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Aus dem Institut für VirologieDirektor: Professor Dr. Stephan Becker
des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg
Klonierung der Human Airway Trypsin-like Protease und Untersuchungen zu ihrer Fähigkeit der Aktivierung des
Influenza A-Virus Hämagglutinins
Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der gesamten Humanmedizin
dem Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg
vorgelegt von Michaela H. Beyerle aus Hagen/Westfalen
Marburg 2008
Angenommen vom Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg am 24.04.2008
Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs.
Dekan : Professor Dr. Matthias Rothmund
Referent : Professor Dr. Wolfgang Garten
Korreferent : Professor Dr. Andrej Hasilik
2
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung.................................................................................................................. 7
1. Einleitung............................................................................................................................ 8
1.1. Influenza...................................................................................................................... 8
1.1.1. Historischer Überblick.......................................................................................... 8
1.1.2. Ätiologie............................................................................................................. 11
1.1.3. Pathogenese und Klinik...................................................................................... 12
1.1.4. Therapie und Prophylaxe................................................................................... 14
1.1.5. Mikrobiologie und Klassifizierung der Influenzaviren.......................................... 15
1.1.5.1. Influenza A-Virus ....................................................................................... 16
1.1.5.1.1. Replikationszyklus Influenza A-Virus....................................................... 19
1.1.5.1.2. Hämagglutinin (HA)............................................................................. 22
1.2. Bedeutung der Aktivierungsproteasen....................................................................... 26
1.2.1. PRSS22 (protease serine S1 family member 22)............................................... 28
1.2.2. PRSS8 (protease serine S1 family member 8)................................................... 28
1.2.3. Human Airway Trypsin-like Protease (HAT)....................................................... 29
1.2.3.1. Eigenschaften und Lokalisation der Human Airway Trypsin-like Protease
(HAT)....................................................................................................................... 29
1.2.3.2. Genetik und Molekularbiologie von HAT..................................................... 31
1.2.3.3. Weitere Untersuchungen zu HAT............................................................... 32
1.2.4. TMPRSS2 (transmembrane protease, serine, 2)................................................ 33
1.3. Zielsetzung................................................................................................................ 34
2. Material ............................................................................................................................ 35
2.1. Geräte........................................................................................................................ 35
2.2. Verbrauchsmaterialien............................................................................................... 35
2.3. Chemikalien............................................................................................................... 36
2.4. Sera........................................................................................................................... 37
2.5. Medien für Zellkulturtechniken................................................................................... 38
2.6. Enzyme...................................................................................................................... 38
2.7. Kits............................................................................................................................ 38
2.8. Plasmide und Vektoren.............................................................................................. 39
2.8.1. pIRESbleo3, Klonierungsvektor.......................................................................... 39
2.8.2. pCAGGS + MCS, Klonierungsvektor ................................................................. 40
3
2.8.3. pCR®2.1-TOPO®-Vektor..................................................................................... 41
2.9. Oligonukleotide und Sequenzen................................................................................ 42
2.10. Antikörper................................................................................................................ 43
2.11. Eukaryotische Zellen................................................................................................ 44
2.12. Influenzavirusstämme.............................................................................................. 44
2.13. Bakterienstämme..................................................................................................... 44
3. Methoden.......................................................................................................................... 45
3.1. Molekularbiologische Methoden................................................................................. 45
3.1.1. Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien im kleinen Maßstab (Minipräparation)
..................................................................................................................................... 45
3.1.2. Isolierung von Plasmid-DNA im großen Maßstab (Maxipräparation).................. 46
3.1.3. RNase-Behandlung............................................................................................ 48
3.1.4. Quantifizierung von Nukleinsäuren..................................................................... 48
3.1.5. RNA-Isolierung aus eukaryotischen Zellen......................................................... 48
3.1.6. Überprüfung von Sequenzen mittels Integration in den pCR®2.1-TOPO®-Vektor
..................................................................................................................................... 50
3.1.7. Polymerasekettenreaktion (PCR) und rekombinate PCR .................................. 51
3.1.8. QuickChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit.................................................... 53
3.1.9. Reverse Transkription und Polymerasekettenreaktion (RT-PCR).......................54
3.1.10. Aufreinigung von Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Molekülen........................... 55
3.1.10.1. Aufreinigung mittels QIAquickTM PCR Purification Kit................................ 55
3.1.10.2. Alkoholfällung........................................................................................... 56
3.1.10.3. Fällung mittels „89/11“-Reagens............................................................... 56
3.1.11. Verdau von Doppelstrang-DNA mit Restriktionsendonukleasen....................... 57
3.1.11.1. Analytische Restriktion doppelsträngiger DNA.......................................... 57
3.1.11.2. Präparative Restriktion doppelsträngiger DNA.......................................... 58
3.1.12. Elektrische Auftrennung von DNA-Fragmenten in der
Agarosegelelektrophorese........................................................................................... 58
3.1.13. Anfärbung und Photographieren der Gele........................................................ 59
3.1.14. Isolierung von DNA aus Agarosegelen............................................................. 59
3.1.15. Ligation von DNA-Fragmenten......................................................................... 60
3.1.16. Dephosphorylierung der 5’Enden linearisierter Plasmide................................. 61
3.1.17. Sequenzierung von DNA.................................................................................. 61
3.1.17.1. Sequenzierung nach Sanger ................................................................... 61
4
3.1.17.2. Automatische DNA-Sequenzierung.......................................................... 62
3.1.18. Kultivierung von Bakterien................................................................................ 63
3.1.19. Herstellung von Glycerinstocks........................................................................ 64
3.1.20. Transformation von Bakterien mit DNA............................................................ 64
3.1.20.1. Transformation nach der TSS-Methode.................................................... 64
3.1.20.2. Klassische CaCl2-Methode ...................................................................... 65
3.1.20.3. Transformation ultrakompetenter Zellen................................................... 66
3.1.20.4. Transformation mittels Elektroporation..................................................... 67
3.2. Zellbiologische Methoden.......................................................................................... 67
3.2.1. Kultivierung von Zellen unterschiedlicher Zelllinien............................................ 67
3.2.2. Anlegen von Zellstocks eukaryotischer Zellen.................................................... 68
3.2.3. Transfektion von Plasmid-DNA in eukaryotischen Zellen .................................. 69
3.2.3.1. Transfektion von adhärenten Zellen............................................................ 69
3.2.3.2. Transfektion von Zellen in Suspension....................................................... 70
3.2.4. Etablierung stabiler Zelllinien.............................................................................. 70
3.2.5. Überprüfung der Proteasen-Aktivität mit spezifischen fluorogenen Substraten in
der Spektrofluoreszensanalyse.................................................................................... 71
3.3. Immunologische Methoden........................................................................................ 72
3.3.1. Immunhistochemische Anfärbung von Zellantigenen......................................... 72
3.3.2. Indirekte Immunfluoreszenz............................................................................... 73
3.3.2.1. DAPI-Färbung............................................................................................. 74
3.3.2.2. EGFP (enhanced green fluorescent protein)-Nachweis.............................. 75
3.4. Infektionsversuche mit Viren verschiedener Influenza-Stämme................................. 75
3.4.1. Alternative Virusanzucht im embryonierten Hühnerei......................................... 75
3.4.2. Experimentelle Virusinfektion von eukaryotischen Zellen mit dem Influenza-Virus
..................................................................................................................................... 76
4. Ergebnisse........................................................................................................................ 77
4.1. Herstellung des pIRESbleo-HAT Plasmids................................................................ 77
4.2. Entwicklung der stabilen Zelllinien mit dem HAT-Gen................................................ 79
4.3. Infektion von Zellen der stabilen Zelllinie MDCK-HAT mit Influenza A-Virus.............. 80
4.4. Nachweis von HAT-RNA in Zellen der stabilen Zelllinien........................................... 81
4.5. Nachweis von HAT-Proteinaktivität mittels MCA-Assay............................................. 82
4.6. Herstellung des pIRESbleo-HAT-Plasmids mit multibasischer Schnittstelle
(pIRESbleo-HAT-args)...................................................................................................... 84
5
4.7. Nachweis der HAT-Proteinaktivität mittels MCA-Assay in den Zellen der stabilen
Zelllinie MDCK-HAT-args................................................................................................. 87
4.8. Herstellung der Plasmidvektoren pCAGGS-HAT-flag3' und pCAGGS-HAT-flag5' .... 88
4.9. HAT-Nachweis in transient transfizierten Zellen mittels Immunfluoreszenz............... 90
5. Diskussion......................................................................................................................... 93
5.1. Überblick über die Zielsetzung dieser Arbeit.............................................................. 93
5.2. Klonierung von HAT aus humanen Atemwegsepithelzellen und Etablierung stabil
HAT-exprimierender Zellen............................................................................................... 93
5.3. Infektion der stabilen MDCK-HAT-Zellen mit Influenza A-Virus................................. 94
5.4. Überprüfung der HAT-Aktivität................................................................................... 95
5.5. Das Plasmid pIRESbleoHAT-args............................................................................. 95
5.6. Die Plasmide pCAGGS-HAT-flag5' und pCAGGS-HAT-flag3'................................... 96
5.7. Weitere Ansätze zum Nachweis von HAT.................................................................. 96
5.8. Spaltung von HA durch HAT...................................................................................... 97
5.9. Ausblick..................................................................................................................... 98
6. Literaturverzeichnis......................................................................................................... 100
7. Sequenzen...................................................................................................................... 115
7.1. pIRESbleo3.............................................................................................................. 115
7.2. pCAGGS+MCS(c5).................................................................................................. 117
7.3. HAT......................................................................................................................... 120
7.4. Human Airway Trypsin-like Protease, kloniert.......................................................... 121
ANHANG............................................................................................................................. 127
6
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Zur Aktivierung des Influenza A-Virus muss während des Replikationszyklus in der Zelle das
Oberflächenprotein Hämagglutinin durch eine Wirtsprotease gespalten werden, um infektiöse
Tochterviren generieren zu können. Die humanen Aktivierungsproteasen, die für diesen
Prozess bei der Influenzavirusinfektion im menschlichen Organismus verantwortlich
zeichnen, sind bis heute nicht eindeutig identifiziert.
In dieser Arbeit wurde eine der möglichen humanen Aktivierungsproteasen, die Human
Airway Trypsin-like Protease (HAT), kloniert und ihre Fähigkeit, Influenza A-Virus
Hämagglutinin zu aktivieren, untersucht.
HAT wurde 1997 primär aus dem Sputum von Patienten mit chronischen
Atemwegserkrankungen isoliert, konnte hernach aber auch in Zellen des Respirationstraktes
Gesunder nachgewiesen werden. Aufgrund ihrer trypsinähnlichen Eigenschaften sowie ihrer
Lokalisation wurde die Human Airway Trypsin-like Protease als aussichtsreiche mögliche
Aktivierungsprotease erachtet und für dieses Forschungsvorhaben ausgewählt.
Die Klonierung der Protease, die Herstellung unterschiedlicher Plasmide sowie die
Entwicklung stabiler Zelllinien mit einigen dieser Plasmide sind die wesentlichen Inhalte der
vorliegenden Arbeit.
Weiterhin wurden verschiedene Versuchsansätze verfolgt, die der weiteren Untersuchung
der Aktivität und der Expression der Human Airway Trypsin-like Protease in den Zellen der
entwickelten Zelllinien dienten. Die Spaltung von Hämagglutinin durch HAT und die daraus
resultierende Aktivierung des Influenzavirus konnte in den in hier vorgestellten
Versuchsreihen nicht bewiesen werden. In einer auf diesen Versuchsreihen aufbauenden
Arbeit am Institut für Virologie in Marburg gelang es jedoch, in weiterführenden Versuchen
die Aktivierung und Spaltung von Hämagglutinin durch HAT mit den in der vorliegenden
Arbeit generierten Plasmiden nachzuweisen1.
Die Klonierung der Vektoren war hierfür wesentliche Voraussetzung. Der schließlich in der
späteren Arbeit erbrachte Erfolg bestätigte die ursprüngliche Vermutung, dass HAT eine der
möglichen Aktivierungsproteasen des Influenzavirus im Menschen sei. Somit leistet die
vorliegende Arbeit ihren wissenschaftlichen Beitrag zur Untersuchung der Biologie und
Pathologie der Influenzavirusinfektion im menschlichen Organismus.
1Böttcher, E., T. Matrosovich, M. Beyerle, H. D. Klenk, W. Garten and M. Matrosovich (2006). Proteolytic activation of influenza viruses by serine proteases
TMPRSS2 and HAT from human airway epithelium. J Virol 80(19): 9896-8.
7
Einleitung
1. Einleitung
1.1. Influenza
1.1.1. Historischer Überblick
Die ersten Berichte von Influenza-Infektionen gehen zurück auf Hippokrates, der bereits 412
v. Chr. eine große Epidemie mit influenzaähnlichen Symptomen beschrieb. Aus den Jahren
1173-74 stammen Schilderungen einer europaweiten Epidemie, die ebenfalls aufgrund der
beschrieben Symptomatik auf die Influenza zurückgeführt wird (Shimizu, 1997).
Dokumentationen, in denen die Symptomatik erstmals so eindeutig charakterisiert wird, dass
eine Influenzavirus-Pandemie als sicher angenommen werden kann, beschreiben eine
Pandemie in den Jahren 1781-82, die sich von Asien aus über Russland ausbreitete und mit
einer hohen Mortalität der älteren Bevölkerung verbunden war. Eine wiederholte Pandemie
ähnlicher Ausbreitung trat 1830-31 in China auf und gelangte über Indien und Indonesien bis
1833 nach Russland, um sich von dort aus nach Europa fortzusetzen. In den Jahren 1836-38
breitete sich die Infektionswelle von Nord- nach Südeuropa aus und erreichte 1847-48 über
den Mittelmeerraum den Westen Europas (Patterson, 1985). Weitere Beschreibungen
ähnlicher Epidemien stammen aus der Zeit zwischen 1889 und 1892 und aus dem Jahr 1900
(Patterson, 1986). All diese Berichte zeigen die Bedeutung des Influenzavirus als
humanpathogenen Krankheitserreger von jeher und bereits lange bevor die gravierenden
Pandemien des zwanzigsten Jahrhunderts auf das Virus aufmerksam machten. Der Name
Influenza lässt sich zurückführen auf den wahrscheinlich Mitte des achtzehnten Jahrhundert
in Italien geprägten Begriff „influenza di freddo“ (ital.: Kälteeinfluss).
Die erste näher untersuchte Influenza-Epidemie war 1918 die sogenannte „Spanische
Grippe“ oder „Spanish Lady“ - die gleichzeitig größte und verheerendste Epidemie des 20.
Jahrhunderts. Diese Pandemie mit einem H1N1-Virus der Gattung Influenza A hat weltweit
schätzungsweise 40 Millionen Opfer gefordert, ca. 300 Millionen Menschen waren erkrankt.
Im Gegensatz zu den späteren Pandemien des zwanzigsten Jahrhunderts, die von einer
Übersterblichkeit älterer und abwehrgeschwächter Menschen geprägt waren, mussten hier
die meisten Todesfälle unter der jungen, gesunden Bevölkerung verzeichnet werden.
In der Diskussion um den primären Ursprung der Pandemie richtete sich die Aufmerksamkeit
zunächst auf die USA, wo im März 1918 in Detroit/South Carolina und im Gefängnis von St.
Quentin von Ausbrüchen der Krankheit berichtet wurde. Man vermutete das erste Auftreten
der Krankheit vor allem in den amerikanischen Armee-Camps, von wo aus sich im Zuge der
8
Einleitung
Truppenbewegungen im ersten Weltkrieg das Virus über den gesamten Globus ausbreiten
konnte. Im April 1918 wurden in den westlichen Häfen Frankreichs, wo die amerikanischen
Truppen landeten, weitere Ausbrüche verzeichnet (Guenel, 2004). Ebenso geben Ausbrüche
in Brest und Boston im Herbst 1918 Hinweis auf die Bedeutung der Truppenbewegung im
Zusammenhang mit der Verbreitung der Krankheit.
Auf Berichte von epidemieartigen Erkrankungen des Respirationstrakts in England und
Frankreich in der Zeit von 1916 und 1917 jedoch gründen Oxford und Wiley die Vermutung,
dass die „Spanische Grippe“ bereits hier ihren Anfang nahm und das Virus schon zu diesem
Zeitpunkt sporadische Ausbrüche der späteren Pandemie verursachte. Das berichtete
klinische Bild (Hammond et al., 1917) war charakteristisch für die Klinik der späteren
pandemischen Ausbrüche im Herbst 1918. Das würde bedeuten, dass sich das Influenza A-
Virus durch kleinere epidemische Ausbrüche bereits über mehrere Jahre verbreitete, bevor
es die Pandemie auslöste (Oxford, 2000).
In den späten zwanziger Jahren des 20. Jahrhunderts konnte Richard Shope zeigen, dass
Influenza vom Schwein durch ultragefiltertes Bronchialsekret übertragen werden kann, was
damals bereits die Vermutung stützte, dass die Krankheit durch ein Virus verursacht wird.
1931 gelang schließlich die Isolation des schweinepathogenen Influenza A-Virus und 1933
konnten Sir Christopher Andrewes, Wilson Smith und Sir Patrick Laidlaw das erste
humanpathogene Influenzavirus isolieren (Shimizu, 1997). 1940 züchtete Sir Frank
Macfarlane Burnet zum ersten Mal Influenzaviren in einem System zur Virusanzucht, das
auch heute noch verwendet wird: in embryonierten Hühnereiern. 1941 entdeckte George K.
Hirst, dass Influenza die Agglutination von Erythrozyten induzierte (Hirst, 1942; Bock, 1950)
und schuf damit eine neue Methode, das Virus zu detektieren. 1955 entwickelte Sir
Christopher Andrewes zusammen mit Burnet and Frederik Bang den zusammenfassenden
Begriff des Myxovirus für Viren der Influenzafamilie (Andrewes et al., 1955).
1957 und 1968 erlebte die Welt zwei weitere Pandemien, verursacht durch die Virustypen
H2N2 1957, Verursacher der „Asiatischen Grippe“, und H3N2 1968, Verursacher der „Hong-
Kong-Grippe“. Beide nahmen ihren Ursprung auf dem asiatischen Kontinent. 1977 brach in
Russland durch ein Influenza A-Virus des Subtyps H1N1 eine weitere, vornehmlich Kinder
und Jugendliche betreffende Epidemie aus, die sich aber nicht so weit verbreitete und auch
weniger Opfer forderte als die Pandemien von 1957 und 1968 (Gregg, 1978).
1981 schließlich gelang es Don C. Wiley, Ian A. Wilson und John J. Skehel, die
dreidimensionale Raumstruktur des Hämagglutininmoleküls mittels Röntgenkristallographie
zu bestimmen (Skehel et al., 1981). Dies ermöglichte die Lokalisation funktionell wichtiger
9
Einleitung
Domänen, wie die der Rezeptorbindungstasche, der Fusionsproteine und antigener Epitope
im Raummodell (Wiley and Skehel, 1987).
Heute ist bekannt, dass die zwei auslösenden humanpathogenen Virenstämme der
Pandemien 1957 und 1968 durch den genetischen Austausch (=Antigen-Shift, s.u.)
unterschiedlicher aviärer und schweinepathogener Influenzavirusstämme entstanden sind.
Phylogenetische und genetische Studien konnten zeigen, dass jedes im letzten Jahrhundert
aus Säugern isolierte Virus-Gen einen aviären Ursprung besitzt. 1997 wurde erstmalig in
Hong Kong ein weiteres aviäres Virus dokumentiert, welches direkt von befallenem Geflügel
auf den Menschen übertragen wurde. Dabei handelte es sich um einen neuen Subtypen des
Influenza A-Virus, den Virustypen H5N1. Von 18 im Krankenhaus dokumentierten Fällen
starben 6 infolge der Erkrankung. Zum ersten Mal konnte bewiesen werden, dass der H5N1
Subtyp direkt, ohne vorherige Wirtsadaptation in einem Säugetier, auf den Menschen
übertragen werden kann (Gabriel et al., 2005).
Ende 2003 und zu Beginn des Jahres 2004 breitete sich das inzwischen als Vogelgrippe
bekannt gewordene Influenza A-Virus H5N1 unter den Geflügelbeständen in weiten Teilen
Asiens aus. Innerhalb von drei Monaten wurden 120 Millionen Vögel von Menschenhand
vernichtet, entweder, weil sie bereits erkrankt waren, oder um die weitere Ausbreitung der
Krankheit einzudämmen. Die Tatsache, dass das Virus von Geflügel direkt auf den
Menschen übertragen werden kann, machte diese Maßnahmen ebenso notwendig wie die
befürchteten wirtschaftlichen und ökologischen Konsequenzen einer weltweiten Ausbreitung.
In 2004 und 2005 folgten weitere Ausbrüche dieses hochpathogenen Influenza A-Virus unter
den Geflügelbeständen mehrerer asiatischer Länder, eine zunehmende Zahl von
Erkrankungsfällen beim Menschen wurde berichtet (Ligon, 2005).
In der Zeit von Oktober 2005 bis Februar 2006 wurden, assoziiert mit Ausbrüchen der
Vogelgrippe in China, Indonesien, dem Irak, Thailand und der Türkei, 49 weitere, beim
Menschen aufgetretene Erkrankungen berichtet (WHO, 2006). Allein im Februar 2006
meldeten 13 weitere Länder der Weltgesundheitsorganisation das Auftreten der Vogelgrippe
unter ihren Geflügelbeständen.
Seit dem ersten Ausbruch in 1997 verstarben nach WHO-Angaben insgesamt 212
Menschen an der H5N1-induzierten Vogelgrippe und mehr als 150 Millionen Vögel in Asien
und Europa wurden vernichtet. Die schnelle Verbreitung des Virus und die Pathogenität von
H5N1 für den Menschen konkretisiert die Bedrohung durch eine erneute Pandemie und die
Bedeutung neuer Impfstoffe und neuer Medikamente zur Bekämpfung des Virus sowie die
Notwendigkeit von Maßnahmen zu Aufklärung und Prophylaxe (Lahariya, 2006).
10
Einleitung
1.1.2. Ätiologie
Während Influenza A-Viren außer dem Menschen noch viele andere Säugetiere und Vögel
infizieren (Fields, 2007), konnten Influenza B-Viren bisher nur aus Menschen und Influenza
C-Viren nur aus Menschen und Schweinen isoliert werden.
Influenza A und B sind ubiquitär verbreitet und treten in jährlichen Epidemien auf beiden
Erdhemisphären zeitversetzt auf. Auf der Südhalbkugel geschieht dies in den Monaten Mai
bis Oktober und auf der nördlichen Hemisphäre in den Monaten November bis April.
Abb.1 . Beobachtung der saisonalen Aktivität von Influenza auf der nördlichen Hemisphäre Verlaufsbeobachtung über 24 Jahre: 1982/83 bis 2005/06 (Quelle: Department of Health and Human Services; Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, U.S.A.)
Während dieser Epidemien erkranken nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation jedes
Jahr 5 - 15% der Bevölkerung an Infektionen der oberen Atemwege. Entsprechend diesen
Angaben wird davon ausgegangen, dass weltweit jährlich 3 bis 5 Millionen Menschen von
ernsthaften Erkrankungen mit Influenza-Viren betroffen sind und zwischen 250.000 und
500.000 Menschen an den Folgen einer Influenzavirusinfektion versterben (WHO, 2003).
Dabei kommt es zu einer Übersterblichkeit abwehrgeschwächter und älterer Menschen.
Auch im Kindesalter sowie bei Vorliegen chronischer Erkrankungen von Herz oder Lunge,
bei Diabetes, Niereninsuffizienz oder anderen Komorbiditäten, kommt es häufig zu schweren
Verläufen mit ernsten Komplikationen, die bis zum Tode führen können.
Die saisonalen Epidemien breiten sich rasch aus und verursachen jedes Jahr eine
nennenswerte wirtschaftliche Belastung durch Krankenhaus- und Gesundheitskosten sowie
eine verminderte Produktivität durch den Ausfall von Arbeitskräften (Nicholson, 2003).
11
Einleitung
1.1.3. Pathogenese und Klinik
Das Influenzavirus ist der Erreger der klassischen Grippe (russ. chrip = röcheln). Die
Infektion wird meist durch mikroskopisch kleine, virusbeladene Tröpfchen übertragen und
löst beim Menschen eine fieberhafte Erkrankung der Atemwege aus. Auch der direkte
Übertragungsweg vom Schwein oder von Vögeln auf den Menschen wird gelegentlich
berichtet (Nicholson, 2003). Wie unter 1.1.1. bereits geschildert, hat die direkte Übertragung
von aviären Influenza A-Viren auf den Menschen durch H5N1 eine neue Bedeutung
gewonnen (Gabriel et al., 2005).
Abb.2 . Ätiologie und Übertragungswege des Influenza A-Virus
Die höchste Pathogenität für den Menschen besitzt unter den Influenzaviren das Influenza A-
Virus, das auch für die Pandemien des letzten Jahrhunderts verantwortlich war. Infektionen
mit Influenza B-Viren sind beim Menschen seltener. Influenza C-Virusinfektionen treten
selten auf und verlaufen häufig inapparent. Unkomplizierte Infektionen mit Influenza A sind
primär gekennzeichnet von entzündlichen Veränderungen des tracheobronchialen Epithels,
die in der Regel die oberen und mittleren Atemwege betreffen, aber auch den gesamten
Respirationstrakt befallen können. Durch die Einwanderung vor allem von T-Zellen,
Neutrophilen, Monozyten und die Freisetzung von Mediatorstoffen kommt es zu einer
entzündlichen, teilweise hochfiebrigen Reaktion. Begleitend treten Ödeme der Mucosa auf,
die sich klinisch in Heiserkeit, Atem- und Schluckbeschwerden manifestieren.
Zielzellen des Virus sind die epithelialen Zellen, die durch zytopathogene Effekte der viralen
Replikation so geschädigt werden, dass sie sich aus dem Gewebeverband lösen. Bei
12
Einleitung
schweren Verläufen, die insbesondere bei geschwächter Abwehrlage der Infizierten zu
beobachten sind, werden große Teile des Epithels abgetragen. Infolge der Nekrosen können
Gewebseinrisse und Blutungen entstehen, die das hämorrhagische Verlaufsbild prägen, das
sich in der hämorrhagischen Tracheitis bis hin zur häufig letal endenden primär-
hämorrhagischen Influenzapneumonie äußert. Greift das Virus auf die Zellen des
Lungenparenchyms über, entwickelt sich eine interstitielle Pneumonie. Diese Form der
primären Influenza-Pneumonie kennzeichnet ebenfalls einen schweren Verlauf, der bis zum
Tod führen kann.
Während der Inkubationszeit von ein bis fünf Tagen vermehrt sich das Virus in den
Schleimhautzellen des Nasopharynx. Der Ausbruch der Erkrankung ist gekennzeichnet
durch eine fiebrige Rhinitis und Pharyngitis. Desweiteren treten Symptome wie Kopf-,
Glieder- und Muskelschmerzen auf, verbunden mit Übelkeit, Kältegefühl und allgemeiner
Schwäche. Die Myositis führt gerade bei Kindern häufig zu einer reversiblen Gehunfähigkeit.
Gefürchtet sind Verlaufsformen, bei denen das ZNS oder innere Organe, insbesondere das
Herz, in Mitleidenschaft gezogen werden.
Perakute Verläufe, die auch bei Jugendlichen und jungen Erwachsenen beobachet werden,
sind wegen der hohen Mortalität, vor allem durch ein sekundäres Herz-Kreislaufversagen,
besorgniserregend.
Besonders bei immungeschwächten Patienten sind bakterielle Superinfektionen gefürchtet,
da diese zu fulminanten Verläufen der Erkrankung führen. Die hier am häufigsten
beobachteten Bakterien sind Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae und
Streptococcus pneumoniae. Mehrere Berichte zeigen, dass die Virusinfektion des
Respirationstraktes die Wachstumsbedingungen für die Bakterien begünstigt. Die
tracheobronchiale Clearance-Funktion wird reduziert und damit die Adhärenz der Bakterien
an die Bronchialmucosa unterstützt (Nugent et al., 1983). Darüber hinaus konnte im
Mausmodell gezeigt werden, dass einige Staphylococcus aureus-Stämme (Wood 46;
M86/86) eine trypsinähnliche Serin-Protease sezernieren, die das Hämagglutinin bestimmter
Influenza A-Virusstämme zur Aktivierung des Virus proteolytisch spaltet. Dadurch kommt es
im Falle einer Koinfektion zu einer schnelleren Ausbreitung des Virus im Gewebe und damit
zu einer Verstärkung der Infektivität und der Pathogenität des betreffenden Virusstammes
(Tashiro et al., 1987). Streptokinase oder Staphylokinase produzierende Streptokokken-,
bzw. Staphylokokken-Stämme akzelerieren auf indirektem Weg die virale Replikation,
verstärken die Pathogenität des Virus durch die Aktivierung des Plasminogen-Plasmin-
Systems und bewirken dadurch eine Aktivierung des Hämagglutinins. Andere Bakterien der
13
Einleitung
Familie Streptococcaceae, wie Aerococcus viridans, sind in der Lage, das Hämagglutinin
bestimmter Influenza-Virusstämme durch Spaltung direkt zu aktivieren (Scheiblauer et al.,
1992). Das erklärt die bedeutende Rolle einer bakteriellen Koinfektion in der Entwicklung
eines schweren Krankheitsverlaufs und die Tatsache, dass die Zahl der Influenzavirus-
Pneumonien mit bakteriellen Koinfektionen dreifach so hoch ist wie die der primär viralen
Pneumonien (Tashiro et al., 1987). Heute sind bakterielle Superinfektionen antibiotisch
weitgehend beherrschbar, früher waren sie jedoch verantwortlich für die hohe Letalität der
Grippeinfektionen.
Bei unkomplizierten Verläufen sind die Patienten nach durchschnittlich sechs Tagen wieder
fieberfrei, die akuten Symptome verschwinden und es beginnt die Regeneration des
zilientragenden Epithels. Geringe körperliche Belastbarkeit und Orthostase-Probleme
können jedoch noch über Wochen anhalten.
1.1.4. Therapie und Prophylaxe
Primär besteht die Therapie der Influenzavirusinfektion in einer symptomatischen
Behandlung, eine kausale Therapie ist nur bedingt möglich. Für die kausale Behandlung
können antivirale Substanzen wie Amantadin oder Rimantadin, die die
Nukleinsäurefreisetzung des Virus in die Wirtszelle verhindern, zum Einsatz kommen. Sie
richten sich gegen das M2-Membranprotein und verhindern, indem sie diesen Ionenkanal
blockieren, die intravirale Ansäuerung im Endosom. Dadurch bleibt das Hämagglutinin in
seiner fusionsinaktiven Form bestehen und die Destabilisierung des Nukleokapsids wird
verhindert (Ohuchi et al., 1994). Primär werden diese antiviralen Substanzen in der
postexpositionellen Prophylaxe angewendet, vornehmlich bei alten und immunsupprimierten
Menschen im Verlauf von Epidemien. Diese Substanzen sollten möglichst innerhalb von 24 -
48 h nach Kontakt mit dem Virus verabreicht werden, um eine optimale Wirksamkeit zu
erzielen. Eine vollständige Hemmung der Virusausbreitung kann nicht erreicht werden,
darüber hinaus sind in höheren Dosen die Auswirkungen von Amantadin auf das zentrale
Nervensystem zu beachten. Resistenzen durch M2-Substitutionsmutanten führen zu einer
Selektion von Viren, die auf diese Therapie nicht mehr ansprechen.
Die Sialinsäurederivate Zanamivir und Oseltamivir hemmen die Virusausbreitung im Körper
durch Blockierung der influenzaviralen Neuraminidase und können damit, wenn sie innerhalb
von 36 Stunden post infectionem eingenommen werden, den Krankheitsverlauf
abschwächen und die Krankheitsdauer verkürzen. Die Schwierigkeit, in klinischen Studien
die Empfindlichkeit der Virusneuraminidase zuverlässig zu messen und die unzureichende
14
Einleitung
Erfahrung lassen keinen endgültigen Schluss zu, aber in-vitro-Beobachtungen zeigten, dass
auch bei diesen Substanzen Resistenzen ein Problem bei der Bekämpfung der Infektion
darstellen (Barnett et al., 1999, 2000).
Die erwähnten bakteriellen Superinfektionen werden entsprechend dem isolierten Erreger
nach einem spezifischen Antibiogramm behandelt.
Eine Schutzimpfung mit einem Totimpfstoff ist generell möglich. Bei den Impfstoffen handelt
es sich um vermehrungsunfähige inaktivierte Viren oder um aufgereinigte
Oberflächenproteine. Die entsprechenden Antigene werden jährlich nach Empfehlungen der
WHO, die sich an den sich aktuell ausbreitenden Influenzastämmen bzw. Subtypvarianten
ausrichten, neu zusammengestellt. Der Impfschutz besteht jedoch nur zeitlich begrenzt, da
auftretende Subtypvarianten mit einem durch Punktmutationen veränderten Genom aufgrund
der gewandelten Antigenität nicht oder nicht vollständig durch die Impfung abgedeckt
werden. Daher stehen neu auftretenden Pandemien auch geimpfte Personen ungeschützt
gegenüber.
Die Herstellung eines Lebendimpfstoffes birgt Schwierigkeiten, da die Gefahr besteht, durch
Rekombination ein hochpathogenes Virus zu generieren. Dennoch gibt es Versuche, durch
die Erzeugung rekombinanter Influenzaviren diesem Problem zu begegnen. Die Idee ist die
Herstellung eines abgeschwächten, reassortierten Virus, dessen Hämagglutinin- und
Neuraminidase-Gene aus einem virulenten Virus stammen, während die restlichen Gene aus
einem abgeschwächten Donor-Virus, insbesondere einer kältesensitiven Variante stammen.
Studien mit bi- und trivalenten, kältesensitiven, rekombinanten Influenzavirus-Impfstoffen,
bestehend sowohl aus Influenza A-Virussubtypen (H1N1 und H3N2), als auch aus dem
Influenza B-Virus, konnten eine reduzierte Viruslast und eine verminderte Serum-Antikörper-
Reaktion in Erwachsenen zeigen (Keitel et al., 1993). Darüber hinaus wurden als eine neue
Strategie NS1-modifizierte, attenuierte Influenzaviren als Lebendimpfstoff vorgestellt, mit
denen im Tierversuch erfolgreiche Resultate erzielt worden waren (Solorzano et al., 2000).
Doch solange einige wichtige Pathogenitätsfaktoren der Influenzavirusinfektion nicht
vollständig bekannt sind, bleiben die Strategien in Prophylaxe und Therapie
optimierungsfähig und weitere Bemühungen, verbesserte Impfstoffe gegen das
Influenzavirus zu generieren, sind indiziert (Keitel, 2002).
1.1.5. Mikrobiologie und Klassifizierung der Influenzaviren
Influenzaviren gehören zur Familie der Orthomyxoviridae (griech.: ortho = richtig; myxo =
Schleim) (Lamb and Krug, 2001). Die Viren dieser Familie zeichnen sich durch ein
15
Einleitung
einzelsträngiges, segmentiertes RNA-Genom negativer Polarität [ss(-)RNA] aus (Pons,
1971), wobei jedes Molekül für ein bis zwei virale Proteine codiert. Die genomischen viralen
RNAs werden durch das Nukleoprotein (NP) und eine RNA-Polymerase in virales
Nukleoprotein (vRNP) verpackt und sind von Matrixprotein M1 umhüllt, das unter der
lipidhaltigen Virusmembran angelagert ist (Zhao et al., 1998). Es ist für die innere Stabilität
des Virions verantwortlich und damit die formgebende Komponente des Virions. Darüber
hinaus befinden sich im Virion geringe Mengen des NEP-Proteins. Nicht Bestandteil des
Virions ist das virale Nichtstrukturprotein NS1, das von Influenzaviren in infizierten Zellen
exprimiert wird. Die Virushülle besteht aus einer Lipiddoppelschicht, deren Lipide bestimmten
glykoproteinfreien Mikrodomänen der Membran der Wirtszelle entstammen (Klenk et al.,
1971; Nayak et al., 2004). Man geht davon aus, dass diese sogenannten Rafts durch ihren
hohen Anteil an Cholesterol und Glycosphingolipiden für die strukturelle Ordnung der
Lipiddoppelschicht bestimmend sind (Scheiffele et al., 1999). In den Hüllkomplex sind virale
glykolysierte Transmembranproteine (Spikes) eingelagert (Klenk, Rott and Becht, 1971;
Steinhauer, 1999), die für die spezifische Antigenität der verschiedenen Subtypen
entscheidend sind.
Basierend auf der typspezifischen Antigenität des Nukleokapsidproteins und serologischer
Charakteristika des Matrixproteins werden die Influenzaviren in A-, B- und C-Viren typisiert.
Die Serotypen A und B werden in einem Genus zusammengefasst. Sie besitzen jeweils acht
Gensegmente, von denen jedes für ein bis zwei Gene codiert (Lamb and Choppin, 1981). In
die Virushülle eingelagert sind die Oberflächenproteine Hämagglutinin (HA) und
Neuraminidase (NA) (Lohmeyer et al., 1979). Ebenfalls Integralprotein des Hüllkomplexes ist
das membranständige M2 Ionenkanalprotein (Veit et al., 1991), welches jedoch in nur
kleinen Mengen an der Oberfläche repräsentiert ist. Bei Influenza C finden sich nur sieben
Gensegmente und die Funktionen der Oberflächenproteine werden durch ein Protein, das
Hämagglutinin-Esterase-Fusions(HEF)-Protein, zusammengefasst. Dieses ist sowohl
verantwortlich für die Adsorption des Virus an die Wirtszelle als auch für die Freisetzung der
einzelnen Nachfolgevirionen (Herrler et al., 1988).
1.1.5.1. Influenza A-Virus
Die in der Lipiddoppelschicht der Virushülle spikeförmig angeordneten Oberflächenproteine
lassen sich drei Typen unterscheiden. Zum einen finden sich hier die beiden Hauptantigene
Hämagglutinin (s.u.) und die Neuraminidase (Rott et al., 1976), ein als Tetramer
vorliegendes Typ-II-Membranprotein, dessen vier identische Untereinheiten durch
16
Einleitung
Disulfidbrücken miteinander verbunden sind (Varghese et al., 1983). Die Neuraminidase
besitzt enzymatische Aktivität zur Abspaltung terminaler Sialinsäuren von viralen
Glykoproteinen (Klenk E. et al., 1955; Blix et al., 1957; Hughes et al., 2000) und hat über ihre
Rolle im viralen Replikationszyklus hinaus auch Bedeutung für den Transport des Virus zu
den Zielzellen im zilientragenden Epithel. Desweiteren findet sich unter den
Oberflächenproteinen das bereits genannte M2-Ionenkanalprotein (Lamb and Choppin,
1981; Lamb et al., 1985), ebenfalls ein Homotetramer aus vier durch Disulfidbrücken
miteinander verbundenen Untereinheiten (Holsinger and Lamb, 1991). Es bildet den
Ionenkanal für den passiven Transport entlang des Protonenkonzentrationsgradienten (Pinto
et al., 1992), über den pH-Wert Veränderungen im Virusinneren und die resultierenden
Konformationsänderungen des HA reguliert werden (Chizhmakov et al., 1996).
Abb.3 . Elektronenmikroskopische Aufnahme von Influenza A-Viren (aus dem Institut für Virologie, Philipps-Universität Marburg)
Unter der Lipidmembran der Virushülle befindet sich die 6 nm dicke, aus dem M1 Protein
bestehende Matrix. Verschiedenen Untersuchungsergebnisse postulieren, dass das
Matrixprotein M1 sowohl mit den RNPs als auch mit den anderen viralen Proteinen HA, NA
und M2 interagiert (Dimmock et al., 1989; Zhao et al., 1998; Nayak et al., 2004). Während
des Replikationszyklus ist phosphoryliertes M1 für den Austritt neu-synthetisierter RNPs aus
dem Zellkern und den Transport zur Plasmamembran erforderlich (Bui et al., 2000). Alle
Influenzaviren besitzen eine eigene trimere RNA-abhängige RNA-Polymerase, die nach der
Infektion der Replikation und der Transkription des Virusgenoms dient. Ihr heterotrimerer
Komplex setzt sich zusammen aus den drei Untereinheiten PB1, PB2 und PA, die jeweils an
den 3’-Enden der RNPs kolokalisiert sind (Noda et al., 2006). Diese Polymerase katalysiert
die im Zellkern der Wirtszelle ablaufenden RNA-Syntheseprozesse. Die drei Proteinketten
wurden nach ihrem Verhalten bei der Elektrofokussierung benannt. Während die beiden PB-
17
Einleitung
Proteine ihren isoelektrischen Punkt (I.P.) im basischen (B) Bereich innehaben, liegt der
isoelektrische Punkt des PA-Proteins im sauren Bereich (A). Die Gensegmente liegen
verbunden mit dem Nukleoprotein (NP) und dem Polymerasekomplex als RNP-Komplex vor
(Yamanaka et al., 1990). Die Bindung des NP an virale RNA ist für die
Transkriptionsprozesse und die Replikation unerläßlich (Elton et al., 1999). Darüber hinaus
ist das Nukleoprotein ein typspezifisches Antigen, durch das sich Influenzaviren in A, B und
C unterscheiden lassen. Des Weiteren ist es Angriffspunkt für die zytotoxischen T-
Lymphozyten der Immunabwehr des Wirtes (Yewdell et al., 1989).
Das in infizierten Zellen exprimierte Phosphoprotein NS1 hemmt sowohl den Spleißvorgang,
als auch die Polyadenylierung zellulärer prä-mRNAs, was zu deren Retention im Zellkern
führt und dazu beiträgt, dass die Zelle nach kurzer Zeit ausschließlich virale Proteine
produziert. Das NS1-Protein besitzt die Fähigkeit, an Doppelstrang-RNA zu binden und
damit die Ausbildung eines interferoninduzierten antiviralen Status in der Zelle zu
antagonisieren (Reinhardt and Wolff, 2002).
Abb.4 .Schematische Darstellung des Influenza A-Virus
Das primär als Nichtstrukturprotein NS2 identifizierte Nuklear-Export-Protein (NEP) konnte,
wenn auch nur in geringen Mengen, als Bestandteil des Virions nachgewiesen werden. Es
spielt vermutlich ebenfalls eine Rolle im Zellkernexport viraler RNPs (O'Neill, 1998).
Das in Segmenten bestehende Genom ermöglicht den Viren die Bildung von Reassortanten.
Hier werden bei Infektionen von Zellen mit zwei unterschiedlichen Virustypen die RNA-
Moleküle während der Replikation und Morphogenese gemischt. Die Nachkommenviren
können so Neukombinationen der RNA-Segmente und damit neue Eigenschaften erhalten
(Webster et al., 1992). Anhand der Kombinationsvariationen von HA und NA erfolgt in der
Gruppe der Influenza A-Viren die Einteilung in die einzelnen Subtypen. Des Weiteren wird für
18
Einleitung
die genaue Bezeichnung die Wirtsquelle, der Ursprungsort, die Stammnummer und das Jahr
der Isolation benannt, z.B. Mallard/Alberta/205/98 (H2N9).Bei Hämagglutinin konnten bis heute 16 verschiedene Subtypen und für die Neuraminidase
neun unterschiedliche Subtypen identifiziert werden (Röhm et al., 1996; Steinhauer, 1999).
Die daraus resultierende Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten zwischen HA- und NA-
codierenden Gensegmenten bestimmt die große Zahl der möglichen Virussubtypen.
Der als Antigen-Shift bezeichnete Austausch von RNA-Segmenten und die damit
verbundene Bildung neuer Subtypen führt zu einer Veränderung der Oberflächenstruktur, die
im Wirtsorganismus eine Wiedererkennung und damit eine immunologische
Gedächtnisreaktion abschwächt oder gar unmöglich macht. Erst spät ist der Organismus in
der Lage, das Virus durch eigene Antikörper zu neutralisieren, was die Schwere der Infektion
und die Ausbreitung des Virus in einer Population verstärkt. Durch den Antigen-Shift erklären
sich somit die immer wieder auftretenden Pandemien des Influenzavirus, die mit einer
erheblichen Mortalität verbunden sein können (Shimizu, 2000).
Die jährlichen kleineren Epidemien beruhen auf der hohen Mutationsrate, die durch die
mangelnde Präzision der RNA-duplizierenden virusspezifischen Polymerase verursacht wird.
Diese Punktmutationen einzelner Segmente werden als Antigen-Drift bezeichnet. Dadurch
entstehen unterschiedlich starke Abweichungen in der Sequenz einzelner Virusisolate von
der Grundsequenz ihres Subtyps (Webster et al., 1980; Kilbourne et al., 1990). Durch die
daraus resultierende Veränderung in der Aminosäuresequenz ergibt sich eine kontinuierliche
Veränderung bestehender Antigenmuster.
1.1.5.1.1. Replikationszyklus Influenza A-Virus
Nach der Adsorption über das virale Hämagglutinin an die N-Acetylneuraminsäuren
membranständiger Glykoproteinrezeptoren, deren bestimmende Domäne durch die
wirtsspezifischen Sialyloligosaccharide charakterisiert ist, wird das Virus von der Zelle
endozytiert (Matrosovich and Klenk, 2003). Die Bindung erfolgt bei humanpathogenen
Subtypen über α2-6 verknüpfte Sialinsäuren, die auf der Oberfläche nicht-zilientragender
Epithelzellen des Respirationstraktes lokalisiert sind. Die Rezeptoren für die Bindung des
Hämagglutinins aviärer Subtypen sind α2-3 verknüpfte Sialinsäuren auf der Oberfläche der
zilientragenden Atemwegszellen (Matrosovich et al., 2004). Das Endozytosevesikel wird von
der zellulären Zytoplasmamembran abgeschnürt und fusioniert nach dem Transport zum
Endosom mit dessen Membran. Das Virion wird ins Innere des Endosoms freigesetzt. Im
dadurch entstehenden Phagolysosom sinkt durch H+-ATPasen der pH-Wert auf 5,4 bis 5.
19
Einleitung
Durch die Veränderung des pH-Werts ändert der Hämagglutininkomplex seine Konformation
und exponiert die hydrophobe fusogene Domäne am aminoterminalen Ende der HA2-
Untereinheit am Kopfteil des Proteins (Abb. 6). Dieser Arm des HA kann aufgrund seines
hydrophoben Charakters in die Endosomenmembran eingelagert werden, und es kommt zur
Fusion der Virushülle und der Lipiddoppelschicht des Phagolysosoms. Das saure Milieu wird
durch den M2-Ionenkanal ins Virus-Innere fortgeleitet. Der nun auch im Inneren des Virions
erniedrigte pH-Wert bewirkt die Destabilisierung des Nukleokapsids; das Matrixprotein M1
wird von den RNPs abgelöst (Whittaker et al., 1996). Die RNPs werden nach der Fusion der
beiden Membranen ins Zytoplasma freigesetzt. Die Kerntransportsignale, die sich auf dem
Nukleoprotein und den Polymerasemolekülen befinden, stimulieren nun den Transport der
RNP-Komplexe durch das zelluläre Importin-System in den Zellkern (Wang et al., 1996). Hier
wird die Replikation initiiert. Wie bei allen Viren mit einem Genom einzelsträngiger RNA in
Negativorientierung [ss(-)RNA] ist zusätzlich zur Freisetzung des Komplexes aus RNA und
assoziierten Proteinen die RNA-Polymerase notwendig, die von dem eingedrungenen
Genom zunächst eine vollständige komplementäre RNA-Kopie in Positivorientierung erstellt
(cDNA), welche als Matrize für die Herstellung von ss(-)RNA-Strängen dient. Diese ss(-)
RNA-Stränge können einerseits zu Genomen neuer Tochterviren zusammengefasst werden
(vRNA), andererseits dienen sie zur Transkription virusspezifischer (+)mRNA, die ins Zytosol
ausgeschleust wird. Hier werden von der viralen mRNA die viralen Proteine durch den
Syntheseapparat der Wirtszelle translatiert (Whittaker et al., 1996; Wang et al., 1997). Bis
auf die Membranproteine werden alle Proteine an freien Ribosomen im Zytoplasma
synthetisiert und nach ihrer Fertigstellung zunächst wieder in den Zellkern transportiert. In
der frühen Replikationsphase werden vornehmlich NP- und NS1-Proteine exprimiert. Diese
wandern wieder in den Zellkern ein, wo das NP nach ausreichender Akkumulation den
Übergang von der Transkription in die Replikationsphase bewirkt, während NS1 den Export
der viralen mRNAs ins Zytoplasma initiiert. Durch Signalpeptide vermittelt werden in der
späteren Phase der Replikation HA, NA und M2 an der Membran des rauen
endoplasmatischen Retikulums (rER) translatiert. Während der Prozessierung im Golgi-
Apparat wird das HA zu einem homotrimeren Proteinkomplex zusammengesetzt, NA und M2
zu homotetrameren Komplexen. Hier werden auch die im rER zum Teil schon begonnenen
posttranslationalen Modifikationen vollendet, wie die Glykolisierung der Membranproteine
(Elder et al., 1979; Klenk et al., 2002) sowie die Phosphorylierung des M2-Proteins und das
Anfügen von Palmitinsäureresten an HA und M2 (Veit et al., 1990).
20
Einleitung
Abb.5 . Replikationszyklus des Influenza A-Virus
Vom Golgi-Apparat aus werden die Proteine durch die Golgi-Vesikel zur Zellmembran
transportiert. Bei bestimmten Influenza A-Virusinfektionen ist es erforderlich, dass die
Azidität im trans-Golgi-Netzwerk durch das M2-Protein reduziert wird, um die vor der
Assemblierung und der folgenden Abknospung erforderliche Passage des säuresensiblen
Hämagglutinins zur Plasmamembran zu ermöglichen (Chizmakov et al., 1996).
Das im späteren Verlauf des Replikationzyklus gebildete M1-Protein assoziiert im Zellkern,
gebunden an das Nuklear-Export-Protein, mit den vRNPs und induziert deren Export ins
Zytosol. Aufgrund der spezifischen Affinität des M1-Proteins werden ausschließlich vRNPs
ausgeschleust. Die Signalstellen für die Kernlokalisation des NP werden durch die Bindung
von M1 verdeckt; dies verhindert einen möglichen Rücktransport der vRNPs in den Nukleus
(Whittaker et al., 1996).
Die Morphogenese neuer Viren beginnt, wenn genügend vRNPs und Strukturproteine
synthetisiert wurden. Diese assemblieren in den Bereichen der Zellmembran, die
21
Einleitung
ausschließlich mit den neu synthetisierten viralen Membranproteinen besetzt sind. Das
Matrixprotein M1 bestimmt durch die Assoziation an HA, NA, die RNPs und die Zellmembran
den Prozess der Virushüllenbildung (Gomez-Puertas et al., 2000). In diesem letzten Schritt
der Morphogenese wird das Kapsid mit der zellulären Lipidmembran umhüllt, die neuen
Viren werden abgeschnürt und ausgeschleust. Dabei werden endständige N-
Acetylneuraminsäuren viraler Glykoproteine von der Neuraminidase abgespalten, um eine
Anheftung an der Zellmembran zu verhindern und die einzelnen Virions aus ihrem Verband
zu lösen. Diese können jetzt neue Zellen infizieren.
1.1.5.1.2. Hämagglutinin (HA)
Das Hämagglutinin (HA), benannt nach der Fähigkeit der Influenza-Viren, Erythrozyten zu
agglutinieren (Hirst, 1941), ist ebenso verantwortlich für die zu Beginn der Influenza-
Virusinfektion stattfindende Bindung an Rezeptoren der Wirtszelle, wie für die
Verschmelzung der Virushülle mit der Endosomenmembran. Da das Immunsystem gegen
die Struktur des Hämagglutinins die meisten Antikörper bildet und das Hämagglutinin die
Fusionsprozesse steuert, spielt es die Schlüsselrolle im Infektionsprozess (Wiley and Skehel,
1977).
HA liegt als homotrimerer Komplex auf der Virusoberfläche vor (Wiley et al., 1977). An jeder
der drei Trimerkomplex-Untereinheiten ist eine Bindungsstelle für den HA-Rezeptor
lokalisiert. In diesem Areal sind die Aminosäuren hochkonserviert und bestimmen die
Spezifität der einzelnen Subtypenstämme, während die weiteren Bereiche häufig durch
Punktmutationen verändert sind.
Die zur Fusion befähigten Spikes bestehen aus den Untereinheiten HA1 und HA2, die aus der
Spaltung des inaktiven Vorläufermoleküls HA0 entstehen. Nach der Interaktion der
monomeren HA-Proteine im Golgi-Apparat zum homotrimeren Proteinkomplex HA0 macht
sich das Virus zelleigene Endoproteasen zunutze, die HA0 in einen aminoterminalen
Abschnitt HA1 und einen carboxyterminalen Abschnitt HA2 spalten. Die beiden Untereinheiten
bleiben über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden. Diese Spaltung ist essentiell für die
Aktivierung des Hämagglutinins (Lazarowitz and Choppin, 1975; Klenk et al., 1975; 1977;
Zhirnov et al., 2003). Die Spaltung findet an einer seitlichen Peptidschleife statt, an der 329.
Aminosäurenposition, einem Arginin. Dieses wird von dem hochkonservierten Glycin
abgespalten, das dann den N-Terminus des HA2 bildet. Anschließend wird der Argininrest -
monobasisch im Fall der apathogenen und humanen Virusstämme, multibasisch bei den
hochpathogenen Stämmen - an der Spaltstelle des HA1 entfernt (Garten et al., 1982; 1989).
22
Einleitung
Diese Abspaltung erfolgt durch die Einwirkung einer Exopeptidase vom Typ der
Carboxypeptidase B, deren Aktivität jedoch nicht für die Infektivität des Virus entscheidend
ist (Garten and Klenk, 1983). Durch die Spaltung des Hämagglutinins wird im Zuge einer
Konformationsänderung am aminoterminalen Ende des HA2 ein Abschnitt hydrophober
Aminosäuren im Inneren des Moleküls verborgen.
HA0 HA1+HA2
a) b) c)
Abb.6 . Hämagglutinin: a) ungespalten, HA0 mit seitlicher Schleife, 329. Aminosäurenposition (Arginin) (Pfeil)
b) gespalten, HA1 und HA2 über Disulfidbrücke noch miteinander verbunden
c) Entfaltung des Moleküls mit Exposition des Kopfteils aus hydrophoben Aminosäuren im sauren Milieu. Der Kopfteil befähigt das Virus zur Verschmelzung mit der Endosomenmenbran.
Im sauren Milieu der Endosomen entfaltet das Protein nun zu Beginn des Replikationszyklus
seine Struktur. Der niedrige pH-Wert ist hierbei entscheidend. Durch die bei pH 5 induzierte
Konformationsänderung wird der durch proteolytische Spaltung freigesetzte Abschnitt
hydrophober Aminosäuren, das sogenannte Fusionspeptid, am Kopfteil des Proteins
exponiert. Dies befähigt das Virus zur Verschmelzung der Virushülle mit der
Endosomenmembran (Skehel and Wiley, 2000). Somit wird deutlich, dass die proteolytische
Spaltung von HA0 ein entscheidender Faktor bei der Ausbreitung des Virus im Gewebe ist
(Zhirnov and Klenk, 2003).
Das Aminosäurenmotiv der Spaltstelle kann variieren. Das Motiv bestimmt den Ort, wo die
Spaltung stattfindet und die Protease, die vom Virus genutzt wird. Besitzt das HA in seiner
23
Einleitung
Spaltstelle die multibasische Erkennungssequenz für subtilisin-ähnliche Proteasen wie Furin
(Garten et al., 1981) oder PC6 (Horimoto et al., 1994; Garten et al., 2004), erfolgt die
Spaltung bereits intrazellulär während der Assemblierung der Virionen im Replikationszyklus.
Diese charakteristischen multibasischen Spaltstellen liegen nur bei hochpathogenen aviären
Influenzastämmen vor, welche zu den HA-Subtypen H5 oder H7 gehören (Steinhauer, 1999).
H1 : PSIQS---R-GLFH2 : PQIES---R-GLFH3 : PEKQT---R-GLFH4 : PEKAS---R-GLFH5 : PQRKRKKKR-GLFH6 : PQIET---R-GLFH7 : PEIPKKKKR-GLFH8 : PSVEP---R-GLF
H9 : PAVSS---R-GLFH10 : PEIMQG--R-GLFH11 : PAIAS---R-GLFH12 : PQVQD---R-GLFH13 : PAISN---R-GLFH14 : PGKQA---R-GLFH15 : PEKIHT—-R-GLF
Abb.7 . Schnittstellen-Motive der HA-Subtypen
Die subtilisin-ähnlichen Proteasen, die diese Spaltstellen erkennen, sind ubiquitär verbreitet
und können daher das Virus in nahezu allen Zellen aktivieren. Dadurch erklärt sich die hohe
Pathogenität dieser Stämme und ihre Fähigkeit zur systemischen Ausbreitung in den
zahlreichen Geweben des Wirtes (Bosch et al., 1981; Steinhauer, 1999). Untersuchungen
des aviären hochpathogenen Fowl Plaque Virus (FPV) A/FPV/Rostock/34 (H7N1) in
Hühnerembryonen ergaben, dass das Hämagglutinin des FPV an Endothelzellen als
Zielzellen bindet. Die Rezeptoren für die Adsorption, die über die Bindung von HA vermittelt
wird, werden restriktiv nur von Zellen des Endothels und einigen epithelialen Zellen
exprimiert, nicht aber von Geweben, die das Endothel umgeben. Dieser Endotheltropismus
wird unterstützt durch die lediglich an der apikalen Membran infizierter Zellen stattfindende
Abschnürung neuer Viren und deren Freisetzung ins Lumen. Neue Untersuchungen zu den
spezifischen Zielzellen des Virus in differenzierten humanen Epithelzellen des
Respirationstraktes ergaben, dass die humanen Stämme vorzugsweise nicht-zilientragende
Zellen infizieren, während die aviären Virusstämme sowie eine hühnerei-adaptierte
24
Einleitung
humanpathogene Variante mit aviärer Rezeptorspezifität vornehmlich zilientragende Zellen
befallen. Die Untersuchungen ergaben eine klare Korrelation zwischen den Virusstämmen
und den Sialinsäurenverknüpfungen der Rezeptoren auf der Oberfläche der jeweiligen
Zielzellen (Matrosovich et al., 2004).
Aufgrund der multibasischen Spaltstelle, an der die ubiquitäre Protease Furin angreift, kann
das Hämagglutinin der hochpathogenen aviären Virusstämme in allen Geweben gespalten
werden. Die so aktivierten Viren breiten sich über das Gefäßsystem systemisch in den
Endothelien und epithelialen Zellen der Wirtsorgane aus (Feldmann et al., 2000). In
Zellkulturen, in denen HA0 mangels einer geeigneten Protease nicht gespalten wird, kann die
Spaltung durch die exogene Zugabe von Trypsin initiiert werden (Klenk et al., 1975).
Bei den aviären Stämmen von niedriger Pathogenität sowie bei den humanen Virusstämmen
liegt zwischen den beiden Untereinheiten eine monobasische Spaltstelle, die von trypsin-
ähnlichen Serinproteasen gespalten wird. Sie spalten HA0 extrazellulär an der Zelloberfläche
(Lazarowitz et al., 1973; Garten et al., 1981). Da diese Aktivierungsproteasen nur in
bestimmten Zelltypen oder Geweben vorzufinden sind, verursachen die Viren dieser Stämme
üblicherweise nur lokale Infektionen, wie beispielsweise im Respirationstrakt von
Säugetieren oder im Gastrointestinaltrakt der Wasservögel (Steinhauer, 1999).
In humanen epithelialen Drüsenzellen (HAEC) wird HA0 humaner Virusstämme nicht
gespalten, wenn die Virionen in der Extrazellulärflüssigkeit vorliegen und keine Adsorption an
die Zellen stattgefunden hat. Währenddessen wird neu in den Zellen synthetisiertes HA0 in
die beiden Untereinheiten HA1 und HA2 gespalten, deren Kumulation in den Zellen
nachgewiesen werden kann. Ebenso wird HA0 der Virionen, die an die Zellen binden,
proteolytisch in HA1 und HA2 gespalten. Dies unterstützt die Vermutung, dass die Spaltung
von HA0 humaner Stämme in HAEC zellgebunden ist. Die Spaltung und die Virusaktivierung
konnten durch Inhibitoren wie Aprotinin und Leupeptin gehemmt werden, während die
Zugabe von fetalem Kälberserum, welches mehrere hochmolekulare Antiproteasen enthält,
die mit extrazellulären Proteasen konkurrieren, keine Hemmung der Virusausbreitung in
HAEC induzierte. Diese Ergebnisse weisen ebenfalls darauf hin, dass im humanen
respiratorischen Epithel die Spaltung des Influenza A-Virus Hämagglutinins ein von
Serinproteasen begleiteter, zellassoziierter Prozess ist, der durch niedermolekulare exogene
Serinproteasen-Inhibitoren gehemmt werden kann (Zhirnov et al., 2002).
25
Einleitung
1.2. Bedeutung der Aktivierungsproteasen
Die meisten viralen Glykoproteine, die post-translationem gespalten werden, werden durch
ubiquitäre intrazelluläre Proteasen gespalten. Einige Glykoproteine, unter ihnen das
Influenzavirus-Hämagglutinin, werden jedoch durch Sezernierungsproteasen aktiviert, die
nur in bestimmten Wirtssystemen vorkommen. Diese Mechanismen sind von entscheidender
Bedeutung für die Ausbreitung einer Infektion, die Wirtssysteme des Virus und seine
Pathogenität (Klenk and Garten, 1994).
Daher ist die Charakterisierung HA-spaltender Endoproteasen in vivo von großer Bedeutung
für das biologische Verständnis und unter Umständen für eine gezielte Therapie der
Influenzavirusinfektion.
Die Schwere einer Erkrankung mit dem Influenza A-Virus kann durch einen allgemeinen
Serinproteaseninhibitor, wie z.B. Aprotinin, gemildert werden (Zhirnov et al., 1985a; 1985b).
Zahlreiche Ergebnisse veranschaulichen – wie unter 1.1.5.1.2. bereits erwähnt – die
Bedeutung der Aktivierungsproteasen bei der Spaltung von Hämagglutinin. Aufgrund dieser
Beobachtungen stellt sich die Frage nach der Rolle der Serinproteasen des
Respirationstraktes bei der Spaltung von HA im Rahmen der Influenzavirus-Infektion.
In vitro-Versuche erbrachten den Nachweis, dass Trypsin und trypsinähnliche
Serinproteasen ebenso wie einige andere Proteasen, u.a. Akrosin und Urokinase, an der
HA-Spaltstelle angreifen und zur Spaltung von HA0 befähigt sind (Lazarowitz et al.,1973;
Klenk et al.,1975).
In vivo wurden bis heute einige Proteasen des Respirationstraktes beschrieben, aber noch
nicht vollständig charakterisiert bzw. genetisch identifiziert. Eine der Bekanntesten unter
ihnen ist die aus der Lavage von Rattenlungen isolierte Tryptase Clara. Sie wird in Clara-
Zellen synthetisiert und in sekretorischen Granulae gespeichert. Eine Kolokalisation mit
Lungen-Surfactant konnte nachgewiesen werden. Tryptase Clara ist in der Lage, durch die
Spaltung von Hämagglutinin die Influenzaviren zu aktivieren. Sie hat ein neutrales pH-
Optimum und lässt sich durch unterschiedliche Proteaseinhibitoren, u.a. Aprotinin, Leupeptin
und Lungen-Surfactant, hemmen (Kido et al., 1993).
Sakai et al. haben gezeigt, dass im Rahmen einer Infektion mit dem Sendai-Virus die
Kompartimentierung dieser Protease pathologisch verändert wird. Das Fusionsprotein des
Sendai-Virus wird, wie das Hämagglutinin, an einem Argininrest in die Untereinheiten F1 und
F2 gespalten. Während im gesunden Respirationstrakt Tryptase Clara weder in bronchiolären
Flimmerzellen noch in Alveolarzellen vorkommt, wurde sie zu Beginn der Infektion in
luminalen peripheren Membranen sowohl von nicht-zilientragenden als auch von
26
Einleitung
zilientragenden Epithelzellen der Bronchiolen nachgewiesen. Daneben war in den Zellen das
Sendai-Virus-Oberflächenprotein F2 nachweisbar. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass im
Zuge der viralen Infektion das Sendai-Virus die Sekretion von Tryptase Clara aus den nicht-
zilientragenden Bronchiolarzellen in die Atemwege stimuliert und dadurch die Aktivität der
Tryptase Clara im Respirationstrakt zunimmt. Dies würde bedeuten, dass sich die
Kompartimentierung der Aktivierungsproteasen als Reaktion auf virale Infektionen verändern
kann (Sakai et al., 1994).
Das ebenfalls aus der Ratte isolierte Mini-Plasmin, eine trypsin-ähnliche Protease, ist ebenso
in der Lage, bestimmte HA-Moleküle des Influenzavirus in vitro zu spalten (Murakami et al.,
2001). Auch bestimmte Proteasen bakterieller Herkunft kommen als HA-aktivierende
Enzyme in Frage (Tashiro et al., 1987a; 1987b).
Aufgrund ihrer Arginin-Substrat-Spezifität sind in den letzten Jahren eine Reihe von
trypsinähnlichen Proteasen bekannt geworden, die zu der Gruppe der Typ II Transmembran-
Serinproteasen (TTSPs) gehören. Die verschiedenen gemeinsamen strukturellen Aspekte
der TTSPs sind die proteolytische Domäne, die Transmembrandomäne, sowie die
zytoplasmatische Domäne. Der extrazelluläre C-terminale Bereich enthält die
Serinproteasen-Domäne, deren Aminosäurensequenz in den verschiedenen TTSPs zu
einem großen Teil identisch ist. Insbesondere die Histidin-, Aspartat- und Serinreste, die für
die katalytische Aktivität entscheidend sind, weisen hochkonservierte Motive auf. Die
Transmembrandomäne ist so gelegen, dass die proteolytische Domäne extrazellulär
lokalisiert ist. Der zytoplasmatische N-terminale Anteil der TTSPs ist von unterschiedlicher
Größe und variiert bei den verschiedenen Vertretern dieser Proteasengruppe zwischen 12
und 112 Aminosäuren. Er läßt eine mögliche Funktion in der Signaltransduktion vermuten
(Hooper et al., 2001). Typ II Transmembran-Serinproteasen werden als Zymogene
synthetisiert und vermutlich durch die Spaltung an einem Arginin oder Lysin im
hochkonservierten Motiv aktiviert. Die proteolytische Domäne bleibt mit der katalytischen
Domäne über eine Disulfidbrücke verbunden. Alle Typ II Transmembran-Serinproteasen
spalten carboxyterminal von Arginin. Die TTSPs kommen in vielen unterschiedlichen Zellen
und Geweben vor, die einzelnen Proteasen weisen jedoch restriktive Expressionsmuster auf,
was gewebespezifische Funktionen und Substratspezifitäten vermuten lässt. Bestimmte
Serinproteasen, unter anderem die Enteropeptidase, Trypsin, TMPRSS2 und die Human
Airway Trypsin-like Protease (HAT), aktivieren Protease-Aktivierte-Rezeptoren (PAR) vom
Typ PAR2 durch proteolytische Spaltung der N-terminalen Rezeptordomäne. Diese
Transmembranrezeptoren sind G-Protein-gekoppelt. Durch ihre Aktivierung wird das
27
Einleitung
intrazelluläre freie Calcium erhöht und die Signaltransduktion initiiert. Die von der
Enteropeptidase aktivierten PAR2 finden sich an der apikalen Membran von Enterozyten
(Hooper et al., 2001), während HAT PAR2 humaner Bronchialepithelzellen aktiviert (Miki et
al., 2003, Matsushima, 2006).
Für die HA-Aktivierung humanpathogener Influenza-Viren gelten vier Serinproteasen als
vielversprechende Kandidaten:
1. PRSS22 (protease serine S1 family member 22)
2. PRSS8 (protease serine S1 family member 8)
3. HAT (Human Airway Trypsin-like Protease)
4. TMPRSS2 (transmembrane protease, serine, 2)
1.2.1. PRSS22 (protease serine S1 family member 22)
Die Protease mit dem Synonym Tryptase Epsilon ist eine Serinprotease der Serin-S1-
Proteasen Familie. Ihre Gensequenz wurde im humanen Gen-Cluster 16p13.3 entdeckt. Die
hier codierten Proteasen werden in den epithelialen Zellen des Respirationstraktes
exprimiert. PRSS22 konnte aus epithelialen Zellen der Trachea und des Ösophagus
Erwachsener sowie aus unterschiedlichen anderen epithelialen Geweben isoliert werden.
Während PRSS22 in der Lunge Erwachsener nur spärlich exprimiert wird, konnte in
Präparaten fetaler Lungen das Transkript in größerer Menge nachgewiesen werden. Diese
Ergebnisse weisen hin auf eine mögliche regulierende Rolle dieser Protease in der
Lungenentwicklung (Wong et al., 2001).
1.2.2. PRSS8 (protease serine S1 family member 8)
PRSS8, auch unter dem Synonym Prostasin bekannt, ist ebenfalls eine Serinprotease der
Serin-S1-Proteasen Familie. Diese Protease ist meist membrangebunden in einer GPI-
verankerten Form und konnte außer aus der Lunge auch aus Prostata, Niere,
Gastrointestinaltrakt und Haut isoliert werden. PRSS8 wird primär als Transmembranprotein
mit einem Carboxy-terminalen Peptidanker synthetisiert. Zu ihrer Aktivierung muss das
Zymogen an der tryptischen Spaltstelle hydrolisiert werden. Die Peptidase wird vor allem in
Epithelzelllinien des humanen Respirationstraktes exprimiert. In diesen Zellen bewirkt
PRSS8 eine Aktivitätssteigerung des Amilorid-sensitiven epithelialen Natriumkanals (ENaC)
an der Zelloberfläche. Bei Untersuchungen des Krankheitsbildes der zystischen Fibrose (CF)
am ΔF598 CF Epithel konnte die Bedeutung der Protease in der regulativen Funktion der
28
Einleitung
Natriumionenströme gezeigt werden (Tong et al., 2004). PRSS8 wird von Aprotinin in seiner
Funktion gehemmt.
1.2.3. Human Airway Trypsin-like Protease (HAT)
Die Human Airway Trypsin-like Protease (HAT) wurde 1997 durch sequentielle
chromatographische Verfahren von Yasuoka et al. aus dem Sputum von Patienten mit
chronischen Atemwegserkrankungen isoliert und als neue trypsin-ähnliche Protease
beschrieben. HAT wird aber auch im Bronchialepithel Gesunder exprimiert. Sie konnte in den
Geweben des menschlichen Respirationstraktes, hauptsächlich der Trachea, nachgewiesen
werden, die primäres Ziel natürlicher Influenzavirusinfektionen sind. Darüber hinaus konnte
gezeigt werden, dass HAT Proteine carboxyterminal an einem Argininrest spaltet (Yasuoka
et al., 1997). Aufgrund ihrer Lokalisation und ihrer spezifischen proteolytischen
Eigenschaften wurde die Human Airway Trypsin-like Protease als aussichtsreiche Kandidatin
für eine HA-Aktivierungsprotease erachtet.
1.2.3.1. Eigenschaften und Lokalisation der Human Airway Trypsin-like Protease (HAT)
Bei der HAT handelt es sich um eine integrale Typ II Transmembran-Serin-Protease mit
einer extrazellulären katalytischen Ektodomäne. Hier weist HAT Homologien zu Acrosin,
Hepsin, der Enteropeptidase und der Tryptase der Mastzellen auf (Yamaoka et al., 1998).
Durch verschiedene Versuche konnte gezeigt werden, dass HAT am Carboxy-Terminus von
Argininresten in der P1 Position bestimmter Peptide spaltet. Als spezifisches Substrat erwies
sich Boc-Phe-Ser-Arg-4-Methylcumaryl-7-Amid, das auch von Trypsin gespalten wird. Es
wird von HAT bei einem pH-Optimum von 8,6 gespalten. Die Aktivität von HAT kann von
einer Reihe von Proteaseinhibitoren effektiv gehemmt werden, unter anderem von
Diisopropylfluorophosphat (DFP), Aprotinin, Leupeptin, Antipain und dem Soybean-Trypsin-
Inhibitor. Dagegen hemmen der sekretorische Leukozyten-Proteasen-Inhibitor sowie
Elastinal (Elastase-Inhibitor) und Bestatin (Aminopeptidase B Inhibitor) die Aktivität von HAT
nur geringfügig (Yasuoka et al., 1997).
Es zeigte sich in verschiedenen Untersuchungen, dass auch HAT an den bereits
beschriebenen Protease-Aktivierten-Rezeptoren (PAR) vom Typ 2 agonistisch wirkt durch
die Spaltung der aminoterminalen Rezeptordomäne. PAR2 werden durch Serinproteasen der
Trypsin-Familie aktiviert, wie z.B. Trypsin oder die Mastzelltryptase (Chokki et al., 2004). In
humanen Zellen des Bronchialepithels wurde in vitro ein Anstieg der intrazellulären
29
Einleitung
Calciumkonzentration durch die Aktivierung von PAR2 durch HAT nachgewiesen (Miki et al.,
2003). PAR2 ist G-Protein gekoppelt. Seine Aktivierung führt über die Aktivierung der
Phospholipase C zur Hydrolyse des Phosphatidylinositol-bisphosphats und zur Freisetzung
von Calciumionen aus den intrazellulären Speichern des sarkoplasmatischen Retikulums
(Matsushima et al., 2006). In vitro haben Matsushima et al. 2006 auch gezeigt, dass HAT
über die Aktivierung von PAR2 die Proliferation humaner bronchialer Fibroblasten stimuliert.
Das würde in vivo bedeuten, dass HAT nicht nur die Regeneration im Respirationstrakt
mitbeeinflusst, an der in akuten Entzündungen Fibroblasten beteiligt sind, sondern auch das
Remodeling durch Fibroblasten, wie die Verdickung der Basalmembranen und der
subepithelialen Schichten im Rahmen chronischer Entzündungen.
Einige Lokalisationen von HAT im Respirationstrakt konnten durch immunhistochemische
Untersuchungen ermittelt werden. HAT fand sich im Zytoplasma zilientragender Zellen des
Bronchialepithels und im basalen Anteil der Zilien. Im Zytoplasma von Zellen der
bronchoepithelialen Suprabasalschicht, die mit den zilientragenden Zellen korrespondieren,
belegten die Untersuchungen eine granuläre und vesikuläre Immunreaktivität, was auf eine
Lokalisation im Golgi-Apparat oder am rauen endoplasmatischen Retikulum hinweist
(Takahashi et al., 2001).
Andere Arbeiten ergaben eine Lokalisation der Protease in den submukösen, serösen
Drüsenzellen der Trachea und der Bronchien. Diese Zellen sind hauptverantwortlich für die
Sekretion der unterschiedlichen Makromoleküle, die das Bronchialsekret bilden und damit
eine wichtige Funktion in der Infektionsabwehr im Respirationstrakt besitzen. Ein Nachweis
für HAT in den Bronchialepithelzellen konnte in diesen Untersuchungen jedoch nicht erbracht
werden (Yasuoka et al., 1997). Die unterschiedlichen Untersuchungen stimmen darin
überein, dass HAT nicht in alveolären Zellen oder Mastzellen des Respirationstraktes
lokalisiert ist. Es wird vermutet, dass HAT von epithelialen Zellen sowohl in die Epithelschicht
als auch während Entzündungsprozessen und bei anderen Gewebeschädigungen in die
subepitheliale Schicht freigesetzt wird. Dort könnte HAT als parakriner Faktor an den Zellen
wirken (Matsushima et al., 2005).
Die unterschiedlichen Ergebnisse verdeutlichen zum einen, dass die Lokalisation von HAT
im Respirationstrakt noch der genaueren Klärung bedarf, und zum anderen, dass die
Expression von HAT im Gewebe in Abhängigkeit vom physiologischen und
pathophysiologischen Status des Bronchialepithels sehr variiert. Aufgrund dieser Ergebnisse
lässt sich vermuten, dass die Human Airway Trypsin-like Protease an der Abwehr und der
mukoziliären Clearance sowohl im gesunden als auch im erkrankten Respirationstrakt
30
Einleitung
beteiligt ist und darüber hinaus möglicherweise auch Prozesse und Gewebeveränderungen
chronischer Atemwegserkrankungen verstärkt und unterstützt (Takahashi et al., 2001).
1.2.3.2. Genetik und Molekularbiologie von HAT
Im Sputum liegt HAT als Monomer mit einem Molekulargewicht von 27 kDa vor. Die Analyse
der cDNA läßt darauf schließen, dass HAT als Vorläufermolekül mit einem Molekulargewicht
von 48 kDa synthetisiert wird und diese membrangebundene Vorstufe durch limitierte
Proteolyse zu einer löslichen Protease aktiviert wird, die an die Schleimhaut freigesetzt wird
(Takahashi et al., 2001). Das zugehörige Gen wurde kloniert und sequenziert. Das
Polypeptid besteht aus 418 Aminosäuren, 232 bilden die extrazelluläre carboxyterminale
katalytische Region und 186 Aminosäuren den nicht-katalytischen Bereich.
Die Sequenz der katalytischen Region stimmt zu 29-38% mit Hepsin, der Enteropeptidase,
Acrosin und der Mastzelltryptase überein. Diese Region wird als Serinproteasendomäne
identifiziert. Sie enthält die katalytische Triade aus Histidin, Aspartat und Serin, die zur
Substratspaltung erforderlich ist. Man geht davon aus, dass die katalytische
Serinproteasendomäne nach der Spaltung der membrangebundenen Protease sezerniert
wird. Diese Spaltung wird vermutlich im Bereich der Prodomäne, die der
Serinproteasendomäne direkt vorgelagert ist, vollzogen. Dieser Bereich aus 14 Aminosäuren
enthält einen Argininrest, an dem die Spaltung wahrscheinlich erfolgt.
Abb.8 . Aufbau der Human Airway Trypsin-like Protease
(H2N: Aminoterminus; TM: Transmembrandomäne, SEA-Modul: „urchin sperm protein, enterokinase and agrin“-Domäne; P: Prodomäne/Aktivierungsdomäne; COOH: Carboxyterminus; die Zahlen bezeichnen die Aminosäurenposition der verschiedenen Domänen)
Die nicht-katalytische Region von HAT weist nur wenige Übereinstimmungen mit anderen
bekannten Proteasen auf (Yamaoka et al., 1998; Takahashi et al., 2001). In dieser Region
liegt vermutlich nahe des Aminoterminus eine hydrophobe Transmembrandomäne.
Neben der Transmembrandomäne ist ein SEA (= urchin sperm protein, enterokinase and
agrin) Modul lokalisiert. SEA-Module bilden Domänen, die in vielen Muzinen und membran-
assoziierten Proteinen zu finden sind (Palmai-Pallag et al., 2005). Es wird vermutet, dass
31
Einleitung
diese Domänen die Bindung an die Zelloberfläche vermitteln. In der Gruppe der Typ II
Transmembran-Serin-Proteasen gibt es noch einige wenige andere Vertreter, wie die
Enteropeptidase, die dieses Modul aufweisen (Hansen et al., 2004).
1.2.3.3. Weitere Untersuchungen zu HAT
In vitro-Versuche zeigten, dass HAT die Schleimsekretion in Zelllinien des respiratorischen
Epithels steigert und die Mukusglykokonjugat-Synthese erhöht. HAT verstärkt die Muzin-
Gen-Expression in diesem Fall jedoch wahrscheinlich nicht über PAR2, sondern über den
Anti-Amphiregulin-EGFR-Weg. Sollten sich die Ergebnisse in vivo bestätigen lassen, wäre
HAT mitverantwortlich für die erhöhte Sekretproduktion in den Atemwegen bei Patienten mit
chronischen Atemwegserkrankungen (Chokki et al., 2003).
HAT ist in der Lage, Fibrinogen zu spalten, insbesondere dessen α-Kette. Durch
Vorbehandlung von Fibrinogen mit der Protease konnte eine Verminderung bis zu einem
kompletten Verlust der Thrombin-induzierten Koagulationsfähigkeit erreicht werden. Diese
Ergebnisse postulieren, dass HAT eine Rolle in antikoagulatorischen Prozessen im
Respirationstrakt, besonders auf der Ebene der mukosalen Membranen spielen könnte,
indem sie Fibrinogen spaltet und damit inaktiviert (Tsuchihashi et al., 1997; Yoshinaga et al.,
1998).
HAT konnte auch aus anderen Geweben, unter anderem aus der Haut, isoliert werden. In
den Epidermiszellen von Psoriasis-Patienten wurde eine erhöhte Expression von HAT und
eine erniedrigte Expression des PAR2 festgestellt. Weiterführende Untersuchungen zeigten,
dass HAT im Zusammenspiel mit PAR2 die IL-8-Produktion in der Epidermis von Psoriasis-
Patienten verstärkt, um die Einwanderung von inflammatorischen Zellen zu erhöhen (Iwakiri
et al., 2004). Auch in Bronchialepithelzellen konnte die IL-8-Synthese über die Aktivierung
des PAR2 durch die Human Airway Trypsin-like Protease stimuliert werden (Matsushima et
al., 2006). Ein Nachweis in Zellen des Nebennierenmarks sowie in adrenergen Tumoren
lassen eine Funktion im Wachstum der Nebenniere und in der Adrenaltumorgenese
diskutieren (Hansen et al., 2004).
Die Ergebnisse zeigen, dass HAT vielfältige Rollen im menschlichen Organismus zu erfüllen
hat, die nicht auf den Respirationstrakt beschränkt sind. Die weitere Untersuchung dieser
Protease mit dem Ziel, ihre Aufgabe bei verschiedenen Krankheitsbildern zu entschlüsseln,
könnte maßgeblich zum Verständnis von Entzündungsprozessen und Infektionen beitragen.
32
Einleitung
1.2.4. TMPRSS2 (transmembrane protease, serine, 2)
TMPRSS2 gehört zur Familie der humanen Typ II Transmembran-Serin-Proteasen. Die
Gensequenz dieser Protease ist auf dem Chromosom 21q22.3 lokalisiert. TMPRSS2 wird
vornehmlich in Zellen des normalen Prostatagewebes exprimiert, ist aber auch in
Lungengewebe, Pankreas, Leber, Niere und Kolon nachweisbar. In neoplasmatischem
Prostataepithel kommt es zu einer Überexpression von TMPRSS2, daher wird ihre Rolle in
der Karzinogenese diskutiert (Paoloni-Giacobino et al., 1997; Wilson et al., 2005).
Das 492 Aminosäuren große Protein ist androgen-reguliert. Es besitzt die Serinproteasen-
Domäne der S1 Familie, die vermutlich an Arginin- oder Lysinresten spaltet, sowie eine
SRCR (scavenger receptor cysteine-rich)-Domäne der Gruppe A. Diese Domäne ist
involviert in die Bindung an andere Zelloberflächen oder extrazelluläre Moleküle.
Desweiteren weist die Protease eine LDLRA (LDL receptor class A)-Domäne auf, die eine
Bindungsstelle für Calcium bildet, und eine Transmembrandomäne (Paoloni-Giacobino et al.,
1997; Hooper et al., 2000).
Zur Aktivierung von TMPRSS2 bedarf es einer autokatalytischen Spaltung. Nach ihrer
Aktivierung wird die Protease von der Zelloberfläche gelöst und in den Extrazellulärraum
sezerniert. Sie aktiviert unter anderem den bereits erwähnten G-Protein-gekoppelten PAR2,
was zur transienten Erhöhung des intrazellulären Calciums durch eine Freisetzung von Ca2+
aus intrazellulären Calciumspeichern führt und damit eine Signaltransduktion vermittelt. Die
Rezeptoren der PAR-Familie werden in verschiedenen normalen wie auch malignen
Geweben nachgewiesen. Ihre physiologische Aufgabe variiert und schließt Funktionen in
Entzündungsprozessen und bei der Metastasierung neoplastischer Zellen mit ein (Wilson et
al., 2005). TMPRSS2 weist eine genetische Verwandschaft mit anderen Serinproteasen, u.a.
Prostasin, auf. Die Protease beeinflusst den Natriumtransport in den Zellen der Lunge über
die Regulation des epithelialen Natriumkanals (ENaC = Epithelial Na+ Channel). Die
Regulation dieses Kanals ist für das Sekretvolumen und die mukoziliäre Clearance im
Respirationstrakt verantwortlich (Donaldson et al., 2002).
Die Fähigkeit von TMPRSS2, das Influenza A-Virus durch die proteolytische Spaltung von
Hämagglutinin zu aktivieren, konnte in vitro in MDCK-Zellen belegt werden. Die transiente
Expression von TMPRSS2 ermöglichte ohne die Zugabe exogenen Trypsins eine
multizyklische Replikation von Influenzaviren in diesen Zellen (Garten et al., 2004; Boettcher
et al., 2006).
33
Einleitung
1.3. Zielsetzung
Die Human Airway Trypsin-like Protease ist eine aus dem menschlichen Respirationstrakt
isolierte integrale Typ II Transmembran-Serinprotease, die Proteine carboxyterminal von
einem Argininrest spaltet. Es gibt zahlreiche Hinweise auf eine Bedeutung von HAT im
Rahmen von Infektionen, doch ihre Funktionen und Eigenschaften konnten noch nicht
vollständig geklärt werden. Die bisherigen Ergebnisse weisen sie jedoch als eine
aussichtsreiche Kandidatin für die Hämagglutinin-spaltende Wirtsprotease im Menschen aus.
Ziel dieser Arbeit war es, die Human Airway Trypsin-like Protease aus normalen humanen
Bronchialepithelzellen zu klonieren und Vektorplasmide, die das HAT-Gen enthalten, zu
generieren. Mit diesen Plasmiden sollten stabile Zelllinien etabliert werden, in denen HAT
konstant exprimiert würde, um sodann ihre Fähigkeit in der Aktivierung des Influenza A-Virus
durch die Spaltung von Hämagglutinin zu untersuchen. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde
die Zielsetzung dahingehend erweitert, zunächst die Protease selbst und ihre Expression in
den Zellen nachzuweisen und die Aktivität von HAT in den Zelllinien zu überprüfen.
34
Material
2. Material
2.1. Geräte
Beckmann CoulterTM Zentrifuge Avanti J-25 Beckmann, Frankfurt
mit JA-10 Rotor
Brutschrank, Cytoperm Inkubator Heraeus, Hanau
Elektrophorese Electrophoresis EPS 301 Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Eppendorf Zentrifuge 5415 C Eppendorf-Netheles-Hinz, Hamburg
GeneAmp PCR System 2400 Perkin Elmer, Wiesbaden
GenePulser Biorad, München
Heizblock Eppendorf-Netheless-Hinz, Hamburg
MegaBACETM 500 Amersham Biosciences, Freiburg
MegaBACETM 1000 Amersham Biosciences, Freiburg
Fluoreszenz-Mikroskop Axiophot Zeiss, Göttingen
Microzentrifuge Heraeus, Hanau
Minigelkammer Kentz, Reiskirchen
Minifuge T Heraeus, Hanau
Photometer Gene Quant Pro Amersham Pharmacia, Freiburg
Polaroid Kamera, Gel Doc 2000 BioRad GmbH, München
+ Sony Video Graphic Printer UP-895CE Dormed, Hamm
Quarzküvette Hellma, Müllheim
Schüttler für Bakterien + Hefeanzuchten HT Infors AG, Bottmingen
Spektralphotometer (Graphicord) Shimadzu, Japan
Spot Kamera, Version 2.1.2 Roche Diagnostics, Rotkreuz, Schweiz
Taumelschüttler Biorad, München
Vortex Mixer Gemmy Industrial Corp., Taipei, Taiwan
Wasserbad, julabo U3 MAGV, Rabenau
2.2. Verbrauchsmaterialien
Polypropylenröhrchen 1,5/2 ml Eppendorf-Netheles-Hinz, Hamburg
Deckgläschen Menzel Gläser, Braunschweig
Falcon® Röhrchen BD Biosciences, Heidelberg
Kanüle 25G BD Biosciences, Heidelberg
Kodak BioMax Röntgenfilm Kodak, Stuttgart
35
Material
Neubauer Zählkammer Braun, Ludwigshafen
Nitrozellulose-Membran AmershamLifeScience, Buckinghamshire,
U.K.
Parafilm “M” AmericanNationalCan™,Chicago, IL, USA
Ponal™ Klebstoff Henkel, Düsseldorf
Sterilfilter Schleicher und Schuell, Düsseldorf
Zellkulturflaschen Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Zellschaber Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
2.3. Chemikalien
Acrylamid-Mix (30% AA,0,8% BisAA) Roth, Karlsruhe
Agarose SeaKem LE® FMC Bioproducts, Biozym, Hameln
Ammoniumacetat (NH4CH3OH) Merck, Darmstadt
Ammoniumpersulfat Merck, Darmstadt
Ampicillin Serva, Heidelberg
Bakto-Hefe-Extrakt Merck, Darmstadt
Borsäure Sigma Aldrich Laborchemikalien, Seelze
Bromphenolblau (BPB) MBI Fermentas, St. Leon Roth
4,2-Diamino-2-phenylindol (DAPI) Serva, Heidelberg
1,4 Diazobicyklo- [2,2,2]-Oktan (DABCO) Sigma Aldrich Laborchemikalien, Seelze
Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck, Darmstadt
Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Merck, Darmstadt
Fluoroprep™ bioMériuex, Nürtingen
Fragmentgrößenstandard „1 kb DNA ladder“ New England Biolabs, Frankfurt a.M.
Fragmentgrößenstandard „Gene Ruler® MBI Fermentas, St. Leon Roth
1 kb DNA ladder“
Glycerin Merck, Darmstadt
Glycin Merck, Darmstadt
Isopropanol Merck, Darmstadt
Ligationspuffer (ATP-haltig) MBI Fermentas, St. Leon Roth
Lipofectamin™ 2000 Gibco/BRL, Karlsruhe
ß-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt
Methanol Merck, Darmstadt
36
Material
Molekulargewichtsmarker Pierce, Rockford, IL, U.S.A.
BlueRanger®Prestained Protein
Molecular Weight Marker Mix
Natriumacetat Merck, Darmstadt
Natriumazid (NaN3) Merck, Darmstadt
Natriumchlorid (NaCl) Merck, Darmstadt
Natriumdodecylsulfat (SDS) Serva, Heidelberg
Natriumhydroxid (NaOH) Merck, Darmstadt
o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid (OPD) Serva, Heidelberg
Paraformaldehyd Merck, Darmstadt
Pefablock SC Roche, Mannheim
Penicillin/Streptomycin-Antibiotikagemisch(100x) Gibco/BRL, Karlsruhe
Pepton (aus Casein pankreatisch verdaut) Merck, Darmstadt
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) Sigma Aldrich Laborchemikalien, Seelze
Polyethylenglycol, PEG 8000 Serva, Heidelberg
Salzsäure (HCl) Merck, Darmstadt
Schwefelsäure (H2SO4) Sigma Aldrich Laborchemikalien, Seelze
SuperSignal® West Dura ED Substrate Pierce, Rockford/IL, USA
TEMED Serva, Heidelberg
TPCK-Trypsin Sigma Aldrich Laborchemikalien, Seelze
TrisBase Sigma Aldrich Laborchemikalien, Seelze
(2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol )
TritonX-100™ Sigma Aldrich Laborchemikalien, Seelze
Trueblue™ Peroxidase Substrat KPL, USA
Tween™ (ICI Americas) Serva, Heidelberg
Wasserstoffperoxid (H2O2) Sigma Aldrich Laborchemikalien, Seelze
X-Galaktose (X-Gal) Serva, Heidelberg
Zeocin™ Invitrogen, Carlsbad, U.S.A.
2.4. Sera
Rinderserumalbumin (BSA) Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen
Fötales Kälberserum (FKS) Gibco/BRL, Karlsruhe
NDS (normal donkey serum) Institut für Virologie, Marburg
NHS (normal horse serum) Institut für Virologie, Marburg
37
Material
2.5. Medien für Zellkulturtechniken
DMEM Gibco/BRL, Karlsruhe
(Dulbecco’s Modified Eagle Medium) + 1% Glutamin
MEM (Minimal Essential Medium) Gibco/BRL, Karlsruhe
OPTI-MEM Gibco/BRL, Karlsruhe
(Optimal Minimal Essential Medium)
2.6. Enzyme
AmpliTaqFS (Fluorescent Sequencing) ABgene, Epsom, U.K.
DNA-Polymerase
Cloned Pfu DNA-Polymerase Stratagene, Heidelberg
PfuTurboTM DNA-Polymerase Stratagene, Heidelberg
PfuTurbo™ 10xPuffer Stratagene, Heidelberg
RNase A Sigma, Deisenhofen
Restriktionsenzym Schnittstelle
EcoRI GAA TCC
NotI GCG GCC GC(G)
DpnI quickchange GM6 ATC
SequenaseTM United States Biochemical, U.S.A.
Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) AmershamLifeScience, Buckinghamshire,
U.K.
Trypsin Life Technologies, Karlsruhe
T4-DNA-Ligase New England Biolabs, Frankfurt a.M.
2.7. Kits
High Pure RNA Isolation Kit Roche Diagnostics, Mannheim
HiSpeed Plasmid Maxi Kit Qiagen, Hilden
OneStep RT-PCR Kit Qiagen, Hilden
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden
QIAprep 8 Miniprep Kit Qiagen, Hilden
38
Material
QuickChange™ Site Directed Mutagenesis Kit Stratagene, Heidelberg
RNA-Isolierungskit Qiagen, Hilden
TOPO®-TA Cloning Kit Invitrogen, Carlsbad, U.S.A.
2.8. Plasmide und Vektoren
2.8.1. pIRESbleo3, Klonierungsvektor
Der Vektor pIRESbleo3 ist ein Klonierungsvektor, der durch die Firma Becton Dickinson
(BD) Biosciences Clontech (Clontech, pIRESbleo3 Vector Information, PT 3643-5) vertrieben
wird. Die in diesem bicistronischen Expressionsvektor vorhandene IRES-Sequenz codiert für
eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES), eine Sequenz, die primär in verschiedenen
Viren nachgewiesen wurde. Diese erlaubt die cap-unabhängige Translation, das heißt, das
Ribosom bindet die mRNA am Startcodon unabhängig von der 5'-wärts gelegenen
unübersetzten Region (Mountford and Smith, 1995). Das bedeutet, dass die IRES-Sequenz
die Expression zweier singulärer Proteine unter einem Promotor von einem mRNA-
Transkript ermöglichen kann.
MCS
Abb.9 .Abb. 1.2 Restriktionskarte und Multiple Cloning Site (MCS) des pIRESbleo (pIRESbleo3 Vector Information BD Biosciences Clontech, PT 3643-5)
39
Material
Der Vektor pIRESbleo3 enthält die interne ribosomale Eintrittsstelle des
Encephalomyocarditis-Virus (ECMV).
Die spezifische Selektion der Kolonien erfolgt durch den Zusatz von Bleomycin, Phleomycin
oder Zeocin™ (2.3.) zum Medium. Nach der Selektion exprimieren fast alle Kolonien stabil
das gesuchte Gen. Das Expressionsniveau der Antibiotikaresistenz für Bleomycin wurde
vermindert, indem das Resistenzgen auf eine weniger optimale Position für durch die IRES-
Sequenz gesteuerten Translationen verschoben wurde. Dadurch wird der Selektionsdruck
durch das Antibiotikum Zeocin™ auf die gesamte Expressions-Kassette verstärkt, und es
resultiert eine Selektion für Zellen, die das gesamte Transkript einschließlich des insertierten
Gens auf einem hohen Niveau exprimieren. Dieser Selektionsdruck garantiert, dass die
Genexpression in der Kultur über lange Zeit konstant bleibt. Solange die Experimente keiner
reinen Zellpopulation bedürfen, können anstelle von Isolation und Charakterisation klonaler
Zelllinien die Zellen gängig verwendet werden, die die Selektion überlebt haben.
Die Expressionskassette von pIRESbleo3 enthält den humanen Cytomegalie-Virus (CMV)
„major immedeate early“ Promotor, der von einer multiple cloning site (MCS) gefolgt ist.
Dieses synthetische Intron verbessert die Stabilität der mRNA. Das ECMV IRES ist gefolgt
von dem Bleomycinresistenz-Gen und dem Polyadenylierungssignal des Virus SV40.
Ribosomen können an der bicistronischen mRNA entweder am 5’-Ende ansetzen, um das
gesuchte Gen zu translatieren, oder an der ECMV IRES für die Translation des
Antibiotikaresistenzmarkers. Für die Selektion von Säugerzellen wird abhängig von der
Zelllinie eine Phleomycin-Konzentration von 40-200 µg/ml empfohlen.
2.8.2. pCAGGS + MCS, Klonierungsvektor
Der eukaryotische Expressionsvektor pCAGGS+MCS wurde freundlicherweise von Dr. Jan
ter Meulen, Institut für Virologie, Marburg, zur Verfügung gestellt und wurde ursprünglich im
Labor von Dr. Miyazaki, Japan entwickelt (Niwa et al., 1991).
Der Vektor enthält einen CAG-Promotor (chicken-β-actin-Promotor), der für eine konstitutive
Expression durch die zelluläre RNA-Polymerase-II sorgt, eine für die β-Globin des
Kaninchens codierende Gensequenz, die ein Polyadenylierungssignal beinhaltet und ein für
die Ampicillinresistenz codierendes Gen. Zusammen mit einem SV40 ori (origin of replication
including an early SV-40 promoter) wurden die Segmente in den pUC13 Vektor eingefügt.
Die multiple cloning site (MCS) enthält Restriktionsstellen für die in dieser Arbeit
verwendeten Restriktionsenzyme EcoRI und NotI (2.6.).
40
Material
MCS
Abb.10 .pCAGGS + MCS (c5)
2.8.3. pCR®2.1-TOPO®-Vektor
Das TOPO® TA Cloning® Kit wurde von der Firma Invitrogen entwickelt, um innerhalb weniger
Minuten PCR-Produkte direkt im Anschluss an die PCR-Reaktion zu klonieren.
Der pCR®2.1-TOPO®-Vektor bindet für die Klonierungsprozesse die T7-Polymerase, eine
Topoisomerase I. Der Vektor besitzt eine multiple cloning site (MCS), enthält 3'-T-Überhänge
für die direkte Ligation taq-amplifizierter PCR-Produkte und einen T7-Promotor für die in vitro
RNA-Transkription und die Sequenzierung. Bindungsstellen für M13-forward und M13-
reverse Primer (2.9.) sind für die Sequenzierung enthalten. Die Insertionsstelle des PCR-
Produktes wird flankiert von EcoRI Schnittstellen, die später eine einfache Exzision des
Inserts ermöglichen. Für die Transformation von Escherichia coli und zur anschließenden
Selektion auf antibiotikahaltigen Nährböden finden sich auf dem Vektor Resistenzgene für
Kanamycin und Ampicillin. Die Agarböden enthalten X-Galaktose (Xgal), die, wird sie von β-
Galaktosidase gespalten, ein blaues Nebenprodukt bildet. Für die β-Galaktosidase codiert
ein LacZ-Gen in der MCS des Vektors. Bei transformierten Bakterien, die Plasmide ohne
Insert exprimieren, kann die β-Galaktosidase X-Galaktose metabolisieren, da das LacZ-Gen
intakt ist. Die angewachsenen Kolonien, die den Vektor mit inseriertem PCR-Produkt
enthalten, können auf den Agarplatten durch die fehlende Färbung von den blauen Nicht-
Rekombinanten unterschieden werden, da das Insert das LacZ-Gen trennt und damit
ausschaltet. Aufgrund der fehlenden β-Galaktosidase sind diese Bakterien nicht mehr in der
Lage, Xgal zu verstoffwechseln und wachsen auf den Nährböden als farblose Kolonien an.
41
pCAGGS+MCS (c5)4754 bps
1000
2000
3000
4000
AccIHincIISalISpeI
BsaAISnaBI
ApaIPspOMI
Bpu1102I
AarI
SgrAI
XbaI
EcoRIXhoIAcc65IKpnISmaIXmaINotIEcl136IISacINheIBglII
Van91I
PstIHindIII
BsaBISfiI
StuIBlnI
PsiIBsmI
SapI
DrdI
AhdIBsaI
FspI
PvuIScaI
XmnISspI
SexAI
Amp-R
Material
Abb.11 .pCR®2.1-TOPO®-Vektor (Invitrogen Produktinformation)
2.9. Oligonukleotide und Sequenzen
Die verschieden Oligonukleotide (Primer) wurden von der Firma MWG Biotech AG,
Ebersberg hergestellt. Diese kurzkettigen Nukleinsäuremoleküle dienen als Startermoleküle
bei allen PCR-Reaktionsvarianten.
HAT-F5’-GCGCAATAATGCGGCCGCGCCACCATGTATAGGCCAGC
ACGTGT-3’
HAT-R5’-CCGATTATGAATTCCTAGATCCCAGTTTGTTGCCTAATCC
-3’
HAT-R415 5’-CATGACAACATCCGCTCTC-3’
HAT-F224 5’-CACCAGCTACACAGGAATAC-3’
HAT-F374 5’-CTGAGGCAAGATGGTAGTGG-3’
42
Material
HAT-F718 5’-CATGTGGATCCTGACAGCAGC-3’
HAT-R752 5’-CCAGACGTGGCAATCCAGTC-3’
HAT-F1094 5’-GAGCCATCTTGTCTGGAATGC-3’
Args-f (forward)5’-CTAATAACATTGTCTGAGCAGCGAAGACGCAGGAGAATC
CTTGGAG GCACTGAG-3’
Args-r (reverse)5’-CTCAGTGCCTCCAAGGATTCTCCTGCGTCTTCGCTGCTC
AGACAAT GTTATTAG-3’
T7 (forward) 5'-GGGATATCACTCAGCATAAT-3'
M13 (reverse) 5'-GTCATAGCTGTTTCCTG-3'
EcoRI-flag-HAT (forward)5'-GAATTCATCGACTACAAGGACGACGATGACAAGTA
G-3'
NotI-flag-HAT (reverse)5'-CGCCGGCGCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTC
GAT-3'
2.10. Antikörper
Erstantikörper:
anti-FLAG polyklonal vom Kaninchen, gegen N-
terminal und C-terminal flag-konjugierte
Proteine
Sigma, St.Louis/Missouri, USA
anti-NP-A monoklonal, von der Maus gegen das
Nukleoprotein von Influenza A
CDC, Atlanta/GA, USA
(freundlicherweise zur
Verfügung gestellt von
Alexander Klimov, Atlanta)
Zweitantikörper:
Peroxidase konjugiertes Anti-Maus-IgG vom Schaf DAKO, Hamburg
Peroxidase konjugiertes Anti-Maus-IgG vom Kaninchen DAKO, Hamburg
Peroxidase konjugiertes Anti-Kaninchen-IgG vom Esel DAKO, Hamburg
Peroxidase konjugiertes Anti-Kaninchen IgG von der Ziege DAKO, Hamburg
FITC-konjugiertes Anti-Kaninchen-IgG vom Schwein DAKO, Hamburg
43
Material
2.11. Eukaryotische Zellen
Madin-Darby Canine
Kidney(MDCK)-Zellen
Nierenzelllinie vom Hund Frederic Hayden,
Charlottesville, Virginia, USA
293T-Zellen humane, embryonale Nierenzelllinie
mit genom-integriertem großen T-
Antigen des Virus SV40
American Type Culture
Collection, Rockville, MD, USA
A549-Zellen humane Tumorzellen aus einem
Adenokarzinom der Lunge
American Type Culture
Collection, Rockville, MD, USA
NHBE-Zellen Normale humane
Bronchialepithelzellen
Clonetics BioWhittaker,
Taufkirchen
2.12. Influenzavirusstämme
H2N9: Mallard/Alberta/205/98
H1N1: A/Memphis/14/96
H3N2: A/Aichi/2/68
2.13. Bakterienstämme
Die bei den Arbeiten verwendeten Escherichia coli Stämme sind sämtlich Derivate des 1922
in Stanford/Kalifornien isolierten, anerkannten Sicherheitsstammes Escherichia coli K12.
Stamm Genotyp Hersteller
XL-I Blue K12 recA1 lac endA1 gyrA96 thi-1
hsdR17 supE44 relA1 (F’ proAB
lacIq lacZ dm15 Tn10 (Tetr)Amy
Camr )
Stratagene®, Heidelberg
XL-10-Gold
Ultracompetent Cells
for Large and Ligated
DNA
Tetr ∆(mcrA)183 ∆(mcrCB-
hsdSMR-mrr)173 end A1 supE44
thi-1 recA1 lac Hte (F’ proAB
lac1qZ∆M15 Tn10 (Tetr) Amy Camr2
Stratagene®, Heidelberg
2 Chloramphenicolresistenz bei Konzentrationen < 40 µg/ml, jedoch sensitiv bei Konzentrationen von 100 µg/ml
44
Methoden
3. Methoden
3.1. Molekularbiologische Methoden
Soweit nicht anders angegeben, entsprechen die in der Arbeit angewendeten
molekularbiologischen Methoden den Standardverfahren (Sambrook and Russel, 2001).
Die Verfahren mit den Produkten der Firma Qiagen erfolgten nach Angaben des Herstellers.
3.1.1. Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien im kleinen Maßstab (Minipräparation)
Für die Isolierung von bis zu 20 µg Plasmid-DNA wurden das QIAprep Spin Miniprep Kit und
QIAprep 8 Miniprep Kit (2.7.) verwendet. Mit letzterem können mittels Vakuumapplikation bis
zu 48 Plasmid-DNA-Proben parallel aufgereinigt werden.
Das Prinzip der Kits besteht in der Kombination einer modifizierten alkalischen Lyse der
Bakterienzellen (Birnboim and Doly, 1979) mit anschließender reversibler Adsorption der
Plasmid-DNA bei hoher Salzkonzentration an eine Silica-Matrix. Durch Zugabe von SDS
(Natriumdodecylsulfat) werden zelluläre Proteine in löslicher Form erhalten und von der
Matrix entfernt.
Es werden 1,5 ml einer Escherichia coli-Übernachtskultur in ein Eppendorfgefäß überführt
und 1 - 2 min bei 13.000 rpm abzentrifugiert. Das Bakterienzellsediment wird in 250 µl
gekühlter Lösung P1 (Sambrock & Russel, 2001) möglichst homogen resuspendiert.
Lösung P1
50 mM Tris-HCl (pH 8,0)
10 mM EDTA
100 µg/ml RNase A
Danach werden 250 µl der Lösung P2 zugegeben. Der Ansatz wird gut gemischt und für 5
min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Hierbei kommt es zur alkalischen Denaturierung der
DNA.
Lösung P2
0,2 M NaOH
1% SDS
45
Methoden
Um das Natriumhydroxid zu neutralisieren und das Detergenz SDS zu entfernen, werden
500 µl der Lösung N3 zum Ansatz hinzugefügt. Dieser wird gut gemischt, jedoch nicht mit
dem Vortex-Gerät, da dies zum Scheren der chromosomalen DNA führt. Anschließend wird
bei 13.000 rpm für 10 min zentrifugiert, um Zelltrümmer, die denaturierten Proteine und die
chromosomale DNA zu sedimentieren.
Lösung N3
3 M Natriumacetat (pH 4,8)
Der Überstand, in dem sich die Plasmid DNA befindet, wird dann auf eine Säule gegeben
und mittels Zentrifugalkraft oder mit Hilfe eines Vakuums durch das Säulenmaterial gedrückt.
Die Plasmid-DNA bindet dabei aufgrund ihrer negativen Ladung an das Säulenmaterial,
während die ungebundenen RNA- und Proteinrückstände je nach Verfahrensweise durch
ein- bis zweimaliges Waschen der Säule mit 0,75 - 1 ml QC-Waschpuffer entfernt werden.
Puffer QC
0,1 M NaCl
0,05 M MOPS (pH 7,0)
15% Ethanol
Die an das Säulenmaterial gebundene Plasmid-DNA wird hernach durch die Zugabe von 30
- 100 µl Elutionspuffer (EB oder TE) eluiert, wobei zu beachten ist, dass EDTA nachfolgende
enzymatische Reaktionen unter Umständen beeinflussen kann.
Puffer EB
10 mM Tris-HCl (pH 8,5)
Puffer TE
10 mM Tris-HCl
1 mM EDTA (pH 8,0)
3.1.2. Isolierung von Plasmid-DNA im großen Maßstab (Maxipräparation)
Für die Gewinnung großer DNA-Mengen (250 µg – 500 µg) wurde das QIAfilterTM Plasmid
Maxi Kit (2.7.) verwendet. Diese Methode ermöglicht die Aufarbeitung größerer Mengen an
Zellen mit einer hohen Ausbeute an hochreiner DNA.
46
Methoden
Das Prinzip basiert ― wie auch bei der Minipräparation ― auf einer modifizierten alkalischen
Lyse mit anschließender Bindung und Reinigung der Plasmid-DNA über eine
Anionenaustauschersäule und Fällung der DNA durch Isopropanol (Hochsalzmethode).
100 ml der Bakterienkulturen werden bei 4 °C 15 min bei 6.000 rpm (Beckmann JA-10 Rotor,
2.1.) abzentrifugiert. Das entstehende Sediment wird in 10 ml gekühlter Lösung P1 (3.1.1.)
möglichst homogen suspendiert. Danach werden 10 ml Lösung P2 (3.1.1.) zugegeben. Der
gut gemischte Ansatz wird für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Um das Natriumhydroxid und das Detergenz SDS zu entfernen, werden 10 ml Lösung P3 zu
dem Ansatz gegeben, dieser wird gut gemischt und sofort in eine QIAfilter©-Spritze überführt.
Lösung P3
3 M Kaliumacetat (pH 5,5)
Nach einer zehnminütigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur wird der Kolben in die
Spritze eingeführt und das Lysat mechanisch auf eine zuvor bereits mit 10 ml QBT-Puffer
äquibrilierte Qiagen® Tipp 500-Säule gedrückt.
Puffer QBT
0,75 M NaCl
0,05 M MOPS (pH 7,0)
15% Ethanol
0,15% Triton X-100TM (2.2.)
Die Plasmid-DNA bindet aufgrund ihrer negativen Ladung an das Säulenmaterial, während
die ungebundenen RNA- und Proteinrückstände durch zweimaliges Waschen der Säule mit
30 ml QC-Waschpuffer (3.1.1.) entfernt werden. Die an das Säulenmaterial gebundene
Plasmid-DNA wird nun durch die Zugabe von 15 ml Elutionspuffer QF eluiert.
Elutionspuffer QF
1,25 M NaCl
0,05 M Tris-HCl (pH 8,5)
15% Ethanol
Das Eluat wird mit 0,7 Volumina (10,5 ml) Isopropanol versetzt. Es erfolgt die Präzipitation
der Plasmid-DNA, die nach einer dreißigminütigen Zentrifugation bei 15.000 rpm
47
Methoden
sedimentiert. Das Sediment wird mit 5 ml 70%igem Ethanol gewaschen und an der Luft oder
im Vakuum getrocknet. Anschließend wird das Sediment in eine entsprechende Menge
Puffer EB (3.1.1.) aufgenommen.
3.1.3. RNase-Behandlung
In manchen Fällen können vorhandene RNA-Moleküle in einer DNA-Lösung nach erfolgter
Präparation störend sein. Durch fünfminütige Inkubation mit 100 µg/ml RNase A werden
selbst größere Mengen an RNA degradiert.
10 mg RNase A werden in 1 ml 10 mM Tris-HCl und 15 mM NaCl gelöst und durch 15 min
bei 100 °C von DNase befreit.
3.1.4. Quantifizierung von Nukleinsäuren
Da DNA ultraviolettes Licht absorbiert, kann man durch die Messung der Extinktion (E) bei
einer Wellenlänge von 260 nm die Konzentration von DNA in wässriger Lösung bestimmen.
Bei dieser photometrischen Konzentrationsbestimmung erfolgt die Messung gegen den
Blindwert von aqua bidest. im Photometer. Es wurde eine Quarzküvette (2.1.) mit 500 µl
Füllvolumen und 1 cm Lichtweg verwendet. Um den linearen Messbereich von 0,01 – 0,8
einzuhalten, wurde die DNA-Lösung in aqua bidest. entsprechend verdünnt
(Verdünnungsfaktor 1:50 – 1:200). Auch Proteine absorbieren Licht bei einer Wellenlänge
von 260 nm. Ihr Absorptionsmaximum liegt jedoch bei 280 nm. Daher können bei einer
Wellenlänge von 280 nm Verunreinigungen durch Proteine gemessen und zur Überprüfung
der Reinheit der DNA dann das Verhältnis O.D.260nm/O.D.280nm ermittelt werden. Bei
O.D.260nm/O.D.280nm von 1,8 oder mehr kann die DNA als rein bezeichnet werden.
Einer ∆E260nm von 1 entsprechen näherungsweise Konzentrationen von 50 µg/ml für
Einzelstrang-DNA und 20 µg/ml für Oligonukleotide.
3.1.5. RNA-Isolierung aus eukaryotischen Zellen
Zur Amplifikation von Genfragmenten via RT-PCR wurde RNA aus Bronchialepithelzellen
bzw. den MDCK-Zellen (2.11.) der stabilen Zelllinien gewonnen. Sie wurde mit Hilfe des High
Pure RNA Isolation Kits (2.7.) isoliert.
Die am Vortag passagierten und zu einem subkonfluenten Monolayer herangewachsenen
Zellen werden zweimal mit PBS gewaschen und anschließend mit einem Zellschaber vom
Boden der Zellkulturflasche abgelöst. Die 106 -107 Zellen werden in PBS aufgenommen und
48
Methoden
abzentrifugiert. Das Pellet wird in 200 µl PBS resuspendiert und mit 400 µl Lysepuffer
versetzt, um die Zellen aufzulösen.
PBS (phosphat buffered saline)
137 mM NaCl
2,7 mM KCl
80,9 mM KH2PO4
HCl-Zugabe, bis pH 7,4
Lyse-Puffer
4,5 M Guanidiumchlorid
50 mM Tris-HCl
30% Triton-X-100™ (w/v), pH 6,6
Das Zellysat wird auf ein High Pure Filter Röhrchen gegeben und für 15 sec bei 10.000 rpm
zentrifugiert. Hierbei erfolgt die Bindung der RNA an ein Glasvlies. Pro Probe werden 90 µl
DNase-Puffer mit 10 µl lyophilisierter DNase (≈18.000 U/ml) gemischt, auf das Glas-Filter-
Vlies pipettiert und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert.
DNase-Puffer
1 M NaCl
20 mM Tris-HCl
10 mM MnCl2 (pH 7,5)
Anschließend wird die Säule mit 500 µl Waschpuffer I gewaschen und für 15 sec bei 15.000
rpm zentrifugiert. Die folgenden zwei Waschschritte werden mit Waschpuffer II durchgeführt,
zuerst mit 500 µl für 15 sec bei 15.000 rpm und dann mit 200 µl für 2 min bei 20.000 rpm.
Waschpuffer I
5 M Guanidiumchlorid
20 mM Tris-HCl (pH 6,6)
38% Ethanol
49
Methoden
Waschpuffer II
20 mM NaCl
2 mM Tris-HCl (pH 7,5)
80% Ethanol
Anschließend wird die Säule in ein autoklaviertes 1,5 ml Eppendorf-Gefäß (2.2.) überführt
und die RNA mit 50 - 100 µl Elutionspuffer oder nukleasefreiem bidestilliertem Wasser
eluiert. Die Menge der auf diese Weise gewonnenen Gesamt-RNA beträgt ca. 15 µg.
3.1.6. Überprüfung von Sequenzen mittels Integration in den pCR®2.1-TOPO®-Vektor
Um die Sequenz des für ein Protein codierenden Gens in stabil transfizierten Zellen zu
überprüfen, wird zunächst die mRNA aus den Zellen gewonnen (3.1.5.), die durch eine
anschließende RT-PCR (3.1.9.) in DNA umgeschrieben und anschließend aufgereinigt wird.
Für die Sequenzierung wurde in dieser Arbeit das HTP TOPO®TA Cloning Kit der Firma
Invitrogen gemäß Herstellerangaben verwendet. Die Sequenzierung läuft über den pCR®2.1-
TOPO-Vector, in den das PCR-Produkt integriert wird. Für diese Ligationsreaktion wird keine
Ligase benötigt, weil die Topoisomerase I kovalent an die Enden des linearisierten Vektors
gebunden ist und die Vektorenden vor dem Verdau durch Exonukleasen schützt. Dadurch
wird die Einheit des Vektors gewährleistet. Der Zusatz von Ligase zum Reaktionsansatz
kann die korrekte Sequenz modifizieren, denn häufig enthält sie Nukleasen, die DNA
scheren können. Da in diesem Ansatz nur zwei Moleküle, das PCR-Produkt und der Vektor,
für die Ligation interagieren müssen, ist eine schnellere und effizientere Reaktion möglich.
Das PCR-Produkt wird nun durch die Ligationsreaktion in den pCR®2.1-TOPO®-Vektor
integriert. Dafür wird der Ansatz, bestehend aus dem TOPO®-Vektor und der DNA in H2O für
zwei Stunden bei 22 °C inkubiert. Anschließend werden kompetente Escherichia coli-Zellen
mittels Elektroporation (3.1.20.4.) transformiert und für 1 h bei 37 °C in LB-Medium inkubiert.
Danach erfolgt das Ausplattieren auf Kanamycin-haltige Agarplatten, die mit je 40 µl X-
Galaktose (2.3.) und IPT6 vorbehandelt wurden. Diese Zusätze führen aufgrund der
spezifischen Eigenschaften des Vektors (2.8.3.) dazu, dass die blau gefärbten Kolonien, die
mit Plasmiden ohne integriertes PCR-Produkt transformiert sind, von den ungefärbten
Kolonien, die das Plasmid mit korrekt integrierter Gensequenz besitzen, zu unterscheiden
sind.
50
Methoden
Es folgen die übliche DNA-Amplifizierung mittels Minipräparation und die weitere
Aufbereitung der DNA für die Sequenzierung. Für die Sequenzierungs-PCR-Reaktion
(3.1.17.) werden zwei Startermoleküle eingesetzt: M13 (forward-primer) und T7 (reverse
primer) (2.9.). Sie hybridisieren in entgegengesetzten Richtungen mit der Vektor-DNA, so
dass sie nicht nur einen Abschnitt eingrenzen, sondern der ganze Vektor durch die
Polymerase vervielfältigt werden kann. Bei einer Insert-DNA mit einer Größe über 500 bp ist
es empfehlenswert, einen weiteren Primer zuzusetzen, der im Mittelteil des eingefügeten
DNA-Abschnitts hybridisieren kann, um eine vollständige Polymerisierung des gesamten
Plasmids zu gewährleisten. Der anschließenden DNA-Präzipitation (3.1.10.) folgen die
automatische DNA-Sequenzierung und die Analyse der Sequenz (3.1.17.2.).
3.1.7. Polymerasekettenreaktion (PCR) und rekombinate PCR
Die PCR (polymerase chain reaction) nach Mullis und Faloona (Mullis and Faloona, 1987;
Saiki et al., 1988) erlaubt die spezifische exponentielle Amplifikation von
Nukleinsäurebereichen definierter Länge und Sequenz mit Hilfe zweier sequenzspezifischer
Oligonukleotide (Primer). Die synthetischen Oligonukleotide dienen als Startermoleküle,
deren Sequenz circa 20 bis 30 Nukleotide lang und jeweils zu einem der beiden DNA-
Stränge komplementär ist. Eines der Oligonukleotide hybridisiert parallel mit dem
codogenen, das zweite antiparallel mit dem nicht-codogenen DNA-Strang, wodurch der zu
amplifizierende Abschnitt eingegrenzt wird. Durch Hybridisierung der Starter-Oligonukleotide
kommt es somit zur Doppelstrangbildung in dem komplementären Bereich, der als Startpunkt
für die DNA-Polymerase dient. Die Reaktion wird durch eine thermostabile DNA-Polymerase
(2.6.) katalysiert, so dass die zyklische Abfolge der einzelnen Schritte bei der jeweils
optimalen Temperatur erfolgen kann. Die gewählten Polymerasen wurden aus hitzestabilen
Bakterien isoliert und sind in der Lage, bei hohen Temperaturen über 70 °C zu arbeiten und
sind selbst bei 95 °C für kurze Zeit stabil. Ihre Funktion besteht darin, in Anwesenheit eines
Nukleotidgemisches (dNTPs) und der Primer einen einzelsträngigen DNA-Bereich zum
Doppelstrang zu polymerisieren. Jede PCR besteht aus mehreren identischen Zyklen. Die
Schritte eines einzelnen Zyklus sind primär die Denaturierung der DNA-Stränge, es folgt die
Hybridisierung der Oligonukleotide mit der DNA-Matrize und schließlich die Verlängerung der
Polynukleotidkette. Nach jedem Zyklus kommt es zur Verdoppelung der DNA und damit zu
einer exponentiellen selektiven Anreicherung des durch die Oligonukleotide begrenzten
DNA-Bereichs. Mit Hilfe der PCR können auch gezielt Mutationen eingefügt werden, indem
51
Methoden
die ausgewählten Primer neben komplementären Bereichen auch eine veränderte Sequenz,
z.B. eine Schnittstelle besitzen (QuickChange-Methode, 3.1.8.).
Die Reaktion wird in 200 µl Reaktionsgefäßen im GeneAmp PCR System 2400 (2.1.)
durchgeführt. Die doppelsträngige DNA-Matrize wird 5 min bei 95 °C denaturiert, dann folgt
25 - 35 mal der Reaktionszyklus: Denaturierung bei 95 °C für 30 - 60 sec, Hybridisierung für
30 - 60 sec und Amplifikation der DNA-Abschnitte bei 68 - 72 °C für näherungsweise 1 min
pro 1000 Nukleotide. Eine abschließende zehnminütige Inkubation bei 72 °C soll
gewährleisten, dass die Amplifikate vervollständigt werden, bevor die Reaktion beendet und
das Reaktionsgefäß auf 4 °C abgekühlt wird. Die Hybridisierungstemperatur richtet sich nach
der Schmelztemperatur der Oligonukleotide, die sich nach der Formel
Tm(°C)= 2°C x (A+T) + 4°C x (G+C)
berechnet. Dabei werden nur bindende Nukleotide berücksichtigt. Bei dieser Temperatur
liegt die eine Hälfte der Nukleinsäuremoleküle in einer Lösung in doppelsträngiger Form, die
andere in einzelsträngiger Form vor.
Die Hybridisierungstemperatur wird so gewählt, dass sie etwa 5 °C unter der Tm der Primer
liegt.
Der Erfolg einer PCR-Reaktion ist abhängig von der Konzentration der eingesetzten
Komponenten und den Reaktionsbedingungen wie Temperaturen und Zeiten. Die
Komponenten der Reaktionssätze mit einem Gesamtvolumen von 50 µl sind nach Angaben
des Herstellers zusammengesetzt.
Reaktionsansatz (50µl)
Komponenten Menge
DNA-Matrize (dsDNA) ≈ 100 ng
Startermolekül (Oligonukleotid) #1 250 ng
Startermolekül (Oligonukleotid) #2 250 ng
Nukleotidgemisch (dNTPs) 400 µmol
DNA-Polymerase-Puffer (10x) 5 µl (1x)
DNA-Polymerase 1 – 5 Einheiten
aqua dest. auf 50 µl auffüllen
52
Methoden
Bei diesem Ansatz gilt, dass eine Einheit der Polymerase den Umbau von 10 nM
Desoxyribonukleosid-Triphosphaten bei 74 °C innerhalb von 30 min in ein säureunlösliches
DNA-Produkt katalysiert. Um Sekundärstrukturen zu vermeiden, können jeweils 5 µl Q-
Solution® zugesetzt werden. Dieses Produkt von Qiagen ist zur Optimierung der Reaktion
gedacht, seine Zusammensetzung wird von der Firma nicht angegeben. Es verändert den
Schmelzpunkt der DNA, dient insbesondere zur Auflösung starker G/C-Bindungen und
eliminiert unspezifische PCR-Produkte. Zur anschließenden Analyse der Reaktion wurde 1 µl
des Ansatzes für eine Agarosegelelektrophorese verwendet (3.1.12.). Eine Reiningung über
das QIAquick PCR Purification Kit bzw. eine Fällung mittels Ethanol oder 89/11-Reagens
(3.1.10.) zum Entfernen von Salzen restlichen Nukleotiden und Enzymen, ging der weiteren
Verwendung der PCR-Amplifikate voraus.
3.1.8. QuickChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit
Mit dem von der Firma Stratagene® entwickelten Kit (2.7.) lassen sich Punktmutationen,
Deletionen und Insertionen von einer oder mehreren Aminosäuren in eine beliebige
supercoiled dsDNA einfügen. Dabei wird die Differenzierungsmöglichkeit aufgrund des
unterschiedlichen Methylierungszustandes von PCR-Amplifikaten und Ausgangs-DNA
ausgenutzt. Das Restriktionsenzym DpnI (10 U/µl) (2.6.) wird dabei am Ende der PCR zu
dem Ansatz hinzupipettiert und für 1 h bei 37 °C inkubiert. In dieser Zeit verdaut das Enzym
die methylierte Ausgangs-DNA, während es die neu synthetisierte, nicht-methylierte DNA
nicht umsetzt.
Reaktionsansatz (50µl)
Komponenten Menge
DNA-Matrize 10 ng
Startermolekül (Oligonukleotid) #1 125 ng
Startermolekül (Oligonukleotid) #2 125 ng
Nukleotidgemisch (dNTPs) 25 mM je dNTP
Reaktionspuffer 10x 5 µl
PfuTurbo™ DNA Polymerase 2,5 U (1 µl)
aqua dest. auf 50 µl auffüllen
DpnI (wird nach dem Thermal Cyler
Programm zugegeben)
10 U (1 µl)
53
Methoden
Nach der Aufreinigung erfolgt dann die Transformation von Bakterien mit Plasmiden
(3.1.20.), welche ausschließlich die eingeführte Mutation tragen sollen.
3.1.9. Reverse Transkription und Polymerasekettenreaktion (RT-PCR)
Um DNA-Abschnitte von aus Zellen gewonnener mRNA zu amplifizieren, wurde das One-
Step RT-PCR Kit (2.7.) verwendet. Mit Hilfe der reversen Transkriptase kann die RNA-
Matrize in cDNA umgeschrieben werden Zunächst wird eine reverse Transkriptions-Reaktion
von Gesamt-RNA, viraler RNA (vRNA) oder messenger-RNA (mRNA) mit einem Oligo-dT-
Molekül oder auch mit einem spezifischen internen Startermolekül durchgeführt.
Reaktionsansatz (50 µ l):
Komponenten Menge
RNA-Matrize 1 pg – 2 µg
Startermolekül (Oligonukleotid) #1 0,6 µM
Startermolekül (Oligonukleotid) #2 0,6 µM
Nukleotidgemisch (dNTPs) [40 mM] 400 µM je dNTP
5x QIAGEN OneStep RT-PCR Puffer 10 µl
QIAGEN OneStep RT-PCR Enzym Mix 2 µl
RNase Inhibitor [40 U/µl] 5 – 10 U
RNase-freies H2O auf 50 µl auffüllen
OneStep RT-PCR Enzyme-Mix
1 mM DTT
0,1 mM EDTA
0,5% (v/v) Nonidet® P-40
0,5% (v/v) Tween® 20
50% Glycerin (v/v), pH 9,0
Omniscript™ Reverse Transkriptase
Sensiscript™ Reverse Transkriptase
HotStart Taq® DNA Polymerase (2.6.)
54
Methoden
OneStep RT-PCR 5xPuffer
Tris-Cl
KCl
(NH4)2SO4
12, 5 mM MgCl2DTT (pH 7,8)
Der eigentlichen PCR geht eine reverse Transkription von RNA in cDNA voraus, dabei wird
der Reaktionsansatz für 30 min bei 50 °C inkubiert. Bei dem folgenden PCR-
Aktivierungsschritt wird die Temperatur für 15 min auf 95 °C erhöht. Dadurch wird die
HotStartTaq DNA-Polymerase aktiviert, Omniscript und Sensiscript Reverse Transkriptase
werden inaktiviert und die cDNA wird denaturiert.
Es folgen 25 – 40 Zyklen mit der Denaturierung bei 94 °C für 30 – 60 sec, der Hybridisierung
bei 50 – 68 °C für 30 – 60 sec und der Kettenverlängerung bei 72 °C für 1 min/kb. Auch hier
dient eine abschließende zehnminütige Inkubation bei 72 °C dem Abschluss der
Kettenverlängerung, bevor der Ansatz auf 4 °C heruntergekühlt wird.
3.1.10. Aufreinigung von Desoxyribonukleinsäure (DNA) -Molekülen
Bei den unterschiedlichen Reinigungsmethoden macht man sich chemische Eigenschaften
der DNA zunutze. DNA ist gut wasserlöslich, löst sich jedoch kaum in organischen
Lösungsmitteln.
3.1.10.1. Aufreinigung mittels QIAquickTM PCR Purification Kit
Ansätze aus Restriktions-, Dephosphorylierungs- oder PCR-Reaktionen werden vor der
weiteren Verwendung mittels QIAquickTM PCR Purification Kit der Firma Qiagen gereinigt, um
nachfolgende enzymatische Reaktionen nicht zu beeinträchtigen. Verunreinigungen wie
Primer, Oligonukleotide, Enzyme, Proteine und ungeeignetes Puffermilieu können auf diese
Weise entfernt werden. Zugrundeliegendes Prinzip ist die selektive und reversible Bindung
der DNA an eine Silicagel-Membran bei hohen Salzkonzentrationen und definiertem pH-
Wert.
Hierfür wird der Ansatz mit dem fünffachen Volumen an PB-Puffer versetzt, gut gemischt und
auf die QIAquickTM-Säule gegeben. Zur Zusammensetzung des Puffers PB macht der
Hersteller keine Angaben. Es folgt die selektive Bindung der amplifizierten DNA an das
55
Methoden
Säulenmaterial, dNTPs können dann durch einmaliges Waschen mit 750 ml PE-Puffer
(3.1.14.) entfernt werden.
Die so gereinigte DNA wurde mit 20 – 50 µl aqua bidest. oder 30 – 50 µl Puffer EB (3.1.1.)
eluiert.
3.1.10.2. Alkoholfällung
Diese Methode wird durchgeführt, um die Konzentration einer DNA-Lösung zu verändern
oder störende anorganische Ionen zu beseitigen. Die DNA-Moleküle überschreiten dabei in
wässrigen Lösungen mit einer hohen Konzentration einwertiger Kationen ihr
Löslichkeitsprodukt, wenn entsprechende Volumina an Ethanol oder Isopropanol zugegeben
werden.
Fällungsansatz
DNA-Lösung
1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5,2) 4 °C
2 bis 3 Volumina Ethanol 96% (1 Volumen Isopropanol) -20 °C
Der Ansatz wird gut gemischt und 30 min auf Trockeneis inkubiert. Durch eine
anschließende Zentrifugation für 30 min bei 13 000 rpm und 4 °C wird die Plasmid-DNA
sedimentiert. Der Überstand wird abgenommen. Um die Reste des eingesetzten
Natriumacetats zu beseitigen, wird die Plasmid-DNA nach der Fällung noch einmal mit 1 ml
70%igem Ethanol bei 13 000 rpm und 4 °C für 10 min gewaschen. Der Überstand wird
abgenommen, die pelletierte DNA getrocknet und in 1 ml TBE Puffer (3.1.12.) oder in 20 µl
aqua dest. aufgenommen.
3.1.10.3. Fällung mittels „89/11“-Reagens
Nach der Extraktion aus dem Gel kann mittels dieser Methode DNA weiter aufgereinigt
werden. Der Reaktionsansatz besteht aus der zu fällenden DNA in H2O, der das dreifache
Volumen an 89/11-Reagens zugefügt wird.
89/11
89% Ethanol
11% NH4OAc
56
Methoden
Der Ansatz wird für 30 min bei 13.000 rpm und RT zentrifugiert und das Pellet mit 70%
Ethanol gewaschen. Bei diesem Waschschritt wird die Probe für weitere 30 min bei 13.000
rpm zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und die DNA getrocknet. Anschließend kann
die gereinigte DNA in 10 - 20 µl H2O aufgenommen werden.
3.1.11. Verdau von Doppelstrang-DNA mit Restriktionsendonukleasen
Die für diese Arbeit eingesetzten Restriktionsendonukleasen gehören dem Typ II an und
wurden in 30 Einheiten pro Reaktion gemäß Herstellerangaben verwendet. Sie erkennen 4 -
8 bp lange, meist palindromische Sequenzen. Innerhalb dieser Sequenzen bzw. in einem
definierten Abstand zu ihnen schneiden die Restriktionsendonukleasen den DNA-
Doppelstrang unter Hydrolyse je einer Phosphodiesterbindung pro Einzelstrang. Danach
tragen die 3’-Enden des DNA-Moleküls eine Hydroxyl- und die 5’-Enden eine
Phosphatgruppe. Enzymspezifisch entstehen dabei entweder glatte (blunt ends) oder 3’-
bzw. 5’-überstehende Molekülenden (sticky ends).
3.1.11.1. Analytische Restriktion doppelsträngiger DNA
Für die Charakterisierung von Einzelklonen nach einer Transformation dient dieses
Verfahren der DNA-Spaltung. Die dabei eingesetzte Plasmid-DNA (ca. 100 ng/µl) wird durch
Minipräparation gewonnen. Für einen analytischen Verdau werden 0,2 – 1 µg Plasmid-DNA
benötigt. Die erforderlichen Spaltungspuffer stellt der Hersteller zusammen mit dem
gelieferten Enzym zur Verfügung.
Der Spaltungsansatz setzt sich zusammen aus DNA-Lösung, dem Restriktionspuffer und der
entsprechenden Restriktionsendonuklease und wird mit aqua dest. auf das gewünschte
Volumen ergänzt. Der Restriktionsverdau läuft bei 37 °C für 0,5 – 2 h ab. Zur Analyse
werden die Fragmente im Agarosegel parallel zu einem Längenstandard elektrophoretisch
aufgetrennt (3.1.12.). Mit Ethidiumbromid (2.3.) werden die DNA-Banden sichtbar gemacht
(3.1.13).
3.1.11.2. Präparative Restriktion doppelsträngiger DNA
Die für Ligationsansätze zum Zweck der Klonierung benötigten definierten DNA-Fragmente
werden in größeren Mengen gebraucht. Für deren Gewinnung werden 5 – 20 µg DNA
benötigt. In dem Volumen von 20 - 30 µl sind außerdem 30 Einheiten der
Restriktionsendonukleasen enthalten. Jeweils 1/10 des Gesamtvolumens wird durch den
57
Methoden
entsprechenden 10x Restriktionspuffer gebildet. Die Proben werden zwischen 60 und 120
min bei 37 °C inkubiert.
Die Reaktion läuft bei der für das Enzym optimalen Temperatur ab. Hierbei ist die
vollständige Spaltung des Fragments sehr wichtig, weswegen die Reaktion über mehrere
Stunden inkubiert wird. Bei einer Doppelspaltung wird dem Ansatz zuerst ein Enzym
zugegeben. Nach mehreren Stunden wird ein Aliquot auf ein entsprechendes Gel
aufgetragen. Lässt sich hier die Spaltung nachweisen, wird das zweite Enzym hinzugefügt.
Spaltet das zweite Enzym nicht im Spaltungspuffer, ist ein anderer Puffer höherer
Salzkonzentration zuzugeben. Ist dies nicht möglich, ist zuvor eine Alkoholfällung (3.1.10.2.)
erforderlich.
3.1.12. Elektrische Auftrennung von DNA-Fragmenten in der Agarosegelelektrophorese
Die Agarosegelelektrophorese dient der analytischen Auftrennung zur Größenbestimmung
und Mengenabschätzung und der präparativen Gewinnung von DNA-Fragmenten. Die
negativ geladenen DNA-Fragmente wandern zur Anode eines elektrischen Feldes, wobei die
Wanderungsgeschwindigkeit innerhalb bestimmter Molmassenbereiche umgekehrt
proportional zum Logarithmus der Masse und somit auch der Menge ist.
Um DNA-Fragmente zu trennen, die größer als 200 bp sind, werden Agarosegele verwendet,
die Konzentrationen zwischen 0,4 % und 2% aufweisen.
Die Agarose (2.3.) wird in gewünschter Konzentration in 1x TBE-Puffer gelöst und in einem
Mikrowellengerät bis zum vollständigen Lösen der Agarose aufgekocht. Die Lösung wird
anschließend in eine abgedichtete Flachgelkammer aus Plexiglas gegossen. Ein
eingesetzter Kamm erzeugt die zu beladenden Geltaschen. Die DNA-Proben werden mit 1/6
Volumen 6x Ladepuffer und aqua dest. auf das gewünschte Volumen gebracht und in die
Geltaschen geladen. Zur Analyse von Größe und Konzentration der eingesetzten DNA
reichen geringe Mengen der DNA-Proben aus (0,5 – 1 µl). Die Größe der Fragmente und der
eingesetzten DNA-Mengen werden im Vergleich zum DNA-Fragmentgrößenstandard 1 kb
DNA Ladder (2.3.) mit Fragmenten definierter Größe geschätzt.
Die Elektrophorese läuft horizontal bei einer konstanten Spannung von 80 – 140 V ab, je
nach Gelgröße bzw. Elektrodenabstand in 1x TBE als Laufpuffer.
58
Methoden
TBE-Puffer (1l)
108 g Trisbase
55 g Borsäure
4 ml EDTA (0,5M; pH 8,0)
ad aqua dest.
Ladepuffer (6x)
60% (v/v) Glycerin
60 mM EDTA
0,009 % (w/v) BPB
0,009% Xylencyanol FF
3.1.13. Anfärbung und Photographieren der Gele
Zur Darstellung und Dokumentation der DNA-Fragmente wurden die Gele nach Beendigung
des Gellaufs aus den Kammern genommen und 2 - 5 min in einem Ethidiumbromid-
Tauchbad (50 µl EtBr-Stammlösung (1000x)) gefärbt. Ethidiumbromid interkaliert in die
Doppelstrang-DNA und fluoresziert unter UV-Licht bei einer Wellenlänge von λ = 302 nm.
Eine anschließende Entfärbung in Wasser für 5 min bereinigt entstandene
Ethidiumbromidflecken auf dem Gel. Die DNA-Fragmente werden unter UV-Licht sichtbar
und können so photographiert werden. Die Größenbestimmung erfolgt anhand des
Vergleichs mit dem verwendeten Fragmentgrößenstandard (2.3.).
3.1.14. Isolierung von DNA aus Agarosegelen
Definierte DNA-Fragmente nach präparativem Verdau (3.1.11.2.) und Auftrennung in der
Agarosegelelektrophorese wurden mit dem QIAquickTM Gel Extraction Kit (2.7.) eluiert.
Mit diesem Verfahren lassen sich die aus Agarosegelen ausgeschnittenen DNA-Fragmente
(70 - 10.000 bp) reinigen. Das Ausschneiden der gewünschten DNA-Banden erfolgt unter
längerwelliger Beleuchtung (> 302 nm), um DNA-Verluste oder -Defekte zu vermeiden.
Darüber hinaus können die DNA-Banden durch Aluminium-Folie geschützt werden. Die
zunächst zerkleinerten Gelstücke werden in ein oder mehrere Eppendorfgefäße überführt,
mit 3 Volumina (w/v) Puffer QG (Zusammensetzung von der Firma Qiagen nicht angegeben)
versetzt und bei 50 °C inkubiert. Je nach Dicke und Menge der Agarose-Stücke dauert es 5
bis 10 min bis zu ihrer Aufschmelzung, nach der die DNA in Lösung vorliegt. Für DNA-
Fragmente < 500 bp und > 4 kb wird 1 Gelvolumen Isopropanol hinzugegeben. Danach wird
die DNA-Lösung auf eine QIAquickTM-Säule gebracht und 1 min bei 13.000 rpm zentrifugiert.
59
Methoden
Um die nun gebundene DNA zu waschen, werden 0,75 ml Puffer PE auf die Matrix gegeben.
Es folgen zwei Zentrifugationsschritte bei 13.000 rpm, um alle Reste des Waschpuffers zu
entfernen.
Puffer PE
10 mM Tris-HCl (pH 7,5)
10 mM NaCl
1 mM EDTA
in 70% Ethanol
Die DNA wird anschließend mit 30 - 50 μl Puffer EB eluiert, indem nach Zugabe des Puffers
erneut bei 13.000 rpm für 1 min zentrifugiert wird.
3.1.15. Ligation von DNA-Fragmenten
Für die Ligation linearisierter Plasmid-DNA mit Fremd-DNA-Fragmenten wurde das Enzym
T4-DNA-Ligase (2.6.) verwendet, welches unter ATP-Hydrolyse die Verbindung von
3’-Hydroxylgruppen mit 5’-Phosphatgruppen katalysiert. Dazu werden an den DNA-Enden
zunächst komplementäre Überhänge (sticky ends) durch Restriktion erzeugt (3.1.11.2.).
Durch die Ligasereaktion können sowohl sticky ends als auch stumpfe Enden (blunt ends)
doppelsträngiger DNA kovalent miteinander verknüpft werden. Hierbei werden wechselseitig
die 5’-Phosphat- und die 3’-Hydroxylgruppen der Partnermoleküle unter ATP-Verbrauch
verestert.
Für die Ligationsreaktion werden ein geschnittener, linearisierter Vektor und das zu
klonierende Fremd-DNA-Fragment je nach Größe im molaren Verhältnis von 1:3 oder größer
in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl eingesetzt. Darüber hinaus enthält der Ansatz
den ATP-haltigen Reaktionspuffer, die T4-Ligase und aqua dest..
Der Ligationsansatz wird bei 16 °C für 10 - 20 h inkubiert. Ein Aliquot von 4 μl kann hier auf
ein Gel aufgetragen werden, um den Erfolg der Ligation zu prüfen. Die anderen 16 μl werden
anschließend zur Transformation eingesetzt.
10xLigationspuffer
0,25 M Tris-HCl (pH 7,6)
50 mM MgCl25 mM ATP (Adenosintriphosphat)
5 mM DTT
25% (w/v) PEG 8000
60
Methoden
3.1.16. Dephosphorylierung der 5’Enden linearisierter Plasmide
Ist das für eine Ligationsreaktion vorgesehene Vektorfragment nur mit einem
Restriktionsenzym als lineares Molekül hergestellt worden, so ist es zur Verhinderung einer
monomolekularen Religation notwendig, die 5’-Phosphatgruppe der Vektor-DNA
abzuspalten. Die Dephosphorylierung erfolgt nach dem Restriktionsverdau während einer
Inkubation von 20 - 60 min mit einer alkalischen Phosphatase. Der Vorgang wird gestoppt
und die Phosphatase für 10 min bei 65 °C inaktiviert. Anschließend wird der Ansatz
aufgereinigt. Die in dieser Arbeit verwendete Phosphatase ist die Shrimp Alkaline
Phosphatase (SAP, 2.6.).
Zur Dephosphorylierung wurde der Restriktionsansatz des Vektors mit 10xSAP-Puffer
(Endkonzentration 1x) und 2-3 Einheiten alkalischer Phosphatase mit entsprechender Menge
aqua dest. auf ein Ansatzvolumen von 30 μl aufgefüllt.
SAP-Puffer(10x)
200 mM Tris-HCl, pH 8,8
3.1.17. Sequenzierung von DNA
Nach erfolgter Klonierung werden die Nukleotidsequenzen durch Sequenzierung, d.h. durch
die Bestimmung der Abfolge von Basen in einem DNA-Abschnitt, überprüft. Dafür stehen
verschiedene Verfahren zur Verfügung.
3.1.17.1. Sequenzierung nach Sanger
Zur Sequenzierung nach Sanger (Sanger et al., 1977) wird das Plasmid, auf dem sich die
gesuchte Sequenz befindet, zu Einzelsträngen denaturiert. Durch die Zugabe eines Starter-
Oligonukleotids, das spezifisch in der Nähe der 5’-Region der Sequenz bindet, wird der
Startpunkt der Gegenstrangsynthese festgelegt. Das daran beteiligte Enzym SequenaseTM,
eine modifizierte T7-DNA-Polymerase, baut neben den normalen, im Reaktionsansatz
enthaltenen vier Desoxynukleosidtriphosphaten (dNTP) auch das in geringer Konzentration
jeweils vorhandene einzelne 2’,3’-Didesoxynukleosid-5’-triphosphat (ddNTP) ein. Durch den
Einbau eines Didesoxynukleotids in einer der vier parallelen Synthesereaktionen wird
aufgrund der der DNA fehlenden 3’-Hydroxylgruppe eine weitere Verlängerung des
synthetisierten Gegenstranges unterbunden. Damit kommt es in einer Serie von
basenspezifischen Kettenlängen an dieser Stelle zum Syntheseabbruch. Aufgrund der im
Gegenstrang verteilten Positionen der komplementären Nukleotide entstehen DNA-
61
Methoden
Fragmente aller zugehörigen Kettenlängen, ebenso wie in den drei parallelen
Synthesereaktionen mit einem der übrigen ddNTPs, die anschließend alle elektrophoretisch
in vier Spuren aufgetrennt werden.
3.1.17.2. Automatische DNA-Sequenzierung
Die DNA-Sequenzierung erfolgt mittels der Didesoxy-Kettenabbruch-Methode in modifizierter
Form. Die Reaktion beruht auch hier auf der Verlängerung eines zum Matrizenstrang
komplementären Oligonukleotids, den Kettenabbrüchen der Synthesereaktion der 2’,3'-
Didesoxynukleotid-5’-Triphosphate (ddNTP) im dNTP-Mix und der Größenauftrennung der
als Folge entstehenden, unterschiedlich langen DNA-Fragmente. Die
Didesoxynukleotidtriphosphate sind anstelle von Radioisotopen mit verschiedenfarbigen
Fluoreszenzeigenschaften versehen (FddNTPs) (Prober et al., 1987; Lee et al., 1992). Der
jeweils bei charakteristischer Wellenlänge lichtemittierende Fluoreszenzmarker ermöglicht
eine Identifikation des endständigen Nukleotids. Die sogenannten Multicolorsysteme der PE
Biosysteme sind in der Lage, blaue, gelbe, grüne und rote Farbstoffe (Rhodamin- und
Fluoreszin-Derivate) simultan anzuregen und zu detektieren, wodurch es möglich wird, jeder
Base eine eigene Farbe zuzuordnen. In einer Polymerasekettenreaktion (PCR), ausgehend
von der zu sequenzierenden DNA-Matrize und einem unmarkierten Startermolekül, werden
mit Hilfe einer speziellen Taq-DNA-Polymerase (2.6.) die FddNTPs eingebaut. Diese sorgen
sowohl für die Abbruchreaktion der Sanger-Sequenzierung als auch für die Farbmarkierung
der Fragmente.
Nach Anregung durch einen Argon-Laserstrahl bei 488 nm emittieren die Farbstoffe Licht
verschiedener Wellenlängen zwischen 525 nm und 605 nm, das über ein Gitter, den
sogenannten Spektrographen, in seine Spektralfarben zerlegt wird. Anschließend erfolgt die
zeitgleiche Detektion der Spektralfarben mit Hilfe einer digitalen, konfokalen Optik,
verschiedenen Filtern sowie eines Computers und der entsprechenden Analyse-Software
(Amersham Bioscience MegaBACETM Sequence Analyser, 2.1.).
Als Startermolekül sollte das komplementäre Oligonukleotid möglichst eine TM von 55 °C
aufweisen. Der Dye Terminator Ready-Mix stellt ein Gemisch aus den FddNTPs und der
Ampli-Taq-FS-DNA-Polymerase dar. Die PCR verläuft in 25 Zyklen. Vor Beginn der Zyklen
werden die Proben bereits für 1 min auf 95 °C erhitzt. Pro Zyklus wird der Ansatz zunächst
für 20 sec auf 94 °C erhitzt, dann die Temperatur für 20 sec auf 55 °C gesenkt und dann
4 min auf 60 °C gehalten. Nach Abschluß der PCR wird die Probe auf 4 °C heruntergekühlt.
62
Methoden
Reaktionsansatz Sequenzier-PCR-Reaktion (20 μl)
Komponenten Menge
DNA-Matrize 0,25 - 1 μg
Startermolekül (Primer) 20 μM
Dye Terminator Ready-Mix 4 μl
H2O ad 20 μl
Der Ansatz wird nach der Polymerisationsreaktion aufgereinigt und in 5 μl Probenpuffer
(Formamid-EDTA-Dextranblau) aufgenommen, bevor er im Sequenzierlauf analysiert wird.
Dabei werden die Proben auf die verschiedenen Spuren des chromatographischen
Auftrennungsmediums gegeben und bei 2 kV für 80 sec in die mit Acrylamidgel gefüllten
Glaskapillaren gezogen. Die Auftrennung der DNA-Fragmente erfolgt bei 9 kV für 130 min.
In dieser Arbeit wurde die automatische Sequenzierung an institutseigenen
Kapillarsequenziergeräten (MegaBACETM) durchgeführt, einige Proben wurden von der
Firma „Sequence Laboratories GmbH Göttingen“ sequenziert.
3.1.18. Kultivierung von Bakterien
Alle in dieser Arbeit benötigten Kulturen von Escherichia coli wurden in Luria-Bertani-Medium
(Bertani, 1951) bzw. auf Luria-Bertani-Agar bei 37 °C angezogen. Zur Selektion von
plasmidtragenden Klonen ist der Zusatz von 0,1 mg/ml Ampicillin zum Medium erforderlich.
Luria-Bertani (LB)-Medium
Bacto-Hefe-Extrakt 5 g/l
Pepton 10 g/l
Natriumchlorid 5 g/l
ad. aqua dest.
Luria-Bertani-Agar
Bacto-Agar 15 g/l
Luria-Bertani Medium 1 l
Zur Herstellung einer Übernachtkultur werden 5 ml LB-Medium mit einer steril entnommenen
Kolonie von einer LB-Agarplatte angeimpft und über Nacht auf einem Schüttler mit 200 rpm
bei 37 °C inkubiert.
63
Methoden
3.1.19. Herstellung von Glycerinstocks
Zur Lagerung von Bakterienstämmen können Suspensionen der Übernachtkulturen mit 15%
Glycerin im Verhältnis 1:1 versetzt und bei -20 °C eingefroren werden.
3.1.20. Transformation von Bakterien mit DNA
Die Transformation stellt ein Verfahren dar, bei dem Plasmid-DNA in Bakterien eingebracht
wird. Diese weisen nach Replikation und Expression der Plasmid-DNA neue Eigenschaften
auf, nach denen die Bakterien selektioniert werden können. Als Beispiel seien hier
bestimmte Antibiotikaresistenzen genannt. Für die Transformation muss die Zellwand der
Bakterien für die einzubringende DNA durchlässig gemacht werden. Die so zur Aufnahme
von DNA vorbereiteten Zellen werden als „kompetente Zellen“ bezeichnet. Die
Transformation von Bakterien erfolgte in dieser Arbeit mittels dreier unterschiedlicher
Verfahren.
3.1.20.1. Transformation nach der TSS-Methode
Um die Effizienz der Aufnahme zu erhöhen, erfolgt eine Vorbehandlung der Bakterien; die
eigentliche Transformation erfolgt durch Hitzeschock (Chung et al., 1989).
Für die Transformation von Escherichia coli (XL1-Blue, 2.13.) werden 100 ml LB-Medium
(3.1.18.) mit 100 µl einer Übernachtkultur im Verhältnis 1:100 angeimpft und bei 37 °C auf
einem Schüttler bei 200 rpm inkubiert. Das Wachstum der Kultur wurde durch
photometrische Messung der O.D. bei einer Wellenlänge von 578 nm kontrolliert. Als
Blindwert dient hierfür die O.D.578nm-Messung von LB-Medium. Ist eine O.D.578nm von 0,5 – 0,6
erreicht, wird die Bakterienkultur 30 min auf Eis abgekühlt, mit der Minifuge T (2.1.) bei 3.000
rpm und 4 °C für 10 min pelletiert und in 2 ml eiskaltem TSS-Puffer resuspendiert. Die
Suspension wird anschließend zehn Minuten auf Eis inkubiert.
200 µl der so erzeugten kompetenten Bakteriensuspension werden mit der zu
transformierenden DNA in einem Eppendorfgefäß gemischt und für 30 - 45 min auf Eis
inkubiert. Die Aufnahme der DNA in die Bakterien erfolgt bei einer anschließenden
Inkubation bei 42 °C für 2 min. Nach der Abkühlung auf Eis für 2 min werden dem
Transformationsansatz 800 µl LB-Medium zugesetzt. Durch Inkubation für weitere 60 min bei
37 °C auf dem Schüttler kann sich die plasmidcodierte Antibiotikaresistenz durch Expression
der Selektionsmarker wie β-Laktamase-Expression oder Ampicillinresistenz etablieren. Nach
Zentrifugation von 1 min bei 13.000 rpm mit der Minifuge T und Resuspension in 100 μl LB-
Medium werden jeweils 100 μl und das Restvolumen auf LB-Agarplatten, die zur Selektion
64
Methoden
z.B. Ampicillin (100 μg/ml) enthalten, ausplattiert. Unter diesen Selektionsbedingungen
wachsen während einer Inkubation von 16 h bei 37 °C nur die transformierten
Bakterienklone. Die Transformationseffizienz beträgt zwischen 107 und 109 Transformanten
pro Mikrogramm Supercoil-DNA. Um einen immer gleichbleibenden Standard für die
Transformationseffizienz zu haben, wird als Positivkontrolle ein Ansatz immer mit der
gleichen Menge Supercoil-Plasmid-DNA transformiert. Ferner ist eine Negativ-Kontrolle mit
kompetenten, nicht transformierten Zellen durchzuführen, die durch die fehlende
plasmidcodierte Resistenz in ihrem Wachstum unterdrückt werden. Damit wird sichergestellt,
dass nur Bakterien mit dem Selektionsvorteil durch die Aufnahme des Plasmids auf dem
Nährboden anwachsen.
Die Platten mit gewachsenen Bakterienkolonien werden mit Parafilm versiegelt und bis zur
weiteren Verwendung bei 4 °C aufbewahrt.
TSS-Puffer (Transformation and Storage Solution)
85% LB Medium (v/v)
10% Polyethylenglycol (w/v)
5% DMSO (v/v)
50 mM MgCl2
in aqua dest. und steril filtriert
3.1.20.2. Klassische CaCl2-Methode
Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass kompetente Zellen bei Bedarf direkt zur
Verfügung stehen und nicht, wie bei der TSS-Methode, jedes Mal frisch hergestellt werden
müssen. Dafür ist die Transformationseffizienz mit 106 und 107 Transformanten pro μl
Supercoil-DNA bedeutend geringer.
Bei diesem Verfahren (Cohen et al., 1972; Dagert and Ehrlich, 1979) werden die Zellwände
der Bakterienzellen durch die Behandlung mit einem Überschuss von Ca2+-Ionen
destabilisiert. Dadurch wird die Aufnahme von Fremd-DNA in die Bakterien ermöglicht.
Hierfür müssen sich die Zellen in ihrer logarithmischen Wachstumsphase befinden. Aus einer
Übernachtkultur werden 500 ml LB-Medium im Verhältnis 1:100 angeimpft und bei 37 °C
geschüttelt, bis eine OD578nm von < 0,5 erreicht ist. Danach werden die Zellen für 10 min bei
4 °C abzentrifugiert, bei 6.000 rpm im Beckmann JA-10 Rotor. Das Bakteriensediment wird
in 100 ml einer eiskalten 0,1 M CaCl2-Lösung resuspendiert und anschließend für 30 min auf
Eis inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation sind die Zellen in 20 ml 0,1 M CaCl2 + 16%
65
Methoden
Glycerin-Lösung aufzunehmen und als je 200 μl zu aliquotieren. Die kompetenten Zellen
können nun bei -70 °C eingefroren werden und sind mehrere Jahre haltbar.
Für eine Transformation werden 200 μl kompetente Zellen auf Eis vorsichtig aufgetaut und
zu der zu transformierenden DNA oder dem Ligationsansatz in ein Falcon®Röhrchen (2.2.)
gegeben. Durch schnelle Temperaturwechsel wird dabei die Aufnahme der DNA erleichtert.
Einer dreißigminütigen Inkubation auf Eis folgt ein zweiminütiger Temperaturschock bei
42 °C. Anschließend werden die Bakterien für 2 min auf Eis wieder heruntergekühlt, in 800 μl
LB-Medium aufgenommen und für 1 h bei 37 °C auf dem Schüttler bei 200 rpm inkubiert.
Während dieses Schrittes erfolgt die Etablierung des Plasmids und die Expression der
Selektionsmarker. Anschließend wird der Ansatz auf ein bis vier Agarplatten mit 6 cm
Durchmesser, die zur Selektion der transformierten Escherichia coli-Zellen das Antibiotikum
enthalten, für dessen Resistenz das Plasmid codiert, ausgestrichen und für 16 - 20h bei
37 °C inkubiert.
Die Kontrollen erfolgen wie bei der Transformation nach der TSS-Methode (3.1.20.1.).
3.1.20.3. Transformation ultrakompetenter Zellen
Für einige der Versuche wurden in dieser Arbeit XL 10 Gold® ultrakompetente Escherichia
coli der Firma Stratagene (2.13.) verwendet. Zur Herstellungsart macht die Firma keine
Angaben. Die Zellen müssen nicht zuerst als Übernachtkultur wachsen, sondern sind so
vorbereitet, dass sie nach wenigen, kurzen Vorbereitungsschritten direkt zur Transformation
verwendet werden können.
50 µl der Zellen werden mit 25 mM β-Mercaptoethanol versetzt und 10 min auf Eis inkubiert.
50 ng Plasmid-DNA werden zugefügt und die Zellen für weitere 30 min auf Eis inkubiert.
Dann wird der Transformationsansatz für 45 sec bei 42 °C erhitzt und direkt im Anschluss
wieder für 2 min auf Eis abgekühlt. Nach der Zugabe von 500 ml LB-Medium erfolgt eine
Inkubation für 1 h bei 200 rpm auf dem Schüttler. Anschließend werden jeweils 250 μl auf
eine antibiotikahaltige Agar-Platte ausgestrichen und wie in den anderen Verfahren für 16 -
20 h bei 37 °C inkubiert.
3.1.20.4. Transformation mittels Elektroporation
Die Elektroporation ist eine weitere effiziente Methode, um Nukleinsäuren in Zellen
einzubringen. Dabei wird ein elektrisches Feld hoher Intensität aufgebaut, das die Membran
permeabilisiert und damit durchlässig macht für Makromoleküle wie DNA, die sich im
umgebenden Medium befinden. Dafür werden pro Ansatz je 50 μl der zu transformierenden
66
Methoden
Zellen in LB-Medium mit Plasmid-DNA versetzt und im GenePulse® (2.1.) bei 0 °C für 4,6
msec einem konstanten elektrischen Feld ausgesetzt. Bei einer Spannung von 2,5 kV, einem
Widerstand von 200 Ω und einer Kapazität von 25 μF beträgt die Feldstärke 12,5 kV/cm.
Direkt im Anschluss werden zum Transformationsansatz 100 μl LB-Medium zugegeben und
die Zellen bei 37 °C für 1 h inkubiert. Danach werden 40 - 100 μl der Bakterienkultur auf den
vorbereiteten antibiotikaversetzten Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C für
das Wachstum der Kolonien inkubiert.
3.2. Zellbiologische Methoden
3.2.1. Kultivierung von Zellen unterschiedlicher Zelllinien
Für die Entwicklung der stabilen Zelllinien wurden MDCK-Zellen (2.11.) verwendet, für die
transienten Transfektionen mit Plasmiden fanden sowohl MDCK-Zellen als auch A 549 und
T 293-Zellen (2.11.) Verwendung.
Diese Säugerzellen werden in Brutschränken mit einer konstanten Temperatur von 37 °C
und unter 5% CO2-Atmosphäre bei 80% Luftfeuchtigkeit als einschichtiger Zellrasen in
25 cm2- oder 75 cm2- Zellkulturflaschen im geeigneten Nährmedium kultiviert. Nach
Erreichen der Konfluenz werden die als adhärenter Monolayer wachsenden Zellen von ihrer
Unterlage gelöst und im gewünschten Verhältnis geteilt. Das Kulturmedium wird hierbei
entfernt und die Zellen werden mit einer auf 37 °C erwärmten Trypsin-EDTA-Lösung
gewaschen, um abgestorbene Zellen und Serum zu entfernen. Anschließend werden die
Zellen in 3 bis 5 ml dieser Lösung für ca. 5 min inkubiert, bis sie sich vom Flaschenboden
und aus dem Zellverband gelöst haben. Nach Vereinzelung der Zellen durch die
Trypsininkubation wird der Vorgang durch Zugabe des Nährmediums mit fetalem
Kälberserum gestoppt. In einem für jede Zellart spezifischen Verhältnis bezogen auf die
Fläche werden die Zellen auf neue, mit Kulturmedium versehene Flaschen aufgeteilt, meist
im Verhältnis 1:5 bis 1:20.
Kulturmedium
DMEM
1% L-Glutamin
10% FKS (fetales Kälberserum), 30 min bei 56 °C inaktiviert
1% 100x Penicillin/Streptomycin-Antibiotikagemisch
67
Methoden
Waschmedium
MEM (Dulbecco’s MEM à la Brandl)
Trypsin-EDTA-Lösung
0,025% Trypsin
0,05% EDTA
in H2O
3.2.2. Anlegen von Zellstocks eukaryotischer Zellen
Eukaryotische Zellen können eingefroren und dauerhaft bei -132 °C gelagert werden.
Subkonfluente Zellmonolayer, ausgehend von einer 75 cm2-Zellkulturflasche, werden mit
PBS gewaschen und mit Trypsin-EDTA-Lösung abgelöst, vereinzelt und mit 1x Dulbecco’c
MEM mit 10% FKS versetzt. Die Zellen werden bei 4 °C für 3 min bei 3000 rpm pelletiert, in
Frostmedium aufgenommen und zu je 1 ml in Polypropylen-Kryogefäße überführt. Daraus
resultiert eine Zellkonzentration von 5 x 106 Zellen pro Kryogefäß. Um die Zellen
kontinuierlich herunterzukühlen, werden sie 24 h in Isopropanol-gefüllten Gefrierbehältern
bei -80 °C gelagert und für die Dauerlagerung anschließend bei -132°C in der Gasphase
über flüssigem Stickstoff (-196 °C) aufbewahrt.
Frostmedium
DMEM
10% FKS
1% Glutamin
1% Penicillin/Streptomycin-Antibiotikagemisch
10% DMSO
Eingefrorene Zellen werden nach Entnahme aus dem flüssigen Stickstoff sofort im
Wasserbad bei 37 °C aufgetaut und direkt im Anschluss in eine Zellkulturflasche mit
entsprechendem Medium überführt. Nach 24 h im Brutschrank werden die Zellen geteilt und
erneut passagiert.
3.2.3. Transfektion von Plasmid-DNA in eukaryotischen Zellen
Im Unterschied zu der Transformation von Bakterienzellen, die erst durch eine
Vorbehandlung aufnahmefähig gemacht werden müssen, wird die DNA-Aufnahme bei der
Transfektion eukaryotischer Zellen meist durch einen DNA-Reagens-Komplex erreicht. Für
68
Methoden
das Einbringen von Plasmid-DNA in eukaryotische Zellen (Felgner et al., 1987) wurde in
dieser Arbeit Lipofectamin™ 2000 nach Herstellerangaben verwendet. Vor der Inkubation
der Zellen mit der DNA wird das Lipofectamin™-Plus Reagens der DNA zugegeben, mit dem
die Transfektion effizienter wird. Das Prinzip der Transfektion liegt darin, dass das
Lipofectamin™ mit seinen positiv geladenen Komponenten DOSPA, einem polykationischen
Lipid und dem Phospholipid DOPE eine Komplexbildung mit der negativ geladenen DNA zu
einem DNA-Lipidkomplex eingeht. Der hydrophobe Anteil des Komplexes ist in der Lage, mit
der Zellmembran zu fusionieren, und es kommt zur Freisetzung der DNA in die Zelle. Die
Inkubation der DNA mit dem Lipofectamin™-Plus Reagens führt zur Bildung eines Vorläufer-
Komplexes, was die Wahrscheinlichkeit der DNA-Lipid-Komplexbildung erhöht.
Für eine erfolgreiche Transfektion ist es wichtig, dass bei der gleichzeitigen Transfektion
mehrerer Plasmide eine DNA-Gesamtmenge von 10 µg nicht überschritten wird, weil größere
Mengen des DNA-Lipidkomplexes sehr wahrscheinlich toxisch auf die Zellen wirken.
Weiterhin muss das DNA-Volumen mit maximal 20 µl möglichst gering gehalten werden, da
ein größeres Volumen das Reagens-Medium-Verhältnis stört und damit die Konzentration
des Reagens und die DNA-Lipid-Komplexbildung vermindert.
3.2.3.1. Transfektion von adhärenten Zellen
Die einzusetzenden Mengen der Reagenzien richten sich nach den Angaben des
Herstellers. Im Herstellerprotokoll sind für die jeweiligen Zellkulturschalen und -platten
genaue Mengen angegeben, die für die Zellzahl per Vertiefung und Oberfläche des
Monolayers berechnet werden. Die Zellen werden bis zu einer Konfluenz von 80% in
Zellkulturschalen kultiviert.
In zwei Reagenzgefäßen werden je die errechneten Mengen Lipofectamin™-Plus Reagens
und zu transfizierende DNA in dem entsprechenden Volumen Transfektionsmedium
angesetzt und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend werden der Plasmid-
und der Lipofectamin™-Plus-Ansatz zusammengegeben und für 20 min bei RT zur
Komplexbildung (Lipofectamin™-DNA) inkubiert. Die Zellen werden einmal mit MEM
gewaschen und das Transfektionsmedium wird zugegeben. Nach Abschluss der
zwanzigminütigen Inkubation wird der Transfektionsansatz vorsichtig auf die Zellen gegeben.
Nach einer Inkubationszeit im Brutschrank von 4 bis 6 h ist das Transfektionsmedium durch
Kulturmedium (3.2.1.) zu ersetzen und für weitere 24 - 48 h zu inkubieren.
Transfektionsmedium
OPTI-MEM (2.3)
69
Methoden
3.2.3.2. Transfektion von Zellen in Suspension
Der Transfektionsansatz wird ebenso vorbereitet wie für die Transfektion des Monolayers
(3.2.3.1.). Die in einer 75 cm2-Zellkulturflasche konfluent gewachsenen Zellen werden einmal
mit Trypsin-EDTA-Lösung (3.2.1.) gewaschen und anschließend in dieser Lösung inkubiert,
bis die Zellen sich vom Flaschenboden gelöst und aus dem Zellverband separiert haben.
Anschließend werden sie in 2 ml OPTI-MEM aufgenommen und für 5 min bei 900 rpm und
RT zentrifugiert. Das Pellet wird in 8 ml Transfektionsmedium resuspendiert. Je 1 ml der
Zellsuspension wird in je eine Vertiefung einer 6-Well-Platte gegeben, anschließend wird der
Transfektionsansatz mit dem DNA-Lipidkomplex hinzugegeben. Die Zellen werden nun für
8 h im Brutschrank inkubiert, bevor das Transfektionsmedium durch das Kulturmedium
ersetzt wird, in dem die Zellen für weitere 24 h wachsen. Auch hier können für
unterschiedliche Ansätze und Plattengrößen die genauen Mengen berechnet werden.
3.2.4. Etablierung stabiler Zelllinien
In Zellen stabiler Zelllinien werden die auf dem eingebrachten Vektorplasmid codierten Gene
durch eine Selektion in das Genom der Zelle eingefügt und stabil exprimiert.
Für die Herstellung stabiler Zelllinien werden die MDCK-Zellen für die Transfektion einen Tag
zuvor mit Trypsin vereinzelt und mit frischem Kulturmedium auf Zellschalen verteilt (3.2.1.),
so dass am Tag der Transfektion der Zellrasen zu 90 - 95% konfluent gewachsen ist. Zur
Transfektion werden die Zellen für 4 - 6 h mit dem Transfektionsmedium und dem DNA-
Lipofectamin-Komplex inkubiert (3.2.3.1), anschließend wird das Medium durch
Kulturmedium ohne ZeocinTM-Zusatz ersetzt. Ca. 12 h nach der Transfektion wird das
Kulturmedium ausgetauscht und das Antibiotikum zugesetzt, für das der Expressionsvektor
das Resistenzgen trägt. In dieser Arbeit wurde der Expressionsvektor pIRESbleo3
verwendet, dessen Gen für die Bleomycin-Resistenz die Selektion stabiler Zellklone durch
den Zusatz von ZeocinTM (2.3.) ermöglichte. Die Verwendung unterschiedlicher
Konzentrationen hat ergeben, dass eine ZeocinTM-Konzentration von 1mg/ml einen
ausreichenden Selektionsdruck auf die Zellen ausübt. Die Kolonien einzelner Zellklone
werden über einen Zeitraum von ein bis zwei Wochen selektioniert. Um die Klone zu
isolieren, werden Metallzylinder auf die Kolonien gesetzt, in deren Lumen dann die
Trypsinisierung und die Vereinzelung der Zellen vorgenommen wird, so dass eine
Vermischung mit Zellen anderer Kolonien vermieden wird. Die vereinzelten Zellen werden
dann in Kulturmedium auf frische Zellkulturflaschen verteilt und regelmäßig passagiert. Von
nun an werden die Zellen dieses Klons als eigenständige Zelllinie kultiviert.
70
Methoden
3.2.5. Überprüfung der Proteasen-Aktivität mit spezifischen fluorogenen Substraten in der Spektrofluoreszensanalyse
Um die Aktivität einer Protease in unterschiedlichen Zellen zu bestimmen, wird die Spaltung
eines spezifischen Substrates, das durch die Spaltung fluoreszierende Eigenschaften erhält,
mittels der Fluoreszenz-Spektrophotometrie überprüft. Die zu analysierende Probe wird mit
dem spezifischen Substrat inkubiert, die Protease setzt das Substrat um und die
Fluoreszenzintensität wird bestimmt.
In dieser Arbeit wurde diese Untersuchung für die Aktivitätsanalyse der Human Airway
Trypsin-like Protease in den unterschiedlichen stabil und transient transfizierten Zellen
eingesetzt. Sie orientiert sich am Protokoll von Yasuoka et al. der Universität von Tokushima,
Japan (Yasuoka et al., 1997). Als spezifisches Substrat wird Boc-Phe-Ser-Arg-MCA (2.3.)
verwendet. Methylcumarinamid (MCA) wird von HAT durch Spaltung zu
Aminomethylcumarin (AMC) umgesetzt. AMC besitzt fluoreszierende Eigenschaften, daher
kann anhand der Intensität der gemessenen emittierten Fluoreszenz die Aktivität des
Enzyms bestimmt werden. Die Messung der Emission erfolgt bei 460 nm im Strahlengang
gegen die Extinktion bei 350 nm. Das Peptid des synthetisierten Substrates wird in H2O
gelöst. Das Substrat wird in Probenpuffer aufgenommen (10 µg/ml) und bei 37 °C für 10 bis
60 min mit der Probe inkubiert. Aufgrund der negativen Resultate wurde die Inkubationszeit
in wiederholten Versuchen variiert. Nach der Inkubationszeit wird die Reaktion durch die
Zugabe von 30%igem Acetat gestoppt und die Probe für 5 min bei 2500 rpm zentrifugiert.
Die Fluoreszenzintensität des freigesetzten Aminomethylcumarins (AMC) wird nun im
Fluoreszenz-Spektrophotometer bestimmt. Eine Aktivitätseinheit ist dabei festgesetzt als die
Menge, die 1 µmol AMC pro Minute generiert.
Probenpuffer 10ml
0,5 ml NaCl 85%
526 µl TrisHCl, 1M, pH 8,6
3,5 µl BSA 30%
100 µM MCA-Substrat
9,5 ml H2O
71
Methoden
3.3. Immunologische Methoden
3.3.1. Immunhistochemische Anfärbung von Zellantigenen
Diese Nachweismethode dient der Auffindung von Antigenen mittels spezifischer
monoklonaler Antikörper, die wiederum durch einen Zweitantikörper detektiert werden und
mit verschiedenen Färbemethoden sichtbar gemacht werden können.
Nach Abnahme des Nährmediums werden die Zellen zunächst fixiert. Dies geschieht
entweder durch eine einstündige Inkubation mit Paraformaldehyd 4% in MEM bei
Raumtemperatur oder durch eine zehnminütige Inkubation mit 80%igem Aceton bei -20 °C.
Nach zweimaligem Waschen mit PBSdef werden die Zellwände durch eine zwanzigminütige
Inkubation mit 10% Triton-X-100™ in PBS permeabilisiert. Es folgen zwei Waschschritte mit
PBSdef und eine Inkubation mit der Verdünnungslösung für die Antikörper, um spätere
unspezifische Bindungen zu minimieren. Nach drei Waschschritten mit PBS wird der
Erstantikörper gegen das zu detektierende Protein in der jeweiligen Verdünnung in Elisa-
Puffer hinzugegeben.
Nach einer Inkubation von 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C und
dreimaligem Waschen mit dem Waschpuffer wird der Sekundärantikörper [z.B. Peroxidase-
gekoppelter Anti-Schaf-Antikörper vom Kaninchen (2.10.)] in der jeweiligen
Verdünnungsstufe im Puffer hinzugegeben. Auf eine weitere Inkubation für 1 h bei
Raumtemperatur folgen zwei Waschschritte mit Waschpuffer und einer mit PBSdef.
Anschließend wird das Substrat hinzugegeben [z.B. TrueBlue™ Peroxidase Substrat (2.3.)].
Unter dem Mikroskop kann dann die Färbereaktion beobachtet und ausgewertet werden. Ist
eine ausreichende Anfärbung erfolgt, wird die Reaktion durch Waschen der Zellen mit aqua
dest. gestoppt, um eine unspezifische Hintergrundfärbung zu vermeiden. Die Zellen werden
an einem dunklen Ort getrocknet und aufbewahrt. Damit wird ein Ausbleichen der Färbung
verhindert.
Alternativ kann als Substrat o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid [OPD (2.3.)] verwendet
werden, wobei die Peroxidase 10 min mit dem OPD-Substrat reagiert. Die Farbreaktion wird
mit H2SO4 gestoppt und photometrisch bei 490 nm im TeraTerm-Analysator (2.1.) abgelesen.
Elisa-Puffer
10% NHS (normal horse serum)
0,1% Tween 80
in PBS
72
Methoden
Je nach Antikörper wird der Elisapuffer zur Verdünnung variiert; statt NHS kann NDS
(normal donkey serum) verwendet werden, oder BSA (bovine serum albumin) kann
hinzugefügt werden. Auch die Konzentrationen können variiert werden.
Waschpuffer
0,05% Tween 80
in PBS
3.3.2. Indirekte Immunfluoreszenz
Die Immunfluoreszenz dient zum Nachweis von Antigenen mittels
fluoreszenzfarbstoffmarkierten Antikörpern. Hierbei wird das Antigen durch einen
spezifischen Erstantikörper detektiert. Ein anschließend zugesetzter fluoreszenz-
farbstoffmarkierter Zweitantikörper bindet an den Erstantikörper. Nach Anregung bei
entsprechender Wellenlänge werden vom Fluoreszenzmarker spezifische Lichtsignale
emittiert, die mittels eines geeigneten Mikroskops (2.1.) als indirekter Nachweis der Antigen-
Antikörper-Bindung beobachtet werden können.
In vorliegender Arbeit diente die Immunfluoreszenz zum Nachweis und zur Lokalisation von
amino- und carboxyterminal mit flag-Protein versehener Human Airway Trypsin-like Protease
in transient transfizierten intakten Zellen.
Die Zellen werden auf Objektträgern in Kulturschalen mit acht Vertiefungen herangezogen
und 12, 24 und 48 h nach Transfektion fixiert. Hierfür werden die Zellen in kaltem PBSdef
gewaschen und anschließend zu Fixierung mit 4%igem Paraformaldehyd (2.3.) in MEM für
15 min inkubiert. PFA wird mit kaltem PBSdef abgewaschen und die Zellen werden für weitere
10 min mit 100mM Glycin in PBS inkubiert. Nachdem auch das Glycin mit PBS
abgewaschen ist, wird 0,1%iges Triton-X-100™ in PBS zur Membranpermeabilisierung
zugesetzt. Die Inkubationszeit beträgt 20 min. Danach werden die Zellen erneut sorgfältig mit
PBSdef gewaschen. Sättigt man die Zellen anschließend mit einem dafür vorgesehenen
proteinhaltigen Puffer ab, so lassen sie sich mehrere Tage bei 4 °C aufbewahren.
Absättigungspuffer
2% BSA
5% Normal Donkey Serum (NDS)
0,01% NaN3
in PBS
73
Methoden
Zur Markierung mit Antikörpern wird zunächst der Absättigungspuffer abgewaschen. Dann
werden die Zellen für 1 h mit einem spezifischen, in BSA-Puffer verdünnten Erstantikörper
[hier: anti-flag vom Kaninchen (2.10.)] inkubiert und anschließend in PBSdef gewaschen.
Darauf folgt die einstündige Inkubation mit einem fluoreszenzmarkierten Zweitantikörper
[hier: Texas RedTMAnti-Kaninchen IgG (2.10.)]. Nach einem weiteren Waschschritt mit PBSdef
wird für die Fluoreszenzmarkierung der Nuklei noch DAPI für 10 min zugegeben (3.3.2.1).
Die Präparate werden nach Waschschritten mit PBSdef und einem, zur Verhinderung der
Salzkristallbildung, abschließenden Waschschritt mit aqua dest. in FluoroprepTM (2.3.)
eingedeckt. Um ein Ausbleichen zu verhindern, werden der FluoroprepTM-Lösung zuvor
0,2%(v/v) des Radikalfängers DABCO (1,4 Diazobicyklo- [2,2,2]- Oktan, 2.3.) zugefügt. Dann
werden die Deckgläschen aufgelegt und die Ränder mit transparentem Nagellack versiegelt.
Die Auswertung der fluoreszenz-immunologischen Färbung erfolgt mit Hilfe eines
Mikroskops mit Epifluoreszenz (Axioplan, 2.1.) und einer Kameraausrüstung (Spot Kamera,
2.1.).
3.3.2.1. DAPI-Färbung
Zur Darstellung von Zellkernen in der indirekten Fluoreszenzmikroskopie (3.3.2.) werden die
Präparate nach der Immunfärbung für 10 min mit DAPI-Färbelösung inkubiert und
anschließend mit PBSdef und aqua dest. gewaschen. Der Fluoreszenzfarbstoff DAPI (4,2-
Diamino-2-phenylindol, 2.3.) interkaliert mit DNA, so dass das Chromatin und somit der
Zellkern nach Anregung durch UV-Licht entsprechend fluoreszieren.
DAPI-Färbelösung
300 mM Natriumchlorid
30 mM Natriumcitrat
0,1 ug/ml DAPI
in H2O
3.3.2.2. EGFP (enhanced green fluorescent protein)-Nachweis
Zur Kontrolle des Transfektionserfolgs werden die Zellen einer Vertiefung auf dem
Objektträger mit einem Plasmid, das EGFP exprimiert, transfiziert. EGFP fluoresziert nach
Anregung mit UV-Licht eines definierten Spektralbereichs. Mit geeigneten Filtern ist so eine
Detektion des exprimierten EGFPs in der lebenden Zelle möglich (Zylka and Schnapp,
74
Methoden
1996), was unter dem Mikroskop eine Lokalisationsbestimmung und eine Aussage über die
Menge der transfizierten Zellen zuläßt.
Das Wildtyp-GF-Protein, das ursprünglich aus den beiden Cnidaria Aequorea victoria und
Renilla spp. isoliert wurde, strahlt bei zwei Anregungsmaxima (396 nm und 475 nm) jeweils
Licht der Wellenlänge von 508 nm ab (Morise et al., 1974). Der Vorteil gegenüber anderen
Reportergensystemen ist die direkte Detektierbarkeit in lebenden Zellen oder Geweben
(Chalfie et al., 1994). So kann die Transfektionseffizienz leicht unter dem Mikroskop beurteilt
werden. Verschiedene Mutationen des Wildtyps führten zur Verstärkung der Emission des
grün leuchtenden Proteins (EGFP), zur Verschiebung der Anregungs- und Emissionsmaxima
(rote und blaue Varianten) und zur Steigerung der Thermostabilität des C-Terminus
(Siemering et al., 1996).
3.4. Infektionsversuche mit Viren verschiedener Influenza-Stämme
3.4.1. Alternative Virusanzucht im embryonierten Hühnerei
Das klassische System zur Anzucht von Influenza-Viren sind 11 Tage alte, embryonierte
Hühnereier, in denen sie sich zu hohen Titern in der Allantoismembran replizieren (Klenk and
Rott, 1973). Die Viren werden in die Allantoisflüssigkeit abgegeben und können mit dieser
geerntet werden.
Die Eier werden im Bereich der Luftblase mit Jodlösung desinfiziert. Die Infektion mit 100 µl
der in PBS vorbereiteten Virusverdünnungen erfolgt mit einer Spritze, deren Kanüle (0,55 x
25 mm) senkrecht und vollständig in die vorher perforierte Eierschale eingeführt wird. Die
Öffnung wird mit Ponal™ Klebstoff (2.2.) verschlossen. Die Eier werden zunächst für 48 h
bei 37 °C und 80%-Luftfeuchtigkeit im Brutschrank inkubiert, um eine optimale
Virusvermehrung zu garantieren. Die nachfolgende Inkubation über Nacht bei 4 °C
ermöglicht anschließend die Entnahme von Allantoisflüssigkeit ohne Einblutung aus den
embryonalen Gefäßen. Die Entnahme der Allantoisflüssigkeit mit darin enthaltenen Viren
erfolgt nach vorsichtiger Öffnung des Eies im Bereich der Luftblase. Die Virussuspension
wird in Aliquots zu je 200 μl abgefüllt und bei -70 °C aufbewahrt.
3.4.2. Experimentelle Virusinfektion von eukaryotischen Zellen mit dem Influenza-Virus
Bei den Infektionsversuchen werden die zu infizierenden Zellen dreimal mit MEM oder PBS+
gewaschen. Die zweiwertigen Ionen bewirken die Stabilisierung des Virus.
75
Methoden
PBS + :
2,5 mM MgCl23,4 mM CaCl2in PBS
Zunächst werden die verschiedenen Verdünnungsreihen des Virus hergestellt. Dazu wird die
Virussuspension (3.4.1) in Infektionsmedium in einer log10-Verdünnungsreihe diluiert. In den
Versuchen, in denen eine Virusaktivierung durch HAT in Zellen der stabilen Zellinien oder
transient transfizierten Zellen nachgewiesen werden sollte, wurde nur in den Kontrollreihen
TPCK-Trypsin3 (10 – 20 µg/ml, 2.1.) zum Medium hinzugegeben.
Das Waschmedium wird abgenommen und das Virusmedium auf die Zellen gegeben. Zur
Virusvermehrung werden die Zellen dann im Brutschrank unter 5% CO2-Begasung bei 35 °C
und 80% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Ab ca. 8 Stunden Inkubation ist je nach Virusstamm ein
Replikationszyklus abgeschlossen und der zytopathische Effekt kann kontrolliert werden.
Infektionsmedium
DMEM
1% Glutamin
1% Streptomycin/Penicillin-Antibiotikagemisch
3 Es handelt sich hier um speziell gereinigtes Trypsin aus dem Pankreas von Rindern, das die Aktivität von Chymotrypsin zerstört, ohne die Aktivität von trypsin zu beeinträchtigen. Die beiden
Serin-Proteasen bevorzugen unterschiedliche Substrate und hydrolysieren Peptidbindungen. Chymotrypsin hydrolysiert diese Peptidbindungen nach großen, hydrophoben Aminosäuren
(F,Y,W), Trypsin nach den Aminosäuren Lysin und Arginin (L,R).
76
Ergebnisse
4. Ergebnisse
4.1. Herstellung des pIRESbleo-HAT Plasmids
Mit Hilfe einer RT-PCR (3.1.9.) wurde aus mRNA humaner Bronchialepithelzellen (NHBE,
2.11.) durch Verwendung der Primer HAT-F und HAT-R (2.9.) das HAT-Gen amplifiziert.
Zusätzlich wurden dabei die Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme EcoRI und
NotI angefügt. Die beiden Enzyme schneiden innerhalb ihrer Erkennungssequenz immer am
gleichen Ort der Symmetrieachse und erzeugen DNA-Fragmente überstehender
einzelsträngiger Enden, sogenannter „sticky ends“.
In der Kontroll-Gelelektrophorese (3.1.12.) wurde eine Bande einer Größe von ca. 1,2 kb
erkannt, die der Molekülgröße der DNA der HAT entsprach.
Marker 1 2 3
5000bp 1 und 2 : RT-PCR-Produkt der beiden mRNA-Isolat-Proben
4000bp 3 : Vektorplasmid pIRESbleo3 bei ca. 4,9 kb
1500bp
1000bp
Abb.12 .Gel-Elektrophorese zur Kontrolle nach RT-PCR und Restriktionsverdau
Das RT-PCR-Produkt wurde nach dem QIAquick Gel Extraction Protokoll (3.1.14) aus dem
Agarosegel isoliert und aufgereinigt. Anschließend wurden das Gen und das Vektorplasmid
pIRESbleo3 (Clontech; 2.8.1) im Restriktionsverdau mit EcoRI und NotI für die Ligation
präpariert. Die Schnittstellen für EcoRI und NotI sind in der MCS des ausgewählten Vektors
lokalisiert. Durch den Restriktionsverdau (3.1.11.2.) mit diesen Enzymen sowohl des
Gensegmentes als auch des Vektorplasmids werden kohäsive Enden erzeugt, wodurch das
Gen nahtlos in den Vektor eingefügt werden kann. Nach der zusätzlichen Inkubation des
Vektorplasmids mit Phosphatase und der anschließenden Aufreinigung in der Alkoholfällung
(3.1.10.2.) wurde das HAT-Gen mit Hilfe der DNA-T4-Ligase (3.1.15) über die Schnittstellen
EcoRI und NotI in die MCS des Vektors eingefügt.
77
Ergebnisse
Abb.13 .Schematische Darstellung des Konstruktes pIRESbleo-HAT
Die Plasmid-DNA wurde mittels TSS-Transformation (3.1.20.1) in Escherichia coli (2.12.)
eingebracht. Die transformierten Bakterien wurden mit Hilfe Ampicillin-haltiger Agarplatten
selektioniert und einzelne Kolonien in LB-Medium mit Ampicillinzusatz kultiviert (3.1.18.). Für
die Analyse wurde zunächst im kleinen Maßstab Plasmid-DNA isoliert (3.1.1). Die so
gewonnene DNA wurde erneut mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NotI inkubiert und in
der Gelelektrophorese überprüft. Positive Klone wurden für die Isolierung von Plasmid-DNA
im großen Maßstab über Nacht kultiviert. Anschließend wurde die DNA in der
Maxipräparation (3.1.2.) isoliert. Die Konzentration der DNA wurde mittels UV-
Spektrophotometrie (3.1.4.) bestimmt und anschließend durch Sequenzierung (3.1.17.2.)
überprüft.
78
Ergebnisse
Marker 1 2 3 4 5 6 7
5000bp linearisierter Plasmidvektor bei ca. 5 kb
1500bp exzidiertes HAT-DNA-Fragment in Proben 4 und 7
1000bp
Abb.14 .Kontroll-Gelelektrophorese nach Minipräparation und Restriktionsverdau
4.2. Entwicklung der stabilen Zelllinien mit dem HAT-Gen
Für eine stabile Expression von HAT wurden MDCK-Zellen mit dem Plasmid pIRESbleo-HAT
transfiziert und mit ZeocinTM-haltigem Medium selektioniert (3.2.4.). Zur Kontrolle wurden
MDCK-Zellen unter gleichen Bedingungen mit einem EGFP-tragenden Plasmid transfiziert
und eine weitere Kontrolle lediglich mit dem Lipofectamin-Reagens in Transfektionsmedium
inkubiert. Nach weiteren 24 - 36 h wurden die Zellen gewaschen und mit neuem
Kulturmedium mit ZeocinTM-Zusatz versehen. Der Transfektionserfolg konnte indirekt anhand
der Fluoreszenz in der Kontrolle mit dem EGFP-Plasmid überprüft werden (3.3.2.2.).
ZeocinTM wurde als Antibiotikum zur Selektion in den Konzentrationen 1mg/ml, 0,5 mg/ml und
0,25 mg/ml zugesetzt. Über einen Zeitraum von ca. 2 Wochen wurde regelmäßig das
Medium gewechselt und das Wachstum der transfizierten Zellen beobachtet. Es stellte sich
auch anhand der Kontrollen heraus, dass die Antibiotikakonzentration von 1mg/ml ZeocinTM
für einen ausreichenden Selektionsdruck erforderlich war. Nach 16 - 18 Tagen konnten
mehrere Kolonien selektionierter Zellklone isoliert werden, die für die Etablierung stabiler
Zelllinien Verwendung fanden. Die Klone wurden durch Aufsetzen eines sterilen
Metallzylinders isoliert, darin durch Trypsinzugabe vereinzelt und in frische Zellkulturflaschen
überführt. Aus den vier isolierten Klonen wurden so vier stabile Zelllinien etabliert, die für
weitere Untersuchungen zur Verfügung standen.
79
Ergebnisse
4.3. Infektion von Zellen der stabilen Zelllinie MDCK-HAT mit Influenza A-Virus
Zur Untersuchung, ob die Zellen der vier stabilen Zellklone HAT exprimieren und die
Protease in der Lage ist, Influenzavirus-Hämagglutinin zu aktivieren, wurden die Zellen mit
Influenza A-Virus infiziert.
Dazu wurden MDCK-HAT-Zellen in einer 96-well-Platte passagiert, so dass am Tag der
Infektion der Zellrasen zu 80% konfluent war. Als Negativkontrolle dienten normale MDCK-
Zellen. Als Positivkontrolle wurden vor der Infektion (3.4.2.) Trypsin und BSA zum Medium
der MDCK-HAT-Zellen bzw. der normalen MDCK-Zellen hinzugegeben. Für die Infektion
wurde das Virus in Infektionsmedium verdünnt (3.4.2.). Die Fixierung mit Aceton oder
Paraformaldehyd für die immunhistochemische Anfärbung erfolgte 8 bis 24 h nach der
Infektion (3.4.2.). Für die Anfärbung wurde als Erstantikörper der polyklonale Maus-anti-NP-
A-Antikörper (2.10.) verwendet in einer Verdünnung von 1:500. Zur Absättigung
unspezifischer Bindungsstellen wurde den Lösungen zur Antikörperverdünnung noch NHS
zugesetzt. Nach der Inkubation und den Waschschritten erfolgte die Markierung des
Erstantikörpers mit dem als Zweitantikörper eingesetzten Peroxidase-konjugierten Anti-
Maus-IgG (2.10.) Nach der erneuten Inkubation und den weiteren Waschschritten erfolgte
die Anfärbung mit dem TrueBlue-Peroxidase-Substrat (2.3.).
MDCK MDCK-HAT
ohne
Trypsinzusatz
mit
Trypsinzusatz
Abb.15 .Zellen der stabilen Zelllinie MDCK-HAT nach Infektion mit Influenza A-Virus und Kontrollen
In mehrfachen Versuchsreihen mit unterschiedlichen Virusverdünnungen sowie
unterschiedlichen Zeiten für die Inkubation mit Infektionsmedium für alle Zelllinien der drei
HAT-Klone konnte keine signifikante Aktivierung im Vergleich zu den MDCK-Zellen
80
Ergebnisse
festgestellt werden. Auch die Zugabe unterschiedlicher, aus dem Bronchialsystem
gewonnener Muzine, mit der Idee, darin enthaltenene Proteasen würden eventuell das HAT-
Zymogen aktivieren, zeigte keinen Erfolg.
4.4. Nachweis von HAT-RNA in Zellen der stabilen Zelllinien
Da keine Aktivierung des Influenzavirus in den Zellen der stabilen Zelllinien nachgewiesen
werden konnte, sollte die Expression des Gens überprüft werden. Zunächst wurde mRNA
isoliert. Diese wurde aus den vier Klonen der stabilen Zelllinien, aus NHBE-Zellen (2.11.) zur
Positiv-Kontrolle sowie aus normalen MDCK-Zellen zur Negativ-Kontrolle gewonnen (3.1.5.).
In einer RT-PCR wurde HAT-DNA aus den Zellen der stabilen Zelllinien und den NHBE-
Zellen mit Hilfe der entsprechenden Oligonukleotide amplifiziert. In der Gelelektrophorese
wurde das Ergebnis kontrolliert.
HAT-Klone
Marker MDCK 1 2 3 4 NHBE
MDCK : aus normalen MDCK-Zellen isolierte mRNA
Klon 1 : aus MDCK-HAT-Zelllinie 1 isoliertemRNA; ZeocinTM 0,5 mg/ml
Klon 2-4 : aus MDCK-HAT Zelllinien 2 - 4 isolierte mRNA; ZeocinTM 1 mg/ml
NHBE : aus normalen humanen Bronchialepithelzellen isolierte mRNA
Abb.16 .Gelelektrophorese zum Nachweis von HAT-spezifischer mRNA in infizierten Zellen der stabilen Zelllinie und den Kontrollen
In der Kontroll-Gelelektrophorese ist zu erkennen, dass aus den Zellen des Klons Nummer 1
keine mRNA der Protease zu gewinnen war. Die Klone 2,3 und 4 waren positiv. Hier war in
der Gelelektrophorese im Vergleich mit den NHBE-Zellen sehr gut zu erkennen, dass mRNA
der Human Airway Trypsin-like Protease gleichmäßig aus allen drei Zelllinien sowie aus der
Positivkontrolle isoliert und in der RT-PCR als DNA amplifiziert werden konnte. Die DNA
wurde mit dem QIAquickTM PCR Purification Kit (3.1.10.1.) aufgereinigt und die DNA-
Konzentration der verschiedenen Proben mittels UV-Spektrophotometrie bestimmt.
81
Ergebnisse
Zur Überprüfung der Sequenz wurde erneut RNA aus den Zellen der positiven Zelllinien
gewonnen, in einer RT-PCR als DNA amplifiziert und im Elektrophoresegel kontrolliert. Dann
wurde die DNA mit dem QIAquickTM Gel Extraction Kit aus dem Gel eluiert und mit dem
„89/11“-Reagens weiter aufgereinigt (3.1.10.3.). Das PCR-Produkt wurde in einen pCR®2.1-
TOPO-Vektor integriert (3.1.6.) und mittels Elektroporation (3.1.20.4.) in Escherischia coli
transformiert. Die aus der Minipräparation gewonnene DNA wurde mit dem
Restriktionsenzym EcoRI verdaut. Im anschließenden Kontrollgel war ein DNA-Fragment der
erwarteten Größe von ca. 1200 bp zu erkennen.
Marker 1 2 3 Marker
5000bp
4000bp Marker : Fragmentgrößenstandard 1 kb DNA ladder
linearisierter Plasmidvektor pIRESbleo in allen 3 Proben bei ca. 5 kb
1500bp exzidiertes DNA-Fragment bei ca. 1,2 kb entsprechend dem 1000bp HAT-Insert
Abb.17 . Kontroll-Gelelektrophorese der Proben aus der stabilen Zelllinie des Klons Nr. 3 nach dem Restriktionsverdau mit EcoRI
In der PCR für die folgende Sequenzierung wurden die Oligonukleotide T7 (forward), M13
(reverse) und aufgrund der Länge des Inserts noch der Primer HAT-F374 (2.9.) verwendet.
Das PCR-Produkt wurde durch Alkoholfällung aufgereinigt und die DNA sequenziert. Hier
konnte die korrekte Sequenz der Human Airway Trypsin-like Protease in den Proben der
stabilen Zelllinien nachgewiesen werden.
4.5. Nachweis von HAT-Proteinaktivität mittels MCA-Assay
Der Nachweis der HAT-mRNA belegte die Transkription des HAT-Gens in der Zelllinie. Es
sollte nun überprüft werden, ob die fehlende Aktivierung des Influenza A-Virus durch HAT in
den Zellen eventuell auf eine generelle Inaktivität der Protease zurückzuführen sei.
82
Ergebnisse
Die Überprüfung der Aktivität der Protease orientierte sich am Protokoll von Yasuoka et al.,
(1997; 3.2.5.). In mehreren Versuchsansätzen wurden die Zellen mit dem für die Human
Airway Trypsin-like Protease spezifischen Substrat Boc-Phe-Ser-Arg-MCA inkubiert. Dabei
wurden sowohl lebende konfluente Zellen mit Substrat-versetztem Medium inkubiert, als
auch die Zellen mit Triton-X 100 permeabilisiert und dann das Substrat zugegeben. Die
Permeabilisierung der Zellmembranen sollte eine Freisetzung der Protease im Falle einer
nicht stattfindenden Sezernierung aus den Zellen ermöglichen. Weiterhin wurden Zellen
lysiert und nach Protokoll zentrifugiert, die Proteinaktivität wurde in den so gewonnenen
Überständen bestimmt. Je nach Versuchsaufbau wurde das Substrat in Probenpuffer (3.2.5.)
oder in Infektionsmedium verdünnt.
Die Extinktionen wurden gegen die Leerprobe des Reaktionspuffers oder des Mediums und
gegen eine Positivprobe gemessen, in der das Substrat mit Trypsin in einer Konzentration
von 10 µg/ml inkubiert wurde sowie gegen eine weitere Kontrolle mit normalen MDCK-Zellen.
RB : Reaktionspuffer
TX : Triton-X 100
IM : Infektionsmedium
MCA : Boc-Phe-Ser-Arg-MCA
Abb.18 .Graphische Darstellung des MCA-Assays MDCK-HAT
Die am Vortag umgesetzten Zellen wurden bei einer Konfluenz von 85 - 95% ebenso wie die
entsprechenden Kontrollen mit dem im Probenpuffer oder Infektionsmedium
aufgenommenen Substrat inkubiert. Die Zellüberstände wurden nach der Inkubationszeit
abgenommen, zentrifugiert und analysiert. Die Emission wurde bei einer Wellenlänge von
460 nm gegen die Extinktion bei 350 nm je nach Versuchsreihe nach 30 min, 60 min, 4 h,
12 h und 24 h bestimmt. In keiner der Versuchsreihen war eine signifikante Freisetzung von
AMC und damit eine Umsetzung des spezifischen Substrats messbar.
83
RB+ TX+ MCA 30'
RB + MCA 30'
RB + MCA 60'
IM + MCA 4h
IM + MCA 12h
IM + MCA 24h
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
LeerprobeMDCKMDCK-HATTrypsin
Emis
sion
Ergebnisse
4.6. Herstellung des pIRESbleo-HAT-Plasmids mit multibasischer Schnittstelle (pIRESbleo-HAT-args)
Die Tatsache, dass weder die Expression von HAT in den stabilen Zelllinien nachweisbar
war, noch ein Aktivitätsnachweis erbracht werden konnte, noch ein spezifischer Antikörper
zur Verfügung stand, führte zu der Überlegung, HAT könnte als inaktives Zymogen in den
Zellen vorliegen. Angesichts ihrer Struktur wird vermutet, dass HAT zur Aktivierung entweder
autokatalytisch oder durch ein anderes Enzym gespalten werden muss. HAT sollte nun
durch die Einfügung einer multibasischen Spaltstelle für Furin spaltbar gemacht werden, um
damit eine Aktivierung in den generierten Zellen zu ermöglichen. Mit dem
QuickChangeTMSite Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, 2.7.) wurde an der
Nukleotidposition 554 der HAT-Sequenz im Plasmidvektor pIRESbleo-HAT eine für vier
Arginin codierende Sequenz von 12 Basen integriert, um damit innerhalb des HAT-Proteins
eine Spaltstelle für Furin auszubilden. Yamaoka et al. postulierten bereits 1998 aufgrund
ihrer Untersuchungsergebnisse die Peptidbindung Arg186-Ile187 als Spaltstelle für die
Aktivierung von HAT. Die Aminosäurenpositionen 173 und 187 (entsprechend der
Nukleotidsequenz von Position 561 bis 603) begrenzen den Bereich der Prodomäne. Hier
wird aufgrund der Aminosäurensequenz und aufgrund des Vergleichs mit anderen Typ II
Transmembran-Serinproteasen eine mögliche Spaltstelle vermutet. Diese Spaltung ist
möglicherweise für eine Sezernierung der aktiven Protease erforderlich.
Marker 1 2 3 4
5000bp
Marker : Fragmentgrößenstandard „1 kb DNA ladder“, GeneRulerTM
1 – 4 : DNA-Fragmente aus den Proben der Minipräparation in
der Größe des Plasmidvektors pIRESbleo-HAT-args
(ca. 6,2 kb)
Abb.19 .Kontroll-Gelelektrophorese mit Proben der Minipräparation des Plasmids nach Ethanolfällung
84
Ergebnisse
Für die Einfügung dieser multibasischen Spaltstelle wurde in einer Quick-Change-PCR
(3.1.8.) das Vektorplasmid pIRESbleo-HAT (4.1.) als Ausgangs-DNA verwendet; als Primer
dienten die Oligonukleotide Args-f und Args-r (2.9.). In der anschließenden Inkubation mit
Dpn I (2.6.) wurde die methylierte Ausgangs-DNA verdaut, anhand der Gelelektrophorese
überprüft und in Escherichia coli transformiert. Die Plasmid-DNA wurde durch
Minipräparation isoliert, zur Linearisierung mit EcoRI gespalten und in einer Ethanolfällung
aufgereinigt. Die DNA wurde anschließend sequenziert.
Die Sequenzierung zeigte die erfolgreiche Integration der multibasischen Schnittstelle in die
HAT-Sequenz des Vektors pIRESbleo-HAT.
Nukleotidposition
554 566
Abb.20 .Sequenz der multibasischen Schnittstelle im Sequenzierungsausschnitt des pIRESbleo-HAT-args-Plasmids (Sequenzierung mit dem reverse-Primer HAT-R 752)
Nach der Konstruktion wurde das pIRESbleo-HAT-args-Plasmid verwendet, um, wie in
Kapitel 4.2. beschrieben, eine stabile MDCK-Zelllinie mit dem HAT-args-Gen zu etablieren.
Aminosäurenposition 182-185
4 Arginin eingefügt
SEQRILGG -> SEQRRRRRILGG
Abb.21 .pIRESbleo-HAT-args
85
Ergebnisse
Nach mehrtägiger Selektion mit einer ZeocinTM-Konzentration von 1 mg/ml im Kulturmedium
wurde ein Klon isoliert, dessen Kolonie umgesetzt und als stabile Zelllinie „MDCK-HAT-args“
weiter kultiviert wurde. Auch in dieser Zelllinie konnte der Nachweis von mRNA mit dem in
Kapitel 4.4. beschriebenen Verfahren erbracht werden.
Marker 1 2 3
Marker : Fragmentgrößenstandard 1 kb DNA ladder
1500bp
1000bp 1 : Zelllinie 1 des Klons pIRESbleo-HAT-args
2 : Zelllinie 2 des Klons pIRESbleo-HAT-args
3 : Negativkontrolle aus MDCK-Zellen
Abb.22 .Kontroll-Gelelektrophorese HAT-args
Wie in der Elektrophorese zu sehen, konnte aus der Zelllinie 1 keine mRNA von HAT
gewonnen und keine HAT-DNA in der RT-PCR amplifiziert werden. Aus der Zelllinie 2
desselben Klons konnte die HAT-mRNA isoliert und in der RT-PCR als DNA amplifiziert
werden. Mittels Sequenzierung wurde das HAT-args-Gen überprüft.
86
Ergebnisse
4.7. Nachweis der HAT-Proteinaktivität mittels MCA-Assay in den Zellen der stabilen Zelllinie MDCK-HAT-args
Der Nachweis der mRNA sprach für eine Expression von HAT in den Zellen der stabilen
Zelllinie MDCK-HAT-args. Um die Aktivität der Protease in diesen Zellen zu überprüfen,
wurden Untersuchungen zur Aktivität mit dem spezifischen Substrat durchgeführt. Die Zellen
wurden, wie bereits in Kapitel 4.5. beschrieben, mit dem Substrat Boc-Phe-Ser-Arg-MCA
inkubiert, die Zellüberstände wurden gewonnen und die Emission des fluoreszierenden AMC
bei einer Wellenlänge von 460 nm gegen die Extinktion bei 350 nm gemessen. Die
Untersuchung zur Substrataktivität erfolgte ebenfalls in transient transfizierten A549-Zellen
(2.11.). Dafür wurden die Zellen mit dem leeren Vektorplasmid pIRESbleo3 sowie mit den
Plasmiden pIRESbleo-HAT und pIRESbleo-HAT-args transfiziert.
Wie in den Versuchsreihen zuvor wurden die Zellen mit dem Substrat inkubiert, das in
Infektionsmedium (IM) verdünnt worden war. Um die Zellmembranen zu permeabilisieren,
wurde bei einem Teil der Zellen noch Triton-X 100 (T-X) zugesetzt. Die Zellüberstände
wurden nach 60 min abgenommen bzw. die Zellen wurden mit den Überständen in ein
Eppendorfröhrchen aufgenommen, abzentrifugiert und analysiert.
Abb.23 .Graphische Darstellung des MCA-Assays MDCK-HAT-args mit dem spezifischen Substrat Boc-Phe-Ser-Arg-MCA in stabilen Zellen MDCK-HAT-args
Abb.23.2 .Graphische Darstellung des MCA-Assays mit Boc-Phe-Ser-Arg-MCA in transient transfizierten A549-Zellen
Auch hier waren in keiner Versuchsreihe eine signifikante Freisetzung von AMC und damit
eine Umsetzung des spezifischen Substrats messbar.
87
LeerprobeMDCKMDCK-HAT-argsTrypsin
LeerprobeA 549-Zellen transfiziert mit pIRESbleo3A 549-Zellen transfiziert mit pIRESbleoHATA 549-Zellen mit pIRESbleoHAT-argsTrypsin
Überstand + MCA 1h0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
5500
6000
Über-stand + MCA
IM + T-X + MCA
IM + MCA0
50010001500200025003000350040004500500055006000650070007500
Ergebnisse
4.8. Herstellung der Plasmidvektoren pCAGGS-HAT-flag3' und pCAGGS-HAT-flag5'
In einer RT-PCR wurden an die HAT-Sequenz flag-Epitop-codierende Sequenzen angefügt,
um die Protease einmal amino- und einmal carboxyterminal mit dem flag-Epitop zu
konjugieren. Das flag-Epitop besteht aus der Aminosäurenfolge DYKDDDDK. Mit einem
spezifischen polyklonalen Antikörper gegen das flag-Epitop (2.10.) kann die Protease so in
transfizierten Zellen detektiert werden. Die verwendeten Oligonukleotide waren EcoRI-flag-
HAT und NotI-HAT bzw. EcoRI-HAT und NotI-flag-HAT, die die flag-HAT-Sequenz noch mit
den jeweiligen Schnittstellen der MCS des Vektors pCAGGS (c5) (2.8.2.) versehen haben.
Marker 5' 3'
1500bp DNA-Fragmente nach RT-PCR der beiden Proben in der Größe der
1000bp gesuchten DNA bei ca. 1,2 kb
Abb.24 .Kontroll-Gelelektrophorese HAT-flag 5' und HAT-flag 3' nach RT-PCR
Marker 5' 3' pCAGGS
5000bp
4000bp
Marker : Fragmentgrößenstandard 1 kb DNA ladder
1000bp pCAGGS: Vektorplasmid pCAGGS+MCS (c5)
5'/3' : aufgereinigte RT-PCR-Produkte bei ca. 1,2 kb
Abb.25 .Gelelektrophorese zur Konzentrationsabschätzung vor Ligation
88
Ergebnisse
Die RT-PCR-Produkte wurden im Kontrollgel überprüft und für die Ligation mit dem Vektor
präparativ mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NotI verdaut. Nach der Linearisierung
des Vektors mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NotI und der Inkubation mit
Phosphatase wurde der Vektor mit dem aufgereinigten PCR-Produkt ligiert. Das Plasmid
wurde daraufhin in TSS-kompetente Escherichia coli transformiert und die Plasmid DNA
mittels Minipräparation isoliert. Die DNA wurde nach dem Restriktionsverdau mit EcoRI und
NotI in der Gelelektrophorese überprüft.
HAT-flag 3' HAT-flag 5'
Marker 1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6 7 8
Abb.26 .Gelelektrophorese nach Minipräparation und Restriktionsverdau
Positive Klone wurden für die Maxipräparation verwendet. In der Maxipräparation wurde die
DNA im großen Maßstab aufgereinigt und anschließend ihre Konzentration bestimmt. Die
DNA wurde für weitere Verwendungen bei -20°C gelagert.
89
Ergebnisse
Abb.27 .Schematische Darstellung des Konstruktes pCAGGS-HAT-flag5' (carboxyterminal)
Abb.28 .Schematische Darstellung des Konstruktes pCAGGS-HAT-flag3' (aminoterminal)
4.9. HAT-Nachweis in transient transfizierten Zellen mittels Immunfluoreszenz
Zur in vivo-Analyse wurden in mehreren Versuchsreihen MDCK-Zellen mit den beiden HAT-
flag-Plasmiden transfiziert und nach 8 - 16 h fixiert und die Proteinexpression mit Hilfe der
fluoreszenzimmunologischen Färbung (3.3.2.) analysiert. Als Kontrolle dienten normale
MDCK(H)-Zellen. Der Transfektionserfolg wurde mittels EGFP-transfizierter Zellen überprüft.
90
Ergebnisse
Die Hälfte der transfizierten Zellen wurde nach der Fixierung mit Paraformaldehyd zusätzlich
mit Triton-X 100 behandelt, um die Zellwände zu permeabilisieren. Die andere Hälfte wurde
für die Oberflächenfärbung nur mit PFA fixiert.
Als Erstantikörper wurde der polyklonale Kaninchen-anti-flag-Antikörper (2.10.) verwendet, in
Verdünnungen 1:50 bis 1:400. Nach einer Inkubationszeit von 1 h und den Waschschritten
wurde als Zweitantikörper FITC-konjugiertes Anti-Kaninchen-IgG (2.10.) verwendet. Die
Zellkerne wurden anschließend mit DAPI-Färbelösung dargestellt (3.3.2.1.). Wie in
Abbildung 28 gezeigt, konnte nach transienter Transfektion im Vergleich zur EGFP-Kontrolle
nur in sehr wenigen Zellen das an die Protease gekoppelte flag-Epitop markiert werden, eine
Expression war somit nur in einer sehr geringen Zahl von Zellen nachweisbar und genügte
nicht für den eindeutigen Nachweis der Protease in den transfizierten MDCK-Zellen.
MDCK-Zellen
transiente Transfektion mit dem EGFP-
Plasmid (grün fluoreszierend)
MDCK-Zellen
Transfektion mit pCAGGS-HAT-flag3'
flag-Markierung mit dem FITC-anti-
rabbit-AK als Zweitantikörper (grün
fluoreszierend)
Zellkernanfärbung mit DAPI-
Färbelösung (blau fluoreszierend)
Abb.29 .Immunfluoreszenzaufnahmen nach transienter Transfektion mit pCAGGS-HAT-flag-Plasmiden und dem EGFP-Plasmid zur Kontrolle; 20fache Vergrößerung
91
Ergebnisse
Abb.30 .Immunfluoreszenz-Bild nach transienter Transfektion mit pCAGGS-HAT-flag-Plasmiden; 40fache Vergrößerung
Die Versuchsreihe wurde in A549-Zellen mit gleichem Versuchsaufbau wiederholt, das
Ergebnis entsprach denen der in MDCK-Zellen durchgeführten Versuche.
92
Diskussion
5. Diskussion
5.1. Überblick über die Zielsetzung dieser Arbeit
Ziel dieser Arbeit war es, die Human Airway Trypsin-like Protease in ihrer Eigenschaft als
wirtszellspezifische Endoprotease des Respirationstraktes zu charakterisieren sowie ihr
mögliches Aktivierungspotential für das Influenza A-Virus-Hämagglutinin zu untersuchen.
Diese Arbeit ist eingegliedert in ein großangelegtes Forschungsprojekt, dessen Ziel es ist,
zunächst die Natur verschiedener wirtszellspezifischer Endoproteasen zu beschreiben, die
Influenzaviren mit monobasischen HA-Spaltstellen aktivieren, und sodann in weiteren
Untersuchungen ihren Biosyntheseweg, die Speicherorte, eine mögliche Sekretion, die
Aufenthaltsorte und den Ort der Spaltung des Influenza A-Virus Hämagglutinins zu
analysieren. Ebenso sollen Untersuchungen zu pathophysiologischen Veränderungen infolge
der Influenzavirusinfektion in Bezug auf Aktivität und Kompartimentierung der
Aktivierungsproteasen in dieses Forschungsvorhaben integriert werden.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sollen ein umfassenderes Verständnis für die
Pathophysiologie der Influenzavirusinfektion, die Virusausbreitung im Respirationstrakt und
die pathologischen Veränderungen in den Zellen des infizierten Gewebes schaffen und die
Erkennung von weiteren Zusammenhängen in der Interaktion zwischen Wirtszelle und Virus
ermöglichen. Dadurch könnten neue Ansätze in der Therapie der Influenzavirusinfektion
gewonnen werden. Substratspezifitäten und die Ermittlung der Raumstruktur der HA-
Aktivierungsproteasen sollen für die Entwicklung spezifischer Inhibitoren genutzt werden.
Für eine über die symptomatische Behandlung hinausgehende Therapie der
Influenzavirusinfektion würde das bedeuten, dass nicht mehr nur primär das Virus und seine
Proteine direkter Angriffsort der Therapeutika wären, sondern dass durch die spezifische
Hemmung von Aktivierungsproteasen eine Ausbreitung des Virus im Körper verhindert
werden könnte.
5.2. Klonierung von HAT aus humanen Atemwegsepithelzellen und Etablierung stabil HAT-exprimierender Zellen
Die Human Airway Trypsin-like Protease (HAT) wurde ursprünglich aus Epithelzellen des
Bronchialsystems von Patienten mit chronischen Atemwegserkrankungen isoliert, sie ist
aber auch in humanen Bronchialepithelzellen Gesunder nachzuweisen. In diesen Geweben
kann das Influenza A-Virus durch Spaltung des Hämagglutinin durch eine Wirtsprotease
aktiviert werden. HAT wurde als trypsinähnliche Serinprotease, die im humanen
93
Diskussion
Respirationstrakt aktiv ist, beschrieben und erschien für die Untersuchungen zur
Influenzavirusaktivierung im menschlichen Wirt interessant. Es gelang, die mRNA der
Human Airway Trypsin-like Protease aus humanen Bronchialepithelzellen (NHBE) zu
gewinnen und mittels RT-PCR zu klonieren. Das Gen wurde in das Vektorplasmid
pIRESbleo3 eingebracht. Die Klonierung des Plasmids pIRESbleo-HAT war erfolgreich und
wurde durch die Sequenzierung mit verschiedenen spezifischen Primern bestätigt.
Die Idee der stabilen Zelllinie gründete auf der Planung breit angelegter Versuchsreihen und
der Überlegung, dass in stabilen Zellen, in denen das HAT-Gen in das Genom der Zelle
eingefügt wurde, die Expression zunehmen würde. Nach Transfektion von MDCK-Zellen mit
dem Plasmid pIRESbleoHAT wurden einzelne Klone durch den Zusatz des Antibiotikums
Zeocin zum Nährmedium selektioniert. Durch die regelmäßige Passage wurden aus den
Zellklonen drei stabile Zelllinien (MDCK-HAT 1-3) etabliert und standen für weitere
Untersuchungen zur Verfügung.
5.3. Infektion der stabilen MDCK-HAT-Zellen mit Influenza A-Virus
Die stabilen MDCK-HAT-Zellen wurden mit humanen Influenza A-Viren unterschiedlicher
HA-Subtypen infiziert, um zu überprüfen, ob HAT die Fähigkeit besitze, das Virus durch die
Spaltung des HA0 in HA1 und HA2 proteolytisch zu aktivieren. Nach 24 Stunden wurden die
Zellen fixiert und in der immunhistochemischen Anfärbung analysiert. Eine Spaltung des
Influenza A-Virus Hämagglutinins und eine daraus resultierende Aktivierung des Virus
konnte im Gegensatz zu der mit Trypsin behandelten Kontrollreihe nicht gezeigt werden. Hier
stellte sich die Frage nach der Ursache. In Betracht kamen verschiedene Möglichkeiten:
Entweder war HAT nicht in der Lage, HA zu spalten oder HA nicht als Substrat zu erkennen,
oder die Protease war nicht in den Zellen aktiv bzw. wurde gar nicht erst exprimiert. In
weiteren Untersuchungen wurden die in Betracht gezogenen Antworten überprüft.
Dazu wurde die aus den stabilen MDCK-HAT-Zellen gewonnene mRNA mittels spezifischer
Primer in der RT-PCR amplifiziert und die cDNA anschließend sequenziert. Hierbei konnte
die HAT-mRNA in den Zellen der stabilen Zelllinien nachgewiesen werden. Dies bedeutete,
dass die Generierung der stabilen Zelllinien erfolgreich war, das Vorliegen der mRNA sprach
primär für die Expression der Protease in den Zellen. Eine verbleibende Möglichkeit war die
fehlende Aktivität der Protease durch eine mangelhafte Translation der HAT-mRNA bzw.
eine fehlerhafte Prozessierung und ein daraus resultierender Defekt von HAT in den Zellen.
Eine weitere Überlegung war, ob die Expression der Protease eventuell toxisch für die Zellen
war und zur Apoptose der Zellen führte, in denen sie exprimiert wurde. Da keine spezifischen
94
Diskussion
Antikörper gegen HAT zum direkten Nachweis der Protease in den Zellen zur Verfügung
standen, wurde zunächst die Aktivität von HAT in den stabilen Zellen untersucht.
5.4. Überprüfung der HAT-Aktivität
Die MDCK-HAT-Zellen wurden mit dem HAT-spezifischen Substrat Boc-Phe-Ser-Arg-MCA
inkubiert, um die Aktivität der Protease über die Umsetzung des Substrats in das
fluoreszierende AMC (Aminomethylcumarin) in der Spektrofluoreszenzanalyse zu
bestimmen. Wie im Ergebnisteil dargestellt, erbrachte die Untersuchung nicht den
gewünschten Nachweis einer Aktivität im Vergleich zur Positivkontrolle, in der das Substrat
mit Trypsin inkubiert wurde. Es konnte festgehalten werden, dass HAT in den Zellen nicht
aktiv oder nicht in der Lage war, das Substrat zu erkennen. Daher bedurfte es nach wie vor
der Klärung, ob die Protease überhaupt exprimiert wurde, oder ob sie nach erfolgter
Expression als inaktives Zymogen in den Zellen vorlag.
5.5. Das Plasmid pIRESbleoHAT-args
Die Möglichkeit, dass HAT als inaktives Zymogen in den Zellen vorläge und die Überlegung,
dass es zur Aktivierung von HAT einer autokatalytischen oder einer anderen Spaltung
bedürfe, führten zu der Klonierung des Plasmids pIRESbleoHAT-args. Durch die Einfügung
einer multibasischen Schnittstelle sollte die Spaltung und damit die Aktivierung in den
stabilen MDCK-Zellen durch Furin ermöglicht werden. Dafür wurden vier basische
Aminosäuren (4 Arginin) an der Aminosäurenposition 184 – 188 eingeführt. In diesem der
Serinproteasendomäne vorgelagerten Bereich haben 1997 Yamaoka et al. bereits die
Prodomäne beschrieben, deren Spaltung zur Aktivierung oder Sezernierung von HAT
notwendig sein könnte.
Es zeigte sich, dass die Integration der Mutation erfolgreich war. Auch mit diesem Plasmid
pIRESbleoHAT-args wurde eine stabile Zelllinie etabliert. Die mRNA des HAT-Gens konnte
aus den stabilen Zellen isoliert und sequenziert werden. Ebenso wie in der stabilen Zelllinie
MDCK-HAT bestand jedoch auch hier die Schwierigkeit, die Protease in den Zellen
nachzuweisen.
Die Aktivität von HAT wurde primär mittels des HAT-spezifischen Substrats Boc-Phe-Ser-
Arg-MCA in der Spektrofluoreszenzanalyse überprüft. Eine Aktivität von HAT in den stabilen
Zellen MDCK-HAT-args konnte hier nicht gezeigt werden. Auch in diesen Versuchsreihen, in
denen das Plasmid pIRESbleoHAT-args verwendet wurde, stellte sich das Problem, dass die
95
Diskussion
Möglichkeiten zur Detektion der Protease in den Zellen unzureichend waren, da ein
spezifischer Antikörper nicht vorlag.
5.6. Die Plasmide pCAGGS-HAT-flag5' und pCAGGS-HAT-flag3'
Um den Nachweis von HAT in transfizierten Zellen mittels spezifischer Antikörper erbringen
zu können, wurde die Protease einmal amino- und einmal carboxyterminal mit einem flag-
Epitop konjugiert. Mittels spezifischer Antikörper gegen das flag-Epitop sollte so die Protease
in den Zellen detektiert werden. Dafür wurde die HAT-Sequenz mit den für das flag-Epitop
codierenden Sequenzabschnitten versehen und in den Plasmidvektor pCAGGS+MCS (c5)
kloniert. Der Vektor wurde ausgewählt wegen seines starken Promotors und der dadurch
erhofften besseren Expression der Protease sowie wegen der positiven Erfahrungen in den
Arbeiten mit diesem Vektor an unserem Institut. Der konstruierte Plasmidvektor pCAGGS-
HAT-flag5' codierte dabei für HAT mit dem aminoterminalen flag-Epitop, der Vektor
pCAGGS-HAT-flag3' für HAT mit dem flag-Epitop am carboxyterminalen Ende.
Mit den Konstrukten wurden A549- und MDCK-Zellen transient transfiziert. Der gegen das
flag-Epitop gerichtete Immunfluoreszenz-Antikörper zeigte jedoch nur in wenigen Zellen eine
spezifische Anfärbung, was für eine geringe Expression der Protease in den Zellen sprach.
Die Transfektion selbst war erfolgreich, wie die Kontroll-Transfektion mit dem EGFP-Plasmid
zeigte.
5.7. Weitere Ansätze zum Nachweis von HAT
Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Ansätze verfolgt, um die Expression von
HAT in den stabil und transient transfizierten Zellen nachzuweisen. So wurden von der AG
Professor Garten Kaninchen gegen Peptidsequenzen der Protease immunisiert, um
spezifische Antikörper zu gewinnen. Immunhistochemische Versuchsreihen zur Anfärbung
von HAT mithilfe der Kaninchenseren in stabilen und transient transfizierten Zellen sowie die
Auftrennung zellulärer Proteine in der SDS-Page und die Detektierung der Protease im
Western Blot mittels der Seren zeigten jedoch unzureichende und zu unspezifische
Bindungen. Daher wurden die Ergebnisse dieser Versuchsreihen hier nicht präsentiert.
96
Diskussion
5.8. Spaltung von HA durch HAT
In einer weiterführenden Arbeit am Institut für Virologie in Marburg ist durch die
Koexpression von HA und HAT in Säugerzellen die Spaltung des Hämagglutinins durch HAT
gelungen. Dafür wurden A549-Zellen, humane Zellen eines bronchialen Adenokarzinoms,
mit dem pCAGGS-HAT-flag3'-Plasmid sowie mit dem pCAGGS-Vektor, in den das HA des
A/HongKong/1/68 (H3N2) kloniert wurde, transient transfiziert. Zwei Tage nach der
Transfektion wurden die zellulären Proteine mittels SDS-PAGE und Western Blot aufgetrennt
und auf eine HA-Spaltung hin analysiert. Die Koexpression von HA und HAT in den Zellen
führte zur Spaltung des HA0 in zwei Polypeptide mit einem Laufverhalten, das dem von HA1
und HA2 in der trypsinbehandelten HA-Kontrolle entsprach (Böttcher et al., 2006).
Abb.31 .Western Blot: Spaltung von HA0 in HA1 und HA2 durch HAT sowie durch Trypsin in der Kontrolle (Böttcher et al., 2006)
In den Zellen, die mit leeren pCAGGS-Plasmiden anstelle von pCAGGS-HAT-flag3'
transfiziert wurden, war keine Spaltung von HA zu beobachten. Die Ergebnisse ließen sich in
MDCK-Zellen sowie in 293T-Zellen reproduzieren. Anschließend wurden die Auswirkungen
der Protease auf die Virusinfektion getestet. Transient transfizierte Zellen wurden zehn
Stunden nach Transfektion mit einem Influenza A-Virus infiziert und 24 Stunden nach der
Infektion fixiert und immunhistochemisch angefärbt. Die Zellkulturen, die HAT exprimierten,
zeigten eine deutliche Virusausbreitung, während in den Zellen der Negativkontrolle nur
97
Diskussion
vereinzelt infizierte Zellen detektiert werden konnten. Das Ergebnis sprach dafür, dass die
Protease in der Lage ist, die Infektiosität des Influenza A-Virus zu aktivieren. Darüber hinaus
war dieses Ergebnis mit drei verschiedenen HA-Subtypen humaner Influenza A-Viren (H1,
H2, H3) reproduzierbar. Die Untersuchungen brachten den Nachweis, der in den
Versuchsreihen dieser vorangehenden Arbeit nicht zu erbringen war.
Abb.32 .Deutliches Muster der Virusausbreitung nach Infektion von HAT-exprimierenden Zellen mit Influenza A-Virus (Böttcher et al., 2006)
Es zeigte sich, dass in der transienten Transfektion mit den pCAGGS+MCS-HAT-flag-3' und
klonierten pCAGGS-HA-Plasmiden die Spaltung von Hämagglutinin (HA) durch HAT bei
einer vielfach geringeren Transfektions-DNA-Menge nachzuweisen war, als bei den in der
vorliegenden Arbeit zur Transfektion verwendeten, an den Herstellerangaben orientierten
Mengen. Als Ursache in Betracht kommen eine mangelnde Expression oder eine zu starke
Expression, die eventuell Toxizität für die MDCK-Zellen bedeutete und die Apoptose der die
Protease exprimierenden Zellen zur Folge hatte. Die Ursache konnte noch nicht
abschließend geklärt werden.
5.9. Ausblick
Die Therapie der Influenzavirusinfektion ist heute hauptsächlich symptomatisch. Amantadin,
das das Uncoating der Viren verhindert, ist ein Virostatikum, das nur als postexpositionelle
Prophylaxe im Zuge von Influenza A-Epidemien verabreicht wird. Die Präparate Oseltamivir
und Zanamivir als Neuraminidaseinhibitoren stehen als Therapeutika der Virusgrippe zur
Verfügung. Sie sind in der Lage, den Krankheitsverlauf zu mildern und die Krankheitsdauer
abzukürzen, müssen aber für eine effektive Therapie innerhalb der ersten zwei Tage nach
98
Diskussion
Symptombeginn verabreicht werden. Die Gabe von Zanamivir erfolgt inhalativ, Oseltamivir
wird oral eingenommen. Auch hier besteht die Problematik einer möglichen Entwicklung von
Resistenzen.
Eine hochspezifische Hemmung der Aktivierungsproteasen wäre also ein neuer
Therapieansatz. Indem man die Aktivierung des Virus durch den Wirt verhinderte, könnte der
Krankheitsverlauf besonders in gefährdeten Patientenkollektiven mit geschwächter
Abwehrlage und Komorbiditäten positiv beeinflusst werden. Schwere, häufig letal endende
Verlaufsformen würden seltener zum Tragen kommen.
Unter dem Gesichtspunkt der zunehmenden Resistenzentwicklung des Influenzavirus gegen
bereits vorhandene Therapeutika, welche gegen die virale Neuraminidase oder das M2-
Protein gerichtet sind, wäre HAT als zelluläre Protease daher ein optimaler Ansatzpunkt für
eine mögliche Therapie, da eine Resistenzbildung des Virus vermieden würde.
Es ist noch wenig bekannt über die Aktivierungsproteasen, die unter den Bedingungen einer
natürlichen Influenzavirusinfektion im Menschen Hämagglutinin spalten. Die Expression der
Typ II Transmembran-Serinprotease HAT im menschlichen Respirationstrakt ist
nachgewiesen und es gibt zahlreiche Hinweise auf ihre komplexen Funktionen im
respiratorischen Gewebe, sowohl membrangebunden als auch in der sekretorischen Form.
Die Regulation zellulärer Funktionen über PAR2 sowie die Stimulierung der humanen
Fibroblastenproliferation und die vermehrte Expression bestimmter Muzingene durch HAT
wurden bereits in der Einleitung dargestellt. In welchem Maß sich diese Funktionen und
Veränderungen in der Kompartimentierung der Proteasen auf den Verlauf von Infektionen
auswirken, und inwiefern dies für die Aktivierung des Influenza A-Virus Hämagglutinins
bedeutsam sein könnte, ist zur Zeit noch Vermutungen anheim gestellt.
Die gewonnenen Erkenntnisse über die Spaltung von HA durch HAT tragen zum
zunehmenden Verständnis der Influenzavirusinfektion im Menschen bei und sind
richtungsweisend für weitere Untersuchungen, die neue Therapiemöglichkeiten eröffnen
könnten.
99
Literaturverzeichnis
6. Literaturverzeichnis
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114
Sequenzen
7. Sequenzen
7.1. pIRESbleo3
Molekül : pIRESbleo3, 4874 bp DNA, zirkulär
Beschreibung : CMV-Promotor, MCS, ECMV-IRES, Polyadenylierungssignal SV 40,
Bleomycinresistenzgen, Ampicillinresistenzgen
Dateiname : pIRESbleo3
Ausdruck : 1 - 4874 (komplett), Format Einzelstrang
1 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 61 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 121 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 181 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 241 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 301 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 361 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 421 attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 481 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 541 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 601 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 661 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 721 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 781 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 841 ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gcttggtacc 901 gagctcggat cgatatctgc ggccgcgtcg acggaattca gtggatccac tagtaacggc 961 cgccagtgtg ctggaattaa ttcgctgtct gcgagggcca gctgttgggg tgagtactcc 1021 ctctcaaaag cgggcatgac ttctgcgcta agattgtcag tttccaaaaa cgaggaggat 1081 ttgatattca cctggcccgc ggtgatgcct ttgagggtgg ccgcgtccat ctggtcagaa 1141 aagacaatct ttttgttgtc aagcttgagg tgtggcaggc ttgagatctg gccatacact 1201 tgagtgacaa tgacatccac tttgcctttc tctccacagg tgtccactcc caggtccaac 1261 tgcaggtcga gcatgcatct agggcggcca attccgcccc tctccctccc ccccccctaa 1321 cgttactggc cgaagccgct tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc 1381 caccatattg ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac 1441 gagcattcct aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt 1501 gaaggaagca gttcctctgg aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg
115
Sequenzen
1561 caggcagcgg aaccccccac ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata 1621 agatacacct gcaaaggcgg cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga 1681 aagagtcaaa tggctctcct caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt 1741 accccattgt atgggatctg atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc 1801 gaggttaaaa aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac 1861 acgatgataa gcttgccaca acccagcttg ccagctgggg cgccctctgg taaggttggg 1921 aagccctgca gatctgatca ccatggccaa gttgaccagt gccgttccgg tgctcaccgc 1981 gcgcgacgtc gccggagcgg tcgagttctg gaccgaccgg ctcgggttct cccgggactt 2041 cgtggaggac gacttcgccg gtgtggtccg ggacgacgtg accctgttca tcagcgcggt 2101 ccaggaccag gtggtgccgg acaacaccct ggcctgggtg tgggtgcgcg gcctggacga 2161 gctgtacgcc gagtggtcgg aggtcgtgtc cacgaacttc cgggacgcct ccgggccggc 2221 catgaccgag atcggcgagc agccgtgggg gcgggagttc gccctgcgcg acccggccgg 2281 caactgcgtg cacttcgtgg ccgaggagca ggactgaccg acgccgacca acaccgccgg 2341 tccgacgcgg cccgacgggt ccgaggcatc gtcgactcta gataactgat cataatcagc 2401 cataccacat ttgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac 2461 ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt 2521 tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct 2581 agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttaacgcg tcgagtgcat tctagttgtg 2641 gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctgtat accgtcgacc tctagctaga 2701 gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc 2761 cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct 2821 aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc 2881 agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt 2941 ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag 3001 ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca 3061 tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt 3121 tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 3181 gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct 3241 ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg 3301 tggcgctttc tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca 3361 agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 3421 atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta 3481 acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 3541 actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct 3601 tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt 3661 tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga 3721 tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca 3781 tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat
116
Sequenzen
3841 caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg 3901 cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt 3961 agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag 4021 acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc 4081 gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag 4141 ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca 4201 tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa 4261 ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga 4321 tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata 4381 attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca 4441 agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg 4501 ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcg 4561 ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg 4621 cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag 4681 gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac 4741 tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca 4801 tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag 4861 tgccacctga cgtc
7.2. pCAGGS+MCS(c5)
Molekül : pCAGGS+MCS (c5), 4759 bp DNA zirkulär
Beschreibung : CAG-Promotor (chicken-β-actin-promoter), MCS, β-Globin des
Kaninchen codierende Gensequenz mit Polyadenylierungssignal,
Ampicillinresistenzgen, SV40-ori
Dateiname : pCAGGS+MCS (c5)
Ausdruck : 1 - 4759 bp (komplett); Format Einzelstrang
1 gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 61 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 121 ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 181 ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggact atttacggta aactgcccac ttggcagtac 241 atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 301 cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg
117
Sequenzen
361 tattagtcat cgctattacc atgggtcgag gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc 421 atctcccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt attttgtgca 481 gcgatggggg cggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg 541 gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt 601 tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc 661 gggagtcgct gcgttgcctt cgccccgtgc cccgctccgc gccgcctcgc gccgcccgcc 721 ccggctctga ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc 781 gggctgtaat tagcgcttgg tttaatgacg gctcgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag 841 ccttaaaggg ctccgggagg gccctttgtg cgggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg 901 tgtgtgtgtg cgtggggagc gccgcgtgcg gcccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg 961 cgggcgcggc gcggggcttt gtgcgctccg cgtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc 1021 ggtgccccgc ggtgcggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 1081 tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgg cggtcgggct gtaacccccc cctgcacccc 1141 cctccccgag ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtgc ggggcgtggc 1201 gcggggctcg ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg 1261 ccgcctcggg ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gccccggagc gccggcggct 1321 gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcaag 1381 ggacttcctt tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc 1441 tctagcgggc gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc 1501 cttcgtgcgt cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg 1561 ggggacggct gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc 1621 ggcagctcta gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg 1681 ggcaacgtgc tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattcct cgagggtacc 1741 cccggggcgg ccgcgagctc ttaattagct agcagatctt tttccctctg ccaaaaatta 1801 tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc taataaagga aatttatttt 1861 cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc ggaaggacat atgggagggc 1921 aaatcattta aaacatcaga atgagtattt ggtttagagt ttggcaacat atgcccatat 1981 gctggctgcc atgaacaaag gtggctataa agaggtcatc agtatatgaa acagccccct 2041 gctgtccatt ccttattcca tagaaaagcc ttgacttgag gttagatttt ttttatattt 2101 tgttttgtgt tatttttttc tttaacatcc ctaaaatttt ccttacatgt tttactagcc 2161 agatttttcc tcctctcctg actactccca gtcatagctg tccctcttct cttatgaaga 2221 tccctcgacc tgcagcccaa gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 2281 ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg 2341 gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca 2401 gtcgggaaac ctgtcgtgcc agcggatccg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg 2461 cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat 2521 ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc 2581 cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct aacttgttta
118
Sequenzen
2641 ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat 2701 ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct 2761 ggatccgctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg 2821 ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 2881 atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 2941 gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 3001 gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 3061 gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 3121 gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 3181 aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 3241 ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 3301 taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 3361 tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 3421 gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 3481 taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 3541 tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 3601 tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 3661 ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 3721 taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 3781 tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt 3841 cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 3901 gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 3961 cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg 4021 ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac 4081 aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 4141 atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 4201 tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 4261 gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 4321 aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat 4381 acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 4441 ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 4501 tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 4561 aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 4621 catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 4681 atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 4741 aaaagtgcca cct
119
Sequenzen
7.3. HAT
Molekül : Human Airway Trypsin-like Protease (HAT), 1226 bp DNA, linear
Dateiname : HAT
Beschreibung : Aminoterminus, Transmembrandomäne, SEA-Modul, Prodomäne,
Serinproteasendomäne, Carboxyterminus
Ausdruck : 1 - 1226 bp (komplett); Format Einzelstrang
1 gagtgggaat ctcaaagcag ttgagtaggc agaaaaaaga acctcttcat taaggattaa 61 aatgtatagg ccagcacgtg taacttcgac ttcaagattt ctgaatccat atgtagtatg121 tttcattgtc gtcgcagggg tagtgatcct ggcagtcacc atagctctac ttgtttactt 181 tttagctttt gatcaaaaat cttactttta taggagcagt tttcaactcc taaatgttga241 atataatagt cagttaaatt caccagctac acaggaatac aggactttga gtggaagaat301 tgaatctctg attactaaaa cattcaaaga atcaaattta agaaatcagt tcatcagagc 361 tcatgttgcc aaactgaggc aagatggtag tggtgtgaga gcggatgttg tcatgaaatt421 tcaattcact agaaataaca atggagcatc aatgaaaagc agaattgagt ctgttttacg 481 acaaatgctg aataactctg gaaacctgga aataaaccct tcaactgaga taacatcact541 tactgaccag gctgcagcaa attggcttat taatgaatgt ggggccggtc cagacctaat 601 aacattgtct gagcagagaa tccttggagg cactgaggct gaggagggaa gctggccgtg661 gcaagtcagt ctgcggctca ataatgccca ccactgtgga ggcagcctga tcaataacat 721 gtggatcctg acagcagctc actgcttcag aagcaactct aatcctcgtg actggattgc781 cacgtctggt atttccacaa catttcctaa actaagaatg agagtaagaa atattttaat841 tcataacaat tataaatctg caactcatga aaatgacatt gcacttgtga gacttgagaa901 cagtgtcacc tttaccaaag atatccatag tgtgtgtctc ccagctgcta cccagaatat 961 tccacctggc tctactgctt atgtaacagg atggggcgct caagaatatg ctggccacac1021 agttccagag ctaaggcaag gacaggtcag aataataagt aatgatgtat gtaatgcacc 1081 acatagttat aatggagcca tcttgtctgg aatgctgtgt gctggagtac ctcaaggtgg1141 agtggacgca tgtcagggtg actctggtgg cccactagta caagaagact cacggcggct 1201 ttggtttatt gtggggatag taagctgggg agatcagtgt ggcctgccgg ataagccagg1261 agtgtatact cgagtgacag cctaccttga ctggattagg caacaaactg ggatctagtg 1321 caacaagtgc atccctgttg caaagtctgt atgcaggtgt gcctgtctta aattccaaag1381 ctttacattt caactgaaaa agaaactaga aatgtcctaa tttaacatct tgttacataa 1441 atatggttta acaaacactg tttaaccttt ctttattatt aaaggttttc tattttctcc
120
Sequenzen
7.4. Human Airway Trypsin-like Protease, kloniert
Molekül : Human Airway Trypsin-like Protease (HAT), 1226 bp DNA, linear
Dateiname : HAT
Beschreibung : Aminoterminus, Transmembrandomäne, SEA-Modul, Prodomäne,
Serinproteasendomäne, Carboxyterminus
Ausdruck : 1 – 1226 bp (komplett); Format Einzelstrang; Sequenzierung aus dem
klonierten Plasmid pIRESbleoHAT mit den Primern
• HAT-R 415 (reverse)
• HAT-R 752 (reverse)
• HAT-F 224 (forward)
• HAT-F 718 (forward)
• HAT-F 1094 (forward)
121
Sequenzen
122
Sequenzen
123
Sequenzen
124
Sequenzen
125
Sequenzen
126
ANHANG
ANHANG
Abkürzungsverzeichnis
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
μM mikromolar
μmol Mikromol
A Adenin; Adenosin; Ampère; Alanin
AA Acrylamid
Abb. Abbildung
Ac Acetat
Ala Alanin
AMC Aminomethylcumarin
Amp Ampicillin
APS Ammoniumpersulfat
Arg Arginin
AS Aminosäure
Asp Aspartat
ATP Adenosin-5’-triphosphat
bidest. bidestillata (zweifach destilliert)
Boc(-Aminosäure) tert-Butoxycarbonyl(-Aminosäure)
bp Basenpaare
BPB Bromphenolblau
BSA Bovine Serum Albumin (Rinderserumalbumin)
bzw. beziehungsweise
C Cytosin; Cystein
C-Terminus Carboxy-Terminus
CaCl2 Calciumchlorid
127
ANHANG
CAG-Promotor Chicken-β-Actin-Promotor
(β-Aktin-Promotor vom Huhn)
cDNA Complementary DNA (Komplementär-DNA)
CF Cystische Fibrose
CMV Cytomegalievirus
cRNA Complementary RNA (Komplementär-RNA)
CPE cytopathischer Effekt
d.h. das heißt
DABCO 1,4 Diazobicyklo- [2,2,2]- Oktan
DAPI 4,6-Diamido-2-phenylindol
DFP Diisopropylfluorophosphat
ddNTP Didesoxy-5’-Nukleotidtriphosphate
dest. destillata (destilliert)
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle's Medium
(Nährmedium von GIBCO)
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
DNase Desoxyribonuklease
dNTP Desoxy-5'-Nukleotidtriphosphate
DOPE Dioleoylphosphatidylethanolamin
DOSPA 2,3-Dioleoyloxy-N-
2[(sperminecarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-
h propanaminiumtrifluoroacetat
dsDNA Doppelstrang-DNA
DTT Dithiothreitol
EB Elutionspuffer
ECMV Encephalomyocarditis-Virus
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein
(verstärktes grün-fluoreszierendes Protein )
128
ANHANG
EGFR Epidermal-Growth-Factor-Receptor
(epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor)
ENaC Epithelial Na+ Channel
(epithelialer Natriumkanal)
et al. et alteri oder et alii (und andere)
f forward (vorwärts)
FITC Fluoreszinisothiocyanat
FKS Fetales Kälberserum
FPV Fowl Plaque Virus (Geflügelpest-Virus)
G Glycin
G-Protein Guanosintriphosphat-bindendes Protein
GPI Glykosylphosphatidylinositol
H Hämagglutinin; Wasserstoff
H2O Wasser
HA Hämagglutinin
HAEC Human Adenoid Epithelial Cells
(Humane epitheliale Drüsenzellen)
HAT Human Airway Trypsin-like Protease
HCl Salzsäure
HEF-Protein Hämagglutinin-Esterase-Fusions-Protein
His Histidin
HRP Horse Reddish Peroxidase
(Meerettichperoxidase)
H2SO4 Schwefelsäure
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
I.P. Isoelektrischer Punkt
129
ANHANG
IPT6 Isopentenyltransferase 6
IRES Internal Ribosomal Entry Site
(Interne ribosomale Eintrittsstelle)
KCl Kaliumchlorid
KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat
LB-Medium Luria-Bertani Medium
LDLRA-Domäne LDL-Rezeptor-Klasse A-Domäne
M Molar
M1 Matrixprotein 1
M2 Membranprotein 2 (Ionenkanalprotein)
MCA 7-Amino-4-Methylcumarin
MCS Multiple Cloning Site (Polylinker)
MgCl2 Magnesiumchlorid
MnCl2 Manganchlorid
MOPS 3-[N-Morpholino]propansulfonsäure
MPBST-Lösung Milk-Phosphat-Buffered-Saline-Tween-Lösung
(mit Milchpulver versetzter Phosphatpuffer mit
Zusatz von Tween)
mRNA Messenger-RNA (Botschafter-RNA)
N Neuraminidase; Stickstoff
N-Terminus Aminoterminus
NA Neuraminidase
NaCl Natriumchlorid
NaN3 Natriumazid
NaOH Natriumhydroxid
NDS Normal Donkey Serum (Eselserum)
NEP Nuklear-Export-Protein
130
ANHANG
NHBE-Zellen Normale Humane Bronchialepithelzellen
NH4OAc Ammoniumacetat
(NH4)2SO4 Ammoniumsulfat
NHS Normal Horse Serum (Pferdeserum)
nm Nanometer
NP Nukleoprotein
NS1 Nichtstrukturprotein 1
O.D. Optische Dichte
OPD o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid
OPTI-MEM Optimal Minimal Essential Medium
(Nährmedium von GIBCO)
PAR2 Protease-Aktivierter Rezeptor 2
PC6 Proprotein Convertase 6
(Proprotein-Konvertase 6)
PBS Phosphat Buffered Saline
(Salzhaltiger Phosphatpuffer)
PCR Polymerase Chain Reaction
(Polymerasekettenreaktion)
PEG Polyethylenglycol
PFA Paraformaldehyd
Phe Phenylalanin
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
PRSS Protease Serine S1 Family
(Familie der Serinproteasen S1)
r reverse (rückwärts)
rER Rauhes Endoplasmatisches Retikulum
RNA Ribonukleinsäure
RNP Ribonukleoprotein
rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)
131
ANHANG
RT Raumtemperatur, Reverse Transkriptase
SAP Shrimp Alkaline Phosphatase (alkalische
Phosphatase, aus Eismeergarnelen isoliert)
SEA-Modul Sea Urchin Sperm-Protein (Protein des
Seeigelsamens), Enterokinase und Agrin-
Modul
SDS Sodiumdodecylsulfate (Natriumdodecylsulfat)
Ser Serin
SRCR-Domäne scavenger receptor cysteine-rich-Domäne
(cystein-reiche Domäne des Phagozyten-
Rezeptors)
ss Single Strand (Einzelstrang)
SV 40 Simian Vacuolating Virus 40 (Affenvirus 40)
T Tyrosin, Temperatur
TBE-Puffer TrisBase-Borsäure-EDTA-Puffer
TEMED N,N,N,N-Tetramethylethylendiamin
TPCK-Trypsin Tosyl-Phenyalanyl-Chlormethyl-Keton-Trypsin
TSS Transformation and Storage Solution
(Transformations- und Aufbewahrungslösung)
TTSP Typ II Transmembran Serin Proteasen
U Units (Einheiten)
vRNA Virale Ribonukleinsäure
vRNP Virales Ribonukleoprotein
X-Gal X-Galaktose
z.B. zum Beispiel
132
ANHANG
Verzeichnis der akademischen Lehrer
Meine akademischen Lehrer und Lehrerinnen waren Damen und Herren in Marburg:
Arnold, Aumüller, Bach, Barth, Basler, Baum, Becker, Beyer, Christiansen, Czubayko, Daut,
Eilers, Feuser, Garten, Geus, Görg, Gotzen, Griss, Gudermann, Happle, Hellinger, Hesse,
Hofmann, Jungclas, Katschinski, Kern, Klaus, Klenk, Klose, Koolman, Kretschmer, Krieg,
Kroll, Kroh, Kuhlmann, Lammel, Lang, Lill, Löffler, Lohoff, Maier, Maisch, Mann, Mennel,
Moll, Mueller, Mutters, Moosdorf, Neubauer, Oertel, Remschmidt, Renz, Roehm, Rothmund,
Schäfer, Seitz, Seyberth, Schmidt, Schneyer, Steiniger, Suske, Vohland, Weihe, Werner,
Westermann, Wulf
133
ANHANG
Danksagung
Meinem Doktorvater, Herrn Professor Dr. Garten, danke ich für die Ermöglichung dieser
Arbeit, die Auswahl des Themas und die gute und zuverlässige Betreuung der Dissertation.
Herrn Professor Dr. Klenk danke ich für die vielen Anregungen in den zahlreichen
Arbeitsgruppenbesprechungen und die zusätzliche Supervision meiner Arbeit.
Mein besonderer Dank gilt meinen Betreuern Dr. Mikhail Matrosovich und Dr. Tatyana
Matrosovich, die während meiner eineinhalbjährigen Arbeit im Labor offen waren für die
vielen Fragen einer in der laborwissenschaftlichen Arbeit primär unerfahrenen
Medizinstudentin.
Dr. Tatyana Matrosovich danke ich insbesondere für die Unterstützung bei der praktischen
Arbeit und Dr. Mikhail Matrosovich für seine geduldigen Erklärungen und immer neuen Ideen
für weiterführende Versuchsansätze. Ihre sehr zuverlässige, freundliche und humorvolle
Betreuung habe ich sehr zu schätzen gelernt.
Auch Eva Böttcher gilt mein Dank. Sie hat, nachdem das Ehepaar Matrosovich aus
beruflichen Gründen nach London gegangen war, die Betreuung der schriftlichen Arbeit
übernommen, hat sie Korrektur gelesen und mir durch ihre gute, konstruktive Kritik und ihre
Unterstützung in der Diskussion sehr geholfen. Darüber hinaus war sie so freundlich, mir
Bildmaterial Ihrer Diplomarbeit, in der sie die Erkenntnisse meiner Arbeit weitergeführt und
zu einem erfolgreichen Ergebnis gebracht hatte, für die Diskussion meiner Dissertation zur
Verfügung zu stellen.
Den vielen anderen Mitarbeitern des Instituts für Virologie möchte ich danken für die sehr
angenehme Arbeitsatmosphäre, die vielen Anregungen sowie die große Hilfsbereitschaft, die
mir entgegengebracht wurde. Nennen möchte ich hier vor allem Dr. Gülsah Gabriel für ihre
fachlichen Ratschläge sowie Jennifer Uhlendorff für den Kurierdienst zwischen London und
Marburg, Dr. Hosam Shams-El-Din für die Hilfe bei der Sequenzierung im TOPO®-Vector,
Astrid Herwig für Ratschläge bei den Zellkulturtechniken und Katharina Kowalski für die
Sequenzierungen.
Herrn Professor Dr. Wulf, Direktor der Abteilung für Anästhesie und Intensivtherapie am
Universitätsklinikum Gießen und Marburg, Standort Marburg, danke ich für meine
dreimonatigen Freistellung vom Dienst, die mir den Abschluss meiner Dissertation zu
diesem Zeitpunkt erlaubt hat.
Meinen FreundInnen Katharina Hiller, Vanessa Wennekes und Heiko Held sowie Gerd
Wurrmann und Martin Unger danke ich für das geduldige Zuhören, die freundlichen
134
ANHANG
Ermunterungen und die aufbauenden Worte ebenso wie für die Korrekturlesungen und die
fachliche Hilfe beim Scannen der Gelphotographien und der Sequenzen.
Mein größter Dank gilt meiner Familie, insbesondere meinen Eltern, deren Unterstützung mir
zu jedem Zeitpunkt gewiss war und deren Vertrauen in mich und meine Fähigkeiten immer
Motivation bedeutete. Sie haben mich mein Leben lang gefördert und meinen Weg begleitet.
Ihnen adäquat zu danken ist in Worten sicher nicht möglich. Meinen Geschwistern Beatrix
und Konrad gilt mein Dank, deren meist nicht ganz so liebevolle, doch immer ermunternde
Worte mich darin bestärkten, meine Dissertation abzuschließen, während die konstruktive
Kritik meiner Schwester in der Korrektur mir sehr half.
135
