Evolution des Mutationsmusters in gastrointestinalen ... · In der Diagnostik der gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) spielt neben der Histologie die Immunhistochemie eine zentrale

Evolution des Mutationsmusters in gastrointestinalen Stromatumoren

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

Doctor medicinae (Dr. med.)

an der Medizinischen Fakultät

der Universität Leipzig

eingereicht von:

Katrin Schierle

geboren am 09.02.1977 in Schwäbisch Hall

angefertigt an:

Medizinische Fakultät der Universität

Institut für Pathologie

Betreuer: Prof. Dr. Claudia Wickenhauser / Prof. Dr. Lars-Christian Horn

Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom 18. Juni 2013

Für meine Familie

Bibliographische Beschreibung

Schierle, Katrin


Universität Leipzig, Dissertation

87 Seiten, 41 Literaturangaben, 12 Abbildungen, 46 Tabellen

Referat: In der Diagnostik der gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) spielt neben der

Histologie die Immunhistochemie eine zentrale Rolle. Die vorliegende Arbeit befasst

sich mit der Fragestellung, welche Wertigkeit der Mutationsanalyse im

diagnostischen Kontext zukommt und wie stabil Immunphänotyp und Mutationsstatus

im Verlauf der Erkrankung tatsächlich sind. In drei Fällen rezidivierter GIST war die

Histomorphologie, die Immunhistochemie und der Mutationsstatus im Vergleich zum

Primärtumor stabil. Bei den untersuchten synchron auftretenden Tumoren von drei

Patienten waren in der Mutationsanalyse unterschiedliche Ergebnisse zu erheben.

Bei zwei Patienten unterstützte das unterschiedliche Mutationsmuster das Vorliegen

synchroner Tumoren, bei einem Patienten ist das Vorliegen eines Primärtumors und

einer Metastase statt einem synchronen GIST wahrscheinlich. Die Untersuchung

metastasierter GIST wurde an verschiedenen Tumoren von neun Patienten

durchgeführt. Acht der neun Fälle zeigten sich bezüglich der Metastasen genotypisch

stabil, einer der acht Fälle wies zusätzlich einen Zugewinn einer Punktmutation auf,

die als Möglichkeit eines Tumormosaiks oder als neu erworbene zusätzliche Mutation

zu werten sein könnte. Zudem wurden 28 Fälle unklarer spindelzelliger Tumoren mit

uneinheitlichem immunhistochemischen Profil untersucht. In Zusammenschau mit

der Mutationsanalyse war eine eindeutige Bestimmung der Tumorentität möglich.

Abschließend zeigt sich die Kombination aus Histomorphologie,

immunhistochemischer Untersuchung und Mutationsanalyse als gutes

diagnostisches Mittel zur Sicherung der Tumorentität und Entdeckung eventuell neu

aufgetretener prognostisch relevanter Mutationen mit therapeutischer Konsequenz.

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis 1 1. Einleitung

2

1.1 Definition und Epidemiologie 2 1.1.1 Definition 2

1.1.2 Epidemiologie 3

1.2 Histologie 3 1.2.1 Spindelzellige GIST 4

1.2.2 Epitheloide GIST 5

1.2.3 Intermediäre GIST 6

1.2.4 Mitosen 7

1.3 Immunhistochemie 8 1.4 Molekulare Pathologie 9 1.5 Klinische Diagnostik 11 1.6 Krankheitsverlauf und Risikoabschätzung 11 1.7 Therapie 13 1.7.1 Patienten mit lokalem Tumorgeschehen 13

1.7.2 Patienten mit lokal fortgeschrittenem oder

metastasiertem GIST 13

2. Zielsetzung

15

3. Material und Methoden

16

3.1 Untersuchungsgut 16 3.1.1 Rezidivierte gastrointestinale Stromatumoren 16

3.1.2 Synchrone gastrointestinale Stromatumoren 16

3.1.3 Metastasierte gastrointestinale Stromatumoren 16

3.1.4 Unklare spindelzellige Tumoren 17

3.2 Chemikalien 17 3.3 Verbrauchsmaterialien 17

3.4 Chemikalien-Zusammensetzungen 18 3.5 Geräte 19 3.6 Antikörper Immunhistochemie 20 3.7 Oligonukleotide 20 3.8 Bestimmung des Risikoprofils und TNM-Klassifikation 22 3.9 Immunhistochemie 24 3.9.1 Probenaufarbeitung 25

3.9.2 Durchführung und Färbung 25

3.9.3 Auswertung und Kontrolle 26

3.10 Mutationsanalyse 27 3.10.1 Probenaufbereitung 27

3.10.2 Entparaffinierung 27

3.10.3 DNA-Extraktion 27

3.10.4 Amplifikation / Polymerase-Kettenreaktion 29

3.10.5 Konzentrationsbestimmung des PCR-Produktes 30

3.10.6 Kapillargelelektrophorese 30

3.10.7 Aufreinigung der PCR-Produkte 32

3.10.8 Sanger-Sequenzierung 32

3.10.9 Sequenzauswertung 33

4. Ergebnisse

35

4.1 Patienten mit Lokalrezidiv eines GIST 37 4.1.1 Risiko der Krankheitsprogression nach Fletcher und

Miettinen

37

4.1.2 Immunhistochemie 38

4.1.3 Mutationsanalyse 38

4.2 Patienten mit synchron aufgetretenen GIST 39 4.2.1 Risiko der Krankheitsprogression nach Fletcher und

Miettinen

40



4.3 Patienten mit metastasiertem GIST 42 4.3.1 Risiko der Krankheitsprogression nach Fletcher und

Miettinen

44



4.4 Patienten mit unklaren spindelzelligen Tumoren 49 4.4.1 Risiko der Krankheitsprogression nach Fletcher und

Miettinen

51



5. Diskussion

57

5.1 Patienten mit Lokalrezidiv eines GIST 57 5.2 Patienten mit synchronen GIST 59 5.3 Patienten mit metastasiertem GIST 61 5.4 Patienten mit unklaren spindelzelligen Tumoren 70 Zusammenfassung

73

Tabellenverzeichnis

76

Abbildungsverzeichnis

78

Literaturverzeichnis

79

Erklärung

84

Danksagung

85

Lebenslauf

86

Abkürzungen

A Adenin

AEC 3-Amino-9-Ethylcarbazol

αSMAC glattmuskuläres Aktin (alpha-smooth-muscle-Actin)

bp Basenpaar

C Cytosin

CD Oberflächenmarker (Cluster of differentiation)

dNTPs Desoxyribonukleosidtriphosphate

DNA Desoxyribonukleinsäure

DOG-1 Protein unbekannter Funktion auf der Oberfläche von GIST

ESMO European Society for Medical Oncology

G Guanin

GIST Gastrointestinaler Stromatumor

HE Hämatoxylin-Eosin-Färbung

HPF Gesichtsfeld in der 40er Vergrößerung (high power field)

kb Kilobasen (1.000 Basen)

KIT Protoonkogen für einen transmembranären Tyrosinkinaserezeptor

m Milli

µ Mikro

M Molar

ML Lungenmittellappen

PAS Perjodsäure-Schiffs-Reaktion (periodic acid-Schiff-reaction)

PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)

PDGFRA Rezeptor für den Wachstumsfaktor PDGF-A

(platelet derived growth factor)

Prot. Protein

prox. proximal

rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)

S100 Protein neuroektodermalen Gewebes

T Thymin

Taq Thermus aquaticus

UL Lungenunterlappen

1

1. Einleitung

1.1 Definition und Epidemiologie

1.1.1 Definition

Gastrointestinale Stromatumoren (GIST) stellen eine besondere Entität unter den

mesenchymalen Tumoren dar. Die Zellen des GIST entstehen wahrscheinlich aus

den interstitiellen Cajal-Zellen oder deren Vorläuferzellen, die auch als

Schrittmacher-Zellen des Gastrointestinaltrakts bezeichnet werden. Sie stellen die

Vermittler zwischen dem autonomen Nervensystem und der muskulären Wandung

zur Steuerung der Peristaltik dar. Dabei tragen sie sowohl immunhistochemisch als

auch ultrastrukturell neuronale und muskuläre Merkmale in unterschiedlicher

Ausprägung (Kindblom et al. 1998).

Betrachtet man in Kenntnis dieser Tatsachen die historische Entwicklung von der

Erstbeschreibung bis zur Mutationsanalyse, so ist die Schwierigkeit der

Charakterisierung der GIST gut nachzuvollziehen. Sie wurden erstmals von Golden

und Stout (1941) als „mesenchymale Tumoren des Verdauungstraktes“ beschrieben.

Durch die ab den frühen 1980er Jahren möglich gewordenen immunhistochemischen

Untersuchungen fiel auf, dass die Tumoren mit fehlendem oder nicht-eindeutigem

immunhistochemischen Nachweis muskulärer Marker neu zuzuordnen waren. Es

wurde für diese Tumoren der Begriff des „stromalen Tumors“ eingeführt (Mazur und

Clark 1983). Im Rahmen der immunhistochemischen und elektronenmikroskopischen

Untersuchungen wurde eine genauere Zuordnung dieser Tumoren versucht, was

auch mit der Etablierung des Nachweises von CD34 und vor allem CD117 gelang.

Seit 1998 können GIST aufgrund des immunhistochemischen Profils einer

eigenständigen Tumorentität zugeordnet werden (Sarlomo-Rikala et al. 1998). Dies

wurde durch die Beschreibung von Mutationen im KIT-Gen weiter untermauert

(Hirota et al. 1998, Rubin et al. 2000). Im Anschluss daran vergrößerte sich das

Wissen um die GIST stetig. Durch die fortschreitende Entwicklung in der

Immunhistochemie mit der Einführung des Markers DOG-1 (Discovered on GIST)

und dem routinemäßigen Einsatz von Mutationsanalysen hat die Diagnostik an

Präzision gewonnen und das Verständnis der Pathogenese konnte gefestigt werden.

2

1.1.2 Epidemiologie

Grundsätzlich sind mesenchymale Tumoren des Gastrointestinaltraktes selten. Dabei

gelten GIST als die häufigsten unter ihnen. Da die eigenständige Tumorentität GIST

erst seit den 1990er Jahren eindeutig definiert wurde, sind erst seit etwa 10 Jahren

verlässliche Statistiken verfügbar. Darin wird eine Prävalenz von 15 bis 20 Fällen pro

Million beschrieben, dies entspricht in Deutschland circa 1200 Neuerkrankungen pro

Jahr. Die Prävalenz ist wahrscheinlich höher anzugeben, da viele Tumoren zufällig

bei Routineuntersuchungen entdeckt werden. Zudem zeigte eine Studie gastrischer

GIST im Obduktionsgut, dass kleine Tumoren von bis zu 10 Millimeter Durchmesser

bei mehr als 20% der Erwachsenen über 50 Lebensjahre nachgewiesen werden

können (Agaimy et al. 2007).

GIST können in jedem Alter auftreten, in der Regel sind Erwachsene ab dem 40.

Lebensjahr betroffen, das mittlere Erkrankungsalter beträgt 55 Jahre (DeMatteo et al.

2000). 55% der GIST treten bei Männern auf.

Des Weiteren gibt es Einzelberichte, die auf eine hereditäre Prädisposition für die

Entwicklung von GIST verweisen; dies ist jedoch aufgrund der geringen Fallzahl

wenig erforscht.

1.2 Histologie

In der Untersuchung von GIST fällt eine unterschiedliche Histomorphologie der

Tumoren auf. Es können drei verschiedene Wachstumsmuster identifiziert werden:

spindelzellig (70%), epitheloid (20%) und intermediär (10%). Sie sind in Abbildung

1.1 bis 1.3 dargestellt. Selten zeigen die Tumoren ein prominentes myxoides Stroma

oder nestartiges Wachstum, das an ein Paragangliom erinnert. In weniger als 3% der

Fälle kommen zelluläre Atypien vor. Gelegentlich zeigen GIST, vor allem im

Dünndarm, eingeschlossene eosinophile Faserstrukturen oder noduläre Strukturen,

die sich in der PAS-Reaktion positiv darstellen. Diese hyalinen oder fibrillären

Strukturen entsprechen Anteilen von Kollagenfasern ohne weitere histologische

Signifikanz (Fletcher et al. 2000).

3

1.2.1 Spindelzellige GIST

Ein GIST dieses Wachstumsmusters zeichnet sich durch eosinophile, gleichförmige

Zellen, die in kurzen Faszikeln oder Wirbeln angeordnet sind, aus. Die Zellkerne sind

oval bis rund konfiguriert mit teils feinvesikulärem Chromatin. Oft zeigen sich die

Zellkerne palisadenförmig angeordnet. Interstitiell finden sich oft kleine, dünnwandige

Gefäße und Blutungen in den Tumoren sind häufig. Das histologische Bild ist in

Abbildung 1.1 dargestellt.

Abbildung 1.1:

Histomorphologie eines spindelzelligen GIST mit wirbelartig angeordneten Zellen mit

überwiegend ovalen Zellkernen ohne Polymorphie und einzelnen interstitiellen

Gefäßen (HE, 200fache Vergrößerung).

4

1.2.2 Epitheloide GIST

Dieser Wuchstyp eines GIST besteht aus nestartig konfigurierten runden

Tumorzellen mit variabler Eosinophilie. Gelegentlich kann auch ein klares

Zytoplasma vorliegen. Das Zytoplasma ist mitunter um den Zellkern retrahiert. Dieser

zeigt sich, ähnlich dem der spindelzelligen GIST, rund bis oval mit gleichförmigem

vesikulärem Chromatin. Das histologische Bild ist in Abbildung 1.2 veranschaulicht.

Abbildung 1.2:

Histomorphologie eines epitheloiden GIST mit runden teils eosinophilen Zellen, zum

Teil mit klarem Zytoplasma und gleichförmigen runden bis ovalen Zellkernen (HE,

200fache Vergrößerung).

5

1.2.3 Intermediäre GIST

Die Histomorphologie dieser GIST entspricht einer gemischten Zellarchitektur. Die

Übergänge zwischen spindelzelligen und epitheloiden Arealen können innerhalb

eines Tumors sehr scharf sein. Andere intermediäre GIST zeigen ein zytologisches

Bild, das einer Mischung der vorbeschriebenen Wachstumsformen entspricht. Dabei

zeigen die Zellen ein ovales Erscheinungsbild mit den bereits vorbeschriebenen

runden bis ovalen gleichförmigen Zellkernen, wie Abbildung 1.3 darstellt.

Abbildung 1.3:

Histomorphologie eines intermediären GIST mit eosinophilen teils runden, teils

spindelförmigen Zellen sowie überwiegend wirbelartiger Anordnung mit

gleichförmigen runden bis ovalen Zellkernen ohne Atypien (HE, 200fache

Vergrößerung).

6

1.2.4 Mitosen

Bei der Untersuchung von GIST fällt auf, dass aufgrund des histomorphologischen

Bildes kein Rückschluss auf das klinische Verhalten der Tumoren möglich ist. Zur

Lösung dieses Problems war von Ranchod und Kempson (1977) die Zählung der

Mitosen an glattmuskulären Tumoren als hilfreich bewertet worden. Es konnte an

einer Serie von 100 Fällen gezeigt werden, dass eine Anzahl von mehr als fünf

Mitosen pro zehn HPF mit einem aggressiven klinischen Verhalten des Tumors

einhergeht. Seitdem ist die Mitosezählung als bester Prognosemarker für Tumoren

von breiter Akzeptanz. Inzwischen hat sich bei GIST die Zählung von 50 HPF zur

Bestimmung der Mitosezahl durchgesetzt. Wird die Tumorgröße beziehungsweise

die Lokalisation mit einbezogen ist es möglich, mehrere Risikoklassifikationen zum

Krankheitsprogress anzuwenden, auf die im Späteren eingegangen wird. In der

Abbildung 1.4 wird eine Mitose eines GIST gezeigt.

Abbildung 1.4:

Darstellung einer Mitosefigur (Pfeil) in einem intermediären GIST in 400facher

Vergrößerung (HE), wie es einem HPF entspricht.

7

1.3 Immunhistochemie

Die Durchführung immunhistochemischer Untersuchungen bildet neben der

Mutationsanalyse einen zentralen Bestandteil der Diagnostik der GIST. Durch die

Einführung der Immunhistochemie war die Identifikation als eigenständige

Tumorentität möglich, wenngleich lediglich die Positivität in der Färbung für DOG-1

spezifisch für GIST ist. Die Färbung für CD34, die als erste Färbung bei der

Identifikation der Tumoren eine große Rolle spielte, ist unspezifisch für das Vorliegen

eines GIST. Durch diese Färbung werden auch andere mesenchymale Tumoren

charakterisiert. Zudem zeigen sich, je nach Literaturangaben, GIST in 60 – 80% der

Fälle positiv für diese Immunreaktion (Fletcher et al. 2002). Des Weiteren ist die

Färbung für CD117 zu nennen. Sie ist zwar ebenfalls unspezifisch, aber in 95% der

GIST positiv. Dabei zeigen sich variable Färbungsmuster, die von einer starken

diffusen zytoplasmatischen Färbung über ein punktförmiges, Golgi-assoziiertes („dot-

like“) Färbemuster bis hin zu einer starken membranären Färbung reichen.

Diesbezüglich ist zu bemerken, dass keinerlei Korrelation mit dem Vorliegen einer

Mutation in KIT hergestellt werden kann.

Besonders hervorzuheben ist die immunhistochemische Färbung für DOG-1. Sie

zeigt eine höhere Sensitivität und Spezifität für GIST als alle anderen

immunhistochemischen Untersuchungen und kann als spezifischer Marker für GIST,

unabhängig vom Mutationsstatus des Tumors, verwendet werden. Dabei zeigen sich

ähnlich viele GIST positiv, wie in der Färbung für CD117, jedoch werden auch

Tumoren, die meist durch fehlende Immunreaktivität für CD117 auffallen, mit erfasst

(Miettinen et al. 2009).

Zusätzlich können weitere immunhistochemische Untersuchungen für den platelet

derived growth factor receptor A (PDGFRA), αSMAC, S100, Caldesmon, Protein-

Kinase-C, Nestin und weitere durchgeführt werden, die sich aber weder spezifisch

noch als gut reproduzierbar herausgestellt haben (Liegl-Atzwanger et al. 2010).

Bezüglich der Darstellung der immunhistochemischen Färbungen sei auf Abbildung

4.1 im Ergebnisteil verwiesen.

8

1.4 Molekulare Pathologie

Mutationen von KIT- und PDGFRA-Rezeptor-Tyrosinkinasen spielen bei GIST die

größte Rolle. Die genomische Sequenzen beider Rezeptoren sind auf Chromosom 4

(4q12) lokalisiert und sie sind Teil der Familie der Typ-III-Rezeptor-Tyrosinkinasen.

Grundsätzlich bilden die Tyrosinkinase-Rezeptoren eine Gruppe transmembranärer

Proteine mit einer extrazellulären Domäne (ED), an die ein Ligand bindet, einem

transmembranären Anteil (juxtamembranäre Domäne – JMD), der die

Selbstaktivierung hemmt und zwei Tyrosinkinase-Domänen (TK1 und TK 2, Roskoski

2005). Die schematische Struktur der Rezeptoren ist in Abbildung 1.5 dargestellt.

TK1

TK2

JMD

ED

L

P P

P P

TK1

TK2

JMD

P P

P P

Exon 9

Exon 11

Exon 13

Exon 17 Exon 18

L

TK1

TK2

JMD

ED

L

P P

P P

TK1

TK2

JMD

P P

P P

Exon 9

Exon 11

Exon 13

Exon 17 Exon 18

L

Abbildung 1.5:

Schematischer Aufbau des KIT-Tyrosinkinase-Rezeptors (links) und PDGFRA-

Tyrosinkinase-Rezeptors (rechts) mit Bindungsstelle des Liganden (L), extrazellulärer

Domäne (ED), juxtamembranäre Domäne (JMD) und zwei Tyrosinkinase-Domänen

(TK1 und TK2) mit Zuordnung zu den jeweils kodierenden Exonen.

9

Die Bindung von zwei homodimerisierten Ligandenmolekülen an zwei

Tyrosinkinaserezeptoren führt zu einer Dimerisierung mit Autophosphorylierung und

Aktivierung der intrazellulären Tyrosinkinase-Domänen. Über Phosphorylierung wird

die Aktivierung verschiedener nachgeschalteter Signalkaskaden vermittelt und

aktiviert. Dies bestimmt die Differenzierung und Proliferation sowie letztendlich das

Überleben der Zellen (Rönnstrand 2004).

Kommt es im Verlauf der Tumorgenese zu einer Mutation des KIT-Gens, so folgt eine

liganden-unabhängige, dauerhafte Aktivierung der Signalkaskade. Dies führt zu einer

gesteigerten Zellproliferation, einer Hemmung der Apoptose und somit zu einer

Neoplasie (Hirota et al. 1998).

Aufgrund der Lokalisation der Mutationen im KIT- oder PDGFRA-Gen sind zwei

Sorten von Mutationen zu unterscheiden:

1. Mutationen des Rezeptor-regulierenden Anteils im Bereich der extrazellulären

und juxtamembranären Domäne (ED und JMD)

2. Mutationen des enzymatischen Anteils im Bereich der Tyrosinkinasen

Im Falle einer Mutation im KIT-Gen treten diese am häufigsten in Exon 11,

entsprechend der juxtramembranären Domäne, auf. Dies führt zu einer Instabilität

der autoregulatorischen Funktion und setzt eine spontane Tyrosinkinase-Aktivierung

in Gang. Die zweithäufigste Mutation im KIT-Gen betrifft das Exon 9, entsprechend

der extrazellulären Domäne, bei der somit die Antidimerisierung außer Kraft gesetzt

wird. Es kommt hier zu einer spontanen Homodimerisierung mit nachfolgender

Rezeptoraktivierung. Im Falle einer Mutation resultiert eine Aktivierung

unterschiedlicher intrazellulärer Signalwege.

Die Majorität der PDGFRA-Mutationen betrifft die intrazelluläre Signalweiterleitung

mit Mutationen in Exon 18, das für die Tyrosinkinase 2-Domäne kodiert. Es wird eine

Aktivierungs-Schleife in Gang gesetzt, die sowohl die ATP-Bindungstasche als auch

die Kinase-Aktivierung verändert.

Bei familiären GIST-Syndromen treten sehr ähnliche Mutationen im KIT-Gen und /

oder PDGFRA-Gen als Keimbahnmutation auf. Zusätzlich sind in diesen Fällen zwei

Mutationen in Exon 8 und Exon 12 von KIT nachgewiesen worden, die noch nie in

sporadischen GIST beschrieben wurden (Lasota und Miettinen 2008).

10

1.5 Klinische Diagnostik

Sehr häufig werden GIST als Zufallsbefunde im Rahmen anderer diagnostischer

Maßnahmen oder chirurgischer Interventionen entdeckt. Daraus ergibt sich eine Rate

der zufällig entdeckten GIST von bis zu 55% bezogen auf die Gesamtzahl der GIST

(Agaimy et al. 2007). Da GIST keine spezifischen Symptome zugeordnet werden

können, ist das klinische Erscheinungsbild der Patienten ausgeprägt heterogen und

oft geprägt durch die primäre Ursache, die zu einer Untersuchung oder Intervention

geführt hat, die letztendlich zur Entdeckung eines GIST führte. In der

weiterführenden Diagnostik spielt neben bildgebenden Verfahren die Endoskopie

eine zentrale Rolle. Hier imponieren GIST als submuköse Raumforderungen mit oder

ohne oberflächliche Ulzeration der Schleimhaut. Die Diagnostik kann durch die

Endosonographie ergänzt werden, in der ein GIST in der Regel als scharf begrenzter

Tumor imponiert. Zusätzlich erfolgt die Ausbreitungsdiagnostik mittels

Computertomographie (CT) zum Staging. Der Positronenemissionstomographie

(PET) wird in der Primärdiagnostik eine eher untergeordnete Rolle zugedacht. Sie ist

jedoch unerlässlich zur späteren Beurteilung eines Ansprechens auf die

medikamentöse Therapie.

Trotz aller bildgebender und interventioneller Methoden ist die letztendliche Diagnose

eines GIST Aufgabe des Pathologen mit Bestimmung des immunhistochemischen

Profils und der Mutationsanalyse, da differentialdiagnostisch immer auch

Leiomyome, Neurinome, Lipome oder Sarkome in Frage kommen.

1.6 Krankheitsverlauf und Risikoabschätzung

Seit der Erkennung der GIST als eigenständige Tumorentität wurde versucht, die

bezüglich des Verlaufes sehr heterogene Gruppe dieser Tumoren in

Risikoklassifikationen einzuteilen. Dabei stellte es sich als sehr schwierig heraus, den

weiten Bogen von zufällig entdeckten kleinen Tumoren bis hin zu metastasierten

Tumoren zu spannen. Bezüglich des Risikos des Krankheitsprogresses sind mehrere

Faktoren entscheidend: die Größe des Tumors, die erfasste Mitosenzahl pro 50 HPF

und je nach Klassifikation auch die Tumorlokalisation. Im klinisch-pathologischen

11

Alltag haben sich die Klassifikation nach Fletcher (Fletcher et al. 2002) und die

Klassifikation nach Miettinen (Miettinen und Lasota 2006) durchgesetzt. Sie sind in

den folgenden Tabellen aufgeführt.

Tabelle 1.1 – Risikoklassifikation nach Fletcher

Mitose-Rate Tumorgröße Risiko der Krankheitsprogression

< 5 / 50 HPF < 2 cm Sehr geringes Risiko

< 5 / 50 HPF 2 – 5 cm Geringes Risiko

< 5 / 50 HPF 5 – 10 cm

6 – 10 / 50 HPF < 5 cm Intermediäres Risiko

> 5 / 50 HPF > 5 cm

jede > 10 cm

> 10 / 50 HPF jede

Hohes Risiko

Tabelle 1.2 – Risikoklassifikation nach Miettinen

Risiko der Krankheitsprogression

Mitose-Rate Tumorgröße Magen Jejunum /

Ileum Duodenum Rektum

≤ 5 / 50 HPF ≤ 2 cm kein Risiko kein Risiko kein Risiko kein Risiko

> 2 ≤ 5 cm sehr gering gering gering gering

> 5 ≤ 10 cm gering moderat

> 10 cm moderat hoch hoch hoch

> 5 / 50 HPF ≤ 2 cm kein Risiko hoch - (*) hoch

> 2 ≤ 5 cm moderat hoch hoch hoch

> 5 ≤ 10 cm hoch hoch

> 10 cm hoch hoch hoch hoch

(*) Für GIST im Duodenum mit < 5 Mitosen / 50 HPF und ≤ 2 cm Größe ist aufgrund

der niedrigen Fallzahlen kein Risikoprofil verfügbar.

Zusätzlich steht seit der siebenten Auflage der TNM-Klassifikation eine Klassifikation

für die bisher in dieser Form nicht erfassten GIST zur Verfügung (TNM –

Klassifikation maligner Tumoren, Wittekind, Meyer, 2010).

12

1.7 Therapie

Die Heterogenität der Gruppe der GIST macht auch die Auswahl eines adäquaten

therapeutischen Verfahrens sehr komplex. Es werden im Rahmen der Erstdiagnostik

zwei Patientengruppen unterschieden: Patienten mit lokalem Tumorgeschehen und

Patienten mit lokal fortgeschrittenem oder metastasiertem GIST.

1.7.1 Patienten mit lokalem Tumorgeschehen

Prinzipiell ist bei nicht-metastasierten GIST als Standard eine chirurgische R0-

Resektion anzustreben. Ist es nicht möglich, im Rahmen der Primäroperation eine

R0-Situation zu erreichen, besteht die Möglichkeit einer neoadjuvanten Therapie mit

Imatinib (Glivec, Novartis Pharma). Dabei ist auf die Bestimmung des

Mutationsstatus zu achten. Beispielsweise spricht ein GIST ohne Nachweis einer

Mutation an den klassischen GIST-Positionen, ein sogenannter Wildtyp, schlecht auf

eine Imatinib-Therapie an. Gleiches ist bei Mutationen in Exon 17 von KIT und in

Exon 18 von PDGFRA beschrieben. Mutationen in Exon 9 von KIT erfordern eine

Verdopplung der Dosis, um ein Therapieansprechen zu ermöglichen.

1.7.2 Patienten mit lokal fortgeschrittenem oder metastasiertem GIST

Patienten dieser Gruppe erhalten eine medikamentöse Therapie mit Imatinib, wobei

es keine Rolle spielt, ob es sich um eine lokal fortgeschrittene Erkrankung oder um

einen metastasierten GIST mit gegebenenfalls chirurgischer Entfernung aller

Metastasen handelt. Hierzu ist die Mutationsanalyse unerlässlich. Durch sie erfolgt

eine Festlegung der erforderlichen Dosis. Zudem wurde erkannt, dass eine

Resektion von Metastasen zu einem Überlebensvorteil führt. Kontrovers wird derzeit

diskutiert, ob lokal unter Imatinib-Therapie progrediente Tumoren reseziert werden

sollen, oder ob der medikamentösen Zweitlinien-Therapie der Vorzug zu geben ist.

Entsprechend der aktuellen ESMO-Leitlinien ist im Falle eines Tumorprogresses

unter Imatinib die Entscheidung im Einzelfall festzulegen (Casali et al. 2010).

Statistisch liegt der Vorteil der Resektion auf Höhe des Vorteils einer Zweitlinien-

Therapie mit Sunitinib (Sutent, Pfizer). Im Moment wird die Resektion eines lokal

13

fortgeschrittenen Tumors eher als palliative Intervention betrachtet. Dem gegenüber

wird die Steigerung der Dosis von Imatinib von 400 mg/d auf 800 mg/d als Standard

bei fortschreitendem Wachstum des Tumors angesehen. Falls es zu einer Resistenz

gegen Imatinib kommt, ist eine Zweitlinientherapie mit Sunitinib möglich. Folgt ein

Therapieversagen in der Zweitlinientherapie, so ist der Patient in eine Studie mit

neuen Substanzen einzuschließen.

Allen Patienten ist gemeinsam, dass eine Besprechung des Falles in einem

interdisziplinären Tumorboard mit Anwesenheit von Vertretern der Chirurgie,

Onkologie, Pathologie, Radiologie und Strahlentherapie zur gemeinsamen

Festlegung des Vorgehens obligat ist. Dies ist auch in den ESMO-Leitlinien als Gold-

Standard festgelegt (Casali et al. 2010).

14

2. Zielsetzung

In Klinik und Pathologie fällt bei der Tumorentität GIST auf, dass sie sehr heterogen

sind und die Verläufe der Krankheitsgeschichten sehr unterschiedlich erscheinen.

Zudem ist bei wenigen anderen Tumorentitäten die Molekularpathologie so zentraler

Bestandteil der Diagnostik und auch mit entscheidend für die medikamentöse

Therapie. Da die Tumorentität als „jung“ anzusehen ist und innerhalb kürzester Zeit

die meisten Patienten mit Imatinib behandelt wurden, sind nur noch wenige Daten

der „Vor-Imatinib-Ära“ verfügbar. Aus dem Archiv des Eingangsgewebes und dem

Sektionsarchiv des Instituts für Pathologie des Universitätsklinikums Leipzig konnte

das Untersuchungsgut überwiegend Imatinib-naiver Patienten für diese Arbeit

rekrutiert werden. Mit dieser Arbeit sollten folgende Fragen beantwortet werden:

- Ist ein Unterschied der Histomorphologie, Immunhistochemie und

Mutationsanalyse von rezidivierten GIST im Vergleich von Primärtumor und

Rezidiv zu evaluieren?

- Finden sich bei Patienten mit synchron aufgetretenen GIST Unterschiede

zwischen den einzelnen Tumoren und ist es möglich, diese Tumoren mittels

Immunhistochemie und Mutationsanalyse genauer zu charakterisieren?

- Findet sich in Metastasen eines GIST ein ähnliches histomorphologisches Bild

und immunhistochemisches Ergebnis im Vergleich zum Primärtumor?

- Sind dieselben Mutationen in Metastasen und Primärtumor nachweisbar?

- Besteht bei unklaren spindelzelligen Tumoren die Möglichkeit, sie durch

Immunhistochemie in Kombination mit Mutationsanalyse zu charakterisieren

und die Tumorentität festzulegen?

15

3. Material

3.1 Untersuchungsgut

Die vorliegende, retrospektive Studie umfasste Tumorproben von insgesamt 43

Patienten, bei denen zwischen 2001 und 2011 im Rahmen einer chirurgischen

Intervention beziehungsweise einer Obduktion ein gastrointestinaler Stromatumor

diagnostiziert wurde bzw. bei denen im Rahmen der Obduktion ein gastrointestinaler

Stromatumor entdeckt wurde. Die Diagnose wurde histologisch und

immunhistochemisch gestellt. Sämtliche Tumoren wurden immunhistochemisch

charakterisiert, wobei die Phänotypisierung die Reaktionen für CD117, CD34,

αSMAC, DOG-1 und Vimentin umfasste. Die klinischen Daten wurden aus den

Patientenakten und aus dem Sektionsarchiv des Institutes für Pathologie der

Universitätsklinik Leipzig rekrutiert.

3.1.1 Rezidivierte gastrointestinale Stromatumoren

Im Probenkollektiv befanden sich drei Patienten, bei denen ein Rezidiv eines

gastrointestinalen Stromatumors diagnostiziert wurde. Ein Primärtumor war im

Oesophagus lokalisiert, wobei sich das Rezidiv mediastinal darstellte. Bei einem

weiteren Patienten lag der GIST im Duodenum mit einem Rezidiv periduodenal vor.

Der dritte Patient zeigte einen GIST im Magen mit einem Rezidiv im Treitzschen

Band sowie perikolisch im linken Oberbauch.

3.1.2 Synchrone gastrointestinale Stromatumoren

Im Rahmen der Probenauswahl war es möglich, Tumormaterial von drei Patienten

mit synchron aufgetretenen gastrointestinalen Stromatumoren mit einzubeziehen.

Dabei waren bei einem Patienten zwei synchrone GIST des Magens, bei einem

weiteren Patienten drei synchrone GIST des Magens und bei einem dritten Patienten

synchrone Tumoren in Colon und Dünndarm zu finden.

3.1.3 Metastasierte gastrointestinale Stromatumoren

In diese Gruppe fielen neun Patienten. Sämtliche Metastasen wurden zusammen mit

den Primärtumoren genotypisch charakterisiert. Bei einem Patienten (KE(3)) lagen

16

lediglich die entfernten Metastasen zur Untersuchung vor, da der Primärtumor zuvor

mit unbekanntem Untersuchungsergebnis in einer anderen Institution entfernt

worden war. Das Untersuchungsergebnis des Primärtumors war nicht zu erhalten.

3.1.4 Unklare spindelzellige Tumoren

In diese Gruppe fallen 28 nicht eindeutig zuordenbare spindelzellige Tumoren, bei

denen eine Mutationsanalyse durchgeführt wurde, um die Tumorentität festzulegen.

3.2 Chemikalien

Folgende Chemikalien wurden im Rahmen dieser Arbeit verwendet:

Tabelle 3.1 - Chemikalien

Bezeichnung Quelle

Aqua ad injectabila Braun, Melsungen

dNTPs ThermoScientific, Walldorf

Ethanol 100% Baker, Griesheim

H2O2, 3% (822287) Merck, Darmstadt

Isopropanol Baker, Griesheim

TaqPolymerase ThermoScientific, Walldorf

Xylol VWR, Darmstadt

3.3 Verbrauchsmaterialien

Bei der Bearbeitung des Untersuchungsgutes waren folgende Verbrauchsmaterialien

notwendig:

Tabelle 3.2 - Verbrauchsmaterialien

Bezeichnung Quelle

Einmalskalpell Braun / Aesculap, Tuttlingen

17

Bezeichnung Quelle

Eppendorf-Reaktionsgefäße (1,5 ml, 2,0 ml) Eppendorf, Hamburg

Objektträger und Deckgläser / Menzel-Gläser ThermoScientific, Walldorf

PCR-Reaktionsgefäße Sarstedt, Nümbrecht

Pipetten Eppendorf, Hamburg

Pipettenspitzen (Filter-tip) Eppendorf, Hamburg

QIAxcel DNA High-Resolution Kit (Kartusche) QIAGEN, Hilden

QX 0,2 ml 12-Tube Strips QIAGEN, Hilden

ZytoChem-Plus HRP Polymer-Kit (POLHRP006) Zytomed Systems, Berlin

3.4 Chemikalien-Zusammensetzungen

Es wurden im Rahmen der teils apparativ durchgeführten Untersuchungen folgende

Chemikalienzusammensetzungen und Test-Kits verwendet:

Tabelle 3.3 – Chemikalien-Zusammensetzungen

Bezeichnung Quelle

AEC-Konzentrat (ACI33C002) DCS, Hamburg

Aquatex Eindeckmedium (108562) Merck, Darmstadt

Mayers Hämalaunlösung (1.09249.0500) Merck, Darmstadt

QIAmp DNA FFPE Kit QIAGEN, Hilden

QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN, Hilden

QX Alignment Marker 15bp/1kb QIAGEN, Hilden

QX DNA Size Marker 50-800 pb QIAGEN, Hilden

Substratpuffer (PCI32RI00) DCS, Hamburg

Tabelle 3.4 – Zusammensetzung Master-Mix für PCR

Ansatz in µl

Wasser 24,5

10x Taq.-Puffer + (NH4)2SO4-MgCl2 4

dNTP’s Mix (2 mM) 4

18

Ansatz in µl

MgCl2 (25 mM) 4

Primer S2 (10 µM) 0,5

Primer AS2 (10 µM) 0,5

Taq.-polymerase (1 U/µl) 0,5

Summe 38

DNA 2

Gesamtansatz 40

3.5 Geräte

Die folgenden Geräte wurden bei den Untersuchungen eingesetzt:

Tabelle 3.5 – Geräte

Bezeichnung Quelle

Lichtmikroskop (Axioskop 2 plus) Carl Zeiss, Jena

NanoDrop (ND-1000) NanoDrop Technologies, Wilmington

QIAcube QIAGEN, Hilden

QIAxcel QIAGEN, Hilden

Schlittenmikrotom / Microm HR430 ThermoScientific, Walldorf

Thermocycler (PTC200) BIORAD, München

Thermomixer (5436) Eppendorf, Hamburg

Tischzentrifuge (5402) Eppendorf, Hamburg

Vortex (Vibrax-VXR) Janke und Kunkel, Staufen

Wärmeschrank (bis 80°C) Memmert, Schwabach

Wasserbad / Tissue Floatation Bath 45 Medite, Burgdorf

19

3.6 Antikörper Immunhistochemie

Für die immunhistochemische Untersuchung der histomorphologisch erfassten

Tumoren wurden Primärantikörper zum Nachweis von CD34, CD117, DOG-1, α-

Smooth-Muscle-Actin (αSMAC) und S100 verwendet.

Tabelle 3.6 – Herkunft der Primärantikörper

Antikörper Klon Spezies Bestellnr. Quelle

CD34 QBEND10 Maus PN IM0786 Beckman Coulter, Krefeld

CD117 polyclonal Kaninchen A4502 Dako, Hamburg

DOG-1 BV10 Kaninchen RMAB031 Zytomed Systems, Berlin

αSMAC 1A4 Maus M0851 Dako, Hamburg

S100 15E2E2 Maus MU058-UC DCS, Hamburg

Es wurden folgende Verdünnungen der Primärantikörper und Substrate zur

Darstellung verwendet:

Tabelle 3.7 – Verdünnungen und Substrat

Primärantikörper Verdünnung Substrat

CD34 1:50 AEC

CD117 1:50 AEC

DOG-1 1:30 AEC

αSMAC 1:80 AEC

S100 1:250 AEC

3.7 Oligonukleotide

Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide (Tabelle 3.8 und 3.9)

wurden von der Firma Metabion (Martinsried) bezogen.

Die Primer entsprechen den Mindestanforderungen an die Konfiguration des Primers

und der Genproduktlängen entsprechend der Empfehlung zur Durchführung der

20

Ringversuche gemäß den Vorgaben der Qualitätssicherungs-Initiative "QuIP" der

Deutschen Gesellschaft für Pathologie und des Bundesverbandes Deutscher

Pathologen zur diagnostischen Immunhistochemie und Molekularpathologie. Zum

Teil wurden die Primer mit Hilfe des freien online verfügbaren Programms „Primer3“

entworfen und überprüft (z. B. http://simgene.com/Primer3).

Tabelle 3.8 – Primer KIT

Genabschnitt Strang Sequenz (5’-3’)

Exon 9 (310) Forward GCC ACA TCC CAA GTG TTT TAT G

Reverse GAG CCT AAA CAT CCC CTT AAA TTG

Exon 11 (331) Forward TGT TCT CTC TCC AGA GTG CTC TAA

Reverse GGC GCA ATT TCA CAG AAA AC

Exon 13 (232) Forward CCT GTA TGG TAC TGC ATG CG

Reverse TGA TAA CCT GAC AGA CA

Exon 17 (243) Forward ATG GTT TTC TTT TCT CCT CC

Reverse TAC ATT ATG AAA RTC ACA GG

Länge des Genproduktes in Spalte 1 in Klammern.

Tabelle 3.9 – Primer PDGFRA

Genabschnitt Strang Sequenz (5’-3’)

Exon 18 (213) Forward CAG CTA CAG ATG GCT TGA TC

Reverse GAA GGA GGA TGA GCC TGA C

Exon 18 (256) Forward CAT GGA TCA GCC AGT CTT GC

Reverse TGA AGG AGG AGT AGC CTG AC

Länge des Genproduktes in Spalte 1 in Klammern.

21

3.8 Bestimmung des Risikoprofils und TNM-Klassifikation

Die Hämatoxylin-Eosin-gefärbten Schnittpräparate des Tumorgewebes wurden

reevaluiert und hinsichtlich des Risikos der Krankheitsprogression nach Fletcher

(Fletcher et al. 2002) und nach Miettinen (Miettinen und Lasota 2006) nach unten

beschriebenen Tabellen eingeordnet. Die Krankheitsprogression wird definiert als

Metastasierungsrate oder der Rate des tumorbezogenen Todes. In die Abschätzung

des individuellen Risikoprofils gehen die Variablen Tumorgröße und Auszählung der

Mitosen pro 50 HPF sowie im Falle der Klassifikation nach Miettinen die

Tumorlokalisation mit ein. Die Auswertung der Mitosen erfolgte in doppelter Zählung,

entsprechend 2 x 50 HPF.

Tabelle 3.10 – Klassifikation nach Fletcher

Mitose-Rate Tumorgröße Risiko der Krankheitsprogression

< 5 / 50 HPF < 2 cm Sehr geringes Risiko

< 5 / 50 HPF 2 – 5 cm Geringes Risiko

< 5 / 50 HPF 5 – 10 cm

6 – 10 / 50 HPF < 5 cm Intermediäres Risiko

> 5 / 50 HPF > 5 cm

jede > 10 cm

> 10 / 50 HPF jede

Hohes Risiko

Tabelle 3.11 – Klassifikation nach Miettinen

Risiko der Krankheitsprogression



≤ 5 / 50 HPF ≤ 2 cm kein Risiko kein Risiko kein Risiko kein Risiko

> 2 ≤ 5 cm sehr gering gering gering gering

> 5 ≤ 10 cm gering moderat

> 10 cm moderat hoch hoch hoch

> 5 / 50 HPF ≤ 2 cm kein Risiko hoch - (*) hoch

> 2 ≤ 5 cm moderat hoch hoch hoch

22



> 5 / 50 HPF > 5 ≤ 10 cm hoch hoch

> 10 cm hoch hoch hoch hoch

(*) Für GIST im Duodenum mit < 5 Mitosen / 50 HPF und ≤ 2 cm Größe ist aufgrund

der niedrigen Fallzahlen kein Risikoprofil verfügbar.

Zusätzlich besteht seit der siebenten Auflage der TNM-Klassifikation (TNM –

Klassifikation maligner Tumoren, Wittekind, Meyer, 2010) die Möglichkeit, GIST in

einer Tumorklassifikation zu erfassen. Die Kriterien hierfür sind in Tabelle 3.12

dargestellt. Das histopathologische Grading basiert auf der Mitoserate und wird mit

„niedriger Mitoserate“ bei Nachweis von weniger als 5 Mitosen pro 50 HPF und mit

„hoher Mitoserate“ bei Nachweis von mehr als 5 Mitosen pro HPF angegeben.

Tabelle 3.12 – TNM-Klassifikation

T - Primärtumor

TX Primärtumor kann nicht beurteilt werden

T0 Kein Anhalt für Primärtumor

T1 Tumor 2 cm oder weniger

T2 Tumor mehr als 2 cm, aber nicht mehr als 5 cm

T3 Tumor mehr als 5 cm, aber nicht mehr als 10 cm

T4 Tumor mehr als 10 cm in größter Ausdehnung

N – Regionäre Lymphknoten

NX Regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden

N0 Keine regionären Lymphknotenmetastasen

N1 Regionäre Lymphknotenmetastasen

M – Fernmetastasen

M0 Keine Fernmetastasen

M1 Fernmetastasen

Zudem besteht die Möglichkeit einer Stadiengruppierung nach UICC (International

Union against Cancer) für GIST des Magens und es Dünndarms, die in Tabelle 3.13

aufgeführt wird.

23

Tabelle 3.13 – Stadiengruppierung nach UICC

GIST des Magens (*) Mitoserate

Stadium IA T1, T2 N0 M0 niedrig

Stadium IB T3 N0 M0 niedrig

Stadium II T1, T2 N0 M0 hoch

T4 N0 M0 niedrig

Stadium IIIA T3 N0 M0 hoch

Stadium IIIB T4 N0 M0 hoch

Stadium IV jedes T N1 M0 jede

jedes T jedes N M1 jede

GIST des Dünndarms (*) Mitoserate

Stadium I T1, T2 N0 M0 niedrig

Stadium II T3 N0 M0 niedrig

Stadium IIIA T1 N0 M0 hoch

T4 N0 M0 niedrig

Stadium IIIB T2, T3, T4 N0 M0 hoch

Stadium IV jedes T N1 M0 jede

jedes T jedes N M1 jede

(*) Die Kriterien für die Stadiengruppierung des Magens kann auch für primäre,

solitäre GIST des großen Netzes angewandt werden.

Die Kriterien der Stadiengruppierung des Dünndarms können auch für weniger

häufige Lokalisationen, z. B. Ösophagus, Kolon, Rektum und Mesenterium

angewandt werden.

3.9 Immunhistochemie

Eine immunhistochemische Färbung dient der Visualisierung von Gewebe- bzw.

Zellantigenen. Dabei wird die spezifische Bindung des Primärantikörpers mit einem

Sekundärantikörper markiert. Hierzu wird ein Enzym-Polymer eingesetzt, in dem der

Sekundärantikörper wiederum mehrere Moleküle Meerrettich-Peroxidase (Horse

Radish Peroxidase – HRP) trägt. Die Meerrettich-Peroxidase visualisiert über eine

24

Enzym-Substrat-Reaktion in Gegenwart einer chromogenen Komponente die

Sekundärantikörperbindung und somit indirekt die Primärantikörperbindung.

3.9.1 Probenaufbereitung Von Tumorblöcken des ausgewählten Untersuchungsmaterials wurden mittels eines

Schlittenmikrotoms Paraffinschnitte hergestellt und bei maximal 80°C bis zu 20

Minuten im Brutschrank getrocknet. Anschließend folgte eine Entparaffinierung in

Xylol sowie eine absteigende Alkoholreihe, um das Schnittpräparat zu rehydrieren.

3.9.2 Durchführung der Färbung In einem ersten Schritt wird die endogene Peroxidase mit einer Inkubation des

Präparates mit 3%iger H2O2-Lösung inaktiviert. Wird auf diesen Schritt verzichtet, so

kann es zu einer unerwünschten Hintergrundfärbung kommen. Um eine

unspezifische Bindung des Primär- oder Sekundärantikörpers zu vermeiden und

somit unerwünschte Hintergrundfärbungen zu verhindern, wurden die

Primärantikörper in der unter Tabelle 3.7 beschriebenen Verdünnung verwendet.

Nach Auftragen des spezifischen Primärantikörpers (siehe Tabelle 3.6) und

Inkubation schließt sich ein Waschschritt und die Zugabe eines Verstärkungsreagenz

(PostBlock) an. Nach einem weiteren Waschschritt wird das HRP-Polymer

aufgetragen und der Überschuss entfernt. Anschließend wird durch Zugabe der

Substrat/Chromogenlösung eine enzymatische Reaktion der Peroxidase in Gang

gesetzt. Im Verlauf dieser Reaktion bildet sich am Ort der Bindung des

Primärantikörpers ein rotbrauner Farbniederschlag, entsprechend dem verwendeten

Chromogen AEC. Ist die gewünschte, mittels Lichtmikroskop kontrollierte,

Farbintensität erreicht, wird die Reaktion unter Zugabe von Wasser beendet und

anschließend eine Gegenfärbung der Kerne mit Mayers Hämalaunlösung

durchgeführt. Abschließend werden die Schnitte mittels des wässrigen

Eindeckmediums Aquatex abgedeckt. Die Zeiten der Reaktionsschritte sind in

Tabelle 3.14 beschrieben. Alle Reaktionsschritte werden bei Raumtemperatur

durchgeführt.

Die im Rahmen dieser Studie beschriebenen immunhistochemischen

Untersuchungen wurden für alle Tumoren gleichzeitig unter Mitführung der Positiv-

und Negativkontrollen durchgeführt.

25

Tabelle 3.14 – Durchführung der immunhistochemischen Färbung

Arbeitsschritt Zeit

1. Peroxidblock (3% H2O2-Lösung) 10 min

2. Waschen mit Waschpuffer 1 x 2 min

3. Primärantikörper (siehe Tabelle 2.6) 30 – 60 min


5. PostBlock 20 min


7. HRP-Polymer 30 min


9. AEC (lichtmikroskopische Kontrolle der Farbintensität) 5 – 15 min

10. Stoppen der Reaktion mit H2O

11. Gegenfärbung mit Mayers Hämalaun

12. Eindecken mit Aquatex

3.9.3 Auswertung und Kontrolle Die immunhistochemisch angefärbten Schnitte wurden gemeinsam mit den

korrespondierenden Hämatoxylin-Eosin-gefärbten Tumorpräparaten

lichtmikroskopisch ausgewertet. Dabei wurde die Färbeintensität bewertet. Ein

Präparat wurde als „positiv“ beschrieben, wenn mindestens 85% der Tumorzellen

eine starke Färbeintensität zeigten. Eine „schwach positive“ Färbung lag vor, wenn

die Färbeintensität gering ausgeprägt war oder weniger als 50% der Tumorzellen

eine positive Färbung zeigten. Bei einer „negativen“ Bewertung war keine Färbung,

entsprechend einer fehlenden Immunreaktivität, darzustellen. Lag eine

unzureichende Färbung der Positivkontrolle oder eine Anfärbung der

Negativkontrolle vor, so wurden die immunhistochemischen Aufarbeitungen

wiederholt.

Im Rahmen dieser Studie wurden auch unklare gastrointestinale spindelzellige

Tumoren mit einbezogen. Ein spindelzelliger Tumor wurde dann als „unklar“

bezeichnet, wenn ein uneinheitliches immunhistochemisches Profil vorlag, das heißt,

wenn immunhistochemische Färbungen, die typisch für das Vorliegen eines GIST

sind (Positivität für CD34, CD117, DOG-1), negativ oder lediglich schwach positiv

ausfielen. Zudem wurden in diese Gruppe Tumoren aufgenommen, deren

26

immunhistochemisches Profil zwar gut vereinbar war mit dem Vorliegen eines GIST,

aber andere Marker (αSMAC, S100) zusätzlich eine Immunreaktivität zeigten.

3.10 Mutationsanalyse

3.10.1 Probenaufbereitung

Die jeweiligen Tumorproben wurden einer lichtmikroskopischen Kontrolle unterzogen

und der Tumorbezirk markiert. An folgenden, mit Hilfe eines Schlittenmikrotoms

angefertigten Schnitten des korrespondierenden Paraffinblocks, folgte eine

Makrodissektion des Tumorareals. Hierzu wurden die nicht untersuchungsrelevanten

Areale des Schnittes mit einem Skalpell entfernt sodass der Tumorzellgehalt der

Proben mindestens 80% betrug.

3.10.2 Entparaffinierung

Das im Gewebe des makrodissezierten Schnittpräparats enthaltene Paraffin musste

für weitere Untersuchungsschritte aus dem Gewebe entfernt werden. Es wurde

mittels einer Lösung in Xylol und einer nachfolgenden absteigenden Alkoholreihe

gelöst. Hierfür wurden die Schnitte drei mal zehn Minuten in Xylol und anschließend

jeweils fünf Minuten in Ethanol mit absteigender Konzentration (100%, 95%, 70%)

inkubiert. Im Anschluss wurde das Material vorsichtig vom Objektträger entnommen

und in 2,0 ml Tubes überführt. Diese wurden mit geöffnetem Deckel bei 56°C in den

Thermomixer gestellt und so lange getrocknet, bis sich der Alkohol vollständig

verflüchtigt hatte.

3.10.3 DNA-Extraktion

Aus dem in Suspension befindlichen entparaffinierten Tumormaterial konnte die DNA

mittels des QIAamp DNA FFPE Tissue Kits (QIAGEN Katalog-Nummer 56404)

extrahiert werden.

Dabei wurden die 2,0 ml Tubes mit Puffer ATL und Proteinase K Solution versetzt,

kurz zentrifugiert und über Nacht bei 56°C bzw. mindestens eine Stunde inkubiert. Es

folgte eine Inkubation im Thermomixer bei 90°C über eine Stunde unter leichtem

27

Schütteln (300 rpm), um die Vernetzungen der DNA, die bei Formalinfixierung

auftreten, zu lösen. Die Proben wurden auf Raumtemperatur abgekühlt und

zentrifugiert.

Die folgenden Schritte erfolgten dann automatisiert mit Hilfe des QIAcube.

Tabelle 3.15 – Reaktionsschritte QIAcube

Reagenzien Reaktionsschritt

1. Zentrifugation, um Tropfen im Deckel zu entfernen

2. 200 µl Puffer AL wurden hinzugefügt, mischen mit Vortex

3. 200 µl Ethanol

(96 – 100%)

wurden hinzugefügt, mischen mit Vortex, um die

Flüssigkeit auf die Bindung an der Säule vorzubereiten

4. Zentrifugation, um Tropfen im Deckel zu entfernen

5. Überführung des Lysates auf die QIAmp MinElute-Säule

6. Zentrifugation bei 8 000 rpm für 1 Minute

7. 500 µl Puffer AW1 wurden hinzugefügt, um die Substanzen zu lösen, die

nicht an die Säule gebunden sind


9. Überführung der Säule in ein sauberes 2 ml

Probengefäß und Verwerfen des Überstandes

10. 500 µl Puffer AW2 wurden hinzugefügt, um die Substanzen zu lösen, die

nicht an die Säule gebunden sind




13. Zentrifugation bei 14 000 rpm für 3 Minuten, um die

Membran zu trocknen



15. 30 µl Puffer ATE wurden hinzugefügt, um die an der Säule gebundenen

DNA-Moleküle zu lösen

16. Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Minute


28

3.10.4 Amplifikation / Polymerase-Kettenreaktion

Die diagnostisch relevanten DNA-Regionen im KIT- und PDGFRA-Gen wurden durch

die Auswahl geeigneter Primer (siehe Abschnitt 3.7) mit einer Polymerase-

Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt. Die Polymerase-Kettenreaktion ermöglicht es,

spezifische Regionen der DNA zu vervielfältigen, wenn umgebend zwei Regionen mit

bekannter Sequenz vorhanden sind. Aus diesen umgebenden Regionen wurden

zwei Oligonukleotide ausgewählt, die zur Synthese von Primern verwendet werden.

Da als Ausgangsmaterial doppelsträngige DNA verwendet wurde, sind die Primer so

zu wählen, dass sie in 5’zu3’-Richtung aufeinander gerichtet sind.

Die Sequenzen wurden mittels des öffentlich zugänglichen Programmes „Primer3“

ausgewählt. Die PCR ist eine durch DNA-Polymerase katalysierte exponentielle

Reaktion, bei der als Ergebnis ein exponentiell vervielfältigtes Fragment

doppelsträngiger DNA, das durch die 5’-Enden der Primer begrenzt wird und dessen

Länge durch die Distanz zwischen beiden Primern gekennzeichnet ist, entsteht. Bei

der Primer-Wahl war darauf zu achten, dass keine komplementären Regionen

innerhalb der Primer vorhanden sind, da dies zu einer Zusammenlagerung der

Primer-Moleküle mit Entstehung von Primer-Dimeren führen würde.

Durch den Einsatz einer thermostabilen, DNA-abhängigen DNA-Polymerase (Taq-

Polymerase) wurde die Automatisierung der PCR ermöglicht. Dieses Enzym wurde

erstmals aus dem thermostabilen Bakterium Thermus aquaticus isoliert (Chien et al.

1976).

Eine PCR besteht im Wesentlichen aus drei, sich wiederholenden Schritten:

1. Denaturierung

Erhitzen der extrahierten doppelsträngigen DNA, beide Stränge trennen sich

voneinander.

2. Annealing

Absenkung der Temperatur, abhängig von der Primer-Sequenz, dabei erfolgt

eine Anlagerung an die komplementäre Sequenz des Einzelstrangs.

3. Elongation

Erhöhung der Temperatur auf die optimale Arbeitstemperatur der Taq-DNA-

Polymerase zur Verlängerung der Sequenz.

29

Die Schritte können bis zu 40 Mal wiederholt werden, danach nimmt die Menge an

Fehlhybridisierungen zu.

In den PCR-Gefäßen wurden im Thermocycler die vorbeschriebenen

Reaktionsschritte mit 40 – 50 ng Ausgangs-DNA bei folgenden Temperaturen und

Zeiten durchgeführt:

Tabelle 3.16 – Reaktionsschritte PCR

Temperatur Zeit Wiederholung

95°C 2 Minuten

95°C 30 Sekunden

60°C 40 Sekunden

72°C 40 Sekunden

40 x

72°C 5 Minuten

10°C Aufbewahrung

Zusätzlich wurde, entsprechend jedem PCR-Ansatz, als letzte Probe ein PCR-Gefäß

ohne DNA sowie eine Positiv- und Negativkontrolle mitgeführt. Grundsätzlich erfolgte

die Untersuchung in vierfach-Bestimmung.

3.10.5 Konzentrationsbestimmung des PCR-Produktes

Um die entstandene Menge der amplifizierten DNA zu verifizieren, wurde eine

Konzentrationsbestimmung mittels spektrophotometrischer Bestimmung mit dem

Gerät NanoDrop durchgeführt. Bei diesem Verfahren wird unverdünntes PCR-

Produkt auf die Messfläche pipettiert. Durch die Oberflächenspannung der

Flüssigkeit entsteht eine Flüssigkeitssäule zwischen den optischen Fasern des

Gerätes. Dies ermöglicht eine Bestimmung der Konzentration und durch die

Beurteilung des Kurvenverlaufs eine Feststellung der Qualität des PCR-Produktes.

3.10.6 Kapillargelelektrophorese

Im Anschluss wurde mittels einer Kapillargelelektrophorese das PCR-Produkt

hinsichtlich der Menge und Größe des spezifischen Amplifikats untersucht. Die

Lösung des PCR-Produktes wird in Abhängigkeit der Größe der vorliegenden DNA-

30

Fragmente und der Stärke des angelegten elektrischen Feldes in einer Gel-gefüllten

Kapillare aufgetrennt. Die Intensität der Farbsignale korreliert dabei mit der DNA-

Menge entsprechender Länge. Daraus resultiert ein entsprechendes Bandenbild.

Es wurden 10,1 µl des PCR-Produktes in vorgefertigte Probengefäße pipettiert und

mit dem QIAxcel-Analysegerät eine Auftrennung der DNA mit dem QIAxcel DNA

High Resolution Kit durchgeführt. Dabei wurde die vorinstallierte Auflösungsmethode

OM500 für DNA-Konzentrationen von 10-100 ng/µl angewandt, da die zu messenden

PCR-Produkte ihre Größe in diesem Auflösungsbereich hatten.

Zeigte sich ein schwaches Bandenbild oder ein unsauber getrenntes DNA-Gemisch

mit Zusatzbanden, so wurde die PCR wiederholt.

Abbildung 3.1:

Links: Schematische Darstellung des Funktionsprinzips des QIAxcel-Systems. Die

DNA-Amplifikate werden in einer Gel-Kapillare unter Anlage eines elektrischen

Feldes nach Größe sortiert. Während sich die Amplifikate zu dem positiv geladenen

Ende der Kapillare bewegen, werden sie mit dem Photomultiplier-Detektor erfasst.

Die Daten werden mit der QIAxcel ScreenGel Software in ein Elektropherogramm

und in ein Gelbild umgewandelt (siehe rechts).

Rechts: Beispielhafte Abbildung eines scharf getrennten Bandenbildes (C03) und

eines unspezifischen Bandenbildes (C04) von zweifelhafter Qualität.

31

3.10.7 Aufreinigung der PCR-Produkte

Ergab die Kapillargelelektrophorese ein zufriedenstellendes Bild folgte eine

Aufreinigung der Amplifikate mittels des QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN). Sie

dient der Reinigung des PCR-Produktes und der Entfernung störender Bestandteile

der PCR (zum Beispiel Primer oder Puffer). Der PCR-Ansatz wird hier über eine im

Kit enthaltene Silikat-Säule eluiert, wobei die DNA in der Säule verbleibt und

Verunreinigungen mit einer Größe von weniger als 40 Basenpaaren (in erster Linie

Oligonukleotide) ausgewaschen werden. Die Bindung der DNA an die Säule erfolgt

pH-abhängig, sodass ein pH-Wert von < 7,5 gewährleistet sein muss. Im Kit ist ein

pH-Indikator enthalten, sodass nach Bedarf eine Korrektur des pH-Wertes

vorgenommen werden kann.

Zur Aufreinigung wurde das PCR-Produkt mit Puffer versetzt, gegebenenfalls der pH-

Wert mittels der Zugabe von 10µl 3M Natriumacetat (pH5,0) ausgeglichen, die

Flüssigkeit über die im Kit enthaltene Säule gegeben und eine Zentrifugation über

30-60 Sekunden durchgeführt. Der Überstand wurde verworfen. Daran schlossen

sich mehrere Zugaben von Waschpuffer mit Zentrifugationen an. Am Ende wurde

die Säule in ein 1,5 ml Mikrozentrifugengefäß platziert und durch Pufferzugabe mit

anschließender Zentrifugation die aufgereinigte DNA von der Säule gelöst.

3.10.8 Sanger-Sequenzierung

Das gemäß des in 3.10.7 genau beschriebenen Verfahrens aufgereinigte PCR-

Produkt wurde zusammen mit den Sense- und Antisense-Primern zur Sanger-

Sequenzierung an die Firma GATC (GATC Biotech AG, European Custom

Sequencing Center, Gottfried-Hagen-Straße 20, D-51105 Köln) versandt.

Die Sanger-Sequenzierung erfolgt nach folgendem Prinzip:

Es wird zunächst an dem aufgereinigtem Amplifikat eine Sequenzierungs-PCR unter

Verwendung der Sense- oder Antisense-Primer und spezieller Nukleotide

durchgeführt. Die Nukleotide sind teilweise mit unterschiedlichen Farbmarkierungen

versehen und binden an den DNA-Einzelstrang, wodurch ein Kettenabbruch

verursacht wird. Somit entstehen viele verschiedene, unterschiedlich lange,

unterschiedlich farbmarkierte Einzelstränge. Diese werden in einer hochauflösenden

Kapillargelelektrophorese nacheinander erfasst und dabei die Farbmarkierungen

32

detektiert. Die Farbmarkierungen sind spezifisch für die Nukleotide Adenin, Cytosin,

Guanin und Thymin. So folgt eine nach Längen der Einzelstrangfragmente

angeordnete Reihenfolge der Farbmarkierungen, die der Nukleotid-Reihenfolge des

zu untersuchenden Einzelstrangs entspricht. Durch Messung der Intensität des

Lichtsignals wird das Ergebnis in einem sogenannten Elektropherogramm abgebildet.

Die Sequenzierung wird in zwei Schritten jeweils für den „Vorwärts-Strang“ (Sense)

und den „Rückwärts-Strang“ (Antisense) durchgeführt und es folgen zwei

komplementäre Elektropherogramme.

3.10.9 Sequenzauswertung

War die Sequenzierung durch die Firma GATC beendet, so wurden die

Elektropherogramme auf einem Server zur Verfügung gestellt und konnten unter

„http://www.gatc-biotech.com/en/index.html“ abgerufen werden. Im Rahmen der

Auswertung wurden die Elektropherogramme mit Hilfe der freien Software „FinchTV“

(Geospiza, Version 1.4.0, 2004-2006) visualisiert und mit den publizierten

Sequenzen des jeweiligen Genabschnitts verglichen („Nucleotid Blast“ (Altschul et al.

1990) der National Library of Medicine).

Grundsätzlich werden folgende Typen von Mutationen unterschieden:

Punktmutationen:

Austausch einer einzelnen Base im Leseraster gegen eine andere. Es kann zu einer

Veränderung der kodierten Aminosäure kommen. In einem anderen Teil der Fälle

verläuft die Mutation „stumm“, da dieselbe Aminosäure kodiert wird.

Duplikationen:

Verdopplung eines Genabschnitts beziehungsweise mehrerer Nukleotide. Ist die

Menge der fehlenden Basen nicht durch drei teilbar, resultiert daraus eine

Verschiebung des Leserasters.

Deletionen:

Verlust mehrerer Basen einer Nukleotidsequenz und damit verbunden Kodierung

einer fehlerhaften Proteinsequenz. Ist die Menge der fehlenden Basen nicht durch

drei teilbar, resultiert daraus eine Verschiebung des Leserasters.

33

Insertionen:

Einbau zusätzlicher Nukleotide in den DNA-Strang. Solitäre Insertionen führen häufig

zu einer Verschiebung des Leserasters. Oft sind Insertionen in Vergesellschaftung

mit Deletionen zu finden.

Komplexe Mutationen:

Kombination unterschiedlicher Mutationstypen miteinander.

Zusätzlich zum elektronischen Verfahren folgte eine händische Auswertung der

Sequenzen mit Hilfe der Software „FinchTV“, um bei hohem Normalgewebegehalt

oder bei Tumormosaik keine Punktmutationen zu übersehen. Zeigte sich in den

Betrachtungs- und Vergleichsprogrammen eine Abweichung der vorgegebenen

Reihenfolge, so wurde manuell eine erneute Überprüfung mit einem Vergleich der

Basenreihenfolge durchgeführt. Die festgestellte Mutation wurde gemäß des

Standards der „Human Genome Variation Society“ (www.hgvs.org) auf DNA- und auf

Proteinebene beschrieben.

34

4. Ergebnisse

Die immunhistochemischen Färbungen wurden nach der Färbeintensität in „stark

positiv“, „schwach positiv“ und „negativ“ unterteilt. Abbildung 4.1 zeigt eine

beispielhafte Darstellung der Färbeintensitäten in der immunhistochemischen

Untersuchung für CD34, CD117 und DOG-1.

Abbildung 4.1: Darstellung der immunhistochemischen Auswertung, jeweils in

200facher Vergrößerung

Oben: CD34, stark positiv (links), schwach positiv (Mitte), negativ (rechts)

Mitte: CD117, stark positiv (links), schwach positiv (Mitte), negativ (rechts)

Unten: DOG-1, stark positiv (links), schwach positiv (Mitte), negativ (rechts)

35

Beispielhafte Darstellung eines Kapillargelelektrophorese-Bildes, in dem aufgrund

der verkürzte Laufstrecke des Amplifikates im Vergleich zum Wildtyp bereits eine

Deletion angenommen werden kann. In der Sanger-Sequenzierung ergab sich in

diesem Fall eine Deletion von 48 Basenpaaren (Abbildung 4.2). In Abbildung 4.3 ist

eine Darstellung eines Elektropherogramms einer Punktmutation im

Betrachtungsprogramm „FinchTV“ demonstriert.

Abbildung 4.2:

Kapillargelelektrophoresebild

(KW(3)) der Amplifikation des

Exon 11 von KIT

Links: Wildtyp mit normaler

Länge des Amplifikats

Mitte: Magen

Rechts: Leberhilus

Mitte und rechts mit ver-

kürztem Amplifikat bei Nach-

weis einer Deletion von 48

Basenpaaren in der Sanger-

Sequenzierung

Abbildung 4.3:

Elektropherogramm Exon 9

von KIT (KW(3)) mit Nach-

weis einer Punktmutation

(Darstellung im Betrach-

tungsprogramm „FinchTV“,

Pfeil markiert die Punkt-

mutation

36

Aufgrund der unter Abschnitt 3.1 durchgeführten Patientenselektion wurden folgende

Ergebnisse, auf die Untergruppen der Patienten bezogen, erhoben:

4.1 Patienten mit Lokalrezidiv eines GIST

Die in Abschnitt 3.1.1 vorbeschriebenen GIST zeigten folgende Charakterisierung

hinsichtlich der Lokalisation, Größe und des zeitlichen Verlaufs. Zwei der Patienten

waren nicht vorbehandelt gewesen, ein Patient (GS(1)) hatte in der Zeit zwischen der

Operation des Primärtumors und der Diagnose des Rezidivs eine adjuvante Therapie

mit Imatinib erhalten.

Tabelle 4.1 – Zeitlicher Verlauf zwischen Primärtumor und Rezidiv

Patient Tumor Lokalisation Tumorgröße Jahr

BA(1) Primärtumor Oesophagus 6,4 cm 2004

Rezidiv Mediastinum 4,5 cm 2009

PP(1) Primärtumor Duodenum 6,5 cm 2007

Rezidiv Periduodenal 10,5 cm 2009

GS(1) Primärtumor Magen 23,0 cm 2007

Rezidiv 1 Treitzsches Band 4,0 cm 2012

Rezidiv 2 Kolon / linker Oberbauch 12,5 cm 2012

Spalte 1 mit Identifikationskürzel der Patienten und der Gruppenzugehörigkeit nach

Abschnitt 3.1.1 in Klammern.

4.1.1 Risiko der Krankheitsprogression und TNM-Klassifikation

Die unter Tabelle 4.2 beschriebenen Risikoprofile mit TNM-Klassifikation waren für

die Primärtumoren der Patienten mit einem Rezidiv eines GIST zu erheben.

Tabelle 4.2 – Risiko der Krankheitsprogression der Primärtumoren und TNM-

Klassifikation

Patient Lokalisation Tumorgröße Mitosen Fletcher Miettinen

BA(1) Oesophagus 6,4 cm 1 / 50 HPF intermediär - (*)

TNM: pT3 pNX M0, UICC-Stadium II

37


PP(1) Duodenum 6,5 cm 0 / 50 HPF intermediär hoch

TNM: pT3 pNX M0, UICC-Stadium II

GS(1) Magen 23,0 cm 6 / 50 HPF hoch hoch

TNM: pT4 pNX M0, UICC-Stadium IIIB

(*) Eine Klassifikation nach Miettinen ist nicht möglich, da diese Tumorlokalisation in

der Klassifikation nach Miettinen nicht mit einbezogen wird.



4.1.2 Immunhistochemie

Die in Tabelle 4.3 erfassten immunhistochemischen Ergebnisse charakterisierten die

Gruppe der rezidivierten GIST: sämtliche Tumoren zeigen einen klassischen

immunhistologischen Phänotyp, der sich auch im Rezidiv nicht veränderte.

Tabelle 4.3 – Immunhistochemische Ergebnisse der rezidivierten GIST

Patient Tumor CD34 CD117 DOG-1 αSMAC S100

BA(1) Primärtumor schwach positiv positiv negativ negativ

Rezidiv positiv positiv positiv negativ negativ

PP(1) Primärtumor schwach positiv positiv negativ negativ

Rezidiv schwach positiv positiv negativ negativ

GS(1) Primärtumor positiv positiv positiv negativ negativ

Rezidiv 1 positiv positiv positiv negativ negativ

Rezidiv 2 positiv positiv positiv negativ negativ



4.1.3 Mutationsanalyse

Bei den mit in dem Patientenkollektiv erfassten Patienten mit histomorphologisch und

immunhistochemisch gesichertem, rezidivierten GIST war eine Mutation in Exon 11

38

von KIT nachweisbar, wobei bei einem Patienten eine zusätzliche stumme Mutation

in Exon 18 von PDGFRA vorlag. In Exon 9 von KIT war in keinem der Fälle eine

Mutation nachweisbar. Das nachweisbare Mutationsmuster der Tumoren blieb auch

im Rezidiv stabil. Genauere Informationen sind der Tabelle 4.4 zu entnehmen.

Tabelle 4.4 – Mutationen der rezidivierten GIST

Patient Tumor Exon 11 -

DNA

Exon 11 -

Protein

Exon 18 -

DNA

Exon 18 -

Protein

BA(1) Primärtumor c.1663_1668del6 p.V55_Q556del c.2803C>T Wildtyp

Rezidiv c.1663_1668del6 p.V55_Q556del c.2803C>T Wildtyp

PP(1) Primärtumor c.(1650_1652del3;

1656_1667del12)

p.K550_Q556

delinsNM Wildtyp Wildtyp

Rezidiv c.(1650_1652del3;

1656_1667del12)

p.K550_Q556

delinsNM Wildtyp Wildtyp

GS(1) Primärtumor c.1655_1714del60p.M552_D572

delinsN Wildtyp Wildtyp

Rezidiv 1 c.1655_1714del60p.M552_D572


Rezidiv 2 c.1655_1714del60p.M552_D572




4.2 Patienten mit synchron aufgetretenen GIST

In diese Gruppe fielen Tumorproben von drei Patienten. Die Verteilung der

Lokalisationen und die Größenangabe ist der folgenden Tabelle 4.5 zu entnehmen.

Hierbei fällt eine überwiegende Lokalisation der Tumoren im Magenkorpus auf.

Tabelle 4.5 – Lokalisation und Größe der synchron aufgetretenen GIST

Patient Tumor Lokalisation Größe

RA(2) Tumor 1 Magen, kleine Kurvatur, oberer Corpus 2,5 cm

39


RA(2) Tumor 2 Magen, Corpus 0,7 cm

SA(2) Tumor 1 Magen, Corpus 0,4 cm

Tumor 2 Magen, Corpus < 0,4 cm

Tumor 3 Magen, Corpus < 0,4 cm


WS(2) Tumor 1 Dünndarm, Ileum 4,5 cm

Tumor 2 Kolon 2,2 cm




Folgende, in Tabelle 4.6 beschriebenen Risikoprofile und TNM-Klassifikationen

waren für die Patientengruppe der synchron auftretenden GIST zu erheben.

Tabelle 4.6 – Risiko der Krankheitsprogression


RA(2) Magen 2,5 cm 1 gering sehr gering

TNM: pT2 pNX M0, UICC-Stadium IA

Magen 0,7 cm 0 sehr gering kein


SA(2) Magen 0,4 cm 0 sehr gering kein


Magen < 0,4 cm 0 sehr gering kein


Magen < 0,4 cm 0 sehr gering kein


WS(2) Ileum 4,5 cm 2 gering moderat

TNM: pT2 pNX M0, UICC-Stadium I

Kolon 2,2 cm 1 gering - (*)

TNM: pT2 pNX M0, UICC-Stadium I

40






Die immunhistochemische Untersuchung ergab folgende, in Tabelle 4.7

beschriebenen, Ergebnisse. Auch in dieser Gruppe ergab sich für alle Tumoren ein

klassischer immunhistochemischer Phänotyp.

Tabelle 4.7 – Immunhistochemische Ergebnisse der synchron aufgetretenen GIST


RA(2) Tumor 1 positiv positiv positiv negativ negativ

Tumor 2 positiv positiv positiv negativ negativ

SA(2) Tumor 1 positiv positiv positiv negativ negativ

Tumor 2 positiv schwach positiv negativ negativ

Tumor 3 positiv schwach positiv negativ negativ

WS(2) Tumor 1 positiv positiv schwach negativ negativ

Tumor 2 positiv positiv schwach negativ negativ




In den in dieser Gruppe untersuchten Tumorproben zeigten sich in allen Fällen

Mutationen im Exon 11 von KIT. Bei einem Patienten (RA(2)) lagen allerdings

Mutationen in unterschiedlicher genomischer Lokalisation vor. Auch bei dem

Patienten SA(2) waren die Mutationen nicht in allen Tumoren identisch (siehe Tabelle

4.8).

41

Tabelle 4.8 – Ergebnisse der Mutationsanalyse der synchron aufgetretenen GIST

Patient Tumor Exon 11 - DNA Exon 11 - Protein

RA(2) Tumor 1 c.1735_1740del6 p.D579_H580del

Tumor 2 c.1720_1740dup21 p.T574_H581dup

SA(2) Tumor 1 Wildtyp Wildtyp

Tumor 2 c.1679_1681del3 p.560delinsE

Tumor 3 c.1679_1681del3 p.560delinsE

WS(2) Tumor 1 c.1674_1718del45 p.K558_P573del

Tumor 2 c.1674_1718del45 p.K558_P573del



4.3 Patienten mit metastasiertem GIST

Das Untersuchungsgut in dieser Untergruppe umfasste neun Patienten. Bei einem

Patienten (HW(3)) war eine Therapie mit Imatinib durchgeführt worden, bei einem

weiteren Patienten (DV(3)) war nach einem Nicht-Ansprechen auf die Therapie mit

Imatinib nach einem Jahr die Therapie auf Sunitinib umgestellt worden. Zusätzlich

war bei Patient KE(3) lediglich Gewebe der Metastasen zu untersuchen, wobei das

Ergebnis der Untersuchung des Primärtumors unbekannt war. Es waren Tumoren

und Metastasen folgender Lokalisationen und Größe untersucht worden (siehe

Tabelle 4.9).

Tabelle 4.9 – Lokalisation und Größe der metastasierten GIST


KE(3) Metastase 1 Oberbauch / Omentum majus 10,0 cm

Metastase 2 Omentum majus 0,5 cm

RA(3) Primärtumor Dünndarm 19,5 cm

Metastase Leber 1,5 cm

DV(3) Primärtumor Jejunum 5,0 cm

Metastase 1 Mesenterium 1,0 cm


42


HH(3) Primärtumor Magen 15,0 cm

Metastase Omentum majus 5,2 cm

HG(3) Primärtumor Magen 7,0 cm

Metastase Leber 1,3 cm

GR(3) Primärtumor Colon transversum 12,0 cm


Metastase 2 Leber Segment V – VII 3,5 cm

HW(3) Primärtumor Colon 3,5 cm

Metastase 1 Leber Segment VI / VII 3,5 cm



Metastase 4 Omentum majus Mittelbauch 4,0 cm

Metastase 5 Omentum majus linker Oberbauch 4,5 cm

TA(3) Primärtumor Magenhinterwand Corpus und Fundus 17,0 cm

Metastase 1 Peritoneum Sigma / Rektum / Harnblase 16,0 cm

Metastase 2 Leber und Leberhilus 8,0 cm

Metastase 3 Intraabdominaler Tumor, Gewicht 5,5 kg fragmentiert

Metastase 4 Ureter 0,4 cm

Metastase 5 Funiculus spermaticus 3,0 cm

Metastase 6 Milz 8,0 cm

Metastase 7 abdominales Zwerchfell 8,0 cm

KW(3) Primärtumor Magenhinterwand prox. Corpus 3,5 cm

Metastase 1 Omentum majus 1,2 cm

Metastase 2 Papilla duodeni major 1,3 cm

Metastase 3 Leber 10,0 cm

Metastase 4 Niere rechts 0,7 cm

Metastase 5 Lunge rechter Oberlappen 0,5 cm

Metastase 6 Lunge rechter Mittel- und Unterlappen 0,5 cm

Metastase 7 Pericard (per continuitatem linke Lunge) 1,0 cm

Metastase 8 Herzmuskulatur 1,0 cm

Metastase 9 Zunge 0,8 cm

Metastase 10 Wirbelkörper 0,8 cm

43




Für die Primärtumoren der Patienten dieser Gruppe lagen unten genannte

Risikoprofile nach Fletcher und Miettinen vor (siehe Tabelle 4.10).



RA(3) Dünndarm 19,5 cm 18 / 50 HPF hoch hoch

DV(3) Jejunum 5,0 cm 8 / 50 HPF intermediär hoch

HH(3) Magen 15,0 cm 43 / 50 HPF hoch hoch

HG(3) Magen 7,0 cm 10 / 50 HPF hoch hoch

GR(3) Colon 12,0 cm 15 / 50 HPF hoch - (*)

HW(3) Colon 3,5 cm 3 / 50 HPF gering - (*)

TA(3) Magen 17,0 cm 8 / 50 HPF hoch hoch

KW(3) Magen 3,5 cm 4 / 50 HPF intermediär sehr gering





Des Weiteren waren folgende, in Tabelle 4.11 beschriebene, TNM-Klassifikationen

für die oben genannten Patienten zu erheben. Für den Patienten KE(3) ist eine

vollständige TNM-Klassifikation nicht möglich, da sich bei klinisch nicht

angegebenem Primärtumor lediglich Netzmetastasen im Untersuchungsgut fanden.

Tabelle 4.11 – TNM-Klassifikationen

Patient TNM-Klassifikation UICC

RA(3) pT4 pN0 pM1 (HEP) IV

DV(3) pT2 pN0 pM1 (PER) IV

44


HH(3) pT4 pN0 pM1 (PER) IV

HG(3) pT3 pN0 pM1 (HEP) IV

GR(3) pT4 pN0 pM1 (HEP, PER) IV

HW(3) pT2 pN0 pM1 (HEP, PER) IV

TA(3) pT4 pN0 pM1 (HEP, PER, OTH) IV

KW(3) pT2 pN0 pM1 (PUL, HEP, MAR, PER, OTH) IV




Im Rahmen der weiteren Aufarbeitungen der Primärtumoren und Metastasen waren

folgende immunhistochemische Ergebnisse zu erheben (siehe Tabelle 4.12). Der

überwiegende Teil der Primärtumoren zeigte ein gleichartiges

immunhistochemisches Profil wie die Metastasen. Lediglich in einem Fall (KW(3))

waren große Abweichungen mit einer fehlenden Immunreaktivität der Metastasen für

CD117 im Vergleich zu einer starken Positivität des Primärtumors zu sehen.

Tabelle 4.12 – Immunhistochemische Ergebnisse der metastasierten GIST


KE(3) Metastase 1 positiv negativ schwach negativ negativ

Metastase 2 positiv negativ schwach negativ negativ

RA(3) Primärtumor schwach positiv positiv negativ negativ

Metastase schwach positiv positiv negativ negativ

DV(3) Primärtumor positiv positiv positiv negativ negativ

Metastase 1 positiv positiv positiv negativ negativ


HH(3) Primärtumor negativ positiv positiv negativ negativ

Metastase negativ positiv positiv negativ negativ

HG(3) Primärtumor positiv positiv positiv negativ negativ

Metastase positiv positiv positiv negativ negativ

45


GR(3) Primärtumor positiv positiv positiv negativ negativ


Metastase 2 positiv positiv positiv positiv negativ

HW(3) Primärtumor negativ positiv positiv negativ negativ

Metastase 1 schwach positiv positiv negativ negativ





TA(3) Primärtumor positiv positiv positiv negativ negativ



Metastase 3 schwach positiv positiv schwach negativ





KW(3) Primärtumor positiv schwach schwach schwach schwach

Metastase 1 positiv negativ negativ negativ negativ


Metastase 3 positiv schwach negativ negativ schwach










46


In dieser Gruppe zeigten acht Patienten eine gleichartige Mutation im Primärtumor

und den Metastasen. Dabei waren die Mutationen überwiegend im Exon 11 von KIT

lokalisiert. Einzelne Mutationen waren im Exon 9 von KIT nachweisbar. Bei einem

Patienten (TA(3), siehe Tabelle 4.20) war in mehreren Metastasen zu einer Mutation

in Exon 11 von KIT noch eine zusätzliche Mutation in Exon 9 von KIT zu finden. Bei

zwei Lokalisationen von Tumorabsiedlungen dieses Patienten war für die

Bestimmung von Exon 9 von KIT in mehrfachen Versuchen keine aussagekräftige

DNA zu amplifizieren.

Im Tumorgewebe eines Patienten (KE(3), siehe Tabelle 4.13) fand sich bezüglich der

untersuchten Läsionen keine Mutation. Bei einem Patienten (KW(3), siehe Tabelle

4.21 und 4.22) war ein GIST des Magens mit einer Mutation in Exon 11 von KIT und

einer stummen Punktmutation in Exon 18 von PDGFRA zu sichern. Die zusätzlich

untersuchten Metastasen zeigten überwiegend eine Wildtyp-Sequenz. Lediglich eine

Metastase des Wirbelkörpers hat zwei Punktmutationen in Exon 9 von KIT und eine

im Vergleich zum Primärtumor differierende Mutation in Exon 11 von KIT.

Tabelle 4.13 – Patient KE(3), Wildtyp

Lokalisation Mutation

Metastase 1 Wildtyp Exon 9, 11, 13, 17, 18

Metastase 2 Wildtyp Exon 9, 11, 13, 17, 18

Tabelle 4.14 – Patient RA(3), Mutation in Exon 9 von KIT

Lokalisation Exon 9 - DNA Exon 9 - Protein

Primärtumor c.1504_1509dup6 p.A502_Y503dup

Metastase c.1504_1509dup6 p.A502_Y503dup

Tabelle 4.15 – Patient DV(3), Mutation Exon 9 von KIT


Primärtumor c.1504_1539dup36 p.A502_K513dup

Metastase 1 c.1504_1539dup36 p.A502_K513dup

Metastase 2 c.1504_1539dup36 p.A502_K513dup

47

Tabelle 4.16 – Patient HH(3), Mutation in Exon 11 von KIT


Primärtumor c.1669_1718delinsCA p.W557_P573delinsQ

Metastase c.1669_1718delinsCA p.W557_P573delinsQ

Tabelle 4.17 – Patient HG(3), Mutation in Exon 11 von KIT


Primärtumor c.1671_1676del6 p.W557_V559insC

Metastase c.1671_1676del6 p.W557_V559insC

Tabelle 4.18 – Patient GR(3), Mutation Exon 11 von KIT


Primärtumor c.1709_1735dup27 p.I571_D579dup

Metastase 1 c.1709_1735dup27 p.I571_D579dup

Metastase 2 c.1709_1735dup27 p.I571_D579dup

Tabelle 4.19 – Patient HW(3), Mutation Exon 11 von KIT


Primärtumor c.1678_1680del3 p.V560del

Metastase 1 c.1678_1680del3 p.V560del





Tabelle 4.20 – Patient TA(3), Mutation Exon 9 und Exon 11 von KIT

Lokalisation Exon 9 DNA Exon 9 Prot. Exon 11 - DNA Exon 11 – Prot.

Primärtumor Wildtyp Wildtyp c.166_1713del48 p.Q556_I571del

Metastase 1 Wildtyp Wildtyp c.166_1713del48 p.Q556_I571del



Metastase 4 - - c.166_1713del48 p.Q556_I571del

Metastase 5 - - c.166_1713del48 p.Q556_I571del

48

Lokalisation Exon 9 DNA Exon 9 Prot. Exon 11 - DNA Exon 11 – Prot.

Metastase 6 c.1505C>T p.A502V c.166_1713del48 p.Q556_I571del

Metastase 7 c.1505C>T p.A502V c.166_1713del48 p.Q556_I571del

Tabelle 4.21 – Patient KW(3), Mutation des Primärtumors in Exon 11 von KIT und 18

von PDGFRA

Lokalisation Exon 11 - DNA Exon 11 - Protein Exon 18 -

DNA

Exon 18 -

Protein

Primärtumor c.1652_1660del9 p.551_554delinsQ c.2529C>T Wildtyp

Tabelle 4.22 – Patient KW(3), Mutationen der Metastasen in Exon 9 und 11 von KIT

Lokalisation Exon 9 - DNA Exon 9 –Prot. Exon 11 - DNA Exon 11 - Prot.

Metastase 1 Wildtyp Wildtyp Wildtyp Wildtyp









Metastase 10 c.1427G>A p.S476N

c.1444G>A p.A482T c.1678_1680del3 p.V560del

4.4 Patienten mit unklaren spindelzelligen Tumoren

In dieser Gruppe wurde Gewebe von 28 Patienten untersucht. Alle Patienten zeigten

ein uneinheitliches histomorphologisches und immunhistochemisches Bild, das nicht

eindeutig einem GIST zuzuordnen war. Die Lokalisationen der Tumoren sind in

Tabelle 4.23 dargestellt.

49

Tabelle 4.23 – Lokalisation und Größe der unklaren spindelzelligen Tumoren

Patient Lokalisation Tumorgröße

LI(4) Ileum 0,8 cm

MJ(4) Magen 14,5 cm

SG2(4) Magen 0,6 cm

SK(4) Jejunum 1,2 cm

GW(4) Ileum 2,0 cm

KW1(4) Magencorpus 3,0 cm

LU(4) Magenfundus 4,5 cm

MH(4) Magencorpus 2,5 cm

GG(4) Magen, große Kurvatur 7,5 cm

LS(4) Magen, kleine Kurvatur 3,0 cm

KW2(4) Magen, Cardia 5,5 cm

KI(4) Magenfundus 0,4 cm

ME(4) Übergang Jejunum - Ileum 6,5 cm

HB(4) Duodenum Übergang Pankreasschwanz 12,0 cm

RKH(4) Magen, kleine Kurvatur 5,0 cm

AU(4) Magencorpus 15,5 cm

FG(4) Magen 4,5 cm

RH(4) Magen, kleine Kurvatur 0,9 cm

SE(4) Magencorpus 5,5 cm

SG1(4) Magencorpus 6,0 cm

MG(4) Magen, Übergang Corpus - Fundus 4,0 cm

EK(4) Magen Stanzbiopsie 1,6 cm

VM(4) Distaler Oesphagus 4,8 cm

DA(4) Magenantrum 6,0 cm

EJ(4) Angulus Biopsien 0,2 cm

SI(4) Magenvorderwand 0,4 cm

HM(4) Magenfundus 0,1 cm

KG(4) Magenantrum 2,0 cm



50


In der unten aufgeführten Tabelle werden die unterschiedlichen Risikoprofile

hinsichtlich der Krankheitsprogression der spindelzelligen Tumoren aufgeführt (siehe

Tabelle 4.24).



LI(4) Ileum 0,8 cm 2 / 50 HPF kein kein

MJ(4) Magen 14,5 cm 12 / 50 HPF hoch hoch

SG2(4) Magen 0,6 cm 2 / 50 HPF sehr niedrig kein

SK(4) Jejunum 1,2 cm 1 / 50 HPF sehr niedrig kein

GW(4) Ileum 2,0 cm 1 / 50 HPF gering kein

KW1(4) Magen 3,0 cm 4 / 50 HPF gering sehr gering

LU(4) Magen 4,5 cm 4 / 50 HPF gering sehr gering

MH(4) Magen 2,5 cm 3 / 50 HPF gering sehr gering

GG(4) Magen 7,5 cm 3 / 50 HPF intermediär gering

LS(4) Magen 3,0 cm 1 / 50 HPF gering sehr gering

KW2(4) Magen 5,5 cm 4 / 50 HPF intermediär gering

KI(4) Magen 0,4 cm 3 / 50 HPF sehr niedrig kein

ME(4) Jejunum / Ileum 6,5 cm 3 / 50 HPF intermediär moderat

HB(4) Duodenum 12,0 cm 3 / 50 HPF hoch hoch

RKH(4) Magen 5,0 cm 3 / 50 HPF gering sehr gering

AU(4) Magen 15,5 cm 3 / 50 HPF hoch moderat

FG(4) Magen 4,5 cm 2 / 50 HPF gering sehr gering

RH(4) Magen 0,9 cm 3 / 50 HPF sehr niedrig kein

SE(4) Magen 5,5 cm 5 / 50 HPF intermediär gering

SG1(4) Magen 6,0 cm 2 / 50 HPF intermediär gering

MG(4) Magen 4,0 cm 5 / 50 HPF gering sehr gering

EK(4) Magen min. 1,6 cm 0 / 50 HPF sehr niedrig kein

VM(4) Oesophagus 4,8 cm 0 / 50 HPF gering - (*)

DA(4) Magen 6,0 cm 2 / 50 HPF intermediär gering

EJ(4) Magen min. 0,2 cm 1 / 50 HPF sehr niedrig kein

SI(4) Magen 0,4 cm 2 / 50 HPF sehr niedrig kein

51


HM(4) Magen 0,1 cm 2 / 50 HPF sehr niedrig kein

KG(4) Magen 2,0 cm 2 / 50 HPF gering kein





Zudem ergaben sich folgende, in Tabelle 4.25 beschriebene, TNM-Klassifikationen.

Tabelle 4.25 – TNM-Klassifikationen der spindelzelligen Tumoren

Patient TNM-Klassfikation UICC

LI(4) pT1 pNX M0 I

MJ(4) pT4 pNX M0 IIIB

SG2(4) pT1 pNX M0 IA

SK(4) pT1 pNX M0 I

GW(4) pT1 pNX M0 I

KW1(4) pT2 pNX M0 IA

LU(4) pT2 pNX M0 IA

MH(4) pT2 pNX M0 IA

GG(4) pT3 pNX M0 IB

LS(4) pT2 pNX M0 IA

KW2(4) pT3 pNX M0 IB

KI(4) pT1 pNX M0 IA

ME(4) pT3 pNX M0 II

HB(4) pT4 pNX M0 IIIA

RKH(4) pT2 pNX M0 IA

AU(4) pT4 pNX M0 II

FG(4) pT2 pNX M0 IA

RH(4) pT1 pNX M0 IA

SE(4) pT3 pNX M0 IB

SG1(4) pT3 pNX M0 IB

MG(4) pT2 pNX M0 IA

52


EK(4) pT1 pNX M0 IA

VM(4) pT2 pNX M0 I

DA(4) pT3 pNX M0 IB

EJ(4) pT1 pNX M0 IA

SI(4) pT1 pNX M0 IA

HM(4) pT1 pNX M0 IA

KG(4) pT1 pNX M0 IA




Die Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen der Tumoren dieser

Patientengruppe sind in Tabelle 4.26 zusammengefasst.

Tabelle 4.26 – Immunhistochemische Ergebnisse der spindelzelligen Tumoren

Patient CD34 CD117 DOG-1 αSMAC S100

LI(4) positiv negativ positiv negativ negativ

MJ(4) positiv positiv negativ negativ negativ

SG2(4) positiv positiv positiv negativ schwach

SK(4) schwach positiv positiv negativ negativ

GW(4) schwach positiv schwach negativ negativ

KW1(4) positiv positiv schwach negativ negativ

LU(4) positiv schwach positiv negativ negativ

MH(4) positiv positiv schwach negativ negativ

GG(4) positiv positiv positiv schwach negativ

LS(4) positiv positiv schwach negativ negativ

KW2(4) positiv positiv schwach negativ negativ

KI(4) schwach positiv positiv negativ negativ

ME(4) positiv schwach positiv negativ negativ

HB(4) positiv schwach positiv negativ negativ

53

Patient CD34 CD117 DOG-1 αSMAC S100

RKH(4) positiv schwach positiv negativ negativ

AU(4) schwach schwach schwach negativ negativ

FG(4) positiv positiv positiv negativ schwach

RH(4) positiv positiv schwach negativ negativ

SE(4) positiv positiv positiv schwach negativ

SG1(4) positiv positiv schwach negativ negativ

MG(4) positiv schwach positiv negativ negativ

EK(4) positiv positiv schwach negativ negativ

VM(4) schwach positiv positiv negativ negativ

DA(4) positiv positiv negativ negativ negativ

EJ(4) positiv positiv schwach negativ negativ

SI(4) negativ schwach positiv negativ negativ

HM(4) positiv schwach positiv negativ negativ

KG(4) positiv schwach positiv negativ negativ



Kursiv hervorgehoben sind die Untersuchungsergebnisse, die zur Einordnung als

unklare spindelzellige Tumoren geführt haben.


In der Mutationsanalyse dieser Patientengruppe war bei 14 der 28 Patienten eine

Mutation in Exon 11 von KIT nachweisbar. Daneben war bei vier Patienten eine

Mutation in Exon 18 von PDGFRA zu finden, davon waren zwei Mutationen stumm

und ohne Auswirkung auf Proteinebene. Vier Patienten zeigten eine Mutation in Exon

11 von KIT und eine zusätzliche Mutation in Exon 18 von PDGFRA, wobei alle

Mutationen in Exon 18 stumm und ohne Auswirkung auf die Reihenfolge der

Aminosäuresequenz waren. Bei sechs Patienten war weder in den Bestimmungen

von Exon 9, 11, 13 und 17 von KIT noch in Exon 18 von PDGFRA eine Mutation

nachweisbar. Bei keinem der 28 Fälle fand sich in den Tumoren eine Mutation von

Exon 9 von KIT, daher wurde auf die tabellarische Darstellung verzichtet.

54

Im Folgenden sind die Ergebnisse tabellarisch aufgeführt (siehe Tabelle 4.27).

Tabelle 4.27 – Ergebnisse der Mutationsanalyse der spindelzelligen Tumoren

Patient Exon 11 - DNA Exon 11 - Protein Exon 18 - DNA Exon 18 - Prot.

LI(4) c.1660_1674del15 p.E554_K558del Wildtyp Wildtyp

MJ(4) c.1681T>A p.V561D Wildtyp Wildtyp

SG2(4) c.1678_1680del3 p.V560del Wildtyp Wildtyp

SK(4) c.1728T>C p.L577P Wildtyp Wildtyp

GW(4) c.1661_1675del15 p.E554_K558del Wildtyp Wildtyp

KW1(4) c.1678_1680del3 p.V560del Wildtyp Wildtyp

LU(4) c.1676T>C p.V559A Wildtyp Wildtyp MH(4) c.1669_1674del6 p.W557_K558del Wildtyp Wildtyp GG(4) c.1648_1674del27 p.K550_K558del Wildtyp Wildtyp LS(4) c.1676T>A p.V559D Wildtyp Wildtyp KW2(4) c.1678_1680del3 p.V560del Wildtyp Wildtyp KI(4) c.1674G>T p.K558N Wildtyp Wildtyp

ME(4) c.1698_1724del27 p.N566_Q575

delinsK Wildtyp Wildtyp

HB(4) c.1672_1677del6 p.K558_V558del Wildtyp Wildtyp

RKH(4) Wildtyp Wildtyp c.2526A>T p.D842V

AU(4) Wildtyp Wildtyp c.2528_2539

del12

p.I842_S846

delinsT

FG(4) Wildtyp Wildtyp c.2472C>T Wildtyp

RH(4) Wildtyp Wildtyp c.2472C>T Wildtyp

SE(4) c.1671T>A p.W558R c.2472C>T Wildtyp

SG1(4) c.1680T>G p.V561G c.2472C>T Wildtyp

MG(4) c.1679_1680TT>AG p.V560E c.2472C>T Wildtyp

EK(4) c.1670_1675del6 p.W557_V559

delinsF c.2472C>T Wildtyp

VM(4) Wildtyp Wildtyp Wildtyp Wildtyp

DA(4) Wildtyp Wildtyp Wildtyp Wildtyp

EJ(4) Wildtyp Wildtyp Wildtyp Wildtyp

SI(4) Wildtyp Wildtyp Wildtyp Wildtyp

55

Patient Exon 11 - DNA Exon 11 - Protein Exon 18 - DNA Exon 18 - Prot.

HM(4) Wildtyp Wildtyp Wildtyp Wildtyp

KG(4) Wildtyp Wildtyp Wildtyp Wildtyp



Werden die als Wildtyp getesteten Tumoren mit der immunhistochemischen

Untersuchung korreliert, so ergibt sich folgendes Bild (siehe Tabelle 4.28).

Tabelle 4.28 – Korrelation der Wildtyp-Tumoren mit der Immunhistochemie

Patient Mutation CD34 CD117 DOG-1 αSMAC S100

VM(4) Wildtyp schwach positiv positiv negativ negativ

DA(4) Wildtyp positiv positiv negativ negativ negativ

EJ(4) Wildtyp positiv positiv schwach negativ negativ

SI(4) Wildtyp negativ schwach positiv negativ negativ

HM(4) Wildtyp positiv schwach positiv negativ negativ

KG(4) Wildtyp positiv schwach positiv negativ negativ



56

5. Diskussion

GIST kommen insgesamt selten vor (Prävalenz: 15-20 Fälle pro eine Million).

Dennoch stellen GIST die häufigsten mesenchymalen Tumoren des

Gastrointestinaltrakts dar. Lokalrezidive, synchrone Tumoren und Metastasen sind

selten. Die Häufigkeit des Auftretens von Lokalrezidiven werden von DeMatteo et al.

(2000) mit bis zu 7%, die Häufigkeit der Metastasierung hingegen mit bis zu 47%

angegeben. Aus diesem Grunde war es nicht gelungen, insbesondere bei den

synchronen und rezidivierten Tumoren ein größeres Patientenkollektiv zu aquirieren.

Die erhobenen Daten und die daraus gezogenen Schlüsse sind daher vor dem

Hintergrund einer eingeschränkten Repräsentativität zu betrachten.

5.1 Patienten mit Lokalrezidiv eines GIST

Bei der Betrachtung des zeitlichen Verlaufs der Krankheitsgeschichte der drei

untersuchten Patienten ist festzustellen, dass zwischen der Erstdiagnose mit

Sicherung des Primärtumors und der Diagnose eines Rezidivs ein Zeitraum von 2 - 5

Jahren vergangen ist. Dabei waren alle Patienten leitliniengerecht R0-reseziert

worden. Die kürzeste Zeitspanne von 24 Monaten trat bei einem Patienten auf, der

keine adjuvante Therapie mit Imatinib erhalten hat. Diese Zeitspanne liegt

geringfügig oberhalb des in den Untersuchungen von Al-Batran et al. (2007)

dokumentierten medianen progressionsfreien Überlebens von 18,9 Monaten.

Progressionsfreies Überleben bezeichnet in diesem Zusammenhang die

Tumorfreiheit im Hinblick auf Rezidive und Metastasen. Hinsichtlich des Risikoprofils

der Krankheitsprogression waren nach Fletcher zwei Patienten (BA(1) und PP(1)) mit

intermediärem Risiko, ein Patient (GS(1)) mit einem hohen Risiko einzustufen. Die

Klassifikation nach Miettinen zeigt bei zwei Patienten (PP(1) und GS(1)) ein hohes

Risiko für eine Krankheitsprogression. Bei einem Patienten (BA(1)) war eine

Klassifikation nach Miettinen nicht möglich, da die Klassifikation eine

Tumorlokalisation im Oesophagus aufgrund sehr niedriger Fallzahlen nicht vorsieht.

Lediglich 1-2% der GIST kommen im Oesophagus vor (Miettinen und Lasota 2006).

Betrachtet man zusätzlich zur Einschätzung der Risikoprofile die TNM-Klassifikation

57

der Primärtumoren, so fällt auf, dass alle Tumoren mit einer Kategorie pT3 oder

höher klassifiziert wurden.

Im Rahmen der immunhistochemischen Untersuchungen war eine gleichartige

Anfärbung der Primärtumoren und der Rezidive zu beobachten. Lediglich bei einem

Patienten (BA(1)) war in der Färbung für CD34 ein Unterschied zwischen

Primärtumor („schwach“) und Rezidivtumor („positiv“) zu erheben. Dies wäre über

eine Schwankung der chromogenen Anfärbung im Zuge der immunhistochemischen

Aufarbeitung zu erklären. Es ist bezüglich der Immunhistochemie davon auszugehen,

dass sich ein bereits bekanntes Färbemuster des Primärtumors in der

Immunhistochemie des Lokalrezidivs wiederfindet bzw. dass das Lokalrezidiv die

Merkmale eines GIST erkennen lässt.

Das Tumorgewebe der drei untersuchten Patienten mit einem Lokalrezidiv eines

GIST hat bei Untersuchung der Primärtumoren im Vergleich zu den Rezidiven keine

Änderung des Mutationsstatus erbracht. Alle bereits im Primärtumor bestimmten

Mutationen waren auch in den Rezidivtumoren nachzuvollziehen. Dabei war auch

Gewebe eines Patienten (GS(1)) untersucht worden, der nach Operation des

Primärtumors eine adjuvante Therapie mit Imatinib erhalten hatte. Eine Imatinib-

Resistenz wird häufig durch sekundäre Mutationen, in Kombination mit der Theorie

der Selektion eines resistenten Tumorklons, ausgelöst (Tamborini et al. 2004,

Wardelmann et al. 2005). Die zwei untersuchten Lokalrezidive haben keine

sekundäre Mutation ergeben, wobei zu bedenken ist, dass der Großteil der

Sekundärmutationen in Exon 17 von KIT neben Mutationen von Exon 13 und Exon

14 von KIT nachweisbar sind (Al-Batran et al. 2007). Im Rahmen dieser Studie

wurden keine Untersuchungen von Exon 14 von KIT durchgeführt, sodass ein kleiner

Teil gegebenenfalls vorliegender Sekundärmutationen möglicherweise unentdeckt

blieb.

Zusammenfassend zeigt sich die Mutationsanalyse als bewährtes Mittel, um zu

beweisen, ob es sich um ein Tumorrezidiv (mit bekannter Mutation) oder um einen

neu aufgetretenen GIST handelt. Alle bereits bekannten Mutationen des

Primärtumors waren auch in den Rezidivtumoren nachweisbar, ohne dass sich

zusätzliche Mutationen gezeigt hätten. Das bedeutet, dass sich die Rezidivtumoren

58

hinsichtlich der Histomorphologie, ihres Immunphänotyps und ihres Genotyps stabil

zeigen. Aus den zeitlichen Verläufen lässt sich weiterhin schließen, dass trotz

leitliniengerechter Operation mit R0-Resektion Lokalrezidive auch nach längeren

Zeiträumen vorkommen können und somit eine entsprechende

Nachbeobachtungszeit mit Kontrolle des Lokalbefundes bei Patienten mit erhöhtem

Risikoprofil im klinischen Alltag verankert sein sollten.

5.2 Patienten mit synchronen GIST

Die in dieser Arbeit untersuchten Tumorproben der drei Patienten stammten bei zwei

Patienten aus dem Magen, ein Patient (WS(2)) zeigte einen Tumor im Dünndarm

sowie einen Tumor im Kolon. Passend zu diesen publizierten Daten bei Corless et al

(2004) wird die Häufigkeit eines GIST im Magen mit 60% angegeben. Zusätzlich wird

dort eine Tumorlokalisation im Dünndarm mit einer Häufigkeit von 25% angegeben,

ein GIST des Kolons hat eine Häufigkeit von weniger als 5%.

Grundsätzlich muss bei der Untersuchung von synchronen GIST die Frage gestellt

werden, ob es sich um tatsächliche synchrone Tumoren mit unabhängiger

Entstehung voneinander oder um Metastasen handelt. Dabei kann ein GIST den

Primärtumor und der weitere vermeintlich synchrone GIST die Metastase darstellen.

Des Weiteren ist es auch möglich, dass beide vermeintlich synchrone GIST als

Metastasen eines andernorts lokalisierten, bisher nicht entdeckten GIST auftreten.

Ein bisher unentdeckter GIST mit Metastasen wäre in den klinisch präoperativ

durchgeführten radiologischen Untersuchungen zu sichern.

In der Abschätzung des Risikos der Krankheitsprogression zeigen sich die beiden

Tumoren des Patienten RA(2) mit sehr geringem bzw. geringem Risiko nach Fletcher

und in der Klassifikation nach Miettinen mit keinem bzw. sehr geringem Risiko. Die

synchron aufgetretenen drei Tumoren des Patienten SA(2) zeigen sich alle mit einem

sehr geringen Risiko in der Klassifikation nach Fletcher und in der Klassifikation nach

Miettinen ohne Risiko der Krankheitsprogression. Bezüglich des Patienten WS(2) war

in der Klassifikation nach Fletcher für beide Tumoren ein geringes Risiko zu erheben.

Aufgrund der Tumorgröße und Lokalisation ergibt sich in der Klassifikation nach

Miettinen für den Tumor im Ileum ein moderates Risiko, für den Tumor im Kolon war

59

aufgrund der Lokalisation keine Einstufung in der Klassifikation nach Miettinen

möglich, da diese Tumorlokalisation nicht mit einbezogen wird. Die TNM-

Klassifikation der Tumoren war bei den Tumoren des Patienten RA(2) mit pT2

(Tumor 1) beziehungsweise pT1 (Tumor 2) anzugeben. Die drei Tumoren des

Patienten SA(2) waren alle dem Stadium pT1 zuzuordnen. Bei den beiden, zum Teil

nicht in der Risikoklassifikation nach Miettinnen erfassbaren Tumoren des Patienten

WS(2) war jeweils pT2 zu klassifizieren. Insgesamt lagen niedrigere Tumorstadien

als bei den rezidivierten und metastasierten GIST vor.

Im Zuge dieser Untersuchungen ließ sich die Diagnose eines GIST bereits

immunhistochemisch stellen, wenngleich bei zwei Patienten einzelne

immunhistochemische Färbungen schwach ausfielen. Bei einem Patienten (SA(2))

war die Färbung für CD117 in Tumor 2 und Tumor 3 schwächer verlaufen. Zieht man

nun die Ergebnisse der Mutationsanalyse hinzu, so stellt sich heraus, dass Tumor 1

dieses Patienten zwar immunhistochemisch eindeutig einem GIST zuzuordnen ist,

aber keine Mutation der Exone 9, 11, 13 und 17 von KIT und Exon 18 von PDGFRA

trägt. Der Literatur ist zu entnehmen, dass dies bei 10 – 20% der Fälle auftritt (Lasota

und Miettinen 2008). Die Tumoren 2 und 3, deren Färbung für CD117 schwächer

ausfiel, tragen beide dieselbe Deletion in Exon 11 von KIT. Dabei sind zwei Theorien

zu entwerfen: ein Tumor stellt die Metastase des anderen Tumors dar. Dies scheint

bei einer Tumorgröße von weniger als 0,5 cm und der Abschätzung des

Metastasierungsrisikos nach Miettinen mit einer „ohne Risiko“ aufgeführten

Tumorkategorie (Lasota und Miettinen 2006) eher unwahrscheinlich. Die andere

Theorie wäre, dass sich beide genetisch identische Tumoren voneinander

unabhängig entwickelt haben. Grundsätzlich sind beide Szenarien möglich, da die

Tumoren ein identisches Risikoprofil besitzen, wobei die letztere die

wahrscheinlichste Theorie darstellt.

Des Weiteren zeigte sich in der Immunhistochemie, dass die Färbung für DOG-1 bei

beiden Tumoren eines anderen Patienten (WS(2)) schwach ausfiel. Entsprechend

dieser Duplizität der schwachen immunhistochemischen Reaktion zeigt sich eine

weitere Duplizität in der Mutationsanalyse. Beide Tumoren zeigen eine gleichartige

Deletion in Exon 11 von KIT. Entsprechend des Risikoprofils ist der Tumor des

Dünndarms mit einem moderaten Risiko in der Klassifikation nach Miettinen

60

anzusehen; der Tumor des Kolons ist hier nicht weiter einzuordnen. Möglich ist in

dieser Konstellation, dass der Tumor des Kolons einer Metastase entspricht. GIST

des Dünndarms sind wesentlich häufiger als die des Kolons (Dünndarm 25% versus

Kolon < 5%, Corless et al. 2004). Zudem war der Dünndarmtumor größer (Dünndarm

4,5 cm versus Kolon 2,2 cm) und in der Risikoklassifikation des

Metastasierungsrisikos nach Miettinen mit einem höheren Metastasierungspotential

anzusehen (Lasota und Miettinen 2006). In der Klassifikation nach Miettinen sind für

Tumoren des Kolons (ausgenommen das Rektum) zu niedrige Fallzahlen verfügbar

und somit eine Einordnung des Risikoprofils nicht vorgesehen. Eine endgültige

Zuordnung (synchroner Tumor oder metastasierender Prozess) war nicht Ziel dieser

Untersuchung und ist abschließend nicht sicher zu klären.

Es ist grundsätzlich für synchron auftretende GIST festzuhalten, dass sie

unterschiedliche Mutationen tragen können. Zeigt sich ein gleichartiges

Mutationsmuster der synchronen Tumoren, ist differentialdiagnostisch in Erwägung

zu ziehen, dass es sich um einen metastasierten GIST handelt, der, unabhängig von

der Tumorgröße, einer entsprechenden leitliniengerechten medikamentösen

Therapie zugänglich zu machen ist (Casali et al. 2010). Entscheidend für die weitere

klinische Führung des Patienten ist daher nach der Einschätzung des Risikoprofils

mittels der Klassifikationen nach Fletcher und Miettinen unbedingt auch die

Mutationsanalyse.

5.3 Patienten mit metastasiertem GIST

Die Lokalisationen der Metastasen in der vorliegenden Arbeit decken sich mit den

von Blay et al. (2007) erhobenen Daten mit einer überwiegenden Verteilung der

Metastasen in Leber und / oder Peritoneum. Die nach der Datenlage in der Literatur

als sehr selten beschriebenen Lymphknotenmetastasen (Blay et al. 2007) waren

auch im hier vorliegenden Tumorgewebe nicht zu finden.

Betrachtet man die TNM-Klassifikationen der metastasierten GIST, so fällt auf, dass

bei drei Patienten ein als pT2 klassifizierter Primärtumor bereits mehrere Metastasen

an den typischen Lokalisationen, wie Leber und Peritoneum, verursachen kann. Die

61

übrigen untersuchten Primärtumoren entsprachen, wie es eher zu erwarten wäre,

einer höheren T-Kategorie.

In der Gruppe der Patienten mit metastasiertem GIST zeigte sich die initiale Mutation

des Primärtumors in allen Metastasen stabil. Dies unterstützt die Annahme, dass sich

diese Mutation sehr früh in der Pathogenese der Tumoren entwickelt (Heinrich et al.

2003, Rubin et al. 2001, Longley et al. 2001, Burger et al. 2005). Da in dieser Gruppe

sämtliche Patienten in der Vor-Imatinib-Ära diagnostiziert wurden, traten

entsprechende beschriebene Resistenzmutationen in den Metastasen nicht auf.

Auffällig aber waren in diesem Zusammenhang die Ergebnisse des Patienten TA(3).

Hier fand sich sowohl im Primärtumor als auch in allen Metastasen (Peritoneum,

Leber mit Leberhilus, intraabdominal, Ureter, Funiculus spermaticus, Milz und

abdominales Zwerchfell) eine gleichartige Mutation in Exon 11 von KIT mit einer

Deletion von 48 Basenpaaren. Zusätzlich war nun eine spezifische Punktmutation in

Exon 9 von KIT in den Metastasen der Milz und des abdominalen Zwerchfells

nachweisbar. Im Primärtumor und in anderen Metastasenlokalisationen war diese

Mutation nicht zu finden. Dabei ist zu bedenken, dass es sich um unterschiedlichste

Gewebetypen handelt, die alle der gleichen Behandlung unterzogen wurden. Da

diese Mutation in keiner Datenbank in der Online-Abfrage unter „http://www.hgvs.org“

und „http://www.sanger.ac.uk“ (Merkelbach-Bruse et al. 2010) als bekannt

beschrieben wurde, wurden die Untersuchungen mehrfach in unterschiedlichen

Ansätzen wiederholt, um das Ergebnis zu bestätigen. Da immer noch die Möglichkeit

einer Fehlbestimmung im Raum stand und Punktmutationen häufiger als

Fixierartefakte auftreten können, wurde eine weitere Datenbankrecherche unter

„http://www.hgvs.org“ in einem speziellen für Artefakte bereit gestellten Datenbankteil

durchgeführt. Die in Exon 9 von KIT untersuchte Mutation war auch in dieser

Datenbank nicht zu finden. Zudem wurde diese Mutation auch nicht in anderem

Gewebe des Patienten gefunden. Insofern ist die Punktmutation in Exon 9 von KIT in

erster Linie als real einzustufen. Es ergibt sich folgendes Szenario (siehe Abbildung

5.1):

62

Primärtumor Magenhinterwand 17 x 16 x 12 cm Mutation Exon 11

Lebermetastasen bis 8 x 7 x 7 cm Mutation Exon 11

Dieses Szenario erlaubt folgende Schlussfolgerungen:

- Die initiale Mutation des Primärtumors zeigt sich stabil und ist auch in allen

Metastasen nachweisbar.

Abbildung 5.1:

Darstellung der KIT-Mutationen in Primärtumor und Metastasen des Patienten

TA(3) aus der Gruppe der metastasierten GIST.

Kursiv hervorgehoben die Mutation in Exon 9 von KIT.

Konglomerattumor / Peritonealmetastase Sigma/Rektum-Harnblase 16 x 15 x 12 cm Mutation Exon 11

Ureter links 0,4 cm Mutation Exon 11

abd. Zwerchfellmetastasen bis 8 x 7 x 7 cm Mutation Exon 11 + Mutation Exon 9

Milzmetastase bis 8 x 7 x 6 cm Mutation Exon 11 + Mutation Exon 9

Tumor intraabdominal frag. Gewebe 5,5 kg Mutation Exon 11

Metastase Fun. spermaticus bis 3,0 Durchmesser Mutation Exon 11

63

- Im Zuge der Metastasenentstehung im abdominalen Zwerchfell und der

Milzmetastasen kommt es zu einem Zugewinn einer Punktmutation im Sinne

einer weiteren genetischen Instabilität des Tumorgewebes. Alternativ ist

möglich, dass der Primärtumor ein Mosaik bietet und die Punktmutation in

anderen untersuchten Geweben unterhalb der Nachweisschwelle von 20%,

die zum Nachweis mit dieser Methode erforderlich ist, vorhanden ist.

Die Möglichkeit eines Tumormosaiks ist in der Interpretation für die zukünftige

klinische Patientenführung von höchster Brisanz. Es stellt sich die Frage, ob das

Sensitivitätsniveau der Mutationsanalyse weiter erhöht werden muss oder ob neue

Methoden, wie das Next-Generation-Sequencing, die erforderliche Sensitivität

erbringen, die zur Entdeckung eines Tumormosaiks nötig wäre. Mit diesem Verfahren

wäre es auch möglich, Resistenzmutationen, die bereits im Primärtumor in einer

kleinen Zahl der Tumorzellen vorliegen können, sicher auszuschließen. Für die

klinische Führung der Patienten bedeutet dies, dass Metastasen nach Möglichkeit

genetisch untersucht werden müssen, zumindest, wenn das Therapieansprechen

nicht optimal ist. Weitere Untersuchungen hinsichtlich dieser Problematik sind

erforderlich und bereits in Planung. Sie waren nicht Ziel dieser Studie.

Da auch nach ausführlicher Literaturrecherche keine Daten über den Verlauf des

Mutationsmusters in Primärtumoren und Metastasen von GIST zu erheben waren, ist

für alle zukünftigen Patienten eine Mutationsanalyse von Primärtumor und allen

resezierten Metastasen anzustreben. Bezüglich des Patienten TA(3) ist festzuhalten,

dass nach Lasota und Miettinen (2008) eine dort beobachtete Deletion in Exon 11

von KIT möglicherweise mit einem gesteigerten Malignitätspotential assoziiert ist, vor

allem wenn es sich um einen Tumor des Magens handelt. Zudem liegt diese

Mutation häufig bei einem spindelzelligen Tumortyp vor, der auch hier zu finden war.

Die sekundäre Mutation befindet sich in Exon 9 von KIT. GIST mit Mutationen in

Exon 9 von KIT werden nach den ESMO-Leitlinien (Casali et al. 2010) mit einer

doppelten Imatinib-Dosis (800 mg versus 400 mg) behandelt und es zeigt sich dabei

eine verbesserte Ansprechrate des Tumors und ein verbessertes Gesamtüberleben

(Verweij et al. 2004). Die Information einer zusätzlichen Mutation in Exon 9 von KIT,

die mit einer Dosiserhöhung verbunden ist, kann aber nur durch eine

Mutationsanalyse aller Metastasen erhalten werden. Unterbleibt die Untersuchung

64

aller Metastasen, kommt es durch die unentdeckte Mutation in Exon 9 von KIT zu

einer unzureichenden Dosisverteilung von Imatinib. Dabei kann auch die in den

ESMO-Leitlinien (Casali et al. 2010) empfohlene Therapie eines metastasierten GIST

in der Initialtherapie bei metastasiertem GIST unwirksam sein, da sekundäre

Mutationen auch in genomischen Arealen für Imatinib-Resistenz (Al-Batran et al.

2007) vorkommen können. Zudem bleibt dem Patienten eine second-line-Therapie

bei Imatinib-Resistenz mit weiteren Substanzen, z. B. Sunitinib verwehrt (Rashmi

2011), wenn die Zweitmutation unentdeckt bleibt. Für den Patienten bedeutet dies,

dass ein Tumorprogress erst bei Symptomen beziehungsweise bildmorphologisch zu

sichern ist und bis dahin eine nicht nebenwirkungsfreie medikamentöse Therapie

ohne Effekt durchgeführt wurde.

Bei der Korrelation der immunhistochemischen Charakteristika und der

Mutationsanalysen ist ein weiterer Patient (KW(3)) hervorzuheben. Im initialen

Befundbericht war damals ein metastasierter GIST diagnostiziert worden, der eine

auffällige Unterschiedlichkeit der Immunhistochemie im damals mutmaßlichen

Primärtumor im Magen und den Metastasen in Omentum majus, Papilla duodeni

major, Leber, Niere, Lunge, Pericard, Herz, Zunge und Wirbelkörper bot. Werden die

Hämatoxylin-Eosin-gefärbten Schnittpräparate hinzugezogen, so fällt auf, dass der

Tumor des Magens eine spindelzellige Morphologie mit gleichförmigen längs

ausgezogenen Tumorzellen im Gegensatz zu der angedeutet epitheloid-zelligen

Morphologie der Metastasen mit erhöhter Zell- und Kernpolymorphie zeigt. Zusätzlich

zeigten sich in der Mitosenzählung des Magentumors 4 Mitosen / 50 HPF und in den

Metastasen bis zu 30 Mitosen / 50 HPF, die zum Teil auch atypisch waren. Dies ist

in Abbildung 5.2 näher dargestellt.

65

Abbildung 5.2:

Links: Tumor des Magens mit spindelzelliger Histomorphologie bei gleichförmigen

Tumorzellen, HE, 100fache Vergrößerung

Rechts: Tumor des Netzes mit angedeutet epitheloidzelliger Morphologie und

hoher Zell- und Kernpolymorphie, HE, 100fache Vergrößerung

Bei Reevaluation der Befunde im Rahmen dieser Studie zeigte sich der Primärtumor

immunhistochemisch stark positiv in der Färbung für CD34 und schwach positiv in

der Färbung für CD117 und DOG-1. Die Metastasen zeigen ebenfalls eine starke

Positivität für CD34 und im Gegensatz zum Primärtumor eine fehlende

Immunreaktivität in den Färbungen für CD117, DOG-1, αSMAC und S100. Diese

Unterschiede werden in Abbildung 5.3 verdeutlicht.

66

Abbildung 5.3:

Oben: Tumor des Magens mit starker Positivität für CD 34 (links) und schwacher

Positivität für CD 117 (rechts), 200fache Vergrößerung

Unten: Tumor des Netzes mit starker Positivität für CD 34 (links) und fehlender

Immunreaktivität für CD 117 (rechts), 200fache Vergrößerung

Der in den Abbildungen veranschaulichte Unterschied zeigt sich auch in der

Mutationsanalyse. Im Tumor des Magens war eine Mutation in Exon 11 von KIT und

eine stumme Mutation für Exon 18 von PDGFRA zu evaluieren. Dieser Tumor ist

somit als GIST zu identifizieren. Dazu konträr stehen die anderen Tumoren, bei

denen mit Ausnahme der Wirbelkörpermetastase keine Mutation in Exon 9, 11, 13

und 17 von KIT und Exon 18 von PDGFRA nachweisbar war. Auf die

Wirbelkörpermetastase wird im Späteren näher eingegangen werden. Sogenannte

„Wildtyp-GIST“, das heißt GIST ohne nachweisbare Mutation in KIT und PDGFRA

sollen nach Literaturberichten in 10 – 20% der Fälle auftreten (Lasota und Miettinen

2008). Addiert sich nun die fehlende Immunreaktivität für CD117 in den Tumoren

67

außerhalb des Magens, erscheint die Diagnose eines metastasierten GIST

retrospektiv immer unwahrscheinlicher. Nach Literaturangaben sollte zumindest in

95% der Fälle eine Positivität des GIST in der Färbung für CD117 zu erheben sein

(Jung et al. 2011). Da natürlich die Möglichkeit eines weiteren synchronen GIST mit

fehlender Immunreaktivität für CD117 und in der Mutationsanalyse in allen

untersuchten Exonen mit Metastasierung gegeben war, erfolgte im Anschluss an die

Mutationsanalyse eine komplette Reevaluation des Falles. Dabei zeigte sich nun in

allen, ursprünglich wegen des spindelzelligen Charakters des GIST eingeordneten

Tumoren mit Ausnahme der Wirbelkörpermetastase eine Positivität in der Färbung

für den Pan-Zytokeratin-Marker KL-1. Bei im Rahmen der Obduktion fehlendem

Nachweis eines Karzinoms, das als Primärtumor für diese Metastasen in Frage käme

muss hier auch an die Möglichkeit eines metastasierten epitheloiden Sarkoms (WHO

– Classification of Tumours, Soft Tissue an Bone, 2002) mit Metastasen in Omentum

majus, Papilla duodeni major, Leber, Niere, Lunge, Pericard, Herz und Zunge

differentialdiagnostisch gedacht werden, wobei auch hier im Rahmen der Obduktion

kein Primärtumor zu sichern war. Hierbei zeigte sich die Mutationsanalyse in

Kombination mit der Immunhistochemie als wirksames diagnostisches Instrument zur

Charakterisierung der Tumorinfiltrate.

Noch verwirrender ist die Interpretation der genomischen Daten der

Wirbelkörpermetastase dieses Patienten. Diese zeigte sich in den

immunhistochemischen Untersuchungen positiv für CD34 und mit fehlender

Immunreaktivität in den Färbungen für CD117, DOG-1, αSMAC und S100,

entsprechend der anderweitigen, oben beschriebenen Tumorinfiltrate. Die

immunhistochemische Untersuchung der Wirbelkörpermetastase ist mit

eingeschränkter Repräsentativität zu betrachten, da es sich um Blockmaterial aus

dem Jahre 2002 aus dem Sektionsarchiv handelt und die Entkalkung in Säure

erfolgte. Die Säureentkalkung zeigt eine erhebliche Artefaktbildung in der

Immunhistochemie. Wird nun die Mutationsanalyse hinzugezogen, zeigt sich ein

überraschendes Bild: es konnten zwei Punktmutationen in Exon 9 von KIT und eine

Deletion in Exon 11 von KIT nachgewiesen werden. Diese Mutationen stimmen

weder mit dem GIST des Magens noch mit den anderen Tumoren überein.

68

Dafür gibt es mehrere Erklärungsansätze:

- die Entkalkung führte zu einer Artefaktbildung in der Immunhistochemie und

der Mutationsanalyse und die dargestellten Mutationen sind nicht real

- das Tumorgewebe des Wirbelkörpers ist eine Metastase eines andernorts

gelegenen GIST, dessen primäre Lokalisation im Rahmen der Obduktion nicht

erkannt wurde

- die Tumorinfiltrate des Wirbelkörpers liegen als Metastase des bereits

bekannten GIST mit einem Mutationsmuster eines Minorklons des Tumors vor

- es liegt ein primärer extraintestinaler GIST vor

- das Tumorgewebe des Wirbelkörpers ist eine Metastase eines andernorts

gelegenen Tumors, dessen Primärlokalisation im Rahmen der Obduktion nicht

erkannt wurde

Die Artefaktbildung im Rahmen der Entkalkung ist eher unwahrscheinlich, da in der

Mehrzahl der Fälle eine Formalinfixierung zu einer Artefaktbildung führt. Daher erfolgt

eine Vorbehandlung der Proben im Rahmen der DNA-Extraktion (siehe Abschnitt

3.10.3). Zudem stellten sich die als artefiziell beschriebenen Mutationen in der

Datenbankrecherche („http://www.hgvs.org“) als Punktmutationen dar. Dies würde

zwar die beiden Punktmutationen in Exon 9 von KIT erklären, die Erklärung der

Deletion in Exon 11 von KIT bleibt aber offen. Hinzu kommt, dass Artefaktbildungen

oft im Zusammenhang mit DNA-Extraktionen aus mehreren Einzelzellen ungleich

häufiger auftreten, als bei Fällen, in denen mehr Tumorgewebe zu Verfügung steht.

Im hier dargestellten Fall war genügend Gewebe zur DNA-Extraktion vorhanden.

Das Vorliegen eines weiteren GIST mit Metastasierung in die Wirbelsäule zeigt sich

ebenfalls als unwahrscheinlich. Zum Einen wurde das vorliegende Tumorgewebe des

Patienten vollständig untersucht und kein weiterer GIST gesichert. Zum Anderen sind

Wirbelkörpermetastasen eines GIST extrem selten. In der von Blay et al. (2007)

untersuchten Kohorte von 192 Patienten war keine Metastase des Wirbelkörpers zu

evaluieren. Hinzu kommt, dass in der Untersuchung von Reith et al. (2000) mit einer

großen Serie von 48 extraintestinalen GIST, die sich insgesamt als sehr selten

darstellen, als Tumorlokalisation das Retroperitoneum und intraabominal angegeben.

Damit scheint eine primäre extraintestinale Manifestation eines GIST in einem

Wirbelkörper unwahrscheinlich. Als Arbeitshypothese wäre eine Metastase eines

69

andernorts lokalisierten, bisher nicht entdeckten, Primärtumors mit einer Mutation in

Exon 9 und 11 von KIT, denkbar. Derartige Mutationen wurden bei bis zu 17% der

Fälle von malignen Melanomen beschrieben (Grossmann et al. 2012). Eine

Verifizierung in der immunhistochemischen Untersuchung mit Melanom-Markern

gelang am mittels Säure entkalkten Material nicht und ist in der Auswertung nicht

aussagekräftig. Bei fehlendem Nachweis eines Primärtumors bleibt die

abschließende Wertung jedoch spekulativ.

Zusammenfassend lässt sich schlüssig darlegen, dass die Mutationsanalyse

insbesondere bei Fällen mit inhomogener Verteilung der Immunhistochemie ein

robustes und diagnostisch sicheres Mittel zur Untersuchung von GIST darstellt.

Werden Mutationen in einem Primärtumor gesichert, so findet sich diese Mutation

auch in den Metastasen wieder. Ein Fall zeigt den Zugewinn einer Mutation, wobei

sich die primär festgestellte Mutation weiterhin nachweisen lässt. In einem weiteren

Fall erlaubt die Mutationsanalyse die Klärung eines für einen GIST sehr

ungewöhnlichen Metastasierungsmusters und ein vermeintlicher metastasierter GIST

stellt sich nach der Untersuchung in der Mutationsanalyse als vergleichbar harmloser

solitärer GIST der Magenwand heraus.

5.4 Patienten mit unklaren spindelzelligen Tumoren

Die untersuchten unklaren spindelzelligen Tumoren stammten in 22 von 28 Fällen

aus dem Magen. Tumoren des Dünndarms lagen in fünf Fällen vor und ein Patient

(VM(4)) wies einen Tumor im distalen Oesopagus auf. Damit entsprach die

Verteilung in etwa der für GIST zu erwartenden Lokalisationen (Corless et al. 2004).

Werden die für die Tumoren erhobenen TNM-Klassifikationen betrachtet, so zeigt

sich ein sehr uneinheitliches Bild, wobei die Majorität der Tumoren der Kategorie pT1

und pT2 zuzuordnen waren, lediglich in einem Fall lag die Kategorie pT4 vor. Dies

gibt auch die Erfahrung aus der Literatur wider. DeMatteo et al. (2000) beschriebt,

dass wenn GIST Symptome verursachen, in zwei Drittel der Fälle Tumoren von mehr

als 5 cm Durchmesser vorliegen. Werden GIST aber als asymptomatische Tumoren

70

zufällig entdeckt, so sind sie in der Regel von kleinerem Durchmesser und dies

spiegelt sich auch in den niedrigen pT-Stadien wider.

Die Tumoren zeigten ein uneinheitliches immunhistochemisches Profil mit fehlender

Färbung in der Immunhistochemie für typische Marker eines GIST (CD34, CD117

und DOG-1) beziehungsweise es lag eine für GIST untypische Positivität in den

anderen durchgeführten immunhistochemischen Färbungen vor (S100 und αSMAC).

Somit waren die Tumoren dieser Patientengruppe nicht eindeutig der Entität eines

GIST zuzuordnen. Die immunhistochemischen Untersuchungen zeigten sich in

einem Fall mit fehlender Immunreaktivität für CD34 (3%), in einem Fall mit fehlender

Immunreaktivität für CD117 (3%), in zwei Fällen mit fehlender Immunreaktivität für

DOG-1 (7%), in zwei Fällen schwach positiv für αSMAC und in zwei weiteren Fällen

schwach positiv für S100 (jeweils 7%). Diese Ergebnisse decken sich, unter

Berücksichtigung der niedrigen Patientenzahl von 28 Patienten mit den publizierten

immunhistochemischen Ergenissen: GIST zeigen sich in 70 – 80% der Fälle positiv in

der Färbung für CD34, in 90 – 95% der Fälle positiv in der Färbung für CD117 und in

95% der Fälle positiv in der Färbung für DOG-1 (Liegl-Atzwanger et al. 2010, Jung et

al. 2011, Kang et al. 2012).

In der Mutationsanalyse waren 22 der 28 Fälle in Zusammenschau mit der

immunhistochemischen Untersuchung eindeutig als GIST zu identifizieren. Es lagen

überwiegend Mutationen in Exon 11 von KIT und zum Teil in Exon 18 von PDGFRA

vor. In Exon 9 von KIT waren keine Mutationen zu ermitteln. Dabei war zwar das

immunhistochemische Bild uneinheitlich, aber durch die eindeutige Mutationsanalyse

war eine Einordnung in die Tumorentität GIST ohne Probleme möglich.

Die sechs Tumorproben, bei denen keine Mutation in Exon 9, 11, 13 und 17 von KIT

und Exon 18 von PDGFRA zu finden waren, entsprechen 21% der Fälle. KIT-

Mutationen treten in 85% und PDGFRA-Mutationen 8% der Fälle von GIST auf

(Liegl-Atzwanger et al. 2010). Somit wären die hier vorliegenden sechs Fälle als

„Wildtyp“ zu klassifizieren. Da die Immunhistochemie in der Kombination der Marker

dennoch für einen GIST passend war, wurde auch bei vorliegendem Wildtyp der

Tumor als GIST klassifiziert.

Daraus ist zu schließen, dass in Fällen unklarer immunhistochemischer

Untersuchungen die Sicherung der Tumorentität gut durch eine Mutationsanalyse

71

ergänzt werden kann und die Tumorentität in 78% der Fälle mit der Mutationsanalyse

eindeutig festgelegt werden kann. Ist die Tumorentität bestimmt, kann

gegebenenfalls auch eine adäquate Therapie erfolgen.

Als zusammenfassendes Fazit aus dieser Studie lässt sich konstatieren, dass eine

Kombination aus immunhistochemischer Untersuchung und besonders die

Mutationsanalyse spindelzelliger Tumoren bei Verdacht auf das Vorliegen eines

GIST eine valide und robuste Methode darstellt, die gut auch in die tägliche Praxis zu

integrieren ist. Grundsätzlich lässt sich an den hier vorliegenden Daten feststellen,

dass sich eine primär in einem GIST diagnostizierte Mutation auch in den

Metastasen wiederfindet. Eine Mutationsanalyse eines neu diagnostizierten GIST ist

bereits in den Abläufen der Leitlinien verankert. Dies dient ebenso der

Diagnosesicherung als auch zur Festlegung der Imatinib-Dosis. Zudem können

Tumoren identifiziert werden, die auf eine Imatinib-Therapie nicht ansprechen. Im

Idealfall ist aufgrund der vorliegenden Daten zu fordern, dass neu aufgetretene

Metastasen einer Mutationsanalyse unterzogen werden, so dass

Sekundärmutationen, die eine eventuelle Dosisanpassung erfordern, identifiziert

werden können.

72

Zusammenfassung

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med.


eingereicht von Katrin Schierle

angefertigt an der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig, Institut für

Pathologie

betreut von Prof. Dr. Claudia Wickenhauser / Prof. Dr. Lars-Christian Horn

Dezember 2012

Gastrointestinale Stromatumoren (GIST) sind die häufigsten mesenchymalen

Tumoren des Gastrointestinaltrakts. Die Befundung derartiger Tumoren bedarf neben

einer makro- und histomorphologischen Aufarbeitung der Immunhistochemie, der

Mutationsanalyse und der Einordnung des Progressionsrisikos nach Fletcher und

Miettinen sowie die TNM-Klassifikation. Die gewonnenen Informationen sind

entscheidend für die Festlegung der individuell erforderlichen Therapie. Im Falle

einer erforderlichen medikamentösen Langzeittherapie ist die Stabilität des

Mutationsstatus entscheidende Vorbedingung für deren Erfolg. Ziel dieser Arbeit war

es, GIST-Rezidive, synchron auftretende GIST, metastasierte GIST und

spindelzellige Tumoren unklarer Histogenese hinsichtlich der Histomorphologie,

Immunhistochemie und des Mutationsstatus zu charakterisieren und zu vergleichen.

Bei der Untersuchung der rezidivierten GIST lag bezüglich des Primärtumors in allen

Fällen ein Progressionsrisiko nach Fletcher von mindestens „intermediär“ und nach

Miettinen von „hoch“ vor. Die Rezidive zeigten sich hinsichtlich der Histomorphologie

und der Immunhistochemie gleichartig zu den Primärtumoren, wenngleich zwischen

Diagnose des Primärtumors und den Rezidiven eine Zeitspanne von bis zu 5 Jahren

vorlag. Daraus lässt sich schließen, dass Lokalrezidive auch nach längeren

73

Zeiträumen vorkommen können und differentialdiagnostisch, vor allem mit der

Mutationsanalyse, von neu entstandenen GIST abzugrenzen sind.

In der Fallgruppe der drei Patienten mit synchron aufgetretenen GIST ist

prognostisch entscheidend, ob die verschiedenen Tumoren tatsächlich unabhängig

entstanden sind oder ob ein metastasierter Prozess vorliegt. Die Tumoren zeigten

jeweils ein gleichartiges histomorphologisches und immunhistochemisches Bild.

Molekularpathologisch konnten bei einem Patienten bzgl. beider Tumoren

unterschiedliche Mutationen nachgewiesen werden, was eine synchrone Entwicklung

sehr wahrscheinlich macht. Gleiches galt für einen weiteren Patienten: Hier war der

erste Tumor, der histomorphologisch und immunhistochemisch eindeutig als GIST

zu identifizieren war, molekularpathologisch einem sog. Wildtyp GIST zuzuordnen.

Die beiden weiteren Tumoren dieses Patienten zeigten in der Mutationsanalyse

dieselbe Mutation. Hiernach erscheint als wahrscheinlichste Theorie, dass beide

Tumoren unabhängig voneinander entstanden sind und dieselbe Mutation tragen. Im

dritten Fall wiesen die beiden Tumoren, die im Dünndarm und im Kolon

nachgewiesen worden waren, ein gleichartiges histomorphologisches,

immunhistochemisches und molekularpathologisches Bild auf. Möglich und in dieser

Konstellation durchaus wahrscheinlich ist hier, dass ein Tumor der Metastase des

anderen entspricht.

Für die Untersuchung metastasierter GIST stand Gewebe von neun Patienten zur

Verfügung. Die Primärtumoren und die Metastasen zeigten, mit einer Ausnahme, alle

eine für GIST typische Histomorphologie und Immunhistochemie. Bei acht der neun

Patienten war die Mutation des Primärtumors auch in den Metastasen zu finden. Bei

einem der acht Patienten zeigte sich zusätzlich eine weitere Mutation in einzelnen

der Metastasen. Diese Mutation könnte sich im Sinne einer zunehmenden

genomischen Instabilität neu entwickelt haben.

Im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen der metastasierten GIST ist ein

weiterer Patient hervorzuheben. Es zeigte sich lediglich für den Primärtumor im

Magen eine für GIST typische Histomorphologie, Immunhistochemie und

Mutationsanalyse. Die übrigen untersuchten Tumoren, die aufgrund ihrer

spindelzelligen Morphologie ursprünglich als Metastasen eingeordnet waren, zeigten

eine immunhistochemische Positivität für den Pan-Zytokeratin-Marker KL-1. Da bei

der Obduktion kein Karzinom diagnostiziert worden war, ist in der

Gesamtkonstellation nun auch als Zweitneoplasie ein epitheloides Sarkom in

74

Erwägung zu ziehen. Der Fall illustriert eindrücklich die Bedeutung der

Mutationsanalyse in Kombination mit der Immunhistochemie bei der definitiven

Festlegung der Diagnose.

Es wurden 28 Fälle unklarer spindelzelliger Tumoren untersucht, die ein

uneinheitliches immunhistochemisches Bild bei spindelzelliger Morphologie boten.

Mit der Zuhilfenahme der Mutationsanalyse waren 22 der 28 untersuchten

Tumorpräparate durch die vorliegenden Mutationen eindeutig als GIST zu

identifizieren. Da bei den übrigen sechs Fällen der Tumor in Kombination der

immunhistochemischen Marker für einen GIST passend war, wurden die Tumoren in

Zusammenschau mit der Immunhistochemie als Wildtyp-GIST klassifiziert. Wir

konstatieren, dass in Fällen unklarer immunhistochemischer Konstellation die

Sicherung der Tumorentität in zumindest 78% der Fälle durch eine Mutationsanalyse

bestimmt werden kann.

Als Fazit aus diesen Untersuchungen lässt sich feststellen, dass die Kombination aus

immunhistochemischer Untersuchung und der Mutationsanalyse bei dem Verdacht

auf das Vorliegen eines GIST eine valide und robuste Methode darstellt, die gut in

die tägliche Praxis zu integrieren ist. Eine primär an einem GIST diagnostizierte

Mutation findet sich im Falle einer Metastasierung oder eines Rezidivs in den

weiterhin resezierten Tumorproben wieder. Im Rahmen der Leitlinien zur Behandlung

eines GIST ist die Mutationsanalyse fester Bestandteil der Diagnostik, wenngleich

aufgrund dieser Daten zu fordern ist, dass Metastasen ebenfalls mittels einer

Mutationsanalyse untersucht werden, damit eine Sekundärmutation, die eine

Dosisanpassung nach sich ziehen würde, identifiziert werden kann.

75

Tabellenverzeichnis

Tab. 1.1 Klassifikation nach Fletcher 12

Tab. 1.2 Klassifikation nach Miettinen 12

Tab. 3.1 Chemikalien 17

Tab. 3.2 Verbrauchsmaterialien 17

Tab. 3.3 Chemikalien-Zusammensetzungen 18

Tab. 3.4 Zusammensetzung Master-Mix für PCR 18

Tab. 3.5 Geräte 19

Tab. 3.6 Herkunft der Primärantikörper 20

Tab. 3.7 Verdünnungen und Substrat der Immunhistochemie 20

Tab. 3.8 Primer KIT 21

Tab. 3.9 Primer PDGFRA 21

Tab. 3.10 Klassifikation nach Fletcher 22

Tab. 3.11 Klassifikation nach Miettinen 22

Tab. 3.12 TNM-Klassifikation der GIST 23

Tab. 3.13 UICC-Klassifikation der GIST 24

Tab. 3.14 Durchführung der immunhistochemischen Färbung 26

Tab. 3.15 Reaktionsschritte QIAcube 28

Tab. 3.16 Reaktionsschritte PCR 30

Tab. 4.1 Zeitlicher Verlauf zwischen Primärtumor und Rezidiv 37

Tab. 4.2 Risiko der Krankheitsprogression der Primärtumoren und TNM-

Klassifikation

37

Tab. 4.3 Immunhistochemische Ergebnisse der rezidivierten GIST 38

Tab. 4.4 Mutationen der rezidivierten GIST 39

Tab. 4.5 Lokalisation und Größe der synchron aufgetretenen GIST 39

Tab. 4.6 Risiko der Krankheitsprogression und TNM-Klassifikation der

synchronen GIST

40

Tab. 4.7 Immunhistochemische Ergebnisse der synchron aufgetretenen

GIST

41

Tab. 4.8 Ergebnisse der Mutationsanalyse der synchron aufgetretenen

GIST

42

Tab. 4.9 Lokalisation und Größe der metastasierten GIST 42

76

Tab. 4.10 Risiko der Krankheitsprogression der metastasierten GIST 44

Tab. 4.11 TNM-Klassifikation der metastasierten GIST 44

Tab. 4.12 Immunhistochemische Ergebnisse der metastasierten GIST 45

Tab. 4.13 Patient KE(3), Wildtyp 47

Tab. 4.14 Patient RA(3), Mutation in Exon 9 von KIT 47

Tab. 4.15 Patient DV(3), Mutation Exon 9 von KIT 47

Tab. 4.16 Patient HH(3), Mutation in Exon 11 von KIT 48

Tab. 4.17 Patient HG(3), Mutation in Exon 11 von KIT 48

Tab. 4.18 Patient GR(3), Mutation Exon 11 von KIT 48

Tab. 4.19 Patient HW(3), Mutation Exon 11 von KIT 48

Tab. 4.20 Patient TA(3), Mutation Exon 9 und Exon 11 von KIT 48

Tab. 4.21 Patient KW(3), Mutation des Primärtumors in Exon 11 von KIT

und 18 von PDGFRA

49

Tab. 4.22 Patient KW(3), Mutationen der Metastasen in Exon 9 und 11 von

KIT

49

Tab. 4.23 Lokalisation und Größe der unklaren spindelzelligen Tumoren 50

Tab. 4.24 Risiko der Krankheitsprogression der spindelzelligen Tumoren 51

Tab. 4.25 TNM-Klassifikation der spindelzelligen Tumoren 52

Tab. 4.26 Immunhistochemische Ergebnisse der spindelzelligen Tumoren 53

Tab. 4.27 Ergebnisse der Mutationsanalyse der spindelzelligen Tumoren 55

Tab. 4.28 Korrelation der Wildtyp-Tumoren mit der Immunhistochemie 56

77

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1.1 Histomorphologie eines spindelzelligen GIST 4

Abb. 1.2 Histomorphologie eines epitheloiden GIST 5

Abb. 1.3 Histomorphologie eines intermediären GIST 6

Abb. 1.4 Darstellung einer Mitosefigur 7

Abb. 1.5 Schematischer Aufbau des KIT-Tyrosinkinase-Rezeptors und

des PDGFRA-Tyrosinkinase-Rezeptors

9

Abb. 3.1 Schematische Darstellung des Funktionsprinzips des QIAxcel-

Systems und beispielhafte Abbildung eines scharf getrennten

und eines zweifelhaften Bandenbildes

31

Abb. 4.1 Darstellung der immunhistochemischen Auswertung für CD34,

CD117 und DOG-1

35

Abb. 4.2 Kapillargelelektrophorese-Bild der Amplifikation des Exon 11

von KIT

36

Abb. 4.3 Elektropherogramm Exon 9 von KIT 36

Abb. 5.1 Darstellung der KIT-Mutationen in Primärtumor und Metastasen

des Patienten TA(3)

63

Abb. 5.2 Tumor des Magens mit spindelzelliger Morphologie sowie

Tumor des Netzes mit angedeutet epitheloider Morphologie

66

Abb. 5.3 Immunhistochemische Ergebnisse der Tumoren des Magens

und des Netzes

67

78

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83

Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne unzulässige

Hilfe oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Ich

versichere, dass Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte

Leistungen für Arbeiten erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der

vorgelegten Dissertation stehen, und dass die vorgelegte Arbeit weder im Inland

noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde

zum Zweck einer Promotion oder eines anderen Prüfungsverfahrens vorgelegt

wurde. Alles aus anderen Quellen und von anderen Personen übernommenes

Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug genommen

wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen

genannt, die direkt an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren.

………………………. …………………………………

Datum Unterschrift

84

Danksagung

Mein Dank gilt Frau Professor Dr. Claudia Wickenhauser und Herrn Professor Dr.

Lars-Christian Horn, die mir mit Rat und Tat zur Seite standen.

Des Weiteren danke ich Herrn Professor Dr. Christian Wittekind, Direktor des

Institutes für Pathologie des Universitätsklinikums Leipzig, für die Möglichkeit, meine

Promotion hier durchzuführen und für die Bereitstellung der Daten und Materialien,

die zur Durchführung meiner Promotion erforderlich waren.

Zudem möchte ich mich bei den Mitarbeitern des molekularpathologischen Labors

des Institutes für Pathologie unter der Leitung von Herrn Dr. Dr. Udo Siebolts, vor

allem bei Frau Annett Markwarth, für die große Unterstützung und den technischen

Beistand bedanken.

Bezüglich der Unterstützung danke ich ebenso Novartis Deutschland.

Zusätzlich danke ich Frau Dr. Tanja Gradistanac für die guten Ratschläge und ihr

scharfes Auge.

Für die immerwährende und andauernde Unterstützung danke ich meiner Familie,

besonders meinem Ehemann. Ohne sie wäre die Umsetzung dieser Promotion nicht

möglich gewesen.

85

Lebenslauf

Name: Katrin Schierle

Familienstand: verheiratet

Geburtsdatum/ -ort: 09.02.1977 in Schwäbisch Hall

Adresse: Riebeckstraße 15, 04317 Leipzig

Email: [email protected]

Schullaufbahn

1996

Abitur am Ernährungswissenschaftlichen

Gymnasium Schwäbisch Hall

1999 Staatliche Prüfung für medizinisch-technische

Laboratoriumsassistenten

Studium

10/1999 – 05/2006

Studium der Humanmedizin an der Universität Ulm

08/2001 Physikum

03/2003 1. Staatsexamen



Praktisches Jahr

Innere Medizin

2 Monate Gastroenterologie am Universitätsklinikum Ulm

2 Monate Kardiologie am Universitätsklinikum Ulm

Chirurgie 2 Monate Traumatologie am Universitätsklinikum Ulm

2 Monate Herzchirurgie am Universitätsklinikum Ulm

Pathologie 4 Monate am Institut für Pathologie des

Universitätsklinikums Ulm

86

Beruflicher Werdegang

seit 01.06.2006

Ärztin in Weiterbildung am Institut für Pathologie des

Universitätsklinikums Leipzig

Poster

Posterpräsentation „Evolution des Mutationsmusters metastasierter

gastrointestinaler Stromatumoren“ am 01.06.2012 auf der 96. Jahrestagung der

Gesellschaft für Pathologie e.V. in Berlin.

Datum Unterschrift

87

Documents

Evolution des Mutationsmusters in gastrointestinalen ... · In der Diagnostik der gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) spielt neben der Histologie die Immunhistochemie eine zentrale