INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines … · 2019. 1. 10. · Sc. porcinus sowie bedingt auch Sc. hyointestinalis zugeordnet (BENTLEY et al. 1991). Unter der Spezies

Aus dem Institut für Mikrobiologieund Tierseuchen

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Charakterisierung von Streptococcus suis:Beziehungen zwischen Herkunft, Expression potentieller

Virulenzfaktoren und Genotyp

INAUGURAL-DISSERTATIONzur Erlangung des Grades eines

DOCTOR MEDICINAE VETERINARIAEdurch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt vonAchim Allgaieraus Haslach i. K.

Hannover 2000

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. P. Valentin-Weigand

Gutachter: Prof. Dr. P. Valentin-Weigand

Gutachter: Prof. Dr. H. Y. Naim

Tag der mündlichen Prüfung: 30. Mai 2000

Folgende Teile der Arbeit wurden bereits veröffentlicht:

Allgaier A., Goethe R., Wisselink H., Smith H., Schwarz S. and Valentin-Weigand, P.:

Comparison of Macrorestriction Patterns of Streptococcus Suis isolates with clinicalbackground and expression of potential virulance traits.

XIV Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases

Aukland, Neuseeland, 11.-15. Okt. 1999

meinen Eltern

Inhalt

1 Einleitung ............................................................................................................ 4

2 Schrifttum............................................................................................................ 6

2.1 Einleitende Beschreibung der Gattung Streptococcus .............................................. 6

2.2 Streptococcus ........................................................................................................... 6

2.3 Streptococcus suis.................................................................................................... 9

2.3.1 Morphologie und kulturelles Verhalten.............................................................. 102.3.2 Differenzierung ................................................................................................. 11

2.3.2.1 Biochemisches Verhalten und Differenzierung .............................................. 112.3.2.2 Antigenstruktur und serologische Differenzierung ......................................... 152.3.2.3 Genotypische Differenzierung ....................................................................... 17

2.3.2.3.1 Ribotypisierung......................................................................................... 172.3.2.3.2 Makrorestriktionsanalyse mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese ................... 19

2.3.3 Pathogene Bedeutung von Sc. suis.................................................................. 212.3.3.1 Epidemiologie................................................................................................ 212.3.3.2 Pathogenese................................................................................................. 22

2.3.3.2.1 Eintritt und Adhärenz................................................................................ 222.3.3.2.2 Phagozytose und intraphagosomales Überleben...................................... 232.3.3.2.3 Invasion und Ausbreitung ......................................................................... 23

2.3.4 Potentielle Virulenzfaktoren.............................................................................. 242.3.4.1 Adhäsine und Hämagglutinine....................................................................... 242.3.4.2 Kapsel ........................................................................................................... 252.3.4.3 Muramidase-Released-Protein...................................................................... 262.3.4.4 Extrazellulär-Faktor ....................................................................................... 272.3.4.5 Hämolysine ................................................................................................... 29

2.3.5 Therapie und Prophylaxe.................................................................................. 322.4 Problemstellung und Ziel der vorliegenden Arbeit ................................................... 35

3 Material und Methoden..................................................................................... 36

3.1 Bakterien ................................................................................................................ 36

3.2 Zellkulturen ............................................................................................................. 37

3.3 Medien, Pufferlösungen und Lösungen................................................................... 38

3.3.1 Medien für die Zellkultur ................................................................................... 383.3.2 Stammlösungen ............................................................................................... 383.3.3 Standardpuffer.................................................................................................. 39

Inhalt

3.3.4 Puffer und Lösungen für die Pulsfeld-Gelelektrophorese.................................. 393.3.5 Southern-Blotting.............................................................................................. 413.3.6 Sondenhybridisierung....................................................................................... 41

3.4 Kultivierung der Bakterien ....................................................................................... 43

3.5 Serotypisierung....................................................................................................... 43

3.6 Untersuchung auf die Expression von MRP/EF ...................................................... 43

3.7 Hämolysin-Nachweis .............................................................................................. 44

3.8 Adhärenz-Untersuchungen ..................................................................................... 46

3.8.1 Zellkultur........................................................................................................... 463.8.2 Vorbereitung der Zellen für den Adhärenzversuch............................................ 463.8.3 Vorbereitung der Bakterien für den Adhärenzversuch ...................................... 473.8.4 Adhärenzversuch ............................................................................................. 47

3.9 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE).......................................................................... 48

3.9.1 Präparation intakter Gesamt-DNA von Sc. suis ................................................ 483.9.2 Auftrennung der verdauten Gesamt–DNA von Sc. suis mittels PFGE .............. 503.9.3 Erstellung eines Größenmarkers für die PFGE................................................. 51

3.10 Herstellung der Hämolysin-Sonde........................................................................... 51

3.10.1 DNA-Extraktion................................................................................................. 513.10.2 Amplifikation der Sonde mittels PCR ................................................................ 53

3.10.2.1Auftrennung des PCR-Produktes mittels Gelelektrophorese ......................... 533.10.2.2Isolierung des PCR-Produktes aus dem Agarose-Gel ................................... 54

3.11 Southern-Hybridisierung ......................................................................................... 55

3.11.1 Southern-Blotting.............................................................................................. 553.11.2 Radioaktive Markierung der Sonde mit 32Phosphor .......................................... 553.11.3 Hybridisierung und Signaldetektion .................................................................. 56

3.12 Statistische Auswertung.......................................................................................... 57

3.12.1 Logistische Regression .................................................................................... 573.12.2 Odds Ratio ....................................................................................................... 573.12.3 Fragmentmuster und Dendrogramm-Erstellung................................................ 58

3.12.3.1Ähnlichkeitskalkulation zwischen möglichen Paaren der Isolate.................... 593.12.3.2Cluster-Analyse der Matrix ähnlicher Werte. ................................................. 59

4 Ergebnisse ........................................................................................................ 60

4.1 Phänotypische Charakterisierung ........................................................................... 60

4.1.1 Serotypisierung ................................................................................................ 60

Inhalt

4.1.2 Expression von MRP/EF................................................................................... 634.1.3 Expression von Hämolysin ............................................................................... 684.1.4 Adhärenz an Epithelzellen ................................................................................ 70

4.2 Genotypisierung...................................................................................................... 72

4.2.1 Makrorestriktions-Analyse ................................................................................ 724.2.2 Clusteranalyse.................................................................................................. 794.2.3 Genotypischer Nachweis des Hämolysins ........................................................ 82

4.3 Beziehungen zwischen Genotyp und Phänotyp ...................................................... 88

4.3.1 Beziehungen zwischen Genotyp und Herkunft der Isolate................................ 884.3.2 Beziehungen zwischen dem Genotyp und Serotyp........................................... 884.3.3 Beziehungen zwischen Genotyp und MRP/EF-Expression............................... 934.3.4 Beziehungen zwischen Genotyp und Hämolysin-Expression............................ 944.3.5 Beziehungen zwischen Genotyp und der Adhärenz an Epithelzellen................ 98

4.4 Clusterzuordnung der MRP+/EF+/Hämolysin+/Meningitis-Isolate ........................... 99

4.5 Statistische Auswertung........................................................................................ 100

4.5.1 Beziehung zwischen Serotyp und Herkunft der Isolate ................................... 1004.5.2 Beziehung zwischen Expression potentieller Virulenzfaktoren und Herkunft .. 1004.5.3 Beziehung zwischen Genotyp und Herkunft der Isolate.................................. 101

5 Diskussion....................................................................................................... 104

6 Zusammenfassung ......................................................................................... 111

7 Summary ......................................................................................................... 113

8 Literaturverzeichnis........................................................................................ 115

9 Anhang ............................................................................................................ 135

9.1 Chemikalien.......................................................................................................... 135

9.2 Verwendete Gerätschaften ................................................................................... 137

9.3 Verzeichnis der Isolate und deren Charakteritiken ................................................ 138

9.4 Tabellenverzeichnis .............................................................................................. 141

9.5 Abbildungsverzeichnis .......................................................................................... 142

Einleitung

4

1 EinleitungStreptococcus (Sc.) suis stellt in der intensiven Schweineproduktion eine der

Hauptursachen für wirtschaftliche Einbussen dar. Sc. suis wurde bis vor ca. 10

Jahren vor allem bei Infektionen mit zentralnervösem bzw. septikämischem Verlauf

isoliert; in jüngster Zeit wurde der Erreger jedoch immer häufiger auch in

Zusammenhang mit Pneumonien nachgewiesen. Beim Menschen kann Sc. suis

Meningitiden hervorrufen und gilt daher als Zoonose-Erreger.

Sc. suis wird gehäuft bei klinisch unauffälligen Tieren im Genitaltrakt und in den

Tonsillen gefunden, was auf eine stark variierende Erregervirulenz hinweist. Es stellt

sich somit die Frage nach Virulenzmerkmalen des Erregers. Bisher wurden mehrere

potentielle Virulenzfaktoren und virulenzbegleitende Faktoren identifiziert. Jedoch

konnten auch hochvirulente Stämme isoliert werden, bei denen die bislang

bekannten potentiellen Virulenzfaktoren nicht oder nur teilweise nachgewiesen

wurden. Zusammenfassend ist ein wesentliches Problem bei der Bekämpfung von

Sc. suis-Infektionen die hohe geno- und phänotypische Diversität des Erregers.

In der vorliegenden Arbeit wurde daher versucht, Isolate mit unterschiedlichem

klinischem Hintergrund eingehend phänotypisch und genotypisch zu

charakterisieren. Die Phänotypisierung umfasste alle bekannten potentiellen

Virulenzmarker. Die Genotypisierung erfolgte mit der Pulsfeld-Gelelektrophorese,

einer sehr hochauflösenden genotypischen Differenzierungsmethode. Ziel der

Untersuchungen war es, Hinweise auf Zusammenhänge zwischen klinischem

Hintergrund, dem Auftreten potentieller Virulenzfaktoren und dem genetischen

Hintergrund zu erhalten. Mit dieser Arbeit sollte erstmals auch ein detaillierteres Bild

der Sc. suis-Population im norddeutschen Raum erstellt werden.

Einleitung

5

Abkürzungsverzeichnis

A. bidest. Aqua bidestillata (zweifach destilliertes Wasser)ATCC American Type Culture Collectionbp Basenpaarebzw. beziehungsweisecDNA komplementäre DNA (engl.: complementary DNA,

copy DNA)dATP DesoxyadenosintriphosphatdCTP DesoxycytidintriphosphatdGTP DesoxyguanosintriphosphatDMSO DimethylsulfoxidDNA DesoxyribonukleinsäureDNase DesoxyribonukleasedNTP DesoxyribonukleosidtriphosphatdTTP DesoxythymidintriphosphatE. coli Escherichia coliERG Eppendorf-Reagenzgefäss (1,5 ml Reagenzgefäss)ELISA engl. enzyme-linked immunosorbent assay

(Enzym-gekoppelter Immunabsorptionstest)EDTA Ethylendiamin-tetraessigsäureEF Extrazellulär-Faktoret al. et aliGG GrossgruppenLsg. LösungMRP Muramidase-Released-ProteinOD Optische DichtePCR Polymerase-KettenreaktionRNA RibonukleinsäureRNase RibonukleaseSc. suis Streptococcus suisSDS Natriumdodecylsulfatsog. sogenanntST SerotypST-Zellen Schweinehoden-Zellen (engl. Swine-testis-Zellen)Stammlsg. StammlösungUV Ultraviolettv/v Volumen pro Volumenw/v Gewicht pro Volumenz. B. zum Beispiel

Schrifttum

6

2 Schrifttum

2.1 Einleitende Beschreibung der Gattung StreptococcusUnter die Gruppe der fakultativ anaeroben grampositiven Kokken wird neben den

Enterokokken und Laktokokken auch die Gattung Streptococcus gefasst

(SCHLEIFER 1986), innerhalb derer aufgrund unterschiedlicher Subtypen, Biotypen

und Serovare über 40 verschiedene Arten unterschieden werden (SCHLEIFER u.

KILPPER-BÄLZ 1987; BENTLEY et al. 1991). Da sich die Streptokokken nur in einer

Ebene teilen, sind sie in Paaren oder Ketten angeordnet. Ihr Durchmesser beträgt

etwa 0,6 – 1,2 µm. In ihrer Mehrzahl sind sie unbeweglich. Ihr Wachstumsoptimum

sowohl in flüssigen als auch auf festen Nährmedien liegt bei 37°C. Aufgrund der

unterschiedlichen Hämolysine, die von den verschiedenen Streptokokkenarten

produziert werden, wachsen sie auf bluthaltigen Nährböden mit einer vollständigen

Lysis der Erythrozyten (β-Hämolyse), einer unvollständigen Lysis (α-Hämolyse) oder

anhämolysierend (γ-Hämolyse). Im allgemeinen haben Streptokokken eine komplexe

Anforderung an Nährstoffen. Dabei fermentieren sie aus den unterschiedlichen

Kohlenhydraten als Endprodukt vorwiegend L(+)-Milchsäure.

Die Zellwand der Streptokokken enthält Polysaccharid- und Proteinantigene. Der C-

Polysaccharidanteil (C-Substanz), bestehend aus Rhamnose, Glukose und

Galaktose, dient dabei als Antigen für die serologische Gruppendifferenzierung nach

LANCEFIELD (1933). Bisher wurden 18 verschiedene Serotypen der Streptokokken

identifiziert, welche mit den Buchstaben A-V bezeichnet werden. Es wurden jedoch

auch Arten beschrieben, welche sich aufgrund dieser Gruppendifferenzierung nicht

einer Gruppe zuordnen lassen (SCHLEIFER u. KILPPER-BÄLZ 1987; BISPING u.

AMTSBERG 1988; LÄMMLER u. HAHN 1994).

2.2 StreptococcusIn der Gattung Streptococcus werden zahlreiche Arten zusammengefasst, welche

aufgrund biochemischer und molekularbiologischer Untersuchungen in den

vergangenen Jahren taxonomische Änderungen erfahren haben (SCHLEIFER u.

KILPPER-BÄLZ 1987; BENTLEY et al. 1991; LÄMMLER 1992). Mittels

molekularbiologischer, chemotaxonomischer und numerisch-taxonomischer

Methoden konnten phylogenetische Zusammenhänge der verschiedenen Arten

geklärt werden ( SCHLEIFER u. KILPPER-BÄLZ 1987).

Schrifttum

7

In der Gattung Streptococcus finden sich humanpathogene, tierpathogene sowie

saprophytische Spezies, die den Pyogen-Streptokokken, den Oral-Streptokokken

sowie einigen anderen Arten ohne besondere Gruppenzugehörigkeit zugeordnet

werden (HARDIE 1986; MUNDT 1986; ROTTA 1986).

Der Gruppe der Pyogen-Streptokokken werden die Arten Sc. pyogenes, Sc.

dysgalactiae, Sc. canis, Sc. equi, Sc.iniae, Sc. agalactiae, Sc. uberis, Sc. parauberis,

Sc. porcinus sowie bedingt auch Sc. hyointestinalis zugeordnet (BENTLEY et al.

1991).

Unter der Spezies Sc. dysgalactiae Subspecies dysgalactiae und Subspecies

equisimilis, werden die Serovar L und G sowie Streptokokken der Serogruppe C und

G des Menschen zusammengefasst, da taxonomische Studien zeigten, dass sich

diese Stämme sowohl biochemisch als auch genetisch sehr ähnlich verhalten

(FELTHAM 1979; FARROW u. COLLINS 1984; KILPPER-BÄLZ u. SCHLEIFER

1984).

Sc. canis schliesst die Streptokokken der Serogruppe G von Hund und Rind ein.

Dabei unterscheiden sich diese Spezies von den anderen Stämmen, welche mit dem

Antiserum der Gruppe G reagieren, dahingehend, dass sie eine β-Galaktosidase-

Aktivität aufweisen, jedoch keine Hyaluronidase-Aktivität (KILPPER-BÄLZ u.

SCHLEIFER 1984).

Als genetisch eng verwandt wurden Sc. equi und Sc. zooepidemicus erkannt

(FARROW u. COLLINS 1984; KILPPER-BÄLZ u. SCHLEIFER 1984), obwohl sie sich

phänotypisch voneinander differenzieren lassen (FELTHAM 1979). Daher wurden sie

zur Spezies Sc. equi mit den beiden Subspezies equi und zooepidemicus vereint

(FARROW u. COLLINS 1984).

Aufgrund der Ergebnisse von rRNA-Sequenzanalysen wurde Sc. agalactiae wegen

des hohen Grades an Homologie zu Sc. dysgalactiae zugerechnet (BENTLEY et al.

1991). Die enge Verwandtschaft zu Sc. dysgalactiae konnte jedoch von anderer

Seite nicht nachgewiesen werden (SCHLEIFER u KILPPER-BÄLZ 1987).

Sc. uberis weist mit seinen beiden biochemisch divergierenden Typen I und II keine

besondere Verwandtschaft zu anderen Streptokokken auf (GARVIE u. BRAMLEY

1979; KILPPER-BÄLZ et al. 1982; COLLINS et al. 1984a; SCHLEIFER u KILPPER-

BÄLZ 1987). Im Gegensatz dazu zeigten rRNA-Sequenzanalysen, dass Sc. uberis

und Sc. parauberis den Pyogen-Streptokokken zuzuordnen ist und dass eine

Schrifttum

8

genetische Beziehung zwischen Sc. parauberis und Sc. iniae besteht (BENTLEY et

al. 1991).

Oralstreptokokken können mittels der serologischen Methode nach Lancefield (1933)

nicht eingeordnet werden. Dabei bilden sie vier Untergruppen, die Oralis-, die

Anginosus-, die Salivarius- und die Mutans-Gruppe (SCHLEIFER u KILPPER-BÄLZ

1987). Die Oralis-Gruppe umfasst sieben Spezies, deren wichtigster Vertreter Sc.

pneumoniae darstellt. Dabei wurde eine enge genetische Verwandtschaft zu Sc.

oralis nachgewiesen (SCHLEIFER u KILPPER-BÄLZ 1987). Weitere Mitglieder

dieser Gruppierung sind Sc. oralis, Sc. sanguis, Sc. parasanguis, Sc. mitis, Sc. crista

und Sc. gordonii.

Die Spezies Sc. anginosus, Sc. constellatus und Sc. intermedius werden in der

Anginosus-Gruppe zusammengefasst. Sie werden von BENTLEY et al. (1991) als

drei separate Spezies dargestellt, während sie aufgrund von DNA-DNA-

Hybridisierungen von COYKENDAL et al.(1987) als eine Spezies (Sc. anginosus)

angesehen werden. In die Untergruppe der Salivarius-Gruppe werden aufgrund

enger verwandtschaftlicher Beziehungen (BENTLEY et al. 1991) die Spezies Sc.

salivarius, Sc. vestibularis und Sc. thermophilus zusammengefasst.

Die Mutans-Gruppe wird von Sc. mutans, Sc. downei, Sc. cricetus, Sc. macacae, Sc.

rattus und Sc. sorbrinus gebildet (BENTLEY et al. 1991). Diese Gruppe zeichnet sich

vor allem dadurch aus, dass sie ein Wachstum bei einer Temperatur von 45°C zeigt.

Sc. ferus wird ebenfalls dieser Gruppe zugerechnet (SCHLEIFER u KILPPER-BÄLZ

1987).

Zusätzlich wurden acht fakultativ anaerobe und drei obligat anaerobe Streptokokken-

Spezies beschrieben, die weder den Pyogen-Streptokokken noch den Oral-

Streptokokken zugerechnet werden (LÄMMLER, 1992). Zur ersten Gruppe werden

unter anderem die Spezies Sc. bovis, Sc. equinus und Sc. alactolyticus gezählt

(BENTLEY et al. 1991). Die enge geno- und phänotypische Übereinstimmung der

Spezies Sc. bovis und Sc. equinus führte dazu, dass vorgeschlagen wurde, die

beiden Spezies zu einer Spezies zusammenzuführen (FARROW et al. 1984). Jedoch

zeigten wiederum biochemische und DNA–Hybridisierungsuntersuchungen, dass

sich diese beiden Stämme voneinander unterscheiden (SCHLEIFER u KILPPER-

BÄLZ 1987). Eine genetische Beziehung zwischen Sc. alactolyticus und den Spezies

Sc. bovis und Sc. equinus wurde zwar nachgewiesen (BENTLEY et al. 1991), Sc.

alactolyticus wird aber dennoch als eigenständige Spezies angesehen.

Schrifttum

9

Für Sc. suis (Streptokokken der Serogruppen R, S, RS, und T) konnten

verwandtschaftliche Beziehungen zu anderen Spezies nicht nachgewiesen werden,

obwohl die Zellwandstrukturen Gemeinsamkeiten mit Sc. oralis aufweisen

(SCHLEIFER u KILPPER-BÄLZ 1987). Genetische Studien mittels DNA-

Hybridisierungen wiesen auf ein geringgradiges Verwandtschaftsverhältnis mit Sc.

bovis hin (HAREL et al. 1994).

Von den Pyogen- und Oral-Streptokokken unterscheidet sich Sc. intestinalis aufgrund

seines kulturellen und biochemischen Verhaltens (ROBINSON et al. 1988). Die

Spezies Sc. adjacens und Sc. defecticus sowie die anaeroben Spezies Sc. parvulus,

Sc. hansenii und Sc. pleomorphus lassen sich ebenfalls keiner bestimmten Gruppe

zuordnen (LÄMMLER 1992).

2.3 Streptococcus suis Sc. suis gilt als einer der bedeutendsten Krankheitserreger beim Schwein

(KILPPER-BÄLZ u. SCHLEIFER 1987; GOTTSCHALK et al. 1989, 1991). Der

Erreger wurde erstmals in England bei zwei bis sechs Wochen alten Ferkeln, welche

an Meningitis und Arthritis erkrankt waren, nachgewiesen. Dabei wurden

Streptokokken isoliert, welche sich keiner bis dato bekannten Serogruppe zuordnen

liessen (FIELD et al. 1954). Jedoch waren schon vorher Berichte aus den

Niederlanden über Meningo-Encephalitiden bei ein bis sechs Wochen alten

Saugferkeln bekannt, bei denen ebenfalls Streptokokken nachgewiesen wurden

(JANSEN u. VAN DORSSEN 1951).

Die Erreger, welche derartige Erkrankungen bei Saugferkeln verursachten, wurden

als Streptokokken der Serogruppe S bezeichnet; andere, welche diese Erkrankungen

bei Mastschweinen hervorriefen, als Streptokokken der Serogruppe R. Desweiteren

wurden Erreger aus solchen Krankheitsbildern in die Serogruppen R/S und T

zusammengefasst (DE MOOR 1963).

Die Isolierung von Streptokokken, welche offensichtlich mit denen von FIELD (1954)

identisch waren, gelang einige Jahre später (ELLIOTT 1966). Dabei wurde bei diesen

Erregern das Antigen der Serogruppe D nachgewiesen, und die Erreger wurden

aufgrund ihrer Kapselstrukturen als Sc. suis Serotyp 1 bezeichnet und der

Serogruppe D zugeordnet (ELLIOTT 1966). 1975 wurden gleichartige Erkrankungen,

wie sie bei Saugferkeln bekannt waren (ELLIOTT 1966), zum ersten Mal auch bei

Mastschweinen beobachtet. Die aus diesen Krankheitsgeschehen isolierten Erreger

Schrifttum

10

unterschieden sich jedoch in ihrer Kapselsubstanz von denen des Sc. suis Serotyps

1, so dass sie als Sc. suis Serotyp 2 der Serogruppe D eingeordnet wurden.

Aufgrund serologischer Kreuzreaktionen zwischen dem Serotyp 1 und der

Serogruppe S bzw. zwischen dem Serotyp 2 und der Serogruppe R wurden diese als

identisch angesehen (WINDSOR 1977). Offiziell wurde die Spezies Sc. suis 1987

beschrieben (KILPPER-BÄLZ u. SCHLEIFER 1987). Bis heute sind über 35

verschiedene Serotypen bekannt (PERCH et al.1983; GOTTSCHALK et al. 1989,

1991b; OKWUMABUA et al. 1995). Es lassen sich jedoch immer wieder Stämme

isolieren, welche sich keiner dieser Serogruppen zuordnen lassen.

2.3.1 Morphologie und kulturelles VerhaltenBei Sc. suis handelt es sich um ovoide, unbewegliche, grampositive Kokken, die mit

einem Durchmesser von ca. 1,0 µm einzeln, in Paaren oder selten in Kurzketten

auftreten (KILPPER-BÄLZ u. SCHLEIFER 1987). Abweichend davon können auch

ovoide oder pleomorphe Kokken in Diploform und in Kurzketten auftreten (CLIFTON-

HADLEY u. ALEXANDER 1988). Auch coryneforme bis lanzettförmige Diplokokken

wurden beschrieben (KAUFHOLD et al. 1988).

Sc. suis zeigt ein fakultativ anaerobes Wachstum (KILPPER-BALZ u. SCHLEIFER

1987). Aus dem Genitaltrakt von Sauen konnten allerdings auch Sc. suis -Stämme

isoliert werden, die kein Wachstum bei atmosphärischer CO2-Spannung zeigten

(DEVRIESE et al.1991; ESTOEPANGESTIE u. LÄMMLER 1993).

Auf Schafblut- und Rinderblut-Agar wächst Sc. suis unter Ausbildung einer α-

Hämolyse. Eine β-Hämolyse kann von einigen Sc. suis -Stämmen auf Pferdeblut-

Agar produziert werden (PERCH et al. 1983; KILPPER-BALZ u. SCHLEIFER 1987).

Der Koloniedurchmesser beträgt nach 24 Stunden Bebrütung auf Blutagar ca. 1-2

mm (SANDFORD u. HIGGINS 1992), die Kolonien sind grau und teilweise schleimig

(KAUFHOLD et al. 1988). In Bouillonkulturen wachsen Sc. suis -Stämme in der

Regel unter homogener Trübung. Jedoch zeigen CO2-abhängige ebenso wie β-

Glucuronidase-negative Stämme eine Bodensatz - Bildung mit klarem Überstand

(DEVRIESE et al. 1993) In Tabelle 1 sind die morphologischen und kulturellen

Charakteristika von Sc. suis zusammengefasst.

Schrifttum

11

Tabelle 1: Morphologie und kulturelles Verhalten von Sc. suis

UntersuchtesKriterium

Erscheinungsform UntersuchtesKriterium

Erscheinungsform

Grösse Bis ca. 1,2 µm Wachstum auf

Blutplatten

α - Hämolyse

Form

Ovoid bis pleomorph

Wachstum auf

Blutplatten bei CO2-

abhängigen

Stämmen

β - Hämolyse

Kolonieform Rund, glattrandig,

grau, teilweise

schleimig

Koloniedurchmesser 1 – 2 mm

Gramfärbung Grampositiv Wachstum in

Bouillon

Homogene

Trübung

Anordnung

zueinander

Diploform,

Kurzketten

Wachstum in

Bouillon bei CO2

Abhängigen

Stämmen

Bodensatzbildung

mit klarem

Überstand

2.3.2 Differenzierung

2.3.2.1 Biochemisches Verhalten und DifferenzierungDas biochemische Verhalten wurde bei der Speziesbeschreibung von KILPPER-

BÄLZ und SCHLEIFFER (1987), wie in Tabelle 2 beschrieben, dargestellt. Die

Reaktionen waren jedoch nicht bei allen Untersuchungen konstant, so dass die

biochemische Differenzierung von Sc. suis anhand unterschiedlicher

Reaktionsmuster festgelegt wurde (siehe Tabelle 3). So konnte bei einigen Stämmen

der Serotypen 3 und 4 die Hydrolyse von Hippurat festgestellt werden (PERCH et al.

1983). Ebenso konnte diese Eigenschaft bei CO2-abhängigen Stämmen aus dem

Genitaltrakt von Sauen (DEVRIESE et al. 1991) gefunden werden. Zudem konnten

Abweichungen hinsichtlich der alkalischen Phosphatase und der β-Glucuronidase

ebenso wie bei der Fermentierung von Mannit und Sorbit festgestellt werden

Schrifttum

12

(DEVRIESE et al. 1991; TARRADAS et al. 1994a). Hinsichtlich der Voges-

Proskauer-Reaktion wurden Sc. suis -Stämme isoliert, die abweichend eine positive

Reaktion zeigten (TARRADAS et al. 1994a).

Aufgrund der Unterschiede hinsichtlich des biochemischen Verhaltens einzelner Sc.

suis -Serotypen wurde gefolgert, dass zwar Unterschiede zwischen den einzelnen

Serotypen vorhanden sind, diese jedoch nicht ausreichen, die einzelnen Serotypen

biochemisch voneinander zu unterscheiden (TARRADAS et al. 1994a).

Tabelle 2: Biochemisches Verhalten von Sc. suis nach KILPPER-BÄLZ u.

SCHLEIFFER (1987)

Kriterium BiochemischesVerhalten

Kriterium BiochemischesVerhalten

D-Glukose + Arginin +

Saccharose + Äskulin +

Laktose + Salizin +

Maltose + Stärke +

Salizin + Glykogen +

Trehalose + Hippurat -

Inulin + VP-Reaktion -

L-Arabinose - Alk-Phosphatase -

D-Mannit - α-Galaktosidase +

D-Sorbit - β-Glukuronidase +

Glyzerin - Leucin-Arylamidase +

Melzitose - β-Galaktosidase d

D-Ribose - Optochin Resistent

Raffinose d 10°C bzw. 45°C -

Melibiose d 6,5% NaCl -

Hyaluronidase d 40% Galle -+ = positiv - = negativ d = variabel

10°C bis 45°C = Wachstum bei 10°C bzw. 45°C

6,5% NaCl, 40% Galle : Wachstum in Anwesenheit von 6,5% NaCl bzw. 40% Galle

VP = Voges-Proskauer Reaktion

Schrifttum

13

Tabelle 3: Unterschiedliche charakteristische biochemische Reaktionen zur Identifizierung von Sc. suis (WAACK 1996)

ERICKSON et al.(1984)

HOMMEZ et al.(1986) TOUIL et al. (1988) GOTTSCHALK etal.(1991) **

ESTEPONGESTIE u.LÄMMLER (1993)

Reaktionen n= 121 Reaktionen n= 188 Reaktionen n= 199 Reaktionen n = 46 Reaktionen n= 1226,5 % NaCl 0* 6,5 % NaCl 0 6,5 % NaCl 4 6,5 % NaCl 0 6,5 % NaCl 0

CAMP - Test 20 CAMP-Test d VP –Reaktion

2 VP -Reaktion

0 VP - Reaktion 0

Trehalose 93 Galle /Äskulin

d Trehalose 97 Trehalose 96 Trehalose 96

Laktose 98 Mc Conckey d Laktose 94 Laktose 100 Salizin 89Sorbit 0 Hippurat 0 Sorbit 1 Sorbit 0 Stärke 94Inulin 90 Lackmus-

Milch100 Salizin 93 Salizin 96

Raffinose 78 Methylen-blau

0 Inulin 91 Inulin 89

Äskulin 53 Äskulin d Glyzerin 1 Glyzerin 2Arginin 69 Arginin 20

Saccharose 98Stärke 100Mannit 0

N = Anzahl der absolut getesteten Stämmed = variabel* = Anzahl positiver Stämme in Prozent** = Angaben gelten für Sc. suis-Serotypen 23 - 28

Tabelle 3:

Sc. suis-Serotypen 23 - 28

n

Schrifttum

14

Das biochemische Verhalten variiert auch in Abhängigkeit von der Herkunft der

Isolate bzw. der Lokalisationen im Schwein. Aufgrund des unterschiedlichen

Verhaltens wurden verschiedene Biotypen festgelegt (DEVRIESE et al. 1991, Tabelle

4)

Tabelle 4: Sc. suis – Biotypen nach DEVRIESE et al. (1991)

Biotyp

Kriterium Mannit/Sorbitpositiv

Mannit/SorbitNegativ

ββββ-

Glukuronidasenegativ

CO2-abhängigeStämme

Homogenes

Wachstum in

Bouillon

+ + D +

Hämolysetyp

auf Schafblut

α α α β

Hippurat-

spaltung

- - - +

β-Glukuronidase

Aktivität

- + - +

Alkalische

Phosphatase

- - - +

Sorbit-

Verwertung

+ - - -

Mannit-

Verwertung

+ - - -

+ = positiv- = negativd = variabel

Neben der konventionellen biochemischen Differenzierung („Bunte Reihe“ in

Röhrchen) werden kommerzielle biochemische Testsysteme ( z. B. API 20 STREP,

Fa. Bio MERIEUX) verwendet, um Sc. suis von anderen Streptokokken

abzugrenzen. Das API 20 STREP–System ist aber zur Identifizierung von Sc. suis -

Schrifttum

15

Stämmen, insbesondere der Serotypen 9-28 nicht geeignet, da nur 54 % der Sc. suis

-Stämme als solche erkannt werden. So konnten aufgrund der fehlenden β-

Glucuronidase-Reaktion diese Isolate nicht als Sc. suis Isolate identifiziert werden,

sondern wurden als Sc. pneumoniae identifiziert (GOTTSCHALK et al.1991a,

WAACK 1996).

Bei der konventionellen Überprüfung wurde in früheren Untersuchungen fast das

gesamte biochemische Spektrum der R- und S-Streptokokken überprüft (KUNTER u.

WITTIG 1976). Spätere Untersuchungen reduzierten die biochemische Unter-

suchung auf die für Sc. suis charakteristischen Reaktionen. So wurde von allen

Untersuchenden das fehlende Wachstum bei 6,5% NaCl als Charakteristikum

angesehen. Auch die Verwertung von Trehalose wurde von den meisten

Untersuchern als eine charakteristische Fähigkeit von Sc. suis angesehen (weitere

Schlüsselreaktionen siehe Tabelle 3).

2.3.2.2 Antigenstruktur und serologische DifferenzierungDie ursprünglich beschriebenen Sc. suis -Stämme wurden in die Serogruppen R, S,

R/S, und T bzw. keiner Serogruppe zugeordnet (DE MOOR 1963; KILPPER-BÄLZ u.

SCHLEIFFER 1987). Dabei wurde bei den meisten Stämmen der Serogruppen R, S,

R/S ein unterschiedliches Peptidoglykan als Zellwand-charakteristikum

nachgewiesen. In Abhängigkeit von der Serogruppe zeichnet sich dieses

Peptidoglykan durch eine unterschiedliche Anordnung der Polysaccharid-

bestandteile Rhamnose, Glukose, Galaktose und Glukosamin aus.

Mittels spezifischer Antiseren konnte nachgewiesen werden, dass Sc. suis Serotyp 1

bzw. 2-Stämme den S- und R-Streptokoken entsprachen, jedoch der Untergruppe

der Serogruppe D zuzuordnen waren (ELLIOTT 1966; WINDSOR u. ELLIOTT 1975).

Als Gruppenantigen der Serogruppe D wurde ein Glukose-substituiertes Polymer aus

α-Glycerinphosphat, eine Teichonsäure, bezeichnet, wobei die Teichonsäure

vermutlich mit der Zellwand assoziiert ist. Je nach Extraktionsmethode konnte dabei

die Teichonsäure entweder als membrangebundene Lipoteichonsäure oder als

lipidfreie Form gewonnen werden, beide Formen reagierten mit spezifischen Anti-

Serotyp 2 Antikörpern (ELLIOTT et al. 1977). Jedoch konnte durch DNA-DNA-

Hybridisierungen keine signifikante genetische Übereinstimmung zwischen Sc. suis

und anderen Streptokokken der Serogruppe D nachgewiesen werden. So lag die

genetische Übereinstimmung (DNA-Sequenz-Homologie) zum Beispiel zwischen E.

Schrifttum

16

faecalis (Streptokokken der Serogruppe D) und Sc. suis unter 10% (KILPPER-BÄLZ

u. SCHLEIFFER 1987).

Die Kapselpolysaccharide der Serotypen 1 und 2 bestehen aus fünf verschiedenen

Zuckern. Das Kapselpolysaccharid von Serotyp 1 wird aus Galaktose, Glukose, N-

Acetyl-Glukosamin, N-Acetyl-Galaktosamin und Sialinsäure in einem molaren

Verhältnis von 2,42 : 1,0 : 1,0 : 1,13 : 1,39 gebildet. Es hat ein Molekulargewicht von

74 Da. Das Kapselpolysaccharid vom Serotyp 2 unterscheidet sich davon nur in

einem Zucker. So tritt an die Stelle des N-Acetyl-Galaktosamins Rhamnose. Dabei

verändert sich sowohl das molare Verhältnis (1,07 : 3,17 : 1,0 : 0,94 : 1,0) als auch

das Gewicht (185 Da), woraus geschlossen werden konnte, dass zwar bis auf den

Austausch der Rhamnose alle weiteren Bestandteile identisch waren, jedoch die

Anteile der einzelnen Bestandteile unterschiedlich waren (ELLIOTT u. TAI 1978).

Seit der Beschreibung der Sc. suis Serotypen 1 und 2 wurden ein Vielzahl weiterer

Serotypen isoliert, die durch Eisatz entsprechender Hyperimmunseren als Serotypen

3 – 8 beschrieben wurden (PERCH et al. 1983). In ähnlicher Art und Weise konnten

die Serotypen 9 – 22 (GOTTSCHALK et al. 1989) und die Serotypen 23 – 28

(GOTTSCHALK et al. 1991b) sowie 29 – 34 (OKWUMABUA et al. 1995) beschrieben

werden. Der Nachweis der Serogruppen (R, S, R/S und T) von Sc. suis wird im

Regelfall nicht durchgeführt, da bei der serologischen Differenzierung mittels der

Überprüfung der Kapselpolysaccharidantigene der Serotypen 1, 2, ½ und 15, auch

Serotypisierung genannt, die Serogruppen R, S, R/S und T miterfasst werden

(WINDSOR u. ELLIOTT 1975, GOTTSCHALK et al. 1989).

Für die Differenzierung werden spezifische Antiseren durch die Hyperimmunisierung

von Kaninchen (ESTEOPANGESTIE u. LÄMMLER 1993) aber auch von anderen

Tieren gewonnen und in verschiedene Verfahren eingesetzt. Neben der

Koagglutinationsreaktion (GOTTSCHALK et al. 1993) sind dies die

Mikrokapillarpräzipitation (LANCEFIELD 1933), die Kapselquellungsreaktion (PERCH

et al. 1983; GOTTSCHALK et al. 1989 ) und die Latex–Agglutination (VECHT et al.

1987).

Bei der polyvalenten Koaggulationsreaktion sind die antigenetischen Unterschiede

des Kapselmaterials, welches sich hauptsächlich aus Kohlenhydraten

zusammensetzt, die Grundlage für die Serotypisierung, bei der 99% der Sc. suis -

Stämme korrekt identifiziert werden können (GOTTSCHALK et al. 1993).

Schrifttum

17

Bei der Kapselquellungsreaktion reagieren Kapselpolysaccharide von Sc. suis mit

spezifischen Antiseren. Dadurch kommt es zu einer stärkeren Lichtbrechung,

wodurch die Kapsel deutlicher zu sehen ist, als die Kapsel von Stämmen, deren

Kapselpolysaccharide nicht mit den Antikörpern reagieren (PERCH et al. 1983;

GOTTSCHALK et al. 1989)

Bei der Mikrokapillarpräzipitation werden in einem Kapillarröhrchen Antiserum und

das zuvor extrahierte Antigen übereinandergeschichtet. Wenn es sich um ein zum

Antiserum passendes Antigen handeln, wird nach spätestens 15 Minuten eine

deutliche Präzipitationsbande zwischen dem Antigen und dem Antiserum erkennbar

(LANCEFIELD 1933).

Bei der Latex-Agglutination werden Polysaccharid-Antigene enzymatisch abgelöst

und dann mit spezifischen Antikörpern, die an farbige Latexpartikel gekoppelt sind,

inkubiert. Wenn es sich um passende Sc. suis -Antigene handelt, kommt es zu einer

deutlich sichtbaren Verklumpung der Latexpartikel.

2.3.2.3 Genotypische Differenzierung

2.3.2.3.1 RibotypisierungBei dieser Methode werden Bakterien-Genome, welche durch

Restriktionsendonukleasen geschnitten wurden, mittels elektrophoretischer

Separation aufgetrennt, mittels Southern-Blotting auf eine Nylonmembran

übertragen, mit entsprechenden Gensonden markiert, und dann wird ein

sogenannter „genetischer Fingerabdruck“ erstellt (Abb.1). Dieser Methode liegt

zugrunde, dass Stämme mit einem gemeinsamen Ursprung oft auch ein identisches

oder sehr ähnliches Genom aufweisen und somit auch eine gleiche Anzahl bzw.

gleiche Positionen von Erkennungssequenzen für die eingesetzten Gensonden

existiert (OLSEN et al. 1994).

Als Gensonde werden bei der Ribotypisierung Sonden zum Nachweis multipel im

Chromosom verteilter Gene eingesetzt, welche die ribosomale DNA (=rDNA)

kodieren. Hierbei können entweder homologe oder heterologe rRNA (GRIMONT u.

GRIMONT 1986; SMITH et al. 1997), Ausschnitte des 16S-23S-5S-rRNA Operons

von Escherichia coli (BROSIUS et al. 1981; BEAUDOIN et al. 1992) oder die 16S-

rRNA kodierende Region von Bacillus subtilis (IGLESIAS et al. 1983) als Gensonde

eingesetzt werden.

Schrifttum

18

Abb 1: Grafische Darstellung der Erstellung eines „genetischen Fingerabdrucks“

Schrifttum

19

Die Speziesdifferenzen, die zwischen der Herkunft der Sonden-DNA und den zu

untersuchenden Stämmen existieren, spielen dabei eine untergeordnete Bedeutung.

Bei Sc. suis ermöglicht die Ribotypisierung eine begrenzte Unterscheidung von

virulenten Sc. suis Serotyp 2 Stämmen von avirulenten Sc. suis Serotyp 2 Stämmen.

Jedoch waren zwischen den Stämmen die Unterschiede nur sehr gering, so dass es

nicht möglich war, alle Serotypen mit der Ribotypisierung anhand des

Bandenmusters zu differenzieren (OKWUMABUA et al. 1995).

2.3.2.3.2 Makrorestriktionsanalyse mittels Pulsfeld-GelelektrophoreseDie Gelelektrophorese ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur

Auftrennung von biologischen Molekülen (Proteine, DNA oder RNA) nach Ladung

und Grösse. Bei der herkömmlichen Elektrophorese sind jedoch Grenzen hinsichtlich

der Grösse gesetzt. Bei DNA-Molekülen liegt sie bei etwa 20 kBp. Mit der

Entwicklung der Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) wurde eine Möglichkeit

entwickelt, auch grössere Moleküle auftrennen zu können. Dabei ist der

grundlegende Unterschied zur herkömmlichen Elektrophorese ein periodisch

wechselndes Stromfeld, welches einen Winkel zwischen 90° und 180° einschliesst.

Mit dieser Methode können DNA-Moleküle im Grössenbereich von 0,1 kBp bis 20000

kBp aufgetrennt werden (SCHWARTZ u. CANTOR 1984). Angewendet wurde diese

Methode zunächst vor allem in der Humangenetik zur Identifizierung genetischer

Basisdefekte bei verschiedenen Erbkrankheiten. In der Mikrobiologie wird diese sog.

Makrorestriktionsanalyse zunehmend angewendet, um Genomanalysen von

Bakterien und niederen Eukaryonten vornehmen zu können und um

epidemiologische Ausbrüche analysieren zu können (SCHWARTZ u. CANTOR

1984).

Das intakte Bakterienchromosom wird mittels selten schneidender

Restriktionsenzyme in idealerweise ca. 20 Fragmente zerschnitten und

anschliessend in der PFGE aufgetrennt. Das so entstandene Fragmentlängenmuster

gibt den Genotyp eines Stammes wieder. Miteinander verwandte Stämme einer

Spezies können so anhand ihrer Ähnlichkeit im Fragmentlängenmuster miteinander

verglichen werden. Klone und klonale Varianten innerhalb einer Taxospezies können

mittels eines quantitativen Fragmentlängenmustervergleichs definiert werden. Diese

Art der Genom-Analyse ist eine sehr sensitive und spezifische Methode und erlaubt,

epidemiologische Fragestellungen näher klären zu können (RÖMLING et al. 1995).

Schrifttum

20

TENOVER et al. (1995) postulierten, dass zwei Stämme nur dann als ein Klon

bezeichnet werden sollten, wenn beim Vergleich der Fragmentlängenmuster keine

Unterschiede festzustellen sind. Bei Differenzen im Fragmentlängenmuster von zwei

bis drei Fragmenten sollten die Stämme als sehr eng verwandt bezeichnet werden.

Wenn vier bis sechs Banden differieren, wird vorgeschlagen, die Stämme in einem

weiter gefassten genetischen Verwandtschaftsgrad im Zusammenhang zu sehen. Bei

einem Unterschied von mehr als sieben Banden können die zu vergleichenden

Stämme nach TENOVER et al. (1995) nicht mehr in einen klonalen Zusammenhang

gesehen werden.

Neben vielen gramnegativen Bakterien wurden auch grampositive Bakterien mittels

PFGE analysiert. Aufgrund des bei Streptokokken relativ niedrigen G-C-Gehaltes der

DNA werden bevorzugt Restriktionsenzyme wie SmaI und ApaI verwendet, da sie

nur je eine G- und C-Erkennungssequenz besitzen und somit nur wenige DNA-

Fragmente entstehen (RUDOLPH et al. 1998). Erfolgreich eingesetzt wurde das

Verfahren z. B. bei Sc. pneumoniae, Sc pyogenes, Sc agalactiae und anderen

Streptokokken (RUDOLPH et al. 1998). So konnte bei der Untersuchung von Sc.

pneumoniae-Stämmen bei allen Stämmen ein unterschiedliches

Fragmentlängenmuster festgestellt werden, selbst bei Stämmen gleichen Serotyps.

Aufgrund dieser Untersuchung konnte ein sehr ausgeprägter Polymorphismus bei

dieser Spezies festgestellt werden (RUDOLPH et al. 1998). Mittels Makro-

restriktionsanalysen von Sc. pneumoniae-Stämmen aus den USA und speziell aus

Alaska konnte aufgrund der PFGE-Ergebnisse gezeigt werden, dass die Diversität

der Stämme aus Kanada viel geringer war, als bei den anderen Stämmen

(RUDOLPH et al. 1998). Der Differenzierungsgrad der PFGE ist aufgrund dieser

Ergebnisse auch bei grampositiven Bakterien als sehr hoch anzusehen (LEFEVRE et

al. 1993). Eine Differenzierung von Sc. suis mittels PFGE wurde bisher nicht

durchgeführt.

Schrifttum

21

2.3.3 Pathogene Bedeutung von Sc. suisSc. suis wird im Zusammenhang mit verschiedensten Erkrankungen des Schweines

isoliert. Der Erreger wird bei Pneumonien, Polyserositiden, Meningitiden,

Encephalitiden, Polyarthritiden, Endokarditiden, Rhinitiden, Vaginitiden und Aborten

des Schweines gefunden (WINDSOR u. ELLIOTT 1975; SANFORD u. TILKER 1982;

SIHVONEN et al. 1988; TOUIL et al. 1988). Dabei beziehen sich die meisten

Untersuchungen auf die Serotypen 2 und 1 (CLIFTON-HADLEY 1983; VECHT et

al.1992). Der Erreger konnte auch bei Meningitiden des Menschen isoliert werden

und gilt daher als Zoonose-Erreger (ARENDS et al. 1988).

2.3.3.1 EpidemiologieDie Übertragung von Sc. suis Serotyp 2 in einen nichtinfizierten Bestand wird

offenbar hauptsächlich durch den Zugang von klinisch gesunden Keimträgern

(Zuchtsauen, Ebern, Absatzferkeln) aus infizierten Beständen verursacht (CLIFTON-

HADLEY,1983). Dabei erkranken meist zuerst die Ferkel einer infizierten Sau, und

anschliessend wird der Erreger durch die überlebenden Tiere innerhalb des

Bestandes verbreitet.

Die oberen Atemwege werden als die hauptsächliche Infektionspforte für Sc. suis

angesehen, da durch oro-nasale Infektion mit Bouillonkulturen von Sc. suis -Serotyp

1 und 2 die Erkrankung bei Saugferkeln und Absatzferkeln reproduziert werden

konnte (ELLIOTT et al. 1966; WINDSOR u. ELLIOTT 1975). Auch die Infektion der

Saugferkel während der Geburt wird für möglich gehalten, da im Genitaltrakt klinisch

gesunder Muttertieren Sc. suis nachgewiesen wurde. Für diese Möglichkeit spricht

auch das frühe Auftreten von Sc. suis -Erkrankungen bei Saugferkeln von infizierten

Muttertieren (ROBERTSON u. BLACKMORE 1989).

Die Erkrankung mit Sc. suis tritt gehäuft bei vier bis acht Wochen alten Ferkeln auf,

jedoch konnte der Erreger sowohl bei wenige Tage alten Ferkeln als auch bei bis zu

sechs Monate alten Schweinen nachgewiesen werden (WINDSOR 1977; LAMONT

et al. 1980).

Unter experimentellen Bedingungen konnte eine Übertragung von Sc. suis innerhalb

von fünf Tagen nach Zusammenführung von infizierten und nichtinfizierten

Schweinen festgestellt werden. Dabei waren die Erreger noch 512 Tage nach der

Infektion nachweisbar (CLIFTON-HADLEY et al. 1984). Die Erreger persistieren

unabhängig von ihrer Virulenz in den Tonsillen. Selbst bei Tieren, welche

Schrifttum

22

opsonisierende Antikörper gebildet hatten oder denen mit Antibiotika vermischtes

Futter verabreicht wurde, konnte Sc. suis isoliert werden (CLIFTON-HADLEY u.

ALEXANDER 1980).

Als prädisponierende Faktoren für das Auftreten von Erkrankungen werden

ungenügende Belüftung mit daraus resultierenden erhöhten Schadgas-

konzentrationen, erhöhter Luftfeuchtigkeit, starke Temperaturschwankungen, sowie

Umgruppierungen und Altersdifferenzen von mehr als zwei Wochen angesehen

(TAYLOR 1989; CLIFTON-HADLEY 1983).

Die Infektiosität von Sc. suis bleibt unter experimentellen Bedingungen im Kot auch

bei Temperaturen von 0°C bis zu 104 Tagen und bei 22 – 25°C bis zu 8 Tagen

erhalten (PARKER 1978). Dadurch kann auch der Mensch, insbesondere der

behandelnde Tierarzt, als Vektor in Betracht gezogen werden, sei es durch eine

latente Infektion oder durch kontaminierte Arbeitskleidung oder Arbeitsutensilien

(DEE u. COREY 1993).

2.3.3.2 Pathogenese

2.3.3.2.1 Eintritt und AdhärenzDie Tonsillen spielen im Infektionsgeschehen von Sc. suis eine wichtige Rolle. So

konnte Sc. suis auch bei klinisch gesunden Schlachtschweinen, selbst bei Tieren, die

antibiotisch vorbehandelt wurden, aus dem Tonsillargewebe, subepithelialem

Gewebe und interfollikularen Gewebe isoliert werden (DAVIES et al. 1991). Dabei

konnte morphologisch kein Unterschied zwischen den Tonsillen von gesunden und

erkrankten Schweinen festgestellt werden, wobei der Erreger sich offenbar auf der

Oberfläche und seltener im Wandepithel der Tonsillarkrypten befindet (VECHT et al.

1989). Viele Streptokokkenarten sind in der Lage, an Epithelzellen zu adhärieren und

anschliessend ein invasives Verhalten in die Wirtszellen und das Gewebe zu zeigen

(LA PENTA et al. 1994). Auch bei Sc. suis konnte eine Adhärenz an Wirtsgewebe

festgestellt werden, womit ihre lange Persistenz im Wirtstier erklärt wurde. Bei

Adhärenz-Untersuchungen von Sc. suis Serotyp 2 Isolaten an porcinem

Lungengewebe konnte zudem festgestellt werden, dass Stämme, welche aus

erkrankten Tieren isoliert worden waren, eine deutlich höhere Adhärenz zeigten, als

solche, welche aus klinisch gesunden Tieren stammten (GOTTSCHALK et al.

1991c). Es wird angenommen, dass die Adhärenz, sowie die Fähigkeit, Wirtszellen

Schrifttum

23

zu lysieren, eine Rolle bei der Invasion in tiefere Gewebe und den Eintritt in den

Blutkreislauf spielt. Dabei wird vermutet, dass die von Sc. suis produzierten

Hämolysine bei diesem Vorgang eine wichtige Rolle spielen. Jedoch sind die

genauen Mechanismen, wie Sc. suis die Epithelschicht durchdringt, noch nicht

geklärt (NORTON et al. 1999; CHARLAND et al. 2000). Im Gegensatz zu den

Gruppe B-Streptokokken konnte keine Invasion in Epithelzellen festgestellt werden

(NORTON et al. 1999; CHARLAND et al. 2000).

2.3.3.2.2 Phagozytose und intraphagosomales ÜberlebenDie wichtigste Abwehrbarriere gegen Sc. suis stellt die Phagozytose dar. Aufgrund

des adhärenten und invasiven Verhalten löst Sc. suis entzündliche Reaktionen aus,

womit es zur Rekrutierung von Makrophagen kommt. Jedoch werden virulente

Stämme nur effektiv phagozytiert, wenn Serotyp-spezifische Antikörper und

Komplement vorhanden sind (WILLIAMS et al. 1990). Sind keine Serotyp-

spezifischen Antikörper vorhanden, so besitzen virulente Sc. suis Stämme die

Fähigkeit, nach der Phagozytose intraphagosomal zu überleben und sich zu

vermehren. Infizierte Makrophagen zeigen morphologische Veränderungen in Form

von Vergrösserungen von Vakuolen und Verblassen des Zytoplasma (WILLIAMS et

al. 1990). Aufgrund des intrazellulären Überleben könnte für Sc. suis die Möglichkeit

gegeben sein, mittels der Makrophagen als „Shuttle“ die Blut-Hirnschranke zu

überwinden (WILLIAMS et al. 1990). Auch die Fähigkeit virulenter Stämme, sich

innerhalb der Makrophagen zu vermehren und diese abzutöten, muss als wichtiger

Mechanismus für die Pathogenese von Sc. suis angesehen werden (NORTON et al.

1997)

Vergleichsstudien mit bekapselten und unbekapselten Sc. suis – Stämmen ergaben,

dass die Kapsel von Sc. suis in Abwesenheit von Antikörpern die

Phagozytoseabwehr durch die Makrophagen erschwerte, während unbekapselte

Stämme wesentlich effektiver von Makrophagen aufgenommen werden können

(SEGURA et al. 1998).

2.3.3.2.3 Invasion und AusbreitungBisher ist nur sehr wenig darüber bekannt, wie Sc. suis die Abwehrbarriere

überwindet und in tiefere Gewebe bzw. den Blutkreislauf gelangt (CHARLAND et al.

1996). Aufgrund der Polysacccharid-Kapsel ist Sc. suis offenbar in der Lage, sich in

Schrifttum

24

einem nicht immunen Wirt der Phagozytose durch Makrophagen zu entziehen und

somit in den Blutstrom zu gelangen und eine Bakteriämie auszulösen (CHARLAND

et al. 1996). Bei in vitro-Untersuchungen mit Sc. suis und mikrovaskulären humanen

Endothelzellen des ZNS konnte festgestellt werden, dass hochvirulente Sc. suis

Stämme in der Lage waren, an diese Zellen zu adhärieren und eine Zellschädigung

auszulösen. Möglicherweise können diese Stämme so die Blut-Hirnschranke

durchdringen. Dabei wird vermutet, dass die Zellschädigung durch das von Sc. suis

produzierte Suilysin verursacht wird (CHARLAND et al. 2000).

2.3.4 Potentielle Virulenzfaktoren

2.3.4.1 Adhäsine und HämagglutinineDie Adhärenz an Epithelzellen wird bei vielen Streptokokken als ein Virulenzfaktor

angesehen, da die Bakterien nur mittels spezifischer Adhäsine in der Lage sind, auf

den Oberflächen von Epithelzellen zu haften, um diese zu besiedeln (BEACHEY et

al. 1981). Über die Adhärenzeigenschaften von Sc. suis gibt es bisher nur sehr

wenige Studien (GOTTSCHALK et al. 1991). Bei einer Untersuchung der Adhärenz

von Sc. suis–Isolaten an Schweine-Lungen wurde beobachtet, dass Isolate von

Schweinen mit Meningitis oder Pneumonie deutlich besser adhärierten als Isolate

von klinisch gesunden Tieren (GOTTSCHALK et al. 1991). Bekannt ist auch, dass

virulente Sc. suis Stämme sowohl humane als auch porcine Erythrozyten

agglutinieren können, eine Fähigkeit, die bei manchen anderen bakteriellen Erregern

mit der Adhärenz an andere Wirtszellen korreliert (GOTTSCHALK et al. 1991; KURL

et al. 1989). Dabei beruht die Hämagglutination auf der Adhärenz von Sc. suis an

spezifische Zuckerreste der Erythrozyten und erfolgt wahrscheinlich über

Oberflächenproteine der Erythrozyten (GOTTSCHALK et al. 1990; KURL et al. 1989).

Sc. suis erkennt offenbar Sialinsäurereste an verschiedenen Glykoproteinen und –

lipiden der Erythrozytenmembranen. Diese Sialinsäurereste werden

interessanterweise auch von anderen schweinepathogenen Erregern wie E. coli K99

und Bordetella bronchiseptica erkannt (ISHIKAWA et al. 1987). Eine klare Korrelation

zwischen Adhärenzvermögen und Serotyp bei Sc. suis konnte dabei nicht festgestellt

werden (KURL et al.1989).

HAATAJA et al. (1994) konnten ein Adhäsin von Sc. suis isolieren. Dieses Adhäsin

bindet an die Disaccharide Gal α 1-4 Gal der P1 und PK -Blutgruppenantigene der

Schrifttum

25

Erythrozyten, konnte in allen untersuchten virulenten Sc. suis -Stämmen

nachgewiesen werden, und war bei Immunisierungsversuchen mit Mäusen

hochimmunogen (TIKKANEN et al. 1996). Jedoch zeigten experimentelle Infektionen,

dass die Ergebnisse, welche bei Versuchen mit Mäusen erlangt werden konnten,

nicht ohne weiteres auf das Schwein übertragbar sind (VECHT et al. 1997).

2.3.4.2 KapselDie von Sc. suis produzierte Polysaccharid-Kapsel spielt eine wichtige Rolle in der

Virulenz dieser Bakterien. So konnte von SMITH et al. (1999) in experimentellen

Infektionen mit Ferkeln nachgewiesen werden, dass unkapselte Deletionsmutanten

gegenüber hochvirulenten Wildstämmen ihre Virulenz verloren hatten. Welche

Aufgabe die einzelnen Bestandteile der Kapsel besitzen, und welche Rolle die

Kapsel, bzw. ihre einzelnen Bestandteile in der Pathogenese von Sc. suis spielen, ist

noch nicht genau geklärt. Es gibt aber Hinweise darauf, dass einzelne Bestandteile

eine Rolle in der Pathogenese von Sc. suis spielt, da bekapselte Stämme in in vivo-

Untersuchungen die Phagozytose durch Alveolarmakrophagen verhinderten,

während die unbekapselten Deletionsmutanten sehr effektiv phagozytiert (über 99 %)

und abgetötet wurden (SMITH et al. 1999).

Die Kapsel von Sc. suis ist aus den Komponenten Glukose, Galaktose, N-

Acetylglukosamin, Rhamnose und Sialinsäure in einem Verhältnis von 1:3:1:1:1

aufgebaut. Die genaue Struktur ist jedoch noch nicht geklärt. Die Kapsel-Gene

konnten kloniert und exprimiert werden. Die Gene hatten eine Gesamtgrösse von 16

kBp und es konnten 14 offene Leserahmen unterschiedlicher Grösse identifiziert

werden. Die Genprodukte von 11 dieser 14 offenen Leserahmen zeigen

Ähnlichkeiten mit Polysaccharid-Biosynthese-Proteinen anderer grampositiver

Mikroorganismen.

Basierend auf der Homologie einzelner Genabschnitte des Kapselgens mit Genen

anderer Bakterien wird vermutet, dass die Kapsel-Gene Glucosyl-, Galaktosyl-, N-

Acetylglukosaminyl- und Rhamnosyl -Transferase Aktivitäten kodieren (SMITH et al.

1999).

Schrifttum

26

2.3.4.3 Muramidase-Released-ProteinBei dem Muramidase-Released-Protein (MRP) handelt es sich um ein

zellwandständiges Protein von Sc. suis mit einem Molekulargewicht von 136 kDa,

welches vor allem bei virulenten Sc. suis - Stämmen und selten bei avirulenten

Stämmen auftritt. Daraus wurde gefolgert, dass das MRP ein Virulenzfaktor oder

zumindest ein virulenzbegleitender Faktor sein könnte (VECHT et al. 1991). Bei

Infektionsversuchen wurde dabei festgestellt, dass die Virulenz der untersuchten Sc.

suis Stämme abhängig von dem Vorhandensein des MRPs und nicht von der

Herkunft des Isolates war. Alle Tiere, welche mit einem MRP-positiven Stamm

infiziert wurden, zeigten klinische Symptome. Bei den Tieren, die mit einem MRP–

negativen Stamm infiziert wurden, waren keine klinischen Symptome zu finden

(VECHT et al. 1992). Allerdings wurde in späteren Infektionsversuchen mit einer

MRP-defizienten Sc. suis Serotyp 2-Mutante eine dem MRP-positiven Sc. suis -Wild-

Stamm vergleichbare Virulenz nachgewiesen. Dies zeigt, dass das MRP nicht direkt

an der Virulenz beteiligt ist, sondern vielmehr einen virulenzbegleitenden Faktor

darstellt (SMITH et al. 1996).

Das MRP wurde eingehend strukturell charakterisiert. Demnach steht das Protein in

Assoziation mit den Peptidoglykanen den Zellwand (VECHT et al. 1991), ähnlich wie

andere Peptidoglykan-assoziierte Proteine von Streptokokken, z. B. das M-Protein

von Sc. pyogenes (FISCHETTI 1989). Das MRP-Gen konnte kloniert und in E.coli

überexprimiert werden. Dabei wurde ein offener Leserahmen mit einer

Nukleotidsequenz von 3,786 kBp identifiziert und sequenziert, woraus eine

Polypeptidkette mit einer Länge von 1256 Aminosäuren und einem kalkuliertem

Molekulargewicht von 135,749 kDa abgeleitet wurde (SMITH et al. 1992).

Die molekulargenetische Charakterisierung ergab, dass das MRP die typischen

Merkmale von Oberflächenproteinen bei grampositiven Kokken aufweist (SMITH et

al. 1992). So sind die ersten 47 Aminosäuren des MRP-Proteins am N–terminalen

Ende ein typisches Signalpeptid. Das N-terminale Ende besteht aus positiv

geladenen Resten, gefolgt von einer hydrophoben Kette, bestehend aus 21

Aminosäuren und vermutlich einer Signal-Peptidase-Spaltungssequenz. Aufgrund

dieser Spaltung der Signal-Peptidase resultiert auch die unterschiedliche

Erscheinungsform des MRP hinsichtlich des Molekulargewichtes von 136 kDa und

131,094 kDa. Eine zweite hydrophobe Region konnte am C-terminalen Ende

identifiziert werden. Da dieser Bereich analog zu anderen Zellwand-assoziierten

Schrifttum

27

Proteinen grampositiver Bakterien ist, handelt es sich hierbei möglicherweise um

eine Zellmembranverankerung. Weitere Regionen aus der MRP-Sequenz wurden

identifiziert. So folgt der schon angesprochenen Aminosäurensequenz am N–

terminalen Ende eine Sequenz von 819 Aminosäuren. Darauf folgen eine

prolinreiche Sequenz von 86 Aminosäuren, sowie drei sich wiederholende Motive

aus je 54 Aminosäuren. Das erste des sich wiederholenden Motivs ist von dem

zweiten durch 77 Aminosäuren getrennt, während die zweite und dritte unmittelbar

aufeinander folgen. Diesen Sequenzen folgt die Zellmembran–Verankerungssequenz

am C–terminalen Ende. Bisher wurden keine auffallenden Homologien des MRPs mit

anderen Proteinen gefunden. Eine geringe Homologie (17,2% Übereinstimmung in

einer Sequenz von 377 Aminosäuren) besteht mit dem fibronektinbindenden Protein

von Staph. aureus, woraus geschlossen wurde, dass das MRP eine Bindung von Sc.

suis an Fibronektin vermitteln könnte (SMITH et al. 1992). Allerdings ist bisher eine

solche Bindung nicht beschrieben worden. Die genaue Funktion des MRP konnte

bisher nicht geklärt werden (SMITH et al. 1992).

2.3.4.4 Extrazellulär-FaktorBei der Untersuchung des Proteinprofiles von Sc. suis Serotyp 2 Isolaten konnte,

neben dem MRP (siehe oben), im Kulturüberstand ein Protein von 110 kDa gefunden

werden, welches als Extrazellulär-Faktor (EF) bezeichnet wurde (VECHT et al.

1991). Das Protein wurde hauptsächlich in Kulturüberständen von Stämmen

identifiziert, welche aus erkrankten Schweinen stammten. Bei 77 % der Stämme,

welche von erkrankten Schweinen stammten, wurde das EF-Protein isoliert. Jedoch

konnte bei nur 15 % der von Humanpatienten isolierten Stämme das EF

nachgewiesen werden. Resultierend aus diesen Beobachtungen wurde postuliert,

dass das EF stärker mit porcinen Stämmen als mit humanen Stämmen assoziiert ist

(VECHT et al. 1991).

Bei der Untersuchung der Proteinprofile der Kulturüberstände konnten auch mehrere

höhermolekulare Proteine ( >150 kDa) festgestellt werden. Beim Nachweis des EF-

Proteines mit monoklonalen Antikörpern wurden auch höhermolekulare Proteine

erkannt. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde gefolgert, dass diese Proteine sehr eng

mit dem EF verwandt sind. Offensichtlich existieren Längenvarianten des EFs bei

den verschiedenen Sc. suis -Stämmen. Alle EF-negativen Stämme (EF-) hatten das

verwandte EF mit der höheren Molekularmasse (EF*), während kein EF-positiver

Schrifttum

28

Stamm (EF+) das verwandte EF* phänotypisch ausprägte (siehe Tabelle 5).

Aufgrund dieser Zusammenhänge wurde gefolgert, dass nur das 110 kDa grosse EF

bei Sc. suis -Infektionen beim Schwein eine Rolle spielt (VECHT et al. 1991).

Bei der Klonierung und Sequenzierung von EF bzw. EF*-Genen verschiedener Sc.

suis Stämme des Serotyps 2 zeigte sich, dass das EF offenbar relativ stark

konserviert ist. Dabei liegt der für das EF kodierende Bereich im ersten offenen

Leserahmen (VECHT et al. 1993).

Tabelle 5: EF-Protein-Varianten bei Sc. suis (VECHT et al. 1993).

Typ MolekulargewichtEF 110 kDa

EF* Typ I 195 kDa

EF* Typ II 180 kDa

EF* TYP III 175 kDa

EF* Typ IV 160 kDa

EF* Typ V 155 kDa

Zwischen den Genen, welche das EF-Protein (epf) und denen, welche die EF*-

Proteine (epf*) kodieren, gibt es hohe Homologien. So sind die ersten 2499

Nukleotide sowohl bei epf und bei epf* nahezu identisch. Dieser Sequenz folgen

beim epf*-Typ I-Gen 2433 Basenpaare, von dem beim epf Gen nur 65 Basenpaare

gefunden werden konnten. Diesen Sequenzen folgen weitere Sequenzen die beim

epf*-Gen gefunden wurden, und die weitgehend mit den korrespondierenden

Regionen des epf-Gens übereinstimmen (SMITH et al. 1993)

Die Proteine, welche von den verschiedenen epf*-Genen kodiert werden,

unterscheiden sich vom EF in den Aminosäurenabschnitten in der Nähe des C-

terminalen Endes durch eine variierende Zahl von Wiederholungen. Es wird daher

vermutet, dass das epf-Gen aus einem epf*-Urspungsgen entstanden ist und dass

der Verlust der sich wiederholenden Sequenzen wichtig für die Virulenz sein könnte

(SMITH et al. 1993).

Die Bedeutung des EF steht offenbar in einem engen Zusammenhang mit dem MRP:

So wurde bei Untersuchungen zur Virulenz von Sc. suis mit unterschiedlichen

MRP/EF Phänotypen bei Schweinen festgestellt, dass die Virulenz sehr eng mit dem

MRP+/EF+ Phänotyp korrelierte (VECHT et al. 1992). Auch Stämme des Phänotyps

Schrifttum

29

MRP+/EF- verursachten klinische Symptome, welche jedoch milder waren, während

Schweine, welche mit Stämmen des Phänotyp MRP-/EF- infiziert worden waren,

keine klinischen Symptome zeigten. Aufgrund dieser Ergebnisse kann vermutet

werden, dass EF ein wichtiger Virulenzfaktor oder zumindest ein virulenz-

begleitender Faktor bei Schweinen ist. Eine mögliche Funktion des EF könnte sein,

dass er beim Überwinden der Schleimhautbarriere im Nasopharynx des Schweines

involviert ist, da nur EF-positive Stämme in der Lage waren, diese Barriere zu

überwinden (VECHT et al. 1992).

Bei Impfversuchen in Schweinen konnte jedoch festgestellt werden, dass eine

isogene MRP-negative EF-negative Mutante die volle Virulenz zeigte (SMITH et al.

1996). Auch konnte festgestellt werden, dass bei Impfungen mit Kultur-Überständen

von Sc. suis die das EFenthielten, die Tiere nach Infektion mit virulenten EF-positiven

Sc. suis-Stämmen, nicht effektiv geschützt wurden (JACOBS et al. 1996). Auch beim

EF ist also die Funktion und Bedeutung noch nicht geklärt (VECHT et al. 1991). Es

gilt aber als gesichert, dass EF in Verbindung mit MRP virulenzassoziiert ist.

2.3.4.5 HämolysineDie Eigenschaft von Bakterien, Erythrozyten zu lysieren (Hämolyse) wird bei

verschiedenen grampositiven und gramnegativen Bakterien in Verbindung mit

Virulenz und Pathogenität gesehen. Auch Sc. suis ist in der Lage, Hämolysine zu

exprimieren. Eine vergleichende Studie von Referenzstämmen zeigte, dass bei den

getesteten Stämmen nur 10 von 23 Serotypen eine hämolytische Aktivität zeigten,

welche je nach Serotyp und Umweltbedingung unterschiedlich stark ausgeprägt war

(siehe Tabelle Nr. 6). So konnte die höchste hämolytische Aktivität bei den

Referenzstämmen der Serotypen 1, 2, und ½ beobachtet werden.

Schrifttum

30

Tabelle 6: Übersicht über hämolytische Aktivitäten von Sc. suis -Referenzstämmen

(FEDER et al. 1994)

Serotyp* Herkunft HämolytischeEinheiten

½ Nordamerika 625

1 Nordamerika 666

2 Nordamerika 666

3 Nordamerika 0

4 Nordamerika 83

5 Nordamerika 17

6 Nordamerika 0

7 Nordamerika 0

8 Nordamerika 0

9 Nordamerika 0

10 Dänemark 0

11 Dänemark 0

12 Dänemark 0

13 Dänemark 0

14 Dänemark 100

15 Dänemark 111

16 Dänemark 0

17 Dänemark 20

18 Dänemark 0

19 Dänemark 50

20 Dänemark 20

21 Nordamerika 0

22 Nordamerika 0

Hämolytische Einheit: = grösste Verdünnung, des Überstandes, die benötigt wird, um in 1 ml50% der Schaf-Erythrozyten einer 1%igen Eryrthrozyten-Suspension zu lysieren.* = Getestet wurde von jedem Serotyp jeweils der Referenz-Stamm

Bei der Hämolysinproduktion spielen die Kultivierungsbedingungen eine grosse

Rolle. So konnte die höchste in vitro Hämolysinproduktion am Ende der

logarithmischen Wachstumsphase und die höchste Aktivität des Hämolysins bei

Schrifttum

31

40°C und 6% CO2 in THB-Medium gemessen werden (FEDER et al.1994). Zudem

konnte gezeigt werden, dass die Produktion der Hämolysine bei Stämmen, die aus

Krankheitsgeschehen wie Meningitis und Septikämie isoliert worden waren, höher

war als bei Stämmen, welche in Reinkultur aus Mischinfektionen aus

Krankheitsherden des Respirationstraktes stammten (SALA et al. 1996).

Die Empfindlichkeit von Erythrozyten unterschiedlicher Säugerarten gegenüber den

Sc. suis -Hämolysinen ist sehr verschieden. Am empfindlichsten reagieren

menschliche Erythrozyten, gefolgt von Pferde -, Schaf -, Rinder -, Schweine – und

Kaninchenerythrozyten (GOTTSCHALK et al. 1995). Bei den bisher beschriebenen

Hämolysinen handelt es sich ausnahmslos um extrazelluläre Proteine.

GOTTSCHALK et al. (1995) konnten ein Hämolysin mit einer molekularen Masse von

65 kDa nachweisen. Weitere Hämolysine mit einer Molekularmasse von 54 kDa

(JACOBS et al. 1994) und 52 kDa (OKWUMABUA et al. 1999) wurden beschrieben.

Homologie-Untersuchungen von OKWUMABUA et al. (1999) ergaben eine sehr hohe

Übereinstimmung des 52 kDa grossen Hämolysins mit dem Hämolysin von JACOBS

et al. (1994). Letzteres wurde von JACOBS (1994) als Suilysin bezeichnet und

gehört, ebenso wie das Hämolysin, welches von GOTTSCHALK et al. (1995)

identifiziert wurde, zur Familie der Thiol-aktivierten Toxine, welche eine antigene

Verwandtschaft mit Cholesterol–bindenden zytolytischen Toxinen aufweisen

(GOTTSCHALK et al. 1995). Das Suilysin verliert seine Aktivität, wenn es oxidiert

wird. Dies ist jedoch reversibel, denn es erlangt seine volle Aktivität unter Zugabe

eines reduzierenden Agens wieder (JACOBS et al. 1994). Der Vergleich der N-

terminalen Aminosäurensequenz des Suilysins ergab viele Gemeinsamkeiten mit

Teilen des N-terminalen Endes der Aminosäurensequenzen von Perfringolysin O,

Streptolysin O, Listeriolysin O, Alveolysin und Pneumolysin (JACOBS et al. 1994).

Das Suilysin-Gen wurde kloniert und sequenziert (SEGERS et al. 1998). Bei der

Überprüfung von 158 Feldstämmen unterschiedlichster Serotypen auf die

Anwesenheit des Suilysin-Genes mittels Polymerase-Kettenreaktion waren 100

positiv. Dabei waren alle Serotyp 1-Stämme und 95% der Serotyp 2-Stämme

Suilysin-positiv. Die Anwesenheit des Suilysin-Genes war jedoch nicht mit der

Expression gleichzusetzen (SEGERS et al. 1998). Welche Funktion den

Hämolysinen von Sc. suis zukommt, ist noch nicht vollständig geklärt. Jedoch konnte

bei in vitro-Versuchen eine zytotoxische Wirkung festgestellt werden. Daraus wurde

geschlossen, dass die Hämolysin-Expression im Zusammenhang mit der Lyse von

Schrifttum

32

Epithel- und Endothelzellen steht und somit für Sc. suis bei der Überwindung von

Zellbarrieren eine Bedeutung haben könnte (NORTON et al. 1999; CHARLAND et al.

2000).

Mit Hämolysin vakzinierte Schweine zeigten nach einer Infektion mit Hämolysin-

positiven Sc. suis–Stämmen nur sehr milde Krankheitssymptome und regenerierten

am schnellsten (JACOBS et al. 1996). Aufgrund dieses partiellen Impfschutzes kann

davon ausgegangen werden, dass die Hämolysine für die Virulenz von Sc. suis eine

Rolle spielen, obwohl auch virulente Hämolysin-negative Sc. suis-Stämme

nachgewiesen wurden (STAATS et al. 1998) Möglicherweise ist die Hämolysin-

Expression als Marker zur Identifikation von hochvirulenten Sc. suis-Isolaten

verwendbar (OKWUMABUA et al. 1999).

2.3.5 Therapie und ProphylaxeSc. suis -Infektionen werden in der Regel mit Penicillin behandelt (GOTTSCHALK et

al. 1991). Bei Saugferkeln wurde eine Behandlung durch parenterale Verabreichung

von Penicillin oder Trimethoprim-Sulfonamid getestet, wobei jedoch bei

fortgeschrittenem Krankheitsgeschehen die Behandlung nur noch wenig Erfolg hatte

(TAYLOR 1989). Bei Untersuchungen hinsichtlich Antibiotika-Resistenzen wurde

festgestellt, dass über 80% der getesteten Stämme resistent gegenüber Neomycin

waren. Eine Resistenz von über 50% der Stämme konnte bei den Antibiotika

Oxytetracyclin, Lincomycin, Erythromycin und Gentamicin beobachtet werden.

Gegenüber den getesteten Antibiotika Oxacillin und Penicillin G zeigten über 90%

der Stämme im Antibiogramm eine Empfindlichkeit. Nur bei Ampicillin wurde eine

Empfindlichkeit aller getesteten Stämme nachgewiesen (WAACK 1996). Bei

Resistenzuntersuchungen von Sc. suis -Isolaten aus Dänemark und Schweden

waren über 23% resistent gegen Makrolid-Antibiotika. Auch eine erhöhte Resistenz

gegen Sulfonamide und gegen Tetracycline konnte festgestellt werden

(AARESTRUP et al. 1998). Einen besseren klinischen Effekt durch die Kombination

von Antibiotika mit Kortikosteroiden, wie er aus der Humanmedizin bekannt ist,

konnte nicht nachgewiesen werden (SZANCER u. VECHT 1996).

Flankierende therapeutische Massnahmen neben einer frühzeitigen antibiotischen

Behandlung bestehen darin, festliegende Tiere aufzusetzen, erhitzte Körper-

oberflächen abzuduschen (CLIFTON-HADLEY 1983), im Verbringen in eine ruhige

Schrifttum

33

kühle Umgebung und die manuelle Zufuhr von Wasser und Elektrolyten (TAYLOR

1989).

Als Massnahmen zur Vorbeugung einer Infektion mit Sc. suis werden neben der

medikamentellen Vorbeugung verbessertes Haltungsmanagement, Tilgungsmass-

nahmen und die Impfprophylaxe angesehen.

Als medikamentelle Prophylaxe wird die Verabreichung von Tetracyclinen oder

Penicillin mit dem Futter angewendet, obwohl diese Methode keinen sicheren Schutz

bieten kann (WINDSOR 1977). So konnte trotz Metaphylaxe mit 300 mg Penicillin

pro Kilogramm Futter in einer Herde das Auftreten von Meningitiden festgestellt

werden (CLIFTON-HADLEY u. ALEXANDER 1980). Zudem muss bei

Futtermedikation berücksichtigt werden, dass Penicilline, als Fütterungsarzneimittel

eingesetzt, erheblichen Stabilitätsverlusten unterworfen sind (COOKE 1984). Bei der

Überprüfung von Antibiotika zur Elimination von Sc. suis aus den Tonsillen gesunder

Schweine musste festgestellt werden, dass weder eine unterschiedliche

Verabreichung von Penicillinen über mehrere Tage noch die Gabe von Ampicillin

oder Ceftiofur ausreichte, den tonsillären Trägerstatus der Tiere zu ändern und somit

immer eine Gefahr der Übertragung auch von klinisch gesunden Tieren ausgehen

kann (AMASS et al. 1996). Diese Ergebnisse stellen den Sinn und die Effektivität

einer Metaphylaxe über Futterarzneimittel in Frage, zumal durch eine solche

Massnahme die Gefahr einer erhöhten Resistenzbildung gegeben ist.

Aufgrund der hohen finanziellen Belastungen sind Eradikationsmassnahmen nur bei

einer sehr hohen Durchseuchung zu rechtfertigen (CLIFTON-HADLEY 1983). Auch

muss nach Schlachtung aller Tiere eines Betriebes auf die Desinfektion der

Stallungen ein besonderes Augenmerk gerichtet werden, um den Erreger auch in Kot

und Staub eliminieren zu können (CLIFTON-HADLEY u. ALEXANDER 1981).

Weiterhin sollten kontinuierliche Aufzuchtmethoden vermieden, bzw. das „Rein-Raus-

Verfahren“ vorgezogen werden. Die Tiere sollten möglichst keinen Kontakt zu

anderen Stallabteilungen haben und in möglichst trockenen, sauberen Buchten

gehalten werden, wobei auch der Kontakt zu Kot möglichst gering sein sollte

(TAYLOR 1989).

Bei Impfungen von Schweinen mit inaktivierten virulenten und avirulenten Sc. suis

Serotyp 2 Stämmen konnte eine belastbare, nicht stammspezifische Immunantwort

hervorgerufen werden, als die Tiere Booster-Injektionen erhielten (HOLT et al. 1988).

Jedoch entwickelten die Schweine, bei denen zur Immunisierung virulente Stämme

Schrifttum

34

verwendet wurden, zu Beginn der Behandlung Krankheitserscheinungen, welche

jedoch im Laufe der Booster-Injektionen abklangen. Es zeigte sich, dass spezifische

Antikörper zwar vor einer Erkrankung schützen können, die Ansiedlung des Erregers

in Tonsillen und Gelenken aber nicht verhindern. Das heisst, dass eine subklinische

Infektion nicht verhindert werden kann (HOLT et al. 1988). Bei Immunisierungs-

versuchen wurde festgestellt, dass mittels Formalin-inaktivierter Sc. suis - Stämme

im Gegenteil zu Hitze-inaktivierten Stämmen eine belastbare Immunität

hervorgerufen werden kann. Dabei spielte die Art der Kultivierung der Bakterien oder

die Verwendung eines Adjuvans keine Rolle. Die Tiere, welche mit Hitze-inaktivierten

Stämmen immunisiert wurden, erkrankten nach einer Belastungsinfektion, obwohl sie

opsonisierende Antikörper gebildet hatten und diese Antikörper bei in-vitro-

Versuchen die gleiche Wirkung zeigten wie die Antikörper der Formalin-inaktivierten

Stämme. Daraus wurde geschlossen, dass bei der Hitze-Inaktivierung

Oberflächenstrukturen zerstört wurden, gegen die im Versuchstier weitere Antikörper

gebildet werden (HOLT et al. 1990).

In einer weiteren Impfstudie konnte MADEC (1986) ebenfalls zeigen, dass bei

Immunisierungsversuchen mit Formalin-inaktivierten und mit Adjuvans versehenen

bestandsspezifischen Stämmen die Erkrankungen der Tiere nach einer

experimentellen Infektion reduziert werden konnte. Bei Untersuchungen der

geschlachteten Tiere zeigte es sich, dass auch vakzinierte Tiere von einer latenten

Sc. suis –Infektionen betroffen waren. Jedoch war der Durchseuchungsgrad dieser

Tiere mit Sc. suis deutlich niedriger als bei einer Kontrollgruppe (MADEC 1986).

Bei der Vakzinierung von Schweinen mit Suilysin wurde nur ein Teilschutz aufgebaut.

Die geimpften Tiere zeigten bei nachfolgender Infektion mit Sc. suis Krankheits-

symptome, die jedoch deutlich milder waren, als bei nicht vakzinierten Schweinen

(JACOBS et al. 1996).

Bei Infektionsversuchen mit Mäusen, welchen unterschiedliche Antikörperfraktionen

von immunisierten Schweinen verabreicht wurden, konnte festgestellt werden, dass

die Mäuse nicht geschützt waren, wenn aus den Schutzseren die Antikörper entfernt

worden waren, die gegen Oberflächenantigene von Sc. suis gerichtet waren. Durch

das komplette Serum waren die Mäuse jedoch geschützt (HOLT et al. 1989). Bei

Untersuchung der Seren mittels Immunoblot-Analyse wurden Antikörper gegen sechs

Sc. suis –Antigene nachgewiesen, welche Molekulargewichte von 44, 78, 86, 94, 130

bzw. 136 kDa hatten. In Verbindung mit Kapselmaterial von Sc. suis könnten diese

Schrifttum

35

Sc. suis –Antigene zur Entwicklung eines Impfstoffs verwendet werden (HOLT et al.

1989).

Bei Immunisierungsversuchen von Mäusen mit dem EF-Protein eines Sc. suis

Serotyp 2-Stammes waren die Tiere geschützt und zeigten nach einer

Belastungsinfektion mit virulenten Sc. suis Serotyp 2 – Stämmen im Gegensatz zur

Kontrollgruppe keine klinischen Symptome (QUESSY et al. 1994).

Ein serotypübergleifender Impfschutz konnte jedoch bisher nicht erreicht werden.

2.4 Problemstellung und Ziel der vorliegenden ArbeitZusammenfassend ist ein wesentliches Problem bei Sc. suis-Infektionen die hohe

geno- und phänotypische Diversität des Erregers und der geringe Kenntnisstand

über dessen Virulenzmerkmale. Daher sollten in der vorliegenden Arbeit Stämme mit

verschiedenem klinischem Hintergrund eingehend phänotypisch und genotypisch

charakterisiert und typisiert werden. Ziel war es, Hinweise auf Zusammenhänge

zwischen klinischem Hintergrund, dem Auftreten potentieller phänotypischer

Virulenzfaktoren und dem genetischen Hintergrund zu erhalten.

Material und Methoden

36

3 Material und Methoden

3.1 BakterienDie Mehrzahl der Isolate wurde von Probenmaterial aus dem diagnostischen Labor

des Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule

Hannover isoliert (Proben eingesandt von praktizierenden Tierärzten, der Klinik für

kleine Klauentiere sowie dem Institut für Pathologie). Die Tabelle 7 gibt Auskunft über

die Anzahl der Isolate und ihre Herkunft. Die Stämme wurden anhand ihrer

morphologischen und biochemischen Merkmale als Sc. suis identifiziert. Die

einzelne Bezeichnung der Isolate erfolgt im Anhang.

Tabelle 7: Herkunft von 92 Isolaten, die für diese Arbeit zur Verfügung gestellt

wurden

Anzahl der zur Verfügung gestellten Isolate vonHerkunft bzw. klinischerHintergrund A B I GMeningitis 10 3 7 11

Septikämie 4 0 1 0

Arthritis 5 1 1 0

Pneumonie 7 8 0 1

Pneumonie-Mischinfektion 7 17 0 0

Nasen-Tupfer 5 0 0 0

Zervix-Tupfer 3 1 0 0

Gesamt 41 30 9 12

A: Diagnostisches Labor des Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen derTierärztlichenHochschule HannoverB: Aussenstelle für Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover in BakumI: IVD, Innovative Veterinär-Diagnostik (Aninstitut der Tierärztlichen Hochschule Hannover)G: Institut für Bakteriologie und Hygiene der Milch des Fachbereichs Veterinärmedizin derJustus–Liebig–Universität Giessen (Prof. Dr. C. Lämmler)


37

Des weiteren standen folgende, in Tab. 8 aufgeführten Referenzstämme zur

Verfügung.

Tabelle 8: Bezeichnung und Herkunft der untersuchten Referenzstämme

Bezeichnung Herkunft Zur Verfügung gestellt vonD 282 Meningitis Lelystad/Holland *

H 5631/2 Tonsillen Lelystad/Holland

H 6399 Meningitis Lelystad/Holland

DSM 9682 Meningitis DSM **

DSM 9683 Meningitis DSM

DSM 9684 Meningitis DSM

P 1/7 Meningitis Lelystad/Holland

T 15 Lunge Lelystad/Holland

Vecht 4005 Meningitis Lelystad/Holland*= ID-DLO Lelystad, Holland (Institute for Animal Science and Health, Lelystad)

**= Deutsche Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkultur, Braunschweig

Zur Erstellung eines Grössenstandard für die Pulsfeld-Gelelektrophorese wurde der

Staphylococcus aureus Stamm DSM 1104 eingesetzt, der von der Deutschen

Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkultur (Braunschweig) erworben

wurde.

3.2 ZellkulturenFür die Adhärenzversuche wurden zwei Epithel-Zelllinien eingesetzt. Hierbei

handelte es sich zum einen um die humane Zelllinie HEp 2 (ATCC-Nr. CCL-23), die

aus dem oberen Atemtrakt stammt. Zum zweiten wurde die porcine Hoden-Zelllinie

ST verwendet, die von Prof. Dr. G. Herrler (Inst. für Virologie der TiHo) zur Verfügung

gestellt wurde.


38

3.3 Medien, Pufferlösungen und Lösungen

3.3.1 Medien für die ZellkulturDulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)

Es handelt es sich um ein steriles Fertigmedium der FA. GIBCO BRL

Als Zusätze wurden verwendet:

Fötales Kälberserum (FCS) 10 %

Penicillin–Streptomycin-Lösung 1 %

(Stock–Lösung: Penicillin 5000 IU/ml; Streptomycin 5000 µg/ml)

3.3.2 StammlösungenTris-HCl, 1 M (pH 7,2, bzw. pH 8,0)

Die pH-Wert-Einstellung erfolgte mittels Zugabe von HCl. Die Lösung wurde

anschliessend autoklaviert.

Na-EDTA, 0,5 M (pH 7,2, bzw. pH 8,0)

Die pH-Wert-Einstellung erfolgte mittels Zugabe von NaOH. Die Lösung wurde

anschliessend autoklaviert.

NaCl, 4 M

Die Lösung wurde autoklaviert.

SDS 20 % (w/v)

Die Lösung wurde mit autoklaviertem A. dest. hergestellt.

Na2HPO4 (pH 7,2), 1 M

Die pH-Wert-Einstellung erfolgte mit H2PO4.

Proteinase K, 20 mg/ml

Die Herstellung der Lösung erfolgte mit autoklaviertem A. dest.


39

3.3.3 StandardpufferTE-Puffer

Tris-HCl (pH 7,5) 10 mM

Na-EDTA 1 mM

10 x TBE (pH 7,5)

Tris-HCl (pH 7,5) 0,9 M

Borsäure 0,9 M

EDTA 0,5 M

20 x SSC

NaCl 3 M

Natriumcitrat 0,3 M

PBS-Puffer (phosphatgepufferte Salzlösung)

NaCl 100 mM

NaH2PO4 x 2H20 100 mM

Na2HPO4 x 2H20 100 mM

3.3.4 Puffer und Lösungen für die Pulsfeld-GelelektrophoresePettIV-Puffer

1 M NaCl

10 mM Tris-HCl pH 8,0

10 mM Na-EDTA

Lyse-Puffer

1 M NaCl


200 mM Na-EDTA

0,5 % (w/v) N-Lauroylsarkosyl

0,2 % (w/v) Natriumdeoxycholat


40

Vor Gebrauch zuführen:

RNase 2 µg/ml

Lysozym 1 mg/ml

Mutanolysin 13 U/ml

Für die Lyse des Staphylokokken-Stammes DSM 1104 wurde an Stelle des

Mutanolysins Lysostaphin (1800 U/ml) eingesetzt.

ESP-Puffer

0,5 M Na-EDTA

1 % (w/v) N-Lauroylsarkosyl

kurz vor Gebrauch:

Proteinase K 1 mg/ml

TE-Puffer


1 mM Na-EDTA

TE-PMSF-Lösung


1 mM Na-EDTA

1,5 mM Phenylmethylsulfonsäurefluorid (PMSF)

PMSF wurde erst kurz vor Gebrauch zugeführt.

10 x TBE-Puffer

0,9 M Tris (ohne HCl)

0,9 M Borat

0,5 M EDTA (Na-frei)

0,5 x TBE-Puffer

0,45 M Tris (ohne HCl)

0,45 M Borat

1 mM EDTA (Na-frei)


41

Äquilibrierungspuffer

10 x Restriktionspuffer

(je nach eingesetztem Enzym) (Fa.Boehringer) 25,00 µl

Aqua dest 225,00 µl

Restriktionslösung

10 x Restriktionspuffer

(je nach eingesetztem Enzym) (Boehringer) 5,0 µl

Enzym 2,0 µl

Aqua dest 43,0 µl

3.3.5 Southern-BlottingDepurinationslösung

HCl 0,25 M


Denaturierungslösung

NaCl 1,5 M

NaOH 0,5 M


20 x SSC-Lösung

Natriumcitrat 300 mM

NaCl 3 M

Der Puffer wurde autoklaviert.

3.3.6 SondenhybridisierungHybridisierungs-Puffer

1,0 mM Na-EDTA

0,5 M Na2HPO4 (pH 7,2)

7,0 % Sodiumdodecylsulfat (SDS)


42

Waschlösung I

40 mM Na2HPO4 (pH 7,2)

1,0 mM Na-EDTA

5 % SDS

Waschlösung II

40 mM Na2HPO4 (pH 7,2)

1,0 mM Na-EDTA

1 % SDS


43

3.4 Kultivierung der BakterienDie verwendeten Bakterien-Stämme wurden auf Columbia-Blutplatten (Fa. OXOID)

über Nacht bei 37°C angezüchtet. Für die Kultivierung der Streptokokken wurde,

soweit nicht anders angegeben, Todd-Hewitt Broth (THB, Difco Laboratories, Detroit,

USA) zu 20 ml in 200 ml Erlenmeyerkolben verwandt. Die Kultivierung der

Staphylokokken wurde in Brain-Heart-Infusion (BHI, FA. Sigma) zu 20 ml in 200 ml

Erlenmeyerkolben durchgeführt.

3.5 SerotypisierungDie Serotypisierung wurde mit freundlicher Unterstützung durch Dr. H. Wisselink und

Dr. H. Smith ( ID-DLO Lelystad/Holland) durchgeführt.

Hierfür wurde die Objektträger–Latex-Agglutination durchgeführt, wie von VECHT et

al. (1985) beschrieben. Es standen Serotyp-spezifische Kaninchen-Antiseren gegen

die Sc. suis -Serotypen 1–28 zur Verfügung.

3.6 Untersuchung auf die Expression von MRP/EFDiese Arbeiten wurden mit freundlicher Unterstützung durch Dr. H. Wisselink und Dr.

H. Smith (ID-DLO Lelystad/Holland) durchgeführt. Hierfür wurde die

Natriumdodecylsulfat–Polyacrylamidgel–Elektrophorese (SDS-PAGE) nach

LAEMMLI (1970) im vertikalen Flachbett in einer Schichtdicke von 1,5 mm

durchgeführt. Als Positivkontrolle diente der Kulturüberstand des Sc. suis Stammes

Vecht 4005. Auf das Trenngel aus 6 % Polyacrylamid wurde das Probengel

bestehend aus 4 % Polyacrylamid mit 10 Geltaschen polymerisiert. Die

Probenauftragung erfolgte nach Mischung von 40 µl Probe mit 20 µl Probenpuffer

mittels einer Mikroliterspritze. Die Elektrophorese wurde 4 Stunden bei 5 mA/Gel

durchgeführt, bis die Lauffront ca. 1 cm über dem unteren Glasrand angelangt war.

Der Nachweis der Proteine erfolgte dann mittels Immunoblot-Analyse nach TOWBIN

et al. 1979. Hierbei wurden die im Polyacrylamidgel enthaltenen Proteine durch ein

elektrisches Feld auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Für den Transfer

wurde die Transfer-Zelle Multiphor II Nova Blot System (Pharmacia LKB, Uppsala,

Schweden) verwendet. Der Transfer erfolgte für 30 min. bei 10 V. Nach Ablauf dieser

Zeit wurde die Nitrozellulosemembran entnommen und über Nacht im Kühlschrank in

Blockpuffer gelegt. Am folgenden Tag wurde der Blockpuffer entfernt und die

Membran 3 x 10 min. unter leichtem Schwenken mit Waschpuffer gewaschen.


44

Anschliessend wurde der Blot mit einem monoklonalen Antikörper gegen MRP in

einer Verdünnung von 1 : 200 für 60 min inkubiert. Dann wurde der Blot mehrmals

mit Waschpuffer gewaschen, um überschüssige Antikörper zu entfernen.

Anschliessend wurden die Anti–Maus-Antikörper, die mit alkalischer Phosphatase

gekoppelt waren, in einer Verdünnung von 1 : 1000 zugegeben. Nach einer Stunde

wurde die Membran mehrmals mit Waschpuffer gewaschen und anschliessend

zweimal in Substratpuffer gewaschen. Es folgte die Zugabe des Substrates für die

Alkalische Phosphatase (Bromochloroindolylphosphat und Nitroblautetrazolium). Der

Blot wurde so lange entwickelt, bis der Hintergrund gerade noch nicht lila wurde.

Gestoppt wurde die Reaktion unter fliessendem Wasser. Nach Trocknung zwischen

zwei Filterpapieren wurde der Blot photografiert. Danach wurde der Blot in gleicher

Weise mit monoklonalen Antikörpern gegen das EF–Protein getestet und

anschliessend entwickelt und dokumentiert.

3.7 Hämolysin-NachweisHierfür wurde eine Modifikationen der Methode von FEDER et al. (1994) verwendet.

Dabei wurden die zu untersuchenden Sc. suis -Stämme wurden über Nacht auf

Trypsin-Soja-Agar bei 37°C kultiviert. Die Kolonien wurden mit eisgekühltem PBS-

Puffer abgeschwemmt, in eisgekühlte Eppendorfgefässe überführt und bei einer

Wellenlänge von 540 nm auf eine optische Dichte von 1,6 eingestellt. Nach

Inkubation der Bakteriensuspensionen für eine Stunde bei 40°C im Wasserbad

wurden die Bakterien-Suspensionen für 10 Minuten bei einer Temperatur von 4°C

abzentrifugiert (12000 x g). Der vorsichtig abgehobene Überstand wurde mittels

eines Nylonfilters mit einer Porenweite von 0,45 µm filtriert. Anschliessend wurde das

Filtrat bis zur Messung auf Eis aufbewahrt oder bei –70°C eingefroren.

Als Quelle für die zur Messung benötigten Erythrozyten wurde frisch gewonnenes

defibriniertes Hammelblut eingesetzt. Das Blut wurde bei 7°C und 3000 U/min

abzentrifugiert und so lange in 0,9 % kühler NaCl-Lösung resuspendiert, bis der

Überstand vollständig klar war. Anschliessend wurden die abzentrifugierten

Erythrozyten in einem Verhältnis von 1:100 mit 0,9 % kühler NaCl-Lösung verdünnt.

Anschliessend wurden je 100 µl der Erythrozytensupension pro Vertiefung einer 96-

well Rundboden-Mikrotiterplatte verteilt. Die verteilte Suspension wurde in einem

dreifachen Ansatz mit 100 µl des zuvor gewonnen Filtats versetzt und für zwei

Stunden bei 37°C und 6 % CO2 inkubiert. Anschliessend wurde die Mikrotiterplatte


45

für 10 Minuten mit dem Erythrozyten-Filtrat-Gemisch bei 4°C und 100xg zentrifugiert.

100 µl des Überstandes wurden in eine 96-well-Flachboden-Mikrotiterplatte

überführt. Anschliessend wurde mit PBS-Puffer eine geometrische Verdünnungsreihe

mit dem Faktor 2 in einem Volumen von 100 µl/Vertiefung hergestellt. Die

hämolytische Aktivität wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 410 nm

ermittelt (Dynatech ELISA-Reader). Als Referenzwert galt die hämolytische Aktivität

des Sc. suis-Hämolysin Referenz-Stammes P1/7 (T. Alexander, Universität

Cambridge, UK), aus dem das Suilysin-Gen isoliert und charakterisiert wurde

(SEGERS et al. 1998).

Mit Hilfe eines PC-gestützten ELISA-Programmes (erstellt von Herrn Dr. B. Franz,

Tierärztliche Hochschule Hannover) wurden aus den gemessenen Extinktionen

hämolytische Einheiten nach der Referenz-Standard-Methode berechnet.

Bei dieser Berechnung stellte die hämolytische Aktivität des Sc. suis –Hämolysin

Referenz-Stammes P1/7 den Referenzwert dar, welcher eine fiktive Aktivität von 100

hämolytischen Einheiten erhielt. Die Extinktion der hämolytischen Aktivität der zu

untersuchenden Stämme wurden mit der Extinktion des Referenzstammes verglichen

und damit eine zum Referenzstamm relative hämolytische Aktivität berechnet. Dabei

wurden zunächst von allen Werten einer Platte die Extinktionswerte des Leerwertes

subtrahiert. Anschliessend wurden die korrigierten Extinktionswerte sowie die

dazugehörigen Verdünnungsstufen des Überstandes dekadisch logarithmiert und die

Regressionsgerade berechnet. Aus dieser Regressionsgeraden wurde die Steigung

(as), der y-Achsenabschnitt (bs) und der Variationskoeffizient (VK) berechnet. Die

hämolytischen Einheiten der Überstände wurden in der jeweiligen Verdünnungsstufe

nach folgendem Algorithmus berechnet:

( )

−∗

∗=−

S

SP

P

abODlog

10

10VEinheitenheHämolytisc

Verdünnungp = Verdünnungsfaktor ProbeODp= Extinktion der Probebs= y-Achsenabschnitt der Referenzgeradenas= Steigung der Referenzgeraden

Der Mittelwert der errechneten hämolytischen Einheiten in den jeweiligen

Verdünnungsstufen aus dem linearen Bereich wurde als die hämolytische Aktivität

der entsprechenden Probe für die Auswertung verwendet. Dabei wurden die Stämme

mit weniger als 10 hämolytischen Einheiten als Hämolysin-negativ bezeichnet. Die


46

Stämme zwischen 10 und 80 hämolytische Einheiten wurden als zweifelhaft positiv,

Stämme mit über 80 hämolytischen Einheiten als Hämolysin-positiv bezeichnet.

3.8 Adhärenz-Untersuchungen

3.8.1 ZellkulturDie beiden verwendeten Zelllinien wurden in DMEM – Zellkultur-Medium bei 8% CO2

und 37 °C kultiviert. Die Epithelzellen wachsen adhärent auf der Oberfläche der

Kulturgefässe, so dass ein Wechsel des Zellkulturmediums leicht erfolgen kann. Alle

2-3 Tage wurde ein Mediumwechsel mit 10 – 15 ml DMEM pro Schale durchgeführt.

Nach Ausbildung eines Monolayer wurden die Zellen neu ausgesät. Dazu wurden die

Zellen nach Absaugen des Mediums mit 3 ml 37°C warmem Trypsin-EDTA für 5

Minuten bei 8% CO2 und 37°C inkubiert. Die Trypsin-EDTA-Lösung wurde durch

Zugabe von 10 ml DMEM ausverdünnt. Durch diese Behandlung war es möglich, die

Zellen mittels Kulturmedium von der Plastikoberfläche abzuspülen. Diese so

gewonnene Zellsuspension wurde auf mehrere neue Schalen mit frischem Medium

ausgesät und wie zuvor bei 8% CO2 und 37°C kultiviert.

Für die Konservierung wurden die Zellen, wie zuvor beschrieben, in Kultur

angezogen, bis sich ein Monolayer gebildet hatte. Anschliessend wurden sie mit

Trypsin geerntet (siehe oben) und für 5 Minuten bei 1000 x g abzentrifugiert. Das

entstandene Pellet wurde in eiskaltem Einfriermedium (Cell Culture Freezing

Medium, Fa. GIBCO) resuspendiert, umgehend in Cryoröhrchen aliquotiert und auf

4°C gekühlt. Nach Beendigung der Aliquotierung wurden die Zellen zunächst über

Nacht in einer geschlossenen Styropor-Box bei –80°C eingefroren und

anschliessend in flüssigen Stickstoff überführt.

3.8.2 Vorbereitung der Zellen für den AdhärenzversuchKurz vor der Ernte der Zellen wurden diese nach Entfernen des Mediums mit 3 ml

37°C warmem Trypsin-EDTA für 5 Minuten bei 8% CO2 und 37°C inkubiert. Nach

Ablösen der Zellen wurden die Zellen mit DMEM mit 10% FCS vorsichtig

resuspendiert und für 5 Minuten bei 1000 x g abzentrifugiert. Nach einer weiteren

Resuspendierung wurde die Zellzahl in einer Neubauer-Zählkammer ermittelt und die

Zellen anschliessend mittels warmem DMEM auf eine Konzentration von 2 x 105

Zellen/ml eingestellt.


47

Von dieser Suspension wurden in einer 24-well-Platte, in welcher zuvor je ein

Deckgläschen (Durchmesser = 10 mm) verbracht worden war, pro Vertiefung je 0,5

ml ausgesät und über Nacht bei 8% CO2 und 37°C bebrütet, bis sich ein konfluenter

Zellrasen gebildet hatte.

3.8.3 Vorbereitung der Bakterien für den AdhärenzversuchDie für den Adhärenz-Versuch ausgewählten Sc. suis -Stämme wurden über Nacht

auf Columbia-Blutplatten bei 37°C kultiviert. Anschliessend erfolgte jeweils eine

Anzüchtung mehrerer Einzelkolonien in 3 ml THB-Medium für 4 Stunden bei 37°C.

Diese Vorkultur wurde in einen Erlenmeyerkolben mit 30 ml THB-Medium überführt

und für 18 Stunden in einem Schüttel-Inkubator bei 37°C inkubiert. Diese

Bakteriensuspension wurde für 15 min. bei 3000 x g und 4°C abzentrifugiert, der

Überstand wurde abgekippt, sorgfältig in 5 ml eisgekühltem PBS-Puffer re-

suspendiert und erneut für 15 Minuten bei 3000 x g und 4°C abzentrifugiert. Dieser

Waschvorgang wurde ein weiteres Mal wiederholt. Nach einer weiteren

Resuspendierung des Pellets in PBS-Puffer wurde die Suspension auf eine

Transmission von 1,0 bei einer Wellenlänge von 660 nm verdünnt, was einer

Bakteriendichte von ca. 5 x 108 Bakterien/ml entsprach. Diese eingestellte

Bakteriensuspension wurde ein weiteres Mal für 15 Minuten bei 3000 x g und 4°C

abzentrifugiert, der Überstand wurde sorgfältig abpipettiert, das Bakterienpellet in 1,0

ml DMEM resuspendiert und bis zur Inkubation der Zellen auf Eis gehalten.

3.8.4 AdhärenzversuchDie vorbereiteten Epithelzellen wurden vor der Infektion zweimal mit DMEM ohne

jegliche Zusätze gewaschen. Dazu wurde zu Beginn das Medium abgesaugt und

durch 0,5 ml 37°C warmes DMEM ersetzt, vorsichtig geschwenkt und wieder

vollständig abgesaugt. Nach einer weiteren Waschung wurde das abgesaugte

Medium durch 0,5 ml der unmittelbar zuvor auf 37°C erwärmten Bakteriensuspension

ersetzt. Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde bei 37°C und 8% CO2 wurden

die Vertiefungen dreimal mit je 1 ml PBS-Puffer gewaschen. Nach dem letzten

Waschschritt wurde der PBS-Puffer durch 1 ml 3,7% Formaldehyd in PBS-Puffer

ersetzt und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um die Zellen und die

adhärenten Bakterien zu fixieren. Nach Absaugen des Formaldehyd-Puffers wurden

die Zellen gefärbt. Als Färbelösung wurde Giemsa verwendet. Dabei wurde zuvor die


48

Giemsafarblösung mit PBS-Puffer in einem Verhältnis von 1:10 verdünnt. Dieser

verdünnte Farbstoff wurde auf die fixierten Zellen gegeben und für 30 Minuten auf

den Zellen belassen. Anschliessend wurde die Färbelösung abgesaugt und die

Vertiefung einmal mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Glasplättchen wurden

vorsichtig aus den Vertiefungen entfernt und auf einen, mit einem Tropfen Moviol

(FA. MERCK) beschickten Objektträger mit der Zellschicht nach unten verbracht. Mit

leichtem Druck wurde das Moviol auf die ganze Fläche des Glasplättchen verteilt. Die

Ränder des Glasplättchen wurden dann mit durchsichtigem Nagellack versiegelt.

Die mikroskopische Untersuchung erfolgte in Hellfeld-Mikroskop (FA. LEICA) mit

einer 630 fachen Vergrösserung, die Dokumentation mit einer Digital-Kamera (FA.

LEICA).

3.9 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE)Bei dieser Methode wird intakte bakterielle Gesamt-DNA mit selten schneidenden

Enzymen in eine überschaubare und für eine epidemiologische Auswertung

genügende Anzahl von Fragmenten zerlegt, die dann in einer PFGE aufgetrennt

werden. Die so entstandenen Bandenmuster erlauben Verwandtschaftsvergleiche

zwischen den einzelnen Isolaten.

3.9.1 Präparation intakter Gesamt-DNA von Sc. suis

Die Präparation erfolgte mit Abweichungen den Angaben von OLSEN et al. (1984).

Die zur DNA-Extraktion ausgewählten Sc. suis-Stämme wurden auf Columbia-

Blutplatten über Nacht bei 37°C kultiviert. Anschliessend erfolgte jeweils eine

Anzüchtung mehrerer Einzelkolonien der Isolate in 3 ml THB-Medium für 4 Stunden

bei 37°C. Diese Vorkultur wurde in einen Erlenmeyerkolben mit 30 ml THB-Medium

überführt und für 18 Stunden in einem Schüttel-Inkubator bei 37°C inkubiert.

Danach wurden 5 ml der Bakterien-Suspension mit THB-Medium auf eine optische

Dichte von 0,3 (Wellenlänge von 576 nm) eingestellt. Diese Bakteriensuspension

wurde für 15 Minuten bei 3000 x g und 4°C abzentrifugiert, der Überstand abgekippt,

sorgfältig mit 5 ml eisgekühltem PettIV-Puffer resuspendiert und erneut für 15

Minuten bei 3000 x g und 4°C abzentrifugiert. Der Überstand wurde wiederum

dekantiert und die verbliebene Flüssigkeit sorgfältig mit der Pipette entfernt. Das

Bakterienpellet wurde in 0,5 ml PettIV-Puffer resuspendiert und im Wasserbad auf

37°C erwärmt. Zu dieser vorgewärmten Bakteriensuspension wurden 0,5 ml 1,2 %


49

Agarose (in H2O gelöst) hinzugegeben und gut vermischt. Dieses Bakterien-Agarose-

Gemisch wurde in Giessförmchen mit einem Volumen von 100 µl portioniert und bis

zum Erstarren der Blöckchen für 10 Minuten im Kühlschrank aufbewahrt.

In sterilen Polypropylenröhrchen wurden pro 5 Agaroseblöckchen jeweils 3 ml

Lyselösung (Lyse-Puffer + Lysozym, Mutanolysin und RNase) vorgelegt. Die

Blöckchen wurden für zwei Stunden bei 37°C in Schräglage in der Lyselösung

inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde die Lyselösung gegen 3 ml ESP-Lösung

ausgetauscht und über Nacht bei 56°C inkubiert.

Am folgenden Tag wurde die ESP-Lösung dekantiert, und die Blöckchen wurden mit

3 ml H2O für 15 Minuten bei Raumtemperatur sanft in der Waagerechten

geschwenkt. Nach Ersetzen des H2O durch je 2 ml TE-PMSF-Lösung schloss sich

eine 30minütige Inkubation bei Raumtemperatur mit konstantem sanftem

waagerechtem Schwenken an. Dieser Schritt wurde wiederholt, und im Anschluss

daran wurde statt der TE-PMSF-Lösung wieder H2O zugegeben und für 15 Minuten

bei Raumtemperatur und konstanten sanften waagerechten Schwenken gewaschen.

Zur Entfernung aller Zelltrümmer folgten drei jeweils 30minütige Waschschritte mit

3ml TE-Puffer, wobei die Röhrchen wiederum bei Raumtemperatur in der

Horizontalen geschwenkt wurden. Die nach diesen Spülungen mit jeweils 5 ml Te-

Puffer versetzten DNA-haltigen Agaroseblöckchen wurden über Nacht bei 4°C

gelagert.

Danach wurde jeweils ein dünnes Stückchen (ca. 0,5 mm dick) eines Agarose-

Blöckchens mit einem sterilen Skalpell abgeschnitten und mit einem Glashäkchen

zur Vorbereitung des Restriktionsverdaus in eine Äquilibrierungslösung, bestehend

aus 225 µl autoklaviertem bidestilierten Wasser und 25 µl zehnfach konzentriertem

Enzympuffer, verbracht. Die Äquilibrierungslösung wurde nach einstündiger In-

kubation bei Raumtemperatur abgesaugt, und auf jedes Gelstückchen wurden 50 µl

einer vorbereiteten Restriktionsenzym-Puffer-Lösung mit folgender

Zusammensetzung pipettiert:

Für den Restriktionsverdau mit SmaI:

5 µl 10 x Puffer A (Boehringer)

2 µl SmaI (10 U/µl) (Boehringer)

43 µl Aqua dest.


50

Für den Restriktionsverdau mit ApaI :

5 µl 10 x Puffer A (Boehringer)

2 µl ApaI (10 U/µl) (Boehringer)

43 µl Aqua dest.

Die Restriktionsverdaus wurden für je 4 Stunden bei 37°C durchgeführt.

3.9.2 Auftrennung der verdauten Gesamt–DNA von Sc. suis mittels PFGEDie Agaroseblöckchenstreifen, in denen die zuvor mittels Restriktionsverdau

geschnittene DNA fixiert war, wurden in die Geltaschen eines 0,8 % igen Agarose-

gels verbracht und die Geltaschen mit der gleichen Agarose, welche zum Giessen

der Blöckchen verwendet worden ist, luftblasenfrei verschlossen. Das Gel wurde in

die Elektrophorese-Kammer, die zuvor mit 3 l 0,5 x TBE-Puffer befüllt worden war,

gelegt und der Separierungsprozess nach vorher programmierten Bedingungen

gestartet. Die Temperatur, Spannung und der eingeschlossene Winkel wurden

folgendermassen gewählt:

Temperatur: 10°C

Spannung: 6 V/cm

Eingeschl. Winkel: 120°

Auftrennung von SmaI-Fragmenten: Pulsrahmen:

Block I: 2-5 Sekunden über 11 Stunden

Block II: 20-40 Sekunden über 13 Stunden

Auftrennung von ApaI-Fragmenten: Pulsrahmen:

Block I: 2-4 Sekunden für 8 Stunden

Block II: 7-12 Sekunden für 10 Stunden

Nach Beendigung des jeweiligen Elektrophoreselaufs wurde das Gel aus der

Kammer entfernt, drei Minuten in einer Ethidiumbromid-Lösung gefärbt und ca. 15

Minuten in Aqua bidest. entfernt. Danach wurde es unter UV-Beleuchtung

photografiert und mittels eines Geldokumentationssystems (BioRad MultiAnalyst)

dokumentiert.


51

3.9.3 Erstellung eines Größenmarkers für die PFGEAufgrund der ausgeprägten Grössenunterschiede der speziellen

Restriktionsfragmente, welche in der PFGE auftraten, waren kommerziell erhältliche

Standards als Grössenmarker nicht geeignet. Daher musste ein Grössenmarker

erstellt werden, mit welchem alle Fragmente, die in der PFGE bei Sc. suis auftraten,

bestimmt werden konnten. Dazu wurde die DNA des Staph. aureus-Stammes DSM

1104 wie bei der Präparation intakter Gesamt-DNA von Sc. suis für die Auftrennung

mittels der PFGE aufbereitet, wobei bei der Aufschliessung der Bakterienzellwand

statt des Mutanolysin Lysostaphin eingesetzt wurde. Anschliessend wurde die intakte

Staph. aureus-DNA mit dem Restriktionsenzym SmaI verdaut, und die entstandenen

Fragmente wurden mittels PFGE aufgetrennt. Als Grössenstandard zur Ermittlung

der Fragmentgrössen wurden eine λ-Phagen-„Ladder“ für den Bereich von 48,5 kBp

bis 776 kBp und ein 5-kBp-DNA-„Ladder“ für den Bereich von 5 kBp bis 40 kBp

verwendet.

Die Auftrennung der Fragmente erfolgte in einem 1 %igen Agarosegel

Temperatur: 10°C

Spannung: 6 V/cm

Eingeschl. Winkel: 12°

Auftrennung der SmaI-Fragmente: Pulsrahmen:

Block I: 2-5 Sekunden über 11 Stunden

Block II: 20-40 Sekunden über 13 Stunden

Nach Beendigung des Elektrophoreselaufs wurde das Gel aus der Kammer entfernt,

drei Minuten in einer Ethidiumbromid-Lösung gefärbt und ca. 15 Minuten in Aqua

bidest. gewaschen, ehe es unter UV-Beleuchtung fotografiert und mittels eines

Geldokumentationssystems (Bio-Rad MultiAnalyst) dokumentiert wurde.

3.10 Herstellung der Hämolysin-SondeDie Sonde wurde mittels PCR (Polymerasekettenreaktion) nach DNA-Isolierung

amplifiziert, isoliert und markiert.

3.10.1 DNA-ExtraktionDer zur DNA-Extraktion ausgewählte Sc. suis-Stamm (I9841/1 und D 282) wurde auf

Columbia-Blutplatten (FA. OXOID) über Nacht bei 37°C kultiviert. Aus dieser Platte


52

wurden mehrere Kolonien in 50 ml THB-Medium über Nacht bei 37°C kultiviert. Diese

Bakteriensuspension wurde mit THB-Medium 1:10 verdünnt. Die verdünnte

Suspension wurde bis zu einer optischen Dichte von 0,7 – 0,8 ( Wellenlänge: 660

nm) kultiviert. Zwei ml dieser Suspension wurden für 10 min. und 4°C bei 8000 x g

zentrifugiert, anschliessend dekantiert und getrocknet. Diese Pellets wurden in

4937,5 µl Muramidase-Puffer und 62,5 µl Mutanolysin (Stocklösung 13U/ml,1:80

Verdünnung) aufgenommen und für zwei Stunden bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert.

Danach wurde die Suspension wiederum für 10 min. und 4°C bei 8000 x g

zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet in 550 µl (275 µl

H2O und 275 µl 2xTEN – Lysozym-Lösung) für 30 Minuten bei 37°C im Wasserbad

resuspendiert.

Nach Zugabe von 15 µl 20 %igem SDS und 10 µl Proteinase K–Lösung

(Konzentration 20 mg/ml) wurde die Suspension vorsichtig mit der Hand gemischt,

um die intakten DNA-Stänge nicht durch Scherkräfte zu zerstören, und

anschliessend für eine Stunde bei 37°C im Wasserbad inkubiert.

Im Anschluss wurden 125 µl einer 4 M NaCl-Lösung zugegeben, vorsichtig gemischt

und danach 80 µl CTAB zugeführt. Dann wurde für 10 Minuten bei 65°C im

Wasserbad inkubiert. Nach der Zugabe von 780 µl Chloroform/ Isoamylalkohol (24:1)

wurde die Suspension vorsichtig gemischt, bis sie vollständig milchig-trüb erschien

und anschliessend für 5 Minuten bei Raumtemperatur bei 6000 x g zentrifugiert. Der

visköse Überstand wurde abgenommen und in ein neues Gefäss überführt. Dabei

musste darauf geachtet werden, dass keine Bestandteile aus der Interphase mit

überführt werden. Diesem Überstand wurden 780 µl eines Phenol/

Chlorophorm/Isoamylalkohol-Gemisch (25:24:1) zugeführt und vorsichtig gemischt.

Dieses Gemisch wurde vorsichtig in der Hand gekippt und anschliessend bei 6000 x

g für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde wiederum in ein neues Gefäss

überführt, 500 µl Isopropanol wurden zugeführt, vorsichtig gemischt, und

anschliessend wurde für 10 Minuten bei 6000 x g zentrifugiert.

Nach erneutem Abnehmen des Überstandes wurden 500 µl 80 % Ethanol zu-

gegeben, vorsichtig gemischt und anschliessend für 5 Minuten bei 6000 x g

zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand abpipettiert, verworfen

und das Pellet im Exikator getrocknet. Für die Aufbewahrung wurde das Pellet in 100

µl TE-Puffer gelöst und bei –20°C gelagert.


53

3.10.2 Amplifikation der Sonde mittels PCRBei einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) handelt es sich um eine Methode zur

Amplifizierung von spezifischen DNA-Fragmenten. Dadurch ist es möglich, selektiv

bestimmte DNA-Fragmente aus sehr geringen DNA-Mengen anzureichern (SAIKI et

al. 1985). Mit dieser Methode kann also schnell ein gezieltes DNA-Stück hergestellt

werden, welches später nach entsprechender Weiterverarbeitung zum Beispiel als

Gen-Sonde eingesetzt werden kann. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die PCR zur

Herstellung der Gensonde wie folgt durchgeführt:

Als Matrix-DNA diente die zuvor vom Sc suis Stamm I9841/1 extrahierte DNA. Es

wurden jeweils 50 µl-Ansätze gewählt und folgendermassen zusammengesetzt:

4 dNTPs je 10 nmol (f.c. 0,2 mM je dNTP)

10xPCR-Puffer 5 µl

Matrizen-DNA 5 µl (ca. 25 ng)

Primer I 50 pmol (f.c.1 µM)

Primer II 50 pmol (f.c.1 µM)

Taq-Polymerase 1 U (O,75 µl)

Aqua bidest ad 50 µl

Nach kurzem Anzentrifugieren wurde der Ansatz mit ca. 50 µl Mineralöl

überschichtet. Die Ansätze wurden in den Thermocycler gestellt und das folgende

Programm wurde gestartet:

1.) Initiale Denaturierung der DNA 2 min 94°C

2.) Amplifikationszyklen (insgesamt 35 Zyklen): 1 min 90°C

2 min 60°C

3 min 72°C

3.) Abschliessende Extension 8 min 72°C

Verwendete Primer:

Primer I: 5‘ – GGG AAT TCC ATA TGA GAA AAA GTT CGC ACT TGA TTT T - 3‘

Primer II: 5‘ – CGG GAT CCT TAC TCT ATC ACC TCA TCC GCA TAC T – 3‘

Nach Beendigung der Extension wurde das PCR-Produkt auf 4°C abgekühlt. Das

Ergebnis der Reaktion wurde auf Agarosegelen überprüft.

3.10.2.1 Auftrennung des PCR-Produktes mittels GelelektrophoreseZur Überprüfung des PCR-Produktes wurden diese mittels Gelelektrophorese

aufgetrennt und anschliessend angefärbt. Dazu wurde ein 0,8 %iges Agarosegel mit


54

0,5 % TBE-Puffer hergestellt. Hierzu wurden 0,24 g einer „Multi-Purpose-Agarose“

mit 30 ml 0,5 % TBE-Puffer kurz aufgekocht, bis sich die Agarose gelöst hatte.

Anschliessend wurde kurz vor Erhärten der Agarose diese mit 0,5 µg

Ethidiumbromid/ml Puffer versehen, gut gemischt, in den Gelschlitten der

Elektrophorese-Kammer gegossen und der Kamm zur Erstellung von Geltaschen in

die noch flüssige Agarose gesteckt. Nach Erkalten der Agarose wurde der Kamm

entfernt und die Kammer mit dem Laufpuffer beschickt, bis das Gel vollständig

bedeckt war. In die erste Tasche wurden als Grössen-Marker 5 µl mit Hind III

verdaute λ-DNA-„Ladder“ gegeben, in die restlichen Taschen das PCR-Produkt.

Sämtliche Proben inklusive des Markers wurden zuvor in einem Verhältnis von 5:1

mit einem Farbstoff (Bromphenolblau) versehen, welcher zur Beschwerung der

Proben und zur Sichtbarmachung der Lauffront der DNA im Gel benutzt wurde. Die

Lauffront des Farbstoffes entspricht etwa der Lauffront eines doppelsträngigen DNA-

Fragmentes von 0,5 kBp.

Der Lauf erfolgte unter einer anfänglichen Spannung von 25 Volt die auf 50 Volt

erhöht wurde, nachdem die Front des Probenfarbstoffes aus den Geltaschen ins Gel

gewandert war. Nach etwa 75 Minuten wurde die Auftrennung gestoppt, und die im

Gel aufgetrennten Fragmente wurden mit UV-Licht (254 nm) sichtbar gemacht und

mittels einer Polaroid-Kamera bzw. mit einem Geldokumentationssystem ( Bio-Rad

MultiAnalyst-System) photografiert.

3.10.2.2 Isolierung des PCR-Produktes aus dem Agarose-GelNach der elektrophoretischen Auftrennung der DNA-Fragmente, die zur Herstellung

der Hämolysinsonde verwendet werden sollten, wurden diese mittels GeneClean II

Kit aus dem Gel gereinigt. Dabei wurde mit einer sterilen Skalpell-Klinge das

Gelblöckchen mit dem zu isolierenden DNA-Fragment ausgeschnitten und in

viereinhalbfachem Volumen NaJ-Lösung und ½ Volumen „TBE-Modifier“ bei 55°C

geschmolzen. Nach der Zugabe von Glasmilch (5 µl je 5 µg DNA) erfolgte die

Bindung der DNA an die Glasmatrix für mindestens 5 Minuten bei leichten

Schwenkbewegungen. Die so gebundene DNA wurde anschliessend für 10 sec. bei

12000 x g sedimentiert und dreimal mit 500 µl eisgekühlter „New-Wash-Lösung“

gewaschen. Der Überstand wurde nach dem letzten Waschschritt sorgfältig

abpipettiert. Die DNA wurde mit 15-20 µl A. bidest von den Glaspartikeln abgelöst.

Nach Abzentrifugation der Glasfragmente wurde das die DNA-Fragmente


55

enthaltende Eluat in ein neues Eppendorf-Reagenzgefäss überführt und bis zur

weiteren Verwendung bei –20°C aufbewahrt.

3.11 Southern-Hybridisierung

3.11.1 Southern-BlottingDer DNA-Transfer aus Agarose-Gelen auf eine Nylonmembran erfolgte als

Kapillarblot. Zu Beginn wurde das Agarose-Gel mit zur Markierung aufgelegtem

Lineal unter UV-Licht photografiert, um nach der Hybridisierung die entstandenen

Markierungen den in der Elektrophorese entstandenen Banden zuordnen zu können.

Anschliessend wurde das Gel zweimal jeweils für 20 Minuten in 0,25 M HCl

gewaschen. Nach zweimaligem Spülen in A. bidest folgten zwei Waschungen für je

15 Minuten in einer Denaturierungs-Lösung, bestehend aus 1,5 M NaCl und 0,5 M

NaOH, um eine alkalische Denaturierung der DNA zu erreichen. Der Kapillarblot-

Aufbau wurde nach den Angaben von SAMBROOK et al. (1989) durchgeführt. Als

Transferpuffer diente 20 x SSC-Lösung. Die Übertragung der DNA erfolgt bei

Raumtemperatur über Nacht. Am darauffolgenden Tag wurden die linke obere Ecke

und die Probentaschen des Gels auf der Membran markiert. Nach der Trennung der

Membran von dem Gel wurde die Membran für 5 Minuten mit 0,5 M Tris-HCl (pH 7,0)

neutralisiert und anschliessend für 5 Minuten in 2 x SSC-Lösung entsalzt. Die auf die

Membran „geblottete“ DNA wurde schliesslich für zwei Stunden bei 80°C auf der

Membran fixiert.

3.11.2 Radioaktive Markierung der Sonde mit 32PhosphorDie radioaktive Markierung der Sonde erfolgte mittels einer Nick-Translation (Fa.

GIBCO Life Technologies, Karlsruhe). Etwa 1 µg der DNA wurden in 5 µl der Lösung

A2 des Nick-Translations-Kits (dNTP-dCTP), 5 µl α32P dCTP, 5 µl Polymerase des

Nick-Translations-Kit (DNA/Polymerase DNase I) aufgenommen und bis zu einem

Gesamtvolumen von 50 µl mit H2O aufgefüllt, gemischt und bei 15°C für 90 Minuten

inkubiert. Der Reaktionsstopp erfolgte mittels Zugabe von 2 µl 0,5 M EDTA pH 8,0.

Die entstandenen DNA-Stränge wurden mit 50 µl Phenol aus dem Reaktionsgemisch

extrahiert.


56

Um die freien Nukleotide abzutrennen, wurde der Ansatz anschliessend über eine

Sephadex G 50 Säule (NickTM Column, PHARMACIA) aufgereinigt. Zunächst wurde

die Säule mit 3 ml TE-Puffer äquilibriert, im Anschluss wurde die radioaktive Probe

aufgetragen. Nach einer Waschung mit 400 µl TE-Puffer erfolgte die Elution der

Sonde mit 450 µl TE-Puffer. Zur Überprüfung der erfolgten Nick-Translation wurde

die Intensität der Radioaktivität der Sonde durch die Messung von 2 µl-Sonde im β-

Szintillationszähler ermittelt.

3.11.3 Hybridisierung und SignaldetektionBei der Hybridisierung erfolgt über spezifische Basenpaarung die Ausbildung eines

Hybridmoleküls. Dieses besteht aus einer markierter Gensonde (in diesem Falle der

Hämolysin-Sonde) und dem nachzuweisenden Fragment der Ziel-DNA.

Zunächst wurde die Membran mit der Auftragungsseite nach oben in eine

Hybridisierungsflasche verbracht und anschliessend in einem Volumen von 1 ml

Hybridisierungspuffer pro 10 cm2 Filterfläche für 2-3 Stunden bei 65°C prähybridisiert.

Der Prähybridisierungpuffer wurde durch frischen Hybridisierungspuffer mit zuvor

denaturierter SS-DNA und denaturierter radioaktiv markierter Sonde (ca. 2,5–3 x 106

cpm/ml) ersetzt. Die SS-DNA und die DNA-Sonde wurden zuvor für 15 Minuten bei

95°C im Thermoblock denaturiert.

Die Hybridisierung erfolgte in einem Volumen von 0,3 ml des mit der Sonde

ergänzten Hybridisierungspuffers pro 10 cm2 Filterfläche über Nacht bei 65°C und

Rotation (ca. 10 x rpm). Nach der erfolgten Hybridisierung wurde der radioaktive

Puffer abgenommen und der Filter zur Entfernung der unspezifisch gebundener

DNA-Moleküle in 50 ml Waschlösung I für 15 Minuten bei 65°C gewaschen.

Anschliessend wurde der Filter dreimal mit je 50 ml Waschlösung II für jeweils 15

Minuten bei 65°C und einmal kurzzeitig mit 2 x SSC bei Raumtemperatur gewaschen

und nach Abtropfen in Frischhaltefolie eingewickelt.

Die Darstellung der hybridisierten Banden erfolgte mittels Autoradiografie auf einem

Röntgenfilm mit Verstärkerfolie bei –70°C.


57

3.12 Statistische Auswertung

3.12.1 Logistische RegressionRegressionsmodelle werden verwendet, um den Zusammenhang zwischen einer

Einflussvariablen und einer Zielvariablen in einer mathematischen Gleichung

darstellen zu können (KREIENBROCK u. SCHACH, 1997). Dieser Gleichungs-

zusammenhang sollte für die gesamte Population der Grundgesamtheit seine

Gültigkeit haben. Statistische Modelle zur Beschreibung einer Ursache-Wirkung-

Beziehung haben die allgemeine Form:

Y = Funktion (X(1),X(2),...,X(m))

Hierbei bezeichnet Y die Zielvariable, die durch m Einflussvariablen (X(1),X(2),...,X(m))

und einer spezifizierenden Funktion beeinflusst wird. Bei der Logistischen

Regression wird nicht mehr direkt die Zielvariable, sondern die Wahrscheinlichkeit,

dass die Zielvariable eine gewisse Ausprägung annimmt, modelliert. Da die

Wahrscheinlichkeit einen Wert zwischen Null und Eins darstellt, muss somit auch die

Funktion der Einflussvariablen zwischen Null und Eins beschränkt sein. Dies führt bei

der Logistischen Regression zu folgender Modellierung der Wahrscheinlichkeit unter

der Bedingung des Vorliegens der Einflussvariablen X(1),X(2),...,X(m)

( ) ( )( ) ( )( )

( ) ( )( )mm

11

mm

11

m1

bX...bXaexp1bX...bXaexp

)X,...,X1Y(P++++

+++==

Die in diesem Modell spezifizierten Parameter bi können in sogenannte Odds Ratios

überführt werden.

3.12.2 Odds RatioDas Odds Ratio ergibt sich aus dem Begriff der Chance (KREIENBROCK u.

SCHACH, 1997). Allgemein wird das Odds der Wahrscheinlichkeit P ausgedrückt als

( )P1

PPOdds−

=


58

d. h. als Wahrscheinlichkeit zur Gegenwahrscheinlichkeit. Dies wird im

Umgangssprachlichen auch als Chance bezeichnet. Betrachtet man nun das Odds

unter einer Bedingung, dass eine Einflussvariable auftritt bzw. nicht auftritt, so ergibt

sich hieraus als Chancenverhältnis das Odds Ratio (OR):

))0X1Y(P(Odds))1X1Y(P(Odds

OR====

=

Hierbei ist )1X1Y(P == die Wahrscheinlichkeit, dass ein Ereignis auftritt unter der

Bedingung, dass eine Einflussvariable x auftritt. Das Odds Ratio ist ein Parameter,

der Werte zwischen Null und ∞ annehmen kann. Ist OR = 1, so ist die Chance eines

Eintritts eines Ereignisses unter Einflussvariable und Nicht-Einflussvariable gleich,

und man unterstellt keinen Einfluss auf das Ereignis. Wird OR > 1, so ist die Chance

eines Eintritts eines Ereignisses unter der Einflussvariablen grösser als unter Nicht-

Einflussvariablen.

Das Odds Ratio wurde in dieser Arbeit dazu verwendet, die Chance auszudrücken,

wie gross die Wahrscheinlichkeit ist, hochvirulente Isolate in Hinblick auf

phänotypische und genotypische Eigenschaften zu erkennen.

3.12.3 Fragmentmuster und Dendrogramm-ErstellungDurch den Vergleich der Grösse und der Anzahl der bei der PFGE entstandenen

DNA-Fragmentmuster können genetische Ähnlichkeiten der verwendeten Isolate

abgeschätzt werden (RÖMLING et al. 1992).

Die Grössen der bei der PFGE entstandenen DNA-Fragmente wurden mittels eines

Computers und der Software MULTI ANALYST (BioRAD) ermittelt. Diese Daten

wurden mit dem Tabellenkalkulationsprogramm Microsoft Excel (FA. MICROSOFT)

grafisch dargestellt.

Um eine Schätzung vornehmen zu können, muss eine ausreichend grosse Anzahl

von sichtbaren Fragmenten vorhanden sein (EL-ADHAMI et al. 1991).

Durch die Standardisierung der Laufbedingungen, den Einsatz eines Längen-

standards sowie der dreimaligen Wiederholung wurde der Vergleich von Gelen

unterschiedlicher Läufe ermöglicht.

Um Fehler bei der Erfassung der Fragmente zu verhindern, wurden die Fragmente

unter Sicht ausgewertet und digital dargestellt. Die Dendrogramme zur Darstellung

von Ähnlichkeiten wurden mit der Software GEL-COMPAR (HEROLAB) erstellt.


59

Dabei beinhaltet die Dendrogramm-Erstellung (“Clustering“) zwei Schritte (siehe

Punkt 2.12.3.1 und 2.12.3.2).

3.12.3.1 Ähnlichkeitskalkulation zwischen möglichen Paaren der IsolateDie Kalkulation der Ähnlichkeitsmatrix basiert auf dem von DICE (1945)

beschriebenen Ähnlichkeitsmass Fxy:

yx

xyxy nn

n2F

+=

nxy = Anzahl der Banden bzw. Fragmente, die in beiden Mustern gleich istnx = Anzahl der Banden bzw. Fragmente in der Spur von Isolat xny = Anzahl der Banden bzw. Fragmente in der Spur von Isolat y

Hierbei werden Übereinstimmungen zwischen den Anordnungen der Werte kalkuliert.

Diese Ähnlichkeitsmatrix sowie die nachfolgende Clusteranalyse nach dem

Verfahren der „Avarage Linkage Between Groups-Methode“ wurden mit Hilfe eines

Computers und der Software Gel-Compar (HEROLAB) durchgeführt

3.12.3.2 Cluster-Analyse der Matrix ähnlicher Werte.Die Clusteranalyse wurde mittels des Verfahrens UPGMA („Unweighted Pair Group

Methode using Arithmetic Average“) durchgeführt. Dabei werden die arithmetischen

Mittelwerte der Ähnlichkeit eines neuen Stammes oder Clusters mit einem bereits

bestehenden Cluster verglichen, wobei alle Partner gleich gewichtet werden. Die

Clusterung erfolgt agglomerativ, hierarchisch und nicht überlappend

(HESSELBARTH u. SCHWARZ, 1995).

Ergebnisse

60

4 ErgebnisseIm folgenden Kapitel wurde eine Einteilung der Isolate hinsichtlich ihrer Herkunft,

potentieller Virulenzfaktoren und ihres Genotyps anhand der zuvor in Kapitel 3

beschriebenen Methoden durchgeführt.

Bei den Isolaten wurde aufgrund ihrer Herkunft eine Einteilung in 4 Gruppen

vorgenommen. So wurden die Meningitis- und Septikämie-Isolate, da sie als

hochvirulent anzusehen sind, in eine Gruppe zusammengefasst. Neben der Gruppe

der Pneumonieerrreger und der Gruppe mit Isolaten aus Pneumonie-

Mischinfektionen, wurde die Gruppe der „Sonstigen“ definiert, in der die Isolate,

welche aus gesunden Schweinen mittels Nasen- oder Zervixtupferprobe isoliert

werden konnten, zusammengefasst wurden.

Hinsichtlich der Serotypen wurden die Serotypen, die nur selten nachgewiesen

werden konnten oder Isolate, die keinem Serotyp zuzuordnen waren, in die Gruppe

der sonstigen Serotypen zusammengefasst.

Im folgenden werden Ergebnisse als signifikant eingestuft, wenn der P-Wert < 0,01

war. (siehe 4.8).

4.1 Phänotypische Charakterisierung

4.1.1 SerotypisierungDer Serotyp wurde mit der Latex-Agglutination nach VECHT et al. (1985) ermittelt.

Die Tabelle 9 führt detailliert die Serotypen der verwendeten Isolate auf. Es wurde

festgestellt, dass die Serotypen 2 und 9 am häufigsten auftraten (45 von 99 Isolaten).

Ein Grossteil der Isolate, welche aus septikämischen Krankheitsbildern (Meningitis,

Septikämie) stammten, konnte den Serotypen 2 und 9 zugeordnet werden (31 von 45

Isolaten). Die Abb. 2 zeigt eine Darstellung, in der die Beziehungen in Prozent

ausgedrückt sind. Dabei wird die Zuordnung der Serotypen 2 und 9 zu

Meningitiserregern deutlich. Auffallend war auch die Zuordnung der Serotypen ½, 3,

4, 5 und 7 zu den Gruppen der Pneumonie-Erreger und Pneumonie-

Mischinfektionen.

Ergebnisse

61

Tabelle 9: Beziehung zwischen Serotyp und Herkunft der Sc. suis Isolate.

HerkunftSerotyp

Meningitis Septikämie PneumoniePneumonie-

MischinfektionSonstige

1 3 1 0 0 1

½ 2 0 4 1 1

2 17 4 2 1 1

3 1 0 3 5 0

4 1 0 2 2 1

5 1 1 1 4 0

7 1 2 2 3 0

8 0 0 0 0 1

9 9 3 1 6 1

12 1 0 0 0 0

15 0 0 0 0 1

16 0 0 1 0 0

25 0 0 0 1 0

Poly 0 0 0 1 1

Auto 1 0 0 0 3

Gesamt 37 11 16 24 11

Poly = Polyagglutination (d.h. nicht typisierbar)Auto = Autoagglutination (d.h. nicht typisierbar)

Ergebnisse

ST = SerotypS = sonstige

Abb. 2: B

Grafikteil z

ST

S

e

e

S

62

enerotypen

ziehungen zwischen dem Serotyp und der Herkunft der Isolate. Der

igt die Werte in Prozent, der Tabellenteil die absoluten Zahlen.

Ergebnisse

63

4.1.2 Expression von MRP/EFDie Expression des Muramidase–Released-Proteins (MRP) und des Extrazellulär

Faktor–Proteins (EF) bei den Sc. suis–Isolaten wurde mittels SDS-Gelelektrophorese

und Immunoblot Analyse nachgewiesen. Diese Arbeiten wurden mit freundlicher

Unterstützung durch H. Wisselink und H. Smith in Lelystad/ Holland durchgeführt.

Der MRP-Nachweis wurde mit den Protoplasten-Überständen durchgeführt, der EF-

Nachweis mit den Kulturüberständen. Die Abb. 4 bis 9 auf den folgenden Seiten

zeigen repräsentative Blots von Protoplasten- und Kulturüberständen von Sc. suis.

Neben dem MRP und EF wurden dabei auch die unterschiedlichen Varianten dieser

beiden Proteine nachgewiesen. So konnte neben dem MRP mit 136 kDa das

höhermolekulare MRP* und das niedermolekulare MRPS nachgewiesen werden.

Beim EF mit 110 kDa konnte die höhermolekulare Variante EF* nachgewiesen

werden.

Das MRP bzw. dessen Varianten konnten bei 52 Isolaten nachgewiesen werden

(MRP+). Bei 32 Isolaten konnte kein MRP nachgewiesen werden (MRP-). Bei 15

Isolaten wurde das EF nachgewiesen (EF+), wobei alle EF+ Isolate auch das MRP

exprimierten (MRP+/EF+) (Tabelle 11).

Tabelle 11: Auftreten der verschiedenen MRP/EF Phänotypen bei den untersuchten

Sc. suis – Isolaten

Phänotyp AnzahlMRP+/EF+ 15 (15,2)

MRP+/EF- 52 (52,5)

MRP-/EF- 32 (32,3)

( ) = Angaben in Prozent

Ergebnisse

64

E

EF*

EF

MRPMRP*MRPS

MRPMRP*MRPS

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Abb... : Nachweis von MRP und EF mittels Immunoblot

Western-Blot-Analyse mit monoklonalen Antikörpern gegen MRP und EF vonÜberständen von Sc-suis-Stämmen nach SDS-PAGE mit 6% Polyacrylamid. Diegebundenen Antikörper wurden mit Anti -Maus-Globulinen, gemacht. Als Kontroll -Stamm diente der Sc.suis-Serotyp 2 Stamm Vecht 4005 (Spur 4, 8) In den übrigen Spurenbefinden sich die Stämme A5141/1/96 (Spur1); A2155/2/97 (2); A3973/4/98 (3);A6165/2/97 (5); A2195/1/97(6); A3313/1/98 (7); A496/98 (9); A6169/1/96 (10)

Abb...::Nachweis von MRP mittels Immunoblooting

Western-Blot-Analyse mit monoklonalen Antikörpern gegen MRP von Überständen vonSc-suis-Stämmen nach SDS-PAGE. Die gebundenen Antikörper wurden mit Anti-Maus-Globulinen sichtbar gemacht. Als Kontroll -Stamm diente der Sc.suis- Serotyp 2 StammVecht 4005 (Spur 4,8) In den übrigen Spuren befinden sich die Stämme A5141/196 (Spur1); A2155/2/97 (2); A3973/4/98 (3); A6165/2/97 (5); A2195/1/97(6); A3313/1/98 (7);A496/98 (9); A6169/1/96 (10)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Abb 3: Nachweis von MRP mittels Immunoblot-AnalyseSc. suis -Isolate wurden fraktioniert und nach Auftrennung in der SDS-PAGE im Immunoblotmit mAk gegen MRP getestet. Als Kontrollstamm diente der Sc. suis -Serotyp 2 Stamm Vecht4005 (Spur 4,8). Der abgebildete Blot zeigt die Isolate A5141/1/96 (Spur 1), A2155/2/97 (2), A3973/4/98 (3), A 6165/1/97 (5), A2195/1/97 (6), A 3313/1/98 (7), A 496/98 (9), A6169/1/96(10). Neben dem MRP (136 kDa) wurden auch die höhermolekulare (MRP*) undniedermolekulare (MRPs) Variante des MRP markiert.

Abb 4: Nachweis von MRP und EF mittels Immunoblot-AnalyseSc. suis -Isolate wurden fraktioniert und nach Auftrennung in der SDS-PAGE im Immunoblotmit mAk gegen MRP und EF getestet. Als Kontrollstamm diente der Sc. suis -Serotyp 2Stamm Vecht 4005 (Spur 4,8). Der abgebildete Blot zeigt die Isolate A5141/1/96 (Spur 1),A2155/2/97 (2), A 3973/4/98 (3), A 6165/1/97 (5), A2195/1/97 (6), A 3313/1/98 (7), A 496/98(9), A6169/1/96 (10) Neben dem MRP (136 kDa) und dem EF(110 kDa) wurden auch diehöhermolekulare (MRP*) und niedermolekulare (MRPs) Varianten des MRP und diehöhermolekulare (EF*) Variante des EF markiert.

Ergebnisse

65

MRPSMRP MRP*

MRP*MRP MRPS

EF

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Abb 1: Western-Blot-Analyse mit monoklonalen Antikörpern gegen MRP vonÜberständen von Sc-suis-Stämmen nach SDS-PAGE mit 6% Polyacrylamid. Diegebundenen Antikörper wurden mit einer alkalischen Phosphatase, welche mit Anti-Maus-Globulinen konjugiert waren, in einer Verdünnung von 1:1000 sichtbar gemacht.Als Kontroll-Stamm diente der Sc.suis-Serotyp 2 Stamm Vecht 4005 (1,4,9) In denübrigen Bahnen befinden sich die Stämme I4627d (=2); I4627c (=3); A2321/1/97 (=5);A5505/93 (=6); A3863/6/97(=7); A5141/1/96 (=8); A5262/1/96 (=10)

Abb 2: Western-Blot-Analyse mit monoklonalen Antikörpern gegen MRP und EF vonÜberständen von Sc-suis-Stämmen nach SDS-PAGE mit 6% Polyacrylamid. Diegebundenen Antikörper wurden mit einer alkalischen Phosphatase, welche mit Anti-Maus-Globulinen konjugiert waren, in einer Verdünnung von 1:1000 sichtbar gemacht.Als Kontroll-Stamm diente der Sc.suis-Serotyp 2 Stamm Vecht 4005 (1,4,9) In denübrigen Bahnen befinden sich die Stämme I4627d (=2); I4627c (=3); A2321/1/97 (=5);A5505/93 (=6); A3863/6/97(=7); A5141/1/96 (=8); A5262/1/96 (=10)

Abb.5: Nachweis von MRP mittels Immunoblot-AnalyseSc. suis -Isolate wurden fraktioniert und nach Auftrennung in der SDS-PAGE im Immunoblotmit mAk gegen MRP getestet. Als Kontroll-Stamm diente der Sc. suis -Serotyp 2 StammVecht 4005 (Spuren 1,4,9). Der abgebildete Blot zeigt die Isolate I4627d (Spur 2), I4627c (3),A2321/1/97 (5), A5505/93 (6), A3863/6/97 (7), A5141/1/96 (8), A5262/1/96 (10). Neben demMRP (136 kDa) wurden auch die höhermolekulare (MRP*) und niedermolekulare (MRPs)Varianten des MRP markiert.

Abb.6: Nachweis von MRP und EF mittels Immunoblot-AnalyseSc. suis –Isolate wurden fraktioniert und nach Auftrennung in der SDS-PAGE im Immunoblotmit mAk gegen MRP und EF getestet. Als Kontroll-Stamm diente der Sc. suis -Serotyp 2Stamm Vecht 4005 (Spuren 1,4,9). Der abgebildete Blot zeigt die Isolate I4627d (Spur2),I4627c (3), A2321/1/97 (5), A5505/93 (6), A3863/6/97 (7), A5141/1/96 (8), A5262/1/96 (10).Neben dem MRP (136 kDa) wurden auch die höhermolekulare (MRP*) und niedermolekulare(MRPs) Varianten des MRP markiert.

Ergebnisse

Abb ..: Nachweis von EF mittels Immunoblotting

Western-Blot-Analyse mit monoklonalen Antikörpern gegen EF vonÜberständen von Sc-suis-Stämmen nach SDS-PAGE. Als Kontroll-Stammdient der Sc.suis-Serotyp 2 Stamm Vecht 4005 (2,8) In den übrigenBahnen befinden sich die Stämme A3313/3/98 (=1); A6/3/94 (=3);DSM9682 (=4); I9841/1 (=5); DSM9684 (=6); I9841/2 (=7); AA3551/1/97 (=9); A5439/2/96 (=10)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

EF

EF*

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

EF*

EF

MRPMRPS

Abb...:

Abb.2

Abb 7: Nachweis von EF mittels Immunoblot-AnalyseSc. suis -Isolate wurden fraktioniert und nach Auftrennung in der SDS-PAGE im Immunoblotmit mAk gegen EF getestet.. Als Kontroll-Stamm diente der Sc. suis -Serotyp 2 Stamm Vecht4005 (2,8). Der abgebildete Blot zeigt die Isolate A3313/3/98 (Spur1); A6/3/97 (3); DSM9682(4); I9841/1 (5); DSM9684 (6); I9841/2 (7); A3551/1/97 (9); A5439/2/96 (10). Neben dem EF(110 kDa) wurde auch die höhermolekulare (EF*) Variante des EF markiert.

Abb 2:Nachweis von MRP und EF mittels Immunoblotting

Western-Blot-Analyse mit monoklonalen Antikörpern gegen MRP und EFvon Überständen von Sc-suis-Stämmen nach SDS-PAGE. Als Kontroll-Stamm diente der Sc.suis-Serotyp 2 Stamm Vecht 4005 (2,8) In den übrigenBahnen befanden sich die Stämme A3313/3/98 (=1); A6/3/94 (=3);DSM9682 (=4); I9841/1 (=5); DSM9684 (=6); I9841/2 (=7); A A3551/1/97(=9); A5439/2/96 (=10)

Abb.8: Nachweis von MRP und EF mittels Immunoblot-AnalyseSc. suis -Isolate wurden fraktioniert und nach Auftrennung in der SDS-PAGE im Immunoblotmit mAk gegen MRP und EF getestet. Als Kontroll-Stamm diente der Sc. suis -Serotyp 2Stamm Vecht 4005 (2,8). Der abgebildete Blot zeigt die Isolate A3313/3/98 (Spur1), A6/3/97(3), DSM9682 (4), I9841/1 (5), DSM9684 (6), I9841/2 (7), A3551/1/97 (9), A5439/2/96 (10).Neben dem MRP (136 kDa) und dem EF (110 kDa) wurden auch die höhermolekulare(MRP*) und niedermolekulare (MRPs) Varianten des MRP und die höhermolekulare (EF*)Variante des EF markiert.

66

Ergebnisse

Der Vergleich der Expression von MRP und EF der Isolate mit deren Herkunft zeigte,

dass 80% der MRP+/EF+Isolate von Tieren mit Meningitis stammten, während kein

einziges MRP+/EF+ Isolat von Pneumonie-Mischinfektionen oder von klinisch

unauffälligen Tieren isoliert werden konnte. Der Vergleich der Expression der

MRP+/EF- Isolate hinsichtlich ihrer Herkunft zeigte, dass 50% der Pneumonie-

Erregern diesem Phänotyp an gehören. Bei den Isolaten aus Pneumonie-

Mischinfektionen waren 54 % phänotypisch MRP+/EF- (Abb.9).

Abb.9: Bezi

Die Ergebn

relativen An

im Vergleich

0%

20%

40%

60%

80%

100%

M e

100%

80%

60%

40%

20%

0%

Ante

il in

% v

on N

N = 48

ehung zwische

isse wurden i

teile der unters

mit der Gesam

n i n g i t i s P n

MRP+ EF+

N = 16

n dem MRP/EF

n Prozent der

chiedlichen MR

tpopulation zu

e u m o n i e P n

MR

N = 24

67

-Phänotyp und

jeweiligen G

P/EF-Express

verdeutlichen.

e u . - M i s ch.

S

P+ EF-

N = 11

der Herkunft d

ruppe ausgedr

ion in der jewe

o n s t i g e

MRP- E

N = 99

er Isolate.

ückt, um die

iligen Gruppe

G e s a m t

F-

Ergebnisse

68

4.1.3 Expression von HämolysinDer Hämolysin-Nachweis wurde mit Modifikationen die Methode nach FEDER et al.

(1994) durchgeführt. Dabei wurden die ermittelten Werte im Verhältnis zum

Hämolysin-Referenzstamm P1/7 ausgedrückt.

Bei 50 Isolaten wurde keine hämolytische Aktivität nachgewiesen. 22 Isolaten

zeigten eine zweifelhafte Hämolysin-Expression, dass heisst, die gemessenen Werte

lagen im Bereich von 10 bis 80 hämolytischen Einheiten. Eine positive Hämolysin-

Expression mit über 80 hämolytischen Einheiten zeigten 27 Isolate (Tab.10).

Tabelle 10: Häufigkeit der Hämolysin-Expression bei den untersuchten Isolaten

Hämolysin-Expression Anzahl der Isolatenegativ 50 (50,5)

zweifelhaft 22 (22,2)

positiv 27 (27,3)

( ) = Angaben in Prozent

Bei dem Verteilung der Sc. suis–Isolate in Gruppen aufgrund ihrer Herkunft zeigte

sich, dass die Hämolysin-positiven Isolate vor allem zur Gruppe der Meningitis-

Isolate und die Hämolysin-negativen Isolate vor allem zur Gruppe der Pneumonie

und Pneumonie-Mischinfektionen gehörten (Abb. 10). So waren in der Gruppe der

hochvirulenten Isolate 87,5 % aller Hämolysin-positiver Isolate aufzufinden. Der

Anteil der Hämolysin-negativen Isolate in der Gruppe der Pneumonie-Erreger lag bei

68,7 %. In der Gruppe der Pneumonie-Mischinfektionen waren 58 % der zu dieser

Gruppierung gehörenden Isolate Hämolysin-negativ. Nur 6,3 % der Pneumonie-

Erreger und 4,2 % der Isolate aus Pneumonie-Mischinfektionen waren Hämolysin-

positiv (Abb. 10).

Ergebnisse

69

Abb 10: Beziehungen zwischen der Herkunft und der Hämoly

suis Isolate. Der Grafikteil zeigt die Werte in Prozent, der T

Zahlen.

= Hämolysin-positiv = Hämolysin-zweifelhaft
= Hämolysin-negativ
sin-Expression der Sc.

abellenteil in absoluten

Ergebnisse

70

4.1.4 Adhärenz an EpithelzellenFür die Untersuchungen wurden die beiden Zelllinien HEp 2 und ST verwendet. Die

Art der Adhärenz, die beobachtet werden konnte, war nicht auf spezielle Regionen

der Zelle beschränkt, sondern diffus über die gesamte Zelloberfläche verteilt

(Abb.11,12,13). Teilweise konnte auch eine unspezifische Adhärenz an der

Glasoberfläche festgestellt werden. Die Auswertung der Adhärenz wurde semi-

quantitativ durchgeführt. Dabei wurden jeweils 50 Zellen ausgezählt. Ein Isolat war

adhärent, wenn mehr als 100 Bakterien pro 50 ausgezählten Zellen vorgefunden

werden konnten. Bei 25 bis 100 Bakterien pro 50 Zellen wurde die Adhärenz als

zweifelhaft eingestuft. Waren weniger als 25 Bakterien pro 50 ausgezählten Zellen

vorhanden, so wurde die Adhärenz als negativ bezeichnet. Dabei wurde festgestellt,

dass bei den HEp 2 Zellen mehr als 80% der Streptokokken keine Adhärenz zeigten,

und bei den ST-Zellen über 70% der Sc. suis – Isolate keine Adhärenz zeigten (siehe

Abb.14). Einen Zusammenhang zwischen der Adhärenz der Sc. suis – Isolate mit

deren Herkunft konnte nicht festgestellt werden.

Abb.11: Adhärenz von Sc. suis an humane HEp 2–ZellenSc. suis-Isolat A 386/94 (nicht typisierbar, MRP-/EF-, Hämolysin-neg.) an humaneHEp 2–Zellen (Giemsa-gefärbter Ausstrich, Vergrösserung: 630fach, Ölimmersion)

Ergebnisse

71

Abb.12: Adhärenz von Sc. suis an porcine ST-ZellenSc. suis-Isolat A 386/94 (nicht typisierbar, MRP-/EF-, Hämolysin-neg.) an ST–Zellen(Giemsa-gefärbter Ausstrich, Vergrösserung: 630fach, Ölimmersion).

Abb.13:Adhärenz von Sc. suis an HEp2–ZellenSc. suis-Isolat A 5505/93 (nicht typisierbar, MRP-/EF-, Hämolysin-neg.) an HEp2–Zellen (Giemsa-gefärbter Ausstrich, Vergrösserung: 630fach, Öl-Immersion).

Ergebnisse

N = 81 N = 22 N = 99

HEp 2 = Humane LaryngotrST-Zellen = Schweine–Hod- = negative Adhärenz (wen+ = zweifelhaft positive Adh++ = positive Adhärenz (me

Abb. 14: Beziehungen zST– Zellen und ihrer HerkDie Ergebnisse wurden Anteile der unterschiedlicGesamtpopulation zu ver

4.2 Genotypisierung4.2.1 MakrorestriktionsBei der Makrorestriktion

Restriktionsenzymverdau

Pulsfeldgelelektrophorese

Für die exakte Grösse

Grössenmarker bestimm

0%

20%

40%

60%

80%

100%

HEp 2 - H

Ante

il in

% v

on N

Meningitis

Ante

il in

% v

on N

N = 14

acheal-Epithen–Zelleniger als 25 aärenz ( zwishr als 100 a

wischen deunft.in Prozenthe Adhäredeutlichen.

-Analyses-Analyse

mit ApaI b

(PFGE) a

nbestimmu

t werden.

Ep 2 + H

Pn

N = 4

72

elzellen

dhärente Bchen 25 unddhärente Ba

r Adhären

für die jenz in der je

wurde die

zw. SmaI

ufgetrennt.

ng der e

Zur Erste

Ep 2 ++

eumonie

N = 72

akterien pro 50 Zellen) 100 adhärente Bakterikterien pro 50 Zellen)

z der Sc. suis Isolate

weilige Gruppe ausgweiligen Gruppe im V

DNA aller Sc. suis

geschnitten und ans

ntstandenen Fragme

llung der Grössenma

ST - ST +

Pneu.-Misch.

N = 5

en pro 50 Zellen)

an HEp2– und

edrückt, um dieergleich mit der

-Isolate mittels

chließend in der

nte musste ein

rker diente der

ST ++ Gesamt

Sonstige

Ergebnisse

73

Staph. aureus DSM 1104. Dessen DNA wurde mit dem Restriktionsenzym SmaI

geschnitten und die Grösse der DNA–Fragmente in einer PFGE mittels zweier

mitgeführter Grössenstandards ( DNA-λ-Phagen-Leiter und eines 5 kBp DNA –

Leiter) ermittelt ( Abb15).

Abb.15: Erstellung eines spezifischen Grössenstandards für die PFGEDie Gesamt-DNA des Staph. aureus-Stammes DSM 1104 wurde nach Restriktionsverdaumit SmaI mittels PFGE aufgetrennt (Spur 1 u. 2). Die entstandenen Fragmente wurdeanhand zweier Grössenmarker bestimmt. Als Grössenmarker für den Bereich von 5-40 kBpwurde eine 5 kBp-DNA-Leiter (Fa. GIBCO BRL) (Spur 3) und für den Grössenbereich vonüber 48,5 kBp ein λ-DNA-Leiter (Fa. BioRad) (Spur 4) verwendet. Die Fragmentgrössen sindin kBp (kBp) angegeben.

Ergebnisse

74

Bei dem Restriktionsverdau mit ApaI entstanden Fragmentbandenmuster, welche

zwischen 15 und 23 Fragmente umfassten. Die Fragmentgrössen lagen im Bereich

von 7,5 kBp bis 340 kBp (Abb. 16 u. 19).

Bei dem Verdau mit SmaI entstanden Fragmentbandenmuster mit 6 bis 13

Fragmenten. Die Fragmentgrössen lagen im Bereich von 18 kBp bis 650 kBp (Abb

17 u.18).

Die Stabilität der erhaltenen Fragmentmuster wurde dadurch überprüft, dass mehrere

zufällig ausgewählte Stämme durch tägliches Überimpfen von Einzelkolonien je 50

mal auf Blutagar passagiert wurden. Anschliessend wurde eine

Makrorestriktionsanalyse der Isolate jeder zehnten Passage durchgeführt. Die

entstandenen Fragmentmuster zeigten auch nach der 50sten Passage keine

Veränderungen.

Durch die Makrorestriktionsanalyse war die Möglichkeit gegeben, alle Isolate anhand

ihrer Fragmentmuster zu differenzieren (Abb. 16-19). Eine Differenzierung war auch

möglich bei Isolaten aus einem Bestand wie z. B. die Stämme I4627c-g (Abb. 18 u.

19) oder aus einem Tier wie z. B. die Stämme I9841/1-3 (Abb. 16 u. 17).

Eine Auswertung der Restriktionsfragmentmuster mit dem Auge erlaubte zwar die

Feststellung, dass gewisse Bandenmuster auftraten, jedoch war eine genaue

Zuordnung in Cluster bei der Anzahl der zu untersuchten Isolate sehr schwierig, so

dass eine digitalisierte Auswertung vorgenommen wurde. Durch dreimaliges

Wiederholen der Auswertung dieser „Rohdaten“ wurden die Reproduzierbarkeit

überprüft und sichergestellt.

Dabei wurde bei den Serotyp 2-Stämmen ein in weiten Teilen sich gleichendes

Fragmentmuster identifiziert (Abb. 16 u. 17).

75

16Abb. 16: Makrorestriktionsanalyse von Sc. suAls Größenstandard diente der Stamm Staphin Kilobasenpaaren (kBp) angegeben. In dA6/3/97 (Spur 1), P1 (2), P202 (3), I4627c (4A123/1/97 (11), P203 (12), P204 (13), P24 (1DSM9682 (21), A2321/1/97 (22), D282 (23), A

Ergebnisse

5783011481401139574

56

352827

kBp

is-Serotyp 2 Stämme nach Restriktionsverdau mit ApaI. aureus DSM 1104 (Spur ST). Die Fragmentgrößen des Standards sind rechts

en übrigen Spuren wurde die DNA folgender Sc. suis -Stämme aufgetrennt:), SuisII (5), B2441/96 (6), Vecht 4005 (7), T15 (8), A2195/1/97 (9), A78/94 (10),4), P25 (15), DSM9684 (16), I9841/3 (17), I9841/2 (18), I9841/3 (19), P1/7 (20),6169/1/96 (24).

44

Ergebnisse

76

ST 1 2 3 4 5 ST 6 7 8 9 10 11 12 13 ST 14 15 16 17 18 19 ST 20 21 22 23 24 ST

Abb....: Auftrennung der DNA von Sc. suis - Serotyp 2 Stämmen nach Restriktionsverdau mit Sma I mittels PFGE

Als Größenstandart diente der Referenzstamm Staph. aureus DSM 1104 (= ST). In den übrigen Spuren wurde die DNAfolgender Sc. suis Stämme aufgetrennt: A6/3/97 (Spur 1), P1 (2), P202 (3), I4627c (4), SuisII (5), B2441/96 (6),Vecht4005 (7), T15 (8), A2195/1/97 (9), A78/94 (10), A123/1/97 (11), P203 (12), P204 (13), P24 (14), P25 (15),DSM9684 (16), I9841/3 (17), I9841/2 (18), I9841/1 (19), P 1/7 (20), DSM9682 (21), A2321/1/97 (22), D282 (23),A6169/1/96 (24)

578

3012531481401139574

56443529

kBp

17Abb. 17: Makrorestriktionsanalyse der Sc. suis-Serotyp 2 Stämme nach Restriktionsverdau mit SmaIAls Größenstandard diente der Stamm Staph. aureus DSM 1104 (Spur ST). Die Fragmentgrößen des Standardssind rechts in Kilobasenpaaren (kBp) angegeben. In den übrigen Spuren wurde die DNA folgender Sc. suis -Stämmeaufgetrennt: A6/3/97 (Spur 1), P1 (2), P202 (3), I4627c (4), SuisII (5), B2441/96 (6), Vecht 4005 (7), T15 (8),A2195/1/97 (9), A78/94 (10), A123/1/97 (11), P203 (12), P204 (13), P24 (14), P25 (15), DSM9684 (16), I9841/3 (17),I9841/2 (18), I9841/3 (19), P1/7 (20), DSM9682 (21), A2321/1/97 (22), D282 (23), A6169/1/96 (24).

Ergebnisse

77

ST 1 2 3 4 5 ST 6 7 8 9 10 ST 11 12 13 14 15 ST 16 17 18 19 20 ST 21 22 23 ST

Abb...: Makro-Restriktions-Analyse mittels Pulsfeldgelelektrophose von Sc.suis-Serotyp 9 Isolaten nach SmaIVerdau.Als Größenstandart dienet der Referenz-Stamm Staph.aureus DSM 1104 nach Apa I-Verdau..In den Spuren 1-23wurden folgende Isolate aufgetragen: B398/97 (Spur 1); B2647/96 (2); B2681/96 (3); A3286/94 (4); A1147/93 (5);B2663/96 (6); B2628/96 (7); B418/96 (8); A3973/4/98 (9); I4627d (10); A3313/1/98 (11); A3313/3/98 (12); A3863/6/97(13); B422/97 (14); B631/97 (15); I4627f (16); A5455/93 (17); A2062/2/97 (18); A5683/94 (19); I4627e (20); P 1/7(Suislysin-Referenzstamm Serotyp 2) (21); D282 (MRP-Referenz-Stamm Serotyp 2) (22); A2350/8/97 (23)

578

301253

14814011395

74

56

443528

kBp

Abb.18: Makrorestriktionsanalyse der Sc. suis-Serotyp 9 Stämme nach Restriktionsverdau mit SmaIAls Größenstandard diente der Stamm Staph. Aureus DSM 1104 (Spur ST). Die Fragmentgrößen des Standards sind rechts inKilobasenpaaren (kBp) angegeben In den übrigen Spuren wurde die DNA folgender Sc. suis -Stämme In den übrigen Spurenwurde die DNA folgender Sc. suis Stämmen aufgetrennt: B398/97 (Spur 1), B2647/96 (2), B2681/96 (3), A3286/94 (4),A1147/94 (5), B2663/96 (6), B2628/96 (7), B418/97 (8), A3973/4/98 (9), I4627d (10), A3313/1/98 (11), A3313/3/98 (12),A3863/6/97 (13), B422/97 (14), B631/97 (15), I4627f (16), A5455/93 (17), A2062/2/97 (18), A5683/94 (19), I4627e (20),P1/7(ST 2) (21), D282 (ST 2) (22), A2350/8/96 (23).

78

19

Abb.18: Makrorestriktionsanalyse der Sc. Als Größenstandard diente der Stamm Ssind rechts in Kilobasenpaaren (kBp) ange. In den übrigen Spuren wurde die DNA foA5683/94 (3), A3286/94 (4), I4627d (5), B2628/96 (11), A5455/93 (12), B422/97 (B631/97 (18), B418/97 (19), D282 (ST 2) (

ST 1 2 3 4 5 ST 6 7 8 9 10 ST 11 12 13 14 15 ST 16 17 18 19 ST 20 21 22 23 ST

Ergebnisse

578301

14814011395

74

564435

kBp

suis-Serotyp 9 Stämme nach Restriktionsverdau mit ApaItaph. Aureus DSM 1104 (Spur ST). Die Fragmentgrößen des Standardsgeben. In den übrigen Spuren wurde die DNA folgender Sc. suis -Stämmelgender Sc. suis Stämmen aufgetrennt: A3973/4/98 (Spur 1), B398/97 (2)A2062/2/97 (6), I4627f (7), A1147/94 (8), B2663/96 (9), B2647/96 (10),13), A 3313/3/98 (14), A3313/1/98 (15), A3863/6/97 (16), B2681/96 (17),20), P1/7 (ST 2) (21), A2350/8/96 (22).

Ergebnisse

79

4.2.2 ClusteranalyseAnhand der bei der Makrorestriktion entstandenen Fragmentmuster wurde nach

digitaler Bearbeitung der Rohdaten (siehe 3.12.3) eine Clusteranalyse mittels

UPGMA durchgeführt und basierend auf dieser Analyse als grafische Darstellung in

Form sog. Dendrogramme dargestellt. Die Ähnlichkeiten, basierend auf dem DICE-

Koeffizienten, wurden in Prozent angegeben und konnten in dem jeweiligen

Dendrogramm anhand der Skalierung der x-Achse in Prozent abgelesen werden

(Abb. 20 u. 21).

In den der bei der Clusteranalyse mittels UPGMA entstandenen Dendrogramme

(Abb. 20 u. 21) konnten sowohl bei dem Restriktionsverdau mit ApaI (MR-ApaI) als

auch mit SmaI (MR-SmaI) vier Grossgruppen (GG) unterschieden werden (GG

A1SmaI,, GG A2SmaI,, GG B1SmaI,, GG B2SmaI,, bzw. GG A1ApaI,, GG A2ApaI,, GG B1ApaI,,

GG B2ApaI,). Jedoch war sowohl die Grösse, wie auch die Zusammensetzung der GG

verschieden. So waren nach der Clusteranalyse mit SmaI verdauter DNA in der GG

A1SmaI 26 Isolate , in der GG A2SmaI 22 Isolate, in der GG B1SmaI 32 Isolate und in der

GG B2SmaI 19 Isolate enthalten (Abb. 20). Nach der Clusteranalyse nach MR-ApaI

waren in der GG A1ApaI 20 Isolate , in der GG A2ApaI 36 Isolate, in der GG B1ApaI 15

Isolate und in der GG B2ApaI 28 Isolate gruppiert (Abb. 21). Die in den GG

zusammengefassten Isolate wurden in der Clusteranalyse UPGMA weiter

diskriminiert, so dass auch innerhalb einer GG die einzelnen Isolate unterschieden

werden konnten.

Ergebnisse

A1

A2

B1

B2

00ÄhNlic ke

Ähnlichkeit in

Abb 20DendrogApaI-vergroup m

Ähnlichkeit in Prozent

220

: Genotypische Vramm. Die Darstdauter DNA von ethod analyses“)

40
40
erwandtschaft dellung basiert au99 Isolaten. Als verwendet.

6it 60

80

er verwendetenf der ClusteranaCluster-Methode

80
80
Sc. suis-Stämlyse der Makro wurde UPGMA

100100

H 5631/2P 202A 370/2/97P 180P 204B 2663/96A 5263/93A 305/3/97B 114/97B 467/97H 6388B 416/97B 398/97B 2801/96Suis 1/2 P 219A 6/3/97A 2883/2/97B 415/97T 15DSM 9683B 422/97A 3313/3/98B 2680/96B 162/97A 3313/1/98A 3863/6/97

B 418/97A 41/2a/97A 425/1/97A 5262/1/97A 386/94A 496/98A 3551/1/97I 4627 fA 5505/93B 2618/96B 2441/96A 123/1/97A 2409/98P 203B 29/97B 423/97A 1147/94I 4627 gA 2195/1/97A 2321/2/97A 2155/2/97A 5455/93A 6462/1/96A 5140/3/96A 5141/1/96B 2795/96A 217/1/97Suis 1/2 P 45

B 2641/96A 5683/94B 631/97B 2681/96

A 896/98B 139/97B 2631/96A 6165/2/96A 10/94A 210/1/97I 4627 dA 5439/2/96Suis IB 2858/96Suis IIB 2622/96DSM 9684B 627a/97B 2628/96A 3973/4/98A 1881/1/97A 2350/8/97D 282P 1I 4627 cB 72/97A 6169/1/96P 25DSM 9682P 24A 2062/2/97Vecht 4005I 4627 eB 92/97B 2647/96B 2816/96A 1731/94

P 1/7

I 9841/1I 9841/3I 9841/2P 182B 649/97A 78/94

A 3286/94

me dargestellt alsrestriktionsanalyse („unweighted pair

A1

A2

B1

B2

Ergebnisse

81

B2

B1

A2

A1

Abb 21 Genotypische Verwandtschaft der verwendeten Sc. suis-StämmeDendrogramm. Die Darstellung basiert auf der Clusteranalyse der MakroresSmaI-verdauter DNA von 99 Isolaten. Als Cluster-Methode wurde UPGMA ( „group method analyses“) verwendet.

0
10 80 60 40 20
Ähnlichkeit in Prozent

A 6165/2/97B 649/97P 25A 2321/1/97H 5631/2I 9841/1I 9841/3I 9841/2D 282

P 1P 24B 416/97A 6/3/97B 627a/97

P 1/7DSM 9682

Suis1/2 p45A 496/98I 4627 cSuis IIP 202H 6388A 5683/94A 896/98A 6462/1/96A 3286/94T 15Suis1/2 p219A 305/3/97A 2883/2/97A 2350/8/97A 5439/2/97A 3863/6/97A 5263/93A 5140/3/96A 5141/1/96B 422/97B 631/97B 29/97B 162/97A 1731/94B 2628/96B 418/97Vecht 4005B 2663/96B 467/97P 182A 1147/94A 78/94A 5505/93A 123/1/97A 5455/93B 2441/96A 2195/1/97DSM 9683A 386/94A 5262/1/96A 2409/98A 2155/2/97A 423/97A 3313/1/98A 3313/3/98B 2647/96B 2681/96I 4627 dA 210/1/97B 2641/96DSM 9684B 2816/96B 2801/96A 1881/1/97I 4627 eB 114/97P 180B 139/97B 2622/96P 203P 204B 2858/96A 41/2a/97B 2795/96I 4627 gB 72/97I 4627 fA 3973/4/97A 2062/2/97A 370/2/97A 10/94Suis IB 398/97A 217/1/97B 2680/96B 2618/96B 415/97A 425/1/97A 3551/1/97A 6169/1/96A 2631/96B 92/97

dargestellt alstriktionsanalyseunweighted pair

A1

A2

B1

B2

Ergebnisse

82

4.2.3 Genotypischer Nachweis des HämolysinsDie bei der Pulsfeld-Gelelektrophorese aufgetrennte DNA der Sc. suis –Isolate wurde

mittels Southernblotting auf eine Nylonmembran übertragen und mit einer radioaktiv

markierten Hämolysin–Sonde, die mittels PCR hergestellt wurde, hybridisiert (Abb.

1). Das Gen zur Herstellung der Sonde wurde aus dem Sc. suis Stamm I 9841/1

isoliert ( Abb. 22) und mit α32 Phosphor markiert. So wurden die zur Verfügung

stehenden Sc. suis–Stämme auf das Vorhandensein des Hämolysin-Gens überprüft.

Die Sonde hatte eine Grösse von 1,493 kBp und umfasste das gesamte Hämolysin-

Gen (Abb. 22).

Durch die Hybridisierung konnte sowohl das Vorhandensein als auch die

Konserviertheit des Hämolysin–Gens bei den Isolaten festgestellt werden.

Es zeigte sich, dass das Hämolysin-Gen bei den verschiedenen Serotypen auf

unterschiedlichen Fragmenten lokalisiert war. Innerhalb eines Serotyps war die

Lokalisation konserviert. So konnte das Hämolysin-Gen bei den Serotyp 9 Isolaten in

einem Fragmentgrössenbereich von 300 kBp nachgewiesen werden, während bei es

bei den Serotyp 2 Isolaten das Hämolysin-Gen auf Fragmenten von ca. 50 kBp

konserviert war (Abb. 23b u. 24b). Bei keinem der untersuchten Isolate war das Gen

auf mehrere Fragmente lokalisiert, d. h. es lag offensichtlich nur in einer Kopie im

Genom vor.

Ergebnisse

83

Abb.22: Größenbestimmung der Hämolysin-Sonde

Überprüfung des PCR-Produktes zur Erstellung einergelelektrophoretischer Auftrennung und Fragmentgröden Größenstandard („Low DNA Mass TM-Ladder“), SpHämolysinsonde eingesetzt wurde. Die GrößenangabErstellung der Hämolysin-Sonde diente der Sc. suis S

Bp Bp

1 2

1493
2000
1200

800

400

200

Hämolysin-Gen-Sonde mittels

ßenbestimmung. Spur 1 zeigtur 1 das PCR-Produkt, das alsen sind in Baasenpaaren. Zurerotyp 2 Stamm I 9841/1.

Ergebnisse

84

ST 1 2 3 4 5 6 ST 7 8 9 10 11 12 ST

Abb...: Auftrennung genomischer DNA von Sc. suis nach Restriktionsenzym-Verdau mittels PFGE

Als Größenstandart diente der Referenzstamm Staph aureus DSM 1104. In denübrigen Spuren wurde die DNA folgender Sc suis Stämme aufgetrennt: B418/97(Spur 1); B2663/96 (2); B2628/96 (3); A3863/6/97 (4); B2641/96 (5); B92/97 (6);B631/97 (7); B2631/96 (8); B2647/96 (9); B2681/96 (10); A1731/94 (11); H5631/2(12)

Abb. 23a: Auftrennung genomischer DNA von Sc. suis nachRestriktionsenzymverdau mittels PFGE.Die Pfeile kennzeichnen die bei der anschließenden Hybridisierung durch dieSonde gekennzeichneten Banden (Abb 23b).

95

10

1618
21 2327 28 35
44

56

74

113

140
148
301578

kBp

Ergebnisse

85

Abb...: Nachweis des Suilysin-Gens mittels Southern-Hybridisierung

Als Standart diente der Referenzstamm Staphylococcus aureus DSM 1104(=ST). In den übrigen Spuren wurden folgende Sc.suis-Stämme aufgetrennt:B418/97 (Spur 1); B2663/96 (2); B2628/96 (3); A3863/6/97 (4); B2641/96(5); B92/97 (6); B631/97 (7); B2631/96 (8); B2647/96 (9); B2681/96 (10);A1731/94 (11); H5631/2 (12)

ST 1 2 3 4 5 6 ST 7 8 9 10 11 12 ST

Abb. 23b: Repräsentativer Genotypnachweis des Hämolysins mittels SouthernHybridisierung mit einen spezifischen Gensonde für das Hämolysin-Gen. Als Standarddiente der Referenzstamm Staphylococcus aureus DSM 1104 (ST). In den übrigenSpuren wurden die Restriktionsverdaus folgender Sc. suis Stämme aufgetragen: B418/97 (Spur 1), B2663/96 (2); B 2628/96 (3); A 3863/6/97 (4); B2641/96 (5); B92/97(6): B 631/97 (7); B2631/96 (8); B2647/96 (9); B2681/96 (10); A1731/94 (11); H5631/2(12).

kBp

578
301
148
140
113

95

74

56

-

44

Ergebnisse

86

577,86300,97148,22140.45113,00

94,8974,24

55,6143,7134,6528,5223,6421,6018,5716,249,81

27,56

5783011481401139574

564435282421181610

Abb. 24a: Auftrennung der DNA-Fragmente von Sc. suis-Isolaten nach Restriktionsverdau mit ApaImittels PFGE

Ergebnisse

87

35

57830114814011395745644352824211816

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ST 11 12 13 14 15 16 17 18 19 ST 20 21 22 23 24 25 26

Abb. 24b: Repräsentativer Genotypnachweis des Hämolysins mittels Southern- Hybridisierung mit einerspezifischen α32P-markierten Gensonde für das Hämolysin-Gen. Als Standard diente der Staph. aureus StammDSM 1104 (ST). In den übrigen Spuren wurde die DNA folgender Sc. suis Stämme aufgetrennt: B2441/96(Spur 1), B2618/96 (2), B2628/96 (3), B2622/96 (4), B2631/96 (5), B2641/96 (6), B2647/96 (7), B2663/96 (8),B2680/96 (9), B2681/96 (19), B2795/96 (11), B2801/96 (12), B2816/96 (13), B2858/96 (14), P1 (15), P24 (16),P25 (17), P180 (18), P182 (19), P202 (20), P203 (21), P204 (22), H5631/2 (23), T15 (24), H6388 (25), P1/7(26).

kBp

Ergebnisse

88

4.3 Beziehungen zwischen Genotyp und PhänotypAufgrund der Genotypisierung konnte nach einer Clusteranalyse die Einteilung der

Isolate in Grossgruppen (GG) vorgenommen werden. Im Anschluss konnte eine

Zuordnung der GG zum untersuchten Phänotyp der Isolate vorgenommen werden.

4.3.1 Beziehungen zwischen Genotyp und Herkunft der IsolateIn der GG A1SmaI war mit 76,9% und in der GG B2ApaI mit 71,5% eine signifikante

Häufung von Isolaten aus Meningitis/Septikämie-Geschehnissen zu erkennen.

Ebenso war eine signifikante Häufung der Isolate aus pneumonischen

Geschehnissen vorhanden. So waren in der GG B2SmaI 57,9% und in der GG A2ApaI

52,8% der Isolate Pneumonie-Erreger (Abb. 25 u. 26). Bei den Isolaten, die aus

gesunden Tieren isoliert worden waren, war in der GG B2ApaI keines zu finden,

während sie sich in den übrigen GGApaI gleichmässig verteilten und keine Häufung

zeigten. In der GG A1SmaI war ein Isolat dieser potentiell avirulenten Isolate

vorzufinden, während die restlichen Isolate sich in den übrigen GGSmaI gleichmässig

verteilten und keine Häufung zeigten.

4.3.2 Beziehungen zwischen dem Genotyp und SerotypAuffallend war hier, dass 14 der 25 Sc. suis Serotyp 2 Isolate (56%) in der GG

A1SmaI gruppiert waren. Nach der MR-ApaI waren 14 der 25 Sc. suis Serotyp 2

Isolate (56%) in der GG B2ApaI wiederzufinden. Bei den Sc. suis Serotyp 9 Isolaten

waren von den 20 Isolaten nach der MR-SmaI jeweils 7 Isolate auf die GG A2SmaI

und GG B1SmaI verteilt. In der GG A2ApaI waren 12 Serotyp 9 Isolate (60%) gruppiert.

Die anderen in der Sammlung aufgetretenen Serotypen zeigten kein auffälliges

Verteilungsmuster (Abb. 25 u. 26).

Ergebnisse

89

A1, A2, B1, B2 = Grossgruppeneinteilung im Dendrogramm nach Makrorestriktionsanalyse

mit SmaI und nach Clusteranalyse mittels UPGMA.

Abb.25: Beziehungen zwischen der Herkunft der Isolate und deren Zuordnung zu

den Grossgruppen A1SmaI,, A2SmaI,, B1SmaI,, B2SmaI nach Clusteranalyse. Die Grafik

zeigt die Anteile der Isolate in Prozent der Gesamtzahl jeder Gruppe.

Herkunft:

Ergebnisse

A1,

A1, A2, B1, B2 =

mit ApaI und nach

Abb.26: Bezieh

den Grossgrupp

zeigt die Anteile

0%

20%

40%

60%

80%

100%An

teil

in %

von

N

Menin

8

Her

N = 20

Grossgruppene

Clusteranalyse

ungen zwische

en A1ApaI,, A2

der Isolate in P

A 1

gitis Pne=

=

==

kunft:

N = 36

90

inteilung im De

mittels UPGMA

n der Herkunf

ApaI,, B1ApaI,, B

rozent der Ge

A 2

umonie Sonstige

Pneumonie-M

Pneumonie Meningitis

N = 15

ndrogramm nac

.

t der Isolate u

2ApaI nach Clu

samtzahl jeder

B 1

Pneumonie-Misch

ischinfektion

N = 2

h Makrorestriktio

nd deren Zuor

steranalyse. D

Gruppe.

B 2

infektion

N = 99

nsanalyse

dnung zu

ie Grafik

Gesamt

Sonstige

Ergebnisse

A1, A2, B1, B2

mit SmaI und n

ST = Serotyp

Abb. 27: Bez

den Grossgru

zeigt die Ante

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Ante

il in

% v

on N

1ST

N = 26

= Grossgruppen

ach Clusteranalys

iehungen zwisch

ppen A1SmaI,, A

ile der Isolate in

A 1

1/2 2

N = 22

91

einteilung im Den

e mittels UPGMA.

en dem Serotyp

2SmaI,, B1SmaI,, B

Prozent der Ges

A 2

3 4

N = 32

drogramm nach M

der Isolate und

2SmaI nach Clust

amtzahl jeder Gr

B 1 B

5 7

N = 19
N=20 N=36 N=15 N=28
akrorestrik

deren Zu

eranalyse

uppe.

2

9

N=99

tionsanalyse

ordnung zu

. Die Grafik

Gesamt

sonstige

Ergebnisse

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Ante

il in

% v

on N

1

A1, A2, B1, B2 =

mit ApaI und nac

ST = Serotyp

Abb. 28: Bezieden Grossgrup

zeigt die Anteile

ST

N = 20

A 1

2 1

Grossgruppen

h Clusteranalys

hungen zwischpen A1ApaI,, A

der Isolate in

N = 36

92

A 2

/2 3

einteilung im D

e mittels UPGM

en dem Herku2ApaI,, B1ApaI,,

Prozent der Ge

N = 15

B 1

4 5

endrogramm na

A.

nft der IsolateB2ApaI nach C

samtzahl jede

N = 28

B 2

7 9

ch Makrorestrik

und deren Zulusteranalyse

r Gruppe.

N = 99

Gesamt

Sonstige

tionsanalyse

ordnung zu. Die Grafik

Ergebnisse

4.3.3 Beziehungen zwischen Genotyp und MRP/EF-Expression

Bei der Verteilung der MRP+/EF+ Isolate in den beiden Dendrogrammen waren inder GG A1SmaI mit 10 (66%) eine deutliche Häufung der 15 MRP+/EF+ Sc. suis

Isolate. In der GG B2ApaI war mit 53,4% eine deutliche Häufung MRP+/EF+ Sc. suis

Isolate. Von den 52 MRP+/EF- Isolaten waren in der GG B1SmaI,I 23 Isolate und in der

GG A2ApaI 24 Isolate gruppiert. Die Verteilung der MRP-/EF- Sc. suis Isolate zeigte

weder in den GGSmaI noch in den GGApaI eine Häufung (Abb.29 u. 30).

A1, A2, B1, B2 =

mit SmaI und nach

Abb.29: Beziehu

Zuordnung zu

Clusteranalyse. D

jeder Gruppe.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Ante

il in

% v

on N

M

N = 26

Grossgruppene

Clusteranalyse

ngen zwisch

den Grossg

ie Grafik zeig

A1

RP+/EF+

N = 22

93

inteilung im De

mittels UPGMA

en dem MRP

ruppen A1Sm

t die Anteile

A2

N = 32

ndrogramm nac

.

/EF-Phänotyp

aI,, A2SmaI,,

der Isolate in

B1

MRP+/EF-

N = 19

h Makrorestrikt

der Isolate

B1SmaI,, B2

Prozent der G

B2

N = 99

ionsanalyse

und deren

SmaI nach

esamtzahl

Gesamt

MRP-/EF-

Ergebnisse

A1, A2, B1, B2

mit ApaI und na

Abb. 30: Bez

Zuordnung zu

Die Grafik zeig

4.3.4 BeziehuBei der Zuor

Betrachtung di

Hämolysin-posfestgestellt we

Hämolysinprod

B1SmaI, mit 4 Is

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Ante

il in

% v

on N

N = 20

= Grossgruppe

ch Clusteranalys

iehungen zwis

den Grossgrup

t die Anteile de

ngen zwischednung der h

eser phänotyp

itiven Isolate rden. So zeigt

uktion (Abb. 3

olaten und GG

A1

MRP + / EF -

N = 36

94

neinteilung im D

e mittels UPGM

chen dem MR

pen A1ApaI,, A2

r Isolate in Pro

n Genotyp unämlysinproduz

ischen Eigensc

in jeweils een 16 von 26

1). In der GG

B2SmaI mit 3 Is

A2

MR

N = 15

endrogramm na

A.

P/EF-Phänoty

ApaI,, B1ApaI,, B

zent der Gesam

d Hämolysin-ierenden Isola

haft auch eine

iner GG derIsolaten (61,5

A2SmaI waren

olaten der Ante

B1

P + / EF +

N = 28

ch Makrorestrik

p der Isolate

2ApaI nach Clus

tzahl jeder Gr

Expressionte konnte be

signifikante H

beiden Den%) in der GG

mit 4 Isolaten,

il der Hämolys

B2

MRP -

N = 99

tionsanalyse

und deren

teranalyse.

uppe.

i isolierter

äufung der

drogrammeA1SmaI eine

in den GG

in-positiven

Gesamt

/ EF -

Ergebnisse

und Isolate unter 50 %. In der GG B2ApaI waren mit 12 von 28 Isolaten 42,9% der

Isolate Hämolysin-positiv. In der GG B1ApaI lag der Anteil der Hämolysin-positiven

ebenso wie in den GG A1ApaI, und GG A2ApaI deutlich niedriger (Abb. 32).

A1, A2, B1, B

mit SmaI und n

Abb.31: Bez

Zuordnung

Clusteranalys

jeder Gruppe

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Ante

il in

% v

on N

N = 99
N = 26
2 = Grossgruppen

ach Clusteranalys

iehungen zwisc

zu den Gros

e. Die Grafik ze

.

A1

Hämo= Hämolysin-z

N = 22

95

einteilung im Den

e mittels UPGMA

hen dem Hämo

sgruppen A1Sm

igt die Anteile d

A2

lysin negativweifelhaft/-negativ

N = 32

drogramm nach

.

lysin-Pänotyp d

aI,, A2SmaI,, B

er Isolate in Pr

B1

Häm

N = 19

Makrorestriktionsanalyse

er Isolate und deren

1SmaI,, B2SmaI nach

ozent der Gesamtzahl

B2 G e s a m t

olysin positiv

Ergebnisse

A1, A2, B1, B2 = Grossgr

mit ApaI und nach Clustera

Abb.32: Beziehungen z

Zuordnung zu den Gros

Die Grafik zeigt die Ante

0%

20%

40%

60%

80%

100%

A1

Ante

il in

% v

on N

H ä m o l y

N = 15N = 20

Hämolysin-zweif

N = 36

96

uppeneinteilung im Dendrogramm

nalyse mittels UPGMA.

wischen dem Hämolysin-Phäno

sgruppen A1ApaI,, A2ApaI,, B1ApaI,,

ile der Isolate in Prozent der Ges

A2 B1

s i n n e g a t i v H ä m oelhaft/negativ

N = 28

nach Makrorestrik

typ der Isolate

B2ApaI nach Clu

amtzahl jeder G

B2

l y s i n p o s i t i v

N = 99

tionsanalyse

und deren

steranalyse.

ruppe.

G e s a m t

Ergebnisse

97

Bei der Untersuchung der Sc. suis –Isolate mit einer positiven oder zweifelhaften

Hämolysin–Expression, konnte bei allen Isolaten das Hämolysin–Gen nachgewiesen

werden.

Bei den Isolaten, bei denen keine Hämolysinproduktion nachgewiesen werden

konnte, wurde bei ca. 50% der betroffenen Isolate das Hämolysin-Gen

nachgewiesen (siehe Abb.26 u. 27).

Tab.12: Auftreten des Hämolysin-Genotyps im Vergleich mit dem Hämolysin-

Phänotyp

GenotypPhänotyp positiv negativnegativ 25 (25,3) 25(25,3)

zweifelhaft 25(25,3) 0

positiv 24(24,2) 0

Summe 74(74,7) 25(25,3)

Phänotyp negativ = keine Hämolysin ExpressionPhänotyp positiv = positive Hämolysin ExpressionPhänotyp zweifelhaft = zweifelhafte Hämolysin ExpressionGenotyp positiv = Hämolysin-Gen konnte in der Southernblot-Hybridisierung

nachgewiesen werdenGenotyp negativ = Hämolysin-Gen konnte in der Southernblot-Hybridisierung nicht

nachgewiesen werden( ) = Angaben in Prozent

Ergebnisse

98

4.3.5 Beziehungen zwischen Genotyp und der Adhärenz an Epithelzellen

Eine Beziehung zwischen dem Genotyp und den Adhärenz-positiven und -zweifelhaft

positiven Isolaten war weder in den GGSmaI noch in den GGApaI zu erkennen, da nur

bei wenigen Isolaten eine Adhärenz nachgewiesen werden konnte und diese Isolate

gleichermassen auf die GG verteilt waren (Tabelle 14).

Tab.14: Beziehungen zwischen den Adhärenzeigenschaften der Isolate und deren

Zuordnung zu den Grossgruppen A1SmaI,, A2SmaI,, B1SmaI,, B2SmaI A1ApaI,, A2ApaI,,

B1ApaI,, B2ApaI nach Clusteranalyse. Die Tabelle zeigt die Anzahl der Isolate jeder

Gruppe.

Adhärenz-Phänotyp

GGSmaI HEp 2 + HEp 2 +/- HEp 2 - ST + ST +/- ST -

A1 1 2 23 1 3 22

A2 0 4 18 2 7 13

B1 2 5 25 2 7 23

B2 1 3 15 0 5 14

GGApaI HEp 2 + HEp 2 +/- HEp 2 - ST + ST +/- ST -A1 1 3 16 3 4 13

A2 2 5 29 1 7 28

B1 0 3 12 0 3 12

B2 1 3 24 1 8 19

Gesamt HEp 2 4 14 81

Gesamt ST 5 22 72

HEp 2, ST = verwendete Epithel-Zelllinien+ = Mehr als 100 adhärente Bakterien pro 50 ausgezählte Zellen+/- = Zwischen 25 und 100 adhärente Bakterien pro 50 ausgezählte Zellen- = Weniger als 25 adhärente Bakterien pro 50 ausgezählte Zellen

Ergebnisse

4.4 Clusterzuordnung der MRP+/EF+/Hämolysin+/Meningitis-IsolateAuffallend war bei der Phänotypisierung der Typ MRP+/EF+/Hämolysin+. Daher

wurde gesondert ein Vergleich des Genotyps dieser Isolate vorgenommen. 14 dieser

MRP+/EF+-Sc. suis -Isolate stammten aus Meningitis-Geschehnissen. Von diesen

wurden 13 Isolate als Serotyp 2 identifiziert. Ein Isolat hatte den Serotyp 1. Neun

dieser Isolate produzierten Hämolysine und ein Isolat war Hämolysin-Genotyp

negativ. Zehn dieser Isolate waren in der GG A1 SmaI, 1 Isolat in der GG A2 SmaI, 2

Isolate in der GG B1 SmaI und ein Isolat in der GG B2 SmaI. Drei dieser Isolate waren in

der GG A1 ApaI, 2 Isolate in der GG A2 ApaI, 2 Isolate in der GG B1 ApaI und 8 Isolate in

GG B2 ApaI verteilt (Abb.33).

Abb.33.: Zuordnung der

MRP+/EF+/Hämolysin+ zu den

B1ApaI,, B2ApaI. Die Grafik zeigt

Gruppe.

0

2

4

6

8

10

12

14

Sma I A 1 S m a I A 2 S

Serotyp 1 Serotyp 2

SmaI ApaI

N = 1

Ante

il in

% v

on N

80 %

60 %

40 %

20 %

100 %

N = 10

N = 8

N = 2

99

Isolate aus

Grossgruppen A1Sm

die Anteile der Iso

m a I B 1 S m a I B 2 A

N = 2

Meningitid

aI,, A2SmaI,,

late in P

p a I A 1 A

N =2

en mit

B1SmaI,, B

rozent de

p a I A 2 A

N = 2

N = 1

dem Phänotyp

2SmaI A1ApaI,, A2ApaI,,

r Gesamtzahl jeder

p a I B 1 A p a I B 2

Ergebnisse

100

4.5 Statistische Auswertung

Zur Absicherung der Ergebnisse der Beziehung zwischen dem Genotyp und dem

Phänotyp wurden die Daten einer statistischen Auswertung unterzogen. Eine

Übersicht über die durch die logistische Regression ermittelten Odds Ratio zeigt

Tabelle 14.

4.5.1 Beziehung zwischen Serotyp und Herkunft der IsolateAls Bezugswert wurde der Serotyp 2 und Meningitis genommen. Bezogen darauf fiel

vor allem auf, dass die Wahrscheinlichkeit, dass die Isolate mit den Serotypen 3 und

7 nicht aus einem Meningitis/Septikämie-Geschehen stammen, mit einer Odds Ratio

von 0,059 und einem P-Wert von 0,0003 um das 16,9-fache höher ist, als bei Serotyp

2. Bei den Isolaten mit den Serotypen 4 und 5 ist die Wahrscheinlichkeit, dass sie

nicht aus einem Meningitis/Septikämie-Geschehen stammen mit einer Odds Ratio

von 0,057 und einem P-Wert von 0,0008 um das 17,4-fache höher. Bei dem Serotyp

9 ist die Wahrscheinlichkeit, nicht aus einem Meningitis/Septikämie-Geschehen zu

stammen, mit einer Odds Ratio 0,286 und einem P-Wert von 0,0782 3,5fach höher

als beim Serotyp 2. Bei den sonstigen Serotypen ist mit einer Odds Ratio von 0,042

und einem P-Wert von 0,009 die Wahrscheinlichkeit, nicht aus einem

Meningitis/Septikämie-Geschehen zu stammen 23,8 fach höher als bei Serotyp 2.

4.5.2 Beziehung zwischen Expression potentieller Virulenzfaktoren undHerkunft

Als Bezugswert hinsichtlich der MRP-Expression wurde der MRP-negative Phänotyp

und Meningitis genommen. Dabei konnte festgestellt werden, dass mit einer Odds

Ratio von 3,714 und einem P-Wert von 0,0046, die MRP-positiven Isolate mit einer

3,7 fach höhere Wahrscheinlichkeit aus einem Meningitis/Septikämie-Geschehen

stammen.

Als Bezugswert hinsichtlich der EF-Expression wurde der EF-negative Phänotyp und

Meningitis genommen. Bezogen darauf fiel auf, dass die Isolate, welche bei den

Untersuchungen EF-positiv waren, mit einer Odds Ratio von 21,00 und einem P-Wert

von 0,0040, eine 21fach höhere Wahrscheinlichkeit haben, aus einem

Meningitis/Septikämie-Geschehen zu stammen.

Ergebnisse

101

Als Bezugswert hinsichtlich der Hämolysin-Expression wurde der Hämolysin-negative

Phänotyp und Meningitis genommen. Dabei ist bei den Hämolysin positiven Isolate

mit einer Odds Ratio von 4,429 und einem P-Wert von 0,0046 eine 4,4fach höhere

Wahrscheinlichkeit gegeben, aus einem Meningitis/-Septikämie-Geschehen zu

stammen.

Als Bezugswert hinsichtlich der Adhärenz wurde bei beiden verwendeten Zelllinien

der Adhärenz-negative Phänotyp und Meningitis genommen. Die Isolate, welche bei

den Untersuchungen mit der HEp 2 Zelllinie eine Adhärenz zeigten, haben mit einer

Odds Ratio von 0,0429 und einem P-Wert von 0,1175, in Bezug auf die Adhärenz-

negativen Isolate, eine 2,33fach höhere Wahrscheinlichkeit, nicht aus einem

Meningitis/Septikämie-Geschehen zu stammen.

Die Isolate, welche bei den Untersuchungen mit der ST-Zelllinie eine Adhärenz

zeigten, haben mit einer Odds Ratio von 1,118 und einem P-Wert von 0,8029, in

Bezug auf die Adhärenz-negativen Isolate, eine 1,12fach höhere Wahrscheinlichkeit,

nicht aus einem Meningitis/Septikämie-Geschehen zu stammen.

4.5.3 Beziehung zwischen Genotyp und Herkunft der IsolateAls Bezugswert wurde die Grossgruppe A1ApaI und Meningitis genommen. Im Bezug

darauf ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Isolate in der GG B2ApaI aus einem

Meningitis/Septikämie-Geschehen stammen, mit einer Odds Ratio von 1,773 und

einem P-Wert von 0,0054,um das 6,5fach höher, als in der GG B2ApaI. Hinsichtlich

der Wahrscheinlichkeit, dass die Isolate in der GG B1ApaI aus einem


einem P-Wert von 0,2422, um das 2,31fache höher, als in der GG A1ApaI. Mit einer

Odds Ratio von 6,5 und einem P-Wert von 0,3587ist die Wahrscheinlichkeit, dass die

Isolate in der GG A2ApaI aus einem Meningitis/Septikämie-Geschehen zu stammen,

1,77fache höher, als in der GG B2ApaI.

Als Bezugswert wurde die Grossgruppe A1SmaI und Meningitis genommen. Mit einer

Odds Ratio von 0,170 und einem P-Wert von 0,0075 ist die Wahrscheinlichkeit, dass

die Isolate in der GG B2SmaI nicht aus einem Meningitis/Septikämie-Geschehen

stammen, 5,88 fach höher Hinsichtlich der Wahrscheinlichkeit, dass die Isolate in der

GG B1SmaI nicht aus einem Meningitis/Septikämie-Geschehen stammen, ist mit einer

Odds Ratio von 0,271 und einem P-Wert von 0,0211, um das 3,7fache höher. Die

Wahrscheinlichkeit, dass die Isolate in der GG A2SmaI nicht aus einem

Ergebnisse

102


einem P-Wert von 0,0239, um das 3,9 fache höher.

Tabelle 14: Odds ratio und Wahrscheinlichkeitsüberschreitung der Phänotypischen

Merkmale im χ2–Test bezogen auf die Herkunft der Isolate.

Phänotyp HerkunftSerotyp Meningitis/

SeptikämiePneumonie/

Sonstige

Oddsratio P – Wert

½ + 1 6 8 0,143 0,01122 21 4 1,000 ------

3 + 7 4 13 0,059 0,00034 + 5 3 10 0,057 0,0008

Sonst. 2 9 0,042 0,00099 12 8 0,286 0,0782

MRP- 9 23 1,000 -----+ 39 28 3,714 0,0046

EF- 34 50 1,000 ----+ 14 1 21,000 0,0040

Haemolysin- 20 30 1,000 ----

+/- 8 14 0,886 0,8182+ 20 7 4,429 0,0046

Adhärenz HEp 2- 42 38 1,000 ----+ 6 13 0,429 0,1175

Adhärenz ST- 34 37 1,000 ----+ 14 14 1,118 0,8029

P – Wert = Überschreitungswahrscheinlichkeit des chi2-TestesMRP = Muramidase-Released-Protein EF = Extrazellulär-FaktorAdhärenz HEp 2 = Adhärenz von Sc. suis an HEp 2 ZellenAdhärenz ST = Adhärenz von Sc. suis an ST Zellen

Ergebnisse

103

Tabelle 15: Odds ratio und Wahrscheinlichkeitsüberschreitung des Genotyps im χ2–

Test bezogen auf die Herkunft der Isolate.

Genotyp HerkunftGrossgruppe Meningitis/

SeptikämiePneumonie/Sonstige

Oddsratio

P-Wert

A1 ApaI 7 13 1,000 ----A2 ApaI 14 22 1,773 0,3587B1 ApaI 7 8 2,311 0,2422B2 ApaI 20 8 6,500 0,0054A1 SmaI 20 6 1,000 ----A2 SmaI 9 13 0,255 0,0239B1 SmaI 13 19 0,271 0,0211B2 SmaI 6 13 0,170 0,0075

P – Wert = Überschreitungswahrscheinlichkeit des chi2-TestesA1 ApaI, A2 ApaI, B1ApaI, B2 ApaI = Bildung der Grossgruppen nach Restriktionsverdau mitApaI, Auftrennung mittels PFGE und Clusterung durch UPGMAA1 SmaI, A2 SmaI, B1SmaI, B2 SmaI = Bildung der Grossgruppen nach Restriktionsverdaumit SmaI, Auftrennung mittels PFGE und Clusterung durch UPGMA

Diskussion

104

5 Diskussion

Sc. suis hat eine grosse Bedeutung als Infektionserreger beim Schwein, vor allem in

der Intensivhaltung, woraus grosse wirtschaftliche Schäden, insbesondere durch die

verminderte Mastleistung, resultieren. Da sowohl bei gesunden wie bei erkrankten

Tieren Sc. suis isoliert werden kann, ist davon auszugehen, dass Sc. suis-Stämme

sehr unterschiedlicher Virulenz existieren. Unterschiede in der Virulenzausprägung

sind nicht nur zwischen den verschiedenen Serotypen sondern auch innerhalb eines

Serotyps zu beobachten. Sc. suis zeigt auch hinsichtlich des biochemischen und

serologischen Verhaltens eine sehr hohe Diversität. So konnten bis heute 35

verschiedene Serotypen identifiziert werden.

Aufgrund des sehr häufigen Auftretens von Sc. suis Serotyp 2 in Verbindung mit den

klinischen Symptomen Meningitis und Septikämie in Europa und Nordamerika wird

postuliert, dass klonale Verwandtschaften zwischen den virulenten Stämmen

existieren. So zeigten bei Ribotypisierungen virulente und avirulente Sc. suis Serotyp

2-Stämme charakteristische Bandenmuster (STAATS et al. 1998, OKWUMABUA et

al. 1995). Die bei der Ribotypisierung entstandenen Bandenmuster ergaben aber

dennoch eine sehr hohe Diversität sowohl zwischen den einzelnen Serotypen als

auch innerhalb eines Serotyps (SMITH et al. 1997). Über die Serotyp-Verteilung und

die Virulenz der Sc. suis-Isolate in Deutschland, insbesondere in Norddeutschland,

ist bisher nur wenig bekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war daher eine

detaillierte phänotypische und genotypische Charakterisierung bzw. Differenzierung

von Sc. suis-Isolaten, die aus verschiedenen Schweinebeständen der Region

stammten, um mögliche Beziehungen zwischen dem klinischen Hintergrund der

untersuchten Isolate und deren Eigenschaften zu ermitteln. Als Vergleich wurde eine

Reihe von Referenzstämmen miteinbezogen.

In Zusammenarbeit mit Dr. H. Wisselink und Dr. H. Smith, DLO-Institute of Animal

Science and Health, Lelystad, Holland, wurde zunächst eine Serotypisierung aller

Isolate durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass der Serotyp 2 mit 25,2 % am

häufigsten vertreten war, gefolgt vom Serotyp 9 mit 20,2 %, Serotyp 3 mit 9,1 %,

sowie den Serotypen ½ und 7 mit je 8 %. Der Anteil der Isolate, die keinem Serotyp

zugeordnet werden konnten, lag mit 6 % der Isolate im Vergleich zu anderen

Untersuchungen, bei denen bis zu 15 % nicht typisierbar waren (SALA et al. 1996),

auf einem niedrigen Niveau. Es ist bekannt, dass die Verteilung der Serotypen

Diskussion

105

geographisch stark varrieren kann. So tritt z. B. in Australien vor allem der Serotyp 15

(36,4 %) auf (HAMPTON et al. 1993). Bei Untersuchungen in Kanada war der

Serotyp 2 mit 24 % am häufigsten vertreten, gefolgt von Serotyp 3 (14 %) und ½ (12

%). In Norditalien wurde der Serotyp 2 mit 36 % der untersuchten Stämme am

häufigsten vorgefunden. (SALA et al. 1996).

Über die Korrelation zwischen Serotyp 2 und Virulenz gibt es ebenfalls

unterschiedliche Erkenntnisse. So konnten z. B. MOGOLLON et al. (1990) 28 von 40

Serotyp 2-Stämmen aus pneumonischen Geschehnissen isolieren und nur 8 Isolate

von Schweinen mit Meningitis oder Septikämie. Im Gegensatz dazu stammten von

den Isolaten, die für die vorliegende Arbeit verwendet wurden, 48 Stämme (48,5 %)

von Schweinen, die an einer Meningitis oder einer Septikämie erkrankt waren.

Hinsichtlich der Herkunft der Isolate war zudem auffällig, dass von den 25 Serotyp 2-

Isolaten 24 aus erkrankten Tieren stammen, wobei 21 Isolate aus

Meningitis/Septikämie-Geschehnissen isoliert wurden. Bei den Serotyp 9 Isolaten

stammen 19 von 20 Isolaten aus erkrankten Tieren, wobei jedoch nur 12 Isolate (60

%) aus Meningitis/Septikämie-Geschehnissen stammen. 7 Isolate (35 %) stammen

aus pneumonischen Herden. Bei den Sc. suis-Serotypen ½, 3, 4, 5 und 7 konnte

eine signifikante Häufung der Isolate aus pneumonischen Geschehnissen

beobachtet werden. Der Serotyp ist jedoch offenbar nicht ausreichend, um

hochvirulente Sc. suis-Isolate zu identifizieren, da auch Sc. suis Serotyp 2-Isolate

aus gesunden Tieren gefunden wurden.

Die vorliegenden Untersuchungen der Isolate zur Expression potentieller

Virulenzfaktoren bzw. virulenzassoziierter Faktoren ergaben, dass von den

untersuchten Sc. suis-Serotyp 2 Isolaten alle bis auf 3 das Protein MRP exprimierten

(MRP+). Von diesen 22 MRP+ Isolaten waren 13 Isolate zudem auch EF positiv

(EF+). Alle MRP+/EF+-Isolate konnten aus Schweinen mit Meningitis oder

Septikämie isoliert werden, was mit den Untersuchungen von GALINA et al. (1996)

und STAATS et al. (1999) übereinstimmt. Bei deren Untersuchungen konnte

ebenfalls eine starke Korrelation von hochvirulenten Sc. suis Serotyp 2-Isolaten mit

der Expression von MRP und EF festgestellt werden. Weitere Untersuchungen von

Serotyp 2 Feld-Isolaten aus Kanada ergaben jedoch, dass über 72 % der

untersuchten Isolate von erkrankten Tieren weder MRP (MRP-) noch EF (EF-)

exprimierten (GOTTSCHALK et al. 1998).

Diskussion

106

Bei den MRP+/EF- Serotyp 2-Isolaten stammten alle bis auf ein Isolat von

Schweinen mit Meningitis oder Septikämie, was ebenfalls mit den Beobachtungen

von STAATS et al. (1999) korreliert. Jedoch konnten auch beim Serotyp 9 fast alle

(19 von 20) Isolate dem MRP+/EF- Phänotyp zugeordnet werden. Keines der

Serotyp 9-Isolate exprimierte das EF. Dabei war die Korrelation dieses Phänotyps mit

Meningitis/Septikämie nicht so deutlich wie bei Serotyp 2 (12 der 20 Serotyp 9-Isolate

stammen aus einer Meningitis/Septikämie-Erkrankung). Auch bei anderen Serotypen

konnte im Gegensatz zu GALINA et al. (1996) der MRP+/EF- Phänotyp

nachgewiesen werden, jedoch stammten von den 24 dieser Isolate nur 6 aus einer

Meningitis/Septikämie-Erkrankung, während 13 aus dem Atemtrakt von erkrankten

Schweinen isoliert worden waren. Dies bedeutet, dass anderen Serotypen als 2 und

9 keine signifikante Korrelation mit der Virulenz von Sc. suis zu bestehen scheint.

Welche Funktionen MRP und EF haben, ist noch nicht geklärt. Untersuchungen mit

“Knockout-Mutanten” ergaben, dass beide Proteine nur als virulenzassoziierte

Faktoren angesehen werden können, da auch die MRP/EF-defizienten Stämme bei

Infektionsversuchen Erkrankungen auslösten (SMITH et al. 1996). Diese Aussage

steht hinsichtlich des MRP in Übereinstimmung mit den Ergebnissen dieser Arbeit,

da das MRP sowohl bei virulenten Stämmen als auch bei potentiell avirulenten

Stämmen nachgewiesen wurde. Auch die Tatsache, dass das MRP bei einigen

virulenten Stämmen nicht nachgewiesen wurde, steht im Einklang mit den

Beobachtungen von SMITH et al. (1996). Hinsichtlich des EF ist die

Wahrscheinlichkeit, das EF-Protein bei Isolaten aus Meningitis/Septikämie-

Geschehnissen isolieren zu können, 21-mal höher, als aus anderen Geschehnissen.

Der Umkehrschluss, dass mit der gleichen Wahrscheinlichkeit Isolate, die aus einem

Meningitis/Septikämie-Geschehen stammen, das EF-Protein exprimieren, konnte

jedoch nicht gemacht werden, da von 48 Meningitis-Isolaten 34 Isolate kein EF-

Protein produzierten. Auch konnte im Gegensatz zu anderen Untersuchungen

(GALINA et al. 1996) bei keinem der untersuchten Isolate das EF-Protein ohne das

MRP nachgewiesen werden. Das EF korrelierte zwar sehr stark mit der Virulenz von

Sc. suis, so dass das EF-Protein bei Vorhandensein zwar als ein Indiz für eine hohe

Virulenz gelten kann; da jedoch die Virulenz nicht von dem Vorhandensein des EF-

Proteins abhängt, muss EF ebenfalls als nur virulenzbegleitender Faktor angesehen

werden.

Diskussion

107

Bei der Untersuchung des potentiellen Virulenzfaktors Hämolysin konnte ein sehr

deutlicher Zusammenhang einer starken Expression von Hämolysinen mit dem

jeweiligen Serotyp festgestellt werden. So produzierten bis auf einen Stamm alle

MRP/EF-positiven Serotyp 2-Isolate auch sehr deutlich Hämolysine und stammten

aus Schweinen mit Meningitis/Septikämie. Diese Korrelation der Hämolysin-positiven

Sc. suis Serotyp 2-Isolate mit einer starken Virulenz konnte auch von STAATS et al.

(1999) festgestellt werden. Jedoch konnten auch Serotyp 2-Isolate ohne

Hämolysinexpression aus Schweinen mit Meningitis/Septikämie isoliert werden, so

dass eine starke Hämolysinexpression der Serotyp 2-Isolate auf einen hochvirulenten

Stamm hinweist, jedoch eine hohe Virulenz bei Serotyp 2-Isolaten mit

einhergehender geringer oder fehlender Hämolysinexpression nicht ausgeschlossen

werden kann.

JACOBS et al. (1995) stellten bei 81 % der Serotyp 9-Isolate eine

Hämolysinexpression fest. Im Gegensatz dazu wurden bei den in dieser Arbeit

untersuchten Serotyp 9-Isolaten nur 2 mit einer deutlichen Hämolysinexpression

identifiziert. Auffällig war jedoch, dass von den 12 Isolaten, die kein Hämolysin

produzierten, bei 9 Isolaten das Hämolysin-Gen nachgewiesen werden konnte. Es

wäre daher möglich, dass die Hämolysinexpression ein regulierter Prozess ist. Um

dies zu klären, müssten weitergehende Untersuchungen vorgenommen werden.

Bei den Serotyp ½-Isolaten stammten zwar 5 von 8 Isolaten aus pneumonischen

Geschehnissen, jedoch konnte nur bei einem Isolat eine Hämolysinexpression

nachgewiesen werden, obwohl von FEDER et al. (1994) dem Sc. suis Serotyp ½-

Referenzstamm eine deutliche Hämolysinexpression zugeschrieben wurde. Ob

Serotyp ½-Stämme tatsächlich Hämolysin-positiv oder –negativ sind, müsste durch

weitergehende Untersuchungen einer grösseren Anzahl überprüft werden. Bei den

Serotyp 3-Isolaten waren bis auf einen Stamm alle ursprünglich aus pneumonischen

Geschehnissen isoliert worden. Eine deutliche Hämolysinexpression konnte dabei

nur bei einem Stamm festgestellt werden. Eine ähnliche Konstellation fand sich bei

den Sc. suis Serotypen 4, 5 und 7. Bei keinem dieser Serotypen war eine deutliche

Hämolysinexpression festzustellen. Bei den Isolaten mit den Serotypen 4 bzw. 5

konnte zwar kein Isolat mit deutlicher Hämolysinexpression nachgewiesen werden,

jedoch konnte bis auf jeweils ein Isolat bei beiden Serotypen das Hämolysin-Gen

gefunden werden. Möglicherweise ist auch bei diesen Isolaten die Expression durch

noch nicht bekannte Faktoren reguliert. Für eine Einstufung der Hämolysine als

Diskussion

108

wichtigem Virulenzfaktor von Sc. suis spricht, dass in einer Studie die Immunisierung

mit dem Hämolysin Suilysin die Schweine teilweise vor einer von nachfolgenden

experimentellen Infektion mit Sc. suis schützte (JACOBS et al. 1996). Zwar wurde

bei vielen hochvirulenten Stämmen eine starke Hämolysinexpression nachgewiesen,

wie es auch von STAATS et al. (1999) und OKWUMABUA et al. (1999) postuliert

wird, jedoch ist es nicht möglich, aufgrund nicht nachgewiesener Hämolysine bei Sc.

suis von avirulenten Isolaten zu sprechen, da in der vorliegenden Arbeit 20 von 48

hochvirulenten Isolaten keine Hämolysine produzierten. Auch konnte bei 38 von 40

Isolaten aus pneumonischen Herden keine deutliche Hämolysin-Expression

nachgewiesen werden, obwohl aufgrund ihrer Herkunft auch diese Isolate als virulent

bezeichnet werden müssen. Von den Isolaten, die von gesunden Tieren

(Nasentupfer oder Vaginaltupfer) isoliert wurden, konnte bei 36,4 % ebenfalls eine

starke Hämolysinproduktion festgestellt werden. Ob diese Isolate avirulent sind oder

isoliert wurden, bevor sie eine Erkrankung hervorrufen konnten, ist nicht geklärt und

müsste durch weitergehende Untersuchungen wie z. B. anhand experimenteller

Infektionen geklärt werden. Möglicherweise besteht ein Zusammenhang zwischen

einer starken Hämolysinexpression und einer hohen Virulenz. Jedoch müsste diese

Korrelation erst durch weitergehende Untersuchungen gesichert werden.

Die Adhärenz gilt bei vielen Bakterien als erster Schritt, um eine Infektion zu

etablieren (ROSTAND et al. 1997). In den bisher relativ wenigen Untersuchungen zur

Adhärenz von Sc. suis wurde auch bei diesem Erreger ein Zusammenhang zwischen

Adhärenz und Virulenz gesehen (GOTTSCHALK et al. 1991; HAATAJA et al. 1994;

TIKKANEN et al. 1996). Daher wurde in der vorliegenden Arbeit das

Adhärenzverhalten der verwendeten Isolate mit zwei Epithelzelllinien getestet. Dabei

konnte keine Zuordnung des Adhärenzverhaltens zu einem bestimmten Serotyp oder

Krankheitsbild festgestellt werden, vor allem, da überraschenderweise nur sehr

wenige Stämme adhärent waren. Über 90 % der potentiell hochvirulenten Isolate

(aus Meningitis/Septikämie) zeigten keine Adhärenz. Dies lässt darauf schliessen,

dass das Adhärenzvermögen nicht geeignet ist, um Hinweise auf die Virulenz zu

erhalten. Möglicherweise wird auch das Adhärenzvermögen reguliert, so dass

weitere Untersuchungen nötig sind, um die Adhärenz als potentiellen Virulenzfaktor

einschätzen zu können.

Genotypische Untersuchungen wurden bei Sc. suis mit verschiedenen Methoden wie

Ribotypisierung (STAATS et al. 1998) oder Multilokal-Enzym-Elektrophorese

Diskussion

109

(HAMPSON et al. 1993) bereits durchgeführt. Meistens bezog sich jedoch die

Untersuchung nur auf den Serotyp 2, so dass eine Aussage hinsichtlich der Diversität

zwischen den Serotypen nicht möglich war. Zur Genotypisierung der in dieser Arbeit

untersuchten Isolate wurde die Makrorestriktionsanalyse mittels Pulsfeld-

Gelelektrophorese (PFGE) verwendet. Eine Untersuchung des Genoms von Sc. suis

mittels PFGE wurde bisher noch nicht beschrieben. Durch die Verwendung zweier

Restriktionsenzyme (ApaI und SmaI) konnten Isolate, die bei einem der beiden

Enzyme ein identisches Fragmentbandenmuster zeigten, anhand des zweiten

Bandenmusters unterschieden werden. Dabei wurde festgestellt, dass im Vergleich

mit Makrorestriktionsanalysen mittels PFGE bei anderen Streptokokken (LEFEVRE

et al. 1993, RUDOLPH et al. 1998) eine vergleichbar hohe Diskriminierung erreicht

wurde. So war es möglich, Isolate auch innerhalb des gleichen Serotyps voneinander

zu unterscheiden. Diese hohe Diskriminierung ermöglicht es daher, sehr genau

epidemiologische Fragestellungen klären zu können. Dies konnte in der vorliegenden

Arbeit dadurch gezeigt werden, dass auch Isolate innerhalb eines Bestandes bzw.

von einem Tier differenzierbar waren. Jedoch ist die Methode zur Klärung von

Fragestellungen der Taxonomie weniger gut geeignet. Hierzu sollten konserviertere

Bereiche des Genoms sequenziert und mittels Clusteranalyse in Zusammenhang

gebracht werden.

Um mögliche klonale Zusammenhänge der Isolate zu erkennen, wurde im Anschluß

an die Makrorestriktion eine Clusteranalyse mittels UPGMA durchgeführt. Basierend

auf Clusteranalysen der PFGE-Muster von ApaI und SmaI-verdauter DNA, die

grafisch in Dendrogrammen dargestellt wurden, ergaben sich jeweils 4

Grossgruppen. Hinsichtlich der Erstellung der Dendrogramme anhand der

Clusteranalyse nach UPGMA muss aber berücksichtigt werden, dass die

Dendrogramme leicht variieren können und daher eine Standardisierung sehr wichtig

ist. Einen Zusammenhang des genetischen Profils mit dem klinischen Hintergrund

konnte aufgrund der Grossgruppenbildung deutlich erkannt werden. Im Gegensatz

zu den Arbeiten von RASMUSSEN et al. (1999) und CHATELLIER et al. (1999), die

ein genetisches Profil mittels Ribotypisierung erstellt hatten, waren die hochvirulenten

Stämme jedoch nicht ausschließlich in einer Grossgruppe geclustert. Die

Ribotypisierung ist allerdings im Vergleich zur PFGE eine weniger hoch auflösende

Technik. Die in der vorliegenden Arbeit festgestellte hohe Diversität des Erregers

stimmt mit den Ergebnissen von HAMPSON et al. (1993) überein. Allerdings konnten

Diskussion

110

HAMPSON et al. (1993) mit der von ihnen durchgeführten Multilokal-Enzym-

Elektrophorese keine klonale Verwandtschaften bei den Isolaten mit gleichem

klinischen Hintergrund feststellen.

Bei dem Vergleich des Genotyps mit der Expression der potentiellen Virulenzmarker

konnte eine Clusterung hinsichtlich der Serotyp 2-, MRP+/EF+- und stark Hämolysin

exprimierenden Isolate festgestellt werden. Daher ist die Möglichkeit gegeben, dass

diese Erreger in enger klonale Beziehung zueinander stehen. Vergleichbare

Korrelationen des Genotyps mit den phänotypischen Merkmalen konnte auch von

SMITH et al. (1997), STAATS et al. (1998) und CHATELLIER et al. (1999)

festgestellt werden; jedoch beschränkten sich die Untersuchungen mittels

Ribotypisierung nur auf die Serotypen 2 bzw. 1. Die vorliegenden Ergebnisse führten

damit zu dem Schluss, dass die meisten hochvirulenten Isolate dem Serotyp 2

angehörten, die Proteine MRP und EF exprimierten, eine starke

Hämolysinexpression zeigten und nach Makrorestriktionsanalyse in einer

Hauptgruppe geclustert waren und somit offenbar in einem sehr engen genetischen

Verhältnis stehen.

Hinsichtlich des Nachweises virulenter Sc. suis-Stämme anhand genotypischer oder

phänotypischer Eigenschaften müssen noch weitere Untersuchungen zur Klärung

der Virulenz des Erregers folgen, um die klonalen Zusammenhänge, die in dieser

Arbeit aufgezeigt wurden, untermauern zu können.

Zusammenfassung

111

6 ZusammenfassungInfektionen mit Sc. suis können beim Schwein zu Meningitiden, Arthritiden,

Septikämien, Endokarditiden und Pneumonien führen und haben hohe wirtschaftliche

Schäden in der Intensivhaltung der Schweinemast zur Folge. Beim Menschen kann

Sc. suis Meningitiden auslösen und gilt daher als Zoonose-Erreger. Ein wesentliches

Problem ist jedoch offenbar, dass die Virulenz der verschiedenen Stämme sehr

unterschiedlich ist. Bisher konnten mehrere potentielle Virulenzfaktoren bzw.

virulenzbegleitende Faktoren von Sc. suis identifiziert werden. Die Rolle dieser

Faktoren in der Virulenz von Sc. suis ist jedoch noch nicht geklärt.

In der vorliegenden Arbeit wurden 99 Sc. suis-Isolate mit unterschiedlichem

klinischen Hintergrund phänotypisch und genotypisch charakterisiert. Ziel der

Untersuchungen war es, mögliche Beziehungen zwischen Genotyp, klinischem

Hintergrund und der Expression der bisher bekannten, potentiellen Virulenzmerkmale

(Polysaccharidkapsel, Muramidase-Released-Protein [MRP], Extrazellulär-Faktor

[EF], Hämolysin und Adhärenz) herauszuarbeiten.

Hinsichtlich der Serotypisierung auf der Grundlage der Kapselpolysaccharidantigene

wurde eine signifikante Häufung von Sc. suis -Isolaten der Serotypen 2 (25,3 %) und

9 (20,2 %) festgestellt. Von den Sc. suis Serotyp 2-Isolaten konnten 84 % als

hochvirulent eingestuft werden, da sie aus Tieren mit Meningitis oder Septikämie

isoliert wurden. Bei den Serotyp 9-Isolaten wurden 60 % der Isolate aufgrund ihrer

Herkunft als hochvirulent eingestuft. Mit 35 % der Serotyp 9-Isolate, die aus

Lungenerkrankungen isoliert wurden, war der Anteil der weniger virulenten Stämme

bei diesem Serotyp deutlich höher als bei den Sc. suis Serotyp 2-Isolaten. Bei den

übrigen Serotypen überwog der Anteil der schwach virulenten oder potentiell

avirulenten Isolate.

Bei der Analyse der virulenzbegleitenden Faktoren MRP und EF konnte gezeigt

werden, dass 14 von 15 Isolaten, bei denen sowohl MRP als auch EF nachgewiesen

wurde, hochvirulent waren. Dreizehn dieser hochvirulenten Isolate waren dem

Serotyp 2 zuzuordnen. Bei den 52 Isolaten, die nur MRP exprimierten, war der Anteil

der hochvirulenten Isolate mit 25 deutlich geringer. Hier war der Anteil der

schwachvirulenten Isolate mit 21 Isolaten und der potentiell avirulenten Isolaten mit 6

Isolaten hoch. Bei den Isolaten, die weder MRP noch EF exprimierten, war der Anteil

der hochvirulenten Isolate am geringsten.

Zusammenfassung

112

Hinsichtlich der Expression von Hämolysin konnte festgestellt werden, dass von den

27 Isolaten, welche eine starke Hämolysinexpression zeigten, 14 Isolate dem Sc.

suis Serotyp 2 angehörten. Insgesamt 22 Isolate zeigten eine schwache

Hämolysinexpression, jedoch konnte auch bei diesen das Hämolysin-Gen

nachgewiesen werden. Bei den Isolaten mit schwacher Hämolysinexpression war der

Anteil der schwach virulenten Isolate mit 14 Stämmen relativ hoch. Bei den 50

Isolaten ohne nachweisbare Hämolysinexpression konnte bei 50 % das Hämolysin-

Gen detektiert werden.

Die Untersuchung der Adhärenzeigenschaften von Sc. suis ergab nur bei sehr

wenigen Stämmen eine deutliche Adhärenz. Eine Zuordnung hinsichtlich der Virulenz

konnte daher nicht gemacht werden.

Die Genotypisierung mittels Makrorestriktionanalyse in der Pulsfeld-

Gelelektrophorese (PFGE) ermöglichte anhand des entsprechenden Restriktions-

fragmentmusters eine stammspezifische Differenzierung. Die mittels dieser

Restriktionsfragmentmuster erstellte Clusteranalyse ergab, dass die Isolate 4

Hauptgruppen zugeordnet werden konnten. Der Vergleich dieser Zuordnung

Zusammenhang mit den Ergebnissen der phänotypischen Untersuchungen ergab,

dass die meisten hochvirulenten Isolate dem Serotyp 2 angehören, die Proteine MRP

und EF exprimierten, eine starke Hämolysinexpression zeigten und nach

Makrorestriktionsanalyse in einer Hauptgruppe geclustert werden. Isolate mit einer

geringeren Virulenz sowie Isolate von gesunden Schweinen zeigten dagegen eine

wesentlich stärkere Heterogenität des phäno- und genotypischen Hintergrundes.

Die Ergebnisse dieser Arbeit repräsentieren die erste detaillierte Dokumentation des

geno- und phänotypischen Hintergrunds einer Sc. suis-Population aus dem

norddeutschen Raum und belegen darüber hinaus, dass bestimmte phänotypische

und genotypische Merkmale mit der Virulenz von Sc. suis korrelieren. Die genauen

klonalen Zusammenhänge, auf die die Ergebnisse dieser Arbeit hinweisen, müssen

in zukünftigen Studien geklärt werden, um damit einen Beitrag für die Entwicklung

besserer Bekämpfungsstrategien bei Sc. suis-Infektionen zu leisten.

Summary

113

7 Summary

Characterisation of Streptococcus suis:Relation of clinical background expression of potential virulence factors andgenotype

Achim Allgaier

Sc. suis is a pathogenic bacterial species that may cause meningitis, arthritis,

septicaemia, endocarditis and pneumonia in pigs and leads to high economical

losses in intensive pig fattening. In humans Sc. suis may cause meningitis and is,

therefore, classified as a causative agent of zoonosis. An essential problem seems to

be the difference between the virulence of the various strains. So far, some virulence

factors and virulence associated factors have been identified. However, their function

concerning the virulence of the pathogen is not yet understood.

In this study we characterised 99 isolates of Sc. suis according to their phenotypic

and genetic features. The aim of this study was to evaluate a possible relationship

between genotype, clinical background and expression of the known putative

virulence factors (polysaccharride capsule, muramidase released protein (MRP),

extracellular factor protein (EF), haemolysin and adherence).

Analysis of the serotype showed a significant accumulation of serotype 2 (25,3 %)

and 9 (20,2 %). In terms of virulence, 84 % of the serotype 2 strains were defined as

highly virulent because they were isolated from animals suffering either from

meningitis or septicaemia. Within the serotype 9 isolates, 60 % were classified as

highly virulent according to their clinical background. Since 35 % of the serotype 9

isolates were isolated from cases of lung diseases, the part of only weakly virulent

strains within this serotype was distinctly higher than in Sc. suis 2 isolates. In all other

serotypes that were used in this study the part of weakly virulent or potential non-

virulent isolates was even.

The study revealed a significant correlation between the clinical background and the

production of the MRP- and the EF-protein: 14 of 15 isolates that expressed MRP as

well as EF were highly virulent. Thirteen of these isolates belonged to serotype 2.

Within the 52 isolates expressing only MRP, the portion of highly virulent isolates was

distinctly lower (25 isolates). In this group the portion of weakly virulent (21) and

Summary

114

potential non-virulent (6) isolates was high. Within the isolates expressing neither

MRP nor EF the portion of highly virulent isolates was lowest.

Twenty-seven isolates showed a production of haemolysin. Of these isolates 14

isolates belonged to serotype 2. Twenty-one isolates showed a low production of

haemolysin although the gene of haemolysin was detected. Within these isolates the

portion of weakly virulent isolates was high (14 isolates). Within the group of 50

isolates without a provable synthesis of haemolysin the haemolysin gene was

detected in 50 % of the isolates.

The adherence showed no distinct correlation to the virulence of the strains. Only a

few number of isolates proved to be adherent.

By macrorestriction analysis using pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) it was

possible to discriminate between different strains via their restriction fragment

patterns. Cluster analysis of these data and the typifying investigation showed that

most of the high virulent strains belonged to serotype 2 and expressed MRP as well

as EF, showed a distinct production of haemolysin and were clustered in the same

main group after macrorestriction analysis. Weakly virulent isolates and isolates from

healthy pigs had a much more heterogeneous pheno- and genotypic background.

The results of this study represent the first detailed documentation of the pheno- and

genotypic background in a Sc. suis population in the northern part of Germany.

Furthermore, it has been proven, that certain phenotypic and genotypic features

correlate with the virulence in Sc. suis strains. To ensure the clonal context this study

already indicates, further investigations need to be done to make a contribution to

develop better control strategies in Sc. suis infections.

Anhang

115

8 Literaturverzeichnis

AMASS, S. F., C. C. WU u. L. K. CLARK (1996)

Evaluation of antibiotics for the elimination of the tonsillar carrier of Streptococcus

suis in pigs

J. Vet. Diagn. Invest. 8, 64 - 67

ARENDS, J. P. u. H. C. ZANEN (1988)

Meningitis caused by Streptococcus suis in Humans

Reviews of Infectious Diseases, 10, 131 - 137

AARESTRUP F. M., S. E. JORSAL u. N. E. JENSEN (1998)

Serological characterization and microbial susceptibility of Streptococcus suis

isolates from diagnostic samples in Denmark during 1995 and 1996

Vet. Microbiol. 60, 59 - 66

BENTLEY, R. W., J. A. LEIGH u. M. D. COLLINS (1991):

Intrageneric structure of Streptococcus based on comperative anlysis of Smal-

subunit rRNA sequences

Int. J. syst. Bacteriol. 41, 487 – 494

BEAUDOIN, M. J. HAREL, R. HIGGINS, M. GOTTSCHALK, M. FRENETTE a. J. I.

MACINNES (1992)

Molecular analysis of isolates of Streptococcus suis capsular type 2 by restriction-

endonuclease-digested DNA separated on SDS-PAGE and by hybridization with an

rDNA probe

J. Gen. Microbiol, 138, 2639 - 2645

BISPING, W., u. G. AMTSBERG (1988):

Farbatlas zur Diagnose bakterieller Infektionserreger der Tiere

Verlag Parey, Berlin u. Hamburg

Anhang

116

BROSIUS, J., J. L. PALMER, J. P. KENNEDY a. M. D. COLLINS (1981)

Complete nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA gene from Eschecheria coli

J. Nat. Acad. Sci. 75, 4801 – 4805

CHARLAND N., J. HAREL, M. KOBISCH, S. LACASSE u. M. GOTTSCHALK (1998)

Streptococcus suis serotype 2 mutants deficient in capsular expression

Microbiol. 114, 325 – 332

CHARLAND N., V. NIZET, RUBENS C. E., K. S.KIM, S. LACOUTURE u. M.

GOTTSCHALK (2000)

Streptococcus suis serotype 2 interactions with human brain microvascular

endothelial cells

Infect. Immun. 68, 637 - 643

CHATELLIER, S., M. GOTTSCHALK, R. HIG GINS, R. BROUSSEAU u. J. HAREL

(1999)

Relatedness of Streptococcus suis Serotype 2 isolates from different geographic

origins as evaluated by molecular fingerprinting and phenotyping

J. Clin. Microbiol. 37, 362 – 366

COYKENDAL, A. L., P. M. WESBECHER u. K. B. GUSTAFSON (1987):

„Streptococcus milleri“, Streptococcus constellatus and Streptococcus intermedius

are later synonyms of Streptococcus anginosus.

Int. J. syst. Bacteriol 37, 222 - 228

CLIFTON-HADLEY, F. A. (1983)

Streptococcus sios type 2 infections

Br. Vet. J. 139, 1-5

Anhang

117

CLIFTON-HADLEY, F. A, u. T. J. L. ALEXANDER (1980)

The carrier site and carrier rate of Streptococcus suis type II in pigs

Vet. Rec. 107, 40 – 41

COLLINS, M. D., J. A. E. FARROW, V. KATIC u. O. KANDLER (1984a)

Taxonomic studies on streptococci of serological group E, P, U and V. Description of

Streptococcus porcinus sp. Nov.

Syst. Appl. Microbiol. 5, 402 - 413

COOKE, B. C. (1984)

Instability of penicillin in feed

Vet. Rec. 115, 447 – 448

DAVIES, P. R. u. C. J. OSSOWICZ (1991)

Evaluation of methods used for detecting Streptococcus suis type 2 in, tonsils, and

investigation of the carrier state in pigs

Research in Vet. Science 50, 190 - 194

DEE, S. A. u. M. M. COREY (1993)

He survival of Streptococcus suis on farm and veterinary equipment

Swine Health and Production 1, 17 - 20

DE GRANDIS, S., H. LAW, J. BRUNTON, C. GYLES a. C. A. LINGWOOD (1989)

Globotetraosylceramide is recognized by the pig edema toxin

J. Biol. Chem 264,12520 – 12525

DE MOOR, C. E. (1963)

Septicaemic infections in pigs, caused by haemolytic streptococci of new Lancefield

groups designated R, S and T

Antonie v. Loewenhoek 29, 272 - 280

Anhang

118

DEVRIESE, L. A., K. CEYSSENS, J. HOMMEZ, R. KILPPER-BÄLZ u. K. H.

SCHLEIFER (1991)

Characterisation of different Streptococcus suis ecovars and description of a

simplified identification method.

Vet. Microbiol. 26, 141 – 150

DICE, L. R. (1945)

Measures of the amount of ecologic association between species

Ecology 26, 297 - 3020

EL-ADHAMI, W., L. ROBERTS, A., VICKERY, B. INGLIS, A. GIBBS u. P. R.

STEWART (1991)

Epidemiological analysis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus outbreak

using restriction fragment length polymorphism of genomic DNA

J. Gen. Microbiol. 137, 2713 - 2720

ELLEN, R. P., a. R. J. GIBBONS (1972)

M – protein – associated adherence of Streptococcus pyogenes to epithel surfaces:

prerequisite for virulence

Infect. Immun. 5, 826 - 830

ELLIOTT, S. D. (1966)

Streptococcal infektion in young pigs

II. Epidemiology and experimental production of the disease

J. Hyg. Camb. 64, 213

ELLIOTT, S. D., M. Mc CARTY u. R. C. LANCEFIELD (1977)

Teichoic acids of group D streptococci with special reference to strains from pig

meningitis (Streptococcus suis)

J. Exp. Med. 145, 490 -499

Anhang

119

ELLIOTT, E. D., u. J. Y. TAI (1978)

The type – specific polysaccharides of Streptococcus suis

J. Exp. Med. 148, 1699 - 1704

ERICKSON, E. D., A. R. DOSTER u. T. S. POKORNY (1984)

Isolation of Streptococcus suis from swine in Nebraska

J. Am. Vet. Med. Assoc. 185, 666 - 668

ESTEOPANGESTIE, S., u. LÄMMLER, C. (1993)

Distribution of capsular types 1 to 28 and further characteristics of Streptococcus suis

isolates from various european countries

Zentralbl. Bakteriol. 279, 394 - 403

FEDER, I., M. M. CHENGAPPA, B. FENWICK, M. RIDER u. J. STAATS (1994)

Partial characterization of Streptococcus suis type 2 Hemolysin

J. Clin. Microbiol. 32, 1256 - 1260

FELTHAM, R. K. A. (1979)

A taxonomic study of the genus streptococci

In: M. T. PARKER (Hrsg.):Pathogenic streptococci

Reedbooks Ltd., Chertsey, Surrey

FARROW,J. A. E., J. KRUZE, B. A. PHILLIPS, A. J. BRAMLEY u. M. D. COLLINS

(1984):

Taxonomic studies on Streptococcus bovis and Streptococcus equinus: description of

Streptococcus alaktolyticus sp. nov.

Syst. Appl. Microbiol. 5, 467 – 482

GALINA, L., U. VECHT, H. J. WISSELINK u. C. PIJOAN (1996)

Prevalence of parios phenotypes of Streptococcus suis isolated from swine in the

U.S.A. based on the presence of Muramidase-Released Protein and Extracellular

Factor

Can. J. Vet. Res. 60, 72 - 74

Anhang

120

FIELD, H. I., D. BUNTAIN u. J. T. DONE (1954)

Studies on piglet mortality: 1. Streptococcal meningitis and arthritis

Vet. Rec. 66, 453 – 455

FISCHETTI, V. A. (1989)

Streptococcal M protein: molecular design and biological behavior

Clin. Microbiol. Rev. 2, 285 - 314

GARVIE, E. I., u. A. J. BRAMLEY (1979):

Streptococcus bovis – an approach to its classification and its importance as a cause

of bovine mastitis.

J. Appl. Microbiol. 46, 557 - 566

GRIMONT, F., u. P. A. D. GRIMONT (1986)

Ribosomal ribonucleic acid gene restriction patterns as potential taxonomic tools

Ann.Microbiol. Inst. Pasteur 137B, 165 - 175

GOTTSCHALK, M., R. HIGGINS, M. JAQUES, K. R. MITTAL u. J. HENRICHSEN

(1989)

Description of 14 new capsular types of Streptococcus suis


GOTTSCHALK, M., R. HIGGINS, M. JAQUES,(1991 a)

Isolation and characterisation of Streptococcus suis capsular types 9 - 22

J. Vet. Diagn. Invest. 3, 60 – 65

GOTTSCHALK, M., R. HIGGINS, M. JAQUES, M. BEAUDOIN u. J. HENRICHSEN

(1991 b)

Characterisation of six new capsular types ( 23 through 28 ) of Streptococcus suis


Anhang

121

GOTTSCHALK, M., S. PETITBOIS, R. HIGGINS, u. M. JAQUES, (1991 c)

Adhaerence of Streptococcus suis capsular type 2 to porcine lung sektions

Can. J. Vet. Res.55, 302 – 304

GOTTSCHALK, M., R. HIGGINS, u M. BOUDREAU (1993)

Use of polyvalent Coagglutination reagents for Serotyping of Streptococcus suis


GOTTSCHALK, M., S. LACOUTURE a. J. D. DUBREUIL (1995)

Characterization of Streptococcus suis capsular type 2 haemolysin

J. Microbiol. 141, 189 – 195

GOTTSCHALK, M., A. LEBRUN, H. WISSELINK, J. D. DUBREUIL, H. SMITH u. U.

VECHT (1998)

Production of virulence-related proteins by Canadian strains of Streptococcus suis

capsular type 2

Can. J. Vet. Res. 62, 75 - 79

HAMPSON, D. J., D. J. TROTT, I. L. CLARKE, C. G. MWANIKI u. I. D. ROBERTSON

(1993)

Population structure of Australian isolates of Streptococcus suis


HARDIE, J.M. (1986)

Genus Streptococcus Rosenbach 1884

In P. A. H. SNEATH, N. S. MAIR u. M. E. SHARPE (Hrsg.): Bergey’s Manual of

systematic bacteriology, 8. Aufl. Bd. 2

Williams u. Wilkins, Baltimore 1986, S 1043 - 1047

Anhang

122

HAREL, J., R. HIGGINS, M. GOTTSCHALK u. M. BIGRAS-POULIN (1994)

Genomic relatedness among reference strains of different Streptococcus suis

serotypes

Can. J. Vet. Res. 58, 259 – 262

HAMPSON, D. J., D. J. TROTT, I. L. CLARKE, C. G. MWANIKI u. I. D. ROBERTSON

(1993)

Population structure of Australian Isolates of Streptococcus suis

J. Clin. Microbiol.31, 2895 - 2900

HAATAJA, S., K. TIKKANEN, U. NILSSON, G. MAGNUSSON, K.-A. KARLSSSON u.

J. FINNE (1994)

Oligosaccharide-Receptor Interaction of the Galα1-4Gal binding adhesin of

Streptococcus suis

J. Biol. Chem. 269, 27466 - 27472

HESSELBARTH, J. A. u. S. SCHWARZ, 1995

Comparative ribotyping of Staphylococcus intermedius from dogs, pigeons, horses

and mink.

Vet. Microbiol. 45,11 - 17

HOLT, M. E., M. R. ENRIGHT u. T. J. ALEXANDER (1988)

Immunization of pigs with live cultures of Streptococcus suis type 2

Res. Vet. Sci. 45, 349 – 352

HOMMEZ, J., L. A. DEVRIESE, J. HENRICHSEN u. F. CASTRYCK (1986)

Identification and characterization of Streptococcus suis

Vet. Rec.123, 626 - 627

IGLESIAS, A. P. CEGLOWSKI u. T. A. TRAUTNER (1983)

Plasmid transformation in Bacillus subtilis. Effekts of the insertion of Bacillus subtilis

rRNA genes into plasmids.

Mol. Gen. Genet. 192, 149 - 155

Anhang

123

ISHIKAWA, H. a. Y. ISAYAMA (1987)

Evidence for sialyl glycoconjugates as receptors for Bordetella bronchiseptica on

swine nasal mucosa

Infect. Immun. 55, 1607 - 1609

JACOBS, A. A. C., P. L. W. LOEFFEN, A. J. G. VAN DEN BERG, u. P. K. STORM

(1994)

Identification, purification and characteization of a thiol – activated hemolysin

(Suilysin) of Streptococcus suis

Infect. Immun. 62, 1742 - 1748

JACOBS, A. A. C., VAN DEN BERG, J. C. BAARS, B. NIELSEN u. L. W.

JOHANNSEN (1995)

Production of the suilysin, the thio-activated haemolysin of Streptococcus suis, by

field isolates from diseased pigs

Vet. Rec.137, 295 - 296

JACOBS, A. A. C., VAN DEN BERG, A. J. G. u. P. L. W. LOEFFEN (1996)

Protection of experimentally infected pigs by suilysin, the thiol – activated haemolysin

of Streptococcus suis

Vet. Rec. 139, 225 - 228

JANSEN, J., u. C. A. VAN DORSSEN (1951)

Meningo – Encephalitis bij varkens door streptokokken

Tijdschr. Diergeneskd. 76, 815 - 832

KAUFHOLD, A., R. LÜTTICKEN u. S.LITTERSCHEID (1988)

Systemische Infektion durch Streptococcus suis

Dtsch. Med. Wochenschr. 113, 1642 - 1643

KILPPER-BÄLZ, R.; G. FISCHER u. K. H. SCHLEIFER (1982)

Nucleic acid hybridization af group N and group D streptococci

Curr. Microbiol. 7, 245 – 250

Anhang

124

KILPPER-BÄLZ, R.; u. K. H. SCHLEIFER (1984):

Nucleic acid hybridization and cell wall composition studies of pyogenic streptococci.

FEMS Microbiol. Lett. 24, 355 – 364

KILPPER-BÄLZ, R.; u. K. H. SCHLEIFER (1987):

Streptococcus suis sp. nom. Rev.

Int. J. Sys. Bacteriol. 37, 160 - 162

KREIENBROCK L., u. S. SCHACH (1997)

Epidemiologische Methoden 2. Aufl..

Biometrie, (Hrsg.: R.J.Lorenz u. J. Vollmar), Jena Verlag, Stuttgart

KURL, D. N., S. HAATAJA u. J. FINNE (1989)

Hemagglutination activity of group B, C, D and G Streptococci: Demonstration of

novel sugar-specific cell-binding activities in Streptococcus suis

Infect. Immun. 57, 384 - 389

KUNTER, E., u. W. WITTIG (1976)

R - und S – Streptokokeninfektionen beim Schwein

Arch. Exper. Vet. Med. 30, 211 - 216

LÄMMLER, C. (1992):

Neue Aspekte zur Taxonomie der Streptokokken.

DVG-Tagung der Fachgruppe: „Bakteriologie und bakterielle Krankheiten“.

Schloss Rauschholzhausen b. Marburg, 3. – 5. Juni 1992, 190 - 198

LÄMMLER, C. u. G. HAHN (1994):

Streptokokkeninfektionen, 2. Aufl.

Band II/2 Streptokokkeninfektionen und Rotlauf

In: H. BLOBEL u. T. SCHLIEssER (Hrsg.): Handbuch der bakteriellen Infektionen bei

Tieren. Gustav Fischer Verlag Jena Stuttgart (1994), 15 – 141

Anhang

125

LAEMMLI, U. K. (1970)

Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4

Nature 227, 680 - 685

LANCEFIELD, R. C. (1933):

A serological differentiation of human and other groups of haemolytic streptococci

J. Exp. Med. 57, 571 – 595

LEFEVRE, J. C., G. FAUCON, A. M. SICARD u. A. M. GASC (1993)

DNA-Fingerprinting of Streptococcus pneumoniae strains by pulsed field gel-

elektrophoresis


LAMONT, M. H., P. T. EDWARDS u. R. S.WINDSOR (1980)

Streptococcal meningitis in pigs Results of a five-year survey

Vet. Rec. 107, 467 – 469

La PENTA, D., RUBENS, C. E., CHI, E u. P.P. CLEARY (1994)

Group A-Streptococci efficiently invade human respiratory epithelial cells

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12115 - 12119

MADEC, F., M. KOBISCH, M. LE MENEC, P. SANDERS u. H. GUILMOTO (1986)

Sudden death in growing pigs related to Streptococcus suis type II in France.

Epidemiological and prophylactical aspects

In: 9th. Int. Pig. Vet. Soc. Proc., Barcelona 1986, 361

MOGOLLON J. D., C. PIJOAN, M. P. MURTAUGH, E. L. KAPLAN, J. E. COLLINS u.

P. P. CLEARY (1990)

Characterization of prototype and clinically defined strains of Streptococcus suis by

genomic fingerprinting


Anhang

126

MOURICOUT, M., J. M. PETIT,J. R. CARIAS, a. R. JULIEN (1990)

Glycoprotein glycans that inhibit adhesion of Escherichia coli mediated by K99

fimbriae: treatment of experimental colibacillosis


MUNDT, J. O. (1986)

Enterococci; Lactic acid streptococci




NORTON P: M., u. J. A. LEIGH (1997)

Virulence mechanism of Streptococcus suis

Adv. Exp. Med. Biol. 418, 823 – 825

NORTON P: M., C. ROLPH, P.N. WARD, R.W. BENTLEY u. J. A. LEIGH (1999)

Epithelial invasion and cell lysis by virulent strains of Streptococcus suis is enhanced

by the presence of suilysin

FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1, 25 - 35

OKWUMABUA, O., O. ABDELMAGID, u. M. M. CHENGAPPA (1999)

Hybridization analysis of the gene encoding a hemolysin (suilysin) of Streptococcus

suis type 2: evidence for the absence of the gene in some isolates

FEMS Microbiology Letters 181,113 - 121

OKWUMABUA, O., J. STAATS u. M. M. CHENGAPPA (1995)

Detektion of genomic heterogenity in Streptococcus suis isolates by DNA restriktion

fragment length polymorphism of rRNA genes (Ribotyping)


OLSEN, J. E. u. M. SKOV (1984)

Genomic lineage of Salmonella enterica serovar Dublin


Anhang

127

PARKER, M. T.(1978)

The pattern of streptococcal diseases in man

In: SKINNER, F. A. u. L. B. Quesnal (Hrsg.): Streptococci.

PERCH, B., K. B. PEDERSEN u. J. HENRICHSEN (1983)

Serology of capsulated streptococci pathogenic for pigs: Six new serotypes of

Streptococcus suis.

J. Clin. Microbiol., 17, 993 – 996

QUESSY, S.; J. D. DUBREUIL, M. CAYA u. R. HIGGINS (1994)

Protein profiles comparison of virulent and avirulent Streptococcus suis serotype 2

isolates from different geograhpical areas

In: 13th Int. Pig Vet. Soc. Proc., Bangkok, S 140

RASMUSSEN R. S., F. M. AARESTRUP, N. E. JENSEN a. S. E. JORSAL (1999)

Association of Streptococcus suis serotyp 2 ribotype profiles with clinical disease and

antimicrobial resistance


ROBERTSON, I. D., u. D. K. BLACKMORE (1989)

Prevalence of Streptococcus suis types 1 and 2 in domestic pigs in Australia and

New Zealand

Vet. Rec. 124, 391 - 394

ROBINSON, M., J. M. STROMLEY, V. H. VAREL u. E.P. CATO (1988)

Streptococcus intestinalis, a new species from the colons and feces of pigs.

Int. J. Syst. Bakteriol. 38, 245 - 248

Anhang

128

ROMLING, U., D. GROTHEUS, T. HEUER u. B. TÜMMLER (1992)

Physical genome analyses of bacteria

Electrophoresis 13, 626 – 631

ROSTAND K. S., a. J. D. ESKO (1997)

Microbial adherence to and invasion through proteoglycans


ROTTA, J. (1986)

Pyogenic haemolytic streptococci




RUDOLPH K. M., A. PARKINSON, u. M. C. ROBERTS (1998)

Molekular-Analysis by pulsed-field gel elektrophoresis and antibiogram of

Streptococcus pneumoniae Serotype 6B isolates from selekted areas within the

United States


SAIKI, R. K., S. J. SCHARF, F. FALOONA, K. B. MULLIS, G. T. HORN, H. A.

ERLICH u. N. ARNHEIM (1985)

Enzymatic amplification of beta-globulin genomic sequences and restriction site

analysis for diagnosis of sickly cell anemia

Science 230,1350 - 1354

SALA, V., M. ANTONINI, O. VISCHI, A. ANSUINI, P. F. GUADAGNINI, G.

CONEDERA, M. FABBI u. S. PERINI (1996)

Distribution of capsular types and hemolysin production of Streptococcus suis

isolates in Northern Italy

Proceedings of the 14th IPVS Bologna, Italy

Anhang

129

SAMBROOK, J., E. F. FRITSCH a. T. MANIATIS (1989)

In: C. NOLAN (Hrsg.): Molekulae cloning: Alaboratory Manual

2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA

SANDFORD, S. E., u. R. HIGGINS (1992)

Streptococcal diseases

In: A. D. LEMAN, B. E. STRAW, W: L. MENGELING, S. D’ALLAIRE u. D.J. TAYLOR

(Hrsg.): Diseases of swine, 7. Aufl.

Iowa State University Press, S 588 – 598

SANDFORD, S. E., u. A. M. E. TILKER (1982)

Streptococcus suis type II-associated diseases in swine:Observation of a one-year

study

J. Am. Vet. Med. Assoc. 181, 637 – 676

SCHLEIFER, K. H. (1986):

Grampositive cocci

In: P. H. A. SNEATH, N. S. MAIR u. M. E. SHARPE (Hrsg.): Bergey’s Manual of

systematic bacteriology. 8. Auflage. Bd. 2

Verlag Williams and Wilkins, Baltimore, London, S. 999 – 1002

SCHLEIFER, K. H. u. R. KILPPER-BÄLZ (1987):

Molecular and chemotaxonomic approaches to the classifikation of Streptococci,

Enterococci and Lactococci: A review.

Syst. Appl. Microbiol. 10, 1 –19

SCHWARTZ, D. C., u. C. R. CANTOR (1984)

Separation of yearst chromosome-sized DNAs by pulsed-field gradient gel

elektrophoresis

Cell 37, 67 – 75

Anhang

130

SEGERS R. P., T. KENTER, L. A. de HAAN, u. A. A. JACOBS (1998)

Characterization of the gene encoding suilysin from Streptococcus suis and

expression in field strains

FEMS Microbiol. Letters 167, 255 - 261

SEGURA, M., P. CLEROUX u. M. GOTTSCHALK (1998)

Streptococcus suis and group B Streptococcus differ in their interactions with murine

macrophages

FEMS Immunol. Med. Microbiol. 3, 189 - 195

SIHVONEN, L., D. N. KURL u.J. HENRICHSE (1988)

Streptococcus suis isolated from pigs in Finnland

Acta Vet. Scand. 29, 9 - 13

SMITH, E: H., U. VECHT, A. L. J. GIELKENS a. M. A. SMITS (1992)

Cloning and nucleotide sequence of the gene encoding the 136 – kilodalten surface

protein (Muramidase – released protein) of Streptococcus suis type 2

Infect. Immun. 60, 2361 – 2367

SMITH, E: H., F. H. REEK, U. VECHT, A. L. J. GIELKENS a. M. A. SMITS (1993)

Repeats in an extracellular protein of weakly phathogenic strains of Streptococcus

suis type 2 are absent in pathogenic strains

Infect. Immun 61,3318 - 3326

SMITH, E: H., U. VECHT, H. J. WISSELINK, N. STOCKHOFE-ZURWIEDEN, Y.

BIERMANN a. M. A. SMITS (1996)

Mutants of Streptococcus suis types 1 and 2 impaired in expression of Muramidase-

released protein an Extracellular protein induce disease in newborn germfree pigs

Infect. Immun. 64, 4409 - 4412

Anhang

131

SMITH, E: H., M. RIJNSBURGER, N. STOCKHOFE-ZURWIEDEN H. J. WISSELINK,

U. VECHT, , a. M. A. SMITS (1997)

Virulent strains of Streptococcus suis Serotype 2 and highly virulent Strains of

Streptococcus suis Serotyp 1 can be recognized by a unique ribotype profile

J. Clin. Microbiol. 35,1049 - 1053

SMITH, E: H., V. VEERBERGEN, J. van der VELDE. M. DAMMAN, J. WISSELINK,

U. VECHT, , a. M. A. SMITS (1999)

The cps genes of Streptococcus suis serotypes 1,2 and 9: development of rapid

serotype-specific PCR assays

J. Clin. Microbiol.37, 3146 - 3152

SMITH, E: H., M. DAMMAN . J. van der VELDE F. WAGENAAR, J. WISSELINK, U.

VECHT, N. STOCKHOFE-ZURWIEDEN , a. M. A. SMITS (1999)

Identification and characterization of the cps locus of Streptococcus suis serotyp 2:

the capsule protects against phagocytosis and is an important virulence factor

Infect. Immun. 67, 1750 – 1756

STAATS,J., B. L. PLATTNER, J. NIETFELD, S. DRITZ a. M. M. CHENGAPPA

(1998)

Use of ribotyping and hemolysin activity to identify highly virulent Streptococcus suis

type 2 Isolates


STAATS,J.C., B. L. PLATTNER, G. C. STEWART a. M. M. CHENGAPPA (1999)

Presence of the Streptococcus suis suilysin gene and expression of MRP and EF

correlates with high virulence in Streptococcus suis serotype 2 isolates


SZANCER, J. u. U. VECHT (1996)

Evaluation of Penethamate for the treatment of experimentally induced

Streptococcus suis meningitis in pigs

Proceedings of the 14th IPVS Bologna, Italy

Anhang

132

TARRADAS, C., A. ARENAS, A. MALDONADO, I. LUQUE, A. MIRANDA u. A.

PAREA (1994a)

Identifikation of streptococcus isolated from swine: Proposalfor biochemical

parameters


TAYLOR, D. J. (1989)

Streptococcal infections

In D. J. TAYLOR (Hrsg.): Pig diseases

Burlington Press Ltd., Foxton, Cambridge

TENOVER F. C.,R. D. ARBEIT, R. V. GOERING, P. A. MIVKELSEN, B. E.

MURRAY, D. H. PERSING u. B. SWAMINATHAN (1995)

Interpreting chromosomal DNA Restriktion Patterns produced by pulsed field gel

elektrophoresis: Criteria for bacterial strain typing


TIKKANEN, K., J. HAYRINEN, S. PELKONEN u. J. FINNE (1995)

Immunoblot analysis of bacterial polysaccharides: application to the type-specific

polysaccharides of Streptococcus suis and Streptococcus agalactiae

J. Immunol. Methods 187, 233 - 244

TOUIL, F., R. HIGGINS, u. M. NADEAU (1988)

Isolation of Streptococcus from diseased pigs in Canada


TOWBIN, H., T, STAEHELIN u. J. GORDON (1979)

Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamid gels to nitrocellulose sheets:

Procedure and some applications

Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350 - 4354

Anhang

133

VECHT, U., L. A. M. G. van LEENGOED (1989) u. E. R. M. VERHEIJEN (1985).

Streptococcus suis Infections in pigs in The Netherlands Part I

Vet. Q. 7, 315 - 321

VECHT, U., J. P. ARENDS, E. J. van der MOLEN u. L. A. M. G. van LEENGOED

(1989)

Differences in virulence between two strains of Streptococcus suis type 2 after

experimentally induced infection of newborn germ-free pigs

Am. J. Vet. Res. 50, 1037 - 1043

VECHT, U., H. J. WISSELINK, M. L. JELLEMA u. H. E. SMITH (1991)

Identifikation of two proteins associated with virulence of Streptococcus suis type 2

Infect. Immun. 59, 3156 - 3162

VECHT, U., H. J. WISSELINK, J. E. VAN DIJK u. H. E. SMITH (1992)

Virulence of Streptococcus suis type 2 strains in newborn germfree pigs depends on

phenotype

Infect. Immun., 60, 550 - 556

VECHT, U., N. STOCKHOFE-ZURWIEDEN, B. J. TETENBURG, H. J. WISSELINK

u. H. E. SMITH (1997)

Virulence of Streptococcus suis type 2 for mice and pigs appeared host-specific

Veterinary Microbiol. 58, 53 - 60

WAACK, T.,1996

Bakteriologische Untersuchungen zum Vorkommen von Streptococcus suis beim

Schwein

Diss. Vet. Med. TiHo Hannover

WILLIAMS, A. E. (1990)

Relationship between intracellular survival in macrophages and pathogenicity of

Streptococcus suis type 2 isolates

Microbiol. Pathogen. 8, 189 - 196

Anhang

134

WINDSOR, R. S., (1977)

Meningitis in pigs caused by Streptococcus sui type II

Vet. Rec. 101, 378 – 379

WINDSOR, R. S., u. S. D. ELLIOT (1975)

Streptococcal infection in young pigs IV. An outbreak of streptococcal meningitis in

weaned pigs

J. Hyg. Camb. 75, 69 – 78

Anhang

135

9 Anhang9.1 Chemikalien

A. bidest., RNase-frei SIGMA, Deisenhofen

Acrylamid SERVA, Heidelberg

BCIP (5-Bromo-4-chlor-3-indolyl-phosphat-p-Toluidin) SIGMA, Deisenhofen

Bisacrylamid SERVA, Heidelberg

Agarose GIBCO, Eggenstein

Borsäure SIGMA, Deisenhofen

Bromphenolblau SIGMA, Deisenhofen

Chloramphenicol SIGMA, Deisenhofen

CaCl2 (Kalziumchlorid) SIGMA, Deisenhofen

Coomassie Brilliant Blue SIGMA, Deisenhofen

dATP32 NEN, Boston, MA, USA

EDTA SIGMA, Deisenhofen

Essigsäure ROTH, Karlsruhe

Ethidiumbromid SIGMA, Deisenhofen

Ethanol, unvergällt ELCH-Apotheke, Hann.

Ethanol, vergällt ROTH, Karlsruhe

Glycin SIGMA, Deisenhofen

Glyzerin ROTH, Karlsruhe

HCl ROTH, Karlsruhe

H3PO4 (Phosphorsäure) ROTH, Karlsruhe

IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactosid) ROTH, Karlsruhe

Isopropanol ROTH, Karlsruhe

Laurylsulfat (SDS) SIGMA, Deisenhofen

Magnesiumchlorid (MgCl2) GIBCO, Eggenstein

Natriumacetat (Na-Acetat) SIGMA, Deisenhofen

Na2HPO4 SIGMA, Deisenhofen

Natriumzitrat SIGMA, Deisenhofen

NaCl SIGMA, Deisenhofen

NaOH SIGMA, Deisenhofen

Anhang

136

Natriumhydrogencarbonat SIGMA, Deisenhofen

Phenol (Roti -Phenol, TE-equilibriert) ROTH, Karlsruhe

Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan SIGMA, Deisenhofen

Anhang

137

9.2 Verwendete GerätschaftenBioRad MultiAnalyst-System BioRad, München

PFGE-Gerät CHEF DR III BioRad, München

Power Supply, PowerPac 300 BioRad, München

Horizontal Elektrophorese-Kammer HORIZON 58 Gibco, Eggenstein

Filterpapier Gel-Blotting-Papier Schleicher und Schuell

Film Kodak X-OMAT AR Sigma, Deisenhofen

GeneClean II Kit Bio 101 Dianova, Hamburg

Mini Hybridisation Oven Appligene, Illkirch Frankreich

Multi-Block Heater Lab-Line Instr.,Illinois, USA

Nylonmembran Positive Membran Appligene, Illkirch Frankreich

Ofen Booskamp, Wuppertal

Parafilm American National Can, USA

Polaroid-Kamera Polaroid-System DS-34, Angewandte

gentechnologische Systeme GmbH, Heidelberg

Schütler Cello Shaker Variospeed BIOTEC-Fischer

Spektralphotometer Ultrospec III Pharmacia, Freiburg

UV-Transilluminator GE-TFX-20M,312nm Filter Angewandte

gentechnologische Systeme GmbH, Heidelberg

Vortex Genie 2 Bender und Hobein, Zürich,Schweiz

Wasserbad GFL, Burgwedel

Zentrifuge Hermle ZK 2400K Hermle,

Eppendorf Centrifuge 5415 C Eppendorf

-20°C Gefrierschrank Liebherr, Ochsenhausen

-70°C Gefriertruhe GFL, Burgwedel

CO2—Inkubationsschrank Cellstar NUNC

Anhang

138

9.3 Verzeichnis der Isolate und deren Charakteritiken

Anhang

139

Anhang

140

Anhang

141

9.4 TabellenverzeichnisTab 1: Morphologie und kulturelles Verhalten von Sc. suis 12

Tab 2: Biochemisches Verhalten von Sc. suis 13

Tab 3.: Unterschiedliche charakteristische biochemische Reaktionen zur

Identifizierung von Sc. suis 14

Tab 4: Sc. suis–Biotypen nach DEVRIESE et al. (1991) 15

Tab 5: EF-Protein-Varianten bei Sc. suis (Vecht et al. 1993). 30

Tab 6: Übersicht über hämolytische Aktivitäten von Sc. suis-

Referenzstämmen (FEDER et al. 1994) 32

Tab 7: Herkunft von 92 Isolaten, die für diese Arbeit zur Verfügung gestellt

wurden 38

Tab 8: Bezeichnung und Herkunft der untersuchten Referenzstämme 39

Tab 9: Beziehung zwischen Serotyp und Herkunft der Sc. suis Isolate. 64

Tab 10: Häufigkeit der Hämolysin-Expression bei den untersuchten Isolaten 65

Tab 11: Auftreten der verschiedenen MRP/EF Phänotypen bei den

untersuchten Sc. suis – Isolaten 67

Tab.12 : Häufigkeit und Ausprägung des Hämolysin-Genotyp und –Phänotyp 85

Tab.13: Beziehungen zwischen den Adhärenzeigenschaften und deren

Zuordnung zu den Grossgruppen 99

Tab 14: Odds ratio und Wahrscheinlichkeitsüberschreitung der

phänotypischen Merkmale im χ2–Test bezogen auf die Herkunft der

Isolate. 102

Tab 15: Odds ratio und Wahrscheinlichkeitsüberschreitung des Genotyps

im χ2–Test bezogen auf die Herkunft der Isolate. 103

9.5 AbbildAbb. 1: Gra

„gene

Abb. 2: Bez

Abb. 3-8: NAbb. 9: Bez

Isolat

Abb. 10: Be

Isolat

Abb. 11-13:Abb. 14: Be

der S

Abb. 15: Er

Abb. 16: Ma

nach

Abb. 17: Ma

nach

Abb. 18: Ma

nach

Abb. 19: Ma

nach

Abb. 20: Ge

Stäm

Abb. 21: Ge

Stäm

Abb. 22: Gr

Abb. 23a: Anach

Abb. 23b.: ch

Abb. 24a: Anach

Abb. 24b.: chrom

Anhang

142

ungsverzeichnisfische Darstellung der Erstellung eines

tischen Fingerabdruck“ 18

iehungen zwischen dem Serotyp und der Herkunft der Isolate 62

achweis von MRP mittels Immunoblot-Analyse 64-66

iehung zwischen dem MRP/EF-Phänotyp und der Herkunft der

e in Prozent 67

ziehungen zwischen der Hämolysin-Expression der Sc. suis

e mit deren Herkunft 69

Adhärenz von Sc. suis an humane HEp 2–Zellen 70-71

ziehungen zwischen der Adhärenz an HEp2– und ST– Zellen

c. suis Isolate und ihrer Herkunft 72

stellung eines spezifischen Grössenstandards für die PFGE 73

krorestriktionsanalyse von Sc. suis-Serotyp 2 Stämmen

Restriktionsverdau mit ApaI 75

krorestriktionsanalyse der Sc. suis-Serotyp 2 Stämme

Restriktionsverdau mit SmaI 76

krorestriktionsanalyse der Sc. suis-Serotyp 9 Stämme

Restriktionsverdau mit SmaI 77

krorestriktionsanalyse von Sc. suis-Serotyp 9 Stämmen

Restriktionsverdau mit ApaI 78

notypische Verwandtschaft der verwendeten Sc. suis

me dargestellt als Dendrogramm (ApaI) 80

notypische Verwandtschaft der verwendeten Sc. suis

me dargestellt als Dendrogramm (SmaI) 81

össenbestimmung der Hämolysin-Sonde 83

uftrennung genomischer DNA von Sc. suis

Restriktionsenzymverdau mittels PFGE 84

Repräsentative Hybridisierung von Makrorestriktionen

romosomaler DNA von Sc. suis-Isolaten 85

uftrennung der DNA-Fragmente von Sc. suis Isolaten

Restriktionsverdau mit ApaI mittels PFGE 86

Repräsentative Hybridisierung von Makrorestriktionen

osomaler DNA von Sc. suis-Isolaten 87

Anhang

143

Abb. 25: Beziehungen zwischen der Herkunft der Isolate und deren

Zuordnung zu den Grossgruppen A1SmaI,, A2SmaI,, B1SmaI,, B2SmaI 89

Abb. 26: Beziehungen zwischen der Herkunft der Isolate und deren

Zuordnung zu den Grossgruppen A1ApaI,, A2ApaI,, B1ApaI,, B2ApaI 90

Abb. 27: Beziehungen zwischen dem Serotyp der Isolate und deren

Zuordnung zu den Grossgruppen A1SmaI,, A2SmaI,, B1SmaI,, B2SmaI 91

Abb. 28: Beziehungen zwischen dem Serotyp der Isolate und deren

Zuordnung zu den Grossgruppen A1ApaI,, A2ApaI,, B1ApaI,, B2ApaI 92

Abb. 29: Beziehungen zwischen dem MRP/EF-Phänotyp der Isolate und

deren Zuordnung zu den Grossgruppen A1SmaI,, A2SmaI,, B1SmaI,, B2SmaI 93

Abb. 30: Beziehungen zwischen dem MRP/EF-Phänotyp Herkunft der

Isolate und deren Zuordnung zu den Grossgruppen A1ApaI,, A2ApaI,,

B1ApaI,, B2ApaI 94

Abb. 31: Beziehungen zwischen der Hämolysinproduktion der Isolate und

deren Zuordnung zu den Grossgruppen A1SmaI,, A2SmaI,, B1SmaI,, B2SmaI 95

Abb. 32: Beziehungen zwischen der Hämolysinproduktion der Isolate und und

deren Zuordnung zu den Grossgruppen A1ApaI,, A2ApaI,, B1ApaI,, B2ApaI 96

Abb. 33: Beziehungen zwischen MRP+/EF+ und Hämolysin+ Isolate und und

deren Zuordnung zu den Grossgruppen 98

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. P. VALENTIN-WEIGAND für die Überlassung desThemas und die jederzeit gewährte Hilfs- und Diskussionsbereitschaft sowie Unterstützungbei der Durchführung dieser Arbeit.

Herrn Prof. Dr. L. KREIENBROCK und Herrn Dr.R. MEYER aus dem Institut fürBometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung der TiHo Hannover möchteich herzlich für ihre große Unterstützung bei Lösung und Durchführung desDatenverarbeitungsproblemes danken.

Frau Dr. H. SMITH und Herrn Dr. H. WISSELINK aus dem Institute for Animal Science andHealth, Lelystad (ID-DLO Lelystad, Holland) möchte ich danken für ihre großeHilfsbereitschaft bei der Durchführung der Serotypisierung und Ermittlung des MRP/EF-Status.

Herrn Prof. Dr. S. SCHWARZ am Institut für Kleintierforschung Celle/Merbitz der FALBraunschweig-Völkerode gilt mein Dank für seine Unterstützung und seinen Rat beiDurchführung und Auswertung der PFGE.

Herrn Prof. Dr. AMTSBERG möchte ich danken für das Sammeln und Überlassen derunzähligen Isolate.

Bei Herrn Dr. R. GOETHE möchte ich mich für seine immense Geduld bedanken, die eraufbrachte, um mich in die Welt der „molekularbiologischen Forschung“ einzuweihen.

Dank an J. Matusch für seine Bemühungen, mich mit den tiefen Mysterien der Götter „EDV“,„Grafik“ und „Layout“ vertraut zu machen. Ohne Erfolg!

Bei B. Schümann und M. Kühnel für die verzweifelten Versuche, die Rechtschreibung in einevertretbare Form zu bringen.

Ferner möchte ich mich bei allen Mit-Doktoranden und Institutsangehörigen,insbesondere S. Jeckstadt, N. Winterhoff, P. Grüning, S. Herbst, R. Schmidt, S.Thiede, T. Rehm, C. Winterhoff, B. Strommenger, N. Baltes, M. Homuth, K.Strutzberg und besonders bei Fr. Dr. G. Kirpal für die moralische und tatkräftigeUntersützung und für das sehr gute Arbeitsklima von Anfang bis Ende dieser Arbeitbedanken.

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INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines … · 2019. 1. 10. · Sc. porcinus sowie bedingt auch Sc. hyointestinalis zugeordnet (BENTLEY et al. 1991). Unter der Spezies