Instrumentelle Arzneistoffanalytik - WS 2016(Wolfgang Holzer)

empfehlenswerte Literatur:

Hesse - Meier - Zeeh; Spektroskopische Methoden in der organischen Chemie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 9. Auflage, 2016

G. Rücker, M. Neugebauer, G. G. Willems; Instrumentelle pharmazeutische Analytik, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart, 5. Auflage, 2013

A. Dominik, D. Steinhilber; Instrumentelle Analytik, Deutscher Apotheker Verlag, Stuttgart, 2002

J. B. Lambert, S. Gronert, H. F. Shurvell, D. A. Lightner; Spektroskopie - Strukturaufklärung in der organischen Chemie, Pearson, München, 2. Auflage, 2012

Instrumentelle Analytik

●●●● Spektroskopische und optische Methoden

●●●● Elektrochemische Methoden

●●●● Chromatographische Methoden

Pharmazeutische Analytik

●●●● Überprüfung und Charakterisierung von Arzneistoffen,Arzneizubereitungen, Ausgangsmaterialien, Zwischen-produkten mit dem Ziel der ‚Arzneimittelsicherheit‘

Beschreibende Qualitätsmerkmale:

Identität - Reinheit - Gehalt (= Konzentration)

●●●● Arzneistoffsynthese

●●●● Strukturaufklärung

●●●● Pharmakon-Rezeptor Wechselwirkungen

u.a.

Beurteilung (Validierung) analytischer Methoden

●●●● Präzision (Grad der Reproduzierbarkeit)

●●●● Richtigkeit (Abweichung wahrer Wert – Mittelwert)

●●●● Nachweisgrenze (Grenzkonzentration)

●●●● Selektivität/Spezifität (auch in für Bestimmung in einer ‚Matrix‘geeignet?)

●●●● Linearität

●●●● Empfindlichkeit (Anzeigen möglichst geringer Konz.änderungen)

●●●● Bestimmungsbereich

●●●● Robustheit (Störanfälligkeit)

System (Atome, Moleküle)

Störung

Prinzip einer spektroskopischen Methode

Reaktion

Response

Störung: meist elektromagnetische Strahlung

Spektroskopische Methoden

Anregung

E1

E2

Ene

rgie

Zurückfallen in denGrundzustand

unter Abgabe von Strahlung

strahlungslos(Umwandlung der Anregungsenergie

in Wärme)messen kann man:

� das Ausmaß der Energieaufnahme bei der Anregung (die Absorption)

� die Strahlungsabgabe beim Zurückfallen in denGrundzustand (die Emission)

Absorption, Emission

Klassifizierung spektroskopischer Methoden

Absorptionsspektroskopie:

●●●● AAS (Atomabsorptionsspektroskopie, atomic absorption)

●●●● UV/VIS (Ultraviolett-Sichtbar Sp., ultraviolet / visible)

●●●● IR (Infrarot Sp., infrared)

●●●● NMR (Kernresonanzspektroskopie, nuclear magnetic resonance)

Emissionsspektroskopie:

●●●● Fluorimetrie (Fluoreszenzspektroskopie, fluorescence sp.)

●●●● AES (Atomemissionssp. = Flammenphotometrie, atomic emission)

Sonderstellung: MS (Massenspektrometrie, mass spectrometry)

Röntgenstrukturanalyse (X-ray structure analysis)

Zusammenhang zwischen Energie, Wellenlänge und Frequenz

E: Energie (J) h: Planck'sches Wirkungsquantum (6.625•10-34 Js)

νννν: Frequenz (s-1 = Hz (Hertz) = cps (cycles per second))

c: Lichtgeschwindigkeit (2.9979 •108 ms-1)

λλλλ: Wellenlänge (m)

νhE •=λ

cν =

λ

chE

•=

Elektromagnetisches Spektrum

10 102 103 104 105 106 107 108 109λλλλ in nm

1 m1 µµµµm 1 cm

Röntgen UV VIS IR Mikrowellen Radiowellen

Änderung der Elektronenverteilung

Änderung der Schwingungs-zustände

Änderung der Rotationszustände Elektronenspins Kernspins

UV/VISSpektr.

IR-Spektr.Raman-Spektr.

Mikrowellenspektr.Elektronenspinresonanz

NMR Spektr.

1017 ←←←← Frequenz (Hertz) ←←←← 108

107 ←←←← Energie (J/mol) ←←←← 10-1

λ (nm) 10 200 400420 470 530 580 620 700

750

UV/VIS Sektor des elektromagnetischen Spektrums

Röntgen-strahlen

fernesUV

nahesUV

optischesFenster

Infrarot

10-3 m (milli)

10-6 µ (µ (µ (µ (mikro)

10-9 n (nano) →→→→ z. B. nm

10-12 p (pico)

10-15 f (femto)1Å = 10-10 m

103 K (kilo)

106 M (mega) →→→→ z. B. MHz

109 G (giga)

1012 T (tera)

viol

ett

blau

grün

gelb

oran

ge

rot

Maß

zahl

für

das

Aus

maß

der

Abs

orpt

ion

Maßzahl für die Art der absorbierten Strahlung (λλλλ)

Absorptionsmaxima

λλλλmax λλλλmax

UV/VIS Absorptionskurve - schematisch

Absorptionsminimum

Elektronenübergänge und Strahlungsprozesse

E1

E2

E1

E2

Abs

orpt

ion

Em

issi

on

hνννν hνννν� �

∆∆∆∆E = E2 - E1 = hνννν

T: TransmissionE: Extinktion (auch Absorption A = absorbance, bei d=1 auch optische Dichte OD)E = A darf nicht mit der prozentualen Absorption (I0-I)/I0 •100 verwechselt werden!

Definition von Transmission und Extinktion

Probe

d

I 0 Id: Schichtdicke in cm

I 0: Intensität der Strahlung vor der Probe

I : Intensität der Strahlung nach Passage der Probe

0II

T =T1

logII

logE0 ==

LAMBERT-BEER'sche Beziehung

E = εεεε •••• c •••• d

E = Extinktionεεεε = molarer Extinktionskoeffizient (= molar

absorbance index = molar absorptivity)c = Konzentration (mol/l)d = Schichtdicke (cm)

E = ΕΕΕΕspez•••• c •••• d

E = ExtinktionEspez= spezifische Extinktion = spezifischer

Extinktionskoeffizient = Absorptivity = A1%

1cmc = Konzentration (g/100 ml)d = Schichtdicke (cm)

Zusammenhang zwischen εεεε und Espez:ewichtMolekularg

ε10Espez

•=

Lambert – Beer:

• Gilt streng nur für monochromatisches Licht

• Gilt streng nur für verdünnte Lösungen (c ≤ 10-2 mol/l) – bei höheren Konzentrationen erfolgt Abweichung von der Linearität

• Lösung muss klar sein → keine Suspensionen oder Kolloide, die Schwächung der Strahlung muss ausschließlich durch Absorption verursacht sein

Elektronenübergänge - Jablonski-Termschema

Strahlungsprozesse:A AbsorptionF FluoreszenzPh Phosphoreszenz

Strahlungslose Prozesse:IC internal conversionISC intersystem crossing

S0

S1

S2

S3

T1

T2

A A F

PhISC

ISC

IC

IC

S1, S2, .. Singulett-Zustände T1, T2, .. Triplett-Zustände

Franck-Condon Prinzip: während des Übergangs (nur 10-15 s !!!) bleiben Molekülparameter (Bindungslängen, Bindungswinkel, Konformation, …) erhalten

Absorption und Fluoreszenz als Übergänge zwischen elektronischen Schwingungs- (νννν') und Rotationsniveaus (J')

S0

S1

ν''=0

ν''=1

ν''=2

ν''=3

ν'=0

ν'=1

ν'=2

ν'=3

J'

J'

J'

J''

J''

J''

A F

R

R

→ UV/VIS-Spektren sind Bandenspektren!

Molekülorbitale•••• wie in Atomen befinden sich in Molekülen die Elektronen auf genau

festgelegten Bahnen (Molekülorbitale, MO)

•••• core-Orbitale (innere e-): sind für UV/VIS nicht interessant (E zu hoch), bei UV/VIS werden Bindungselektronen angeregt

•••• σσσσ-Orbitale: enthalten e- der Einfachbindungen zwischen den Atomen, durch Überlappung von Atomorbitalen entlang der Bindungsachse

•••• σσσσ∗-Orbitale: antibindendes σσσσ-Orbital, hohe Energie

•••• ππππ-Orbitale: enthalten e- der Doppel- und Mehrfachbindungen zwischenden Atomen, durch Überlappung von Atomorbitalen senkrecht zurBindungsachse; ππππ∗-Orbitale: antibindende ππππ-Orbitale

•••• n-Orbitale: enthalten e- der freien, nicht bindenden Elektronenpaare(lone-pairs), z.B. O, N, S Atome

•••• HOMO: h ighest occupied molecular orbital LUMO: l owestunoccupiedmolecularorbitalHOMO-LUMO Übergang ist energieärmster (= längstwelliger) Übergang

•••• Quantenmechanische Auswahlregeln legen fest, ob ein Übergang 'erlaubt'(hohe Wahrscheinlichkeit) oder 'verboten' (niedrige Wahrscheinlichkeit) ist

Quantenmechanische Auswahlregeln

Die meisten der prinzipiell möglichen Elektronenanregungen finden nicht statt → ‚verbotene Übergänge‘ welche Übergänge verboten sind legen die Auswahlregeln fest

Spin-Verbot: Multiplizität darf sich während der Anregung nicht ändern, d. h. nur S → S bzw T → T möglich, nicht aber S → T oder T → S

Überlappungsverbot: bei der Anregung eines Elektrons von einem Orbital in ein anderes müssen sich die betreffenden Orbitale überlappen, sind sie zu weit voneinander entfernt kann der Elektronen-Transfer nicht erfolgen

Paritätsverbot (Regel von Laporte): bei Molekülen mit Punktsymmetrie (z.B. Benzol, Ethen) sind nur Übergänge zwischen solchen Orbitalen möglich, die unterschiedliche Symmetrie-Eigenschaften bzgl. des Symmetriezentrums aufweisen

Symmetrieverbot: bei nicht punktsymmetrischen Molekülen gilt die Regel von Laporte zwar nicht, aber auch hier aufgrund von Symmetrie-Eigenschaften Verbote möglich

Molekül-Orbitale und Elektronenübergänge

E

σ

π

n

π∗

σ∗

σ σ σ σ →→→→ σσσσ*

n →→→→ σσσσ*

π π π π →→→→ ππππ*

n →→→→ ππππ*

λ (nm)

Absorptionsbereiche der verschiedenen Elektronen-Übergänge

Vakuum-UV UV VIS

σσσσ →→→→ σσσσ*

n →→→→ σσσσ*

ππππ →→→→ ππππ*

ππππ →→→→ ππππ* (konjugierte Systeme)

n →→→→ ππππ*

n →→→→ ππππ* (konjugierte Systeme)

200 400 750

Absorption einfacher, nicht-konjugierter Chromophore

ChromophorBezeichnungdes Überganges λmax (nm)

σ-Elektronen

einsame Elektronenpaare (lone-pairs, non-bonding)

C C und C H

O

N

S

C O

C C (isoliert)

π-Elektronen

C O

σ → σ*

n → σ*

n → σ*

n → σ*

n → σ*

n → π*

π → π*

≤ 150

~ 185~ 195

~ 195

~ 300

~ 190

~ 190

E

HOMO

LUMO

λmax = 175 nmε = 15 000

λmax = 217 nmε = 21 000

λmax = 258 nmε = 35 000

Absorptionsmaxima und molare Extinktionen kongugierter Diene

π

π*

λmax ~ 175 nm

ε ~15 000

E

ππππ →→→→ ππππ* Absorption von Alkenen

π → π*

ββββ-Carotin

11 Doppelbindungen

λmax 460 nm (ε 139 000)

ββββ-Carotin

UV/VIS - wichtige Begriffe

Chromophor: Gruppe mit (leicht) anregbaren Elektronen aus π oder n-Orbitalen (z.B. C=C–C=C)

Auxochrom: Gruppe mit lone-pair, welche - in Konjugation mit einem Chromophor - dessen UV/VIS-Absorption in den langwelligen Bereich verschiebt (z.B. OH, NH2)

bathochromer Effekt (shift): 'Rotverschiebung', Absorptionsmaximum zu größeren Wellenlängen hin verschoben

hypsochromer Effekt (shift): 'Blauverschiebung', Absorptionsmaximum zu kleineren Wellenlängen hin verschoben

NH2

ππππ ππππ* n ππππ*ca. 190 nm ca. 230 nm

H+

NH3

ππππ ππππ*ca. 190 nm

+

bathochromershift

hypsochromershift

kein lone-pair mehr vorhanden, daher kein n ππππ* mehr möglich

hypochromer Effekt: Erniedrigung der Absorptionsintensität (ε wird kleiner) hyperchromer Effekt: Erhöhung der Absorptionsintensität (ε wird größer)

Absorptionsspektrum von Benzol

254 nm

βp

α

Charakterisierung von Banden: Lage, Intensität, Form, Feinstruktur

λ (nm)

Absorptionskurven anellierter Benzole

Absorptionskurven Benzol - Benzoesäure - Zimtsäure

Absorptionscharakteristika monosubstituierter Benzole(Lösungsmittel: Wasser)

λλλλmax εεεεPh-H 254 204

Ph-CH3 260 300

Ph-OH 270 1450

Ph-O- 287 2600

Ph-OCH3 269 1480

Ph-OCOCH3 258 250

Ph-NH2 280 1430

Ph-NH3+ 254 160

Ph-COOH 273 970

Vergrößerung des Chromophors durch intramolekularen charge-Transfer (elektronenabziehender und elektronenschiebender Substituent in para-Stellung am Benzolring)

λmax 375 nm

Nitrobenzol: λmax 269 nmAminobenzol: λmax 280 nm1,4-Dinitrobenzol: λmax 260 nm

Elektronen-Donor-Akzeptor-Komplexe (EDA-Komplexe)

OH

OH

O

O

O

O

O

O

H

H

farblos gelb grün

Konjugation, π-Systeme, Farbe……….

Indigo (Bluejeans)λmax 606 nm (EtOH)

Purpur

1,4-Benzochinon (gelb)λmax 434 nm (Benzol, ε = 20)

1,2-Benzochinon (rot) λmax 610 nm (Benzol, ε = 20)

Derivativspektroskopie

Isosbestischer Punkt

Die Absorptionskurven von Verbindungen mit dissoziierbaren auxochromen Gruppen sind stark vom pH-Wert abhängig. Es existiert aber eine Wellenlänge, bei der die Absorption nicht vom pH beeinflusst wird. Dort befindet sich der Schnittpunkt aller dieser Spektralkurven (isosbestischer Punkt).

Aufbau eines Absorptionsspektrometers

Empf.I

I 0

A (E)

T

Lichtquelle Spalt Monochromator KüvetteSpalt Empfänger

Probe+ LM

reinesLM

Lichtquelle: UV: Wasserstoff-Gasentladungslampe, Vis: Wolfram-Halogen-GlühlampeMonochromator: Prisma oder optisches GitterSpalt: je schmäler, desto monochromatischer, aber auch desto weniger Licht wird durchgelassen → so klein wie nötig, aber so groß wie möglichKüvetten: UV: nur Quarz geeignet (Glas nur für λ > 300 nm durchlässig)

Photometrische Bestimmung von zwei Stoffen (A, B) nebeneinander

E

λλ2

E(λ1)

E(λ2)

Stoff A Stoff B

Mischung A+B

E = ε • c • d Eges.= EA + EB

E(λ1) = εA(λ1) • cA + εB(λ1) • cB

E(λ2) = εA(λ2) • cA + εB(λ2) • cB

εA(λ1), εA(λ2), εB(λ1), εB(λ2) sindvorher ermittelte Stoffkonstanten(bzw. sind tabelliert)

E(λ1), E(λ2) werden gemessen (Gesamtextinktionen)

2 Gleichungen mit 2 Unbekannten

λ1

Probenvorbereitung und Spektrenaufnahme

• Aufnahme in Lösung, c ~ 10-4 mol/l

• Verwendung optisch reiner Lösungsmittelab 195 nm: Pentan, Hexan, Heptan, Cyclohexan, Wasser, Acetonitrilab 210 nm: Methanol, Ethanol, DiethyletherDichlormethan (>220 nm), Chloroform (>240 nm), Tetrachlormethan (>260 nm)ab 280 nm: Benzol, Toluolab 310 nm: Pyridin

• Lösungsmittel mit Eigenabsorption im Messbereich sind ungeeignet!

• Das Lösungsmittel kann erheblichen Einfluss auf die Lage und das Aussehen der Banden haben (z.B. beim Wechsel unpolares LM → polares LM: bathochrome Verschiebung von π→π*, hypsochrome Verschiebung von n→π*)

Kalibriergerade zur quantitativen Bestimmung

A

c (%)gesuchte Konzentration cx

abg

eles

ene

Ab

sorp

tion

A x

abgelesene Absorptionen für Lösungen mit bekannter, verschiedener Konzentration

Atomabsorptionsspektroskopie (AAS)

Anhebung von Elektronen in höhere Atomorbitale

Serien von Absorptionslinien (Linienspektrum)

H-Atom: Lyman, Balmer, Paschen-Serie

höhere Atome: meist nur wenige, scharfe Linien hoher Intensität

zur Bestimmung mittel AAS wird nur eine einzige Linie hoher Intensität verwendet (Resonanzlinie) → ‚Resonanzanregung‘

sehr hohe Spezifität, hohe Empfindlichkeit → Spurenanalyse

Auswertung via modifiziertes Lambert-Beer (Kalibrierung unbedingt nötig)

Atomabsorptionsspektrometer (AAS-Gerät)

Monochromator Detektor

Hohlkathodenlampe Atomisierungseinrichtung

Brenner

Anode Hohlkathode

Zweistrahlgeräte: I0Glasschild

Pressluft

Probe

Zerstäuber

Brenngas

Atomabsorptionsspektroskopie (AAS)

E = εεεε • c • l • f

E Extinktionεεεε Extinktionskoeffizientc Atomdampfkonzentrationl Atomreservoirlänge = Länge der Flammef Wirkungsgrad des Atomisierungsprozesses =

Ausmaß, in dem aus dem entsprechenden Salz Atome frei werden (abhängig von der Flammen-temperatur, von der Zusammensetzung des Brenngases u.v.a.)

es gehen viele Gerätekonstanten einEichkurve notwendig!

mittels AAS werden häufig bestimmt:

Al, As, Pb, Cd, Cr, Cu

Li, Na, Ni, Hg, Zn

Flammenphotometrie

Flammenphotometer (AES-Gerät)

Probe

Pressluft

Brenngas

Zerstäuberkammer

Zerstäuber

Hohlspiegel

Mono-chromator

Detektor

angeregte Atome

Brenner

für: Ba, Pb, Cu, Ag,

Li, Na, K, Ca, Ag

sehr empfindliche Methode (Spurenanalyse)

die Flamme muss eine bestimmte Temperatur aufweisen!

AES - verschiedene Anregungseinheiten

Direct-current plasma (DCP)

Flame

Inductively coupled plasma (ICP)

Laser-induced breakdown (LIBS)

Laser-induced plasma

Microwave-induced plasma (MIP)

Sparc or arc

ICP

Anregungsspektrum und Fluoreszenzspektrum

S1

S0

Energie

Absorptions-intensität

Fluoreszenz-intensität

Anregungs-spektrum

Fluoreszenz-spektrum

λ

νννν = 0

1

43

2

1

43

2

νννν = 0

Definitionen - Fluorimetrie

F Anzahl der emittierten Photonen ϕ = = —————————————— ≤ 1

Iabs Anzahl der absorbierten Photonen

ϕϕϕϕ: Quantenausbeute der Fluoreszenz F: Intensität der FluoreszenzstrahlungI abs: Intensität der absorbierten Strahlung

F = k • I0 • ϕϕϕϕ • εεεε • c • d

k: Gerätekonstante (Eichkurve notwendig!) I 0: Intensität der Anregungsstrahlung εεεε: molarer Extinktionskoeffizient bei λ der Anregung (Absorptionsspektrum!) d: Schichtdicke c: Konzentration

• fluoreszenzfähig sind meist starre, planare Moleküle (größere Doppelbindungssysteme, (Hetero)Aromaten, Carbonylverbindungen)

• Fluoreszenzstrahlung ist immer langwelliger alsAnregungsstrahlung

• Fluoreszenzstrahlung ist immer viel schwächer als Anregungsstrahlung

• Einfluss des Lösungsmittels, von Gegenionen etc.

• oft Verwendung von Fluoreszenzmarkern (z.B. aromatische Sulfonsäurechloride – reagieren mit Aminen)

• Fluoreszenzdetektoren in der HPLC!

• sehr empfindliche Methode, zu quantitativen Bestimmungenin sehr niedrigen Konzentrationsbereichen geeignet (ppb-Bereich, 1 mg Substanz / Tonne Probe!)

Aufbau eines Fluorimeters

LichtquelleAnregungs-

monochromator Küvette

Emissions-monochromator

Absorptions-empfänger

Absorptions-monochromator

Emissions-empfänger

Substanz

Absorptions-spektrum

Emissions-spektrum

90°

IR-Spektroskopie (Schwingungsspektroskopie)

• die IR-Spektroskopie erfasst Molekülschwingungen

• IR-aktiv sind Schwingungen, bei denen sich das Dipolmoment

des schwingenden Moleküls verändert (vollständig symmetrische

Schwingungen sind IR-inaktiv → Raman Spektroskopie)

• je größer die Polaritätsunterschiede der Schwingungspartner desto

intensiver die damit verbundenen Banden (z. B. C-O, C-N)

• 'normaler' IR-Bereich: 2.5 - 50 µm ⇒ 4000 - 200 cm-1

Wellenzahl ν: reziproker Wert der in cm ausgedrückten Wellenlänge (Vorteil: direkt proportional zu Frequenz und Energie)z. B.: λ = 20 µm = 20 • 10-6 m = 20 • 10-4 cm =

500 cm-1

∼

==⇒= 2

1000 ν cm

10002

cm 000 10

20 ∼

Molekülrest

C

OH

Schwingungen und Absorptionen der alkoholischen Hydroxyl-Funktion

C – O – H bending (in plane)1500 - 1200 cm-1C – O stretching

1200 - 1000 cm-1

O – H stretching3700 - 3000 cm-1

C – O – H bending (out of plane, Γ)650 - 250 cm-1

Valenzschwingung:entlang der Bindungsachse(Änderung im Abstand)z.B. νC–O, νO-H

DeformationsschwingungTorsionsschwingung:Veränderung im Bindungswinkeloder Torsionswinkelz.B. δC–O–H(in plane)

Potentialkurve des anharmonischen Oszillators

Eo: Nullpunktsenergie; ED: DissoziationsenergieGrundschwingung: n=0 → n=1 (hohe Wahrscheinlichkeit)Oberschwingungen: n=0 → n=2, n=3, usw. (abnehmende Wahrscheinlichkeit)

Ein Molekül mit N Atomen besitzt n = 3 • N (Bewegungs)freiheitsgradeDavon entfallen 3 auf Translationen (entlang x, y, z) und 3 auf Rotationen (um x, y, z) → es verbleiben 3N-6 Möglichkeiten für Schwingungen (lineare Moleküle 3N-5) → Normalschwingungen

Größere Moleküle besitzen sehr viele mögliche Normalschwingungen

Wasser: 3 Atome → 3 • 3 – 6 = 3 Normalschwingungen

Normalschwingungen (Grundschwingungen)

ννννsym ννννasymδsym

Hook'sches Gesetz

m1

m2

r0x1 x2

m1

m2

K = - k • ∆r(Auslenkung ∆r = x1 + x2)

µ

k2π1

νosc =

k = Kraftkonstanteνosc= Schwingungsfrequenz des

Oszillators

Massereduziertemmmm

µ21

21 =+•=

K = rücktreibende Kraft

Abhängigkeit der Schwingungsfrequenz von der Bindungsstärke:

Abhängigkeit der Schwingungsfrequenz von der Masse der Atome:

C – C 1000 cm-1

C = C 1640 cm-1

C ≡ C 2200 cm-1

C – H 3000 cm-1

C – Br 650 cm-1

IR - charakteristische Gruppenfrequenzen - Einfachbindungen

C – HAlkane: 2850 - 2960Alkene: 3010 - 3100Aromaten: 3010 - 3040Alkine: ~ 3300

N – H ~ 3400 - 3600 cm-1

meist schärfer und weniger intensiv als OH

O – H freies OH: ~ 3600 scharf (selten!)OH in H-Brücken: ~ 3400 - 2500cm-1 (je nach Stärke der H-Brücke)OH ist fast immer in H-Brücken eingebunden!je stärker die H-Brücke, desto länger die OH-Bindung

desto kleinere Wellenzahldesto intensiver die Bandedesto breiter die Bande

intermolekular H-Brücken sind konzentrationsabhängig,

intramolekulare weitgehend konzentrationsunabhängig

~ 3000 cm-1

(meist relativ schwach)

OH

Bildung von H-Brücken ist sterisch behindert → ‚freies‘ OH

IR - charakteristische Gruppenfrequenzen - Dreifachbindungen

C ≡≡≡≡ C

C ≡≡≡≡ N

~ 2100 - 2300(Intensität variabel, abhängig von derStruktur des restlichen Moleküls)

– C ≡ C – 2150 - 2260– C ≡ C –H 2100 - 2140

~ 2200 - 2300(manchmal schwach oder abwesend)

Im Bereich 2100-2300 cm-1 auch kumulierte Doppelbindungen: Isocyanate (R-N=C=O), Isothiocyanate (R-N=C=S), Ketene (R1R2C=C=O), Carbodiimide (R-N=C=N-R‘), Azide (R-N3), Diazoalkane (R2CN2), usw.

IR - charakteristische Gruppenfrequenzen - Doppelbindungen

C = O ~ 1620 - 1850 cm-1, sehr wichtig!

1) abhängig von der Elektronegativität von Substituenten X ander Carbonylfunktion - je größer EN von X, desto größer νC=O

Aldehyd R-CO-H ~ 1720 - 1740Keton R-CO-R' ~ 1705 - 1725Carbonsäureester R-CO-OR' ~ 1735 - 1750Carbonsäure R-CO-OH ~ 1760 (Monomer, sehr selten!)Carbonsäurechlorid R-CO-Cl ~ 1790 - 1815

2) abhängig von Konjugationseffekten - in α,β-ungesättigtenC=O Funktionen ist νC=O um ca. 20 - 40 cm-1 kleiner

gesättigtes Keton R-CO-R' ~ 1705 - 1725 α,β-ungesättigtes Keton R-CO-CH=CH-R' ~ 1665 - 1685Aryl-Keton R-CO-Aryl ~ 1680 - 1700

R = jeweils Alkyl!!!

IR - charakteristische Gruppenfrequenzen - Doppelbindungen

C = O

3) bei cyclischen Carbonylverbindungen ist νC=O abhängig von derRingspannung(Ringgröße) ⇒ zunehmende Ringspannungführt zu erhöhter Frequenz von νC=O

1780 1750 1725 - 1700 (wie offenkettigesKeton)4) νC=O stark abhängig von H- Brückenbindungen

H-Brücke führt zu Verschiebung von ~ 40 - 60 cm-1 zu kleineren Wellenzahlen Carbonsäure: Momomer ~ 1760 Dimer (üblicherweise vorliegend) ~ 1725 - 1700

weitere Doppelbindungen

C=C: Alkene (nicht konjugiert): 1620-1680 cm-1

α,β-ungesättigte Carbonylverbindungen: 1590-1640 cm-1

Diene, Triene: 1600, 1650 cm-1

Aromaten: 2-3 Banden 1500-1600 cm-1

C=N: 1640-1690 cm-1

C=S: 1050-1200 cm-1

NO2: 1350 und 1560 cm-1 (sym. und asym. Valenzschwingung)

IR-Spektrum von Salicylsäuremethylester

Wellenzahl ν (cm-1)∼0

50

100

4000 3000 2000 1000 5001500

Bereich der funktionellen Gruppenhauptsächlich Valenzschwingungen meist gut interpretierbar

Fingerprint-Bereichhauptsächlich Deformations-und Gerüstschwingungen meist nicht vollständig interpretierbar

O

O

OH

O-H C≡C C=C, C=ON-H C≡N C=N, N=OC-H X=Y=Z N-H Deformation

IR-Spektren von Phenol und Anilin

OH

IR-Spektrum von Benzoesäureamid

NH: oft 2 Banden Amid I: C=O ValenzschwingungAmid II: N-H bending

IR-Spektrum von Cimetidine

Wellenzahl ν (cm-1)∼0

50

100

4000 3000 2000 1000 5001500

NH

N S

NH N

H

NC

NCimetidine

ν(C≡ N)

IR - Aufnahmetechniken Probenvorbereitung für Transmissionsmessungen

• KBr (KCl) Pressling (KBr-disc): häufig verwendet, polar, enthält immer Spuren von H2O → νO-H ∼ 3450 cm-1

• Nujol-Technik (Paraffinöl): apolar, C-H (C-C) Bereich vom Medium überlagert (für Luft- bzw.feuchtigkeitsempfindliche Substanzen)

• in Lösung (NaCl-Zelle): Lösungsmittel z. B. CHCl3, CCl4(Eigenabsorption des LM, Zweistrahlgerät!)

• flüssige (nicht wässrige) Proben: direkt zwischen NaCl Plättchen (liquid film)

• gasförmige Proben in Spezialzellen (Umweltanalytik, GC-IR)

Das Aussehen des IR-Spektrums ein und derselben Substanz ist sehr stark von der verwendeten Aufnahmetechnik abhängig!!!

Reflexionsmessungen

Abgeschwächte Totalreflexion (attenuated total reflexion, ATR)keine Probenvorbereitung nötig, Substanz wird auf Probenträger aufgebracht und mit einer integrierten Pressvorrichtung angedrückt (Vermeidung von Reflexionen im Probeinneren)Bestrahlung schräg von unten mit IR, Messung der abgeschwächten Reflexionsstrahlung (mehrfache innere Reflexion – MIR)

IR - Spektrometer

• Absorptionsspektrometer(ähnlich UV, strahlungsdurch-lässige Bauteile dem IR-Bereich angepasst → Halogenid-Kristalle!)

• FTIR -Spektrometer (Fourier-Transform)• alle Wellenlängen werden gleichzeitig angeregt• man erhält ein Interferogramm (Überlagerung vonSchwingungen, 'Zeitdomäne')

• aus diesem wird durch eine mathematische Operation (Fourier-Transformation) das gewohnte IR-Spektrum erzeugt('Frequenzdomäne' = Frequenz (Wellenzahl) gegen Intensität)

• Vorteil: viel schneller (Kopplung mit chromatographischenVerfahren möglich), empfindlicher (besseres Signal-RauschVerhältnis), hohe Präzision (Eichung mittels Laser)

Strahlungsquelle(Nernst-Stift, SiC-Globar, ..)

stationärer Spiegel

beweglicher Spiegel

Detektor

Strahlenteiler

HeNe LaserApertur

Schlitten

Substanzprobe Vergleichsprobe

FT-IR Spektrometer (Michelson-Interferometer)

FT-IR

Interferogramm Referenz (I0)‚Zeitdomäne‘

Interferogramm Probe (I)

Differenzbildung (I-I0) und Fouriertransformation

IR-Spektrum (‚Frequenzdomäne‘)

1743 cm-1

CH3 O

O

CH3

oder CH3 CH3

O???

CH3

O

O

CH3

oder ???

1688 cm-1

OO

O

O O

1770 cm-1

IR – Resümee

• Nachweis bestimmter funktioneller Gruppen (z.B. C=O)

• routinemäßig bei der Strukturaufklärung

• Pharmazeutische Analytik: Identifizierung von Arzneistoffen (Identitätsprüfung), Reinheitskontrolle

• meist nur qualitativ

• quantitative Bestimmungen zwar möglich, aber ungenauer und mühsamer als bei UV/vis

Massenspektrometrie

• im Massenspektrometer werden Moleküle, die sich im Gaszustand befinden, in energiereiche positive (bzw.negative) Ionen übergeführt → Ionisierung

• die gebildeten energiereichen Ionen zerfallen (zumindestzum Teil) in geladene und ungeladene Bruchstücke → Fragmentierung

• die geladenen Teilchen werden in einem elektrischen Feldbeschleunigt, nach ihrer Massenzahl (m/z) aufgetrennt(meist in einem Magnetfeld) und registriert

• im resultierenden Massenspektrum sind die Massenzahlender (Fragment)-Ionen gegen ihre relative Intensitätdargestellt

• das Massenspektrum gibt meist wertvolle Hinweise auf dieStruktur der untersuchten Substanz

Aufbau eines Massenspektrometers

Einlaßsysteme(Probenzuführung)

Ionenquelle(Ionisierung,

Fragmentierung)

Analysator(Fokussierung)

EmpfängerVerstärkerSchreiber

EDV-System

Substanz

Pumpen10-6 - 10-8 Pa

m/z

rel.Int.

Massenspektrum

Hochvakuum

MS – Probenzuführung – Einlass-Systeme

• Direkt-Einlass ('Schubstange'): beheizbarer Tiegel für festeoder flüssige Proben, wird über Schleusenkammer in dasMassenspektrometer eingeführt, dann wird die Probeverdampft (kombinierbar mit EI, CI, MALDI)

• Direkt-Infusion : Probe wird aus einem Vorratsbehälter über eine Kapillare dosiert und kontinuierlich in das Massenspektrometer eingeführt (besonders für Proben in Lösung bzw. bereits im gasförmigem Zustand)kombinierbar mit EI, CI, Spray-Methodenerlaubt die Kopplung mit chromatographischen Methoden (GC-MS, HPLC-MS)

•GC-MS (GC = Gaschromatographie)für flüchtige Substanzen, GC-Trägergas mittels Jet-Separatorgrößtenteils abgetrennt Kombination einer Hochleistungstrennmethode mit einerHochleistungsanalysenmethode, äußerst leistungsfähig

•HPLC-MS Kombination (HPLC = high performance liquidchromatography)für polare Substanzen, Entfernung der polaren mobilen Phaseund Ionisierung mittels Elektrospray-Verfahren (ESI)

Ionenquelle

Vakuum

GC-Säule

Trägergas+ Substanz

SubstanzTrägergas

Jet-Separator

Ionisierung

• Entreißen eines Elektrons→ es entsteht ein Radikal-Kation der Ladung +1 (Molekül-Ion, M+•), sehr energiereich, fragmentiert stark, hauptsächlich bei EI

• Anlagerung eines Elektrons→ es entsteht ein Radikal-Kation der Ladung -1, weniger wichtig, nur für Moleküle mit hoher Elektronenaffinität (z.B. Halogenverbindungen)

• Protonierung→ durch Anlagerung eines Protons entsteht ein Kation [M+1]+

vorzugsweise an ‚basischen‘ Stellen des Moleküls (Atome mit freien Elektronenpaaren wie Amine, O-Verbindungen), bei CI, ESI, APCI, MALDI (Positiv-Modus); oft auch [M+Na]+

• Deprotonierung→ durch Entfernen eines Protons entsteht ein Anion [M-1]-, bei sauren Verbindungen (Carbonsäuren, Phenole), bei CI, ESI, APCI, MALDI (Negativ-Modus)

Ionisierungstechniken

Auswahl abhängig von • gewünschter Information• den Eigenschaften der Probe

leicht verdampfbare Substanzen(Verdampfungsmethoden)

schwer verdampfbareSubstanzen(Desorptionsmethoden)

Elektronenstoß-Ionisation(electron impact, EI)Chemische Ionisation (CI) → 'weiche' Ionisierungs-technik

Feld-Desorption (FD)Fast Atom Bombardement (FAB)matrix-assisted Laser-Desorption (MALDI)Sekundärionen-MS (SIMS)

Das Aussehen eines Massenspektrums hängt sehr stark von der jeweils verwendeten Ionisierungstechnik ab!

Substanzen in Lösung (Zerstäubungsmethoden)

Elektrospray-Ionisation (ESI)Atmospheric Pressure CI (APCI)Inductive Coupled Plasma (ICP)Desorption Electrospray Ionization (DESI)Atmospheric Pressure Photo Ionization (APPI)

Electron-Impact (EI) Ionisation und Fragmentierung

Molekül A-B-C-D

Molekülion [A-B-C-D]+ •

Ionisierung

Fragmentierung

[B-C-D] + •

Radikal-KationA

NeutralmolekülA •

Radikal[B-C-D] +

Kation

1. Schritt

2. Schritt

[C-D] +

KationB

NeutralmolekülB

Neutralmolekül[C-D] + •

Radikal-Kation

a bHomolyseHeterolyse

Probe wird mit energiereichen Elektronen (70 eV) beschossen

EI-Ionenquelle eines Massenspektrometers

Einlass-System

Ionenquelle

AnalysatorSubstanz-Dampf Ionenstrom

(-) (--)

Beschleunigungs-elektroden

Elektronenstrahl

Filament

Kammer-spannung

Elektronen-auffänger

Ionisation,Fragmentierung

Chemische Ionisation

1) CH4 →→→→ CH4+•••• + e- (Aktivierung des Gases)

2) CH4+•••• + CH4 →→→→ CH5

+ + CH3 ••••

3) CH5+ + M| →→→→ [M+H] + + CH4

Verwendung eines Hilfsgases, z. B. Methan, Isobutan, NH3

150 eV

[M+H] + ist kein Radikalkation → stabiler!

für saure Verbindungen: Verwendung eines basischen Hilfsgases (z.b. NH3) → negativ geladene Ionen [M-H]-

MS-Desorptionsmethoden für polare, schwer flüchtige Verbindungen

Laserenergie-reicheAtome

desorbierte Ionen

Atome an einer Oberfläche(Matrix)

'Energie-puls'durch:

energie-reicheIonen

+

Ionisierungstechniken: FAB (Fast Atom Bombardement)

IonenanalysatorSonde

bombardierender Atomstrahl (Ar, Xe)

desorbierte Ionen

Matrix(z.B. Glycerin) mitgelöster Substanz

metallische Spitze(+kV für Spektren positiver Ionen,-kV für Spektren negativer Ionen)

z.B. für organische Säuren, Polypeptide, Oligosaccharide, OligonucleotideNachteil: Störung durch desorbierte Matrix-Molekül-Ionen

Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)

Probenträger (Stahl, 25 kV)

Laser-Strahl (gepulst)

• Einbettung der Probe in kristalline Matrix (Matrix : Probe ca. 1000 : 1)• Matrix-Moleküle müssen bei der Laser-Wellenlänge absorbieren, werden

dabei photo-ionisiert und übertragen Protonen auf die Probe → [MH] +

• Probenvorbereitung wichtig (Matrix muss für Probe ‚passen‘!)• Messbereich bis MG 1 000 000 (verteilt auf mehrere Bereiche), sehr mild!• üblicherweise Kombination mit Flugzeit-Analysatoren (TOF)

Matrix: z.B. 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB), Sinapinsäure (SA), 3-Hydroxy-picolinsäure (3-HPA), usw.

weitere Desorptionsmethoden

Sekundärionen-MS (SIMS)Durch Beschuss mit energiereichen Ionen (Cs+, Ar+, Ga+) werden aus der Probe, die sich auf einer Metalloberfläche befindet, positive und negative Ionen erzeugt; für Peptide und Oligosaccharide, zur Analyse von Kontaminationen auf Oberflächen

Feld-Desorption: Probe wird von einem aktivierten Draht (beschichtet mit feinsten Kohlenstoff-Nadeln) unter Einfluss starker elektrischer Felder desorbiert

Zerstäubungsmethoden: Elektrospray-Ionisierung(ESI) bei HPLC-MS Kombination

3-6 kV

elektrisch leitender Überzug

MS

geladenes Aerosol

DesolvatisierungIonen-Emission

freie Ionen

HPLC

Spray-Gas (N2)

heißes Trockengas(N2)

Ablauf für Gas- und Lösungsmitteldampf

N2

weitere ZerstäubungsmethodenAtmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)Ähnlich ESI, aber keine Spannung auf der Spraykapillare, Ionisierung des Dampfgemisches (Probe plus N2) via Entladungsnadel Vorteil gegenüber ESI: auch für apolare Verbindungen; Nachteil: höhere thermische Belastung

Inductive Coupled Plasma (ICP)für Bestimmung von Elementen, Eluat trifft unter Inertgas auf ca. 10 000 °C heiße Fackel, Zersetzung in atomare Bestandteile, Bildung von Atom-Ionen

Desorption Electrospray Ionization (DESI) Oberflächenanalyse (z.B. DC-Platten); geladene LM-Tröpfchen werden auf Versuchsfläche gesprayt

Atmospheric Pressure Photo Ionization (APPI)ähnlich APCI, Ionen werden aus dem Spray durch Bestrahlung mit UV-Lampe erzeugt, für lipophile, unpolare Substanzen

101 102 103 104 105 106

ionisch

unpolar

EI

CI

APCI MALDI

ESI

Molmasse (MG)

Anwendungsbereich verschiedener Ionisierungsmethoden in Abhängigkeit von Polarität und Molmasse

MS von Ephedrin unter Verwendung verschiedener Ionisierungstechniken

50 100 1500

50

100

OH

NHCH3

CH3

50 100 1500

50

100

50 100 1500

50

100

50 100 1500

50

100

Ephedrin,MG = 165

EI FI

CI (Isobutan) FD

105

58 107

166 (M+1)

107148

166(M+1)

166(M+1)

58

92

108

148

MS - Analysatoren

• magnetischer Sektor (Sektorfeldgeräte)

• Quadrupol-Analysator

• Ionenfalle (QIT) und Orbitrap

• time of flight (TOF)

• Fourier transform Ionencyclotronresonanz (FT-ICR)

Kenngrößen eines Analysators:• Massenbereich (Messbereich, z.B. zwischen m/z 50-2000)• Scangeschwindigkeit (Geschwindigkeit, mit dem der

Massenbereich durchgescannt werden kann, z.B. 2000 m/z s-1)• Genauigkeit (Abweichung von der berechneten Masse des

Ions, ∆m/m)• Auflösung: siehe 10% TAL-Definition

Magnet-Analysator eines Massenspektrometers(Sektorfeld-Gerät)

Ionenquelle

m/z

rel.Int.

Massenspektrum

m1

m2

IonenstromAnalysator-Rohr

Flugbahn m1

Flugbahn m1

B(die Pole des Elektromagneten befindensich oberhalb und unterhalb derZeichenebene)

Massenbereich ~ 10-6000geringe Scangeschwindigkeit

Auftrennung von Ionen im Magnetfeld(Sektorfeld-Gerät)

r FlugbahnradiusB MagnetfeldstärkeU Beschleunigungsspannungm Masse des Ionsz Ladung des Ions (meist 1)

z

mU2

B

1r

⋅⋅=

Quadrupol-Analysator

∼

∼

• Quadrupol-Feld zwischen 4 parallelen Metallstäben

• Wechselspannung ∼ wird so eingestellt, dass nur Teilchen einer ganz bestimmten Masse zwischen denStäben 'durchkommen'

• arbeitet sehr schnell (→ GC-MS)

• nicht für hohe Massen (bis ca. 4000 m/z)

• relativ geringes Auflösungsvermögen

Quadrupol-Ionenfalle (Ion Trap, QIT, Paul-Falle)

• Ionenquelle und Massenanalysator befinden sich in einer gemeinsamenKammer

• positive Ionen werden durch ein Radiofrequenzfeld (Ring-Elektrode) ineinem zylinderförmigen Behältnis 'gefangen'

• nach einem Stablilisierungsschritt wird die Spannung an derRingelektrode sukzessive erhöht und die Ionen nach steigender Massefreigesetzt und detektiert

• Massenbereich 50-6000, hohe Scangeschwindigkeit

Orbitrap-Analysatoren

•Ionen werden in elektrostatischem Feld gefangen, umkreisen die spindelförmige Zentralelektrode und schwingen gleichzeitig entlang der z-Achse in Abhängigkeit von m/z•Die Schwingungen erzeugen in den äußeren, gespaltenen Elektroden Signale, die mittels Fourier-Transformation in m/z-Werte umgewandelt werden•Vorteile: hohe Genauigkeit, hohe Auflösung, Massenbereich bis 6000 m/z,technisch viel weniger aufwendig als FT-ICR (keine Hochfeld-Magnete nötig)

Zentralelektrode

äußere Elektrode

Schwingung

m/zt ∝TOF

Time of Flight (TOF) Analysator

Massenbereich 10 - > 300 000, hohe ScangeschwindigkeitBestimmung der Molekülmasse von Peptiden und Proteinen heute meist mittels MALDI-TOF

ProbenplatteReflektron

linearerDetektor

Detektorfür Reflektron-Modus*(höhere Genauigkeit und bessere Auflösung)

Laser

Flugrohr

MALDI

kleine Ionen fliegen schneller!

*Problem: Ionen gleicher Masse haben nicht genau gleich große Geschwindigkeit

Doppelt fokussierendes Massenspektrometer (Hochauflösung)

Einlaßsysteme

Ionenquelle

elektrostatischeFokussierung

Magnet-Fokussierung

Empfänger

Definition der Auflösung

A: Auflösungm: Masse∆m: Unterschied der zu

trennenden Massen

10%

75%

zwei gleich intensive,benachbarte Signale

mit 10% Überlappung(10% TAL-Definition )

zwei gleich intensive Peaksbei ungenügender Auflösung,

registriert wird die Resultierende(außen)

'normales' MS: A ca. 1000-2000hochaufgelöstes (high resolution) MS:A ca. 150000!

N2: 28.0061CO: 27.9949C2H4: 28.0313

mit HRMS unterscheidbar

genaue Massenzahlen reiner Isotope:

1H: 1.00782512C: 12.00000 (Definition)14N: 14.00307416O: 15.994915

∆Mm

A =

Periodensystem1H1.0079

2He4.0026

3Li6.939

4Be9.0122

5B10.811

6C12.011

7N14.007

8O15.999

9F18.998

10Ne20.179

11Na20.99

12Mg24.305

13Al26.982

14Si28.086

15P30.974

16S32.06

17Cl35.453

18Ar39.948

19K39.098

20Ca40.08

21Sc44.956

22Ti47.90

23V50.942

24Cr51.996

25Mn54.938

26Fe55.847

26Co58.933

28Ni58.71

29Cu63.546

30Zn65.38

31Ga69.735

32Ge72.59

33As74.922

34Se78.96

35Br79.904

36Kr83.80

37Rb85.47

38Sr87.62

39Y88.905

40Zr91.22

41Nb92.906

42Mo95.94

43Tc98.906

44Ru101.07

45Rh102.91

46Pd106.4

47Ag107.87

48Cd112.4

49In114.82

50Sn118.69

51Sb121.75

52Te127.60

53J126.90

54Xe131.30

55Cs132.91

56Ba137.34

57La138.91

72Hf178.49

73Ta180.95

74W183.85

75Re186.2

76Os190.2

77Ir192.2

78Pt195.09

79Au196.97

80Hg200.59

81Tl204.37

82Pb207.19

83Bi208.98

84Po(209)

85At(210)

86Rn(222)

87Fr(223)

88Ra226.03

89Ac(227)

104Rf(261)

105Db(262)

106Sg(263)

107Bh(262)

108Hs(265)

109Mt(266)

58Ce140.12

59Pr140.91

60Nd144.24

61Pm(145)

62Sm150.35

63Eu151.96

64Gd157.25

65Tb158.93

66Dy162.50

67Ho164.93

68Er167.26

69Tm168.93

70Yb173.04

71Lu174.97

90Th232.04

91Pa231.04

92U238.03

93Np237.05

94Pu(224)

95Am(243)

96Cm(247)

97Bk(247)

98Cf(251)

99Es(254)

100Fm(257)

101Md(258)

102No(259)

103Lw(260)

Massenanalyse – Begriffe

Einheit: [u] ‚unit‘: 1/12 der Masse des Isotops 12C (synonym: Da (Dalton), amu)

nominale Masse: Summe der zu ganzen Zahlen gerundeten Atommassen einer Verbindung. Verbindungen gleicher nominaler Masse bezeichnet man als isobar(auch wenn sich diese in ihrer exakten Masse unterscheiden) z.B. N2, CO, C2H4

– alle 28

exakte Masse: die mit hoher Genauigkeit ( ≥4 Nachkommastellen, doppelt fokussierende Geräte) gemessene Masse: z.B. N2: 28.0061

isotopische Masse: exakte Masse eines Isotops

monoisotopischeMasse: Masse jenes Teilchens, bei dem nur die häufigsten Isotope der jeweiligen Elemente zur Gesamtmasse beitragenKohlenstoff: 12C, 13C, (14C); Wasserstoff: 1H = H, 2H = D, (3H=T)Methan: Mmi entspricht exakter Masse von 12CH4; nicht: 13CH4, 12CDH3, 12CD2H2, 12CD3H, 12CD4; 13CH4, 13CDH3, 13CD2H2, 13CD3H, 13CD4, 14CH4…usw……(14CT4).

‚Molekulargewicht‘: jener Massenwert, der sich aus der Summe der mittleren Massen der Elemente (über deren Isotopenverteilung gemittelt) ergibt – kann nicht direkt gemessen werden!

MS - Spektrenauswertung

m/z

% rel. Int.

100%

50%Molekülionen-Peak

(parent peak), M+•, mußnicht immer vorhanden

sein!

Basis-Peak (base peak) = größter Peak im Spektrum, wird als

100% relative Intensität gesetzt,alle anderen Peaks werden in %

des Basispeaks angegeben

0%

M-x

M-y

'Schlüsselbruchstücke'

Isotopenpeaks - Nachweis bestimmter Elemente - Brom

Brom: Gemisch aus 2 Isotopen 79Br : 81Br 1 : 1

1 Brom-Atom im Molekül (z.B. HBr) :

2 Brom-Atome im Molekül (z.B. Br2):

79Br–79Br → MG 158 W = 179Br–81Br → MG 160 81Br–79Br → MG 16081Br–81Br → MG 162 W = 1

W = 1+1 = 2

3 Brom-Atome im Molekül: → 1 : 3 : 3 : 1aaa X 1aab aba baa X+2 1 + 1 + 1 = 3abb bab bba X+4 1 + 1 + 1 = 3bbb X+6 1

80 82

1 : 1

HBr

158 160

1 : 2 : 1

Br2

162

X X+2

1 : 3 : 3 : 1

3 Br im Molekül-bzw. Fragmention

X+4 X+6

Isotopenpeaks - Nachweis bestimmter Elemente - Chlor

Chlor: Gemisch aus 2 Isotopen 35Cl : 37Cl 3 : 1

1 Chlor-Atom im Molekül (z.B. HCl) :

2 Chlor-Atome im Molekül (z.B. Cl2):

35Cl–35Cl → MG 70 W = 3•3 = 935Cl–37Cl → MG 72 W = 3•1 = 3 37Cl–35Cl → MG 72 W = 1•3 = 337Cl–37Cl → MG 74 W = 1•1 = 1

3+3 = 6

3 Chlor-Atome im Molekül: → 27 : 27 : 9 : 1aaa X W = 3•3•3 = 27aab aba baa X+2 W = 3•3•1 + 3•1•3 + 1•3•3 = 27abb bab bba X+4 W = 3•1•1 + 1•3•1 + 1•1•3 = 9bbb X+6 W = 1•1•1 = 1

36 38

3 : 1

HCl

70 72

9 : 6 : 1Cl2

74

Isotopenpeaks - allgemeine Formel

(a + b)n

binomischer Lehrsatz:

(a + b)1 = a + b

(a + b)2 = a2 + 2ab + b2

(a + b)3 = a3 + 3a2b + 3ab2 + b3

die Zahl der Glieder des Binoms gibt die Anzahl der Isotopenpeaks an, die Zahlen selbst das Verhältnis der Intensitäten

z.B. für 2 Cl-Atome im Molekül:(3 + 1)2 = 9 + 2•3•1 + 1 = 9 + 6 +1

a: leichteres Isotop b: schwereres Isotopn: Anzahl der Atome des isotopen Elementsa/b: Mengenverhältnis der Isotopen

Isotopenpeaks treten auch z.B. bei C auf, allerdings kaum auswertbar (12C : 13C ∼ 99 : 1) → sehr kleine 'Nebenpeaks'→ 'Schotter'

wichtig für Strukturaufklärung (Aufstellen einer Strukturformel) mittels MS:

• Elemente O, C, S: geradeWertigkeit, geradesAtomgewicht

• Elemente H, F, Cl, Br , I : ungeradeWertigkeit, ungeradesAtomgewicht

→ Verbindungen, die nur diese Elemente enthalten, habenimmer eine geradzahligeMolekülmasse (Molekulargewicht)

Ausnahme: N ungeradeWertigkeit, geradesAtomgewicht

→ Verbindungen mit einer ungeradenAnzahl an N-Atomen haben stets ein ungerades Molekulargewicht!

Prinzipielle Zerfallsmöglichkeiten eines Molekülions

(1) [A – B]+•••• A• + B+

Molekülion neutrales Kation mit gerader

Radikal Elektronenzahl

(2) [A – B]+•••• A |||| + B •••• +

Molekülion Neutralteilchen Radikalkationmit gerader

Elektronenzahl

Weg (1) energetisch meist bevorzugtWeg (2) bevorzugt, wenn besonders stabiles Neutralteilchen

(H2O, N2, CO) entsteht

Fragmentierungsverhalten bei EI-Ionisierung

Einige charakteristische Neutralteilchen, die aus M+• abgespalten werden

Neutralteilchen aus führt zu Ion mit m/z

H Aldehyden M-1

CH3 Methylverbindungen M-15

H2O Alkoholen M-18

C2H4

CO ex McLafferty M-28

N2

CHO Aldehyden M-29

C2H5 Ethylverbindungen M-29

OCH3 Methoxyverbindungen M-31

homolytische Spaltung in αααα-Stellung zu einer C-Heteroatombindung (αααα-Spaltung)

R – C – Y+• R • + H2C = Y +

Ion mit geraderElektronenzahl

Y = OH, NH2, =O

H

H

prim. Alkohole: R–CH2–OH+• → R• + H2C=OH+ (m/z = 31)

prim. Amine: R–CH2–NH2+• → R• + H2C=NH2

+ (m/z = 30)

Aldehyde: R–C=O+• → R• + H–C≡O+ (m/z = 29)

H → H• + R–C≡O+ (M+-1)

Methylester: → R• + |O≡C-OCH3+ (m/z = 59)

→ OCH3• + R–C≡O|+ (m/z = M+-31)

α

OMe

O · +

R

Mc Lafferty - Umlagerung

Voraussetzungen:

• π-Elektronensystem• H-Atom am dazu γ-ständigen C• Molekül muss so beweglich sein, dass 6-gliedriger

Übergangszustand möglich ist

Spaltung der Bindung α,β zum π-Elektronensystem

αβ

γ

stabilesNeutralteilchen Radikal-Kation

Retro-Diels-Alder (RDA) Reaktion

- C2H4

m/z = 171 m/z = 143

Beispiele:

m/z =284 m/z = 152 m/z = 132

α-Spaltung

Onium

m/z = 222 m/z = 177

m/z = 149

Onium-Reaktion

H

aus Phthalsäureestern (Weichmacher)

charakteristische Fragmentionen

m/z Ion aus

—————————————————————————

29 HCO+ Aldehyden

C2H5+ Ethyl-Verbindungen

30 CH2NH2+ prim. Amin

31 CH2OH+ prim. Alkohol

OCH3+ Methoxy-Verbindungen

43 C3H7+ Propyl-Verbindungen

CH3CO+ CH3-CO-X

59 CH3OCO+ Methylester

77 C6H5+ Phenyl-Verbindungen

91 Tropylium+ Benzyl-Verbindungen

105 C6H5CO+ Benzoyl-Verbindungen

Übergangssignale (metastabile Ionen)

mT: Masse des Tochterions

mM: Masse des Mutterions

zM: Ladung des Mutterions (meist 1)

zT: Ladung des Tochterions (meist 1)

TM

M2

T

zm

zmm

⋅⋅=∗

MS von Benzoesäuremethylester

51

77

105

136 (M+)

- HC≡CH

- CO

- OCH3

O

O

CH3

77

105

77

156 158

MS einer unbekannten Substanz

77

156 158

MS von Brombenzol

Br

155/157

234/236/238

MS einer unbekannten Substanz

155/157

234/236/238

MS von 1,4-Dibrombenzol

Br

Br- Br

- Br

MS von 4-Nitrobenzaldehyd

150

151

NO2

HO

????

78

106

137 (M+)

MS von Nicotinsäuremethylester

78

106

137 (M+)

N

O

O

CH378

105

M+ = 121

10678

1689

????????

EI-Massenspektrum von Benzocain

165(M+)

120

92137

Röntgenstrukturanalyse - Interferenz

konstruktive Interferenz→ Verstärkung

destruktive Interferenz→ Auslöschung

Bragg - Bedingung

für konstruktive Interferenz:nλ = 2dsinθ (Bragg-Bedingung)

} dθ

θ θd

Röntgenstrukturanalyse - Beugungsbedingung (Bragg)

dsinθdsinθ

Gitter-bausteine

n: Beugungsordnungλ: Wellenlänged: Gitterabstandθ: Beugungswinkel

• Beugung von Röntgenstrahlen an den Gitterbausteinen eines Kristalls (λ ähnlich den Gitterkonstanten).

• In Abhängigkeit von der Phasendifferenz erfolgt konstruktive bzw. destruktive Interferenz.

• Es entstehen charakteristische Beugungsmuster. Aus diesen kann man die Daten der Elementarzelle des Kristalls berechnen.

High Voltage

X-Ray DiffractionX-ray Tube

Lead Screen

X-ray Beam

Crystal

Photographic Plate

Röntgenstrukturanalyse - Aufnahme von Beugungsbildern

Röntgenstrukturanalyse - Elektronendichten

Nach Messung der Streuintensitäten mit speziellen Diffraktometern werden die Elektronendichten berechnet (Computer) und in Konturdiagrammen wiedergegeben.

Fourier-Synthese

Beugungsbild/Streuintensitäten

Elektronen-dichte-'map'

Röntgenstrukturanalyse

N

NCH3

O OH

W. Holzer, K. Mereiter, B. Plagens, Heterocycles 50, 799 (1999)

• alle Bindungslängen• alle Bindungswinkel• alle Torsionswinkel• H-Brücken

Elementarzelle

RöntgenstrukturanalyseVorteile:• liefert genaue 3-dimensionale Struktur (alle Bindungs-

längen, Bindungswinkel, Torsionswinkel)

• Bestimmung der absoluten Konfiguration bei chiralenVerbindungen (wenn schwereres Atom vorhanden)

Nachteile:• Beschränkung auf den festen Zustand

• Bio-Moleküle können im physiologischen Milieu andersvorliegen als im Kristall

• genügend große Einkristalle der Probe erforderlich (vieleSubstanzen kristallisieren nicht oder nicht gut genug)

• Position der H-Atome muß nachträglich berechnet werden,da deren Röntgenbeugung nur sehr schwach ist

Struktur eines Enzyms - ermittelt via X-ray

Kernresonanz-Spektroskopie (NMR) Einteilung der Atomkerne

Nuklid ist charakterisiert durch Ordnungszahl (OZ) und Massenzahl (MZ)

N (ug) N (uu) C (gu) C (gg)14

7

15

7

13

6

12

6OZ

MZ

ungerade (u)

gerade (g)

ug, gu, uu - Kerne: Spinquantenzahl I > 0 (1/2, 1, 3/2, 2, ...), besitzen magnetisches Moment µ

gg-Kerne: Spinquantenzahl I = 0, kein magnetisches Moment µ, dem NMR-Experiment nicht zugänglich! → z.B. 12C, 16O !

wichtige NMR-aktive Kerne: 1H (99.985%), 2H (0.015%), 13C (1.1%), 15N (0.36%), 19F (100%), 31P (100%), [17O (0.037%)]

+

+SN

Der Spin des Wasserstoffkerns (Protons)

Spin Magnetfeld Symbol für denKernspin

NS

1H-Kerne (I = ½) verhalten sich wie kleine 'Stabmagnete' (richtiger: atomare Kreisel)

ohne Anlegen eines äußeren Magnetfelds sind die magnetischen Momente der Kerne gleichmäßig in alle Raumrichtungen verteilt, es existiert keinebevorzugte Richtung

beim Anlegen eines äußeren Magnetfeldes B0 ergeben sich 2 Einstell-möglichkeiten: 1. in Richtung von B0 (energetisch günstiger)

2. gegen die Richtung von B0 (energetisch etwas ungünstiger)

Bo

1H-Kerne (I = ½) im Magnetfeld

Bo = 0

Bo > 0 ∆∆∆∆E = h νννν

αααα

ββββ

Besetzung der Energieniveaus αααα und ββββ im Gleichgewichtszustand(Boltzmann-Verteilung)

kB = Boltzmann-Konstante = 1.3805•10-23 JK-1

T = absolute Temperatur in KNα,β = Anzahl der Kerne im α bzw. β-Niveau

ohne Magnetfeld

mit Magnetfeld

• je größer B0, desto größer die Energiedifferenz zwischen α und β Niveau → möglichst starkes Magnetfeld!!!!

• je tiefer die Temperatur, desto größer ∆E (wenig Spielraum!)

∆E für 1H bei 400 MHz (Bo = 9.5 T): 3.8 x 10-5

Kcal/mol

→ Nαααα / Nββββ = 1.000064

Tk

Bhγ1

Tk

∆E1e

N

N

B

0

B

Tk

∆E

α

βB −=−≈=

−

Nβ

Nα

Anregung

Relaxation

Anregung, Relaxation, Sättigung

Gleichgewicht(Boltzmann-Verteilung,

nach Relaxation)

nachAnregung

Sättigung

α

β

Relaxation: das System kehrt nach einer Störung wieder in das thermische Gleichgewicht (Boltzmann-Verteilung) zurück

∆E = hν

0

00

Bγπν2ω bzw.π2

Bγν νhB

2π

h γ E

⋅==

⋅=⇒⋅=⋅⋅=∆

Resonanzbedingung (Larmor-Gleichung)

γ = magnetogyrisches (gyromagnetisches) Verhältnis (Naturkonstante welchedie Empfindlichkeit eines Kernes für das NMR-Experiment beschreibt)

ν = Resonanzfrequenz (60-900 MHz bei NMR-Geräten) ω = Kreisfrequenz der Präzessionsbewegung, Larmorfrequenz

Bo

ωωωωo µµµµ

auf µ wirken zwei Kräfte - die eine versucht ihn entlang B0 auszurichten, die andere hält ihn 'spinning' → es resultiert eine Kreiselbewegung (Präzessionsbewegung) in einem bestimmten Winkel zu B0 ('Kernkreisel' )→ Analogie zum mechanischen Kreisel (dort Schwerkraft anstatt B0)

Abschirmung des Atomkernes durch die Elektronenbewegung

B0B0

in Abhängigkeit von der Beschaffenheit der Elektronenhülle erfährt der Atomkern eine mehr oder weniger große Abschirmung → unterschiedliche elektronische Umgebung führt zu (leicht) unterschiedlichen Resonanzfrequenzen!!!

NMR-Spektrometer (CW) - schematisch

N S

x

y

z

SenderVerstärker

Empfänger-spule

Schreiber

Oszilloskop

MagnetMagnet

Proberöhrchen mitLösung

Senderspule

Sweep- und Shim Spulen

Computer,Bildschirm

NMR - Meßverfahren1) CW-Technik (continous wave)

die einzelnen Resonanzen werden nacheinander durch kontinuier-liche Veränderung von ν (Frequenz-sweep) oder B0 (Feld-sweep)unter Erfüllung der Resonanzbedingung ν = γ/2π•B0 erfaßt→ veraltet, langsam, unempfindlich (nur für empfindliche Kerne),keine modernen NMR-Experimente möglich

2) Puls-Fourier-Transform Technik (PFT)alle Resonanzen werden durch einen RF-Puls gleichzeitig angeregtdas erhaltene Interferogramm (Überlagerung aller Abklingkurven = free induction decay - FID) wird durch eine mathematischeOperation (Fourier-Transformation) in das NMR-Spektrumumgewandelt→ schnell, empfindlich (Akkumlierung von FIDs üblich), besserbearbeitbar; moderne NMR-Spektroskopie verwendet 'Pulsfolgen' =Kombination von mehreren Pulsen verschiedener Richtung undGröße, getrennt durch genau definierte Zeitintervalle

Kryomagnet (supraleitende Spule)heute praktisch ausschließlich verwendet (Permanent- oder Elektromagnete nur bis 100 MHz, Kryomagnet bis 1GHz)

Benchtop NMR Spektrometer

Spezieller Permanentmagnet (hier 60 MHz 1H-Frequenz)Für einfache Anwendungen wie Analyse unkomplizierter Moleküle, Reaktionskontrolle, Qualitätskontrolle, usw. Ausbildung (Lehrzwecke)

Verteilung der Kerne auf dem Doppelpräzessionskegelz

y

x

M 0

Nα

Nβ

Wegen Nα > Nβ resultiert eine makroskopische Gesamt-Magnetisierung(bulk) M 0 in z-Richtung (Richtung desMagnetfeldes B0). Durch die statistischeVerteilung in der xy-Ebene sind dieKomponenten entlang der x- und y-Achsegleich Null! (keine tranversale Magneti-sierung)

B0

B0

übliche vereinfachte Darstellung

B1 aus…

Mo

z

x

B1

z

y

Mxy

y

x

ωωωωo

B0

Puls-NMR

90°x-Puls

nach 90°-Puls beginnt M in der xy-Ebene zu rotieren (mit der Larmorfrequenz ω0) → damit detektierbare, transversale Magnetisierung erzeugt! Detektion mittels Empfängerspule(n) auf der x und y-Achse→ der rotierende Vektor M erzeugt dort eine sinus (cosinus) - förmige Wechselspannung mit der Frequenz ω0

usw.

+1

-1

0

t

+y-y

+x

-x

Puls (B1)

Puls-NMR - Relaxation und FID

nach Abschalten des Pulses (Störung der GG-Population) kehrt das System wieder ins GG (M 0 in Richtung von B0) zurück (Relaxation) → der rotierende Vektor M richtet sich wieder in die z-Richtung auf - die transversale Magnetisierung zerfällt. Es resultiert in der Empfängerspule daher eine Wechselspannung mit abnehmender Amplitude, im Realfall eine Überlagerung vieler Abklingkurven - der FID (free induction decay).

Am

plitu

de

→ Zeit

'Realfall' (viele spins mit verschiedener Frequenz und verschiedener Amplitude)

vom FID zum NMR-Spektrum

Umwandlung der ZeitdomäneFID (Signalamplitude als Funktion der Zeit) in die FrequenzdomäneNMR-Spektrum (Signalamplitude als Funktion der Frequenz) durch Fourier-Transformation

dtetfF

deFtf

i

i

∫

∫

∞+

∞−

+∞

∞−

−

=

=

πν

πν

ν

νν

2

2

)()(

)()(

FT

Realteil →AbsorptionImaginärteil → Dispersion

0 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00t1 sec

FT

1H-NMR - Abschirmung und chemische Verschiebung

• 1H wichtigster NMR aktiver Kern – natürliche Häufigkeit ist99.985% I = ½ γ groß → sehr empfindlich

• Abschirmung: auf 1H-Kern wirkt nicht exakt B0, sondern –bedingt durch die elektronische Abschirmung – ein etwaskleineres Feld Beff

• Beff = B0 – σB0 = (1 –σ) B0 (σ: Abschirmungskonstante)→ Resonanzbedingung: ν = γ/2π (1 –σ) B0

• Protonen mit unterschiedlicher elektronischer Umgebung habenunterschiedliche Resonanzfrequenzen. Das 1H-NMR Spektrumeiner Substanz mit unterschiedlichen Sorten von Protonen bestehtdaher aus so vielen Signalen, wie es verschieden Typen vonProtonon im Molekül gibt

• Signale zueinander verschoben → chemische Verschiebung

Chemische Verschiebung

• Es wird nicht die absolute Lage eines Resonanzsignales gemessen (z.B. 500 000 423 Hz) sondern die relative Lagezum Signal einer Standardsubstanz (Tetramethylsilan = TMS). Die Lage des Standardsignales wird definitionsgemäß 0 gesetzt.

• Angabe der chemischen Verschiebung nicht in Hz weil dann Aufnahmen bei verschiedenen Feldstärken nicht vergleichbar sind (ν ist von B0 abhängig – siehe Resonanzbedingung)

• δδδδ-Skala: chem. Verschiebung als dimensionslose Zahl angegeben, damit unabhängig von B0

equenzBetriebsfr

)TMS(ν)Signal(νδ

−=Gerätes des MHz

ν(TMS)ν(Signal)(ppm) δ

−=oder

Si CH3CH3

CH3

CH3

TMS

z.B. 500 MHz-Gerät, ν(Signal) = 2000 Hz → δ (ppm) = 2000/500 = 4ppm = parts per million = 1/1 000 000 !!! (keine physikalische Einheit!)

01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.0

(δ, ppm)

SiMe4

(TMS)CHCl37.26 ppm

CH2Cl2

CH3Cl

höhere Frequenztieferes FeldEntschirmung

niedrigere Frequenzhöheres FeldAbschirmung

1H-NMR Spektrum - CH 3Cl, CH2Cl2, CHCl3 (äquimolar)

• Die Intensität eines Signals wird durch seine Fläche bestimmt (Integral)• die Intensitäten 2-er Signale verhalten sich so wie das Verhältnis der

Protonen, welche die 2 Signale liefern (z.B. CH3- zu CH2- = 3 : 2)• man erhält nur relative Intensitäten!

1H-NMR chemische Verschiebung

Beeinflussung hauptsächlich durch:

• Induktive Substituenteneffekteelektronegative Substituenten in der Nähe des betrachteten Protons erniedrigen die Elektronendichte → Entschirmung, Tieffeldverschiebung, δ großelektropositive Substituenten erhöhen die Abschirmung →Hochfeldverschiebung, δ klein

• Mesomerieffektepositive Partialladung in (relevanten) mesomeren Grenzstrukturen →Elektronenmangel, Entschirmung, δ großnegative Partialladung → hohe Elektronendichte, Abschirmung, δ klein

• Anisotropieeffektedurch B0 wird ein sekundäres Magnetfeld erzeugt, welches nicht in allen Raumrichtungen gleich groß ist (anisotrop). Je nach räumlicher Lage des betreffenden Protons zu diesem Sekundärfeld kann Entschirmung oder Abschirmung erfolgen

Induktive Substituenteneffekte

• stark nur über 1 Bindung, mit zunehmenden Abstand rasch abnehmend

CH3-Cl CH3-CH2-Cl CH3-CH2-CH2-Cl

• Bei Mehrfachsubstitution kumulative Effekte

CH4 CH3Cl CH2Cl2 CHCl3

• δ (Methin) > δ (Methylen) > δ (Methyl)

Me2-CH-Cl Me-CH2-Cl CH3-Cl

δ 3.05 1.42 1.04

δ 0.23 3.05 5.33 7.26

∆δ 2.82 2.28 1.93

δ 4.13 3.51 3.054.33MeNO2

4.04.25MeF

3.03.05MeCl

2.82.70MeBr

2.52.16MeI

3.53.38MeOH

3.02.36MeNH2

2.50.8MeMe

2.10.4MeH

1.80MeSiMe3

1.0–1MeLi

EN(X)δ(Me)MeX

Mesomerieffekte

N

H

H

H

H

H

HHN

HHN

HHN

HH

N

H

H

H

H

H

OON

OON

OON

OO

O O

O O

+

−−−−

+ +

+ +

−−−−

−−−−

−−−− −−−− ++−−−− −−−− −−−− −−−− −−−−

+

+ +

+

+

−−−−

−−−−

6.52

7.00

6.617.26

8.17

7.53

7.69

6.88

5.93 6.37

4.65

Benzol - Ringstromeffekt

H

H HH

H

[18]-Annulen

7.26(13C: 128.5) 9.28

-2.99

5.795.28(13C: 123.3) ≡

Benzol

Ethen Cylooctatetraen

Hückel-Regel:Aromaten besitzen (4n + 2) π-Elektronen (n = 1, 2, 3, ...)

+ -

9.17 7.26 5.37

jeweils 6 π-Elektronen (n = 1)

(13C: 132.0)

H HC

CH

C C

CH3

H H

H

CH3 CH2 CH3

C O

H

CH3

C C HCH3

magnetische Anisotropie von C=C, C=O, C≡≡≡≡C, NO2

Propan Propen

PropinAcetaldehyd

0.91 1.33

1.66

5.73

4.96

4.88

2.20

9.80

1.81.8

A B

H ist in B im Vergleich zu Aum 1.7 ppm tieffeldverschoben

+-

-

magnetische Anisotropie in Cyclohexanderivaten

Hax

HeqHax (axial) stärker abgeschirmt als Heq (äquatorial)

OH

HH

H

H HOH

OH

OOH

OMe

OH

HH

H

HOHOH

OOH

H

OMe

Methoxygalaktose

α-Form β-Form

3.78

5.18

4.69

3.97

Zwei Kerne innerhalb eines Moleküls sind chemisch äquivalent, wenn sie durch eine auf das Molekül anwendbare Symmetrieoperation ineinander übergeführt werden können, oder wenn sie durch eine schnelle (schneller als die NMR-Zeitskala), intramolekulare Bewegung im Zeitmittel identisch werden. Kerne mit identer chemischer Verschiebung nennt man isochron. Isochronie kann aufgrund chemischer Äquivalenz erfolgen oder aber auch rein zufällig bedingt sein.Befindet sich in Nachbarschaft einer CH2- (oder z.B. CMe2-) Funktion ein chirales (oder prochirales) Zentrum, sind die beiden Methylen-protonen Ha und Hb (bzw. Methylgruppen) nicht mehr chemisch äquivalent! Man bezeichnet solche Gruppen als diastereotop.

chemische Äquivalenz

C C

H

NH2

Hb

Ha

Ph COOH C C

H

NH2

Hb

Ha

CH COOHMe

Me

HH

Phenylalanin Leucin Cholesterin

* * **

Symmetrie

• die Zahl der im Spektrum eines Moleküls auftretenden Signaleist entscheidend von der Symmetrie im Molekül abhängig!

• Enantiomere: die korrespondierenden Signale optischerAntipoden sind im achiralen Milieu ident (völlig identeSpektren)erst im chiralen Milieu (chiraler Hilfsstoff, chirales LM)kann Nichtäquivalenz auftreten

CH3

CH3

H

H

CH3

CH3

CH3

CH3

CH2 BrCH3

CH2

CH3CH3 H

H

H

H

H

H

CH3

CH3

Cl

H

H

H

CN

NC

∗∗

∗

∗

∗

∗

∗

∗

∗

∗

∗∗

∗∗

∗

2 Signale (3:2)

2 Signale(3:1)

2 Signale(3:1)

1 Signal

1 Signal ?

?•

•

•

•

1H-NMR Verschiebungsbereiche organischer Moleküle

Protonen an Heteroatomen

• 'acide' Protonen: OH, NH, SH sehr beweglich, bilden H-Brücken

• δ stark abhängig von Konzentration, Temperatur, Lösungsmittel

• schnelle Austauschreaktion (Identifizierungsmöglichkeit):

R-O-H* + H-OH → R-O-H + H*-OH• Zugabe von D2O zur Probelösung: ROH + DOD → ROD + HOD→ Signal von ROH verschwindet, eines für HOD erscheint

H in intramolekularen H-Brücken haben größte Verschiebung

R

O

R

OH

NN

O

OH

H

oft 14-18 ppm!intramol. H-Brücken weitgehend konzentrations-unabhängig

EtOH

Spin-Spin Kopplung

C–HA

C-HB

B0

HA entweder ↑↑↑↑ (in Richtung B0 → Verstärkung von B0)oder ↓↓↓↓ (entgegen B0 → Abschwächung von B0)

• Wenn HB einen Kern HA der Sorte ↑↑↑↑ ‘spürt ‘ kommt es bei (geringfügig‘) anderer Frequenz zur Resonanz als wenn HA der Sorte ↓↓↓↓ angehört:

• da beide Sorten aber statistisch gleich verteilt sind (geringe Besetzungsunterschiedehier vernachlässigbar) kommt es zu einer 1:1 Aufspaltung des Signals von HB. Der

Abstand der beiden Signalkomponenten ist die Kopplungskonstante J.

• J kann ein positives oder negatives Vorzeichen haben (aus dem Spektrum meist nicht direkt ablesbar)

• Kopplungen werden durch Bindungselektronen übertragen (skalare Spin-SpinKopplung)

• Kopplung erfolgt gegenseitig → analoge Situation für HA: J(B,A) = J(A,B)

• die Größe von J ist unabhängigvon der Stärke des äußeren Magnetfeldes B0 !!!!!

HA– C–HA

C–HBB0

energetischgleichwertig

Spin-Spin Kopplung

δΒ

JAB

JAB

JAB

HA

HA– C–HA

C–HB

B0

δΒ

JAB JAB

Triplett1 : 2 : 1

Quartett1 : 3 : 3 : 1

Allgemein: Koppelt ein Proton mit n äquivalenten Nachbarprotonen, so beträgt seine Signalmultiplizität n + 1 Linien. Die relativen Signalintensitäten verhalten sich wie Binomialkoeffizienten (Pascal‘sches Dreieck).*

* Nur für Spektren 1.Ordnung

Kopplungsbaum

AMXJAM = 10 HzJAX = 4 Hz

AM 2JAM = 10 Hz

JAM

JAX JAX

1 : 1 : 1 : 1

1 : 2 : 1

JAM

JAM JAM

Signal

Dublett eines Dubletts (dd)

Triplett (t)

Vorzeichen von Kopplungskonstanten

Links: ohne Kopplung (J = 0)Rechts: J > 0 (positiv) → Absenkung der Energieniveaus 2 (αβ) und 3 (βα)

I S

Die Kopplungskonstante J hat - definitionsgemäß – dann ein positives Vorzeichen, wenn die antiparallele Einstellung die Energie absenkt

1J ist positiv für Kerne mit γ > 0 (z.B. 13C-1H)

CH2-Gruppe: parallele Einstellung ist günstiger (Hund‘sche Regel) → 2J(H,H) meist negativ

3J(H,H) positiv, long-range Kopplungen positiv oder negativ

E

Spektrenordnung

• Spektren 1. Ordnung: ∆ν/J > 10

• Spektren höherer Ordnung: ∆ν/J < 10• mehr Linien als 1. Ordnung• δ und J können meist nicht mehr direkt abgelesen werden (Computeranalyse)• keine binomialen Intensitätsverhältnisse• oft charakteristische Dachform

Magnetische Äquivalenz

2 Kerne A und B sind magnetisch äquivalent, wenn sie a) chemisch äquivalent sind undb) zu allen anderen möglichen Kernen, die nicht die gleiche chemische Verschiebung wie A und B aufweisen, die gleiche Kopplungskonstante besitzen. Die Kopplung zwischen magnetisch äquivalenten Kernen ist im Spektrum nicht direkt beobachtbar (aber sie existiert).

magnetische Äquivalenz oder Nichtäquivalenz ist entscheidend für das Aussehen von Spektren!

Nomenklatur von Spinsystemen• chemisch äquivalente Kerne werden mit dem gleichen Großbuchstaben

bezeichnet, chemisch nicht äquivalente Kerne mit verschiedenen Großbuchstaben(z.B. A, B, M, X). Große Unterschiede in ihrer chem. Verschiebung (in Hz) kannman durch - im Alphabet - weit auseinanderliegende Buchstaben kennzeichnen (z.B. AX), kleine mit nahe liegenden (z.B. ABC).

• magnetisch nicht äquivalente, aber chemisch äquivalente Kerne werden durcheinen hochgestellten Apostroph voneinander unterschieden, z.B. AA', XX'

• mehrere magnetisch äquivalente Kerne werden durch eine tiefgestellte Zahl hinterdem entsprechenden Buchstaben zusammengefaßt, z.B. Methyl: CH3 → A3

A3X2

A6

AA'BB'

AA'BB'

A2B

ABX

ABC

AA'BB'

CH3 CH2 OR

S

O2N OMe

NN

N

Ph

NH2

COOHH H

H

Cl

H HH

BrNO2

N

N

Größe von Kopplungen

• Nomenklatur: nJ(A,X) oder nJAX

n = Anzahl der Bindungen zwischen den koppelnden Kernen

2J → geminaleKopplung 3J → vicinale Kopplung4J und >4J → Fernkopplungen (long-range), meist nicht mehr aufgelöst

• Die Größe der jeweiligen Kopplung hängt von der Anzahl derBindungen (n) zwischen den Kopplungspartnern ab, in starkemAusmaß aber auch von sterischen (Bindungsabstände und –winkel,Torsionswinkel) und elektronischen Faktoren

• Kopplungen zu aciden H's sind nur bei langsamen Austauschbeobachtbar (z.B. in DMSO-d6 → starker Akzeptor)

H

H

H

H

H

H

3J (ortho)7.5 (7 - 9) Hz

4J (meta)1.4 (1 - 3) Hz

5J (para)0.7 (< 1) Hz

Kopplungen in Benzol (subst. Benzolen)

N2

3

4

5

6

3J(2,3) = 4.9 Hz3J(3,4) = 7.7 Hz4J(2,4) = 1.2 Hz4J(3,5) = 1.4 Hz4J(2,6) = -0.1 Hz5J(2,5) = 1.0 Hz

Pyridin

Vicinale Kopplung – Karplus-Kurve

Die vicinalen Kopplung (3J(H,H)) ist in hohem Ausmaß vom Diederwinkel φ , welchen die beiden H-Atome im Fragment H-C-C-H einschließen, abhängig

CH3 CH2 Rax

ax

eqeq7 - 8 Hz

3J(ax,ax) ~ 10 - 13 Hz (φ 180°)3J(eq,eq) ~ 2 - 5 Hz (φ 60°)3J(ax,eq) ~ 2 - 5 Hz (φ 60°)

H H H

H

H H

Ph COOH

H

HPh

COOH

3Jcis = 6 - 14 Hz meist ~ 10

3Jtrans = 14 - 20 Hz meist ~ 16

3J = 12 Hz 3J = 16 Hz

(cis) Zimtsäure (trans)

Sehr wichtig für die Strukturaufklärung!! (→ Peptide usw.)

φ = 0° φ = 180°

φ

Spektrenvereinfachung

• Spin-Entkopplung(homonuklear, heteronuklear)koppelt A mit B oder nicht?

JAB JAB

A B

Einstrahlungbei νA

• höhere Feldstärken

• Shift-Reagentien

250 MHz

60 MHz

CMe3O

O

CMe3

Eu

1/33+

Eu(DPM)3

Tris(dipivaloylmethanato)- europium

ROH + Eu(DPM)3RO→Eu(DPM)3

H

Nicotinsäureethylester –1H-NMR (400 MHz) in CDCl3

peak-picking

Integral

2

4

5

6

O

O

N

Pyridin: δ H-2,6 > H-4 > H-3,5

Dehnung

1H-NMR von Ethylbenzol in CDCl3 (80 MHz)

Benzhydrol in DMSO-d6

Ph

OH CH

DMSO*H2O

AB-System

Benzhydrol in DMSO-d6 - nach Zugabe von D2O

HOD

DMSO*

Ph

CH

Benzhydrol in CDCl3

Ph

CH# OH

# schneller Austausch, daher keine Kopplung mit OH

1H-NMR (80 MHz) von Phenacetin in DMSO-d6

3J(OEt): (1.3728-1.1988)/2 • 80 = 6.96 Hz

1H NMR (60 MHz) mittelsbenchtop NMR Spektrometer

13C: I = ½, natürliche Häufigkeit 1.1%, γ(13C) nur ¼ von γ(1H) → wesentlich weniger empfindlich als 1H (PFT-Spektrometer, Spektrenakkumulation, spezielle Meßtechniken)

13C ist 'diluted spin':C—C—C—C ca. 96%, dem NMR Experiment nicht zugänglich (I = 0)

C—C—C—C ca. 1% C— C—C—C ca. 1% C—C—C—C ca. 1% C—C—C—C ca. 1%

C—C—C—C ca. 1/100%C—C—C—C ca. 1/100%.......usw.........C—C—C—C ca. 1/106 %

13C-NMR Spektroskopie

diese Isotopomerewerden beim 'normalen' 13C-NMR Experiment gemessen

geht beim 'normalen' 13C-Experiment im Rauschen unter; mit speziellen Verfahren (INADEQUATE) meßbar

(C = 13C, C = 12C)

13C-NMR - Besonderheiten

• Das 'normale' 13C-NMR Spektrum stammt nicht von einereinheitlichen Substanz, sondern von einem Gemischverschiedener Isotopomere

• 13C,13C-Kopplungen sind im 'normalen' 13C-NMR Spektrumnicht sichtbar (die Wahrscheinlichkeit für 2 benachbarte 13C-Kerne ist äußerst gering)

• Kopplungen mit Protonen sind sichtbar. Daher meist sehr vieleLinien (wegen der – meist – vielen Kopplungen mit 1H).Vorteil: viel 'Nachbarschaftsinformation', Nachteil: oftunübersichtlich bis nicht mehr interpretierbar

• → durch verschiedene Maßnahmen (Entkopplung)Kopplungen zu 1H ganz oder teilweise eliminiert

Beff = (1 –σσσσ) B0 (σ: Abschirmungskonstante)

σ = = = = σσσσdia + σσσσpara + σσσσaniso

σσσσdia : beschreibt Abschirmung durch Elektronen mit sphärischer Symmetrie (s-Elektronen), bei 1H dominierendσσσσpara : beschreibt Einfluss von Elektronen mit nicht-sphärischer Ladungsverteilung, negatives Vorzeichen (→ Entschirmung), dominiert bei allen Kernen außer Wasserstoff, enthält Term 1/∆E (∆E ~ mittlere Anregungsenergie), d.h. geringere Anregungsenergien führen zu stärkerer Entschirmungσσσσaniso: beschreibt Einfluss der Anisotropie-Effekte von Nachbargruppen, weniger wichtig bei 13C als bei 1H

Ursachen von 13C chemischen Verschiebungen

δC=O = 215.6 ppmλmax (n → π*) = 292 nm∆E = 401.5 kJ/mol

δC=S = 269.0 ppmλmax (n → π*) = 492 nm∆E = 234.5 kJ/mol

Campher Thiocampher

Hybridisierung : δ sp2 δ sp δ sp3

13C-NMR chemische Verschiebungen

üblicherweise gemessener Kernbereich ca. 0 – 220 ppmReferenzsubstanz: TMS δ(13C) abhängig von:1) Hybridisierungszustand des C-Atoms2) Substituenteneinflüssen3) Elektronendichte

Alkane: ~ 0 – 100 ppmC≡ C ~ 50 – 110 ppm C≡ N ~ 105 – 120 ppm

C=C ~ 90 – 160 ppmC=O ~ 150 – 220 ppmC=S ~ 180 – 240 ppmC=N ~ 110 – 160

> >

Substituenteneinflüsse: • steigende Alkylsubstitution führt zu Entschirmungδ Cquartär> δ Ctertiär > δ Csekundär> δ Cprimär > δ CH4

Substituenteneinflüsse: • elektronegative Substituenten führen zu Entschirmung

CH3F 75 ppmCH3Cl 25 ppmCH3Br 10 ppmCH3I – 21ppm → 'Schweratomeffekt' (Hochfeldverschiebung)CH3OCH3 61.2 ppm

• γ-Effekt: in C-Kette Abschirmung des C-Atoms in γ-Stellung zu X (X = OH, Cl, CO, ...)

Extrembeispiele: CF4 119 ppmCI4 – 292 ppm

6

33

26 30

29 32

23

14 ppm

αβ

γ

• γ-Effekt bei stereochemischen Problemstellungen

NOH

21.5 14.7 17.6

137.5

12.9

132.2

+ -

156 ppm 128.5 ppm 100 ppm

R

O

RC

+R

O

R

O

R

R

C

O+

R

R

Elektronendichte: je geringer die Ladungsdichte (je 'positiver') desto größer die chemische Verschiebung (ähnlich 1H-NMR)

Substituenteneinflüsse:• α-Effekte bei Dreifachbindungen

CH3-C≡N CH3-C≡C-H CH3-CH=CH20.3

117.7

1.9 19.4

133.4

115.9

79.2

66.9

127.4

127.4

199.0

129.9

150.6

142.5

93.0

158.6

91.7

13C chemische Verschiebungen

Signalintensität: 13C-NMR Spektren unter üblichen Aufnahmebedingungen nicht integrierbar da sehr große Unterschiede im Relaxationsverhalten der einzelnen C-Atome; quartäre C-Atome meist geringere Signalintensität

13C,1H Spin-Spin Kopplung*

1J: direkte Kopplung 100 – 300 Hz, meist 120 – 200 abhängig von der Hybridisierung: sp > sp2 > sp3

(Ethan: 1J = 125 Hz, Ethen : 1J = 156 Hz, Ethin: 1J = 248 Hz)elektronegative Substituenten am C-Atom vergrößern 1J

2J, 3J, 4J ..... – 10 bis 60 Hz, meist 0 – 20 Hz (Absolutbetrag)

Nachteil 1H-gekoppelter Spektren: massive Signalüberlagerungen, zusätzlichVerschlechterung des Signal/Noise (S/N) durch Aufsplitten der Resonanzen insehr viele Linien (z.B. R-CH2-CH2-CH3 → 36 Linien!

⇒ Entkopplung von 1H !!

* Aufspaltungsregeln wie bei 1H

13C-NMR Entkopplungstechniken

Bei der Entkopplung erfolgt auch ein Empfindlichkeits-gewinn durch den Nuclear Overhauser Effekt (NOE)!

1H-gekoppeltes 13C-NMR

1H-NMR Bereich 13C-NMR Bereich

1H-breitbandentkoppeltes13C-NMR (lauter Singuletts)

off-resonance entkoppeltes 13C-NMR: 2J, 3J eliminiert, 1J reduziert* (SFORD)

selektive Entkopplung

Cq CH CH2 CH3CH CH2 CH3

* veraltet, heute Multiplizitätsinformation via Editing mittels APT, DEPT, INEPT u.a

APT - Attached Proton Test (auch SEFT, JMODXH)*

BB

APT

CH, CH3

Cq, CH2

O

1

2

3

4

5

6

AB

CE

D

A

BC

D E

1

4

2/6 u. 3/5

* SEFT = Spin Echo Fourier TransformJMODXH = J-modulated Spin-Echo

200 100 0 ppm

Spektren-Editing via DEPT*

*Distorsionless Enhancement by Polarisation Transfer

OH

1

2

34

5

6

A

BC D

CH

CH2

CH3

alle CHn

quartäre C-Atome werden nicht erfasst!

CDCl 3

Ibuprofen: 13C (oben) plus DEPT editing

13C-NMR - Inkrementberechnungen

Me

MeMe

OH

Me

OH

Me

OH

128.5+ 9.3

128.5+ 0.6

128.5+ 0.0

128.5-3.1

128.5+ 0.6

128.5+ 0.0

137.8129.1

128.5

125.4

129.1

128.5

137.8+1.4129.1-7.3

128.5+26.9

125.4-12.7

129.1-12.7

128.5+1.4

139.2121.8

155.4

112.7

116.4

129.9

139.9121.9

155.1

112.5

116.3

129.5

128.5

Berechnung von m-Cresol (3-Methylphenol):

berechnet gefundenComputerprogramm zur Spektrenabschätzung:CSEARCH robot referee – CSEARCH/NMRPREDICThttp://nmrpredict.orc.univie.ac.at/c13robot/robot.php

2D-NMR

PräparationEvolution/Mixing Detektion FID

• Evolutionsphase t1 wird systematisch variiert

• FID damit von 2 Zeitvariablen abhängig (t1,t2)

• 2 × Fourier-Trasformation (nach t1 und t2)

• Signal durch 2 Frequenzen charakterisiert

t1 t2

• δ,δ-Spektren: auf beiden Achsenchemische Verschiebungen

• δ,J-Spektren: auf einer Achse chem.Verschiebung, auf der anderenKopplung

Evolution mix

1D-Spektrum

2D - Contour Plot (Konturdiagramm)

2D-NMR - Darstellungsmöglichkeiten

2D - Stacked Plot

COSY (Correlated Spectroscopy)

Information über das Kopplungsnetzwerk (welches H koppelt mit welchem H?)

Diagonalsignale: 'normales' Spektrum

Kreuzsignale: zeigen Korrelationen an

O

A B

C

D

E

A

B

C

D

E

A

B

C

D

E

2

3

5

7

8

Chinin – COSY, Aromatenbereich

7

HETCOR (idente Information: HMQC, HSQC)*→ Welches H hängt an welchem C?

13C-NMR

1H-NMR

O

A B

C

D

E

A

E

B

C

D

AB C D E

* HMQC: Heteronuclear Multiple Quantum Coherence; HSQC: Heteronuclear Single Quantum Coherence

1013

14

1617

18

19

2

3

45

6

7

88a

1

4a

1112

21

20

15

Chinin – HSQC editiert

CH, CH3: rotCH2: blau

HSQC

HMBC: C,H-Korrelation über mehrere Bindungen

Korrelation über eine Bindung (1J) wird unterdrückt

Chinin – HMBC, Aromatenbereich

2 8 3 7 5

2

8

3

7

5

208a

6

4a

4

21

nicht vollständig unterdrückte 1J-Kopplung

HeteronuclearMultipleBondCorrelation

NOESY – Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

Hb

Ha

Hc

C

Hb

Ha

Hc

δ δ δ δ (f2)

δ δ δ δ (f1)

Räumlich benachbarte Kerne (d < ~ 3.5 - 4Å) geben Kreuzpeaks (off-diagonal) → Distanzinformation!

starker NOE,d klein

schwacher NOEd größer

Hd

kein NOE,d zu groß

Hd

NH

NH 6‘ 6ax

1ax

3ax,5ax

6eq

NOESY - Beispiel

1ax

N C

N C

NOE

NOE

C

N

C

N

NOEs bei der Strukturbestimmung von Proteinen

NOEs bei der Strukturbestimmung von Proteinen

αααα-helix (NHi-NHi+1)

ββββ-sheet ( NHi- HAi-1 )( HAi - HAj )

NH(i)

NH(i-1)

Praktische Durchführung von Messungen

• Probe wird in deuteriertem Lösungsmittel gelöst; häufig verwendet: CDCl3, d6-DMSO, d6-Aceton, d6-Benzol, D2O

• Lösung wird in zylindrisches Röhrchen (NMR-tube, Durchmesser meist 5 mm) gefüllt und dieses mit Teflonkappe verschlossen

• Röhrchen wird mit Spinnerturbine versehen (richtige Position wird mit Schublehre eingestellt – siehe Bild)

• Röhrchen wird in der Bohrung des Magneten (oder im Autosampler) platziert und mittels Pressluftstrom in den Probenkopf befördert

• ‚Lock‘ (Konstanthalten des Feld/Frequenz-Verhältnisses via Deuterium-Signal)• ‚Shim‘ (Feinhomogenisierung des Magnetfeldes via Shimspulen)• Abstimmung der Receiver-Empfindlichkeit• Messung durch Acquisition und Addition mehrerer Pulse (scans)→ FID

• Prozessieren (FT, Phasenkorrektur) meist dezentral

Resümee NMR - wichtigste Anwendungen in der pharm. Analytik/organ. Chemie

• Analytik in der Synthese: Kontrolle präparativen Arbeitens(Konstitution, Einheitlichkeit, Verunreinigungen)

• Strukturbestimmung in Lösung: Konstitution und Stereochemie, vonSyntheseprodukten, Naturstoffen, Biomolekülen; auch für größereMoleküle (z.B. Proteine zur Zeit bis ca. 30 kD ~ 250 Aminosäuren, allerdings erst nach Isotopenanreicherung)

• Untersuchung intermolekularer Wechselwirkungen(Enzym-Inhibitor, DNA-Interkalator oder Repressor, Rezeptor-Substrat, Rezeptor-Arzneistoff, Antikörper-Antigen usw.)

• Untersuchung der molekularen Dynamik(via Relaxationsparameter), z.B. Proteinfaltung, Proteinfunktion

• Bestimmung von Diffusionsparametern

DANKE!

Prüfungsmodalitäten für ‚Instrumentelle pharmazeutische Analytik‘

• Die Prüfung erfolgt schriftlich (ausnahmslos!)• 10 Fragen (darunter können unter anderem auch Rechenbeispiele,

multiple-choice Fragen, Skizzen, usw. sein)• Zur Beantwortung der Fragen steht genau 1 h Zeit zur Verfügung• Die Fragen müssen mit einem nicht-radierbaren Permanent-

Schreibgerät (Kugelschreiber, Faserschreiber, Füllfeder, NICHT mit Bleistift) beantwortet werden

• Die Verwendung von Taschenrechnern, Mobiltelephonen und anderen Hilfsmitteln ist nicht gestattet. Es wird empfohlen, ein Lineal zur Prüfung mitzubringen

• Für jede richtig beantwortete Frage wird 1 Punkt vergeben, dafür muss die Frage vollständig richtig beantwortet werden (es werden keine halben Punkte vergeben)

• Notenschlüssel: 10P = 1, 9P = 2, 8P = 3, 7P = 3, 6P = 4, ≤ 5P = 5 • Laut einer Richtlinie der Studienprogrammleitung werden komm.

Prüfung gleichzeitig mit den ‚normalen‘ Prüfungen unter den selben Rahmenbedingungen und mit den selben Fragen durchgeführt