Kinetik der Hämiglobinbildung

Arch. exper. Path. u. Pharmakol., Bd. 211, S. 345--361 (1950).

Aus der Medizinischcn Klinik Kiel.

Kinetik der H/imiglobinbildung. VII . Mitteilung*.

Die Stoffweehselvorg/inge in roten Zellen bei der H/imiglobinbildung dureh den Kreisprozell Phenylhydroxylamin-Nitrosobenzoh

Von MANFRED KIESE und ~[ANS-])IERCK WALLER.

M_it 9 Textabbildungen.

(Einffegangen am 4. April 1950.)

Wir haben gefunden, daI~ die Oxydation mehrerer ~quivalente H~moglobin durch eine ~¢Iolekel Phenylhydroxylamin oder Nitrosobenzol in roten Zellen (lurch enzymatische Reaktionen in den roten Zellen bewirkt wird, die Glukose als Substrat gebrauchen 1, 2. Der Angriffspunkt der Enzymwirkung ist die Reduktion des Nitrosobenzols, das als Oxydations- produkt des Phenylhydroxylamins in den roten Zellen auftr i t t a, zu Phenylhydroxylamin. Die Untersuchung der Reduktion des H/imi- globins in roten Zellen hat ergeben, dab in den roten Zellen mindestens 4 verschiedene Fermentsys teme vorhanden sind, die reduzierend wirken kSnnen 4. Durch ~essung der H/imiglobinbildung und der Stoffwechsel- reaktionen konnten wir nun das Fermentsys tem bestimmen, welches vor allen anderen an der Reduktion des Nitrosobenzols beteiligt ist. Die An- wendung verschiedener Substrate ergab zun~chst, da[~ ~ilchsiiure und J(pfels~ure den Kreisproze] nur sehr langsam zu unterhalten vermSgen, w~hrend mit Glukose Geschwindigkeiten erreicht werden, die denen in vivo vergleichbar sind. Glukose liefert bei ihrer Vergi~rung in den roten Zellen neben 1V[ilchs~ure Substrute fiir z~vei verschiedene reduzierende Fermentsysteme, n~mlic[L Triosephosphat, das vom oxydierenden Ggrungsferment und Diphosphopyridinnueleotid zu Brenztraubens~ure dehydriert wird, und Hexose-6-phosphat, das vom Zwischenferment und Triphosphopyridinnueleotid dehydriert wird. Das hydrierte Triphospho- pyridinnucleotid gibt den Wasserstoff an die H~miglobinreduktase ab und wird - - gebunden an andere Proteine - - yon den Dehydrierungs- larodukten des tIexose-6-phosphats wiederum hydriert , bis die Hexose zu Kohlendioxyd oxydiert ist.

Die iKessung des dureh den Kreisprozel~ Phenylhydroxylamin-Nitroso- benzol gebildeten Kohlendioxyd und Brenztraubens~ure ergab eine

* VI. Mitt. Arch. exper. Path. u. Pharmakol., 211, 115 (1950).

346 M. KIF~S~: u. H.-I). WAL1,ER:

Zunahme der Brenztraubens/~urebihlung, die der bei Reduktion yon H/tmiglobin in roten Zellen entsprach und somit durch das Auftreten yon H/imiglobin in (ten Zellen erkl/irt war. Die Bildung yon Kohlen- dioxyd wurde durch den Kreisprozell sehr stark erh6ht. Sie war dreimal so grog, wie die yon Brenztraubens/iure ; d. h. das Kohlendioxyd bildende Fermentsystem iibertrug in der Zeiteinheit 6 mal soviel Wasserstoff wie die Systeme, (tie Brenztraubens/iure bilden. Beriieksichtigt man noch, (lag die Brenztraubensaurebildung haupts/~chlich aus der Reduktion yon H/~miglobin resultiert, so wird der Anteil der Brenztraubens/£ure bildenden Systeme (Diphosphopyridinnucleotid-Systeme) an der Reduktion yon Nitrosobenzol noch geringer. Das wird durch Messungen der Reduktion yon Nitrosobenzol in roten Zellen unter AussehluB yon Sauerstoff be- stiitigt ~. Unter diesen Bedingungen wird H/~miglobin nicht gebildet, urd (lie w/ihrend der Reduktion yon Nitrosobenzol gebildete Menge Brenz- traubens/£ure macht nur 2 - -3% des Kohlendioxyds aus. Die Reduktion des Nitrosobenzols erfolgt also durch die hydrierte H~tmiglobinreduktase.

Die Oxydation des Phenylhydroxylamins zu Nitrosobenzol bedingt eine zus/~tzliche Sauerstoffaufnahme der roten Zellen neben der normalen Atmung und dem Sauerstoff, der zur Oxydation des H/~moglobins zu H/~miglobin verbraueht wird. Diese Steigerung der Sauerstoffaufnahme toter Zellen dureh Phenylhydroxylamin war schon 1931 von WARBURG, KunowlTZ undCHRISTIAN s beobachtet, aber damals noch nichtrichtig gedeutet worden; sp~tter nahm WAI~BURG 7 die Oxydation des Phenyl- hydroxylamins zu Nitrosobenzol als Ursaehe der zus/itzlichen Sauerstoff- aufnahme an. Wir haben die durch Phenylhydroxylamin und Nitroso- benzol bewirkte Steigerung der Sauerstoffaufnahme gemessen, um den Wirkungsgrad des Kreisprozesses zu bestimmen.

Nach Zugabe von Phenylhydroxylamin oder Nitrosobenzol zu roten Zellen steigt die Geschwindigkeit der Sauerstoffaufnahme sofort an und kann in 3/[ensehenzetlen das 100fache der normalen Atmung erreichen. Ebenso wie die Geschwindigkeit der H/~miglobinbildung klingt die Geschwindigkeit der Sauerstoffaufnahme mit der Zeit ab. Von dem dnreh die Phenylhydroxylaminwirkung aufgenommenen Sauerstoff ent- f/~llt bei Phenylhydroxylaminkonzentrationen yon 10-7--10 -3 Mol/1 ein Viertel bis ein Drittel (im Mittel aller Versuche 0,28) auf die Oxydation von Hamoglobin zu H/~miglobin, zwei Drittel bis drei Vierte] erseheinen als Kohlendioxyd und Brenztraubensi£ure. Nehmen wir an, dab die Brenztraubens~ure im wesentlichen durch Reduktion yon H/~miglobin gebildet wird (s. o.), so erh6ht sieh der fiir die Oxydation von H/imoglobin verbrauchte Anteil des Sauerstoffs noch ein wenig.

Als Netto-Ergebnis werden also bei jeder Oxydation einer 3/[olekel Phenylhydroxylamin im Mittel 0,8Xquivalent HKmiglobin gebildet. Dieser Wirkungsgrad des Kreisprozesses erscheint gering, wenn man be-

Kinetik der H&miglobinbildung: VI[. 347

denkt, dab es sich bei der Hgmiglobinbildung durch Phenylhydroxyl- amin und Sauerstoff um eine gekoppelte Oxydation handelt , die H~UB- ~]~R8 9 so formuliert, dab bei jeder Oxydation eines Phenylhydroxyl- amins 2 ~quivalente Hi~miglobin gebildet werden. Wie welt eine lockere Kopplung der beiden Oxydationen oder die Redukt ion yon H~miglobin durch Phenylhydroxylamin diesen niedrigen Wirkungsgrad bedingt, werden wir nach Unterbrei tung unserer Messungen der Kinet ik der Re- duktion von H~miglobin durch Phenylhydroxylamin 10 erSrtern.

Je nach der zugesetzten Konzentrat ion yon Phenylhydroxylamin oder Nitrosobenzol ist deren Wirkung nach 2 - -3 Std beendet. Nach der Wir- kung der hSheren von uns untersuchten Konzentra t ionen yon Phenyl- hydroxylamin sind die roten Zellen leichter zu h~molysieren, bzw. h~mo- lysiert bereits ein kleiner Teil der empfindlichen Hundezellen w~hrend des Versuches. Die Umsetzungen des Phenylhydroxylamins in den Zellen verursachen demnach gewisse Veri~nderungen an den Proteinen der Zellen, die nicht im Rahmen der physiologischen Stoffwechselbahnen liegen. Wahrscheinlich gehSren auch die Proteindenatnrierungen, die der Bildung von HeinzkSrpern durch Phenylhydroxylamin zugrunde liegen, hierher. Die Wirkung des Phenylhydroxylamins in den roten Zellen wird jedoch nicht durch eine ZerstSrung der Fermente oder Verbrauch von Substrat beendet, sondern durch den Schwund des Giftes in einer Ent- artungsreaktion. Durch erneuten Zusatz yon Phenylhydroxylamin oder Iqitrosobenzol kann niimlich die Hgmiglobinbildung und Sauerstoffauf- nahme wieder beschleunigt werden. Die In tak the i t der Fermentsys teme wird auch durch die Hgmiglobinreduktion nach Beendigung der Phenyl- hydroxylaminwirkung und ihre Beschleunigung durch Farbstoffe er- wiesen.

Der Kreisprozel~ Phenylhydroxylamin-Nitrosobenzol ~vird yon einer Ket te enzymatischer Reaktionen unterhalten, die unter normalen Be- dingungen der Redukt ion yon H~miglobin, also der Erhal tung des H~moglobins in funktionsfiihigem Zustande dienen. Die Reaktions- fi~higkeit des Nitrosobenzols mit der Hi~miglobinreduktase ermSglicht eine Giftwirkung, welche die Wirkung des Fermentsystems in die ent- gegengesetzte Richtung umkehrt .

Die Reduktion des Nitrosobenzols durch die H~miglobinreduktase und ihre Auswirkungen legen den Vergleich mit der Wirkung der reversibel reduzierbaren Farbstoffe nahe, welche die Reduktion des H~miglobins in roten Zellen katalysieren, wie Toluidinblau, Methylenblau, Thionin u. a. I)iese werden ebenfalls yon der H~miglobinreduktase redu- ziert n. Ih r l%eduktionsprodukt reagiert ebenso wie das t~eduktionsprodukt des Nitrosobenzols, das Phenylhydroxylamin, sowohl mit Sauerstoff wie mit Hi~miglobin. Aber die Reaktion des Phenylhydroxyl- amins mit Hi~miglobin verli~uft - - namentlich bei niedrigen Hiimiglobin-

348 M. KIESE U. H.-D. "~VALLER*

k o n z e n t r a t i o n e n - - | a n g s a m 1°, w ~ h r e n d d ie R e a k t i o n y o n P h e n y l - h y d r o x y l a m i n m i t S a u e r s t o f f u n d Hi~moglobin zu H~tmiglobin u n d

N i t r o s o b e n z o l h ~ m o g l o b i n sehr schne l l ve r l~u f t le, 13. D e m g e g e n i i b e r is t

(lie G e s c h w i n d i g k e i t de r R e a k t i o n y o n h y d r i e r t e m T o l u i d i n b l a u ode r :~[e thy lenblau m i t S a u e r s t o f f u n d m i t Hi~miglobin v o n g le icher Gr613en-

o r d n u n g , so d a b diese z w a r wie P h e n y l h y d r o x y l a m i n die Sauers to f f - a u f n a h m e der r o t e n Ze l l en e r h S h e n 14, 1~ a b e r a u c h in G e g e n w a r t v o n S a u e r s t o f f H~i~miglobin r e d u z i e r e n le, 17, is, 19

Versuche.

A. Methoden. Die Untersuchungen wurden an roten Zellen von Menschen und ttunden

durchgefiihrt, weft in Menschenzellen die Erh6hung der Sauerstoffaufnahme durch Phenylhydroxylamin gegeniiber der normalen Atmung sehr stark ist und wir andererseits an Hunden tmsere Untersuchungen in vivo durchgeftihrt hatten 20. Das Blut wurde defibriniert, die Zellen auf der Zentrifuge vom Plasma abgetrennt, mit isotoner Natriumehloridl6sung und danach mit Carbonat-RiNo~mL6sung bzw. Phosphat-RINcER-L6sung mehrmals gewaschen. Die Zellen wurden dann mit C~rbonat- bzw. Phosphat-RI~GER-L6sung meist so verdiinnt, d~B der Blut- farbstoffgehalt der Suspensionen 15--17 g/100 ml betrug. Glukose wurde in einer Konzentration von etwa 300 mg/lO0 ml Suspension zugesetzt. Bei allen Unter- suchungen wurden die Zellen im Wasserbad bei 37°C gehalten. Die Zellsuspen- sionen in Phosphat-Ri~OER-L6sung wurden durch Schtitteln mit reinem Sauerstoff im Gleichgewieht gehalten, die Suspensionen in Carbonat-RINCER-LSsung mit einem Gemisch von 19 Teilen Sauerstoff und 1 Teil Kohlendioxyd. Die Carbonat- I~L'~GEz-L6sung enthielt 6 g NaCI, 0,2 g KC1, 0,3 g CaC12, 0,1 g MgC1, und 2 g NaHCO3, sowie 3 ml isotoner Phosphatl6sung vom PH 7,4 im Liter. Die Phosphat- RI~GER-L6sung bestand aus 9 Teilen einer L6sung von 8,5g NaCl, 0,23 g KCl und 0,25 g CaC12 im Liter und 1 Teil isotoner Phosphat-LSsung.

Die Geschwindigkeit tier Hgmiglobinbildung wurde durch Messung der H~miglobinkonzentration in entspreehenden Ans~tzen zu versehiedenen Zeiten naeh Zugabe von Phenylhydroxylamin oder Nitrosobenzol bestimmt. I-Ii~miglobin- konzentrationen wurden mit der Cyanid-Methode 21, 22 gemessen.

Die Sauerstoffaufnahme wurde manometrisch nach WARBURG 2~, und zwar sowohl nach der einf~ehen Methode unter Absorption des Kohlendioxyds, wie nach der Gef~Bpaarmethode, die gleichzeitig die S~nrebildung mil~t, bestimmt. In der Bestimmung der Retention yon fixen S~uren und Kohlendioxyd sowie der Trennung der S~uren in Kohlendioxyd und fixe S~uren folgten wir ebenfalls W~d~BURO 6, d~ wir auf anderem ~Vege ermittel t haben, dad der Sauerstoff der nicht ftir die Oxydation von H£moglobin verwandt wird, nur zu einem kleinen Teil als Brenztraubens~ure und im wesentliehen als Kohlendioxyd auftritt.

in groBen Ans~tzen, deren Konzentration an roten Zellen, Glukose und Phenyl- hydroxylamin bzw. Nitrosobenzol denen in den W~R~UR~-Gef~flen entsprach, wurde ferner dureh Probeentnahme die ~nderung der Konzentration folgender Substanzen best immt; Glukose naeh H-~OEDOR:~ und JE~SE~ 2t, Milchs~ure dureh Oxydation mit Cerisulfat zu Azetaldehyd 2~ und ~[essung des in der Apparatur von FucHS 2~ abgetrennten Azet~ldehyds naeh CL~trSEN 27, Brenztraubensi~ure als Dinitrophenylhydrazon nach Lu 2s, freies Phosphat als Stryehninphosphormolybdat gravimetrisch naeh EMBDEN 29, leieht hydrolysierbares Phosphat und Gesamt- phosphat gravimetrisch nach v. LORENZ ~°, 3~. Die Aufnahme von Sauerstoff und

Kinetik der Hiimiglobinbfldung. VII. 349

Bildung von Kohlendioxyd wurde in diesen Ans~tzen bestimmt, indem ein Teil in ein dieht versehlossenes Gef~B ohne Bildung eines Gasraumes gebracht und der Gehalt der Suspension an Sauerstoff und Kohlendioxyd vor dem VerschlnB und nach bestimmten Zeiten nach vA~ SLYXE und NEILL 3~ gemessen wurde. Die im folgenden angegebenen Reaktionsgeschwindigkeiten (Sauerstoffaufnahme, Kohlendioxydbildung, Milchs~urebildnng usw.) wurden - - wenn nicht anders angegeben - - fiir Zellsuspensionen mit einer Blutfarbstoffkonzentration yon 15 g/100 ml Suspension bereehnet.

Phenylhydroxylamin wurde in RI~GER-LSsung, die mit Kohlendioxyd oder Stickstoff yon Sauerstoff befreit war, gelSst. Die LSsliehkeit yon ~Nitrosobenzol in Wasser ist zu gering, um die erforderlichen Mengen in den kleinen Mengen RINGEmLSsung zu 15sen, die in die Seitengef~l]e der WARBURc-Gef~I3e gegeben wurden. Darum wurde Nitrosobenzol zun~chst in Azeton gelSst und diese LSsung dann mit der 4fachen Menge RI~G~.R-LSsung verdiinnt. Durch die Anwesenheit yon Azeton im Seitengef~ wurde im Gasraum ein hoher Azetondruck unterhalten, und Azeton destillierte fortlaufend aus dem Seitengef~B in die Zellsuspen- sionen. Mit dem Einkippen der Fliissigkeit des Seitengefal~es in den tta~ptraum sank der Azetondruek entsprechend der Verdiinnung des Azetons. Diese I)ruck- • nderung wurde durch Kontrollversuche gemessen und dann yon den I)rucken in den einzelnen Versuchen abgezogen. Die Notwendigkeit dieser Korrektur maehte genaue Einhaltung des durch die Kontrollmessungen festgelegten Rhythmus der einzelnen Operatioimn erforderlieh.

B. Ergebnisse.

a) Sauersto//au/nahme und Hdmiglobinbildung. Die fo r t l aufende manome t r i s che B e s t i m m u n g der Sauers toffauf-

n a h m e ro te r Zel len un te r der E inwi rkung yon P h e n y l h y d r o x y l a m i n oder Ni t rosobenzo l nach der ~[e thode yon WARBURG wird kompl i z i e r t dureh die Hi~miglobinbi ldnng, welche die F re i se tzung des an das H~moglob in gebundenen Sauers toffs zur Fo lge ha t . So k a n n nach Zugabe von Pheny l - h y d r o x y l a m i n bei der d i r ek ten Messung der Sauers to f faufnahme (Ab- so rp t ion des K o h l e n d i o x y d s ) der Sauers to f fdruck zun~ehst unve r~nde r t b le iben oder sogar ans te igen, wie die Abb. 1 zeigt . Zur E r rechnnng der Sauers to f faufnahme mul] te also die Ande rung der H~mig lob inkonzen- t r a t i o n zu jeder Zei t b e k a n n t sein. Diese wurde in pa ra l l e l l au fenden GroBans~tzen fo r t l au fend gemessen. N a h m l~ngere Zei t nach dem Zusatz von P h e n y l h y d r o x y l a m i n oder Ni t rosobenzol die H~miglob inkonzen- t r a t i o n wieder ab, so mul~te der vom neu geb i lde ten H~mog lob in ge- bundene Sauers tof f aus der Sauers tof f~ufnahme wiederum e l imin ie r t werden, da diese nur den dureh i rgendwelche R e a k t i o n e n reduz ie r t en Sauers to f f angeben soll u n d wir die B i ldung von Oxyh~moglob in n ich t als eine R e d u k t i o n des Sauers toffs be t rach ten . Die so e rmi t t e l t e Sauer- s to f faufnahme u n d Zunahme der H~mig lob inkonzen t r a t i on mi t der Zei t i s t in Abb . 2 (Kurve A u. C) da rges te l l t fiir die Einwirkur~g von Ni t rosobenzol in e iner K o n z e n t r a t i o n von l0 -4 mol/1 au f eine Suspension von Hundeze l l en in Phosphat-RINGER-LSsung. Die Anfangsgeschwindigke i t der Sauers to f faufnahme gemessen in ~ q u i v a l e n t e n Sauerstoff /1/min i s t

350 31. K I E S E u . H . - D . ~:VALLER:

drei- bis viermM so grog wie die Geschwindigkeit der H/~miglobinbildung. Mit der Zeit n immt sowohl die Geschwindigkeit der HS, miglobinbildung wie die der Sauerstoffaufnahme ab, aber diese langsamer als jene; und zur Zeit der maxinmlen H/imiglobinkonzentration, wenn diese also nicht mehr weiter ansteigt, ist die Sauerstoffaufnahme der Zellen noch immer grSf~er a]s die der Ze]|en, (tie kein Phenylhydroxy]amin erhalten haben.

Die Anderung des Sauerstoff- 7#0 7 " : ITLTR , , / i i

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Abb. 1. - inderung des Sauerstoffdrucks und Hiimi. globinbi ldung in einer Suspension toter Zellen yore Hunde nach Zusatz yon 2,4 x 10 -4 tool Phenyl- hydroxylamin je Liter. Kurve A : Gemessener Druck inl WARBVRG-Gef/il~. Kurve B: l t / tmiglobinkonzen- t ra t ion gemessen in mm Brodiel6sung 8auerstoff- druek, der sich durch Freisetzung des Sauerstoffs des Oxyh~imoglobins bei dessen Oxydation zu It/i- miglobin ergab. Die Differenz zwisehen Kurve B und A gibt die bis zu jedem Zei tpunkt yon den

Zellen allfgelaolllilaeile Menge Sauerstoff an.

druckes in den Gef~iBen mit der Zeit (Abb. 1) veransehaulicht die ungleiche Anderung der Ge- schwindigkeit der Sauerstoff- aufnahme und der H/~miglobinbildung recht gut. Wenn die Sauerstoffaufnahme 4 real so grog ist wie die Geschwindig- keit der Hi~miglobinbildung, so tr i t t keine Druck~mderung auf. Das trifft ffir den Anfang derPhe- nylh ydroxylaminwirkung bei- nahe zu. Sparer t r i t t eine Druck- abnahme auf, d .h . die Sauer- stoffaufnahme ist mehr als 4ma! schneller als die Geschwindig- keit der HS~miglobinzunahme.

Nachdem die H~miglobinkonzentration ihren H6chst- wert erreicht hat, beh~lt die Sauerstoffaufnahme ihre gegen- fiber der Norm erh6hte Ge- schwindigkeit nicht bei, sondern sinkt bMd wieder auf die Gr6ge

der Atmung normMer Zellen ab (Abb. 2, Knrve A 11. C). Ursache dieser Verminderung der Sauerstoffaufnahme ist nicht eine

Schi~digung der Fermente oder Ersch6pfung des Substrates, sondern das Verschwinden des Giftes. Daffir sprechen mehrere Beobachtungen: Zu dem Zeitpunkt, da die Sauerstoffaufnahme auf normMe Werte zurfick- kehrt, beginnt die gedukt ion des H~miglobins. Wird den Zellen zu dieser Zeit nochmal die gleiche Konzentrat ion Nitrosobenzol hinzugesetzt, so steigt die tt/~miglobinkonzentration weiter an, und die Sauerstoffauf- nahme n immt ebenfMls wieder zu. Beide Reaktionen erreichen eine Geschwindigkeit, die nur wenig geringer ist als die nach der ersten Zugabe von Nitrosobenzol (Abb. 2 Kurve B u. D). Nach hohen Konzentrationen yon Phenylhydroxylamin oder Nitrosobenzol (10-3tool/l) bleibt die

Kinetik der H~miglobinbildung. VII. 351

Hi~miglobinkonzentration l~ngere Zeit auf ihrem H6chstwert. Wird den Zellen zu dieser Zeit ein reversibel reduzierbarer Farbs toff wie Toluidin- blau zugesetzt, der die Redukt ion des H~miglobins katalysiert , so sinkt die Hiimiglobinkonzentration sehr schnell ab, was ebenfalls die In t ak t - heit des H~miglobinreduktase-Systems - - auch nach der Einwirkung hoher Giftkonzentrationen - - beweist (Abb. 3).

2 2

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6~ ~ 780 ~//0 300 rain

Abb. 2. Sauers to f faufnahme und H~miglobinbf ldung in ro ten Zellen yore H u n d e naeh wieder- ho l tem Zusa tz yon Nitrosobenzol. Zur Zeit 0 wurde zwei Ans~tzen 10 -~ tool Nitrosobenzol je L i te r Suspension zugesetzt . K u r v e A und C sind bis 120 rain das /~Iittel der beiden Ans~tze. 2~ach 120 rain wurde e inem Ansa tz nochmal 10 -I tool Nitrosobenzol zugesetzt (Kurve /~ und D) . K u r v e E g ib t die Sauers to f faufnahme yon Zellsuspensionen ohne Zusatz yon Nitrosobenzol an. Zellen in Phospha t - t¢INGER-LSsung PH 7,4 un te r Sauerstoff . Die , ,Sauers to f faufnahme" gibt nu t Sauers tof f an, de r n icht ff i r die O x y d a t i o n yon H~imoglobin zu H~tmiglobin ve rwand t wird. Die Gesamtsauers tof f -

au fnahme is t also jeweils die Summe aus , ,Sauers to f f " - ] - H~imiglobin.

Die Wirkung yon Nitrosobenzol und Phenylhydroxylamin ist nicht an den vorherigen Zusatz yon Glukose gebunden. Wurde verarmten Zellen Phenylhydroxylamin zugesetzt, so reagierte es einmal, dann blieb die H~miglobinkonzentrat ion unver~ndert. Wurde 20--30 rain sparer Glukose zugesetzt, so kam die I-I~miglobinbildung und die Sauerstoff- aufnahme schnell in Gang mit einer Geschwindigkeit, die der Phenyl- hydroxylaminkonzentrat ion bei vorherigem Zusatz yon Glukose entsprach (Abb. 4). Der sofortige Beginn der Reakt ion nach Zusatz yon Glukose spricht dafiir, dab das Substrat fiir die enzymatische Reakt ion schnell in wirksamer Konzentrat ion verfiigbar ist, also nicht Milchs~ure sein kann.

Arch. exper . P a t h . u. Pha rmako l , , Bd . 211. 5 4

352 )¢[. K I E S E u. H . - D . W : , L L n t l :

I n dem yon uns un te r such ten Bereich yon 10 -~ bis 10 -a mol Pheny]- h y d r o x y ] a m i n je L i t e r is t das Verh~l tnis der Geschwindigke i t der I-I~mi- globir .b i ldu~g zu der de r Sauers to f faufnahme fiir den Anfang der Wir- kung im Mi t te l a l ler Versuche 0,28.

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Abb. 3. Abb. 4.

Abb. 3. Besclfleunigung der ~li imiglobinreduktion in roten Zellen yore Hunde nach :Hi£miglobil~- b i ldung durch :Nitrosobenzol. Zellen in Carbonat-l~INOl~R-L6sung mi t 0,3 g Glukose je 100 ml unter Saue r s to f fmi t 5% Kohlendioxyd, Blutfarbstoffkonzentrat ion 17,8 g je 100 ml, PH 7,4, Temp. 370 ('. Zu Beginn 6 × 10 -* mol ]Nitrosobenzol je Liter, nach 200 min 10-amolToluidinblau je Liter zugesetzt.

Abb. 4. Wirkung yon I)henylhydroxylamin auf substratfreie robe Zellen und Wirkung des nach- tr~iglichen Zusatzes yon Glukose.

Robe Zellen vom ]:[unde, durch mehrsti indige Giirung und Waschen veto Substrat befreit, in l~ho~ - phat-RIN(]ER-L6sung unter Sauerstoff, PIE[ 7,4 Temp. 370 C; Blutfarbstoff 15 g/100 ml Zellsuspensiom

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Bol Pheny/hydfoxy/amin bz~z Ni / rosobef¢o/ / L

Abb. 5. Anfangsgesehwindigkeit der Sauerstoffaufnahme lind H~miglobinbildung in roten Zelle~t in Abh/ingigkeif~ yon der Phenylhydroxylamin- bzw, Nitrosobenzolkonzentration.

Kurven M = Mensehenzellen in 1)hosphat-RlNGER-L('Jsllng PH 7,1. Kurven H = Hundezellen in Carb,~- nat-RINGER-LSsung PH 7,4.000 und (£~ O ~ Phenylhydroxylamin. × × × lind G ~ • Nitrosobenzo].

Die Daten f i i r (tie Mensehenzellen beziehen sich auf Phenylhydroxylamin. Auswertung yon 62 Versuehen.

b) Dosis und Wirkung. Die Steigerung der Sauerstoffaufnahme roter Zellen durch Phenyl -

h y d r o x y l a m i n und Nitrosobenzol war yon der Konzentrat ion der Gifte

Kine$ik der H~miglobinbildung. VII. 3 5 3

abh~ngig und stieg in dem untersuehten Konzentrationsbereich mit der Konzentrat ion stetig an. Ebenso wie in der Gesehwindigkeit der H~miglobinbildung und der maximal erreichten H~miglobinkonzentration waren Phenylhydroxylamin nnd Nitrosobenzol in der ErhShung der Sauerstoffaufnahme rotor Zellen gleich wirksam. Als ~al~ fiir die Ge- schwindigkeit der Sauerstoffanfnahme und der H~miglobinbildung w~hl- ten wir die Anfangsgesehwindigkeit, die aus den ersten 5 rain der Reaktion errechnet wurde. In der Abb. 5 ist die Dosis-Wirkungsfunktion der Sauerstoffaufnahme und der H~i- miglobinbildung f'tir zwei Ver- suehsreihen dargestellt, n~mlich l~Iensehenzellen in Phosphat- RI~O~,R-LSsung vom pK 7,1 und Hundezellen in Karbonat-RIN- O~,R-L6sung vom pH 7,4. In beiden F~llen ist die Abhgngigkeit der Wirkungsst~rke yon der Gift- konzentration sowohl fiir die Sauerstoffaufnahme wie die Hii- miglobinbildung gleichartig ; beide sind proportional [Phenyl- hydroxylamin] 0,~. Das bedeutet, dall sieh in dem untersuehten

70 ~ - - f - ~ - I I [ l l l l " --

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IIIII I ?Ndlll

IIII IIIIII I II] i z 3 ~ g z~ 5 2 ~ g 8 ~ s j g ~ 70 -3

Mol Ph~lhydroxylamin/ t

Abb. 6. l~Ii£tlere Wechselzahl des Phenylhydroxy- lamins Jo Minute in Abhiingigkeit yon der Phenyl- hydroxylaminkonzentra t ion . Rote Zellen yore Men- schen in Phosphat-RINOER-L~sung vom PfT 7,1.

Konzentrationsbereich die Ausbeute an H~miglobin aus dem aufgenommenen Sauerstoff nieht i~ndert. Der Abstand der Sauerstoff- yon der H~miglobingraden ist in den hier ausgewerteten Versuehen bei den N[ensehenzellen etwas grSl3er als bei den Hundezellen ; dementspreehend ist der Quotient H~miglobin zu Sauerstoff bei den N[enschenzellen etwas kleiner (0,25) als bei den Hundezellen (0,28).

Da die Sauerstoffaufnahme nicht proportional der Phenylhydroxyl- aminkonzentration ansteigt, mug die mittlere Wechselzahl des Phenyl- hydroxylamins mit zunehmender Konzentrat ion kleiner werden. In Abb. 6 ist die mittlere Wechselzahl fiir die Anfangsgeschwindigkeit in Abh~ngigkeit yon tier Phenylhydroxylaminkonzentrat ion dargestellt. In einer Suspension yon ]V[ensehenzellen in Phosphat-RINoF,~-L6sung yore pH 7,1 steigt sie Yon 1,5 bei einer Konzentrat ion yon 10 -~ tool Phenyl- hydroxylamin je Liter anf 95 je Minute bei einer Konzentrat ion yon l0 -~ tool Phenylhydroxylamin je Liter an. Die hier errechnetenWechsel- zahlen sind hSher als die in einer friiheren VerSffentliehung genannten, weft do: t die Wechselzahl nut auf die H~miglobinbfldung, hier aber auf den gesamten iibert:agenen Sauers$off bezogen ist.

Unter gleichen Bedingungen ist die dutch Phenylhydroxylamin be- vcirkte Sauerstoffaufnahme in roten Zellen vom Hunde und Menschen

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354 ~1. KIESE U. H.-D. WALLER:

nur wenig verschieden. Bezogen auf die normale Atmung der Zellen aber ungleich, da die Atmung der Hundezellen doppelt so groB ist wie die dcr )¢[ensehenzellen, 0,018 gegeniiber 0,009 ~quivalent Sauerstoff/Liter/ Minute in Zellsuspensionen mit 15 g Blutfarbstoff je 100 ml Suspension. Die Anfangsgeschwindigkeit der Saucrstoffaufnahme yon Menschenzellen erreichte unter der Einwirkung yon 10 -a tool Phenylhydroxylamin, der hSchsten yon uns untersuchten Konzentration, fast den hundertfaehen Wert der normalen Atmung.

c) Sauer s to / l b i l anz .

Von dem unter der Einwirkung yon Phenylhydroxylamin oder Nitroso- benzol aufgenommenen Sauerstoff wird eine der H~miglobinmenge ~iquiv,~lente i~[enge zur Oxydation des Hgmoglobins verbraucht, also ein Viertel bis tin Drittel der Sauerstoffmenge. Durch die Aufkl~rung des Verbleibs des I4estes des aufgenommenen Sauerstoffs war zu entscheiden, welches l%rmentsystem die Reduktion des Nitrosobenzols durchffihrt.

Zellsuspensionen in Phosphat-RINGEmL6sung wurdcn unmittelbar m~ch Zusatz yon Phenylhydroxylamin oder Nitrosobenzol in vcrschlieB- bare Gef~Be gegeben und vor dem VerschluB sowie nach der 0ffnung naeh bestimmtcr Zeit der Gehalt an Sauerstoff, Kohlendioxyd, ]3renz- traubensgure und ttgmiglobin bestimmt. Da in den Gefgl~en die Bildung einer Gasphase vcrmieden wurde, ergab die Analyse der Suspension quantitativ den Sauerstoffverbraueh und die Kohlendioxydbildung.

Fiir die Ansgtze wurden verschiedene Phenylhydroxylamin- und Nitrosobenzolkonzentrationen sowie Rcaktionszeiten gewghlt. Die einzelnen gcmessenen GrSBen sind darum bci mehreren Versuchen nicht unmittelbar miteinander vergleichbar. In (ler Tab. 1 sind Mittel aus

Tabelle 1. Sauersto//verbrauch, Bihtung yon Kohlendioxyd und Brenztraubensdure in Suspeusionen roter ZeUen vom Hunde in Phosphat-Ringer-L6sung pH 7,4 in 60 rain nach Zusatz vo~ 3 × 10 -4 tool; Phenylhydroxylamin oder Nitrosobenzol je Liter. Blut/arbsto/lgehalt der Suspensionen 19--20 g/lO0 ml. Mittel aus 4 Versuchem

Verbraucht: 3,5 × 10 -a mol Sauerstoff/l Gebildet: 1,87 × 10-amol CO2/1, erfordern: 1,87 × 10 -a tool Sauerstoff/l

4,8 × 10-aJ~quivMent HblII/1 1,2 X 10 -a 0,62 × ]0 a tool Brenztraubensgure/l 0,31 × 10 -a

3,38 X 10 a tool Sauerstoff/'l.

4 Versuchen wiedergegeben, (tie unter ganz gleiehen Bedingungen durchgefiihrt wurden. Zellsuspensionen mit 19--21g Blutfarbstoffin Phosphat- RING'ER-LSsung vom pu 7,4 waren 3× 10 --4 tool Phenylhydroxylamin oder Nitrosobenzol je Liter zugesetzt und die Bildung yon Kohlen- dioxyd, Brenztraubensgure und Hgmiglobin sowie der SauerstoftYer- brauch nach 60 rain gemessen. Die Summe des znr Bildung yon Kohlen-

Kinetik der Hitmiglobinbildung. VII. 355

dioxyd, Brenztraubensi~ure und H~miglobin verbrauehten Sauerstoffs wieh nur innerhalb der Streuung yon der aufgenommenen Sauerstoff- menge ab. Ein Dri t tel des aufgenommenen Sauerstoffs wurde zur Oxy- dation yon Hiimoglobin zu Hi~miglobin verbraucht, mehr als die H~lfte wurde als Kohlendioxyd wiedergefunden und nur ein Zehnte] war in der Brenztraubens~ure vorhanden.

Um gut auswertbare Unterschiede in der Anfangs- und Endkonzen- t rat ion der gemessenen Stoffe zu erhalten, wurden grSfiere Zeitabst~nde, 1--2 Std, zwischen der Zugabe yon Phenylhydroxylamin oder :Nitroso- benzol und der zweiten Analyse der Suspension gew~hlt. Die Versuche erlauben daher keine Angaben fiber die Reaktionsgeschwindigkeit, ins- besondere die Anfangsgesehwindigkeit. Fiir deren Best immung wurden anderen Ans~tzen Proben in kfirzeren Zeitabst~nden entnommen.

d) Kohlenhydratbilanz. Suspensionen roter Zellen des Hundes in Phosphat-RI~GE~-L6sung

mit einem Blutfarbstoffgehalt yon 20 g/100 ml verbrauchen in einer Stunde etwa 0,7 m tool Glukose je Liter. ~¢[ehr als 0,8 dieser Glukose ist als Milchs~ure nachzuweisen, 0,15 als Brenztraubens~ure und Kohlen- dioxyd. Die Summe der ~¢[ilchs~ure, Brenztraubens~ure und K0hlen- dioxyd entspricht innerhalb der Streuung dem Verbrauch an Glukose. Andere Verbindungen entstehen aus Glukose - - wenn iiberhuupt - - nur in minimaler Konzentrat ion. I n den in Tab. 2 wiedergegebenen Ver- suchen betrug die Abnahme der Glukosekonzentration in einer Stunde 0,67 m mol/1; die Summe der gebildeten Milchs~ure, Brenztraubens~ure und des Kohlendioxyds war 0,64 m mol Glukose/1 iiquivalent.

Durch die Einwirkung yon Phenylhydroxylamin oder Nitrosobenzol auf die roten Zellen des I-Iundes wird deren Zuckerverbrauch erhSht. Die Milchs~turebildung bleibt im Mittel gleich. Die dutch die Nitroso- benzolwirkung zns~tzlich verbrauchte Glukose wird zu Kohlendioxyd und Brenztraubens~ure oxydiert. Auch in diesem Falle ist die gesamte Yerbrauchte Glukose a]s Milchs~ure, Brenztraubens~ure und Kohlen- dioxyd wiederzufinden. Die :Daten der Tab. 2 zeigen, dal~ dutch die Einwirkung yon 3 × 10 -4 tool Phenylhydroxylamin oder Nitrosobenzol je Liter Zellsuspension deren Glukoseverbrauch in der ersten Stunde doppelt so grol~ war wie der yon Zellsuspensionen ohne Phenylhydroxyl- amin. Die Glukosekonzentration sank um 1,22 m tool/l, und die Summe aus gebildeter Milchs~ure, Brenztraubens~ure und Kohlendioxyd war 1,21 m mol Glukose/1 ~quivalent.

Die Daten der Tab. 2 erlauben keine Aussagen fiber die Geschwindig- keit des Glukoseverbrauches in roten Zellen unter der Einwirkung yon Phenylhydroxylamin. Analysen in kurzen Zeitabst~nden entnommener Proben ergaben, da.fl ~thnlich der Sauerstoffaufnahme der Verbrauch an

356 M . K I E S E u . H . - D . W A L L E ~ :

Tabelle 2. Verbrauch yon Glukoae und Bildung you Milchsiiure, Brenztraubensiiure sowie Kohlendioxyd durch rote Zellen des Hundea in einer Stunde ohne uml mit Zusatz vqr~ 3 × 10-~ tool Phenylhydroxylamin oder Nitrosobenzol ]e Liter. ZeU- suspensionen in Phosphat-Ringer-L6sung vom pI~ 7,~ Blut[arbstoffkonzentrationen

20g/100 ml. Mittel aus ]e 5 Versuchen.

A. Zellen ohne Zusatz B. Zellen mit

3 x 10 -a tool rhenylhydroxylamin oder Nitrosobenzol je Liter . . . . . .

Glukose Mi]chsiiure Brenztrauben- Kohlendioxyd m Mol/1 m Moll1 s~iure m Mol/1 m ~{ol/1

--0,67 + 1,1 + 0,11 + 0,18

- - 1 , 2 2 .+- ] , i s + 0,62 -4- 1,87

Glukosc u n m i t t e l b a r nach der Zugabe yon P h e n y l h y d r o x y l a m i n am st~irksten e rh6ht i s t und sich ungef~hr pa ra l l e l dem Sauers tof fverbrauch wieder dem Ausgangswer t n~hert .

A m anschau l ichs ten wird die Geschwindigke i t des zusgtzl ichen Glukoseverbrauchs durch die for t laufende manomet r i sche ~¢[essung der S~turebildung darges te l l t , da auch diese Glukose q u a n t i t a t i v als S~ure au f t r i t t . I n Abb. 7 is t Sauers to f faufnahme und Sgurebi ldung ro te r Zellen

w ~ ~ , - D'etre ~ - - ~ ........ i r?A

Saue:s/o#f / -

o 7o 20 ~o /Io 50 rain 80

Abb. 7. Sauerstoffaufnahme und Siturebildung roter Zellen vom Hunde unter der E inwirkung yon Phenylhydroxylamin in Carbonat-RIN6ER-L(isung yore PH 7.4. Blutfarbstoffkonzentxat ion

15 g /100ml . Mittel aus 5 bzw. 4 Versuchen. K u r v e n A : Zellen ohne Zusatz von Phenylhydroxylamin. Kurven B : Zellsuspension m i t 6 × 10-* tool

Phenylhydroxylamin je Liter. Die Daten f l i r die Sauerstoffaufnahme beziehen sich nu t auf den Sauerstoff, der nicht zur I t i imi-

globinbildung verbraucht wird.

vom I-Iunde ohne und mi t 6 × 10 -~ mol Pheny lhyd roxy lamin /1 darge- s te l l t . Die Sgurewer te s ind die molare Summe a l le r geb i lde ten S~uren (~ i lchs~ure , Brenz t raubens~ure und K o h l e n d i o x y d ) und s ind n ich t au f G]ukose reduz ie r t ; so e rg ib t sich nach 60 rain ein weir h6herer W e r t all


S~uren als der verbrauchten Glukose entspricht, n~mlich im Falle der Versuche mit Phenylhydroxylamin 3,6 m mol S~ure gegeniiber 1,22m tool verbrauehter Glukose.

e) Phosphate. Um zu pr(ifen, ob Phenylhydroxylamin oder Nitrosobenzol einen

Zerfall oder Anreicherung organischer Phosphate bewirkte, wurden in je 6 Ans~tzen yon Zellsuspensionen ohne und mit 3 × 10 -a tool Phenyl- hydroxylamin bzw. Nitrosobenzol je Liter d~s freie, das leicht hydrolysierbare (7 rain in 1 normaler S~ure bei 100 ° C) und das Gesamt- phosphat kurze Zeit nach Erw~rmen auf 37 ° C und Zusatz yon Glukose und gegebenenfalls Phenylhydroxylamin sowie eine Stunde sparer bestimmt. Zu Versuchsbeginn betrug der mittlere Gehalt der Suspensionen yon Hundezellen in Phosphat-RINOER-L5sung mit einer Blutfarbstoff- konzentration yon 20 g/100 ml an freiem Phosphat 3,0, an leicht hydro- lysierbarem 0,9 und an Gesamt-Phosphat 6,5 m Mol/1.

Sowohl in den Suspensionen ohne wie in denen mit Phenylhydroxyl- amin nahm das freie Phosphat in einer Stunde im 1V[ittel um 0,1 m tool/1 ab, und das leieht hydrolysierbare um 0,04 m tool/1 zu. Nach mehreren Stunden t ra t in beiden Ans~tzen ein Zerfall organischer Phosphate ein.

1) Milchsdure und Apfelsgiure a~s Substrate~ ~pfels~ure und MSlchs~ure k5nnen den Kreisprozel~ der H~miglobin-

bildung durch Nitrosobenzol und Phenylhydroxy]amin nur mit viel ge- ringerer Geschwindigkeit unterhalten als Glukose. Bei gleicher Nitroso- benzolkonzentration betr~gt die Anfangsgeschwindigkeit der tt~miglobinbildung mit ~pfels~ure als Substrat 0,1--0,2 der Geschwindigkeit mit Glukose als Substrat. Auch die maximal erreichte H~miglobinkonzentration ist viel niedriger und steht zu der durch Glukose erreichten im gleichen Verh~ltnis wie die Anfangsgeschwindigkviten. In Abb. 8 ist die Xnderung der H~miglobinkonzentration mit der Zeit in roten Zellen vom Hunde, denen naeh Verg~rung nicht auswaschbarer Substrate 150 mg ~pfels~ure je 100 ml und 2,4 × 10 -4 tool Nitrosobenzol je Liter zugesetzt war, nach mehreren Versuehen dargestellt. Die Daten mSgen mit denen der Abb. 2 verglichen werden.

Die Sauerstoffaufnahme roter Zellen vom Hunde ist niedriger mit "~pfels~ure als Substrat als mit Glukose, n~mlieh 0,01 bis 0,015 m ~quivalent]l/min gegeniiber 0,18 fiir Suspensionen mit 15g/Blutfarbstoff] 100 ml. Durch den Zusatz yon Nitrosobenzol oder Phenylhydroxylamin wurde die Sauerstoffaufnahme gesteigert, aber nur in weit geringerem MaBe als in Gegenwart yon Glukose. Nach Zusatz yon 2,4 × 10 -¢ tool Nitrosobenzol je Liter betrug die Anfangsgeschwindigkeit 0,06 m ~quivalent Sauerstoff/1/min (Abb. 8), also etwa 0,1 der Gesehwindigkeit mit

358 ~'[. K I E S E U. H . - D . ~ f A L L E R :

Glukose als Substrat. Anfangsgeschwindigkeit der H~inliglobinbildung und der Sauerstoffaufnahme standen im gleichen Verh~ltnis wie bei der l%eaktion mit Glukose als Substrat. Entsprechend der grSl~eren Sauer- stoffaufnahme (lurch die Wirkung yon Nitrosobenzol auf rote Zelien mit Apfelsiiure wurde in diesen ein gr56erer Anfal] yon Brenztraubensiiure (Ketos/~ure) gemessen.

Untersuehungen an roten Zellen vom Menschen mit Milchs/~ure in einer Konzentration yon 200 mg je 100 m] Suspension ergaben eine noch

+[ F i

- - - x / . . . . , b U u o f p ~off ( t (onmollD)).~.- " - -~-- -

0 SO 7~0 780 rain 24/2

Abb. 8. tI~tmiglobinbildung und Sauers tof faufnahme dm'ch Nitrosobenzol in roten Zellen mi$ J~pfel- s~iure s t a t t Glukose als Substra t . Ro te Zellen vom Hunde in Phosphat-Ri~G~lt-LGsung nli t 0,15 g Xpfels~ure je 100 ml unter Sauerstoff, B lu t fa rbs to f f 15 g je 100 ml, PH 7,4, Temp. 370 C. Zu Beginn Zusatz yon 2,4 × 10-* tool Nitrosobenzol je Liter. Kurve A : Sauers tof faufnahme yon roten Zellen m i t "~pfelsliure. K u r v e B : Sauers tof faufnahme, C: Hi imiglobinbi ldung in ro ten Zellcn

m i t "f, pfcls~ure und Nitrosobenzo].

geringere Wirksamkeit der Milchs~ure bei der H~miglobinbildung durch Nitrosobenzo| und Phenylhydroxylamin als die der _~pfels~ure in den Zellen vom Hunde. Das mag vielleicht dureh den noch geringeren Gehah der ~¢[enschenzellen an Ferment, das Milehs~ure und _Apfels£ure dehydriert, bedingt sein. Die Sauerstoffaufnahme wurde auch wieder auf den 3--4fachen Wert der Hi~miglobinbildungsgeschwindigkeit erh6ht. :Da die Wirksamkeit der ~¢[ilchs~ure im Vergleich zu der der Glukose geradezu belanglos erscheint, sollen genauere ])aten bier nicht mitgeteilt werden.

q) Vergleich der Steigerung der Sauersto//au/nahme dutch •itrosobenzol und dutch Farbsto//e.

Die Reduktion des Nitrosobenzols in den roten Zellen wird dutch das gleiche Fermentsys tem durchgeftihrt wie die Reduktion der reversibel reduzierbaren Farbstoffe, die ebenfalls die Sauerstoffaufnahme der roten Zellen stark erh5hen. Wit haben die Wirkung des Phenylhydroxy]-


amins und Nitrosobenzols auf die Sauerstoffaufnahme mit der des Toluidinblaus in gleicher Konzentrat ion verglichen. Die Abb. 9 enth~lt die Ergebnisse eines Versuchs, die die wesentlichen Unterschiede leicht erkennen lassen. I n einer Konzentrat ion yon 2,4 × 10 -4 molll ist die Anfangsgeschwindigkeit der Sauerstoffaufnahme durch Phenylhydroxy]- amin ohne den Sanerstoff, der zur Oxydation yon Hgmoglobin zu H~miglobin verbraucht wird, doppelt so grol~ wie die Sauerstoffauf- nahme durch Toluidinblau. Wah- rend aber die Geschwindigkeit der Sauerstoffaufnahme durch Phenylhydroxy]aTnin mit der Zeit schnell absinkt, ist die Sauer- s toffaufnahme durch Toluidin- blau tiber lange Zeit sehr gleich- mgBig. Wahrscheinlich beruht der Unterschied weniger darauf, dal] Nitrosobenzol schneller re- duziert wird als Toluidinblau, als darauf, dal~ reduziertes Toluidin- blau durch Sauerstoff langsamer dehydriert wird als Phenylhydro- xylamin, das in Gegenwart yon tti~moglobin sehr schnell mit Sauerstoff reagiert.

76' i !

0 ZO ~0 ~ 80

7

i

°~-.

I

700 IZO 7~-0 rain

Abb. 9. Vergle ich der S te igerung des Sauers toff - ve rb rauchs ro te r Zellen vo m H u n d e durch Phe ny l - h y d r o x y l a m i n und T o l u i d i n b l a u in einer Koazen- t rat ioR yon 2,4 X 10 -4 Mol/1. P h o s p h a t - R i n g e r - LSsung m i t 200 !rag Glucose/100 ml . K u r v e A : P h e n y l h y d r o x y l a m i n , K u r v e B : Tolu id inblau ,

K u r v e C: ohne Zusa tz .

Herrn Dr. H. DA~EN~ERO, Fri~ulein I . SCHWA~Z~ und E. THAu haben wit fiir Hilfe bei den Untersuchungen zu danken.

Zusammen/assung. Die Bildung mehrerer Aquivalente H~miglobin dutch eine ~¢[olekel

Phenylhydroxylamin in roten Zellen wird durch enzymatische Reduktion des bei der Umsetzung yon I-I~moglobin mit Phenylhydroxylamin und S~uerstoff gebildeten Nitrosobenzols ermSglicht. Die Reduktion des Nitrosobenzols wird vom H~miglobinreduktasesystem durchgefiihrt und liefert Kohlendioxyd als Oxydationsprodukt. Brenztraubens~ure bildende Fermentsys teme sind an der I~eduktion des Nitrosobenzols nur un- wesentlich beteiligt.

Die H~miglobinbildung durch den Kreisprozel~ Phenylhydroxylamin- Nitrosobenzol geht mit einer starken Steigerung der Sauerstoffaufnahme roter Zellen einher. Durch Zusatz yon 10 -3 mol Phenylhydroxylamin kann die Sauerstoffaufnahme roter Zellen vom •enschen auf den

360 M. KlSSE u. H.-D. WALLE~:

100fachen W e r t der normalen A t m u n g erh6ht werden. E in Viertel bis ein Dr i t t e l des zus~tzl ich au fgenommenen Sauerstoffs ent f~l l t au f die Bi ldung yon Hi~miglobin. I m ]V[ittel werden bei der Oxyda t ion eines Moles Pheny]hy(h 'oxy lamin 0,8 Aqu iva len te Hi~miglobin gebi ldet .

Die Geschwindigke i t der H~mig lob inb i ldung und Sauers tof faufnahme nach P h e n y l h y d r o x y l a m i n ve r l angsamt mi t der Zei t s t a rk und kann Each Beendigung der W i r k u n g des P h e n y l h y d r o x y l a m i n s du tch erneuten Zust~tz wieder ges te iger t werden. Die Anfangsgeschwindigke i t is t propor- t iona l [ P h e n y l h y d r o x y l a m i n ] 0,4.

Der durch (lie W i r k u n g yon P h e n y l h y d r o x y l a m i n bzw. Ni t rosobenzol zusgtzl ich au fgenommene Sauers to f f wi rd zu e inem ~)ritte] i m t-Iiimi- globin, e inem Zehnte] in ]~renztraubens~ure und zum grSBten Tei] als K o h | e n d i o x y d wieder gefunden.

Du tch (tie W i r k u n g von P h e n y l h y d r o x y l a m i n und Ni t rosobenzol wi rd der Verb rauch yon Glukose in ro ten Zellen erh6ht , die Milchsi~ure- b i ldung jedoch nicht . Die zusii tzl ich ve rb rauch te Glukose wird quant i - t a t iv als K o h l e n d i o x y d und Brenz t raubens~ure wiedergefunden.

Die K o n z e n t r a t i o n an freiem und le icht hyd ro ly s i e rba rem Phospha t i inder t sich un te r der E inwi rkung yon P h e n y l h y d r o x y l a m i n in Suspen- s ionen t o t e r Zel len nur wenig. I m Mi t te l n i m m t das le icht hyd ro lys i e rba re P h o s p h a t in der e rs ten S tunde ein wenig zu. 2 - - 3 S td Each Zusa tz yon P h e n y | h y d r o x y l a m i n s ink t die K o n z e n t r a t i o n an ]eicht hydro lys i e rba ren Phospha ten ab.

W i r d den ro ten Zellen s t a t t Glukose Apfels~ure oder Milchs~ure als S u b s t r a t zugesetzt , so be t rgg t die Anfangsgeschwind igke i t der H~mi- g lob inb i | dung und (lie Ste igerung der Sauers to f faufnahme nach Zugabe yon P h e n y l h y d r o x y l a m i n oder Ni t rosobenzo] nvr e twa ein Zehnte l der W i r k u n g dcr gleichen Gif tkonzeDtra t ionen mi t Glukose als Subs t ra t .

Die Ste igerung der Sauers to f faufnahmc ro ter Zel len durch Phenyl - hych 'oxylamin oder Ni t rosobenzol i s t u n m i t t e l b a r nach deren Zugabe grSBer als d ie durch eine gleiche K o n z e n t r a t i o n yon Tolu id inb lau bewirkte . Wi~hrend die W i r k u n g des Tolu id inb laus jedoch l~tngere Zeit gleichm~13ig anhi~lt, n i m m t die des Ni t rosobenzols mi t der Zei t sehr schne| I a.b.

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Kinetik der Hämiglobinbildung