newsletter_02_16Informationen für die Immunhistochemie, in situ-Hybridisierung und Molekularpathologie

Inhalt

AmoyDx® SuperARMS Real-Time PCR Assays – Gesteigerte Sensitivität für den Mutationsnachweis an cfDNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

Neue CISH-Sonden für die Lymphomdiagnostik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

Der Zytomed Systems Lesetipp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

Immunhistochemie bei Karzinomen mit unbekanntem Primärtumor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

PD-L1 Immunhistochemie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

15. Oktober 2016 Grundlagen der Fluoreszenz in situ-Hybridisierung – Theorie und Praxis Workhop, Göttingen

7. bis 9. Oktober 2016 Deutsche Pathologie Tage 2016 Berlin

7. Oktober 2016 Immunhistochemie an Lebertumoren Workhop, Berlin

19. November 2016 Immunhistochemie an Lebertumoren Workhop, Essen

14. bis 17. November 2016 MEDICA Düsseldorf

Termine

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Die Testung von EGFR Mutationen an cfDNA (cell free DNA) aus liquid biopsies wird zunehmend in die Dia-gnostik Einzug finden. Da der Anteil an Tumor-DNA in diesen Proben im Vergleich zu Proben aus FFPE-Materi-al gering ist, wird eine möglichst hohe Sensitivität des Mutations-Nachweises angestrebt. Unter diesem As-pekt hat unsere Partnerfirma AmoyDx® verschiedene Real-Time PCR Assays mit neuer SuperARMS™ Techno-logie (Super-Amplification Refractory Mutation System) speziell für cfDNA Proben entwickelt.

Das neue SuperARMS™ EGFR T790M Mutation De-tection Kit erreicht im Vergleich zu den bisher auf dem Markt befindlichen Real-Time PCR Systemen eine er-höhte Sensitivität von bis zu 0,2 % Mutationsanteil in der wt-DNA beim T790M Nachweis.Ebenfalls neu ist das SuperARMS™ EGFR Mutation Detection Kit. Dieses Kit ermöglicht den Nachweis von 41 Mutationen in den Exons 18 bis 21 des EGFR Gens in cfDNA mit Sensitivitäten von 0,2 – 0,8 % (T790M: 0,2 %). Dieses Kit ist im pre-loaded Format erhältlich.

Neben der Anwendung des EGFR-Mutationsnach-weises beim Lungenkarzinom können zukünftig auch andere Mutationsnachweise an cfDNA interes-sant werden. In einer kürzlich gestarteten Koopera-tion zwischen AmoyDx® und Merck, Darmstadt, soll die Untersuchung von KRAS-, NRAS und BRAF-Muta-tionen in klinischen Studien beim metastasierenden

kolorektalen Karzinom evaluiert werden. Die AmoyDx® SuperARMS Kits sind geeignet für Real- Time PCR Geräte mit einem möglichen Reaktions-volumen von 80 µl. Für die Aufreinigung von cfDNA aus liquid biopsies stehen ein speziell entwickeltes AmoyDx® Circulating DNA Kit sowie die Cell-free DNA Protection Vacuum Tubes zur Verfügung.

Exon 18: G719C, G719A Exon 19: 29 Deletionen

Exon 20: T790M, S768I, 6 Insertionen Exon 21: L858R, L861Q

Literatur

[1] Douillard JY et al. First-line gefitinib in Caucasian EGFR mutation-positive NSCLC patients: a phase-IV, open-label, single-arm study. Br J Cancer 110:55-62, 2014

[2] Zheng D et al. Plasma EGFR T790M ctDNA status is associated with clinical outcome in advanced NSCLC patients with acquired EGFR-TKI resistance. Sci Rep 6:20913, 2016

[3] http://news.merck.de/N/0/2DC53405BDD827A1C1257FFD006F7BC2/$File/PressRelease-Merck_AmoyDxChinaCol-laboration_English280716.pdf

AmoyDx® SuperARMS Real-Time PCR Assays – Gesteigerte Sensitivität für den Mutationsnachweis an cfDNA

Produktinformation

Bezeichnung Form Menge Bestell-Nr.SuperARMS EGFR T790M Mutation Detection KitNachweis der EGFR T790M Mutation an cfDNA (liquid biopsies)

Bulk 1 Kit (24 Tests) ADX-EG12-R

SuperARMS EGFR Mutation Detection KitNachweis von 41 EGFR Mutationen in den Exons 18–21 an cfDNA (liquid biopsies)

pre-loaded 1 Kit (12 Tests) ADX-EG14-R

Bezeichnung Menge Bestell-Nr.Circulating DNA Kit 1 Kit (24 Tests) ADX-BL03-R

Cell-free DNA Protection Vacuum Tube 1 Set (10 Röhrchen) ADX-VT01-R

AmoyDx® SuperARMS™ Kits

Kits für die cfDNA Aufreinigung

Nachweisbare Mutationen mit dem SuperARMS™ EGFR Mutation Detection Kit

Assay-Design: Vier Reaktionen - Vier Fluoreszenzen

Reaktionsmix 1 Reaktionsmix 2 Reaktionsmix 3 Reaktionsmix 4FAM 19-Del T790M G719X 20-InsROX L858R - L861Q -Cy5 - - S768I -HEX/VIC IC* IC* IC* IC*

*IC: interne Kontrolle

ZytoDot® 2C SPEC BCL2 Break Apart Probe, Normalgewebe, 2 Fusionssignale pro Zellkern

ZytoDot® 2C SPEC MYC Break Apart Probe, Non-Hodgkin Lymphom,

1 Fusions- und 1 Split-Signal pro Zellkern

ZytoDot® 2C SPEC CCND1 Break Apart Probe, Mantelzell-Lymphom,

1 Fusions- und 1 Split-Signal pro Zellkern

Neue CISH-Sonden für die Lymphomdiagnostik

Ringversuch News

Neben den klassischen Anwendungsgebieten der chromogenen in situ-Hybridisierung (CISH) bei Mamma- oder Sarkomdiagnostik kann die CISH-Diagnostik dank neuer ZytoDot® 2C Break Apart Sonden nun auch in der Lymphomdiagnostik ein-gesetzt werden. Die Detektion der Sonden erfolgt mit dem ZytoDot® 2C CISH Implementation Kit

(C-3044-40) und unserem CISH-Standardprotokoll. Für neue Gewebetypen sollte bei der Gewebevor-behandlung wie üblich eine Anpassung der Pepsin-Einwirkzeit durchgeführt werden. Für die Auswertung von CISH Break Apart Sonden empfehlen wir die Verwendung eines 100X Objekti-ves (Öl-Immersion) mit hoher Apertur.

Zytomed Systems hat bei dem NordiQC Ring- versuch HER-2 FISH, H9, 2016 erfolgreich teilge-nommen. In diesem Ringversuch sollten 5 Ge-webeschnitte auf ihren HER2 (ERBB2)-Status untersucht werden. Die Untersuchung wurde im Zytomed Systems Labor mit der FISH-Sonde „ZytoLight® SPEC ERBB2/CEN 17 Dual Color Probe“

(Z-2015-200) und dem Vorbehandlungskit „ZytoLight® FISH Tissue Implementation Kit“ (Z-2028-20) unserer Partnerfirma ZytoVision durchgeführt. Das Zytomed Systems Labor nimmt regelmäßig an nationalen und internationalen Ringversuchen zur Qualitätssicherung in der Pathologie (u.a. QuIP, NordiQC, EQA der ESP) teil.

Produktinformation

Bezeichnung Markierung Menge Bestell-Nr.ZytoDot® 2C SPEC ALK Break Apart Probe DIG/DNP 100 µl (10 Tests) C-3055-100

ZytoDot® 2C SPEC ALK Break Apart Probe DIG/DNP 400 µl (40 Tests) C-3055-400

ZytoDot® 2C SPEC BCL2 Break Apart Probe DIG/DNP 100 µl (10 Tests) C-3073-100

ZytoDot® 2C SPEC BCL6 Break Apart Probe DIG/DNP 100 µl (10 Tests) C-3074-100

ZytoDot® 2C SPEC CCND1 Break Apart Probe DIG/DNP 100 µl (10 Tests) C-3075-100

ZytoDot® 2C SPEC IGH Break Apart Probe DIG/DNP 100 µl (10 Tests) C-3071-100

ZytoDot® 2C SPEC MALT1 Break Apart Probe DIG/DNP 100 µl (10 Tests) C-3072-100

ZytoDot® 2C SPEC MYC Break Apart Probe DIG/DNP 400 µl (40 Tests) C-3066-400ZytoLight®, ZytoDot® und ZytoFast® sind eingetragene Marken unserer Partnerfirma ZytoVision GmbH, Bremerhaven.

ZytoDot® 2C CISH Sonden für die Lymphomdiagnostik

Zytomed Systems Lesetipp : PD-L1 Immunhistochemie als Herausforderung für die Pathologie

Kerr KM and Nicolson MC. Arch Pathol Lab Med 2016 March; 140:249-254 Non–Small Cell Lung Cancer, PD-L1, and the Pathologist

Kerr KM and Hirsch FR. Arch Pathol Lab Med 2016 April; 140:325-331 Programmed Death Ligand-1 Immunohistochemistry: Friend or Foe?

Die Autoren diskutieren in diesen beiden Publikationen die aktuelle Situation des PD-L1-Nachweises aus der Sicht des Pathologen und des Onkologen. Insbesondere der Umstand, dass ein einzelnes Zielmolekül im Rahmen der Companion oder Complementary Diagnostics in Abhängigkeit von der in Frage kommenden Therapie mit 4 oder mehr verschiedenen Methoden (und möglicherweise auch noch auf verschiedenen Immunfärbeautomaten) detektiert werden soll, stellt die Pathologie nach Meinung der Autoren vor große, bisher nicht bekannte Herausforderungen.

Kerr & Nicolson, 2016: “The biology of PD-1/PD-L1 is complex, the clinical data for these drugs show considerable variation, the selection performance of the PD-L1 biomarker test is not perfect, and the existence of 4 drug/test combinations adds significantly to the problems faced.”

Beide Publikationen sind auf archivesofpathology.org/toc/arpa/140/3 bzw. archivesofpathology.org/toc/arpa/140/4 frei verfügbar.

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(Tabelle 2, modifiziert nach Kandalaft und Gown, 2016) [1]

Tabelle 2 gibt eine Übersicht der wichtigsten organ-spezifischen Marker. Nicht berücksichtigt sind dabei Marker für Keimzelltumoren. Die Autoren verweisen

stattdessen auf einen Übersichtsartikel [2], in dem die aktuellen Empfehlungen der ISUP (International Society of Urological Pathology) dargestellt werden.

Karzinomtyp Antikörper gegen Lokalisation des Signals Sensitivität Spezifität Zusätzliche Reaktivität

Mamma Östrogenrezeptoren Nukleus moderat moderat endometrioides Adeno-CA, seröses Ovarial-CA

Mamma GCDFP-15 Zytoplasma niedrig moderat Speicheldrüse, Schweißdrüsentumoren

Mamma Mammaglobin Zytoplasma niedrig moderat Speicheldrüse, Schweißdrüsentumoren

Mamma GATA3 Nukleus hoch moderat Speicheldrüse, Urothel-CA, Adnextumoren der Haut

Kolorektum und GI VillinZytoplasma und

Zytoplasmamembran (Bürstensaum)

hoch moderat einige Lungen-CA, Ovarial- und Endometrium-CA

Kolorektum CDX2 Nukleus hoch hoch einige Pankreas-, Magen- und Ovarial-CA

Hepatozellulär HepPar1 Zytoplasma moderat hoch hepatoide Adeno-CA

Hepatozellulär Arginase Nukleus und Zytoplasma hoch hoch

Lunge (Adeno) und Schilddrüse einschließlich neuroendokrin TTF-1 Nukleus hoch hoch neuroendocrine CA anderen Ursprungs

Lunge (Adeno) Napsin A Zytoplasma hoch hoch klarzellige gyn. CA, einige Nierenzell- und Schilddrüsen-CA

Gynäkologische CA PAX8 Nukleus sehr hoch moderat Nierenzell- und Schilddrüsen-CA

Ovar (serös) WT1 Nukleus sehr hoch hoch Mesotheliom

Prostata PSA Zytoplasma sehr hoch sehr hoch

Prostata NKX3.1 Nukleus sehr hoch sehr hoch

Nierenzell PAX8 Nukleus moderat moderat gyn. und Schilddrüsen-CA

Plattenepithel, Urothel p63 Nukleus sehr hoch sehr hochThymome, Speicheldrüsentumoren, eini-ge neuroendokrine CA, trophoblastische Tumoren, einige pulmonale Adeno-CA

Plattenepithel, Urothel p40 Nukleus sehr hoch sehr hoch Thymome, Speicheldrüsentumoren, trophoblastische Tumoren

Schilddrüse Thyreoglobulin Zytoplasma hoch sehr hoch

Schilddrüse PAX8 Nukleus sehr hoch moderat gyn. und Nierenzell-CA

Urothel Uroplakine Zytoplasmamembran niedrig hoch

Urothel GATA3 Nukleus hoch moderat Mamma- und Speicheldrüsen-CA, Adnextumoren der Haut

Karzinom- bzw. tumorspezifische Antikörper

(Tabelle 1, modifiziert nach Kandalaft und Gown, 2016) [1]

In einem Übersichtsartikel in der Ausgabe vom Juni 2016 der Archives of Pathology & Laboratory Medicine stellen Patricia L. Kandalaft und Allen M. Gown etablierte und neue Antikörper für die Klassifikation von Karzinomen mit unbekanntem Primärtumor (CUP) vor [1].

Etwa 4 % aller Krebspatienten werden mit CUPs vor-stellig. Die Identifikation des Primärtumors ist we-gen unterschiedlicher Prognosen und Behandlungs-optionen, insbesondere vor dem Hintergrund neuer zielgerichteter Therapien, von höchster klinischer Relevanz. Trotz der Verfügbarkeit verschiedener neuer Genexpressionstests sehen die Autoren die Immunhistochemie nach wie vor als Goldstandard für die CUP-Diagnostik an.

Für die Aufarbeitung von CUP sind zwei Klassen von Antikörpern hilfreich: (A) Antikörper gegen Kerati-ne (Zytokeratine) und (B) Antikörper gegen zell- oder organspezifische Marker.

Die in diesem Zusammenhang wichtigsten Keratine sind Keratin 7 und Keratin 20, deren Expression in verschiedenen Karzinomen in Tabelle 1 zusammen-gefasst ist. Daneben finden Antikörper gegen Kera-tin 5 (und 14) Verwendung, die dem Nachweis einer plattenepithelialen, urothelialen, myoepithelialen und mesothelialen Differenzierung dienen. Schließ-lich ist zur Unterscheidung von Karzinomen des pan-kreatobiliären Systems und Magenkarzinomen der Nachweis von Keratin 17 hilfreich.

Die organ- oder zellspezifischen Marker werden ihrer-seits in zwei Gruppen unterteilt: (A) zytoplasmatisch und/oder membranständig lokalisierte Differen-zierungsmarker sowie (B) nukleäre Transkripti-onsfaktoren. Die Expression der Differenzierungs-marker und der Anteil der für diese Marker positiven Tumorzellen sind abhängig vom Differenzierungsgrad

des Tumors. In stärker entdifferenzierten Tumoren fin-det man allgemein eine schwächere Expression und weniger positive Zellen. Im Gegensatz dazu sind nu-kleäre Transkriptionsfaktoren meist in der gesamten Tumorzellpopulation nachweisbar und ihre Expression ist (nach Meinung der Autoren) weitgehend unabhän-gig vom Differenzierungsgrad.

Immunhistochemie bei Karzinomen mit unbekanntem Primärtumor

Karzinomtyp Keratin 7 Keratin 20 Häufigkeit dieses Immunphänotyps [%]

Kolorektales Adenokarzinom - + 75 - 95

Adenokarzinom der Lunge + - 90

Duktales Mammakarzinom + - 80 – 95

Serös-papilläres Ovarialkarzinom + - > 90

Adenokarzinom des Endometriums + - 80 - 100

Hepatozelluläres Karzinom - - 71 - 89

Neuroendokrines Karzinom der Lunge - - 60 – 80

Nierenzellkarzinom - - 70 – 90

Adenokarzinom der Prostata - - 60 – 100

Plattenepithelkarzinom der Lunge - - 50 – 90

Urothelkarzinom + + 25 - 90

Verteilung der Keratin 7 und 20 Immunphänotypen in verschiedenen Karzinomen

Darstellung von Arginase-1 am Leberzellkarzinom

GATA3-Nachweis am Urothelkarzinom

Napsin A-Nachweis am pulmonalen Adenokarzinom

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Die Publikation von Kandalaft und Gown ist auf

archivesofpathology.org/toc/arpa/140/6 frei verfügbar.

GATA3: Um eine maximale Sensitivität zu erzielen, wird bei Verdacht auf Mammakarzinom der Nachweis aller drei Mamma-spezifischen Marker, also GATA3, GCDFP-15 und Mammaglobin, empfohlen.

CDX2: Nahezu 100 % aller kolorektalen Karzinome sind CDX2-positiv. Eine Ausnahme stellen kolorektale Karzinome mit Mikrosatelliten-Instabilität dar, die im Allgemeinen nur eine schwache oder sogar fehlende CDX2-Expression zeigen [3].

Arginase-1: Während bis vor einigen Jahren α-Fetoprotein als der beste Marker für eine hepatozelluläre Differenzierung angesehen wurde, stehen inzwischen mit HepPar1, Glypican-3 und Arginase-1 bessere immunhistochemische Nachweise zur Verfügung. Arginase-1 zeigt dabei die höchste Sensitivität und Spezifität und ist für die Identifizierung von Leberzellkarzinomen der Marker der Wahl.

PSA und NKX3.1: In einigen Fällen kann der kombinierte Nachweis von PSA und NKX3.1 für den Nachweis von Adenokarzinomen der Prostata hilfreich sein. Antikörper gegen PSAP (Prostatic Acid Phosphatase) werden dagegen wegen ihrer geringeren Spezifität nicht empfohlen.

PAX8: Für den Nachweis metastasierender Nierenzellkarzinome ist PAX8 ein sensitiver und robuster Marker, der PAX2 inzwischen weitgehend ersetzt hat. Bei der Abgrenzung TTF-1 positiver Schilddrüsen-karzinome von TTF-1 positiven pulmonalen Adenokarzinomen hilft die PAX8-Immunhistochemie insofern als dieses Protein in Adenokarzinomen der Lunge nicht nachweisbar ist.

Literatur

[1] Kandalaft PJ and Gown AW. Practical Applications in Immunohistoche-mistry: Carcinomas of Unknown Primary Site. Arch Pathol Lab Med 140:508-523, 2016

[2] Ulbright TM et al.; Members of the ISUP Immunohistochemistry in Dia-gnostic Urologic Pathology Group. Best practices recommendations in the application of immunohistoche-mistry in testicular tumors: report from the International Society of Urological Pathology consensus con-ference. Am J Surg Pathol 38:e50-e59, 2014

[3] Hinoi T et al. Loss of CDX2 expres-sion and microsatellite instability are prominent features of large cell minimally differentiated carcinomas of the colon. Am J Pathol 159:2239-2248, 2001

Produktinformation: organpezifische Antikörper (Auswahl)

Zytomed Systems bietet eine Vielzahl paraffingän-giger Antikörper gegen organspezifische Marker an. Die Antikörper sind zum Großteil als CE/IVD klassifi-

ziert und meist sowohl als gebrauchsfertige Lösun-gen für die Immunhistochemie als auch in konzen-trierter Form erhältlich.

Bezeichnung Format Verdünnung Menge Bestell-Nr.

Arginase-1Klon: EP261 I Wirt: Kaninchen

gebrauchsfertig - 6 ml API3058AA

konzentriert 1:100 – 1:2000,1 ml ACI3058A0,5 ml ACI3058B

Cadherin 17 (CDH17)Klon: 1H3 I Wirt: Maus

gebrauchsfertig - 6 ml MSG105konzentriert 1:100 – 1:200 0,5 ml MSK105-05

CDX2Klon: EPR2764Y I Wirt: Kaninchen

gebrauchsfertig - 6 ml RBG019

konzentriert 1:50 – 1:1000,5 ml RBK019-051 ml RBK019

GATA3Klon: L50-823 I Wirt: Maus

gebrauchsfertig - 6 ml MSG100

konzentriert 1:100 – 1:200 0,5 ml MSK100-05

Napsin AKlon: BC15 I Wirt: Kaninchen

gebrauchsfertig - 6 ml RBG059

konzentriert 1:100 – 1:200 0,5 ml RBK059-05

NKX3.1Klon: polyklonal I Wirt: Kaninchen

gebrauchsfertig - 6 ml RBG062konzentriert 1:50 – 1:100 0,5 ml RBK062-05

PAX8Klon: BC12 I Wirt: Maus

gebrauchsfertig - 6 ml API438AA

konzentriert 1:100 – 1:2000,1 ml ACI438A0,5 ml ACI438B1 ml ACI438C

SATB2Klon: SATBA4B10 I Wirt: Maus konzentriert 1:50 – 1:100 0,5 ml MSK101-05

TTF-1Klon: 8G7G3/1 I Wirt: Maus

gebrauchsfertig - 6 ml MSG004

konzentriert 1:200 – 1:5000,5 ml MSK004-051 ml MSK004

TTF-1Klon: SPT24 I Wirt: Maus

gebrauchsfertig - 6 ml API3126AA

konzentriert 1:100 – 1:2000,1 ml ACI3126A1 ml ACI3126C

Uroplakin IIKlon: BC21 I Wirt: Maus

gebrauchsfertig - 6 ml MSG102

konzentriert 1:50 – 1:100 0,5 ml MSK102-05

PD-L1 (Programmed Cell Death Ligand 1) sowie der abhängige Rezeptor, PD1 (Pro-grammed Cell death 1), wurden 2000 in Ihrer Funktion und Interaktion beschrie-ben. PD-1 ist auf den T-Zellen in der Zell-membran lokalisiert. Durch Liganden-bindung wird die T-Zelle deaktiviert. Die Ligandenbindung von PD-L1 an PD-1 wur-de zunächst mit dem Effekt der Inhibition der T-Zellproliferation und Verringerung der Zytokinproduktion beschrieben. Eine wei-tere Funktion der zytotoxischen T-Zellen ist die gezielte Einleitung der Apoptose von Tumorzellen nach spezifischer Antigen-präsentation über Antigen-präsentierende Zellen (APC), z. B. B-Lymphozyten und his-tiozytäre Zellen. Diese Inaktivierungswege werden als Checkpoints bezeichnet. Zu diesen Checkpoint-Rezeptoren zählen ne-ben dem oben erwähnten PD-1 zum Bei-spiel auch CTLA4, CD28 und einige weitere. Eine Bindung von Liganden bzw. Aktivie-rung des Rezeptors führt zu einer Deakti-vierung der zytotoxischen T-Lymphozyten. In physiologischen Situationen verhindern APC Zellen durch Oberflächenexpression von PD-L1 eine zytotoxische Reaktion der interagierenden T-Zellen. Die Deaktivierung von T-Zellen mittels Bindung von PD-L1 an PD-1 stellt einen wesentlichen Escape-Me-chanismus von Tumorzellen dar [1]. Innerhalb der letzten Jahre wurden einige Inhibitoren entwickelt, die diese Check-pointmechanismen blockieren können, so genannte Checkpoint-Inhibitoren. Eine der ersten Zielstrukturen war CTLA4 [2]. Insbe-sondere bei Melanomen sehr effektiv, wur-de Ipilimumab (Bristol-Myers-Squibb), ein monoklonaler Antikörper, einer der ersten von der European Medicines Agency (EMA) zugelassenen Checkpoint-Inhibitoren. Es folgten Inhibitoren von PD-1: Nivolumab (Bristol-Myers-Squibb) und Pembroli-zumab (MSD Sharp & Dohme). Der Einsatz dieser PD-1 Inhibitoren ist, neben einer Kombinationstherapie von Nivolumab mit Ipilimumab beim fortgeschrittenen, nicht mehr operablen malignen Melanom, das nicht-kleinzellige Lungenkarzinom (NSCLC) und für Nivolumab das Nierenzellkarzinom (RCC) [3]. Bislang besteht die Zulassung

durch die EMA nur für das vorbehandel-te, nicht operable NSCLC (sowohl Platten-epithelkarzinome als auch Adenokarzi-nome) für die so genannte second line Therapie. Weitere Therapeutika mit einer in den nächsten Jahren zu erwartenden Zulassung für andere Karzinome, z. B. das Harnblasenkarzinom, sind Atezolizumab (Roche) und Durvalumab (Astra-Zeneca).In den verschiedenen Studien wurden un-terschiedliche immunhistologische Para-meter in Bezug auf das Therapieansprechen untersucht. Dabei konnte keine Abhängig-keit in Bezug auf die PD-1 Expression der T-Lymphozyten gefunden werden. Die im-munhistologische PD-L1 Expression wurde als wesentlicher Parameter bei verschie-denen Tumoren beschrieben, wobei neben der Expression von PD-L1 auf den Tumorzel-len auch die PD-L1 Expression auf Antigen-präsentierenden Zellen als signifikant korre-liert gefunden werden konnte [4]. In der momentanen Zulassungslage be-steht für Nivolumab keine Notwendigkeit, die Expression von PD-L1 in Tumoren zu untersuchen. Bei Pembrolizumab ist für die Anwendung bei NSCLC die PD-L1 Fär-bung bezüglich der Tumorzellen nötig. Eine Expression von mindestens 1 % reicht da-bei aus, wobei die Intensität der Färbung und die Ausprägung der membranären Anfärbung (geschlossen – partiell) keine Rolle spielen. Der zukünftige Einsatz in der Erstlinientherapie hat sehr wahrschein-lich höhere Cut-Off Werte. Bei den noch nicht zugelassenen Therapeutika ist in den bisherigen Studien insbesondere das Atezolizumab hervorzuheben, da dort die so genannten Immunzellen, am ehesten APC, hinsichtlich ihrer PD-L1 Expression als Stratifizierungswerkzeug genutzt werden.Die verschiedenen Therapeutika verwen-den dabei in den jeweiligen Studien di-verse monoklonale Antikörper für die im-munhistochemische Färbung, die in einer Harmonisierungsstudie verglichen wurden. Zum Einsatz kommen hier zwei Antikörper der Firma DAKO, Klone 28-8 und 22C3 sowie zwei Antikörper der Firma Roche/Spring, Klone SP142 und SP263. Die Studie konnte zeigen, dass die Spezifität identisch ist. Die

PD-L1 Immunhistochemie

Abbildung 1: Färbung von Plazenta mit anti-PD-L1, CAL10, 200x mit membranärer Färbung des Synzytiotrophoblasten.

Anmerkungen von P. L. Kandalaft und A. M.Gown zu den in Tabelle 2 genannten Markern [1] :

Von Dr. med. Till Braunschweig, Institut für Pathologie, Universitätsklinikum Aachen

Abbildung 2: Färbung von Tonsillengewebe mit anti-PD-L1, CAL10, 200x mit membranärer Färbung Antigen-präsentierender Zellen APC).

Abbildung 3: Färbung eines NSCLC, Plattenepithelkarzinoms, mit anti-PD-L1, CAL10, 200x mit membranärer Färbung Tumorzellen (ca. 70 %).

300 µm2001000

300 µm2001000

300 µm2001000

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Intensität zeigte in dieser Studie ähnliche Ergebnisse bei den zwei DAKO Antikörpern und dem Roche SP142. Der Roche Antikör-per SP263 war als ready-to-use Antikörper deutlich intensiver [5]. Die Antikörper der Firma DAKO sind seit kurzem verfügbar, jedoch kostenintensiv zum Teil als Färbe-kit zu beziehen. Die Antikörper der Firma Roche sind noch nicht regulär zu beziehen und bislang nur als Färbekit und ebenfalls kostenintensiv erhältlich. Alternativen bieten weitere Firmen, als Auswahl: Von der Firma Abcam wird häu-fig als Konzentrat der anti PD-L1 Antikörper, Klon 28-8 (identisch mit den DAKO-Klon) angewandt. Von der Firma Cell Signalling existieren zwei Antikörper (E1L3N und E1J2J), wovon der E1L3N häufig verwendet wird. Auch der monoklonale Antikörper PD-L1 CAL10 (Biocare/Zytomed Systems) zeigt ein identisches spezifisches Färbeergebnis und ist dabei kontrastreich und präzise.Für die Positivkontrolle wird Plazentage-webe eingesetzt, in dem der Synzytio-

trophoblast eine distinkte starke, mem-branäre Färbung zeigt (Abb. 1). APC in der Tonsille können auch als Positivkontrolle dienen, sind jedoch in ihrer Anzahl und Färbeintensität variabel (Abb. 2). Im Tu-morgewebe ist die Expression variabel, unabhängig von der Auswertung der Tu-morzellen oder APC (Abb. 3, Tumorzellen und Abb. 4, APC bzw. Immunzellen).Zur Auswertung für das Scoring im Rahmen der klinischen Anwendung in der Patholo-gie kommt nur die membranäre Färbung von PD-L1 zum Tragen. Dabei wird nur die Anzahl der gefärbten Tumorzellen bzw. APC in Prozent bestimmt. Die Problematik der Auswertung ist zum einen die zu wer-tende Positivität auch sehr zarter membra- närer Färbungen (Abb. 5) und die bereits in der Zulassung von Pembrolizumab für das NSCLC in der second line Therapie festge-legte Grenze von 1 %. Bei größeren histo-logischen Präparaten ist ein sehr genaues, zeitintensives Durchmustern in höherer Ver-größerung notwendig [6].

Antikörper und Kontrollen für die PD-L1-Immunhistochemie

Bezeichnung Format Verdünnung Menge Bestell-Nr.

PD-L1 (CD274)Klon: CAL10 I Wirt: Kaninchen

gebrauchsfertig - 6 ml RBG063konzentriert 1:100 – 1:200 0,5 ml RBK063-05

Bezeichnung Menge Bestell-Nr.

CD274 (PD-L1) Expression IHC Reference StandardParaffinschnitte von Stanzen aus 4 Zellkulturblöcken mit unterschiedlicher PD-L1-Expression (- / + / ++ / +++)

1 Packung mit 5 Objektträgern HD787

Literatur

[1] Igney FH, Krammer PH. Immune escape of tumors: apoptosis resistance and tumor counterattack. J Leukoc Biol 71:907-920, 2002

[2] Pardoll DM. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer 12:252-264, 2012

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Abbildung 4: Färbung eines Plattenepithelkarzinoms, NSCLC mit anti-PD-L1, CAL10, 200x mit membranärer Färbung von Tumorzellen (T) und tumorassoziierten Immunzellen, APC (IC).

Abbildung 5: Färbung eines Plattenepithelkarzinoms, NSCLC mit anti-PD-L1, CAL10, 400x mit membranärer Färbung von Tumorzellen: die Problematik zeigt sich hier mit fraglich geringer membranärer Färbung in 80 % oder doch nur prominente Zellgrenzen (z. B. G)?

300 µm2001000

G

G

IC

IC

T

100 µm50250

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