SDS-PAGEPraktikum Proteinchemie

Meike Flentje und Julia Schwab17.05.2013

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Inhalt

• Theorie Einleitung SDS-PAGE SDS-PAGE Probenvorbereitung Coomassie Gelfärbung

• Versuchsdurchführung• Ergebnisse • Literatur

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Einleitung

• Ziel: Produktion und Aufreinigung von dem Protein FGF-2

• Es handelt sich um einen Wachstumsfaktor• Dieser bindet an den FGF-2 Rezeptor und führt

zur Dimerisierung

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• Eindimensionale Auftrennungsmethode nach der Größe

• Diskontinuirliches Tris-HCL / Tris-Glycin Puffersystem

• Sammelgel: weitporig , pH 6,8 und geringere Pufferstärke sowie Stapelung der Proteine

• Glycin: Folge-Ion wegen geringer Mobilität• Chlorid: Leit-Ion wegen hoher Mobilität

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• Trenngel: pH 8,8 sowie eng porig und damit erfahren die Proteine einen höheren Reibungswiderstand

• Folge: bessere Auftrennung und schärfere Banden

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SDS-PAGE Probenvorbereitung

• Red. Laufpuffer mit einem Überschuss an SDS• Erwärmung der Proben auf 95 °C

Denaturierung• DTT spaltet die Disulfidbrücken• SDS kann sich anlagern und eine negative Mizelle

bilden, damit werden Eigenladungen abgeschirmt• -> Gesamtladung ist

proportional zur Proteingröße

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Coomassie Gelfärbung

• Farbmittel: Coomassie Brillant Blue R-250

• Unspezifische Proteinfärbung

• Interaktion mit den basischen Resten, damit werden Lysin, Arginin und Histidin detektiert

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Versuchsdurchführung

• Gel gießen• Probenvorbereitung• Proben auftragen• Gellauf• Coomassie Färbung

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Ergebnisse

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Abb. : SDS-PAGE nach der Kultivierung: 1: Vorkultur (A) (7 μL); 2-7: 12 h-22 h (B) (7 μL); 8-13: 22 h-32 h (A) (7 μL); M: Protein-Marker (3 μL)

Abb. 3: : 14: 34 h (A) (7 µL); 15-20: 34 h-44 h (B) (7 µL); 21: 46 h (A) (7 µL); M: Protein-Marker (3 µL); 22: Gesamtzellprotein (A) (7 µL); 23: lösliche Proteine (A) (7 µL); 24: unlösliche Proteine (A) (7 µL); 25: Gesamtzellprotein (B) (7 µL); 26: lösliche Proteine (B) (7 µL); 27: unlösliche Proteine (B) (7 µL)

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Ergebnisse

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Abb. 4: SDS-PAGE nach der Kationenaustausch-Membran-Chromatographie: Probe 1-23 (10 μL); M: Protein-Marker (3 μL)

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Ergebnisse

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Abb. 5: SDS-PAGE nach der Heparin-Sepharose-Affinitäts-Chromatographie: M: Protein-Marker (3 μL); 1-16: Probe (10 μL)

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Ergebnisse

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Abb. 6: Zusammenfassung der Ergebnisse: 1: Gesamtzellprotein (B) (10 μL); 2: lösliche Proteine (B) (10 μL); 3: unlösliche Proteine (B) (10 μL); M: Protein-Marker (4 μL); 4-5: Heparin-Sepharose-Affinitäts-Chromatographie K + M (15 μL)

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Literatur• [1] Atherton, B. A.; Cunningham, E. L.; Splittgerber, A. G.: A mathematical

model for the descrip-tion of the Coomassie brilliant blue protein assay. In: Anal Biochem. 233(2), S. 160-8 (1996).

• [2] Fazekas de St. Groth, S.; Webster, R. G.; Datyner, A.: Two new staining procedures for quantit-ative estimation of proteins on electrophoretic strips. In: Biochimica et Biophysica Acta. 71, S. 377–391 (1963).

• [3] Laemmli, U. K.: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacterio-phage T4. In: Nature. 227, S. 680-685 (1970).

• [4] Lottspeich, H.; Zorbas, H.: Bioanalytik. 1. Aufl. Heidelberg: Spektrum, Akad. Verl. (1998).

• [5] Reinard, T.: Molekularbiologische Methoden. 1. Aufl. Stuttgart: Eugen Ulmer KG. (2010).

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Literatur - Bild• Bild 1:

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Protein_FGF2_PDB_1bas.png; 28.05.2013

• Bild 2: http://www.pnas.org/content/96/7/3658/F2.expansion.html; 28.05.2013

• Bild 3: https://www.goldbio.com/FGF2-Basic-FGF-Human-P5983-C241.php; 28.05.2013

• Bild 4: http://www.bio-rad.com/evportal/en/US/LSR/Solutions/LUSOW4GRI/Protein-Electrophoresis-Methods; 28.05.2013

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