F-Praktikum Naturstoffanalytik für Master Analytik und

Master Life Science (ganztägig)

Zeitraum I: 11.01.2016 bis 19.02.2016

Praktikum (R233, Labore LCI) jeweils geöffnet: 9.00 Uhr bis 17.00 Uhr. Das

Seminar “Fundamentals in Mass Spectrometry” startet bereits in der VL

(ab 14.01.2016) und wird an zwei Freitagen (22.01. und 05.02.2016 jeweils

freitags von 9-13.00 Uhr (Raum AC-Bibliothek) fortgesetzt. Die Gruppen-

einteilung, die Bekanntgabe der genauen Termine und die Sicherheitsbe-

lehrung erfolgten bereits in der VL. Eine Vorbesprechung der Versuche

erfolgt jeweils am 1. Praktikumstag. Die Teilnahme an der Vorbesprechung

ist Zulassungsvoraussetzung für die Teilnahme am Praktikum!)

1 Gaschromatographie (GC)

1.1 Einführung in die Bedienung eines Gaschromatographen und des zuge-

hörigen Datenverarbeitungssystems, sowie in die Auswertung von Mas-

senspektren [siehe 4.].

1.2 Theoretische Grundlagen der Gaschromatographie (Aufbau, Injektions-

techniken, Säulen, Trennphasen, Detektoren, Trennleistung, NWG, RI)

[Kolloquium vor den Versuchen!].

1.3 Analytik flüchtiger Naturstoffe: Säulenchromatographie und Fraktionierung

1.3.1 Extraktive Isolierung von Aromastoffen.

1.3.2 Fraktionierung komplexer Aromaextrakte durch Säulenchromatographie.

1.3.3 Charakterisierung des Gesamtextraktes und der Fraktionen (GC-FID, GC-

O, GC-MS)

2 Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)

2.1 Einführung in die Bedienung einer HPLC-Anlage und des zugehörigen

Datenverarbeitungssystems [Seminare an den Geräten]

2.2 Theoretische Grundlagen der Flüssigchromatographie (Aufbau, Injekti-

onstechniken, Säulen, Trennphasen, Detektoren, Trennleistung, NWG)

[Kolloquium vor den Versuchen!].

2.3 Bestimmung von Aminosäuren mittels OPA/FMOC-Derivatisierung

Zentrum Angewandte Chemie

Institut für Lebensmittelchemie PD Dr. U. Krings/Prof. Dr. R. G. Berger

Institut für Lebensmit-

telchemie

PD Dr. Ulrich Krings

Callinstr. 5

30 167 Hannover

Tel.0511-762-4583 +49

511 762 5356

Fax 0511-762-4547 +49 511

762 5391

krings@lci.uni-hannover.de

07.01.16

Zentrale:

Tel 0511-762-4581 +49

511 762 0

Fax 0511-762-4547 +49 511

762 3456

www.lci.uni-hannover.de

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3 Fundamentals in Mass Spectrometry

(Ionisation modes, coupling techniques, structure elucidation)

3.1 Seminar

3.1.1 Introduction:

3.1.2 MS-Analysers:

Sectorfield-, Quadrupole-, Ion-Trap, TOF-Instruments, MS/MS, MSn

3.1.3 Ionisation modes and coupling (hyphenated) techniques:

EI, CI, APCI, ESI, MALDI; GC-MS, LC-MS

3.1.4 Interpretation of mass spectra:

3.2 Demonstration Tests

3.2.1 Peptide sequencing using nano-LC-ESI-QTof-MS2

3.2.1.1 Tryptic digestion

3.2.1.2 Nano-LC

3.2.1.3 Auto-MS2

3.2.1.4 In slico vers. de novo sequencing, Mascot-search

Empfohlene Literatur (Grundlagen - weiterführende Literatur bei den einzelnen Versu-

chen)

Gey MH (2008) Instrumentelle Analytik und Bioanalytik : Biosubstanzen, Trennmethoden, Strukturanaly-tik, Applikationen, Ed 2. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg

Lottspeich F, Engels JW (2012) Bioanalytik. Elsevier (Spektrum Akademischer Verlag), Heidelberg Rücker G, Neugebauer M, Willems GG (2008) Instrumentelle Analytik für Pharmazeuten. Wissen-

schaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart Schwedt G (1995) Analytische Chemie: Grundlagen, Methoden und Praxis. Thieme, Stuttgart u.a. Skoog DA, Leary JJ (1996) Instrumentelle Analytik. Springer, Berlin, Heidelberg

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1 Gaschromatographie (GC)

1.1 Einführung in die Bedienung eines Gaschromatographen und des zugehörigen Datenverarbei-

tungssystems [Seminare an den Geräten]

1.2 Theoretische Grundlagen der Gaschromatographie (Aufbau, Injektionstechniken, Säulen, Trenn-

phasen, Detektoren, Trennleistung, NWG, RI)

[Kolloquium vor den Versuchen!]

1.3 Analytik flüchtiger Naturstoffe: Säulenchromatographie und Fraktionierung

1.3.1 Extraktive Isolierung von Aromastoffen

Prinzip

Die flüchtigen Substanzen einer Frucht werden nach Homogenisation durch kontinuierliche Flüs-

sig-flüssig-Extraktion gewonnen.

Geräte und Hilfsmittel

Haushaltsmixer

Zentrifuge mit 4 GSA (Sorvall) Zentrifugengefäße

Flüssig-flüssig-Extraktionsapparatur

Vigreux-Kolonne

Gaschromatograph mit Sniff-Ausgang

Chemikalien (Volumen pro Ansatz)

15%ige (w/v) NaCl-Lösung (600 mL)

Methanol (400 mL)

Pentan/Diethylether (Azeotrop) = Extraktionslösung (250 mL)

Undecansäuremethylester-Lösung in Methanol, c = 100 mg L-1 (= Wiederfindungs-

standard (1 mL))

Dodecansäuremethylester-Lösung in Methanol, c = 1000 mg L-1 (= interner Stan-

dard (100 µL)). Bei Bedarf wird Ihnen von den Assistenten evtl. ein anderer Stan-

dard zur Verfügung gestellt.

Untersuchungsmaterial

Früchte, Gemüse

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Durchführung

Zweckmäßigerweise wird die Kühlung der Extraktionsapparatur bereits frühzeitig angestellt, um

die Betriebstemperatur (3 °C) zu erreichen.

250 g Frucht bzw. Gemüse werden grob zerkleinert, im Mixer mit 400 mL MeOH und 1 mL der

Undecansäuremethylester-Lsg. als Wiederfindungsstandard versetzt und sofort gründlich homo-

genisiert. Das Homogenat wird in Teflonzentrifugenbecher gefüllt und in der vorgekühlten Zen-

trifuge bei 4 °C und 9500 U min-1 15 min zentrifugiert. Der Überstand wird mit Hilfe eines Glas-

trichters in eine Flüssig/Flüssig-Extraktionsapparatur eingefüllt und mit NaCl-Lösung auf ein Vo-

lumen von ca. 1000 mL verdünnt. Der Glastrichter wird jetzt vorsichtig durch eine Sinterfritte

ersetzt.

250 mL Extraktionslösung werden in einen 500-mL-Rundkolben vorgelegt und einige Siede-

steine zugegeben. Auf diesen Kolben wird die Versuchsapparatur aufgesetzt, die mit einem Küh-

ler versehen ist. Nach Einschalten des Wasserbades (40 °C) wird über Nacht extrahiert.

Nach Beendigung der Extraktion wird der Kühler entfernt, die Apparatur aus dem Wasserbad

gehoben und der Rundkolben mit dem Aromaextrakt abgenommen. Der Inhalt des Rundkolbens

wird zur Entfernung mitextrahiertem Methanols 3x mit dest. Wasser reextrahiert und die organi-

sche Phase anschließend über Na2SO4 getrocknet und an einer Vigreux-Kolonne (Wasserbad-

temperatur 40 °C) auf ca. 1 mL eingeengt und anschließend mit 100 µL internem Standard ver-

setzt (konzentrierter Gesamtextrakt). Desgleichen wird exakt 1 mL Wiederfindungsstandardlö-

sung mit 100 µL internem Standard versetzt (Wiederfindung, Normierung Injektionsvolumen,

Quantifizierung).

1.3.2 Fraktionierung komplexer Aromaextrakte durch Säulenchromatographie

Prinzip

Der konzentrierte Extrakt wird an einer Kieselgelsäule fraktioniert. In Anlehnung an Schreier und

Drawert erfolgt die Trennung nach Polarität an Kieselgel eingestellter Aktivität.

Geräte und Hilfsmittel

Trockenschrank

250 mL Rundkolben

Rotationsverdampfer

15 x 200 mm Glassäule, mit Kühlmantel

Glaswolle, Seesand (P/E extrahiert)

Vigreux-Kolonne (s.o.)

Chemikalien

Pentan, Diethylether (Ether)

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VE-Wasser

Kieselgel 230-400 mesh, Merck, Darmstadt

Untersuchungsmaterial

0,9 mL (0,1 mL für GC-O zurückhalten) des konzentrierten Gesamtextraktes

Durchführung

Das Kieselgel wird durch Trocknung (150 °C, 24 h Trockenschrank) und anschließende defi-

nierte Wasserzugabe von 4,5% (4,5 g 100 g-1 getr. Kieselgel) exakt auf die Aktivitätsstufe II-III

nach Brockmann eingestellt. Dazu wird eine definierte Menge Kieselgel in einen 250 mL Rund-

kolben eingewogen und mit der entsprechenden Menge Wasser versetzt und für 12 h durch

Rotation homogenisiert. Anschließend werden 11 g des Kieselgels mit Pentan in die mit Glas-

wolle und Seesand einseitig verschlossene Glassäule gespült. Dabei ist darauf zu achten, dass

das Festbett niemals trocken läuft sowie Blasen und Kanäle vermieden werden.

Zu Beginn der Fraktionierung sollte lediglich noch eine maximal 2 mm hohe Pentansäule ober-

halb des Festbetts vorliegen. 0,9 mL konzentrierter Gesamtextrakt werden auf die Kieselgelsäule

aufgegeben und die Elution der Aromastoffe erfolgt mit einer Flussrate von max. 5 mL min-1

gemäß nachstehender Tabelle. Bei Bedarf wird u. a. Fraktionierung an das aktuelle Trennprob-

lem angepasst (in Absprache mit den Assistenten).

Fraktion Volumen Lösungsmittel Polarität eluierende Aromastoffe

1 100 mL Pentan/Ether (9:1) unpolar Ester, Phenole, KW

2 100 mL Pentan/Ether (3:1) mittelpolar Alkohole, Aldehyde, Ketone, Phe-

nole

3 100 mL Ether polar Säuren, Alkohole, Lactone

Die Eluate werden analog dem Gesamtextrakt der Konti-Extraktion über Natriumsulfat getrocknet

und anschließend an einer Vigreux-Kolonne auf 1 mL eingeengt. Im Anschluss werden 100 µL

IS zugeben.

Literatur

Schreier P, Drawert F (1974) Gaschromatographisch-massenspektrometrische Untersuchung flüchtiger Inhaltsstoffe des Weines - I. Unpolare Verbindungen des Weinaromas. Zeitschrift für Lebensmit-teluntersuchung und -Forschung A 154: 273-278

Drawert F, Rapp A (1968) Gas-Chromatographische Untersuchung pflanzlicher Aromen. Chromatogra-phia 1: 446-457

Brockmann H, Schodder H (1941) Aluminiumoxyd mit abgestuftem Adsorptionsvermögen zur chroma-tographischen Adsorption. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series) 74: 73-78

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1.3.3 Charakterisierung des Gesamtextraktes und der Fraktionen (GC-FID, GC-O, GC-MS)

Prinzip

Nach Einengen der organischen Phase werden der Gesamtextrakt und die Kieselgelfraktionen

gaschromatographisch untersucht. Geruchsaktive Verbindungen werden durch Abriechen des

Säuleneluates (Effluens) aufgefunden (Gaschromatographie-Olfaktometrie, GC-O) und nachfol-

gend identifiziert (GC-MS, Vergleich mit Referenzsubstanzen, Kovats-Index). Die Gehalte der 10

intensivsten "Riecher" werden anhand des externen Standards berechnet.

Durchführung

Die Durchführung der gaschromatographischen Charakterisierung (GC-FID, GC-O, GC-MS) des

Gesamtextraktes und der Kieselgelfraktionen erfolgt gemäß 1.1 in Absprache mit dem Assisten-

ten.

Ofenprogramm: 40°C 3min, 3K/min auf 150°C, 5K/min auf 230°C, 5 min halten

Protokoll

Das Versuchsprotokoll sollte neben der allgemeinen Versuchsbeschreibung auch die gaschro-

matographischen Parameter enthalten (Chromatogramme bitte beilegen)

Bezeichnung des GC’s, Integrator oder Auswerte-Software

Säulenbeschreibung: Hersteller, Material, Beschichtungsdicke, ID, Länge, Dicke der Säulen-

beschichtung, Vorsäule

Temperaturprogramm

Injektor-, Detektortemperatur

Trägergas, Fluss, Vordruck

Injektionsart (OC)

Injektionsvolumen (1µL)

Berechnung der Wiederfindung der kontinuierlichen Flüssig/flüssig-Extraktion (Wiederfin-

dungsstandard)

Zuordnung von Geruchseindrücken und -intensitäten zu einzelnen Peaks sowie deren Identi-

fizierung (über MS, Referenzsubstanz, Kovatsindex)

(Semi-)Quantifizierung der geruchsaktivsten Substanzen (10) anhand des Externen Stan-

dards.

Vergleichen Sie die erhaltenen GC-O Daten mit Daten aus der Literatur (die 10 aromaaktivs-

ten Verbindungen)

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Literatur

Drawert F, Rapp A (1968) Gas-Chromatographische Untersuchung pflanzlicher Aromen. Chromatogra-phia 1: 446-457

Drawert F, Heimann W, Emberger R, Tressl R (1969) Gas-Chromatographische Untersuchung pflanzli-cher Aromen II. Anreicherung, Trennung und Identifizierung von Apfelaromastoffen. Chromato-graphia 2: 57-66

Acree TE, Barnard J, Cunningham DG (1984) A procedure for the sensory analysis of gas chromato-graphic effluents. Food Chem. 14: 273-286

Grosch W (1993) Detection of potent odorants in foods by aroma extract dilution analysis. Trends Food Sci. Technol. 4: 68-73

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2 Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC/UPLC)

2.1 Einführung in die Bedienung einer HPLC-/UPLCAnlage und des zugehörigen Da-

tenverarbeitungssystems [Seminare an den Geräten]

2.2 Theoretische Grundlagen der Flüssigchromatographie (Aufbau, Säulen, Trenn-

phasen, Detektoren, Trennleistung, LOD, LOQ), [Kolloquium vor den Versuchen!]

2.3 Bestimmung von Aminosäuren

Prinzip

Aminosäuren (AS) werden vor der HPLC-Analytik mit oPA (ortho-Phthaldialdehyd) / FMOC (9-

Fluorenylmethyloxycarbonylchlorid) derivatisiert, mittels HPLC/UPLC aufgetrennt und mit FD

(Fluoreszenzdetektion) nachgewiesen (Theorie der OPA/FMOC-Derivatisierung siehe Gey

(2008), Lottspeich (2006)). Die Zuordnung der Peaks anhand der Retentionszeit erfolgt durch

Injektion der einzelnen Aminosäuren, bzw. deduktiv. Aus der AS-Stammlösung wird eine Kalib-

riergerade erstellt, und deren Regressionsparameter bestimmt. Das zu analysierende AS-

Hydrolysat wird mittels enzymatischer Spaltung über Nacht (20 h) aus Lysozym oder Casein

hergestellt, verdünnt und mittels RP-HPLC vermessen. Außerdem werden die AS einer unbe-

kannten Probe analysiert (wird vom Assistenten bereitgestellt). Es erfolgt eine qualitative und

quantitative Zuordnung der einzelnen AS. Es wird mit internem und externem Standard gearbei-

tet.

Durchführung

Enzymatische Proteinhydrolyse:

Es wird eine Dreifachbestimmung durchgeführt. Hierzu werden jeweils 20 mg Sub-

strat (Casein oder Lysozym) in 2 mL Tubes eingewogen. Anschließend mit 1 mL

100 mM Natriumacetatpuffer (pH 6) und x µL Enzympräparat (vom Assistenten be-

reitgestellt) und (1000-x) µL H2O versetzt (Konzentrationen im Ansatz: 10 mg/mL

Substrat, 50 mM NaAc). Diese Ansätze werden für 20 h bei 37 °C im Thermosha-

ker inkubiert. Zum Zeitpunkt t = 0 min und t = 20 h werden Proben gezogen. Die

Enzyme werden durch Hitze inaktiviert (20 min, 99 °C). Die Proben werden mit

bidest. H2O verdünnt (Rücksprache mit Assistenten, ca. 1:50), membranfiltriert

und, wie unten beschrieben für die RP-HPLC vorbereitet. Diese Verdünnungen

sind jeweils 1:2 (1+1) mit der IS-Lösung (200 µM) zu versetzen (ergibt IS = 100 µM

und eine weitere Verdünnung für das Hydrolysat).

Standards und HPLC:

Für folgende Lösungen wird als Lösungsmittel immer bidest. H2O verwendet.

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Es wird eine AS-Stammlösung vom Assistenten ausgeteilt, die jede AS in einer

Endkonzentration von je 1,25 mM enthält.

Als interner Standard (IS) wird Glutamylglutamat verwendet. 100 ml einer 2 mM

Lösung ansetzen und diese 1:10 (1+9) verdünnen (≙ 200 µM, IS-Lösung)

Stellen Sie eine Verdünnungsreihe der Stammlösung für die Kalibrierung mit den

Endkonzentrationen 20 µM, 50 µM, 80 µM, 110 µM sowie 140 µM her.

Diese Verdünnungen jeweils 1:2 (1+1) mit der IS-Lösung versetzen (ergibt IS =

100 µM und AS mit jeweils der Hälfte der angegebenen Konzentration)

OPA-Methode

Je Vial: 10 µl Probe (filtriert) oder Kalibrierlösungen mit IS

110 µl Kaliumboratpuffer (KB: 0,5 M, pH 10; dafür

50 mmol Borsäure einwiegen, lösen mit ca. 90 ml

H2O, pH auf 10 mit 3 M KOH einstellen und ad

100 ml auffüllen.)

Derivatisierung via Autosampler: 20 µl OPA-Reagenz (100 mg OPA ad 1 ml KB; 9 ml

MeOH zugeben, sowie 100 µl

Mercaptopropionsäure)

Die Mischung wird 120 s derivatisiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 50 µl 1M

Essigsäure gestoppt und 20 µl in die HPLC injiziert.

Die derivatisierten AS sind in der Lösung max. 15 min. stabil und beginnen sich an-

schließend schnell zu zersetzen. Deshalb wird die Derivatisierung der Proben direkt

vor der Messung automatisiert vom Autosampler durchgeführt.

Als Eluenten (Gradientenelution) dienen:

Eluent A:

0,1 M Na-Acetat (16,4 g NaAc bzw. 27,216 g NaAc 3 H2O ad 2000 ml H2O; 880 µl Triethylamin

zugeben und auf pH 6,5 (mit 1 M CH3COOH) einstellen und durch 0,45 µm Filter membranfiltrie-

ren im 3. OG)

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Eluent B:

100 % Methanol

Den Gradienten entnehmen Sie der Software an der HPLC-Anlage (Den Gradienten bitte im

Protokoll angeben!).

Säule: Macherey + Nagel Nucleodur C18 Pyramid 5 µm, 4 mm 250 cm

Fluoreszenzdetektor: (RF-10AXL, Shimadzu): Anregungswellenlänge 330 nm, Detektionswel-

lenlänge 460 nm

HPLC-Anlage: Shimadzu HPLC-Anlage mit SCL-10AVP Systemcontroller, und LC-10AT HPLC

Pumpen

FMOC-Methode

Derivatisierung

FMOC Derivatisierung

Substanz Menge in µl

Probe 150

KB-Pufffer 150

FMOC (0,001M) 50

ADAM 50

Gesamt 380

KB-Puffer = Kaliumboratpuffer (siehe oben unter oPA-Methode) ADAM = Adamantanaminhydrochloride

Als Eluenten (Gradientenelution) dienen:

Eluent A:

50 mM Natriumacetat, pH 7,2 (mit einer Spatelspitze Natriumazid versetzen und durch 0,45 µm

Filter membranfiltrieren)

Eluent B:

100 % Acetonitril

Den Gradienten entnehmen Sie der Software an der UPLC-Anlage (Den Gradienten bitte im

Protokoll angeben!).

Säule: Phenomenex Luna C18 3 µm, 2 mm 150 cm

Fluoreszenzdetektor: (Jasco): Anregungswellenlänge 254 nm, Detektionswellenlänge 313 nm

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UPLC-Anlage: Jasco Komplett-Anlage mit Systemcontroller, Autosampler, 2 UPLC Pumpen,

Hochdruckmischkammer, Säulenofen, UV-VIS und Fluoreszenzdetektor.

Auswertung

Erstellen Sie eine Kalibiergerade für L-Glutaminsäure, indem Sie den Peak einmal

über die Fläche und einmal über die Höhe auswerten. Welche Methode ist wann zu

bevorzugen?

Identifizieren und Quantifizieren Sie die Aminosäuren in der ausgegebenen Probe.

Ermitteln Sie anhand Ihrer Kalibriergeraden den Gehalt der einzelnen Aminosäuren

in den Hydrolysaten.

Frage: Wieso kann kein Prolin nachgewiesen werden?

Literatur

Fehrenbach T (2007) Analyse von Aminosäuren, Proteinen und Nitroderivaten in atmosphärischen Aerosolen und in Straßenstaub. Technische Universität München, München

Gey MH (2008) Instrumentelle Analytik und Bioanalytik : Biosubstanzen, Trennmethoden, Strukturanalytik, Applikationen, Ed 2. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg

Lottspeich F, Engels JW (2006) Bioanalytik. Elsevier (Spektrum Akademischer Verlag), Heidelberg

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3 Fundamentals in Mass Spectrometry

(Ionisation modes, coupling techniques, structure elucidation)

3.1 Seminar

3.1.1 Introduction:

3.1.2 MS-Analysers:

Sectorfield-, Quadrupole-, Ion-Trap, TOF-Instruments, MS/MS, MSn

3.1.3 Ionisation modes and coupling (hyphenated) techniques:

EI, CI, APCI, ESI, MALDI; GC-MS, LC-MS

3.1.4 Interpretation of mass spectra: Discussion of the GC-MS results of the flavour analysis

3.2 Demonstration courses

3.2.1 GC-MS (EI,CI, MS/MS), demonstration

3.2.2 LC-MS (ESI, APCI, MS/MS), demonstration

3.2.3. Identification of proteins: Nano-LC-QTOF analysis of tryptic peptides (Mascot Search)