße haben

entscheidend zum Fortschritt dieser Arbeit beigetragen.

Prof. Dr. Klaus Schughart danke ich für die Möglichkeit, meine Doktorarbeit in der

Abteilung Infektionsgenetik anfertigen zu können und für die ausgezeichneten

Arbeitsbedingungen, welche keine Wünsche offen gelassen haben. Für sein

Interesse an meiner Arbeit und seine Unterstützung bin ich ihm sehr dankbar.

Weiter möchte ich den Mitgliedern meiner Betreuungsgruppe, PD Dr. Eva Medina

und Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand für Ihre Unterstützung und Anregungen

danken.

Ich danke Dr. Bastian Pasche für die Einführung in die Arbeit mit Listeria

monocytogenes sowie für seine Kooperation bei der intravenösen Infektionen.

Ich danke Dr. Heike Kollmus für den Beistand in der Organisation meines Projektes,

sowie Dr. Mahmoud Bahgat Riad für die fachliche Unterstützung im Bereich der

„Proteinnachweise“. Der ganzen Abteilung Infektionsgenetik gebührt mein Dank für

konstruktive Anregungen und das gute Arbeitsklima.

Im Besonderen möchte ich Sylvana Foth für die Hilfe bei organisatorischen Belangen

danken. Weiter den Doktoranden Leonie Dengler, Nora Mehnert, Sarah Leist und

Matthias Preuße für das gemeinsame Abendteuer PhD-Studium. Mein herzlichster

Dank geht an Christin Fricke, zum einen für ihre Versorgungskompetenz und

Organisation des Laboralltags sowie für die schöne Zeit im „social office“. Danke an

alle für die Zeit, die ich neben dem Laboralltag mit Euch verbringen durfte.

Dr. Stefan Lienenklaus möchte ich für die Einführung in das Biolumineszenz-Imaging

des IVIS 200 Systems danken sowie für die Bereitstellung der IFN-β-

Reportermäusen.

Danksagung

176

Dr. Gahan Cormac danke ich für die Bereitstellung der Listerienstämme LmoEGDe-

lux und LmoEGDe-mur-lux.

Bei Anna Rinkel möchte ich mich für die Anfertigung der histologischen Präparate

und Färbungen bedanken.

Weiter möchte ich den Tierpflegern für die Hege und Pflege unserer kleinsten

vierbeinigen Mitarbeiter danken, welche für diese Arbeit unerlässlich waren.

Meiner Familie danke ich für die große Unterstützung und die Motivationsschübe

während der Anfertigung dieser Arbeit. Ohne Euch wäre es nicht möglich gewesen

Studium und Doktorarbeit so „reibungslos“ hinter sich zu bringen.

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In vivo Analyse der oralen Infektion mit biolumineszenten ... · FAE Follikel-assoziiertes Epithel Fd Kapazität (µFD) FKS Fötales Kälberserum (fetal calf serum) FbpA Eisenbindendes