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Aus dem Medizinischen Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg in Zusammenarbeit mit dem Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin sowie dem
Institut für Humangenetik des Universitätsklinikums Heidelberg Direktor der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin des Universitätsklinikums Marburg:
Prof. Dr. med. R.F. Maier Ärztlicher Direktor der Klinik Kinderheilkunde I des Universitätsklinikums Heidelberg :
Prof.Dr.med.,Prof.h.c.(RCH) G.F.Hoffmann Geschäftsführender Direktor des Institutes für Humangenetik der Universität Heidelberg:
Prof. Dr. med. C.R. Bartram
Denaturierungsgradientengelelektrophorese (DGGE) für die molekulare Diagnostik des
Ornithin-Transcarbamylase (OTC-) Mangels
INAUGURAL-DISSERTATION zur
Erlangung des Doktorgrades der gesamten Humanmedizin
dem Fachbereich Medizin
der Philipps-Universität Marburg vorgelegt von
Astrid Preuße geb. Knauer
aus Löbau
Marburg 2008
Angenommen vom Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg am:
24.01.2008
Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs.
Dekan: Prof. Dr. M. Rothmund
Referent: Prof. Dr. Dr. J. Zschocke
Korreferent: Prof. Dr. M. Koch
II
INHALTSVERZEICHNIS
Kapitel I EINLEITUNG
A Einführung......................................................................... 1
B Biochemische Grundlagen ............................................... 3-17
1 Der Harnstoffzyklus ........................................................... 3 2 Die Ornithintranscarbamylase ............................................ 8 3 Struktur des OTC-Gens ...................................................... 14
C Klinische und molekulare Grundlagen .......................... 18-37
1 Erbliche Harnstoffzyklusdefekte ........................................ 18 2 Das klinische Bild des OTC-Mangels ................................ 21 3 Molekulare Basis ................................................................ 23 4 Diagnose ............................................................................. 26 5 Therapie ............................................................................. 34 6 Prognose ............................................................................. 37
D Ziele der Untersuchung ................................................... 38
Kapitel II MATERIAL UND METHODEN
A Methodenwahl .................................................................. 39-46
1 Molekulargenetische Diagnostik ....................................... 39 2 Methode der Wahl .............................................................. 43
B Materialien und Protokolle ............................................. 47-60
1 DNA-Extraktion ................................................................. 47 2 Primer ................................................................................. 49 3 Die Polymerasekettenreaktion............................................ 52 4 Agarose Gelelektrophorese der PCR-Produkte .................. 55 5 DGGE ................................................................................ 56 6 Sequenzierung der DNA .................................................... 58
C Patientendaten .................................................................. 61-66
1 Validierung ......................................................................... 61 2 Prospektive Untersuchung bei Verdacht auf OTC-Mangel ...................................................................... 63
Inhaltsverzeichnis III
Kapitel III ERGEBNISSE
A Übersicht ........................................................................... 67-72
B Darstellung der Analyseergebnisse ................................. 73-93
Exon 1 ................................................................................ 73 Exon 2 ................................................................................ 75 Exon 3 ................................................................................ 78 Exon 4 ................................................................................ 79 Exon 5 ................................................................................ 81 Exon 6 ................................................................................ 85 Exon 7/ 8 ............................................................................ 90 Exon 9 ................................................................................ 91 Exon 10 .............................................................................. 93
C Darstellung der Analyseergebnisse für die Indexpatienten .................................................................. 94-101
Indexpatient 59 ................................................................... 94 Indexpatient 60 ................................................................... 95 Indexpatient 61 ................................................................... 97 Indexpatient 62 ................................................................... 98 Indexpatient 63 ................................................................... 100
Kapitel IV DISKUSSION
A Allgemeine Betrachtung der DGGE Analytik................ 102-110
B Familienbesprechung ....................................................... 111-120
Indexpatient 54 u. 55 .......................................................... 111 Indexpatient 56 ................................................................... 112 Indexpatient 57 ................................................................... 113 Indexpatient 58 u. 59 .......................................................... 114 Indexpatient 60 ................................................................... 114 Indexpatient 61 ................................................................... 116 Indexpatient 62 ................................................................... 117 Indexpatient 63 ................................................................... 118
C Schlußbetrachtung ........................................................... 121
Aussichten .......................................................................... 122-124
V ZUSAMMENFASSUNG 125
VI LITERATURVERZEICHNIS 127
VII VERZEICHNIS DER AKADEMISCHEN LEHRER 135
VIII DANKSAGUNG 136
IV
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
bp Basenpaare
DGGE Denaturierungs-Gradienten-Gelelektrophorese
EC-Nummern Enzyme Commission numbers (numerisches
Klassifikationssystem für Enzyme)
Hsp Heat shock protein (Hitzeschockprotein)
kDa Kilodalton
MIM Mendelian Inheritance in Man
OTC Ornithintranscarbamylase
SSCP Single-Strand Conformational Polymorphism
UTR untranslated region
Kapitel I – A: Einführung 1
KAPITEL I
A Einführung
Der Harnstoffzyklus bildet die Grundlage für die Bildung von Harnstoff als
unschädliches Stickstoffausscheidungsprodukt. In diesen Stoffwechselprozeß sind im
wesentlichen 6 Enzyme involviert. Die Ornithin Transcarbamylase (OTC, EC 2.3.1.3)
dient als mitochondriales Matrixenzym im zweiten Schritt des Harnstoffzyklus der
Umwandlung von Ornithin und Carbamylphosphat zu Citrullin. Der OTC-Mangel ist
der häufigste angeborene Harnstoffzyklusdefekt (Brusilow und Horwich 2000) und
wurde erstmals in den 60er Jahren von Russell et al. beschrieben (Russell et al. 1962).
Das die humane OTC codierende Gen wurde in den 80er Jahren auf dem X-Chromosom
lokalisiert und unterliegt der X-Inaktivierung bei Frauen. Nach der Lyon-Hypothese,
von Mary Lyon 1961 postuliert, ist in somatischen Zellen normaler weiblicher Säuger
jeweils eines der beiden X-Chromosomen weitgehend inaktiviert. Da in manchen Zellen
das inaktive X-Chromosom väterlicher, in andern Zellen mütterlicher Herkunft ist,
können in einem Gewebe X-chromosomale Merkmale mosaikartig verteilt sein (Lyon
1961).
Für den OTC-Mangel wie für viele andere X-chromosomale Krankheiten gilt, dass
hemizygote Männer fast immer klinisch symptomatisch werden, während heterozygote
Frauen abhängig vom Lyonisierungsmuster in der Leber klinische Symptome zeigen
oder klinisch asymptomatisch bleiben (Tuchman et al. 2000).
Die Variabilität bzw. Heterogenität des OTC-Mangels war und ist auch heute noch
Gegenstand vieler Untersuchungen sowohl auf klinischer Ebene als auch auf
biochemischer und molekularer Ebene. Seit dem ersten Mutation-Update für das OTC-
Gen, in welchem 32 Mutationen (große Deletionen ausgeschlossen) beschrieben wurden
(Tuchman 1993), sind drei weitere Updates erschienen (Tuchman u. Plante 1995b;
Tuchman et al. 2002; Yamaguchi et al. 2006). Das zuletzt erschienene enthält eine
Zusammenfassung von 341 Mutationen sowie 29 nicht pathogene Mutationen und
Polymorphismen.
Kapitel I – A: Einführung 2
Die Kenntnis des großen Spektrums der Erkrankung ist erforderlich, um Patienten
rechtzeitig diagnostizieren zu können und schließlich durch Einleiten entsprechender
Therapien die Folgen der Hyperammonämien zu verhindern.
Kapitel I – B: Biochemische Grundlagen 3
B Biochemische Grundlagen
1 Der Harnstoffzyklus
Der Harnstoffzyklus, nach den Entdeckern Hans Krebs und dem Medizinstudenten Kurt
Henseleit 1932 auch als Krebs-Henseleit-Zyklus bezeichnet, war der erste bekannte
zyklisch verlaufende Stoffwechselweg.
Er dient zum einen der Entgiftung der beim Abbau von Aminosäuren entstehenden
Ammoniumionen durch die Bildung von Harnstoff in der Leber und zum anderen der
Synthese von Arginin aus Ornithin.
Die Harnstoffbiosynthese findet in den periportalen Hepatozyten der Leber in zwei
Kompartimenten statt, in den Mitochondrien und im Cytoplasma.
Es handelt sich um einen mehrstufigen Kreisprozeß, in dessen Verlauf ein Molekül
Harnstoff aus je einem Molekül Ammoniak und Bicarbonat sowie dem Aminostickstoff
von Aspartat zusammengesetzt wird.
MITOCHONDRIUM
HCO3¯ + NH4+
2 ATP
N-Acetyl- glutamat
2 ADP + Pi
Carbamylphosphat
Carbamylphosphat Synthetase
CPS I
Ornithin
Citrullin
Pi
OrnithintranscarbamylaseOTC
Aspartat
Argininosuccinat
Arginin
CYTOPLASMA
ATP AMP+PPi
Fumarat
H20 Harnstoff
Argininosuccinatlyase ASL
Arginase
Argininosuccinat Synthetase
Bild 1-1 Die Harnstoffbiosynthese. Der Zyklus ist in der Leber auf zwei Zellkompartimente (Mitochondrium und Cytosol) verteilt. Die mitochondriale Ornithintranscarbamylase katalysiert die Übertragung des Carbamylrestes auf die Aminosäure Ornithin.
Ornithin-Citrullin Antiport
Kapitel I – B: Biochemische Grundlagen 4
Durch das mitochondriale Enzym Carbamylphosphat-Synthetase I wird aus Bicarbonat
und Ammoniak Carbamylphosphat gebildet. Unentbehrlicher Cofaktor dieser Reaktion
ist N-Acetylglutamat, das als allosterischer Aktivator wirkt und durch die N-Acetyl-
Glutamat-Synthetase aus Glutamat und Acetyl-CoA gebildet wird.
Der Carbamylrest von Carbamylphosphat wird im nächsten Schritt auf die
nichtproteinogene Aminosäure Ornithin übertragen, wobei Citrullin entsteht; diese
Reaktion wird von der Ornithintranscarbamylase katalysiert.
Citrullin tritt durch die Mitochondrienmembran in das Cytosol über, wo es dann durch
die Argininosuccinat-Synthetase mit Aspartat zu Argininosuccinat kondensiert wird.
Schließlich spaltet die Argininosuccinatlyase das Argininosuccinat in Fumarat und
Arginin. Arginase spaltet hydrolytisch aus Arginin Harnstoff ab, unter gleichzeitiger
Freisetzung von Ornithin.
Das gebildete Ornithin wird durch den Ornithincarrier aktiv in das Mitochondrium
eingeschleust und steht dort wieder als Trägermolekül für den Carbamylrest zur
Verfügung.
Die Effizienz des Harnstoffzyklus wird durch die Glutaminasereaktion, durch welche
Ammonium aus Glutamin freigesetzt wird, in den Mitochondrien der periportalen
Hepatozyten verbessert. Die Umsatzrate des Harnstoffzyklus wird durch eine Erhöhung
des Ammoniumangebotes an das erste Enzym im Harnstoffzyklus gesteigert. So führt
ein Anstieg der Plasma-Aminosäure-Konzentration zu einem proportional höheren
Anstieg der Harnstoffbildung. Während die Induktion der Harnstoffzyklusenzyme bei
einer kontinuierlich höheren Proteinzufuhr Stunden bis Tage dauern kann, wird über die
Steigerung des Glutamatspiegels vermehrt N-Acetylglutamat gebildet, was eine
Schlüsselrolle bei der schnell wirkenden Regulation des Harnstoffzyklus spielt.
Kapitel I – B: Biochemische Grundlagen 5
Glutamat
NH4+
Glutamin- synthetase
Glutamin
CYTOSOL Perivenöser Hepatozyten
Tabelle I-1 Die Enzyme des Harnstoffzyklus.
Enzyme Abkürzung Kompartiment Vorkommen im Gewebe
N-Acetylglutamat-Synthetase
NAGS EC 2.3.1.1; MIM 237310
Mitochondriale Matrix
Leber, Intestinum, Nieren (in Spuren), Milz
Carbamylphosphat-Synthetase
CPS I EC 6.3.4.16; MIM 237300
Mitochondriale Matrix
Leber, Intestinum, Nieren (in Spuren)
Ornithintranscarb-amylase
OTC EC 2.1.3.3; MIM 311250
Mitochondriale Matrix
Leber, Intestinum, Nieren (in Spuren)
Argininosucchinat-Synthetase
ASS EC 6.3.4.5; MIM 215700
Cytoplasma Leber, Nieren, Fibroblasten, Gehirn (in Spuren)
Argininosucchinat-Lyase
ASL EC 4.3.2.1; MIM 207900
Cytoplasma Leber, Nieren, Gehirn, Fibroblasten
Arginase ARG I EC 3.5.3.1; MIM 207800
Cytoplasma Leber, Erythrozyten, Nieren, Linse, Gehirn (in Spuren)
Die Aktivität der Enzyme des Harnstoffzyklus konnte bereits in der 10.-13.
Schwangerschaftswoche (SSW) nachgewiesen werden.
Ungefähr in der 20. SSW entspricht die Enzymaktivität der Aktivität zum
Geburtszeitpunkt und beträgt ca. 50-90 Prozent der bei Erwachsenen vorhandenen
Enzymaktivität (Raiha et al. 1968; Baig et al. 1992).
1.1 Alternative Wege der Ammoniakeliminierung Eine Reduktion der Harnstoffbiosynthese in den periportalen Hepatozyten führt zu
einem Anstieg der Ammoniakkonzentration.
Eine Fixierung von Ammoniak als Glutamin
wird durch die Glutaminsynthetasereaktion
gewährleistet.
Die Glutaminsynthetase ist ausschließlich in den perivenösen Hepatozyten lokalisiert.
Die über die Pfortader zuströmenden Ammoniumionen werden zu etwa 70 Prozent
durch die periportale Harnstoffbiosynthese entgiftet. Die restlichen 30 Prozent werden
durch die Glutaminbiosynthese entgiftet. Durch diese Zonierung werden die nicht im
Harnstoffzyklus fixierten Ammoniumionen eliminiert, bevor sie die systemische
Zirkulation erreichen.
Kapitel I – B: Biochemische Grundlagen 6
Die Existenz von Stoffwechselwegen, deren Produkte eine Alternative zur
Harnstoffbiosynthese sind, wurde schon vor sehr langer Zeit gezeigt. Man stellte fest,
dass durch die Gabe von Benzoat oder Phenylbutyrat die Ausscheidung von Harnstoff
abnahm und anstatt dessen Hippurat beziehungsweise Phenylacetylglutamin im Urin
ausgeschieden wurden (Lewis 1914; Shiple u. Sherwin 1922).
Brusilow et al. nutzten diese Ergebnisse als therapeutischen Ansatz bei Patienten mit
Harnstoffzyklusdefekten (Brusilow et al. 1980).
Die folgende Darstellung soll den alternativen Stoffwechselweg der
Stickstoffeliminierung bei Patienten mit OTC-Mangel durch die Verabreichung von
Benzoat und Phenylbutyrat verdeutlichen.
Ein für Glycin (= 1 Aminogruppe) spezifisches Enzym, Benzoyl CoA-
Glycinacyltransferase (EC 2.3.1.13), katalysiert die Bildung einer Peptidverknüpfung,
die für die Synthese von Hippurat erforderlich ist. Ein für Glutamin (= 2
Aminogruppen) spezifisches Enzym, Phenylacetyl CoA-Glutaminacetyltransferase (EC
2.3.1.68), katalysiert die Bildung einer Peptidverknüpfung, die für die Synthese von
Phenylacetylglutamin erforderlich ist.
Glycin
Glutamin
Urin
2
1
Bild 1-2 Alternative Stoffwechselwege zur Stickstoffeliminierung bei Patienten mit OTC-Mangel. Die Enzyme Benzoyl CoA-Glycin-Acyltransferase (1) sowie Phenylacetyl CoA-Glutamin-Acetyltransferase (2) sind an den Umwandlungen beteiligt. Alanin, Glutamat, Serin, Glycin und Glutamin fungieren als Stickstoffatomdonatoren bei der Bildung der beiden ausscheidungsfähigen Produkte Hippurat und Phenylacetylglutamin. (Brusilow und Horwich 1995)
Phenylacetat
Kapitel I – B: Biochemische Grundlagen 7
Diese beiden mitochondrialen Enzyme sind in Leber und Niere lokalisiert (Webster et
al. 1976; Killenberg u. Webster 1980; Moldave u. Meister 1957).
Glycin wird aus Serin resynthetisiert, welches durch Transamination mit Alanin oder
Glutamat als Aminogruppendonatoren, aus 3-Phosphohydroxypyruvat entsteht.
Glutamin entsteht durch Amidation von Glutamat. Durch die Verabreichung von
Benzoat und Phenylbutyrat kann Stickstoff in alternative Stoffwechselwege einfließen
und somit den Harnstoffzyklus entlasten.
Kapitel I - B: Biochemische Grundlagen 8
2 Die Ornithintranscarbamylase
2.1 Allgemeine Aspekte Die Ornithintranscarbamylase (OTC, EC 2.1.3.3) ist ein mitochondriales Matrixenzym,
welches hauptsächlich in der Leber und in geringerem Maß auch in der Mucosa des
Dünndarms exprimiert wird. Die Untereinheiten werden an den freien Polyribosomen
im Cytoplasma als Precursor von etwa 40 kDa synthetisiert und posttranslational in das
Mitochondium geschleust (Horwich et al. 1985a). OTC wurde eingehend als ein Modell
zur Erklärung, wie cytosolisch synthetisierte Precursor-Proteine in das Mitochondrium
geschleust werden, studiert.
Die humane OTC wurde erstmals 1978 gereinigt und als Homotrimer mit 322
Aminosäuren und einem Molekulargewicht von etwa 36000 Daltons per
Polypeptidkette dargestellt (Kalousek et al. 1978).
Derzeit sind 341 Mutationen sowie 29 nicht pathogene Mutationen und
Polymorphismen beschrieben (Yamaguchi et al. 2006), und zahlreiche biochemische
Studien von mutanter humaner OTC sind berichtet worden. Für ein besseres
Verständnis der Effekte von Mutationen im OTC-Gen sind Strukturanalysen des
Enzyms unerlässlich. Mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse wurde die dreidimensionale
Struktur der humanen OTC aufgeklärt (Shi et al. 1998).
2.2 Struktur der OTC Die humane OTC gehört zur Gruppe der Transcarbamylase-Enzyme. Diese Gruppe von
Enzymen ist für die Übertragung einer Carbamylgruppe von Carbamylphosphat (CP)
auf die Aminogruppe eines weiteren Substrates, welches hier L-Ornithin ist,
verantwortlich.
Kristallographische Untersuchungen der katabolischen Pseudomonas aeruginosa OTC
und der anabolischen Pseudomonas furiosus OTC (Villeret et al. 1995 u. Villeret et al.
1998) sowie der anabolischen Escherichia coli OTC (Jin et al. 1997 u. Ha et al.1997)
und der humanen OTC (Shi et al. 1998), zeigten eine ähnliche Tertiärstruktur der
Enzyme, welche auch der katalytischen Untereinheit der Aspartat-Transcarbamylase
(ATC) ähnlich ist.
Kapitel I – B: Biochemische Grundlagen 9
Jede Untereinheit weist eine bilobale Struktur mit einer Bindungsstelle für CP an der
Basis der Spalte zwischen den beiden Lappen und eine L-Ornithin Bindungsstelle am
Rand der Spalte auf. Binden beide Substrate, schwingt der SMG-Loop (Ser-Met-Gly-
Motiv; Reste 263-286 in der humanen OTC) in Richtung des aktiven Zentrums, um die
Spalte zu verdecken und eine Interaktion der beiden Substrate zu ermöglichen (Shi et al.
2001).
Durch die experimentelle Bestimmung der ultravioletten Absorption konnte gezeigt
werden, dass das Binden des ersten Substrates CP an die humane OTC die größte
Konformationsänderung bewirkt. Um die Rolle von CP im Hinblick auf die
Konformationsänderung zu klären und endgültig die Substraterkennung des Enzyms zu
verstehen, war es notwendig, die Strukturen des Binärkomplexes der humanen OTC mit
CP als Substrat zu analysieren (Shi et al. 2001).
2.2.1 Überblick über die Struktur Die humane OTC ist ein Homotrimer bestehend aus exakt 3 symmetrischen Monomeren
mit je einem aktiven Zentrum (Bild 1-3).
C
ORN-Domäne CP-Domäne
H1
N
H12 H5
Bild 1-3 Dreidimensionale Darstellung des Monomers der humanen OTC (Peptidrückgrat in Banddarstellung). α-Helices sind in rot gezeigt, ß-Stränge in blau, pink sind die Helices 1, 5 und 12. Helices 5 und 12 verbinden die CP- und ORN-Domäne. N: N-terminales Ende. C: C-terminales Ende.
Kapitel I – B: Biochemische Grundlagen 10
Bild 1-5 Darstellung der Sekundärstruktur der humanen OTC eines Monomers. Bei den kursivhervorgehobenen Buchstaben handelt es sich um konservierte Motive. Die Helices sind mit H (rot) benannt und dieß-Faltblätter mit S (blau). "a" wurde zur Beibehaltung der einheitlichen Nummerierung der wesentlichen Helices vonunterschiedlichen OTC und ATC eingefügt. (Shi et al. 2001)
S L V F P E A E N R K W T I M A V M V S L L T D Y S P Q L Q K P K FH12
P L L Q G K S L G M I F E K R S T R T R L S T E T G F A L L G G H P C F P T T Q D H2S2 S3
I H L G V N E S L T D T A R V L S S M A D A V L A R V Y K Q S D L D T L A K E A S H3 H4S4
I P I I N G L S D L Y H P I Q I L A D Y L T L Q E H Y S S L K G L T L S C F G D G H5S5
A F Q G Y Q V T M K T A K V A A S D W T F L H C L P R K P E E V D D E V F Y S P R H10 H11S10
K V Q L K G R D L L T L K N F T G E E I K Y M L W L S A D L K F R I K Q K G E Y L H1a H1
N N I L H S I M M S A A K F G M H L Q A A T P K G Y E P D A S V T K L A E Q Y A K H6 H6a H7S7
E N G T K L L L T N D P L E A A H G G N V L I T D T W I S M G R E E E K K K R L Q H8a H9 H8 S8 S9
Jede Polypeptidkette bildet zwei strukturelle Domänen: eine CP-(Carbamylphosphat-)
Domäne oder polare Domäne und eine ORN-(Ornithin-) Domäne oder auch äquatoriale
Domäne genannt (Shi et al. 1998). Die Domänen werden durch zwei lange Helices
(Helix 5 und 12) verbunden, und jede Domäne besitzt zentral eine parallele ß-
Faltblattstruktur, die von α-Helices und Loops (Schleifen) mit α/ß Topologie umgeben
ist. Die Sekundärstruktur ist in Bild 1-5 dargestellt.
Bild 1-4 Darstellung des Trimers der humanen OTC mit Blickrichtung entlang der dreigefaltetenSymmetrieachse in B und Seitenansicht in A. Das Trimer setzt sich aus drei identischenUntereinheiten zusammen, welche in grün, blau und rot dargestellt sind.
A B
Kapitel I – B: Biochemische Grundlagen 11
Das aktive Zentrum ist zwischen zwei Domänen in einer Spalte lokalisiert und wird von
den angrenzenden Monomeren geteilt. Die konservierten Motive Ser-Thr-Arg-Thr-Arg
(Reste 90-94) und His-Pro-Xaa-Gln (Reste 168-171), welche CP binden, befinden sich
am N-terminalen Ende von Helix 2 und Helix 5. Ser90, Thr91, Arg92, Thr93 und Arg94
von einer Untereinheit und His117 von der benachbarten Untereineinheit sind in die
Bindung der Phosphatgruppe von CP involviert. Gln171, Cys303 und Arg330 sind an der
Interaktion mit Stickstoff von CP beteiligt. Thr93, Arg141 und His168 sind in die Bindung
an Carbonyl-Sauerstoff involviert (Shi et al. 2001).
Die hochkonservierte Aminosäure Lys88, deren Konformation durch die Interaktion mit
dem Aminosäurerest Asp165 aufrechterhalten wird, scheint eine Schlüsselrolle beim
Binden des zweiten Substrates zu spielen. Eine chemische Modifikation dieser
Aminosäure führt zu einem kompletten Verlust der Enzymaktivität (Valentini et al.
1996). Drei Wassermoleküle, Wasser-359, Wasser-460 und Wasser-439, sind nur in der
Binärstruktur, dem OTC-CP-Komplex, gefunden worden. Diese Wassermoleküle sind
wichtig zur Erhaltung der Konformation der Seitenketten der Aminosäuren Asn199 und
Asp263, um das zweite Substrat zu binden. Die Position von Wasser-460 scheint auch
eine ideale Bindungsstelle für Metall-Ionen wie Zn(II) oder Cd(II) zu sein. Zn(II) oder
Cd(II)-Ionen können fest an die OTC binden (Kuo et al. 1990 und Aoki et al. 1988).
Die Struktur des Binärkomplexes liefert eine potentielle Metall-Bindungsstelle.
Beteiligte Strukturen sind die Seitenketten von Cys303 und zwei Wassermoleküle,
welche in Gegenwart von CP mit dem Phosphat-Sauerstoff von CP, dem Carbonyl-
Sauerstoff von Leu304, den Seitenketten der Aminosäuren Asp263 und Asn199 und
anderen Wassermolekülen interagieren. Das Nε2-Atom von His168 bildet eine starke
Wasserstoffbrückenbindung mit dem Carbonyl-Sauerstoff von CP, so dass die
Seitenkette von His168 als Ligand nicht zur Verfügung steht und die Zn(II)-Bindung nur
schwach ist. Die Seitenkette von His168 kann in Abwesenheit von CP Zn(II) durch einen
leichten Konformationswechsel binden. Die starken Interaktionen zwischen Zn(II) und
den Aminosäureresten der zwei Domänen bewirken eine Enzymisomerisation (Shi et al.
2001).
Kapitel I – B: Biochemische Grundlagen 12
2.2.2 Wechselwirkungen der Untereinheiten Die Wechselwirkungen der Untereinheiten gehen hauptsächlich von zwei Regionen aus:
Aminosäuren 89-99 und Aminosäuren 113-134. Reste von Aminosäuren dieser
Regionen sind auch in die Bindung der Phosphatgruppe von CP involviert. Die
Wechselwirkungen zwischen Arg92 und Glu122 sowie zwischen Arg94 und Phe110 sind in
allen OTCasen und ATCasen konserviert und möglicherweise zur Aufrechterhaltung
der Trimerstruktur und der katalytischen Aktivität von Bedeutung (Allewell et al.
1999). Obwohl die Aminosäure 91 sowohl Glycin, Methionin als auch Leucin sein
kann, scheinen die Wechselwirkungen zwischen Oγ1 von Thr91 und dem Rückgrat N von
His117 funktionelle Bedeutung im Hinblick auf die Substrataffinität von CP zu haben
(Shi et al. 2001).
2.2.3 Substraterkennung Das konservierte Ser90-Thr91-Arg92-Thr93-Arg94-Motiv der humanen OTC gilt als
Bindungsstelle für CP. Die spezifische räumliche Anordnung der Aminosäurereste
sowie das positiv geladene Arginin zusammen mit den Dipolwechselwirkungen der
Helix 2, stellen eine ideale Bindungsstelle der negativ geladenen Phosphatgruppe von
CP dar. Obwohl Thr91 und Arg94 nicht direkt an der Bindung von Carbamylphosphat
beteiligt sind, kommt diesen beiden Aminosäuren eine funktionelle Bedeutung zu. Die
Seitenkette von Thr91 interagiert mit His117 von der angrenzenden Untereinheit, und
diese Wechselwirkung ist von großer Bedeutung für die Bindung von CP. Eine ähnliche
Rolle scheint die Interaktion der Seitenkette der Aminosäure Arg94 mit dem Carbonyl-
Sauerstoff der Aminosäure Phe110 von der benachbarten Untereinheit zu haben (Shi et
al. 2001).
Das zweite konservierte Motiv der humanen OTC, His168-Pro169-Xaa170-Gln171, ist in die
Bindung der Carbamylgruppe von CP involviert. Die absolute Konservierung dieses
Motivs in der Familie der Transcarbamylasen weist auf eine essentielle Rolle für die
Enzymfunktion hin (Shi et al. 2001).
Kapitel I – B: Biochemische Grundlagen 13
Das konservierte His302-Cys303-Leu304-Pro305-Motiv in der humanen OTC ist Teil der
L-Ornithin-Bindungsstelle (Kuo et al. 1990 u. Kraus et al. 1985). Es wurde mit Hilfe
von Mutationen und chemischer Modifikation gezeigt, dass Cys303 essentiell für die
Bindung des zweiten Substrates ist (Kuo et al. 1990; McDowall et al. 1990; Marshell et
al. 1980). Die Kristallstruktur liefert dafür nicht den direkten Beweis, aber das Nε-Atom
von L-Ornithin kann mit dem Sγ-Atom von Cys303 interagieren (Shi et al. 2000).
Die derzeitige Kristallstruktur zeigt das konservierte Motiv Asp263-Xaa264-Xaa265-
Xaa266-Ser267-Met268-Gly269 des flexiblen SMG-Loops der humanen OTC als
Hauptbindungsstelle für L-Ornithin. Es handelt sich dabei um eine sogenannte
induzierte Bindungstasche. Durch Bindung des zweiten Substrates wird eine
Konformationsänderung bewirkt, welche die flexible Schleife in das aktive Zentrum
bringt (Shi et al. 2001).
Kinetische Studien lassen ein geordnetes Binden und Dissoziieren der Substrate an die
OTC erkennen. Zuerst bindet CP, dann L-Ornithin, Citrullin dissoziiert zuerst und
Phosphat zuletzt (Goldsmith et al. 1993 u. Porter et al. 1969).
Die Struktur des Binärkomlexes liefert eine klare Erklärung dafür. CP bindet in einer
tiefen Tasche und im Tertiärkomplex; d.h. nach zusätzlicher Bindung von L-Ornithin ist
CP komplett durch das zweite Substrat und den SMG-Loop verdeckt (Shi et al. 2000).
Die Bindungsstelle für CP ist zugänglicher in der Binärstruktur, da sich der SMG-Loop
abseits des aktiven Zentrums befindet. Dies lässt klar erkennen, dass CP zuerst binden
muss, bevor das aktive Zentrum durch Binden des zweiten Substrates verschlossen wird
(Shi et al. 2001).
Kapitel I – B: Biochemische Grundlagen 14
3 Struktur des OTC-Gens
Das humane OTC-Gen wurde bereits in den 80er Jahren auf dem kurzen Arm des X-
Chromosoms (Xp21.1) lokalisiert (Lindgren et al. 1984), geklont und sequenziert
(Horwich et al., 1984; Hata et al., 1988). Es unterliegt der X-Chromosom-Inaktivierung
bei Frauen, was schon früh mittels in situ Enzymassays in der Leber von heterozygoten
Frauen mit OTC-Mangel nachgewiesen wurde (Ricciuti et al. 1976).
Bild 1-6 X-Chromosom mit Darstellung der Lokalisation des OTC-Gens und angrenzender Abschnitte.
Kapitel I – B: Biochemische Grundlagen 15
Das OTC-Gen ist 73 kb groß, enthält 10 Exons und 9 Introns. Exon 5 ist mit 154 bp das
größte Exon, während Exon 7 mit 54 bp das kleinste Exon ist. Das längste Intron, Intron
4, enthält 21.7 kb und das kürzeste ist Intron 7 mit 80 bp. Alle Exon /Intron Grenzen
stimmen mit der GT-AG-Regel überein: die Introns beginnen mit GT als
Spleißdonorstelle und enden mit AG als Spleißakzeptorstelle.
Enhancer 230 bp
TATAboxes
CAAT boxes
Poly-A-Signalsequenz
NegativRegulierendes Element
Positiv Regulierende Elemente
ATG Intron 1
14.7 kbProtein leader sequenz
Exon1 77 bp
Exon 2139 bp
Exon 3 82 bp
Exon 488 bp
Ser-Thr-Arg-Thr-Arg
Teil der Carbamylphosphat-Bindungsstelle
Intron 3 12.5 kb
Intron 4 21.7 kb
Exon 5154 bp
Intron 5 1.9 kb
Exon 6 123 bp
Exon 754 bp
Exon 8150 bp
Intron 780 bp
Intron 82.9 kb
Exon 9138 bp
Exon 10 60 bp
TGA
Phe-Leu-His-Cys-Leu-Pro
Teil der Ornithin- bindungsstelle
Intron 99.6 kb
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’ 5’
Intron 2 2.3 kb
Bild 1-7 Schematische Darstellung des OTC-Gens Das erste Exon beginnt mit dem Triplett ATG(Startcodon) und Exon 10 endet mit dem Stopcodon TGA.
Kapitel I – B: Biochemische Grundlagen 16
* * * -550 * * * * -500 * *
..gagccccaggactgagatatttttactataccttctctatcatcttgcacccccaaaatagcttccagggcacttctatttgtttttgtggaaagactggcaattagaggtagaaa * * -450 * * * * -400 * * * * agtgaaataaatggaaatagtactactcagggctgtcacatctacatctgtgtttttgcagtgccaatttgcattttctgagtgagttacttctactcaccttcacagcagccagtac -350 * * * * -300 * * * * -250 * cgcagtgccttgcatatattatatcctcaatgagtacttgtcaattgattttgtacatgcgtgtgacagtataaatatattatgaaaaatgaggaggccaggcaataaaagagtcagg * * * -200 * * * * -150 * * *
atttcttccaaaaaaaatacacagcggtggagcttggcataaagttcaaatgctcctacaccctgccctgcagtatctctaaccaggggactttgataaggaagctgaagggtgatat * -100 * * * * -50 * * * * tacctttgctccctcactgcaactgaacacatttcttagtttttaggtggcccccgctggctaacttgctgtggagttttcaagggcatagaatcgtcctttacacaattaaaagaag +1
ATG CTG TTT AAT CTG AGG ATC CTG TTA AAC AAT GCA GCT TTT AGA AAT GGT CAC AAC TTC ATG GTT CGA AAT TTT CG gtaagtgatggtcag
agacttgggtttgatttaggaatcatggtgatgcataaaactatattctgcagtaa---Intron 1---cagtaaaacaatgaatcaccatagtacatgggtcttttctgaaataca Exon 2→
tatttctcccttttaaatctctttttacag G TGT GGA CAA CCA CTA CAA AAT AAA GTG CAG CTG AAG GGC CGT GAC CTT CTC ACT CTA AAA AAC G
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ttacgttccagttactaccagtcccctttttttaaaggca---Intron 2---taaacaatattttaaacacttatttgggggctagttattacttattttctaataaagaatatgt Exon 3→
tttaaa-cataatttatatataagatatattttaattctattcttgtccttgatttatag TAT TTG CCT TTA TTG CAG GGG AAG TCC TTA GGC ATG ATT TTT a A
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ACG GCC CG gtttgtaaatattttcttctctccaaagctgatttcagaatctgatggataaatttcaaaaat---Intron 4---tcttatattaaataaggcattattaagca Exon 5→
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GAC ACC CTT GCT AAA GAA GCA TCC ATC CCA ATT ATC AAT GGG CTG TCA GAT TTG TAC CAT CCT ATC CAG ATC CTG GCT GAT TAC CTC G
ACG CTC CAG gttggtttatttatttgtcttacaaaagagcaaaatcaataattcctgacttgctttaagtgaaacagtttacttaaatc---Intron 5---aagcgaattta Exon 6→
cgcctggatttcatctccttcatcccgtgccttttag GAA CAC TAT AGC TCT CTG AAA GGT CTT ACC CTC AGC TGT TTC GGG GAT GGG AAC AAT ATC G A
CTG CAC TCC ATC ATG ATG AGC GCA GCG AAA TTC GGA ATG CAC CTT CAG GCA GCT ACT CCA AAG gtagggaaactttttgccttgaaactaacccct Exon 7→
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GTA ACC AAG TTG GCA GAG CAG TAT GCC AAA GAG gtatgctctttacatgtaaagctattattgccttttactgtcccatgaagttatttaaccagcgtgtttatgt Exon 8→
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AGC ATG GGA CGA GAA GAG GAG AAG AAA AAG CGG CTC CAA GCT TTC CAA GGT TAC CAA GTT ACA ATG AAG gtacaaattgatgctctctcaggtt A G G Exon 9→
cattaattccattcatgaaggccagaa---Intron 8---gaaaacaaatatgactgccacatataatagtcaaaaagtggtcttatccccatctctttag ACT GCT AAA
GTT GCT GCC TCT GAC TGG ACA TTT TTA CAC TGC TTG CCC AGA AAG CCA GAA GAA GTG GAT GAT GAA GTC TTT TAT TCT CCT CGA TCA
CTA GTG TTC CCA GAG GCA GAA AAC AGA AAG TGG ACA ATC ATG gtaagcaagaaacaaggaatggaggataagttctttgtgtggttccaacttggtcattcat
gcctttggggaaataataagcaagtgagattatccaactacat---Intron 9---aacctaattcaccttctctaggtccctaagcagactgtcgctaatgtttatccatttcttt Exon 10→
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Bild 1-8 Darstellung der genomischen Nukleotidsequenz des humanen OTC-Gens einschließlichder 5'- und 3'-Region und der Intron-Exon Grenzen. Position +1 entspricht dem ersten Nukleotid desStartcodon. Die Nukleotide vom Startcodon aufwärts sind negativ nummeriert. Die 10 Exons sind grauunterlegt. Das vollständige Gen umfasst 73kb. (Hata et al. 1988; Matsuura et al. 1993)
Kapitel I – B: Biochemische Grundlagen 17
Die OTC mRNA kodiert für das Precursor OTC-Protein, bestehend aus 354
Aminosäuren einschließlich der Signalsequenz (Brusilow u. Horwich 1995). Wie die
meisten mitochondrialen Proteine wird es im Zellkern kodiert und in den Matrixraum
der Mitochondrien transloziert. Die Zielsteuerung in die mitochondriale Matrix erfolgt
durch eine aminoterminal lokalisierte Signalsequenz aus 32 Aminosäuren, von denen
einige basisch sind und eine sauer ist. Horwich et al. haben gezeigt, dass das
Leaderpeptid der humanen Pre-OTC ausreichend Information enthält, um das Protein in
das Mitochondrium zu importieren (Horwich et al. 1985a). Der mittlere Abschnitt
dieser Sequenz, besonders der Argininrest in Position 23, ist essentiell für die Bindung
an die mitochondriale Membran, die Aufnahme in die mitochondriale Matrix und die
mitochondriale Umformung zur nativen OTC. Die Bedeutung wurde anhand von
Einzelbasen Substitutionen untersucht. Die Substitution von Arginin an der Position 23
durch Glycin ergab bei Analyse des Vorläuferproteins einen kompletten
Funktionsverlust. Dies könnte durch eine Partizipation in eine lokale Sekundärstruktur,
möglicherweise eine α-Helix, zustande kommen (Horwich et al. 1985b und 1986).
Das erste Exon enthält sowohl beim humanen als auch beim murinen OTC-Gen die
ersten 26 Codons des Signalpeptides. Es wird diskutiert, dass diese für den Transport
des Proteins in das Mitochondrium essentielle Region der Presequenz aus einer
Genfusion während der Evolution hervorgegangen ist und die Ornithintranscarbamylase
dadurch das Signal für die mitochondriale Lokalisation erhielt (Hata et al. 1986). Der
Import schließt eine Reihe von molekularen Interaktionen ein. Da nur entfaltete
Matrixproteine in das Mitochondrium transloziert werden können, wird das Protein
durch Assoziation an das cytosolische Chaperon Hsp70 in einem partiell entfalteten
Zustand gehalten. Die überwiegend positiv geladene Signalsequenz wird durch einen
Rezeptorkomplex in der äußeren Mitochondrienmembran erkannt und durch die
Membranen transloziert. In einem energieabhängigen Prozeß bindet die Signalsequenz
an das mitochondriale Hsp70. In zwei aufeinander folgenden Schritten wird im
Matrixraum des Mitochondriums das Signalpeptid durch Peptidasen abgespalten. Die
Faltung und Zusammensetzung zur nativen Form wird durch einen Hsp60-Komplex in
Kooperation mit einer Hsp10 Komponente gewährleistet (Brusilow u. Horwich 1995).
Kapitel I – C: Klinische und molekulare Grundlagen 18
C Klinische und molekulare Grundlagen
1 Erbliche Harnstoffzyklusdefekte
Die Hauptaufgabe des Harnstoffzyklus ist die Bildung von Harnstoff als unschädliches
Stickstoffausscheidungsprodukt. Ist die Aktivität dieses Stoffwechselweges
eingeschränkt, resultiert eine Akkumulation von Stickstoff in Form des neurotoxischen
Ammoniaks in Blut und Gewebe.
Für jedes der im Harnstoffzyklus beteiligten Enzyme sind erbliche Defekte bekannt. Die
entsprechenden Krankheiten sind der N-Acetylglutamat-Synthetase (NAGS-) Mangel.
der Carbamylphosphat-Synthetase I (CPS I-) Mangel, der Ornithintranscarbamylase
(OTC-) Mangel, die Citrullinämie Typ I oder Argininosucchinat-Synthetase (ASS-)
Mangel, die Argininbernsteinsäure-Krankheit oder Argininsucchinat-Lyase (ASL-)
Mangel und die Hyperargininämie bzw. der Arginase Mangel. Harnstoffzyklusdefekte
gehören zu den häufigsten Stoffwechselerkrankungen mit einer kumulativen Inzidenz
von ca. 1:8000 Neugeborenen. Am häufigsten kommt mit 1:14.000 der X-chromosomal
vererbte OTC-Mangel vor; die anderen, autosomal-rezessiv vererbten Krankheiten
treten mit einer Frequenz von etwa 1:60.000 auf und die Hyperargininämie nur mit
1:350.000 (AWMF-Leitlinien-Kindliche Stoffwechselkrankheiten).
Tabelle I-2 Erbliche Harnstoffzyklusdefekte. NAGS Mangel: N-Acetylglutamat-Synthetase Mangel. HHH Syndrom: Hyperammonämie-Hyperornithinämie-Homocitrullinurie Syndrom oder Ornithin Translocase Mangel
Erkrankung Gen Chromosom Vererbung
NAGS Mangel NAGS 17q21.3 autosomal-rezessiv
Carbamylphosphat Synthetase I Mangel CPS I 2q35 autosomal-rezessiv
Ornithintrans-carbamylase Mangel OTC Xp21.1 X-Chromosomal
Citrullinämie Typ I ASS 9q34 autosomal-rezessiv
Argininosuccinat-acidurie ASL 7cen-q11.2 autosomal-rezessiv
Arginase Mangel ARG1 6q23 autosomal-rezessivHHH Syndrom SLC25A15 13q14 autosomal-rezessiv
Kapitel I – C: Klinische und molekulare Grundlagen 19
Weitere genetische Defekte der Ammoniakentgiftung sind beispielsweise die
Citrullinämie Typ II (Citrinmangel durch Defekt des mitochondrialen Asp-Glu-
Transporters), die Lysinurische Proteinintoleranz durch eine Transportstörung
dibasischer Aminosäuren sowie das autosomal-dominant erbliche Hyperinsulinismus-
Hyperammonämie Syndrom und die Hypoprolinämie (Ornithinstoffwechselstörung).
1.1 Klinisches Bild Ammoniak ist neurotoxisch und angeborene Störungen des Harnstoffzyklus führen über
eine Hyperammonämie zu schweren neurologischen Problemen. Die einzelnen Defekte
lassen sich durch spezifische biochemische Befunde abgrenzen.
Definitionsgemäß spricht man von einer Hyperammonämie, wenn Ammoniak (NH3) im
Blut mehr als 80 µmol/l bzw. bei Neugeborenen mehr als 110 µmol/l beträgt. Eindeutig
abklärungsbedürftige Hyperammonämien liegen vor, wenn beim Neugeborenen die
Ammoniakkonzentration >150µmol/l und jenseits des Neugeborenenalters >100µmol/l
betragen. Patienten mit Störungen im Harnstoffzyklus können in jedem Alter
symptomatisch werden, besonders jedoch zu Zeiten eines erhöhten Proteinkatabolismus,
wie es zum Beispiel in der Neonatalperiode, im späten Säuglingsalter durch die
Umstellung auf proteinreiche Nahrung und dem Beginn einer Periode mit häufigen
interkurrenten Infekten sowie in der Pubertät der Fall ist.
Die akute Symptomatik wird durch das Ausmaß der Hyperammonämie bedingt. Beim
Neugeborenen treten nach einer kurzen Symptomfreiheit Trinkschwäche und Erbrechen
auf. Die neurologische Symptomatik wie eine gesteigerte Irritabilität, Änderungen im
Muskeltonus, Ataxie, grobschlägigen Tremor, Krampfanfälle sowie Lethargie und
Koma entwickelt sich in dramatischer Weise. Infolge einer Gerinnungsstörung kann es
zu einer gefährlichen Hirnblutung kommen. Beim älteren Säugling ist die klinische
Symptomatik variabel und oft weniger drastisch als beim Neugeborenen. Zu den schon
genannten Symptomen beim Neugeborenen können eine Gedeih- und
Entwicklungsstörung sowie Verhaltensauffälligkeiten kommen. Im Kindes- und
Erwachsenenalter findet man episodisch auftretende metabolische Enzephalopathien.
Die häufigsten Symptome bei solchen hyperammonämischen Episoden sind Inappetenz,
Lethargie, Reizbarkeit, Agitiertheit, Verhaltensauffälligkeiten bis hin zu Verwirrtheit,
aber auch Erbrechen, migräneartige Kopfschmerzen und Ataxie. Auch eine rasche
Verschlechterung der Klinik bis hin zum Koma und Tod ist möglich.
Kapitel I – C: Klinische und molekulare Grundlagen 20
Eine chronische Hyperammonämie bzw. immer wieder auftretende Hyperammonämien
führen zur Hirnatrophie und psychomotorischer Retardierung.
Das unterschiedliche Ausmaß und die Schwere der Erkrankungen wird bestimmt von
der enzymatischen Restaktivität (als Resultat des Genotyps sowie bei Frauen mit OTC-
Mangel dem Muster der X-Inaktivierung), den metabolischen Konsequenzen, die aus
den unterschiedlichen Enzymdefekten resultieren sowie externen Faktoren.
Diagnostisch wegweisend sind neben der Bestimmung des Plasma-Ammoniakspiegels
und eines allgemeinen Notfallprogrammes (Blutbild und Bestimmung von Elektrolyte,
Blutzucker, Leber- und Nierenwerte, Gerinnung, Blutgase, Säure-Basen Status), vor
allem die quantitative Bestimmung der Aminosäuren im Plasma und Urin und der
organischen Säuren inclusive Orotsäure in einer Spontanurinprobe sowie die
Untersuchung des Acylcarnitinprofils im Trockenblut.
Anhand der Ergebnisse der Analyse der Plasma-Aminosäurekonzentration in
Kombination mit der Höhe der Orotsäurekonzentration im Urin ist die Festlegung der
Position einer Störung im Harnstoffzyklus möglich.
Differentialdiagnostisch sollte man neben Defekten im Harnstoffzyklus als Ursache
einer Hyperammonämie, Organoazidopathien und Störungen des Transports von
Harnstoffzyklusmetaboliten sowie sekundäre Ursachen wie zum Beispiel
Leberfunktionsstörungen und die Transiente Hyperammonämie des Neugeborenen oder
das Reye Syndrom in Betracht ziehen.
Kapitel I – C: Klinische und Molekulare Grundlagen 21
2 Das klinische Bild des OTC-Mangels
Das klinische Bild beim OTC-Mangel ist sehr variabel und reicht von einem akuten
neonatalen hyperammonämischen Koma bis zum klinisch asymptomatischen
Erwachsenen. Das breite klinische Spektrum ist als Funktion unterschiedlicher
Mutationen und daraus resultierender Enzymveränderungen zu sehen. Aber auch andere
Faktoren wie die Inaktivierung eines X-Chromosoms bei Frauen können Einfluss auf
das klinische Erscheinungsbild nehmen.
Mehr als 80 Prozent der heterozygoten Frauen sind klinisch asymptomatisch. An einem
akuten neonatalen hyperammonämischen Koma erkrankte Neugeborene sind fast
ausschließlich hemizygote männliche Patienten mit schweren Mutationen und fehlender
Enzymaktivität. Bei Patienten mit einem partiellen OTC-Mangel, d.h. Knaben mit
Restenzymaktivität bzw. heterozygoten Mädchen, beobachtet man hingegen eine sehr
unterschiedliche klinische Ausprägung der Symptome wie auch einen variablen
Zeitpunkt der klinischen Manifestation (Tuchman et al. 2002).
Eine OTC Enzymaktivität von mehr als 30 Prozent der normalen Enzymaktivität, führt
in der Regel erst bei katabolen Stoffwechselsituationen und / oder der Aufnahme zu
hoher Nahrungsproteinmengen zu klinischen Symptomen (Finkelstein et al. 1990a).
Je nach Beginn der Erkrankung kann man zwischen dem Neonatal-onset Typ und dem
Late-onset Typ unterscheiden.
2.1 Neonatal-onset Typ Der Zeitpunkt des Beginns der Erkrankung liegt im Neugeborenenalter. Das scheinbar
gesunde Neugeborene erscheint in den ersten 24 Stunden nach der Geburt klinisch
unauffällig. Dem geht auch fast immer eine normale Schwangerschaft ohne pränatale
und perinatale Risikofaktoren voraus.
Erste Symptome wie Trinkschwäche und Irritabilität werden meist zwischen 24 bis 72
Stunden nach der Geburt, manchmal auch einige Tage später, beobachtet. Die
Symptomatik ist progredient, und innerhalb von Stunden entwickeln sich weitere
klinische Symptome wie Erbrechen, Tachypnoe, eine zunehmende Lethargie,
Hypothermie und Hyperventilation mit einer respiratorischen Alkalose. Die
Hyperventilation kann als Symptom einer pulmonale Erkrankung fehlgedeutet werden.
Kapitel I – C: Klinische und Molekulare Grundlagen 22
Ohne Intervention wird das Neugeborene komatös und benötigt eine künstliche
Beatmung. Die progrediente Enzephalopathie, die sich klinisch durch Krampfanfälle,
Reflexverlust, Lethargie, Stupor bis hin zu Koma und respiratorischer Insuffizienz
äußert, entwickelt sich in Abhängigkeit von der Schwere der Hyperammonämie
(Maestrie et al. 1999). Der entscheidende Laborbefund ist die Hyperammonämie mit
erhöhter Konzentration von Orotsäure im Urin. Ein kompletter OTC-Mangel, begleitet
von schwerster Hyperammonämie, Hypocitrullinämie und Orotazidurie, führt oft zum
schnellen Tod.
2.2 Late-onset Typ Prädilektionszeiten für metabolische Stoffwechselentgleisungen sind das späte
Säuglingsalter mit der Umstellung auf proteinreiche Nahrung, die Pubertät mit
verändertem Wachstum, sowie bei Frauen die Peripartalzeit. Auch Infektionen,
Traumen, operative Eingriffe oder proteinreiche Mahlzeiten können zu einem
Stoffwechselstress führen und somit die mögliche Harnstoffsyntheseleistung
überschreiten. Episodisch auftretende Hyperammonämien mit unklarer Enzephalopathie
sind die Folge.
Das klinische Bild bei Säuglingen und Kindern ist geprägt durch eine
Nahrungsverweigerung, Erbrechen und chronisch neurologischen Symptomen, begleitet
von einer Gedeihstörung und einem Entwicklungsrückstand. Es treten episodische
Enzephalopathien mit Lethargie, Ataxie und zerebralen Anfällen auf.
Bei Jugendlichen und Erwachsenen steht die chronisch neurologische oder
psychiatrische Symptomatik im Vordergrund. Migräneartige Kopfschmerzen, Übelkeit
und Erbrechen, aber auch Verhaltensauffälligkeiten mit Reizbarkeit, Agitiertheit,
Verwirrung, Lethargie und Psychose sowie rezidivierende Enzephalopathien im
Zusammenhang mit einer ungewöhnlich hohen Proteinzufuhr oder einer katabolen
Stoffwechselsituation sollten differentialdiagnostisch an einen OTC-Mangel denken
lassen.
Besonders dramatisch ist die akute Eintrübung mit Entwicklung eines Hirnödems, das
trotz dann optimaler Therapie innerhalb weniger Tage zum Tode führen kann. In vielen
Familien wird das Vorkommen eines OTC-Mangels erst nach dem plötzlichen Tod
eines heterozygoten Mädchens bzw. Frau erkannt.
Kapitel I – C: Klinische und Molekulare Grundlagen 23
3 Molekulare Basis des OTC-Mangels
Derzeit sind 341 Mutationen sowie 29 nicht pathogene Mutationen und
Polymorphismen im OTC-Gen beschrieben (Yamaguchi et al. 2006). Die Mutationen
sind relativ gleichmäßig über alle Exons und angrenzenden Introns verteilt, mit
Ausnahme von Exon 1 und Exon 7. Die meisten der Mutationen sind für eine Familie
spezifisch. Man spricht deshalb auch von so genannten „privaten“ Mutationen. Gut 40
Prozent der Mutationen sind mit einer neonatalen Manifestation (innerhalb der ersten
Lebenswoche) des OTC-Mangels assoziiert, ca. 20 Prozent der Mutationen wurden bei
Knaben mit Late-onset-Manifestation und knapp 40 Prozent bei heterozygoten Frauen
nachgewiesen (Yamaguchi et al. 2006). Bei ca. 84 Prozent der Mutationen handelt es
sich um Punktmutationen. Kleine Deletionen sowie Insertionen nehmen mit ca. 12%
und große Deletionen mit 4% einen eher geringen Anteil ein (Yamaguchi et al. 2006).
Ungefähr 13 Prozent der Mutationen betreffen die Splice-Site-Regionen im OTC-Gen
und sind in der Regel mit einer neonatalen Manifestation assoziiert. Es gibt 18 CpG-
Dinukleotide in der kodierenden Sequenz des OTC-Gens und ungefähr ein Drittel aller
Basensubstitutionen betreffen diese hot-spots (Tuchman et al. 2002). CpG-Dinukleotid
bedeutet, dass Cytosin über eine 3'-5'-Phosphodiesterbindung mit Guanin gekoppelt ist.
Die Cytosinreste in den CpG-Dinukleotiden werden häufig am Kohlenstoffatom 5
methyliert und aus dem entstandenen 5-Methylcytosin kann durch Desaminierung
spontan Uracil entstehen. Die häufigsten Substitutionen im OTC-Gen sind
dementsprechend C nach T-Transitionen bzw. G nach A Transitionen (Desamination
auf dem nicht-codogenen Strang).
Weniger als 5 Prozent der Mutationen im OTC-Gen treten gehäuft bzw. wiederholt auf
und sind gleichmäßig auf die CpG-Dinukleotide verteilt (Tuchman et al. 1998). Die
Tatsache, dass G nach A-Transitionen im OTC-Gen 1,6fach mehr beobachtet werden als
C nach T-Transitionen, ist schlecht verstanden, könnte aber mit einem vermehrten
Auftreten von methylierungsabhängiger Desamination im nicht-codogenen DNA-Strang
in Zusammenhang stehen (Wu and Maeda 1987).
Mit der Entdeckung der Tertiärstruktur der humanen OTC, einschließlich des aktiven
Zentrums und Interaktionen zwischen den Monomeren des Trimers, konnten
Auswirkungen von Aminosäuresubstitutionen modellhaft analysiert werden (Shi et al.
1998, 2001).
Kapitel I – C: Klinische und Molekulare Grundlagen 24
Mutationen, welche durch Aminosäuresubstitutionen im Bereich des aktiven Zentrums
entstehen, stehen mit der neonatalen Manifestation des OTC-Mangels in
Zusammenhang. Dazu gehören beispielsweise: R92Q, T93A, R141Q, D196V, D263N,
R277W/R277Q, C303Y (Shi et al. 1998). Mutationen, welche bei Late-onset Formen
des OTC-Mangels zu finden sind, können zum einen die Affinität des Enzyms für des
Substrat Ornithin beeinflussen (zum Beispiel R277W und R277Q) (Morizono et al.
1997). Zum anderen gibt es Mutationen, die Auswirkungen auf die Stabilität des
Enzyms haben können, woraus eine verkürzte Halbwertszeit resultiert (zum Beispiel
R40H, E52D, P225T) (Mavinakere et al. 2001).
Die folgende Tabelle I-3 aus der Arbeit von McCullough et al. 2000, gibt einen
Überblick über die Mutationen in Bezug auf den Phänotyp und gemessene
Enzymaktivitäten. Die in der Tabelle nicht enthaltenen Deletionen und Insertionen sind
meist mit der neonatalen Verlaufsform vergesellschaftet.
R23X G195R (0%) R40H (6%) R277W (5%) IVS1nt+1g>a IVS7nt+2t>cR26Q (0%) M206R G50R R277Q N47I D263NE52K A209V E52D (4%) H302Q E52X D263GIVS2nt-1g>a IVS6nt+2t>c M56T L304F S60L C303YG79E (0%) P225L (0%) L77F 309∆GAA 82∆CTT V315GG83R T247K (0%) K88N (3%) F354C L82X V315DS90N H255P T93A S90R F316SR92Q (0%) Q270X R94T L95S T343KR92X Q279X H117L G106R Y345DA102E (0%) K289N (0%) R129H L139SIVS4nt-2a>c IVS8nt+1g>a I159T (1.5%) R141PIVS4nt-2a>g E310X H168Q K144XR141Q (0%) R320X Q180H L148WR141X R320L H202Y A174PN161S (0%) R330G A208T (4%) G197ET178M W332X P225T S203CE181G IVS9nt+1g>t T247K IVS6nt+1g>aH182L Y345C S267R IVS6nt+3∆gY183C (0%) 272∆GGA (27%) E239E splice*
Neonatal-onset Typs.
bMännliche Patienten, welche nach der ersten Lebenswoche an OTC-Mangel erkranken.cWeibliche Patienten, die an OTC-Mangel erkrankt sind, sind meist Träger von Mutationen des
Tabelle I-3 Phänotyp-Klassifikation der Mutationen im OTC- Gen (McCullough et al. 2000)
Die gemessenen Enzymaktivitäten in Prozent, sind in Klammern als Restenzymaktivität angegeben.aMännliche Patienten, welche innerhalb der ersten Lebenswoche nach der Geburt an einem akuten hyperammonämischen Koma erkranken.
Heterozygote FrauencHemizygote Männer
Neonatal-Onseta Late-Onsetb
Kapitel I – C: Klinische und Molekulare Grundlagen 25
Wie aus der Tabelle I-3 hervorgeht, wurden Mutationen bei klinisch symptomatischen
weiblichen Patientinnen in der Regel nicht bei männlichen Patienten mit Late-onset
Form der Erkrankung nachgewiesen. Daraus lässt sich ableiten, dass heterozygote
weibliche Patientinnen mit manifestem OTC-Mangel mit großer Wahrscheinlichkeit
Neonatal-onset Typ Mutationen tragen.
Es wurde gezeigt, dass ungefähr 80 Prozent der Mutationen bei männlichen Patienten
vererbt worden sind und es sich nur in 20 Prozent der Mutationen um
Spontanmutationen handelt, während bei weiblichen Patienten ein umgekehrtes
Verhältnis vorliegt. Die Mutationsrate im OTC-Gen ist in männlichen Keimzellen höher
als in weiblichen Keimzellen. Aus den bisherigen Veröffentlichungen gehen keine
Daten zur Häufigkeit eines männlichen Keimzellmosaikes für OTC-Mutationen hervor.
Die Wahrscheinlichkeit, dass die Mutter einer betroffenen Tochter Überträgerin des
OTC-Mangels ist, wird als eher niedrig eingeschätzt (Tuchman et al.1995a;
McCullough et al.2000).
Kapitel I – C: Diagnose 26
4 Diagnose
Der Zeitpunkt der Diagnosestellung und der rasche Beginn einer effizienten
Behandlung sind entscheidend für die Vermeidung schwerer Hirnschäden und damit für
die Prognose des OTC-Mangels. Das Auftreten einer Hyperammonämie bei unklarer
Enzephalopathie verlangt ein abgestuftes differenzialdiagnostisches Vorgehen. Eine
rasche Primärdiagnostik ist unbedingt notwendig, um eine gezielte Akuttherapie
einleiten zu können. Der Bestätigungsdiagnostik kommt große Bedeutung für das
weitere therapeutische Vorgehen sowie eine humangenetische Beratung zu.
4.1 Biochemische Untersuchungen Der entscheidende Labortest ist die Bestimmung der Ammoniak-Konzentration im
Plasma, die beim Neugeborenen normalerweise < 110 µmol/l beträgt.
Beim OTC-Mangel findet sich neben einer z.T. massiven Hyperammonämie in der
Regel eine starke Erhöhung der Orotsäureausscheidung, da das im Mitochondrium
akkumulierte Carbamylphosphat in die cytosolische Pyrimidinsynthese einfließt (siehe
Bild 1-9 zur Erklärung der Beziehung zwischen intramitochondrialen und cytosolischen
Carbamylphosphat und Pyrimidinbiosynthese).
Zusammenfassend würde man beim OTC-Mangel folgende Befundkonstellation der
Aminosäuren im Plasma erwarten: Glutamin ↑; Citrullin ↓; Orotsäure/Uracil im
Urin:↑↑.
4.2 Bestimmung der Enzymaktivität Eine Bestimmung der Ornithintranscarbamylase-Aktivität aus biopsiertem Leber- oder
Darmgewebe kann für eine Bestätigung der Diagnose notwendig sein. Die neonatale
Manifestation des OTC-Mangels korreliert mit einer nichtdetektierbaren OTC-Aktivität
(Tuchman et al. 1989). Die Bestimmung der hepatischen OTC-Aktivität bei erkrankten
Frauen, ergab eine deutliche Varianz in unterschiedlichen Biopsieproben.
Beispielsweise wurde bei einer an OTC-Mangel erkrankten Frau, welche während einer
hyperammonämischen Episode verstarb, in 10 biopsierten Proben
(Durchschnittsgewicht 16.8 mg) eine hepatische OTC-Aktivität von 3.1-16.1 Prozent
der normalen Aktivität gemessen.
Kapitel I – C: Diagnose 27
In einem ähnlichen Fall ergab die Bestimmung der hepatischen OTC-Aktivität in 10
biopsierten Proben (Durchschnittsgewicht 12.7 mg), Werte von 4.8 bis 27 Prozent der
normalen Aktivität. Daraus lässt sich ableiten, dass entsprechend niedrig gemessene
OTC-Aktivitäten diagnostisch eindeutig sind, jedoch höher gemessene
Enzymaktivitäten im Einzelfall mehrdeutig sein könnten (Brusilow und Horwich
1995). Ein Überträgerstatus für eine schwere OTC-Mutation bei einer heterozygoten
Frau lässt sich durch eine Leberbiopsie jedoch weitgehend ausschließen.
Bei einem Jungen, der mit 10 Jahren an den Folgen eines hyperammonämischen Komas
verstarb, wurde eine OTC-Restenzymaktivität von 4 Prozent gemessen, während bei
seinem Onkel, der bis dahin keine ernsten Erkrankungen gehabt hatte, auch nur eine
Enzymaktivität von 6 Prozent gemessen wurde. Ebenso sei der 97jährige Ur-Großvater
des Jungen immer gesund gewesen. Wie die darauf folgende Mutationsanalyse ergab,
waren alle drei Personen Träger der Mutation A208T im Exon 6 des OTC-Gens.
Offensichtlich handelte es sich um eine „milde“ Mutation, die wegen der (wenn auch
geringen) Restaktivität nur bei Stoffwechselbelastungen zur schweren
Hyperammonämie führte (Ausems et al. 1997).
4.3 Familienanamnese Zu erfragen sind, ob in mütterlichen oder väterlichen Familie Erbkrankheiten bekannt
sind, unklare Todesfälle Neugeborener aufgetreten sind oder unklare Erkrankungsbilder
in der Familie vorkommen. Eine gute Stammbaumanalyse (ggf. mehrere im
Neugeborenenalter verstorbenen männlichen Patienten) ist bei der Diagnosefindung
eine Hilfe. Als obligat heterozygot kann eine Frau mittels Stammbaumanalyse
identifiziert werden, wenn sie ein oder mehr Kinder mit OTC-Mangel geboren hat und
ein weiterer Fall von OTC-Mangel in der Familie vorliegt.
4.4 Diagnosesicherung Zur Bestätigung der Diagnose „OTC-Mangel“ wäre die Bestimmung der
Enzymaktivität am besten geeignet, da es sich um eine Methode mit der höchsten
Sensitivität und Spezifität handelt und eine Aussage hinsichtlich der Restenzymaktivität
getroffen werden kann. Da es sich dabei jedoch um eine invasive Diagnostik handelt,
gibt man heute der nicht-invasiven molekulargenetischen Diagnostik zunächst den
Vortritt.
Kapitel I – C: Diagnose 28
Die Mutationsanalyse genomischer DNA ist auch für Familienanalysen und die
Pränataldiagnostik optimal geeignet. Aber der Mutationsnachweis gelingt nur in etwa
80% der Fälle mit enzymatisch gesichertem OTC-Mangel. Bei fehlendem
Mutationsnachweis kann eine zusätzliche Enzymaktivitätsbestimmung notwendig sein.
Zur Mutationsanalyse können verschiedene Nachweisverfahren herangezogen werden.
Als Untersuchungsmaterial kann genomische DNA oder cDNA verwendet werden.
Diese kann z.B. aus Blut, Guthrie-Testkarten, Fibroblasten oder Biopsiematerial
gewonnen werden. Für die pränatale Diagnostik wird fetale DNA aus
Chorionzottenbiopsien oder Amnionzellen verwendet.
Das Vorkommen von vielen Neumutationen sowie so genannten „privaten“ oder
familiären Mutationen und die Tatsache, dass nicht ein gehäuftes Vorkommen
bestimmter Mutationen beobachtet wird, gestaltet die Mutationsanalyse schwierig.
Die Analyse der genomischen DNA des OTC-Gens basiert in der Regel auf der
Amplifikation der 10 Exons einschließlich Exon-Intron-Grenzen mittels PCR, gefolgt
von einer Screeningmethode zur Detektion von DNA-Veränderungen oder direkter
Sequenzanalyse der gesamten kodierenden Region des OTC-Gens (Tuchman et al.
2002).
Durch die automatisierten Fluoreszenz-Sequenzierer wurde in den letzten Jahren die
direkte Sequenzanalyse als primäre Methode zur Mutationsanalyse attraktiv. Durch eine
vorausgehende Screeningmethode kann die zu sequenzierende Probenanzahl und damit
der Kosten- und Auswertungsaufwand jedoch reduziert werden. Dazu wurde
überwiegend die Analyse von Einzelstrang-Konformationspolymorphismen
(SSCP=Single Strand Conformational Polymorphism) beschrieben. Die DGGE-Analyse
(Denaturierungs-Gradienten-Gelelektrophorese) erschien uns als kosteneffiziente
Screeningmethode des OTC-Gens aufgrund der hohen Sensitivität sowie der relativ
geringen Anzahl von Exons (insgesamt 10) und deren Größe eine günstigere
Alternative, wie bereits auch in einer Publikation von Finkelstein et al. für Exon 7 u. 8
beschrieben (Finkelstein et al. 1990b).
Ist die krankheitsverursachende Mutation in der Familie bekannt, kann ggf. auch mittels
Restriktionsendonukleasen die Analyse durchgeführt werden (Tuchman et al. 2002).
Kapitel I – C: Diagnose 29
Wird durch die direkte Mutationsanalyse die zugrunde liegende Mutation nicht
nachgewiesen, stellt die Kopplungsanalyse eine Alternative dar. Dabei kann in
Familien, in denen eine Krankheit gehäuft vorkommt, das mutationstragende Allel
bestimmt werden. Als besonders wertvolle Marker im OTC-Gen gelten die
intragenischen Polymorphismen Lys46Arg, IVS3-39_40insT, IVS3-8A>T, Gln270Arg
und IVS4-7A>G (Climent and Rubio 2002).
Die Untersuchung des pathogenen Effektes einer Mutation ist optimalerweise durch
Expressionsstudien möglich. Andere Kriterien zur Festlegung, inwiefern eine Mutation
den Phänotyp modifiziert oder nicht, sind der Mutationstyp, der zu erwartende Effekt
eines Aminosäureaustausches, die Prävalenz einer Mutation, Segregationsanalysen
sowie die Berücksichtigung des Umfanges der molekulargenetischen Diagnostik
(Cotton and Scriver 1998).
4.5 Heterozygotendiagnostik Eine Diagnosestellung bei weiblichen Patientinnen mit partiellem OTC-Mangel ist zum
Teil sehr schwierig. Die meisten heterozygoten Patientinnen für OTC-Mangel sind
asymptomatisch aber tragen ein Risiko für eine hyperammonämische Enzephalopathie
mit schwerwiegenden Folgen. Eine gewissenhafte Anamneseerhebung inklusive
Familienanamnese und Befragung zu Ernährungsgewohnheiten, das episodische
Vorkommen von unspezifischen Symptomen mit Charakterisierung möglicher
Zusammenhänge zwischen Beginn der Symptome und Ernährung, können manchmal
wichtige Hinweise geben (Rowe et al. 1986).
Biochemische Auffälligkeiten sind bei weiblichen Überträgerinnen häufig inkonstant.
Als wegweisender Hinweis kann ein auffälliger Allopurinoltest dienen. Dabei handelt es
sich um eine indirekte biochemische Methode, welche sicher, schnell und nicht-invasiv
ist. Durch unterschiedliche Faktoren sind sowohl falsch-negative als auch falsch-
positive Ergebnisse möglich, wodurch die Interpretation des Testes erschwert wird
(siehe unten). Bei schwangeren Frauen ist der Allopurinoltest nicht anwendbar, was als
Nachteil für die Abklärung einer möglichen Heterozygotie bei einer schon eingetretenen
Schwangerschaft zu werten ist. Bei Late-onset Formen des OTC-Mangels wird von der
Durchführung eines Allopurinoltestes aufgrund der Möglichkeit falsch-negativer
Ergebnisse abgeraten (Grünewald et al. 2004).
Kapitel I – C: Diagnose 30
Mit der Mutationsanalyse als direktem, ebenfalls nicht-invasivem Nachweisverfahren
erreicht man eine Sensitivität von ca. 80%, so dass bei dringendem V.a. heterozygoten
OTC-Mangel und fehlendem Mutationsnachweis die Enzymaktivitätsbestimmung als
ultima ratio bleibt.
Yudkoff et al. (1996) entwickelte eine neue Methode zur Kontrolle des Stoffwechsels
bei weiblichen Patienten mit OTC-Mangel durch Messung der Ureagenese in vivo. Bei
klinisch asymptomatischen Überträgern ist eine normale Harnstoffbildung zu
beobachten, ihr Stickstoffmetabolismus ist trotzdem nicht normal, zu sehen an einer
Zunahme von [5-15N]Glutamin. Bei klinisch symptomatischen Heterozygoten war die
Harnstoffbildung hingegen signifikant unter der Normalen. Nach einer oralen Gabe des
stabilen Isotops 15NH4Cl bestimmt man mittels GC-MS die Konversion von 15NH4Cl zu
[15N]Harnstoff und [5-15N]Glutamin. Sie kamen zu dem Schluss, dass diese Methode
hilfreich zur Bewertung der Effizienz interventioneller Therapien wie beispielsweise
eine Lebertransplantation oder Gentherapie, sein könnte.
Kapitel I – C: Diagnose 31
4.5.1 Allopurinoltest Die Durchführung eines Allopurinoltests (Hauser et al. 1990) kann bei Verdacht auf
heterozygoten oder milden OTC-Mangel mit unklaren passageren bzw.
intermittierenden Hyperammonämien hilfreich sein (Zschocke und Hoffmann 2004).
Durch den Allopurinoltest lässt sich ein erhöhter Umsatz der Pyrimidinsynthese
nachweisen. Nach Inhibition der Orotidinmonophosphat (OMP)-Decarboxylase durch
Oxipurinolribonukleotid (Reaktionsprodukt von Allopurinol in vivo) lässt sich die
Ausscheidung von Orotsäure und Orotidin im Urin quantifizieren. Erhöhte Werte als
Ausdruck einer erhöhten Pyrimidinsynthese sind ein typischer Befund beim OTC-
Mangel. Eine Darstellung der biochemischen Zusammenhänge ist in der folgenden
Abbildung, Bild 1-9, zu sehen.
Bild 1-9 Darstellung der Zusammenhänge zwischen intra-mitochondrialen und cytoplasmatischen Carbamylphosphat, Pyrimidinbiosynthese und Allopurinolmetabolismus bei OTC-Mangel.
Die Akkumulation von Carbamylphosphat im Mitochodrium von Patienten mit OTC-
Mangel führt zur Diffusion von Carbamylphosphat in das Cytoplasma, wodurch die
Pyrimidinbiosynthese stimuliert wird. Oxipurinolribonukleotid, ein Metabolit von
Allopurinol, wirkt inhibitorisch auf die OMP-Decarboxylase. Daraus resultiert ein
Anstieg von Orotidin-5′-Phosphat und dessen Vorstufe Orotsäure, was letztlich eine
Orotazidurie und Orotidinurie bedingt (Hauser et al. 1990).
Carbamylphosphat
Carbamylaspartat
Dihydroorotat
OROTAT
Orotidin 5′-Phosphat
Uridin-5′-Phosphat
OROTIDIN OMP
Decarboxylase
Aspartat
NH4 HCO3
Carbamyl- phosphat
CPS I
Citrullin
OTC Ornithin
Mitochondrium
Kapitel I – C: Diagnose 32
Durchführung Bereits 24 Stunden vor Testbeginn ist auf die Einhaltung der diätetischen Vorschriften
zu achten (Vermeiden von Coffein / Alkohol sowie benzoathaltigen Getränken und
Einschränkung der Flüssigkeitszufuhr). Testbeginn ist am besten morgens. Nach dem
Aufstehen sollten im Spontanurin die Ausgangswerte von Orotsäure, Orotidin und
Kreatinin bestimmt werden.
Nach einer einmaligen oralen Gabe von Allopurinol, deren Dosis vom Alter abhängig
ist (100 mg bei <6J.; 200 mg bei 6-10J.; 300 mg bei >10J.), erfolgt die Sammlung von
Urin in vier 6 Stunden-Perioden: 0-6 Stunden, 7-12 Stunden, 13-18 Stunden und 19-24
Stunden.
Mittels HPLC (High Performance Liquid Chromatography) werden in allen Proben
Orotidin und Orotsäure quantifiziert. Die Ausscheidung von Orotsäure und Orotidin
wird in Relation zu Kreatinin (µmol/mmol Kreatinin) ausgedrückt.
Die Auswertung des Allopurinoltests erfolgt anhand von Referenzwerten für Orotidin
und Orotsäure (Burlina et al. 1992; Hauser et al. 1990).
Ein übermäßiger Anstieg von Orotsäure und Orotidin spricht für einen erhöhten
Durchsatz in der Pyrimidinsynthese. In der Literatur wird eine Sensitivität zwischen 80
und 100 Prozent und eine Spezifität über 90 Prozent angegeben (Arranz et al. 1999;
Hauser et al.1990); Maestri et al. 1998). Mit der Bestimmung von Orotidin erreiche
man die höchste Sensitivität (91 Prozent) (Hauser et al.1990; Maestri et al. 1998;
Arranz et al. 1999; Grünewald et al. 2004), aber eine geringe Spezifität (70 Prozent)
(Grünewald et al. 2004). Es werden sowohl falsch positive als auch falsch negative
Testergebnisse beobachtet. Zum einen ist der Test von dem Metabolismus von
Allopurinol in Oxipurinol abhängig. Zum anderen können eine hohe Restenzymaktivität
wie bei milden Mutationen oder günstigem Mosaik ein falsch-negatives Testergebnis
bedingen (Bowling et al. 1999). Ebenso können Störungen in der Pyrimidinbiosynthese
oder aber methodische Probleme zu verfälschten Testergebnissen führen (Hauser et al.
1990; Zschocke u. Hoffmann 2004).
Kapitel I – C: Diagnose 33
4.5.2 Molekulare Diagnostik Die Mutationsanalyse ist prinzipiell das beste Nachweisverfahren zur Ermittlung eines
potentiellen Trägers einer Mutation. Nach den Untersuchungen von Pelet et al. [1990]
liegt die Wahrscheinlichkeit, dass die Mutter eines erkrankten Sohnes (Über-)Trägerin
der Mutation ist, bei 84 Prozent (Pelet et al. 1990).
Tuchman et al. [1995] schätzt das Risiko auf mindestens 90 Prozent (Tuchman et al.
1995a). Deshalb ist die molekulargenetische Untersuchung von Indexpatienten mit neu
diagnostiziertem OTC-Mangel und die nachfolgende Testung von Familienangehörigen
von großer Bedeutung.
Kann die ursächliche Mutation nicht gefunden werden, stehen ggf. eine Reihe von
informativen Polymorphismen für Kopplungsanalysen in Familien zur Verfügung
(Plante und Tuchman 1998).
4.6 Pränataldiagnostik Die Durchführung einer pränatalen Diagnostik verlangt eine Auseinandersetzung der
Ratsuchenden mit ethischen Fragestellungen, insbesondere bei Feststellung eines
erkrankten Fetus. Eine pränatale Diagnostik ist auf molekulargenetischer Ebene
möglich und an die Durchführung einer Chorionzottenbiopsie ab der 11.
Schwangerschaftswoche oder einer Amniozentese ab der 14. Schwangerschaftswoche
geknüpft. Notwendig ist in der Regel die Kenntnis der krankheitsverursachenden
Mutation bei einem betroffenen Familienmitglied.
Die Bestimmung der OTC-Aktivität in fetalem Lebergewebe ab der 20.
Schwangerschaftswoche (Rodeck et al. 1982), wird in Ausnahmefällen versucht (bei
fehlendem Mutationsnachweis in der Familie), ist aber mit einem hohen
Fehlgeburtenrisiko verbunden. Eine Bestimmung der OTC-Aktivität in humanen
Chorionzotten oder in Ammnionzellen ist nicht möglich.
Kapitel I – C: Therapie 34
5 Therapie
Man muss zwischen einer Akuttherapie mit dem Ziel der Senkung des neurotoxischen
Ammoniaks und einer Dauerbehandlung für eine ausgeglichene Stoffwechsellage
unterscheiden.
5.1 Notfallbehandlung Bei einer Hyperammonämie mit Werten von >200 µmol/l bzw. >350 mg/dl ist eine
Notfallbehandlung indiziert. Deren Prinzip ist der sofortige Stop der Proteinzufuhr, die
Umkehr einer katabolen Stoffwechsellage durch hochkalorische Infusionen;
Optimierung der verbliebenen Funktion des Harnstoffzyklus durch Arginingabe und
Gabe von Medikamenten wie Natriumphenylbutyrat und / oder Natriumbenzoat zur
Ammoniakspiegelsenkung über alternative Stoffwechselwege.
Bei NH3-Werten >400 µmol/l bzw. >700 mg/dl ist unverzüglich eine extrakorporale
Entgiftung durch Hämodiafiltration, gegebenenfalls Hämofiltration oder –dialyse
einzuleiten.
Eine engmaschige Kontrolle der Laborparameter ist erforderlich.
Mehrtägiges Koma und Hirndruckzeichen lassen eine eher schlechte Prognose erwarten.
5.2 Dauerbehandlung Das Ziel der Dauertherapie ist es, eine ausgeglichene Stoffwechselsituation zu schaffen
und zu erhalten, um eine irreversible Hirnschädigung durch rezidivierende
Hyperammonämien zu vermeiden.
Es werden die folgenden Leitlinien empfohlen (Vademecum Metabolicum,
Zschocke/Hoffmann, 2004):
1. Erhaltung des anabolen Stoffwechsels
2. Begrenzte Proteinzufuhr
3. Substitution von Arginin und bei schweren OTC-Defekten Citrullin
4. Zusätzliche Ammoniakentfernung: Na-Benzoat (eliminiert äquimolar Glycin),
und Na-phenylbutyrat (eliminiert äquimolar Glutamin)
5. Supplementierung von Vitaminen und Spurenelementen
6. ggf. Lactulose (bindet durch sauren pH Darmammoniak)
Kapitel I – C: Therapie 35
Die Kontrolle von Wachstum und Entwicklung sowie die Aufrechterhaltung der
Normwerte für Plasma-Ammoniak, Glutamin und Arginin sind wichtige Parameter, um
den Erfolg der Therapie zu überprüfen.
5.3 Andere Therapieformen Bei Patienten mit milderen Formen eines Harnstoffzyklusdefektes kann eine
ausgeglichene Stoffwechsellage durch diätetische Maßnahmen und Gabe von
Medikamenten zur Ammoniakspiegelsenkung über alternative Stoffwechselwege
erreicht werden. Viele Patienten sprechen jedoch nur unzureichend auf diese
konventionelle Therapieformen an. Die Lebertransplantation als kurative Therapieform
stellt bei diesen Patienten eine bedeutende Therapieoption dar, um die Zerstörung des
Gehirns durch wiederkehrende Hyperammonämien aufzuhalten (Hasegawa et al. 1995).
Indikationen für eine Lebertransplantation bei Patienten mit
Harnstoffzykluserkrankungen sind (1) eine schwere Verlaufsform der Erkrankung mit
schlechter Prognose wie beispielsweise der Neonatal-onset Form des OTC-Mangels, (2)
eine progressive Lebererkrankung, welche zum Leberversagen führt wie teilweise bei
Patienten mit Argininosuccinatacidurie und (3) mit anderen Therapieformen nicht
beherrschbare Krankheitsverläufe. Es ist nicht bekannt, wie viele
Lebertransplantationen insgesamt bisher bei Patienten mit Harnstoffzyklusdefekten
durchgeführt worden sind. Einen Überblick über die bisher in der Literatur
veröffentlichten Fälle gibt eine Arbeit von Leonard and McKiernan (2004). Hiernach
war bei 59 Patienten mit Harnstoffzyklusdefekten eine Transplantation durchgeführt
worden, wovon 32 Fälle (über 50%) Patienten mit OTC-Mangel waren. Die
Überlebensrate war 93% insgesamt bzw. 90% bei Patienten mit OTC-Mangel.
Abgesehen von der durch die Transplantation verbesserten Lebensqualität der
überlebenden Patienten, gibt es jedoch nur spärliche Informationen über das
neurologische Outcome. Grundsätzlich ist davon auszugehen, dass eine neurologische
Verschlechterung verhindert wird, und sich sogar in einigen Fällen die intellektuelle
Leistung verbessert (Fletcher et al. 1999, Whitington et al. 1998).
Kapitel I – C: Therapie 36
Horslen et al. (2003) berichten über eine isolierte Hepatozytentransfusion mittels
Umbilikalvenenkatheter in die Pfortader bei einem männlichen Neugeborenen mit
schwerem OTC-Mangel. Oberstes Ziel ist das Verhindern einer Hyperammonämie, um
eine optimale neurologische Entwicklung zu gewährleisten. Bisher ist diese
therapeutische Intervention, bei welcher die transfundierten Hepatozyten als transiente
„Enzymquelle“ fungieren, bei 3 Patienten mit OTC-Mangel durchgeführt worden. Sie
ist als Brücke zur endgültigen Therapie, einer Lebertransplantation, zu sehen (Horslen
et al. 2003; Leonard and McKiernan 2004).
Gentherapeutische Studien mit dem Ziel, den Defekt zu korrigieren, wurden zunächst
unterbrochen, da Adenovirusvektoren nicht zu einem signifikanten Anstieg der
Enzymaktivität geführt haben (Raper et al. 2002) und schwere Komplikationen bis hin
zum Tod eines Patienten aufgetreten sind.
Kapitel I – C: Prognose 37
6 Prognose
Der OTC-Mangel vom Typ Neonatal-onset ist eine verheerende Erkrankung sowohl in
Hinblick auf die Mortalität als auch auf die kognitve Entwicklung (Maestri et al. 1999).
In einer Arbeit von Msall et al. [1984] wurde das Outcome von 26 überlebenden
Kindern untersucht. Bei einem Großteil der Kinder wurden neurologische
Auffälligkeiten festgestellt. Der durchschnittliche IQ betrug 43 +/- 6. Es bestand eine
signifikante Korrelation zwischen der Dauer des hyperammonämischen Komas und den
intellektuellen Fähigkeiten. Diese Prognose kann durch eine frühe Diagnose und früh
einsetzende Therapie verbessert werden (Msall et al. 1984).
Patienten, deren Therapie schon auf das Verhindern eines hyperammonämischen
Komas ausgerichtet war, zeigten eine bessere neurologische Entwicklung als Patienten,
die ein hyperammonämisches Koma überlebten: Insgesamt war ihr IQ signifikant höher,
sie hatten weniger Krampfleiden und keiner hatte eine Zerebralparese. Das
hyperammonämische Koma scheint hauptsächlich für die untersuchten Unterschiede in
der Entwicklung verantwortlich zu sein (Maestri et al. 1991).
Bei Patienten mit OTC-Mangel vom Typ Late-onset, einschließlich klinisch
symptomatischer Mädchen, kann eine adäquate Therapie zu einer Verbesserung der
Verhaltensauffälligkeiten führen, eine Reduktion der hyperammonämischen Episoden
und eine Stabilisierung der intellektuellen Fähigkeiten bewirken (Brusilow und Horwich
1995).
Eine neuere Untersuchung bezüglich des neurologischen und kognitiven Outcomes von
28 an OTC-Mangel erkrankten Kindern, darunter 5 Jungen, ergab, dass die Anzahl der
durchgemachten hyperammonämischen Enzephalopathien weniger aussagekräftig als
die Plasma-Ammoniak-Konzentration sei, um eventuelle neurologische und kognitive
Defizite vorherzusagen (Nicolaides et al. 2002).
Kapitel I – D: Ziele der Untersuchung 38
D Ziele der Untersuchung
Die molekulare Diagnostik als ein fester Bestandteil in der Sicherung der Diagnose des
OTC-Mangels, erfordert in erster Linie zuverlässige, aber auch praktikable
Nachweisverfahren zur Detektion von krankheitsauslösenden genetischen
Veränderungen.
Ziel der vorliegenden Studie war die Etablierung und Evaluierung der
Denaturierungsgradientengel-Elektrophorese (DGGE) für den Nachweis von
Mutationen im OTC-Gen. Die Methode hat potenziell eine Sensitivität von 100% für
den Nachweis von DNA-Veränderungen, deutlich höher als die Sensitivität der
verbreiteten SSCP-Screeningmethode von 80-90%, und ist gleichzeitig deutlich weniger
aufwändig und kostengünstiger als die direkte Sequenzierung.
Die vorliegende Arbeit ist in zwei experimentelle Teile gegliedert. Der erste Teil
umfasste die Entwicklung optimaler PCR-Konditionen, die Erprobung und Optimierung
der Elektrophoresebedingungen der DGGE sowie die Auswertung der jeweiligen
Bandenmuster. Hierfür standen uns drei Patientenkollektive mit gesicherter molekularer
Diagnose zur Verfügung. Die Kontrolle der gefundenen Ergebnisse erfolgte durch
direkte Sequenzanalyse.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde die DGGE als Screeningverfahren der Routine-
Diagnostik bei Patienten mit Verdacht auf OTC-Mangel eingesetzt. Zur genauen
Charakterisierung der im Screeningverfahren detektierten Veränderungen erfolgte
ebenfalls die exonspezifische Sequenzierung. Zusätzlich wurde die Promotorregion
sowie die an die Exongrenzen angrenzenden Intronsequenzen analysiert, um auch
Spleißmutationen erfassen zu können.
Kapitel II – A: Methodenwahl 39
KAPITEL II : METHODIK
A Methodenwahl
1 Molekulargenetische Diagnostik
Methodisch unterscheidet man zwischen einem direkten Gentest, bei dem die zur
Erkrankung führende(n) Mutation(en) nachgewiesen oder ausgeschlossen wird (werden)
und der indirekten Gendiagnostik, bei dem der eine krankheitsrelevante Mutation
tragende Chromosomenabschnitt in einer Familie untersucht wird (Kopplungsanalyse).
Die Durchführung der direkten Gentests setzt die Kenntnis des
krankheitsverursachenden Gens voraus, während bei der indirekten Diagnostik nur die
Genregion bekannt sein muss.
Die meisten Krankheiten werden durch zahlreiche unterschiedliche Mutationen im
gleichen Gen bedingt, was die Durchführung von genetischen Tests erschwert. In der
Regel müssen molekulargenetische Methoden daher zahlreiche unterschiedliche
Mutationen in einem Gen nachweisen können.
Mutationserkennung kann auf der RNA-, DNA- und Proteinebene erfolgen.
Drei methodische Prinzipien bilden die Grundlage der meisten molekularen
humangenetischen Untersuchungen auf DNA Ebene:
1. Die Bindung von zwei einzelsträngigen DNA-Sequenzen nach dem Prinzip der
Basenpaarung (Hybridisierung).
2. Die Vervielfältigung von DNA-Fragmenten durch die Polymerase-Ketten-
Reaktion (PCR).
3. Die Auftrennung von DNA-Fragmenten im elektrischen Feld aufgrund ihrer
elektrischen Ladung und verschiedener Parameter wie Größe.
Kapitel II – A: Methodenwahl 40
1.1 Die Polymerasekettenreaktion (PCR) 1984 veröffentlichte Kary Mullis eine neue Methode zur in vitro Amplifizierung von
spezifischen Nukleinsäure-Fragmenten, die inzwischen zur am meisten verwendeten
Standardmethode in der Molekulargenetik avancierte, da sie einfach und schnell
anzuwenden ist, und außerdem auch ohne die Verwendung vitaler Zellen durchführbar
ist.
Das Prinzip der Polymerasekettenreaktion (PCR = engl. polymerase chain reaction)
setzt sich im wesentlichen aus den drei Schritten Denaturierung, Anheften der
Oligonukleotide sowie Extension zu neuen Doppelsträngen zusammen, welche in Form
von Zyklen wiederholt werden, was eine exponentielle Zunahme der amplifizierten
DNA-Moleküle ergibt. Für die Amplifizierung einer spezifischen Sequenz eines DNA-
Doppelstranges erfolgt zunächst eine Trennung der komplementären DNA-Stränge
durch Denaturierung bei 90-95°C. Darauf folgend wird das Gemisch auf etwa 50-60°C
abgekühlt und zwei aus ca. 15-25 Basen bestehende Oligonukleotide (Primer) zugesetzt,
die jeweils der Sequenz an den 5`-Enden der beiden Einzelstränge komplementär sind.
Durch Zusatz einer thermostabilen DNA-Polymerase werden die beiden Einzelstränge
zum jeweiligen Doppelstrang komplementiert und die zwischen den Primern gelegene
Zielsequenz verdoppelt. Das üblicherweise verwendete Enzym aus dem in heißen
Quellen lebenden Organismus Thermophilus aquaticus, Taq-Polymerase, macht die
Zugabe von neuer Polymerase nach jeder Denaturierung, welche zuvor eine
Inaktivierung der Polymerasen zur Folge hatte, überflüssig.
Anschließend wird der aus Denaturierung, Anlagerung der Primer und Extension
bestehende Reaktionszyklus 30-40 Mal wiederholt, woraus eine exponentielle Zunahme
der amplifizierten DNA-Moleküle folgt. Schon 20 Reaktionszyklen ergibt sich unter
realistischen Bedingungen in der Praxis eine 105-fache Amplifizierung der Zielsequenz.
Die einzelnen Reaktionszyklen werden in automatisierten Thermocyclern durchgeführt,
so dass eine enorme Amplifizierung geringster Mengen Zielsequenz in kürzester Zeit
erfolgt.
Kapitel II – A: Methodenwahl 41
Ursprünglich wurde das PCR-Verfahren für die Amplifizierung von DNA-Fragmenten
beschrieben. Inzwischen finden eine Reihe von Varianten der PCR-Technik wie
beispielsweise die RT-PCR mit RNA als Ausgangsmaterial, Anwendung. Unabdingbare
Voraussetzung für alle PCR-Experimente sind Negativkontrollen, um eine
Kontamination durch nicht zum PCR-Ansatz gehörende DNA auszuschließen.
1.2 Detektion von unbekannten Mutationen
1.2.1. Screeningmethoden
Methoden zur Diagnostik unbekannter Mutationen werden auch als Screeningmethoden
bezeichnet. Gebräuchliche Verfahren sind die Gelelektrophorese mit
Denaturierungsgradienten (DGGE), Analyse von Einzelstrang-
Konformationspolymorphismen (SSCP), Heteroduplexanalyse, Denaturierende
Hochdruckflüssigkeitschromatographie (Denaturing high performance liquid
chromatography, DHPLC), chemische Spaltung an Fehlpaarungsstellungen (CCM) und
enzymatische Spaltung an Fehlpaarungsstellen (EMC).
Denaturierungsgradientenelektrophorese (DGGE) Diese Methode wird im folgenden genauer dargestellt. Man lässt doppelsträngige PCR-
Produkte in einem Elektrophoresegel wandern, das eine zunehmende Konzentration
eines denaturierenden Agens enthält. Die DNA-Moleküle wandern bis zu der Position
im Gel, an der die Duplexstrukturen aufschmelzen und in Einzelstränge getrennt
werden. Basenveränderungen werden durch eine veränderte Schmelzposition
nachweisbar. Mit dieser Methode können nahe 100% der Mutationen detektiert werden
(Cotton 2000).
Vorteile: Kosteneffiziente, hochsensitive Methode zur Mutationsanalyse von
Sequenzabschnitten, welche mehrere hundert Basenpaare umfassen können.
Nachteile: Herstellung eines Gradientengels notwendig; Entwicklung spezifischer
Primer. Analyse problematisch bei GC-reichen Sequenzabschnitten eines Genes.
Kapitel II – A: Methodenwahl 42
Single-Strand Conformational polymorphism analysis (SSCP) Denaturierte, einzelsträngige PCR-Produkte werden auf einem nichtdenaturierenden
Polyacrylamidgel aufgetrennt. Analysiert wird die elektrophoretische Mobilität der
einzelsträngigen DNA, die von der Länge der Molekülkette, der DNA-Sequenz und der
Konformation abhängig ist. In der einfachsten Form der Durchführung liegt die
Mutationsdetektionsrate zwischen 50-80% (Cotton 2000).
Vorteile: Keine besonderen technischen oder methodischen Anforderungen.
Nachteile: Sensitivität begrenzt, v.a. von PCR-Produktgröße abhängig (optimal
zwischen 150-300 bp).
Heteroduplexanalyse Ein doppelsträngiges PCR-Produkt der genomischen DNA eines Mutationsträgers kann
aus zwei identischen DNA-Strängen bestehen (Homoduplex) oder aus einem Strang der
Wildtypsequenz und einem Strang der mutierten Sequenz (Heteroduplex).
Heteroduplex und Homoduplex können sich im Laufverhalten in der Gelelektrophorese
unterscheiden. Ein abweichendes Bandenmuster ist ein Hinweis auf das Vorliegen einer
Sequenzveränderung.
Vorteile: Keine besonderen technischen oder methodischen Anforderungen. Mit SSCP-
Analyse kombinierbar.
Nachteile: Beschränkte Sensitivität
DHPLC Durch die Einführung von HPLC-Methoden wie die Denaturing high performance
liquid chromatography (DHPLC) liegt die Detektionsrate bei ca. 90-95% (Cotton 2000).
Vorteile: Hohe Sensitivität, keine besonderen Primer, automatisiertes Verfahren ohne
Gel
Nachteile: Aufwändige Apparate notwendig, aufwändige Optimierung der Analytik,
schlechte Sensitivität für homozygote Mutationen, hohe Kosten
Chemical cleavage of mismatches (CCM) und Enzyme mismatch cleavage (EMC) Eine radioaktiv markierte Sonde wird mit der Test-DNA hybridisiert. Bei CCM erfolgt
der Nachweis der Fehlpaarungsstellen mit Hilfe von chemischen Reaktionen, die einen
DNA-Strang an einer solchen Stelle spalten. Bei EMC werden bestimmte Enzyme zum
Schneiden an Fehlpaarungsstellen eingesetzt.
Kapitel II – A: Methodenwahl 43
Vorteile: CCM nahezu 100% Sensitivität, für Fragmente bis zu 2 kb Länge anwendbar,
grobe Lokalisation möglich.
Nachteile: Bei EMC Verwendung radiomarkierter RNA bei niedriger Sensitivität (50-
70%). CCM ist eine sehr zeit- und arbeitsaufwendige Methode, für die der Gebrauch
von toxischen Chemikalien erforderlich ist.
1.2.2. Sequenzanalyse
Die direkte Sequenzierung eines definierten DNA-Abschnittes gibt Aufschluss über die
genaue Basenabfolge und kann damit den Beweis für das Vorliegen einer Mutation
liefern. Es ist eine sehr präzise Strukturanalyse zur Aufklärung der Sequenzfolge.
Vorteile: Hohe Sensitivität und Spezifität, hoher Informationsgehalt
Nachteile: In Abhängigkeit von Anzahl der Exons arbeitsaufwändig und kostenintensiv.
Mit Hilfe moderner Automatisierungsverfahren hat sich die direkte Sequenzierung für
kleine Gene als primäres Analyseverfahren vielerorts durchgesetzt. Die Kombination
mit einer Screeningmethode erlaubt allerdings eine deutliche Verringerung des
Arbeitsaufwandes und der Kosten.
2 Methode der Wahl
Wie dargestellt, gibt es eine Reihe von verschiedenen molekularbiologischen Methoden
zum Mutationsscreening. Wir wählten die DGGE-Analyse für die diagnostische
Mutationsdetektion bei OTC-Mangel. Sie stellt eine hochsensitive, reproduzierbare
Methode dar, welche zur Detektion von genomischen Veränderungen wie Insertion,
Deletion bis hin zur Substitution einer einzelnen Base bestens geeignet ist. Im Vergleich
zu anderen Screeningmethoden bietet die DGGE Analyse methodische Vorteile, vor
allem eine hohe Sensitivität. Diese hohe Sensitivität wird auch ohne zusätzlichen
Optimierungsaufwand erreicht. Trotz Verwendung von chemischen Gradientengelen
und spezifischen Primern ist die Methode relativ kostengünstig. Es können sowohl
heterozygote als auch homozygote Varianten identifiziert werden, was z.B. bei der
Heteroduplexanalyse nicht der Fall ist. Die Analyse größerer Probandengruppen ist
möglich.
Kapitel II – A: Methodenwahl 44
2.1 Denaturierungs-Gradientengel-Elektrophorese (DGGE) Die Denaturierungs-Gradienten-Gelelektrophorese ist eine Screeningmethode zur
Detektion bekannter und unbekannter Mutationen in der molekulargenetischen
Routinediagnostik. Das Prinzip der DGGE wurde von Fischer und Lerman 1979
publiziert und nachfolgend zur Detektion von Punktmutationen in verschiedenen Genen
angewandt (Fischer u. Lerman 1979). Untersucht werden Unterschiede der
Schmelztemperatur von DNA-Fragmenten, welche mittels PCR hergestellt wurden.
Die Temperatur, bei der doppelsträngige DNA denaturiert und sich die Einzelstränge
voneinander lösen, ist von der DNA-Sequenz abhängig und kann durch Mutationen
verändert werden. Eine zunehmende Konzentration eines denaturierenden Agens (z.B.
Formamid) führt zur Dissoziierung und Retardierung der DNA an einer bestimmten
Stelle im Gel. Unterschiede in der Schmelztemperatur resultieren in einer früheren oder
späteren Denaturierung und führen so zu einer Verschiebung des Bandenmusters, so
dass Heteroduplexe im Gel in Bereichen niedrigerer Konzentrationen von
denaturierendem Agens stehen bleiben als die korrespondierenden Homoduplexe.
Durch die Verwendung von PCR-Primern, denen eine 40-60 bp lange "GC-Klammer"
angefügt wurde, kann eine gleichmäßige Schmelztemperatur des PCR-Produktes bei
bleibender Verbindung der beiden Stränge erreicht werden, was die Detektion von
Mutationen in allen Domänen ermöglicht (Sheffield et al. 1989). Die Primerauswahl
erfolgt mit Hilfe von speziellen Computerprogrammen, in denen sich die
Schmelzeigenschaften der spezifischen PCR-Produkte untersuchen lassen, um
Domänen mit einer hohen Schmelztemperatur außerhalb der GC-Klammer zu
vermeiden. Nach PCR und Erzeugung von Heteroduplexen wird die DNA direkt auf ein
Polyacrylamidgel aufgetragen. Die Darstellung der Banden erfolgt durch Färbung mit
Ethidium-Bromid. In der DGGE-Analyse findet sich bei Homozygotie eine einzelne
Bande, während man bei Heterozygotie 2 bis 4 verschiedene Banden erkennen kann.
Es ist möglich, verschiedene Mutationen anhand spezifischer Bandenmuster
voneinander zu unterscheiden. Für den Nachweis X-chromosomal gekoppelter
Mutationen bei männlichen Personen kann die Zugabe von Wildtyp-DNA zur zu
untersuchenden männlichen DNA-Probe für die Erzeugung von Heteroduplexbanden
notwendig sein.
Kapitel II – A: Methodenwahl 45
Bild 2-1 Schematische Darstellung des DGGE-Analyse Prinzips.
2.2 Sequenzierung Zur Sequenzierung der genomischen DNA wurde eine Modifikation der von Frederick
Sanger entwickelten enzymatischen Kettenabbruchmethode verwendet (Sanger et al.
1977). Hierzu folgt nach Amplifizierung der DNA mittels normaler PCR eine
zusätzliche Cycle-Sequencing-PCR. Dazu verwendeten wir universelle
Sequenzierprimer, die am 3`-Ende der PCR-Produkte ansetzen und der universellen
Sequenz eines zusätzlichen Schwanzes der primären PCR-Primer entsprechen.
Die Analyse der Basensequenz wurde dadurch erreicht, dass die PCR in vier gleich
große Ansätze aufgeteilt wird und zusätzlich zu den Desoxynukleosidtriphosphaten
(dNTP) in jeden Ansatz eine geringe Menge eines spezifischen 2´,3´-
Didesoxynukleosidtriphosphates (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) gegeben wird. Wird
dieses Nukleotid anstelle des normalen Nukleotids in die wachsende Polynukleotid-
kette eingebaut, so wird das Kettenwachstum beendet, da keine freie 3´-OH-Gruppe für
die Polymerisierung mehr vorhanden ist. Es entstehen dadurch also sequenzspezifische
Kettenabbrüche. In dem Ansatz, in den beispielsweise zusätzlich dd-ATP gegeben
wurde, weist jeder Kettenabbruch auf das Vorhandensein der Base Adenin an dieser
Stelle der Sequenz hin.
Doppelsträngige DNA
Hohe Schmelz-temperaturdomäne(GC-Klammer)
Niedrige Schmelz-temperaturdomäne
Zunahme der Konzentration des denaturierenden chemischen Agens
Komplette Auftrennung der
Stränge
Partielle Auftrennung, Arrest im Gel
Kapitel II – A: Methodenwahl 46
Werden anschließend die vier Ansätze nebeneinander auf ein hochauflösendes
Polyacrylamid-Gel aufgetragen, so treten nach der Elektrophorese die verschieden
langen Fragmente in Form unterschiedlicher Banden auf, aus denen sich die Sequenz
der amplifizierten DNA ablesen lässt. Die Banden können generell durch den Einsatz
von fluoreszierend bzw. radioaktiv markierten Primern oder Terminatoren sichtbar
gemacht werden.
Bei der vorliegenden Arbeit wurden fluoreszenzmarkierte Primer und zur
automatisierten DNA-Sequenzierung der Sequenzierer ALFexpress (Amersham
Biosciences, Freiburg) verwendet. Die bei der Cycle-Sequencing-PCR eingesetzten, mit
Cy5 markierten Primer fluoreszieren im Laserlicht und werden während der
Elektrophorese von Photometern während ihres „Vorbeiwanderns“ erfasst und von der
Software aufgezeichnet.
Durch den Einsatz der universellen, am 5´-Ende fluoreszierend markierten Primer M13,
M13 reverse, P51 und P172 bei der Cycle-Sequencing-Reaktion wird eine Markierung
zahlreicher sequenzspezifischer Primer überflüssig, wodurch Zeit und Kosten eingespart
werden, weil die universellen Primer für alle Exons einsetzbar sind, sofern bei der
ersten PCR Primer mit den entsprechenden Schwänzen am 5´-Ende benutzt wurden
(siehe Tabelle II-1 in Teil B-Materialien und Protokolle).
Es wurden jeweils beide gegenläufigen komplementären DNA-Stränge sequenziert, was
die Genauigkeit der Methode noch erhöht und die Fehlerwahrscheinlichkeit verringert.
Das detaillierte Protokoll zur Sequenzierung ist in Abschnitt B dieses Kapitels
beschrieben.
Kapitel II – B: Materialien und Protokolle 47
B Materialien und Protokolle
1 DNA-Extraktion
Aus peripheren Lymphozyten Venöse Blutproben werden in EDTA-Röhrchen gesammelt, bei 4°C gelagert (sofern
notwendig) und so schnell wie möglich weiterverarbeitet, um den Verlust an DNA so
gering wie möglich zu halten. Die Zellen werden, wie im Einzelnen unter 1.2
beschrieben, vom Plasma getrennt, die Erythrozyten lysiert und die DNA-enthaltenden
Leukozyten durch Zentrifugation gesammelt. Die DNA-Extraktion erfolgt mit dem
BACC2 Extraktions-Kit (Amersham Biosciences, Freiburg).
Anschließend wird die DNA in TE-Puffer suspendiert und bei –20°C gelagert.
Aus Guthrie-Karten DNA für PCR-Analysen kann außerdem aus getrockneten Blutstropfen oder Guthrie-
Karten extrahiert werden, selbst wenn diese schon über Jahre gelagert wurden.
Wir machten die Erfahrung, dass diese Proben, auch wenn sie quantitativ weniger DNA
lieferten, ebenso gute Sequenzierergebnisse zuließen wie frisch extrahierte DNA aus
Vollblut.
Die Blutstropfen sollten von ausreichender Größe und das Filterpapier gut durchtränkt
sein. Die Extraktion der DNA erfolgt wie unter 1.4 dieses Kapitels beschrieben.
1.1 Materialien BACC2 Extraktions-Kit (Amersham Biosciences, Freiburg); 5 M Natriumperchlorat
(70%); Chloroform; Ethanol absolut; Chelex-Resin (5%ige Suspension Chelex 100
Resin BT der FA. Bio-Rad (München) in H2O); TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM
EDTA pH 7,4)
1.2 DNA-Extraktion aus Vollblut 1. 5 ml EDTA-Blut in einem 50 ml Polypropylen Röhrchen (Greiner Labortechnik,
Frickenhausen) mit Reagenz A (Extraktions-Kit) auf 40 ml auffüllen und
anschließend für 4 Minuten gründlich durchmischen.
Kapitel II – B: Materialien und Protokolle 48
2. 5 min bei 1300 g zentrifugieren.
3. Den Überstand verwerfen; das Pellet 2 ml Reagenz B des Nucleon-Extraktions-Kits
resuspendieren, gründlich mischen und in 5 ml Röhrchen überführen.
4. 500 µl 5 M Natriumperchlorat-Lösung dazugeben und einige Sekunden schütteln.
5. 2 ml Chloroform dazugeben und 10 min mischen.
6. 2 min bei 800 g zentrifugieren.
7. Langsam 300 µl Nucleon Resin dazupipettieren und 4 min bei 1400 g zentrifugieren.
8. Den Überstand vorsichtig abpipettieren und in ein neues 50 ml Röhrchen umfüllen.
9. Die DNA mit kaltem Ethanol absolut ausfällen und mit einem dünnen, über der
Bunsenbrennerflamme sterilisiertem Glasstab in ein weiteres Röhrchen zu 500 µl TE-
Puffer überführen.
10. DNA-Stammlösung bei –70°C lagern.
1.3 Bestimmung der DNA-Konzentration und Reinheit 1. 10 µl der DNA-Stammlösung in 90 µl destilliertem H2O auflösen (1:10).
2. Die optische Dichte (OD) bei 260 nm bestimmen (Absorption mit der von H2O als
Standard vergleichen – Eine OD-Einheit entspricht einer DNA-Konzentration von
etwa 50 µg/ml – Die Konzentration der DNA-Stammlösung (µg/ml) wird als
OD260•10•50 berechnet).
3. Die OD bei einer Wellenlänge von 280 nm bestimmen und die Ratio OD260:OD280
berechnen (Eine Ratio von <1,65 wäre Hinweis auf eine Proteinkontamination und
würde eine weitere Aufreinigung der Probe erforderlich machen, was bei uns in
keinem Fall notwendig war).
4. Die Konzentration der DNA-Stammlösung durch entsprechende Verdünnung auf
500 µg/ml einstellen.
1.4 DNA-Extraktion aus Guthrie-Karten 1. 1 ml steriles, destilliertes Wasser in ein 1,5 ml Eppendorf-Cup füllen und ein 3x3 mm
großes Stück Papier aus dem getrocknetem Blutstropfen ausstanzen, dazugeben und
vortexen.
2. Bei Raumtemperatur 15-30 min inkubieren und gelegentlich vortexen.
3. Für 2-3 min bei 10000-15000 g zentrifugieren.
Kapitel II – B: Materialien und Protokolle 49
4. Den Überstand vorsichtig entfernen und verwerfen, so dass nur das Pellet, das
Papierstück und 20-30 µl der Flüssigkeit im Gefäß verbleiben.
5. Mit 5% Chelex zu einem Gesamtvolumen von 200 µl auffüllen und für 15-30 min im
Wasserbad bei 56°C inkubieren.
6. Anschließend für 5-10 s bei max. Stärke vortexen.
7. In kochendem Wasser für weitere 8 min inkubieren.
8. Danach 5-10 s bei max. Stärke vortexen und für 2-3 min bei 10000-15000 g
zentrifugieren.
9. 20 µl des Überstandes für PCR verwenden.
10. Den Rest der Probe tiefgekühlt lagern.
2 Primer
2.1 Primerauswahl Die Primersequenzen für die Sequenzierung von Exon 2, 4, 5, 6, 7/8 und 9 übernahmen
wir aus der Publikation von Matsuura et al. (Matsuura et al. 1993). Primer für Exon 1, 3
und 10 entwarfen wir mit Hilfe des Oligo-Programm (MedProbe) auf einem Macintosh-
Computer selbst. Die Primersequenzen für die PCR-Amplifikationen der
Promotorregion wurden uns freundlicherweise von der Arbeitsgruppe E. Bakker aus den
Niederlanden zur Verfügung gestellt.
Allen Primern wurde ein 18-20 bp langer universaler Schwanz (M13, M13rev, P51 bzw.
P172) zugefügt, welcher die Verwendung universeller Primersequenzen für die spätere
Sequenzierung erlaubte. Primersequenzen sind in Tab. II-1 aufgeführt.
Nach der PCR zum Sequenzieren, wurden 5 µl des PCR-Produktes durch
Gelelektrophorese auf einem Agarosegel dargestellt, um den Erfolg der Amplifikation
zu überprüfen.
Die Primer für die DGGE wurden für alle zehn Exons des OTC-Gens mit OLIGO
Primer Analysis Software (MedProbe, Oslo/Norwegen) auf einem Macintosh-Computer
entworfen, um durch Anfügen einer entsprechenden "GC-Klammer" die spezifische
Anlagerung und die zu erwartenden Schmelzeigenschaften zu simulieren.
Im folgenden sind die spezifischen Schmelztemperaturkurven der PCR-Produkte für
alle Exons des OTC-Gens dargestellt.
Kapitel II – B: Materialien und Protokolle 50
Synthetisiert wurden die Primer von der Firma GIBCO BRL (jetzt Invitrogen,
Karlsruhe).
Die PCR lief entweder auf der Perkin Elmer PE 480 oder dem Gene Amp® PCR System
9700 (PE). Die Protokolle sind im Einzelnen dieses Kapitels beschrieben.
EXON 7/8
EXON 6
EXON 1 EXON 2
EXON 3 EXON 4
EXON 5
EXON 9 EXON 10
Bild 2-2 Schmelztemperaturkurven der PCR-Produkte für die DGGE von Exon 1 bis Exon 10 des OTC-Gens. Auf der Abszissenachse ist die Basenpaarlänge (Basepair-bp) und auf der Ordinatenachse die Schmelztemperatur (Tm) aufgetragen.
Kapitel II – B: Materialien und Protokolle 51
2.2. PCR-Amplifikation und Sequenzierung
Tabelle II-1 Darstellung der Primersequenzen für die Sequenzierreaktion. Der unterstrichene Bereich der Sequenz in F (Forward/Vorwärts) oder R (Reverse/Rückwärts) entspricht der Sequenz des jeweils verwendeten Universalprimers für die Cycle-Sequencing-Reaktion. Die Primersequenz von Exon 2, Exon 4 rückwärts, Exon 6, 7/8 und 9 entspricht der für die DGGE verwendeten Primersequenz. bp: Basenpaare.
Primersequenzen in Forward (vorwärts) bzw. Reverse (rückwärts) Richtung
PCR-Produkt-
größe
Univ. Primer-schwanz
Promotor F 5' TATGTAAAACGACGGCCAGTGGTAGAAAAGTGAAATAAATGG 3' 438 bp M13
R 5' CAGGAAACAGCTATGACCTAAGAAATGTGTTCAGTTGCAG 3' M13rev
Exon 1 F 5' TATAAGGGAACAAAAGCTGGTGGAGTTTTCAAGGGCATAG 3' 201 bp P51
R 5' TATGTAAAACGACGGCCAGTTTCCTAAATCAAACCCAAGTC 3' M13
Exon 2 F 5' TATGTAAAACGACGGCCAGTCACCATAGTACATGGGTCTTTTCTGA 3' 288 bp M13
R 5' CAGGAAACAGCTATGACCAAAAAGGGGACTGGTAGTAACTGGAAC 3' M13rev
Exon 3 F 5' TATTATAGGGCGAATTGGGTTATTTGGGGGCTAGTTATTAC 3' 271 bp P172
R 5' TATGTAAAACGACGGCCAGTTCAATCCCTCTCTTCAACAC 3' M13
Exon 4 F 5' TATGTAAAACGACGGCCAGTGTTGAGATGATGGCCAATTCTTTGT 3' 261 bp M13
R 5' CAGGAAACAGCTATGACCCCATCAGATTCTGAAATCAGCTTTG 3' M13rev
Exon 5 F 5' TATGTAAAACGACGGCCAGTGCATTATTAAGCATAATTATCTTAG 3' 304 bp M13
R 5' CAGGAAACAGCTATGACCTTCACTTAAAGCAAGTCAGGAATTA 3' M13rev
Exon 6 F 5' TATGTAAAACGACGGCCAGTTGGATTTCATCTCCTTCATCCCGTG 3' 239 bp M13
R 5' CAGGAAACAGCTATGACCGTGATTTAAGAGAGGGGTTAGTTTC 3' M13rev
Exon 7/8 F 5' TATGTAAAACGACGGCCAGTCCTAAATAAGATTTAAATTCCTTCCT 3' 390 bp M13
R 5' CAGGAAACAGCTATGACCGGAATTAATGAACCTGAGAGAGCAT 3' M13rev
Exon 9 F 5' TATGTAAAACGACGGCCAGTGCCACATATAATAGTCAAAAAGTGG 3' 312 bp M13
R 5' CAGGAAACAGCTATGACCATCTCACTTGCTTATTATTTCCCCA 3' M13rev
Exon 10 F 5' TATGTAAAACGACGGCCAGTCAGACTGTCGCTAATGTTTATC 3' 296 bp M13
R 5' TATAAGGGAACAAAAGCTGGCACAATGGCAAAGCATATCATAC 3' P51
2.2.3 Die markierten Universalprimer für die Cycle-Sequencing-Reaktion M13 5' ς-TAT GTA AAA CGA CGG CCA GT 3'
M13 rev 5' ς-CAG GAA ACA GCT ATG ACC 3'
P51 5' ς-TAT AAG GGA ACA AAA GCT GG 3'
P172 5' ς-TAT TAT AGG GCG AAT TGG GT 3'
Kapitel II – B: Materialien und Protokolle 52
2.3. DGGE
Tabelle II-2 Darstellung der Primersequenzen für die DGGE. Die GC-Klammern sind unterstrichen dargestellt. Aufgrund der notwendigen Schmelzeigenschaften ist neben der 40bp-GC-Klammer an einen der beiden Primer, zusätzlich an den jeweils zugehörigen Primer eine GC-Klammer von 5-6bp angehängt worden.
Primersequenzen in Forward (vorwärts) bzw. Reverse (rückwärts) Richtung
Exon 1 Forward 5' TTAGTTTTTAGGTGGCCCCC 3'
Reward 5' CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGAGTTTTA TGCATCACCATGATTCCT 3'
Exon 2 Forward 5' CGCCCGCACCATAGTACATGGGTCTTTTCTGA 3'
Reward 5' CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGAAAAAG GGGACTGGTAGTAACTGGAAC 3'
Exon 3 Forward 5' CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGGATATAT TTTAATTCTATTCTTG 3'
Reward 5' GTCTTCACCTTCAATCCCTCTCTT 3'
Exon 4 Forward 5' CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGGTTTTTT CAAAATGATTTTTTTC 3'
Reward 5' GCCCGCCATCAGATTCTGAAATCAGCTTTG 3'
Exon 5 Forward 5' CCCCCGCCCGTATCTTAGATTATCTTTTTC 3'
Reward 5' CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGTGATTTT GCTCTTTTGTAAG 3'
Exon 6 Forward 5' GCCCGTGGATTTCATCTCCTTCATCCCGTG 3'
Reward 5' CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGGTGATTT AAGAGAGGGGTTAGTTTC 3'
Exon 7/8 Forward 5' CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTAAAT AAGATTTAAATTCCTTCCT 3'
Reward 5' CGCCCGGAATTAATGAACCTGAGAGAGCAT 3'
Exon 9 Forward 5' CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGGCCACAT ATAATAGTCAAAAAGTGG 3'
Reward 5' GCCCGACTTCACTTGCTTATTATTTCCCCA 3'
Exon 10 Forward 5' CGCCCGTCTAGGTCCCTAAGCAGACTGTCGC 3'
Reward 5' CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCAACTCA TTCTGTTACTGAAG 3'
3 Die Polymerasekettenreaktion (PCR)
3.1 PCR-Reagenzien Die Primer wurden von der Firma GibcoBRL (jetzt Invitrogen, Karlsruhe) synthetisiert
und in Form getrockneter Pellets geliefert. Diese waren entsprechend ihrer
Konzentration in TE-Puffer zu verdünnen, um eine 100 µM Stammlösung herzustellen.
Die Stammlösung wird 1:40 in H2O verdünnt, um eine 2,5 µM (Sequencing) bzw. 1:25
in H2O, um eine 4 µM (DGGE) Gebrauchslösung zu erstellen.
Kapitel II – B: Materialien und Protokolle 53
Im einzelnen wurden verwendet:
Platinum™ Taq DNA Polymerase od. Taq DNA Polymerase (5 U/µl), 10X PCR-Puffer
und MgCl2 (50 mM) waren als Set bei der Firma GibcoBRL (jetzt Invitrogen,
Karlsruhe) erhältlich.
2 mM dNTP-Lösung (10X Konzentration) wurde durch Verdünnung von 60 µl dNTP
(jedes Nukleotid 20 mM, (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg)) in 940 µl H2O
hergestellt.
Die DNA-Stammlösung (500 µg/ml) wird 1:20 verdünnt, um eine Gebrauchslösung mit
der Konzentration von 25 µg/ml zu erhalten.
3.2 PCR Ansatz und Konditionen Die PCR wurde entweder mit der PE 480 oder mit Gene Amp® PCR System 9700
(jeweils Perkin Elmer, Applied Biosystems, Darmstadt) mit maximaler
Aufheizgeschwindigkeit (Ramp Speed), durchgeführt. Bei der PE 480 musste dem
Ansatz im letzten Schritt als Verdunstungsschutz ein Tropfen Mineralöl zugefügt
werden.
Es wurde jeweils mit 15 µl (DGGE) bzw. 50 µl (Sequencing) Ansätzen gearbeitet, die
sich wie unten beschrieben zusammensetzten.
Verwendung fanden dabei 200 µl PCR-Softtubes der Firma Biozym (Hessisch
Oldendorf).
3.2.1 PCR-Konditionen für die DGGE
Ansatz pro Cup
15 µl-Ansatz zur DGGE:
Volumen Endkonzentration
10XPCR-Puffer 1,5 µl 1x
50 mM MgCl2 0,45 µl 1,5 mM
2 mM dNTP 1 µl 133 µM
Primer (je 4 µM) 2 µl je Primer ~1 µM
Taq DNA Polymerase 0,1 µl 0,5 Units Dest. H2O 7 µl
DNA 1,0 µl
Kapitel II – B: Materialien und Protokolle 54
PCR-Zyklen zur DGGE
Exon 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10
Denaturierung 94°C 5 min
94°C 45 sec
38 Zyklen 55°C 45 sec
72°C 45 sec
Extension 72°C 5 min
Denaturierung 94°C 5 min
Heteroduplexformation 65°C 20 min
37°C 20 min
Abkühlung 4°C Dauer
Exon 7/8
Denaturierung 94°C 5min
94°C 45sec
38 Zyklen 52°C 45sec
72°C 45cec
Extension 72°C 5min
Denaturierung 94°C 5min
Heteroduplexformation 65°C 20min
37°C 20min
Abkühlung 4°C Dauer
3.2.2 PCR-Konditionen für das Sequenzieren
Ansatz pro Cup
50 µl-Ansatz zum Sequenzieren:
Volumen Endkonzentration
10XPCR-Puffer 5 µl 1x
50 mM MgCl2 1,5 µl 1,5 mM
2 mM dNTP 5 µl 0,2 mM
Primer (je 2,5 µM) 5 µl je Primer 250 nM
(Platinum™) Taq DNA Polymerase
(0,2 µl)-0,3 µl (1)-1,5 Units
Dest. H2O 23,5 µl
DNA 5 µl 125 ng
Kapitel II – B: Materialien und Protokolle 55
PCR-Zyklen zum Sequenzieren
Promotorregion und Exon 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10
Denaturierung 94°C 5min
94°C 30sec
15 Zyklen 55°C 60sec
72°C 60cec
20 Zyklen 94°C 30sec
65°C 60sec
Extension 72°C 5min
Abkühlung 4°C 30min
Exon 7/8
Denaturierung 94°C 5min
94°C 60sec
35 Zyklen 52°C 60sec
72°C 2min
Extension 72°C 7min
Abkühlung 4°C 30min
4 Agarose Gelelektrophorese der PCR-Produkte
4.1 Materialien Loading-Puffer (5X): 30% Glycerin, 5% SDS, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,1%
BPB (3 ml Glycerin, 0,5 ml SDS, 10 mg Tris-HCl, 4 mg EDTA, 10 mg BPB, H2O ad
10 ml).
Größenstandard (1 kb Leiter): Gemisch aus 15 µl der 1 kb-Leiter (Amersham Pharmacia
Biotech, Freiburg), 25 µl Loading-Puffer und 60 µl H2O.
Ethidiumbromid-Stammlösung: 0,5 mg/ml in dest. H2O.
4.2 Methode 1. Für mittelgroße Gele 3 g SEAKEM® Agarose (Bio Whittaker Molecular
Applications, USA), NuSieve® Agarose (Bio Whittaker Molecular Applications,
Kapitel II – B: Materialien und Protokolle 56
USA) oder ein Gemisch beider zu 150 ml 1X TBE-Puffer (Bio Whittaker
Molecular Applications, USA) geben. Anschließend gründlich mischen und in der
Mikrowelle so lange erhitzen, bis die Agarose vollständig aufgelöst ist.
2. Die Lösung auf etwa 50°C abkühlen lassen, 75 µl (0,5 µl pro ml Gel)
Ethidiumbromid-Stammlösung dazugeben und gründlich mischen.
3. Die Agarose in eine Gelform gießen, den Kamm inserieren und das Gel auf
Raumtemperatur abkühlen lassen, anschließend Kamm entfernen.
4. 5 µl des PCR-Produkts mit 2 µl Loading-Puffer mischen und in die Taschen des
Gels pipettieren. Die 1 kb-Leiter als Standard in die anliegenden Taschen
pipettieren.
5. Elektrophorese bei 5-10 V/cm (normalerweise 100 V) für eine angemessene Zeit
laufen lassen.
6. Nach der Elektrophorese können die Banden unter UV-Licht sichtbar gemacht
werden.
5 DGGE
5.1 Equipment Gradienten-Mischer (BioRad, München) ca. 50 cm über dem Arbeitsplatz stehend
Modifiziertes Bio-Rad Protean II-Xi-Elektrophorese-System mit 16 cm Glasplatten,
1,0 mm Spacer und Kämmen
Wasserbad mit Pumpe (Grant, Cambridge, UK) zur Pufferzirkulation unter
Konstanthaltung der eingestellten Temperatur
5.2 Materialien 40% Acrylamid (19:1) (Biozym, Hessisch Oldendorf), Formamid (Invitrogen,
Karlsruhe), Urea (Invitrogen, Karlsruhe), 10X TAE-Puffer (Bio Whittaker, USA 16-
011Y 6x1l), APS (Sigma, Taufkirchen A-9164, 25 g), TEMED (Sigma, Taufkirchen
T-7024, 25 ml)
Kapitel II – B: Materialien und Protokolle 57
5.3 Herstellen der Gellösungen (6 % Polyacrylamidgel)
Null-Lsg.: 40% Acrylamid (19:1) 75 ml
10X TAE-Puffer 50 ml
H2O ad 500 ml
Lagerung bei 4°C in lichtgeschützten Flasche.
80% Denat.-Lsg.: 40% Acrylamid (19:1) 75 ml
10X TAE-Puffer 50 ml
Deionisiertes Formamid 160 ml
Urea 168 g
H2O ad 500 ml
Lagerung bei 4°C in lichtgeschützten Flasche.
Formamid-Deionisierung: Ca. 15 g Mixed Bed Resin TMD-8 (Sigma, Taufkirchen M-8157; 100 g) + 0,5 l
Formamid ca. ½ h auf dem Rührer mischen; filtrieren
5.4 Durchführung 1. Scheiben mit Ethanol säubern; anschließend mit Glykol einreiben und einspannen.
2. 15 ml Null-Lsg. (=Low) sowie 15 ml 80%-Denaturierungs-Lsg. (=High) in je ein
50-ml-Falcon-Röhrchen geben und je 6 µl TEMED und je 100 µl APS (10%)
zugeben und mischen.
3. Gradienten-Mischer: in die rechte Kammer L-Lsg. und in die linke (mit
Haupthahn) H-Lsg. geben. Zuerst die Verbindung zwischen den Kammern
aufdrehen, dann den Haupthahn und Gel langsam zwischen die Glasplatten laufen
lassen.
4. Nach ca. 2 min Kamm einstecken; Gradienten-Mischer und Schlauch mit Aqua
dest. säubern und Vorgang für das zweite Gel wiederholen.
5. Gele 30-60 min polymerisieren lassen.
6. Gerät (Protean II Xi-System von Bio-Rad) anstellen und auf Puffertemperatur von
58°C temperieren. Elektrophorese-Kammer mit 6,5 l 1XTAE-Puffer füllen.
7. Kamm ziehen und Taschen 2x mit 1XTAE-Puffer spülen und Puffer in Taschen
füllen.
8. Gele in Ständer einklicken und mit 1XTAE Puffer auffüllen.
Kapitel II – B: Materialien und Protokolle 58
9. Taschen spülen und Proben laden (mit langer dünner Spitze):
X1, X2, X3, X6, X9, X10 2 µl PCR-Probe + 2µl Loading Dye
X4, X5, X7/8 4 µl PCR-Probe + 2µl Loading Dye
10. Ständer in Elektrophorese-Kammer stellen und zu folgenden Bedingungen starten:
180V; 58°C (im Tank!); 6 Stunden Laufzeit
11. Entwicklung der Gele in Ethidiumbromidbad für 10 min und anschließend für
10 min in Aqua dest. Bad legen.
12. Gel vorsichtig auf UV-Transluminator legen und fotografieren.
6 Sequenzierung der DNA
6.1 Materialien Thermo Sequenase™ fluorescent labelled Primer Kit (Amersham LIFE SCIENCE)
enthält A-, C-, G-, T- Reagenz (dNTP`s, das entsprechende ddNTP, Magnesiumchlorid,
Tween™ 20, Nonidet™ P-40, 2-Mercaptoethanol, thermostabile Pyrophosphatase und
Thermo Sequenase DNA-Polymerase) und Formamid Loading-Dye (Formamid, EDTA
und Methylviolett).
Sequagel-6 der Firma National Diagnostics umfaßt Monomerlösung (5,7% Acrylamid,
0,3% Methylen-Bisacrylamid und Harnstoff in 0,1 M Tris-Borat und 2 mM EDTA-
Puffer, pH 8,3) und Pufferlösung (5X TBE-Puffer und Katalysator in deionisiertem
dest. H2O).
Ammoniumpersulfat (98%) von der Firma Sigma (Taufkirchen), 1X TBE-Puffer
(0,1 M Tris-Borat und 2 mM EDTA, pH 8,3)
6.2 Cycle-Sequencing 1. Das gewünschte Exon, wie oben beschrieben, mittels PCR amplifizieren und 5 µl
des PCR-Produktes zur Kontrolle auf einem Agarose-Gel laufen lassen. Das
Produkt nur dann sequenzieren, wenn eine einzelne starke Bande sichtbar ist.
2. Das PCR-Produkt durch zentrifugieren über QIAquickspin (Qiagen, Hilden)
Reinigungssäulchen den Herstellerangaben entsprechend aufreinigen.
Kapitel II – B: Materialien und Protokolle 59
3. Für jedes zu amplifizierende Exon zwei Ansätze erstellen (je einer pro DNA-
Strang).
Von jedem Ansatz je 6 µl in vier 200 µl PCR-Softtubes pipettieren (jedes enthält
2 µl des entsprechenden A-; C-; G-, oder T-Reagenzes)
4. Die Cycle-Sequencing-PCR bei folgenden Konditionen auf dem Thermo-Cycler
(Gene Amp® PCR System PE 9700) mit maximaler Ramp Speed laufen lassen:
Denaturierung 94°C 5min
25 Zyklen 94°C 30sec
Annealingtemperatur 68°C 30sec
Extension 72°C 5min
Abkühlung 4°C 30min
5. Anschließend 2 µl Formamid Loading-Dye zu den PCR-Produkten pipettieren und
möglichst bald zum Sequenzieren auf das Polyacrylamid-Gel auftragen.
6.3 Herstellung des Polyacrylamid-Gels 1. Die Glasplatten gründlich mit nichtfluoreszierendem Detergenz (Alconox, Aldrich)
reinigen, mit destilliertem Wasser und Ethanol absolut abspülen und trocknen
lassen.
2. Die Deckplatte unter Verwendung der 0,5 mm Spacer auf der Basis positionieren
und mit Halteklammern arretieren. Den Kamm etwa bis zur Hälfte am oberen Ende
der Apparatur zwischen die Platten schieben.
3. 40 ml Monomerlösung und 10 ml Pufferlösung (SequaGel-6) in einen
dickwandigen Erlenmeyerkolben füllen und unter Rühren für 2-5 min entgasen.
4. 400 µl frisch angesetzter 10%iger Ammoniumpersulfat Lösung zugeben und
behutsam mischen.
5. Die Lösung vom unteren Rand her mit einer Spritze vorsichtig zwischen die Platten
füllen und dabei die Entstehung von Luftblasen vermeiden.
A C G T A C G T
Exon
1
10
Forward → Reward →
Kapitel II – B: Materialien und Protokolle 60
6. Den Kamm nun vollständig einführen, mit Klammern fixieren und das Gel für etwa
zwei Stunden polymerisieren lassen.
6.4 Sequenzierungs-Elektrophorese 1. Das Gel in den Sequenzierer (ALFexpress, Pharmacia Biotech) hängen, die Behälter
am oberen und unteren Ende des Gels bis zur Markierung mit 1X TBE-Puffer füllen
und behutsam den Kamm entfernen.
2. Die Taschen mit Puffer spülen, die Intensität des Lasers überprüfen und das Gerät
für 15-30 min bei 34 W laufen lassen.
3. Gegebenenfalls die Proben in der Zwischenzeit durch zweiminütiges Erhitzen auf
90°C denaturieren und auf Eis stellen.
4. Die Taschen des Gels erneut mit Puffer spülen und die Proben in die nummerierten
Taschen pipettieren (die Temperatur des Gels sollte etwa 50°C betragen).
5. Nach Überprüfung der Elektroden und der Laserintensität das Gel für 8-12 Stunden
bei 34 W laufen lassen.
6. Anschließend die vom Gerät detektierten Banden mit Hilfe der Software (AM
V3.02 auf dem OS/2 System) am Computer auswerten: Aus der Reihenfolge der
Banden (Peaks), die die Basen Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin repräsentieren,
lässt sich die Sequenz des Gens erstellen.
Kapitel II – C: Patientendaten 61
C Patientendaten
Die Etablierung eines Screeningverfahrens zur Mutationsanalyse in der
molekulargenetischen Diagnostik des OTC-Mangels erforderte die Untersuchung
verschiedener Patientenkollektive.
1 Validierung der DGGE-Analyse
Im Rahmen der Einführung der DGGE, dem ersten Teil der experimentellen Arbeit,
wurden insgesamt 53 bereits typisierte DNA-Proben auf Mutationen im OTC-Gen
untersucht. Die Proben erhielten wir von anderen Arbeitsgruppen, die meist als
Screeningverfahren zur Mutationsanalyse eine SSCP- (Single Strand DNA
Conformation Polymorphism) Analyse verwendeten oder die Proben vollständig
sequenziert hatten.
Im ersten Schritt der Einführung der DGGE wurden zunächst 9 DNA-Proben (Nr. 1-9)
analysiert. Die DNA sowie die in Tabelle II-3 dargestellten Informationen bezüglich des
Überträger- bzw. Krankheitsstatus sowie die jeweilige Mutation, wurden uns durch
Herrn Dr. Bakker / Leiden (Niederlanden) zur Verfügung gestellt.
Tabelle II-3 Experiment 1 zur Validierung der DGGE-Analyse. Die jeweiligen Mutationen in den DNA-Proben-Nr. 1-9 wurden mittels DGGE und exonspezifischer Sequenzierung detektiert.
Proben-Nr. Exon / Intron Mutation
1 Exon 5 Arg141Gln Carrier
2 Exon 6 Gly195Arg Carrier
3 Exon 1 Arg23X Patient
4 Exon 6 Ala209V Carrier
5 Exon 6 Ala208Trp Carrier
6 Exon 6 Asp196Asn Patient
7 Exon 4 Arg129His Patient
8 Exon 6 Ala208Trp Patient
9 Exon 2 Met56Thr Patient
Kapitel II – C: Patientendaten 62
Exon 1 R26Q Exon 2 W58X Intron 2/ Exon 3 Dupl1bp Exon 5 R141G Exon 5 R141X Exon 5 L173P Exon 5 L178M Exon 6 K210E Exon 6 A208T Exon 8 G269A Exon 10 T343K
10 männlich 11 männlich 12 weiblich 13 weiblich 14 weiblich 15 männlich 16 männlich 17 weiblich 18 weiblich 19 weiblich 20 weiblich
?
Der zweite experimentelle Schritt befasste sich mit der DGGE-Analyse und
Sequenzanalyse von 11 teils anonymisierten DNA-Proben (Nr. 10-20). Die DNA-
Proben molekulargenetisch gesicherter OTC-Fälle erhielten wir von Herrn Dr. Santer /
Kiel (Deutschland). Zur Verfügung gestellt wurden Daten zum Geschlecht, männlich/
weiblich, sowie eine Liste von 11 Mutationen, die wir nach der Analyse den
entsprechenden Proben zuordnen konnten.
Tabelle II-4 Experiment 2 zur Validierung der DGGE-Analyse. Die Detektion von den patientenspezifischen Mutationen in den DNA-Proben Nr.10-20 erfolgte durch DGGE-Analyse und anschließende Sequenzierung des entsprechenden Exons.
Nach erfolgreichem Abschluss dieses experimentellen Schrittes, folgte die
Untersuchung von 33 anonymisierten DNA-Proben (Nr. 21-53), welche uns durch
Herrn Prof. Wermuth / Bern (Schweiz) zur Verfügung gestellt worden sind. Es standen
lediglich Informationen hinsichtlich des Geschlechts zur Verfügung. Insgesamt waren
es 25 DNA-Proben weiblichen sowie 8 DNA-Proben männlichen Geschlechts. Die
Anonymisierung fand in Bezug auf die nachgewiesenen Mutationen in den Proben des
zur Verfügung stellenden Institutes statt. Nach Vorliegen der Analyseergebnisse wurde
die Anonymisierung aufgehoben und ein Ergebnisvergleich durchgeführt.
Kapitel II – C: Patientendaten 63
2 Prospektive Untersuchung bei Verdacht auf OTC-Mangel
Im Teil zwei der hier vorgelegten Arbeit wurde eine molekulargenetische Diagnostik
bei 10 Familien mit der klinischen Fragestellung Verdacht auf OTC-Mangel
(10 Indexpatienten und 15 Familienangehörigen) durchgeführt. Die zur Verfügung
gestellten Angaben sind in Tab. II-5 zusammengefasst dargestellt. Bei einigen Patienten
standen klinische Daten nur unvollständig zur Verfügung, so dass die Ergebnisse der
molekulargenetischen Analyse nur unter Vorbehalt diskutiert werden können.
Ein biochemisch bzw. enzymatisch gesicherter OTC-Defekt lag lediglich bei Patient
60.1 sowie 61.1 vor. Drei klinische Fälle sollen besonders erwähnt werden.
Tabelle II-5 Auflistung der Patienten bzw. Familien mit V.a. OTC-Mangel und Indikation zur Durchführung einer Molekulargenetischen Analyse des OTC-Gens.
PROBEN-NR. Geschlecht /
Familienstatus Zusammenfassung der Klinischen Angaben
54.1 Weibl. Pat., geb.1997 V.a. OTC-Mangel. Klinische Informationen liegen nicht vor.
54.2 Mutter, geb.1961
55 Weibl. Pat., geb.1996 V.a. heterozygoten OTC-Mangel Klinische Informationen liegen nicht vor.
56.1 Weibl. Pat., geb.1998 V.a. OTC-Mangel. Siehe Text.
56.2 Mutter, geb.1965
56.3 Vater
57 Weibl. Pat., geb. 1996 V.a. OTC-Mangel bei Z.n. Schocksyndrom bei Sepsis. Pancytopenie, Embolische Hirninfarkte. Orotsäure im Urin erhöht. DD: H-H-H-Syndrom.
58 Männl. Pat., geb. 1950 V.a. OTC-Mangel bei rezidivierenden komatösen Zuständen nach Infektionen. Psychopatholog. auffällig i.S. eines Eifersuchtswahns.
59.1 Weibl. Pat., geb.1996 Hyperammonämie mit rezidivierenden Erbrechen, Somnolenz und intermittierender Ataxie. Erhöhung der Transaminasen zwischen 150-250 U/l, Quick 28%.
59.2 Mutter
59.3 Vater
59.4 Schwester von 59.1 Asymptomatisch.
60.1 Männl. Pat., geb. 1999, verstorben im Alter von 5 Tagen
Siehe Text.
60.2 Mutter
60.3 Fetus
60.4 Vater
61.1 Männl. Pat., geb 1999 Anamnese: Hyperammonämie mit Enzephalopathie im Alter von 36 Stunden. Orotsäure stark erhöht, Citrullin nicht nachweisbar. Biochemisch gesicherter OTC-Mangel.
61.2 Mutter
61.3 Schwester von 99-282 Late-onset Form des OTC-Mangels
62.1 Weibl. Pat., geb. 1996 Ungarische Patientin mit V.a. OTC-Mangel. Klinische Informationen liegen nicht vor.
62.2 Mutter
62.3 Vater
Kapitel II – C: Patientendaten 64
PROBEN-NR. Geschlecht / Familienstatus Zusammenfassung der Klinischen Angaben
63.1 Männl. Pat., geb. 2000 Siehe Text.
63.2 Mutter
63.3 Vater
Indexpatient 56 Bei der Patientin 56.1 trat in der zweiten Lebenswoche eine enzephalopatische Krise
mit Hyperammonämie bis 400 µmol/l, erhöhter Orotsäureausscheidung
(3000 mmol/mol Kreatinin) sowie nicht nachweisbaren Citrullin im
Plasmaaminosäureprofil auf. Es wurde die Verdachtsdiagnose eines heterozygoten
OTC-Mangels gestellt. Ein im Verlauf durchgeführter Allopurinoltest war unauffällig,
wie im übrigen auch bei der Mutter des Mädchens. Die Orotsäureausscheidung
normalisierte sich im Verlauf. Unter einer mäßigen Eiweißrestriktion, oraler
Substitution von Citrullin und Gabe von Natriumbenzoat, zeigten sich niedrige
Ammoniakspiegel.
Eine Glutaminerhöhung konnte zu keinem Zeitpunkt nachgewiesen werden. Die in Bern
durchgeführte SSCP-Analyse des OTC-Gens zeigte keinen Hinweis auf das Vorliegen
einer Mutation.
Indexpatient 60 Der Patient 60.1 verstarb im Alter von 5 Tagen im hyperammonämischen Koma. Ein
OTC-Mangel wurde durch eine vermehrte Orotsäureausscheidung im Urin vermutet und
durch eine Leberbiopsie enzymatisch gesichert (Restaktivität von 5 µmol/min/mg
Protein). Als Untersuchungsmaterial bekamen wir DNA aus einer Leberbiopsie. Des
weiteren erhielten wir Untersuchungsmaterial (DNA aus Vollblut) von der Mutter
(60.2) und vom Vater (60.4) des Patienten. Anamnestisch gab es keine Hinweise auf
Stoffwechselerkrankungen oder ungeklärte neonatale Todesfälle in der Familie. Ein bei
der Mutter durchgeführter Allopurinoltest (siehe Tabelle II-6), zeigte eine grenzwertige
Erhöhung von Orotidin und insbesondere der Orotsäure im Urin in µmol/mmol
Kreatinin in Bezug auf die Referenzwerte von Hauser et al. (1990). Zusätzlich erhielten
wir DNA aus einer bei der Mutter durchgeführten Chorionzottenbiopsie (CVS) zur
Durchführung einer Mutationsanalyse des OTC-Gens im Rahmen einer pränatalen
Diagnostik (Probe 60.3).
Kapitel II – C: Patientendaten 65
Tabelle II-6 Ergebnisse des Allopurinoltest von der Probandin 60.2 (Mutter des Patienten 60.1).
Resultat Resultat
Orotsäure (µmol/mmol Kreatinin)
Orotsäure Orotidin (µmol/mmol Kreatinin)
Orotidin
Normale Frau Obligat Heterozygot
Wahrscheinlich Heterozygot
Normale Frau Obligat Heterozygot
Wahrscheinlich Heterozygot
Nullwert 1,80 <0,8 1,4 (<0,8-6,1) 1,3 (<0,8-6,0) 0,3 <0,8 0,8 (<0,8-1,6) 0,8 (<0,8-1,1)1.Periode (0-6h)
15,3 4,1 (<0,8-14,2)
31,6 (2,94-194,5)
25,9 (3,4-66,0)
1,2 1,0 (<0,8-3,0)
4,8 (<0,8-30,7)
4,9 (<0,8-13,9)
2.Periode (7-12h)
10,8 5,4 (<0,8-12,6)
100,6 (2,4-384,0)
46,3 (2,6-231,0)
5,6 2,0 (<0,8-4,6)
27,2 (<0,8-118,5)
21,6 (3,2-49,8)
3.Periode (13-18h)
4,2 3,5 (<0,8-15,5)
65,9 (<0,8-329,9)
39,0 (<0,8-199,0)
5,3 3,0 (0,8-6,5)
28,2 (2,6-78,8)
31,2 (2,0-103,4)
4.Periode (19-24h)
4,8 2,1 (<0,8-7,6)
17,0 (<0,8-66,2)
15,1 (<0,8-65,7)
3,9 3,1 (<0,8-7,2)
20,9 (<0,8-63,4)
30,6 (<0,8-138,2)
Referenzwerte in µmol/mmol Kreatinin Referenzwerte in µmol/mmol Kreatinin
Indexpatient 63 Im Alter von einem Jahr und 11 Monaten wurde bei dem männlichen Patienten die
Verdachtsdiagnose OTC-Mangel gestellt, nachdem eine stationäre Aufnahme bei
starker Unruhe, rezidivierenden Erbrechen und Somnolenz erfolgte. Laborchemisch
wurden wegweisend eine Hyperammonämie mit Werten von 273 µmol/l sowie eine
massiv erhöhte Orotsäure im Urin gemessen. Des Weiteren wurde eine Erhöhung der
Transaminasen, eine Gesamt-Bilirubinerhöhung und ein Quick von 63% festgestellt.
Die klinische Untersuchung ergab eine psychomotorische Entwicklungsverzögerung.
Ein Schädel-MRT zeigte den klassischen Befund einer hyperammonämischen
Enzephalopathie mit Hirnatrophie, fokalen Marklagerveränderungen frontal und
okzipital und subcortikalen U-Fasern. Aus der Anamnese sind bedeutend: ein
rezidivierend auftretender Ikterus, rezidivierende Unruhezustände und Erbrechen, eine
Entwicklungsstörung sowie eine Abneigung gegen Fleisch und Milchprodukte.
Differentialdiagnostisch wurden eine Hepatitis A, B oder C, eine hämolytische Anämie
und eine Sphärozytose ausgeschlossen.
Nach Akuttherapie mit Glukose, Fettinfusion, parenteraler Gabe von Natriumbenzoat
und Argininhydrochlorid, wurde eine Dauerbehandlung mit eiweißarmer Diät
(Gesamteiweißzufuhr von 1,5 g/kg KG/d), Supplementierung essentieller Aminosäuren,
Natriumphenylbutyrat und Citrullin eingeleitet und eine Besserung des klinischen
Bildes unter Normalisierung des Ammoniaks erzielt.
Kapitel II – C: Patientendaten 66
Die Mutationsanalyse erfolgte beim Patienten und den Eltern zunächst aus genomischer
DNA aus Vollblut. Aufgrund des molekulargenetischen Befundes schloss sich eine
Mutationsanalyse aus Fibroblasten sowie Lymphozyten und eine Karyotypisierung des
Patienten an (Prof. G. Wolff, Institut für Humangenetik Freiburg).
Im weiteren Verlauf folgte im Alter von zwei Jahren und 6 Monaten eine stationäre
Aufnahme aufgrund einer Stoffwechselentgleisung mit Hyperammonämie (bis maximal
485 µmol/l), erhöhter Glutaminkonzentration sowie erniedrigter Argininkonzentration
im Plasma. Im Alter von 3 Jahren und 2 Monaten verstarb das Kind an den Folgen eines
hyperammonämischen Komas bei akuter Gastroenteritis während eines
Auslandsaufenthaltes. Trotz Ausschöpfung aller therapeutischer Möglichkeiten zur
Behandlung der Hyperammonämie wurden Plasma-Ammoniakwerte bis 1200 µmol/l
gemessen. Ein MRT des Gehirns zeigte eine schwere akut toxische ödematöse
Veränderung beider Großhirnhemisphären sowie subfalciale, uncale und transtentorielle
Herniation mit beginnender Einklemmung des Hirnstammes. Familienanamnestisch gab
es keine Hinweise auf ähnliche Fälle.
Kapitel III – A: Übersicht 67
L Prom 1 2 3 4 5 6 7/8 9 10 L
Bild 3-1 Darstellung der PCR-Amplifikationsprodukte von Exon 1 bis Exon 10 sowie der Promotorregion für die Sequenzanalyse des OTC-Gens mittels Gelelektrophorese (Agarose). Die Exons sind von 1 bis 10 durchnummeriert. Prom: Promotorregion. L: Größenstandard (1 kb Leiter).
KAPITEL III : ERGEBNISSE
A Übersicht
Im Rahmen der Etablierung der DGGE (Denaturierungs-Gradienten-Gelelktrophorese)
als ein mögliches Screeningverfahren in der Routinediagnostik zur Mutationsanalyse im
OTC-Gen, wurden zunächst bereits typisierte DNA-Proben aus 3 Patientenkollektiven
analysiert. Die Mutationsanalyse der insgesamt 53 DNA-Proben bestand im
Wesentlichen aus zwei Schritten: Analyse der gesamten kodierenden Region des OTC-
Gens und angrenzender Intronabschnitte mittels DGGE und Identifikation zur genauen
Charakterisierung einer detektierten Veränderung durch die exonspezifische
Sequenzierung.
Kapitel III – A: Übersicht 68
Die Ergebnisse bei allen Proben stimmten mit der vorausgegangenen Typisierung
überein.
Bei 45 der 53 DNA-Proben wurden Mutationen in Übereinstimmung mit den
Vorbefunden nachgewiesen. Bei den Proben Nr. 1-9 wurden alle vorgegebenen
Mutationen mittels DGGE erkannt. Bei den Proben Nr. 10-20 konnten Mutationen in
Übereinstimmung mit den vorgegebenen Ergebnissen der verschiedenen Patienten
zugeordnet werden. In den Proben Nr. 21-53 konnten wir bei 8 von 33 Proben keine
Mutation nachweisen; dieses Analyseergebnis deckte sich mit den Ergebnissen der
Schweizer Arbeitsgruppe. In Tabelle III-1 sind die nachgewiesenen Varianten
zusammenfassend aufgeführt und in Kapitel III-B als Abbildungen zu sehen.
Exon1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Exon 6 Exon 7/8 Exon 9 Exon 10 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Bild 3-2 DGGE-Analyse von Exon 1 bis Exon 5 sowie Exon 6 bis Exon 10 desOTC-Gens bei 4 Patienten mit nachgewiesener Mutation. Patientin 1 hat einen Polymorphismus in Exon 2 (K46R) und eine Mutation in Exon 5 (R141Q). Patientin 2 ist heterozygot für eine Mutation in Exon 8 (R277W). Patient 3 ist hemizygot für einenPolymorphismus in Exon 2 (K46R) und eine Mutation in Exon 6 (A208T). Patientin 4 hateine heterozygote Mutation in Exon 9 (W332X). DGGE erfolgte bei 180V, 58°C im Puffertank und einer Laufzeit von 6 Stunden.
Kapitel III – A: Übersicht 69
Tabelle III-1 Tabellarische Auflistung aller entdeckten Mutationen in aufsteigender Reihenfolge im OTC-Gen. Nonsense Mutation bedeutet, Austausch einer Aminosäure gegen STOP Codon. Missense Mutation bedeutet, Aminosäureaustausch chemisch verwandter Aminosäuren (konservativ) bzw. deutlich unterschiedlicher Seitenketten. Frameshift bedeutet, Leserasterverschiebung.
Lokalisation im OTC-Gen
cDNA-Name / -Trivialname-
Mutation Hemizygot (M●)
bzw. Heterozygot (MN)
nachweisbar
Funktionelle Auswirkung
Promotor -176C>G M● / MN
Exon 1 c.67C>T
R23X M● / MN Nonsense Mutation,
CpG Dinukleotid
c.77G>A
R26Q MN CpG Dinukleotid,
Splice site
Intron 1 IVS1+1g>t MN Donorsplicesite
Exon 2 c.119G>A
R40H M● Missense Mutation,
CpG Dinukleotid
c.127C>T
L43F MN Missense Mutation
c.137A>G
K46R M● / MN Polymorphismus
c.167T>C
M56T M● Missense Mutation
c.173G>A
W58X MN Nonsense Mutation
Intron 2/ Exon 3 c.217_218insTTGATTTATAG
Y73fsins11bp Frameshift
Exon 3 c.238A>G
K80E MN Missense Mutation
Intron 3 IVS3-8a>t Polymorphismus
Exon 4 c.299G>A
G100D MN Missense Mutation
c.303A>T
F101L Polymorphismus
c.386G>A
R129H M● CpG Dinukleotid,
Donor splice site
Intron 4 IVS4-7a>g Polymorphismus
Exon 5 c.410C>G
A137G M● / MN Missense Mutation,
konservativ
c.417_418insTATTG M● / MN Frameshift
c.421C>G
R141G MN Missense Mutation
Kapitel III – A: Übersicht 70
Lokalisation im OTC-Gen
cDNA-Name / -Trivialname-
Mutation Hemizygot (M●)
bzw. Heterozygot (MN)
nachweisbar
Funktionelle Auswirkung
c.421C>T
R141X MN Nonsense Mutation,
CpG Dinukleotid
c.422G>A
R141Q MN Missense Mutation,
CpG Dinukleotid
c.518T>C
L173P MN Missense Mutation
c.533C>T
T178M M● Missense Mutation
c.540G>C
Q180H MN Donor splice site
Intron 5 IVS5+1g>a MN Donor splice site
Exon 6 c.548A>G
Y183C MN Missense Mutation
c.583G>A
G195R MN Missense Mutation,
CpG Dinukleotid
c.586G>A
D196N M● Missense Mutation
c.588T>A
D196E M● / MN Missense Mutation,
konservativ
c.605A>C
H202P MN Missense Mutation
c.608_609insTC Frameshift
c.622G>A
A208T M● / MN Missense Mutation,
CpG Dinukleotid
c.626C>T
A209V MN Missense Mutation,
konservativ
c.628A>G
K210E M● Missense Mutation
Exon 7 c.674C>T
P225L M● / MN Missense Mutation
c.717G>T
E239D MN Spleißmutation
Intron 7 IVS7-14t>c Polymorphismus
Exon 8 c.727_730delAAGC Frameshift
c.787G>A
D263N MN Missense Mutation
c.805G>A
G269R M● Missense Mutation
Kapitel III – A: Übersicht 71
Lokalisation im OTC-Gen
cDNA-Name / -Trivialname-
Mutation Hemizygot (M●)
bzw. Heterozygot (MN)
nachweisbar
Funktionelle Auswirkung
c.809A>G
Q270R Polymorphismus
c.829C>T
R277W M● / MN Missense Mutation,
CpG Dinukleotid
Exon 9 c.894G>A
W298X MN Nonsense Mutation
c.996G>A
W332X M● / MN Nonsense Mutation
Intron 9 IVS9-12g>t Polymorphismus
Exon 10 c.1028C>A
T343K M● Missense Mutation
c.1064G>T
X355L MN Missense Mutation
Im zweiten Abschnitt der vorliegenden Arbeit führten wir bei 10 Patienten mit Verdacht
auf OTC-Mangel sowie 15 Familienangehörigen eine molekulargenetische Diagnostik
durch. Die Analyse der gesamten kodierenden Region des OTC-Gens und angrenzender
Intronabschnitte erfolgte auch hier im ersten Schritt bei allen Patienten und
Familienangehörigen mittels DGGE als Screeningverfahren. Anschließend nutzten wir
zur Identifikation der genauen Veränderung die exonspezifische Sequenzierung.
Konnten wir bei hinreichendem klinischen bzw. biochemischen Verdacht auf OTC-
Mangel in der DGGE keinen Hinweis auf das Vorliegen einer genetischen Veränderung
finden, schlossen wir die Sequenzanalyse der gesamten kodierenden Region des OTC-
Gens und angrenzender Intronabschnitte sowie der 5’-nicht-translierten Region an.
Bei insgesamt 6 der 10 Patienten gelang trotz dieser eingehenden Mutationsanalyse kein
Nachweis einer potentiell krankheitsverursachenden Mutation. Bei zwei dieser 6
Patienten, Indexpatienten Nr. 54 und Nr. 55, standen uns keine klinischen und
biochemischen Angaben bzgl. der Verdachtsdiagnose OTC-Mangel zur Verfügung. Bei
3 Patienten war das klinische Bild untypisch für einen OTC-Mangel (Nr. 56, Nr. 57,
Nr. 58). Bei Indexpatient Nr. 60 konnten wir trotz enzymatischer Sicherung der
Diagnose die potentiell verantwortliche Mutation nicht detektieren.
Kapitel III – A: Übersicht 72
Allerdings zeigte die Sequenzanalyse der Promotorregion eine Sequenzvariante, deren
Bedeutung nur spekulativ beurteilt werden kann.
Bei 4 der 10 Patienten konnten wir die potentiell krankheitsverursachende Mutation
nachweisen (Patient Nr. 59, Nr. 61, Nr. 62, Nr. 63).
Die Ergebnisse sind in Tab.III-1 integriert. Die Analyseergebnisse der jeweiligen
Patienten sind in Kapitel III-C aufgeführt.
Kapitel III –B: Analyseergebnisse 73
B Darstellung der Analyseergebnisse
Bei der Mutationsanalyse der 53 DNA-Proben wurden mittels DGGE insgesamt 36
unterschiedliche Mutationen nachgewiesen. Davon waren 24 Missense-Mutationen, 5
Nonsense-Mutationen, 4 Donorsplicesite-Mutationen sowie 2 Insertionen und 1
Deletion. Fünf Mutationen (D196E, A208T, P225L, R277W, W332X) wurden sowohl
heterozygot als auch hemizygot nachgewiesen.
Im folgenden sind die Analyseergebnisse der DGGE und die entsprechenden
Sequenzierergebnisse für die unterschiedlichen Mutationen in den DNA-Proben Nr.
1-53 aufgeführt. Jede Mutation ist jeweils durch einen Ausschnitt der DGGE und einen
Auszug der relevanten Sequenz dargestellt. Die verwendeten Abkürzungen stehen für:
N -Wildtyp;
M● -Mutation, hemizygot;
MN -Mutation, heterozygot;
PN -Polymorphismus, heterozygot;
P● -Polymorphismus, hemizygot;
M+ -gemischte Probe (gesunder hemizygoter Mann + potentiell erkrankter
hemizygoter Mann);
MP -Mutation und Polymorphismus in trans;
MP/N -Mutation und Polymorphismus in cis; Wildtyp auf anderem Chromosom
MP/P -Mutation und Polymorphismus in cis u. Polymorphismus auf anderem
Allel
EXON 1 / Intron 1
Bild 3-3 Ergebnisse der DGGE-Analyse Exon1. A: Darstellung der Mutation R23X (hemizygot). B: Darstellung der Mutation R26Q (heterozygot). C: Darstellung der Mutation IVS1+1g>t (heterozygot) in Intron 1.
M● N N
A
R23X
N MN N
B R26Q
N N MN
C
IVS1+1
Kapitel III – B: Analyseergebnisse 74
Bild 3-4 Sequenzanalyse der Mutation R23X (hemizygot).
Die Mutation R23X (c.67C>T) konnte hemizygot in der DGGE-Analyse (Bild 3-3A)
durch das Auftreten einer Homoduplexbande (M●), welche sich durch die Position im
Gel deutlich von der Wildtypbande abgrenzen ließ, nachgewiesen werden. In der
DGGE-Analyse (Bild 3-3B) der weiblichen Patientin Nr. 19 ließ sich nur in Exon 1 ein
vom Wildtyp abweichendes Bandenmuster abgrenzen (in der direkten Betrachtung
besser sichtbar; aufgrund einer vermutlich zu geringen DNA-Konzentration der Probe
war die Auswertung der DGGE-Analyse erschwert). Die Mutation IVS1+1g>t im Intron
1 zeigte sich in der DGGE-Analyse durch das Auftreten von 2 Homoduplexbanden und
2 Heteroduplexbanden (MN). In Bild 3-3C kann man eine Homoduplexbande in Höhe
der Wildtypbanden (N) und eine weitere oberhalb dieser erkennen. Das würde einem
vorhandenen Wildtyp-Allel und einem mutanten Allel entsprechen. Die Mutation ist
daher auch hemizygot nachweisbar.
R23X / c.67C>T Bei der Mutation R23X verändert die
Substitution der Base Cytosin durch Tyrosin
an cDNA-Position 67 des OTC-Gens das
Codon Nr. 23, welches für die Aminosäure
Arginin (CGA) kodierte, zu einem Stopcodon
(TGA). Es handelt sich in diesem Fall um
eine sogenannte Nonsense-Mutation (Austausch einer Aminosäure gegen ein
Stopcodon). Abbildung 3-4 zeigt das Sequenzierergebnis bei einem hemizygoten
Knaben.
R26Q / c.77G>A
Die Mutation R26Q wurde in der
Sequenzanalyse bei Patientin 19 heterozygot
nachgewiesen (Bild 3-5). Die Substitution
der Base G durch A an cDNA-Position 77
des OTC-Gens betrifft das letzte Nukleotid
von Exon 1. Bild 3-5 Sequenzanalyse der Mutation R26Q (heterozygot).
Kapitel III – B: Analyseergebnisse 75
Das Codon Nr. 26 kodiert nun nicht mehr für die Aminosäure Arginin (CGG) sondern
für Glutamin (CAG); wahrscheinlich wird aber auch das korrekte Spleißen von Exon 1
gestört.
IVS1+1g>t In der Sequenzanalyse von Exon 1 ist diese
Mutation als Substitution der Base Guanin
durch Thymin in der Splice-Donor-Stelle
(erste Base im Intronbereich) in Intron 1
identifiziert worden (Bild 3-6).
Es ist anzunehmen, dass sie das korrekte
Spleißen von Exon 1 verhindert.
EXON 2
Bild 3-7 Ergebnisse der DGGE-Analyse Exon 2. A: Darstellung der Mutation R40H (M●-hemizygot und in gemischter Probe M+). B: Darstellung der Mutation L43F und des Polymorphismus K46R (heterozygot). C: Darstellung des Polymorphismus K46R (PN- heterozygot, P●-hemizygot). D: Darstellung der Mutation M56T (M●-hemizygot). E: Darstellung der Mutation W58X (MN-heterozygot) sowie des Polymorphismus K46R (PN-heterozygot).
Die Mutation R40H (c.119G>A) fanden wir bei einem männlichen Patienten in der
DGGE-Analyse (Bild 3-7A) als einzelne Homoduplexbande (M●) oberhalb der dem
Wildtyp entsprechenden Bande (N). Das bei einem für die Mutation heterozygoten
Bild 3-6 Sequenzanalyse der Mutation IVS1+1g>t (heterozygot) in Intron 1 des OTC-Gens.
N M● M+ N
A
N N MP
B
PN P● N
C
N M● N
D
R40H L43F
M56T
MN N PN
E
W58X
K46R
Kapitel III – B: Analyseergebnisse 76
Patienten zu erwartende Bandenmuster, haben wir durch Mischung einer Wildtyp-
DNA-Probe mit der für die Mutation hemizygoten DNA-Probe erzeugt (M+). In der
DGGE-Analyse der weiblichen Patientin Nr. 23 fand sich abweichend von der
Wildtypbande (N) eine heterozygot erscheinende DNA-Veränderung (MP), die in der
Sequenzanalyse als Mutation L43F (c.127C>T) und Polymorphismus K46R
(c.137A>G) identifiziert wurde. In Bild 3-7B können in MP die Homoduplexe leicht
von der Heteroduplexbande unterschieden werden. Man erkennt, dass sich keine der
Homoduplexbanden auf Höhe der Wildtypbanden (N) befindet. Im Vergleich mit der
Wildtyp-Homoduplex arretiert der Polymorphismus-Homoduplex niedriger und der
Mutations-Homoduplex im Gel höher. Daraus lässt sich schlussfolgern, Mutation und
Polymorphismus befinden sich in trans, d.h. auf zwei verschiedenen Allelen. In Bild
3-7C ist der Polymorphismus K46R (c.137A>G) in heterozygoter und hemizygoter
Form dargestellt. Vergleicht man PN und P●, sieht man bei PN neben einer
Homoduplexbande, die P● entspricht, eine weitere Homoduplexbande, die der
Wildtypbande entspricht. Die Mutation M56T (c.167T>C) wurde bei dem männlichen
Patienten Nr. 9 hemizygot als eine unterhalb der dem Wildtyp entsprechenden Bande
(N) nachgewiesen (Bild 3-7D). Bei der weiblichen Patientin Nr. 12 zeigte sich in der
DGGE-Analyse (Bild 3-7E) durch das Auftreten von 2 Homoduplexbanden und 2
Heteroduplexbanden eine heterozygot erscheinende Variante, welche in der
Sequenzanalyse als Mutation W58X (c.173G>A) identifiziert wurde.
R40H / c.119G>A In der Sequenzanalyse wurde die Mutation
hemizygot durch Substitution der Base G
durch A an cDNA-Position 119
nachgewiesen. Somit kodiert das Codon Nr.
40 nicht mehr für die Aminosäure Arginin
(CGT) sondern für Histidin (CAT).
Die Mutation betrifft ein CpG-Dinukleotid.
Bild 3-8 Sequenzanalyse der Mutation R40H (hemizygot) in Exon 2 des OTC-Gens.
Kapitel III – B: Analyseergebnisse 77
L43F / c.127C>T
Die Substitution der Base C durch T an cDNA-
Position 127 bedingt die Mutation L43F
(heterozygot). Der Polymorphismus K46R
besteht in der Substitution der Base A durch G
bei cDNA-Position 137 (heterozygot).
K46R / c.137A>G Bei der Mutation K46R handelt es sich um einen Polymorphismus in Exon 2 des OTC-
Gens, der mit einer Allelfrequenz von 64% auftritt (Grompe et al. 1989). Die
Substitution der Base A durch G bei cDNA-Position 137 des OTC-Gens bedingt die
Mutation K46R.
M56T / c.167T>C
In der Sequenzanalyse wurde die Mutation
hemizygot durch Substitution der Base T durch
C an cDNA-Position 167 nachgewiesen.
L43F K46R
Bild 3-9 Sequenzanalyse der Mutation L43F und des Polymorphismus K46R (heterozygot) in Exon 2 des OTC-Gens.
A B
Bild 3-10 Sequenzanalyse des Polymorphismus K46R in Exon 2 des OTC-Gens. A. Heterozygot B. Hemizygot.
Bild 3-11 Sequenzanalyse der Mutation M56T (hemizygot) in Exon 2 des OTC-Gens.
Kapitel III – B: Analyseergebnisse 78
W58X / c.173G>A
In der Sequenzanalyse wurde die Mutation W58X bei
der Patientin Nr. 12 heterozygot identifiziert.
Die Substitution der Base G durch A an cDNA-
Position 173 des OTC-Gens verändert das Codon Nr.
58, welches für die Aminosäure Tryptophan (TGG)
kodierte zu einem STOP-Codon (TAG).
Intron 2 / Exon 3
Bild 3-13 Darstellung der Duplikation c.217-10_217dup am Beginn von Exon 3 des OTC-Gens. A: DGGE-Analyse. B: Sequenzanalyse: a: Die Duplikation der letzten 11 Nukleotide von Intron 2 führt vermutlich zu einer Verschiebung des Leserasters ab Codon Nr. 73, sodass eine veränderte Abfolge der Aminosäuren resultiert. b: Kontrollsequenz.
Insertion zwischen 2 benachbarten Nukleotiden / c.217_218insTTGATTTATAG oder Y73fsins11bp
In der DGGE-Analyse von Exon 3 detektierten wir bei der weiblichen Patientin Nr. 20
eine vom Wildtyp (N) abweichende DNA-Veränderung (MN) in Form von drei Banden.
In der sich anschließenden Sequenzanalyse konnte diese Mutation als Insertion von 11
Basenpaaren identifiziert werden (siehe Bild 3-13B). Dabei findet eine Duplikation der
letzten 11 Basenpaare (Bild 3-13B-a: rote Markierung) von Intron 2 statt. Es ist
anzunehmen, dass die erste der beiden potentiellen Splice-Akzeptorsequenzen zum
Spleißen vom Intron verwendet wird und in der Folge es zu einer Insertion zusätzlicher
Aminosäuren mit Verschiebung des Leserasters kommt. Deletionen, Insertionen oder
Duplikationen nehmen im Vergleich zu Punktmutationen einen geringen Anteil ein.
insTTGATTTATAG
→ Intron 2 ← 73 74 75 76 77 78
a tccttgatttatag TTG ATT TAT AGT ATT TGC Leu Ile Tyr Ser Ile Cys
→ Intron 2 ← 73 74 75 76 77 78
b tccttgatttatag TAT TTG CCT TTA TTG CAA Tyr Leu Pro Leu Leu Gln
B
N N N MN
A
Bild 3-12 Sequenzanalyse der Mutation W58X (heterozygot) in Exon 2 des OTC-Gens.
Kapitel III – B: Analyseergebnisse 79
Sie zeigen in der DGGE-Analyse meist einen großen Abstand zwischen Homo- und
Heteroduplexbanden.
Exon 3
Bild 3-14 Darstellung der Mutation K80E (heterozygot) in Exon 3 des OTC-Gens. A: DGGE-Analyse. B: Sequenzanalyse: Substitution der Base A durch G an cDNA-Position 238 des OTC-Gens.
K80E / c.238A>G Diese Mutation konnte heterozygot in der DGGE-Analyse durch das Auftreten von zwei
Homoduplexbanden und eines Heteroduplexes nachgewiesen werden. In Bild 3-14A
erkennt man bei MN eine Homoduplexbande übereinstimmend mit der Wildtypbande,
eine weitere Bande unterhalb der Wildtypbande sowie einen Heteroduplex oberhalb der
Wildtypbande. In der Sequenzanalyse von Exon 3 zeigte sich die Substitution der Base
Adenin durch Guanin bei cDNA-Position 238, wodurch Codon Nr. 80 nicht mehr für
Lysin (AAG) sondern für Glutamat (GAG) kodiert.
Exon 4 Die Auswertung der DGGE-Analyse von Exon 4 des OTC-Gens gestaltete sich durch
das konstante Auftreten einer unspezifischen zusätzlichen Bande schwierig. Eine
Optimierung der Ergebnisse wäre wahrscheinlich durch ein verbessertes Primerdesign
zu erreichen. Die Schmelztemperaturkurve (siehe Seite 50-Kapitel II-B) der von uns
verwendeten Primer für Exon 4 zeigt im 5’-Bereich der untersuchten Sequenz eine
Absenkung der Schmelztemperatur unter 70°C. Ein geradliniger Verlauf der Kurve
wäre für optimale Ausgangsbedingungen wünschenswert. Nichtsdestotrotz konnten wir
in der DGGE-Analyse alle untersuchten DNA-Veränderungen detektieren.
N MN N
A B
Kapitel III – B: Analyseergebnisse 80
Bild 3-15 Darstellung der Mutation G100D (heterozygot) in Exon 4 des OTC-Gens. A: DGGE-Analyse. B: Sequenzanalyse: Die Sequenzanalyse der Patienten in Spur 1 und 2 ergab einen Wildtyp in Exon 4. Die Substitution der Base G durch A an cDNA-Position 299 bedingt die Mutation G100D (heterozygot) und führt zur Umwandlung des Codons GGC in das Codon GAC.
Bild 3-16 Darstellung der Mutation R129H (hemizygot) in Exon 4 des OTC-Gens. A: DGGE-Analyse. In Spur 2 kann man eine DNA-Veränderung erkennen, welche sich von Spur 1 und 3 durch die Höhe der Homoduplexbande unterscheidet. B: Sequenzanalyse: Die Sequenzanalyse der Patienten in Spur 1 und 3 ergab einen Wildtyp in Exon 4. Die Substitution der Base G durch A an cDNA- Position 386 bedingt die Mutation R129H (hemizygot) und führt zur Umwandlung des Codons CGT in das Codon CAT.
G100D / c.299G>A Bei der weiblichen Patientin Nr. 25 detektierten wir in der DGGE-Analyse von Exon 4
eine Variante (MN in Bild 3-15A), die in der Sequenzanalyse als Mutation G100D
(heterozygot) identifiziert wurde.
R129H / c.386G>A In der DGGE-Analyse (Bild 3-16A) von Patient Nr.7 detektierten wir eine hemizygote
DNA-Veränderung (M●), welche in der Sequenzanalyse (Bild 3-16B) als Mutation
R129H identifiziert wurde. Diese Mutation haben wir nochmals bei dem männlichen
Patienten Nr. 32 mittels DGGE-Analyse und direkter Sequenzierung identifiziert. Die
Mutation betrifft ein hypermutagenes CpG-Dinukleotid, was das mehrfache
unabhängige Auftreten erklärt. c.386.G>A betrifft das letzte Nukleotid von Exon 4 und
stört vermutlich auch das direkte Spleißen.
B
N N MN
A
1 2 3
N M● N
A B
1 2 3
Kapitel III – B: Analyseergebnisse 81
Exon 5
Bild 3-17 Ergebnisse der DGGE Analyse Exon 5. A: Darstellung der Mutation R141G (heterozygot) und T178M (hemizygot). Demonstration einer hemizygoten und heterozygoten DNA-Veränderung im Vergleich zum Wildtyp (N): Spur 1, für Mutation und Polymorphismus hemizygoter männlicher Patient (Nr. 16); Spur 2, für Mutation heterozygote und Polymorphismus homozygote weibliche Patientin (Nr. 17); Spur 3, Wildtyp. B: Darstellung der Mutation R141Q mit dem Polymorphismus IVS4-7a>g. C: Darstellung der Mutation R141X (Spur2) und der Mutation L173P (Spur3) zusammen mit dem Polymorphismus IVS4-7a>g (homozygot). D: Darstellung der Mutation Q180H (heterozygot) in Exon 5 sowie IVS5+1g>c (heterozygot).
Der Ausschnitt der DGGE Analyse von Exon 5 in Bild 3-17A zeigt in Spur 1 eine
deutlich vom Wildtyp (N) abgrenzbaren Homoduplexbande. Die Sequenzanalyse ergab
ein hemizygotes Allel mit der Mutation T178M (c.533C>T) und dem Polymorphismus
IVS4-7a>g. In der DGGE Analyse war nicht erkennbar, dass neben der Mutation
zusätzlich noch ein Polymorphismus vorliegt.
In Spur 2 in Bild 3-17A erkennt man eine heterozygot erscheinende DNA-Veränderung,
die in der Sequenzanalyse heterozygot als Mutation R141G (c.421C>G) und homozygot
als Polymorphismus IVS4-7a>g identifiziert wurde. Schon durch die DGGE-Analyse ist
erkennbar, dass es sich nicht nur um eine Mutation in Exon 5 handelt, da sich die aus
zwei unterschiedlichen Allelen zusammengesetzte Homoduplexbande nicht auf Höhe
der Wildtypbande befindet. Ein Wildtypallel liegt also nicht vor. Bei der weiblichen
Patientin befindet sich auf einem Allel die Mutation R141G und der Polymorphismus,
auf dem zweiten Allel allein der Polymorphismus IVS4-7a>g.
T178M R141G
A 1 2 3
PM● PM/P N MN N N
B
R141Q R141X
L173PC 1 2 3
N MN MN
1 2 3 4 D
MN N MN N IVS5+1 Q180R
Kapitel III – B: Analyseergebnisse 82
In der DGGE-Analyse fand sich bei zwei weiblichen Patientinnen (Nr. 1 und Nr. 37)
das gleiche Bandenmuster mit zwei Homoduplexen und zwei Heteroduplexen (Bild 3-
17B). In der sich anschließenden Sequenzanalyse von Exon 5 wurde in beiden Fällen
neben der heterozygot vorliegenden Mutation R141Q (c.422G>A), homozygot der
Polymorphismus IVS4-7a>g identifiziert.
Bei der weiblichen Patientin Nr. 13 (Bild 3-17C Spur 2) lassen sich zwei
Homoduplexbanden von zwei Heteroduplexbanden abgrenzen. In der Sequenzanalyse
erwies sich die heterozygot erscheinende DNA-Veränderung als Mutation R141X
(c.421C>T) im Heterozygotenstatus und homozygot vorliegender Polymorphismus
IVS4-7a>g.
Zusammengefasst kann man feststellen, dass sich die drei detektierten Mutationen im
Codon 141 anhand des Bandenmusters in der DGGE-Analyse voneinander
unterscheiden lassen.
Bei der weiblichen Patientin Nr. 14 (Bild 3-17C Spur 3) erkennt man zwei
Homoduplexbanden, eine unterhalb der Wildtypbande und eine auf Höhe der
Wildtypbande, und zwei etwas abgeschwächte Heteroduplexbanden. Im Vergleich mit
den Bandenmustern der anderen Mutationen ist das Auftreten einer Homoduplexbande
unterhalb der Wildtypbande auffallend.
In der DGGE-Analyse (Bild 3-17D) der beiden weiblichen Patientinnen Nr. 27 (Spur 1)
und Nr. 29 (Spur 3) detektierten wir jeweils heterozygot erscheinende DNA-
Veränderungen. In Spur 1 sind neben einer Homoduplexbande zwei
Heteroduplexbanden erkennbar, während in Spur 3 jeweils zwei Homoduplex -und
Heteroduplexbanden erkennbar sind. In beiden Fällen wurde in der anschließenden
Sequenzanalyse neben einer heterozygoten Mutation der Polymorphismus IVS4-7a>g
homozygot nachgewiesen.
Der Polymorphismus IVS4-7a>g konnte in der Sequenzanalyse der Proben mit
auffälligem Bandenmuster in Exon 5 der DGGE-Analyse identifiziert werden. Ob diese
Variante auch bei den in der DGGE als Wildtyp interpretierten Banden vorhanden ist,
wurde nicht in jedem Fall geklärt. Die Sequenzanalyse einer solchen einem Wildtyp
interpretierten Bande (Probe Nr. 35) ergab den Polymorphismus in homozygoter Form.
Nach Matsuura et al. tritt der Polymorphismus mit einer Allelhäufigkeit von 29% auf
(Matsuura et al. 1993).
Kapitel III – B: Analyseergebnisse 83
R141G / c.421C>G In einer Untersuchung von McCullough et al. wurde gezeigt, dass nur wenige
Mutationen wiederholt auftreten. Mutationen im Codon
141 werden jedoch wiederholt beobachtet. Codon Nr. 141
ist ein CpG-Dinukleotid, was vermutlich die höhere
Mutationsrate bedingt (McCullogh et al. 2000). Bei der
Mutation R141G findet eine Substitution der Base C
durch G an cDNA-Position 421 der genomischen DNA
statt.
R141Q / c.422G>A In der Sequenzanalyse von Exon 5 der weiblichen
Patientinnen Nr. 1 und Nr. 37 wurde neben der
heterozygot vorliegenden Mutation R141Q,
homozygot der Polymorphismus IVS4-7a>g
identifiziert. Die Substitution der Base G durch A
an cDNA-Position 422 bedingt die Mutation
R141Q (heterozygot) und führt zur Umwandlung
des Codons CGA in das Codon CAA.
R141X / c.421C>T
Die Substitution der Base C durch T an cDNA-
Position 421 bedingt die Mutation R141X
(heterozygot) und führt zur Umwandlung des
Codons CGA in das Stopcodon TGA.
L173P / c.518T>C Bei der weiblichen Patientin Nr. 14 wurde in der Sequenzanalyse die Mutation L173P
heterozygot und der Polymorphismus IVS4-7a>g homozygot identifiziert
(Sequenzanalyse nicht abgebildet). Die Mutation L173P entsteht durch Substitution der
Base T durch C an cDNA-Position 518.
R141G
Bild 3-18 Sequenzanalyseder Mutation R141G(heterozygot) in Exon 5 des OTC-Gens.
Bild 3-19 Sequenzanalyse der Mutation R141Q (heterozygot) in Exon 5 des OTC-Gens.
R141X
Bild 3-20 Sequenzanalyse der Mutation R141X (heterozygot) in Exon 5 des OTC-Gens.
Kapitel III – B: Analyseergebnisse 84
T178M / c.533C>T Bei dem männlichen Patienten Nr. 16 wurde
hemizygot die Mutation T178M nachgewiesen. Die
Mutation T178M entsteht durch Substitution der
Base C durch T an cDNA-Position 533 des OTC-
Gens.
Q180H / c.540G>C
Bei der weiblichen Patientin Nr. 27 wurde in der
Sequenzanalyse neben der heterozygoten Mutation
Q180H der Polymorphismus IVS4-7a>g homozygot
nachgewiesen. Die Mutation Q180H entsteht durch
Substitution der Base G durch C an cDNA-Position
540 (heterozygot).
IVS5+1g>c
Die Mutation IVS5+1 wurde bei der Patientin
Nr. 29 heterozygot nachgewiesen und betrifft
die erste Base im Intron 5 durch Substitution
der Base G durch A. Zusätzlich fand sich der
Polymorphismus IVS4-7a>g homozygot.
Q180H
Bild 3-22 Sequenzanalyse der Mutation Q180H (heterozygot) in Exon 5 des OTC-Gens.
T178M
Bild 3-21 Sequenzanalyse der Mutation T178M (hemizygot) in Exon 5 des OTC-Gens.
IVS5+1 g>c
Bild 3-23 Sequenzanalyse der MutationIVS5+1g>c (heterozygot) in Intron 5 desOTC-Gens.
Kapitel III – B: Analyseergebnisse 85
Exon 6
Bild 3-24 Ergebnisse der DGGE Analyse Exon 6. A: Darstellung der Mutation Y183C (heterozygot). B: Darstellung der Mutation G195R und A209V (heterozygot). C: Darstellung der Mutation D196E. C.I zeigt das Ergebnis eines männlichen Patienten, dessen DNA mit Wildtyp-DNA gemischt wurde (M+). C.II zeigt die DGGE-Analyse einer weiblichen Patientin (MN). D: Darstellung der Mutation D196N. Im linken Bild hemizygot durch das Auftreten einer einzigen vom Wildtyp abweichenden Homoduplexbande (M●) zu sehen. Während im rechten Bild die DNA des Patienten mit Wildtyp-DNA gemischt wurde (M+). E: Darstellung der Mutation H202P (heterozygot). F: Darstellung der Insertion c.608_609insTC. G: Darstellung der Mutation A208T. H: Darstellung der Mutation K210E (hemizygot).
Die Mutation Y183C (c.548A>G) konnte in der DGGE-Analyse (Bild 3-24A –MN-) bei
der Patientin Nr. 24 durch das Auftreten von zwei Homoduplexbanden und zwei
Heteroduplexbanden, entsprechend einem Wildtyp-Allel und einem mutanten Allel,
heterozygot nachgewiesen werden. In Bild 3-24B sind die Mutationen G195R
(c.583G>A) und A209V (c.626C>T) dargestellt. Man erkennt neben dem Wildtyp (N)
anhand der unterschiedlichen Bandenmuster, dass es sich erstens um heterozygote
Veränderungen entsprechend einem Wildtyp-Allel und einem mutanten Allel handelt.
Zweitens lässt das verschiedene Laufverhalten der Homo- und Heteroduplexbanden im
Gel erkennen, dass es sich um zwei unterschiedliche Mutationen handeln muss. In Bild
3-24C ist die Mutation D196E (c.588T>A) in der DGGE-Analyse bei dem männlichen
Patienten 43 und der weiblichen Patientin 44 dargestellt. Da die Homoduplexbande
dieser Mutation nicht von der Wildtypbande unterscheidbar ist, zeigte sich in der
DGGE-Analyse ein auffälliger Befund erst nach Mischung der DNA-Probe mit einem
N MN N
A
N MN MN
B
G195R A209VY183C N N M+
C.I
D196E MN N N
C.II
D196E
N N MN
F
InsTC N M● N N N M+
D
D196N D196N
N MN N
E
H202P
M● N N
H
K210E
M+ MN N
G
A208T
Kapitel III – B: Analyseergebnisse 86
männlichen Wildtyp. Dadurch entsteht wie in Bild 3-24C.I-M+- gezeigt, ein
heterozygot erscheinendes Bandenmuster, welches dem bei der weiblichen Patientin
(Bild 3-24C.II-MN-) entspricht.
Bei Patient Nr. 6 detektierten wir in der DGGE-Analyse eine vom Wildtyp (N)
abweichende Homoduplexbande (M●). In einer weiteren DGGE-Analyse haben wir die
DNA des potentiell erkrankten hemizygoten männlichen Patienten mit männlicher
Wildtyp-DNA gemischt und erzeugten damit ein heterozygot erscheinendes
Bandenmuster (siehe Bild 3-24D rechts-M+-). Man erkennt insgesamt 4 Banden, wovon
eine dem Wildtyp entspricht (Wildtyp-Allel), eine weitere Homoduplexbande und zwei
Heteroduplexbanden.
Die Mutation H202P (c.605A>C) konnte heterozygot in der DGGE-Analyse durch das
Auftreten von zwei Homoduplexbanden und zwei Heteroduplexbanden nachgewiesen
werden. In Bild 3-24E erkennt man bei MN eine Homoduplexbande übereinstimmend
mit der Wildtypbande, eine weitere Bande unterhalb der Wildtypbande sowie zwei
Heteroduplexbanden oberhalb der Wildtypbande.
Bei der weiblichen Patientin Nr. 49 zeigte die DGGE-Analyse vom Wildtyp
abweichend zwei Homoduplexbanden mit sehr großen Abstand zwischen zwei
Heteroduplexbanden (Bild 3-24F). In der anschließenden Sequenzierung von Exon 6
konnte die Insertion von 2 Basen (TC) an der Position 608_609 der cDNA des OTC-
Gens nachgewiesen werden.
Die Mutation A208T (c.622G>A) haben wir sowohl bei männlichen (hemizygot) als
auch bei weiblichen Patienten (heterozygot) nachgewiesen. In Bild 3-24G gezeigt ist ein
Ausschnitt der DGGE-Analyse von Exon 6, wo vom Wildtyp (N) abweichende DNA-
Veränderungen mit gleichem Bandenmuster auftreten. Es lässt sich im Vergleich mit
dem Wildtyp (N) deutlich ein heterozygoter Genotyp (MN) abgrenzen. Durch Mischung
einer Wildtyp-DNA-Probe mit der für die Mutation hemizygoten DNA-Probe, erhält
man das einem heterozygoten Genotyp entsprechende Bandenmuster (M+); allerdings
überwog im dargestellten Fall mengenmäßig die Wildtyp-DNA, weswegen die
Mutation-Homoduplexbande schwächer erscheint.
Bei dem männlichen Patienten Nr. 11 zeigte sich eine vom Wildtyp (N) abweichende
DNA-Veränderung in Exon 6 (im Bild 3-24H), welche aufgrund der schlechten DNA-
Qualität der Probe Nr. 11 nur schwach zu erkennen war.
Kapitel III – B: Analyseergebnisse 87
Y183C / c.548A>G Die Mutation Y183C wurde in der
Sequenzanalyse bei Pat. Nr. 24 heterozygot
nachgewiesen. Die Substitution der Base A
durch G an cDNA-Position 548 des OTC-
Gens betrifft das Codon Nr. 178, welches nun
nicht mehr für die Aminosäure Tyrosin
(TAT) sondern für Cystein (TGT) kodiert.
G195R / c.583G>A Bei dieser Mutation handelt es sich um eine
CpG-Mutation, bei der die Substitution der
Base G durch A im Codon Nr. 195 zu einem
Austausch der Aminosäure Glycin (GGG)
durch Arginin (AGG) führt. Expressions-
studien zeigten keine nachweisbare OTC-
Aktivität (Tuchman et al. 1994).
D196E / c.588T>A
Diese Mutation wurde bei dem männlichen
Patient Nr. 43 hemizygot und der weiblichen
Patientin Nr. 44 heterozygot nachgewiesen. In
der Sequenzanalyse zeigt sich die Mutation
D196E durch eine Substitution der Base T
durch A an cDNA-Position 588 des OTC-
Gens.
D196N / c.586G>A Bei Patient Nr. 6 haben wir in der
Sequenzanalyse von Exon 6 die
Mutation D196N identifiziert, durch
welche das Codon Nr. 196 nicht mehr
für die Aminosäure Aspartat (GAT)
sondern für Asparagin (AAT) kodiert.
Bild 3-25 Sequenzanalyse der Mutation Y183C in Exon 6 des OTC-Gens (heterozygot).
G195R
Bild 3-26 Sequenzanalyse der Mutation G195R in Exon 6 des OTC-Gens (heterozygot).
hemizygot
heterozygot
Bild 3-27 Sequenzanalyse der Mutation D196R in Exon 6 des OTC-Gens.
Bild 3-28 Sequenzanalyse der Mutation D196N in Exon 6 des OTC-Gens (hemizygot).
Kapitel III – B: Analyseergebnisse 88
H202P / c.605A>C In der Sequenzanalyse zeigte sich die
Mutation durch die Substitution der Base
Adenin durch Cytosin an cDNA-Position 605,
wodurch Codon Nr. 202 nicht mehr für
Histidin (CAC) sondern für Prolin (CCC)
kodiert.
c.608_609insTC In der Sequenzierung von Exon 6 der
weiblichen Patientin Nr. 49 wurde eine
Insertion nachgewiesen. Die Insertion
von 2 Basen (TC) an cDNA-Position
608_609 des OTC-Gens führt zu einer
Verschiebung des Leserasters
(Frameshift) und somit zu einer
Veränderung der nachfolgenden
Aminosäuren im Genprodukt.
A208T / c.622G>A
Die Mutation A208T wird durch Substitution
der Base G durch A an cDNA-Position 622
bedingt, wodurch das Codon GCA nicht mehr
für die Aminosäure Alanin kodiert, sondern
mit dem Codon ACA für Threonin. Die
Mutation konnte sowohl hemizygot als auch
heterozygot nachgewiesen werden.
Bild 3-29 Sequenzanalyse der Mutation H202P in Exon 6 des OTC-Gens (heterozygot).
199 200 201 202 203 204 205 206 207
A AAT ATC CTG CAC TCT CCA TCA TGA TGA Asn Ile Leu His Ser Pro Ser Stop Stop
199 200 201 202 203 204 205 206 207
B AAT ATC CTG CAC TCC ATC ATG ATG AGC Asn Ile Leu His Ser Ile Met Met Ser
InsTC
Bild 3-30 Sequenzanalyse der Insertion c.608_609insTC in Exon 6 des OTC-Gens.
hemizygot
heterozygot
Bild 3-31 Sequenzanalyse der Mutation A208T in Exon 6 des OTC-Gens.
Kapitel III – B: Analyseergebnisse 89
A209V / c.626C>T
Durch die Substitution der der Base C durch T
an cDNA-Position 626 des OTC-Gens entsteht
die Mutation A209V.
K210E / c.628A>G In der Sequenzanalyse zeigte sich die Mutation
in einer hemizygoten Substitution der Base
Adenin durch Guanin an cDNA-Position 628
des OTC-Gens. Das Codon Nr. 210 kodiert
somit nicht mehr für die Aminosäure Lysin
(AAA) sondern für Glutamat (GAA). Die
Sequenzierung konnte trotz schlechter DNA-
Qualität bei dem hemizygoten Patienten Nr. 11 problemlos ausgewertet werden, da bei
Hemizygotie die Base A vollständig durch die Base G ersetzt ist.
A209V
Bild 3-32 Sequenzanalyse der Mutation A209V in Exon 6 des OTC-Gens (heterozygot).
Bild 3-33 Sequenzanalyse der Mutation K210E in Exon 6 des OTC-Gens (hemizygot).
Kapitel III – B: Analyseergebnisse 90
Exon 7 / Exon 8 Für die Amplifikation von Exon 7 und Exon 8 setzten wir aufgrund der Größe von
Intron 7 (ca. 80 Basen), ein gemeinsames Primerpaar ein. Dies hat den Vorteil, sowohl
in der DGGE als auch in der Sequenzanalyse die Amplifikation eines Exons
einzusparen. Allerdings kann man aus der DGGE-Analyse nicht schließen, ob sich die
jeweilige DNA-Veränderung in Exon 7 oder 8 befindet.
Bild 3-34 Übersicht der DGGE-Analyse von Exon 7/ 8 des OTC-Gens. Die mit dem Stern * markierten Mutationen sind sowohl hemizygot als auch heterozygot dargestellt.
Homoduplexbanden, zu erkennen an einer oder zwei unteren Banden, können von
Heteroduplexbanden, zu erkennen an einer oder zwei oberen Banden, unterschieden
werden. Besonders interessant sind die unterschiedlichen Bandenmuster bei den
Patienten Nr. 30, 31, 47 und 10. Der Polymorphismus Q270R (c.809A>G) in Exon 8 ist
hemizygot (eine Bande in Abwesenheit des Wildtyps) bei Nr. 10 zu sehen und
heterozygot (zwei Homoduplexbanden und zwei Heteroduplexbanden) bei Nr. 47. Bei
Nr. 30 liegen in Abwesenheit einer Wildtypbande der Polymorphismus und die
Mutation auf dem selben Allel, während bei Nr. 31 Polymorphismus und Mutation in
cis, d.h. auf einem Allel vorkommen und in trans der Wildtyp vorliegt, d.h. ein
Wildtypallel.
Die Varianten P225L, Q270R, R277W sind sowohl hemizygot (siehe
Sternmarkierung*) als heterozygot im Vergleich dargestellt.
Jede der in der DGGE detektierten DNA-Veränderung wurde mit Hilfe der direkten
Sequenzanalyse verifiziert. Bei P225L (c.674C>T) und E239D (c.717G>T) handelt es
sich um Mutationen in Exon 7.
R27
7W*
R27
7W
P225
L* +
Q27
0R*
P225
L +Q
270R
IVS7
-14t
>c
c.72
7_73
0del
D26
3N
Q27
0R
E23
9D
Wt
Wt
Q27
0R*
Laufrichtung der DGGE
M● MN MP/● MP/ P● MN MN PN MN N N P● N
Kapitel III – B: Analyseergebnisse 91
Die Mutationen D263N (c.787G>A), Q270R (c.809A>G), R277W (829C>T) sowie die
Deletion c.727_730del AAGC wurden in Exon 8 detektiert.
Die Basenveränderung IVS7-14t>c in Intron 7 wurde bei dem männlichen Patienten Nr.
32 zusätzlich zur Mutation R129H in Exon 4 detektiert. Da sie relativ weit im Intron
liegt, ist eine funktionelle Bedeutung unwahrscheinlich. Bei einem anderen Patienten
mit der Mutation R129H lag IVS7-14t>c nicht vor (DGGE-Analyse).
Bei Q270R handelt es sich um einen Polymorphismus mit einer Allelhäufigkeit von
87,5% (Tuchman et al. 1992).
G269R / c.805G>A Diese Mutation in Exon 8 wurde hemizygot in der DGGE-Analyse durch das Auftreten
einer Homoduplexbande, welche sich durch die Position im Gel deutlich von der
Wildtypbande abgrenzen ließ, nachgewiesen.
Bild 3-35 Darstellung der Mutation G269R (hemizygot) in Exon 8 des OTC-Gens. A: DGGE-Analyse. B:Sequenzanalyse: Substitution der Base G durch A an Position 805 der genomischen DNA.
Exon 9
Bild 3-36 Ergebnisse der DGGE-Analyse Exon 9. A: Darstellung der Mutation W298X (MN-heterozygot). B: Darstellung der Mutation W332X hemizygot in M●, heterozygot erscheinend in gemischter Probe M+ sowie heterozygot in MN.
In der DGGE-Analyse wurde bei Patientin 34 abweichend von der Wildtypbande eine
heterozygot erscheinende DNA-Veränderung in Exon 9 (Bild 3-36A-MN)
nachgewiesen.
M● N N
A B
MN N N
A
M● M+ MN N N
B
Kapitel III – B: Analyseergebnisse 92
In der DGGE-Analyse in Bild 3-36B lässt sich im Vergleich mit dem Wildtyp (N)
deutlich ein hemizygoter Genotyp durch eine Homoduplexbande (M●) von einem
heterozygoten Genotyp (MN) abgrenzen. Durch Mischung einer Wildtyp-DNA-Probe
mit einer für die Mutation hemizygoten DNA-Probe (M+), erhält man das einem
heterozygoten Genotyp entsprechende Bandenmuster.
W298X / c. 894G>A
Die Substitution der Base G durch A verändert
das Codon Nr. 298, welches für die
Aminosäure Tryptophan (TGG) kodierte zu
einem Stopcodon (TGA). Eine solche Mutation
wird auch Nonsense-Mutation genannt.
W332X / c.996G>A
Die Mutation W332X ist eine Nonsense-Mutation, welche mit einer neonatalen
Manifestation des OTC-Mangels vereinbar ist (Matsuura et al. 1994). Substitution der
Base G durch A an cDNA-Position 996 des OTC-Gens wird das Codon TGG in das
Stopcodon TGA umgewandelt.
Bild 3-37 Sequenzanalyse der Mutation W298X (heterozygot) in Exon 9 des OTC-Gens.
hemizygot heterozygot A
Bild 3-38 Sequenzanalyse der Mutation W332X in Exon 9 des OTC-Gens.Bild A: Mutation W332X hemizygot. Bild B: Mutation W332X heterozygot.
B
Kapitel III – B: Analyseergebnisse 93
Exon 10
T343K / c.1028C>A In der DGGE-Analyse wurde bei Probe Nr. 10 abweichend von der Wildtypbande eine
hemizygot erscheinende DNA-Veränderung nachgewiesen (eine Homoduplexbande-
M●), und in der Sequenzanalyse als Mutation T343K identifiziert. Dabei wird die Base
C durch A an cDNA-Position 1028 des OTC-Gens in Exon 10 substituiert. Das Codon
Nr. 343 kodiert somit nicht mehr für die Aminosäure Threonin (ACA) sondern für
Lysin (AAA).
Bild 3-39 Darstellung der Mutation T343K (hemizygot) in Exon 10 des OTC-Gens. A: DGGE-Analyse. B: Sequenzanalyse.
N N M●
A B
Kapitel III – C: Analyseergebnisse 94
C Darstellung der Analyseergebnisse für die Indexpatienten
Im Rahmen der molekulargenetischen Untersuchung von 10 Patienten mit Verdacht auf
OTC-Mangel sowie deren 15 Familienangehörigen, wurden insgesamt 10
unterschiedliche DNA-Varianten nachgewiesen (siehe Kapitel III-A). Darunter waren
eine Variante (-176c>g) in der Promotorregion, eine Nonsense-Mutation (R23X) in
Exon 1, eine Insertion in Exon 5 (c.417_418insTATTG), eine Donorsplicesite-Mutation
(E239D) in Exon 7, sowie eine konservative Missense-Mutation in Exon 5 (Austausch
durch chem. verwandte AS), eine nichtkonservative Missense-Mutation in Exon 10
(Austausch durch AS unterschiedlicher Strukturklasse bzw. Polarität) sowie fünf
häufige Polymorphismen.
Bei den Indexpatienten 54., 55., 56., 57., 58. konnte durch die molekulargenetische
Untersuchung keine Mutation nachgewiesen werden.
Im Folgenden werden die Ergebnisse der Untersuchungen bei den Indexpatienten, bei
denen Mutationen entdeckt wurden, dargestellt.
Indexpatient 59 Bild 3-40A zeigt die DGGE-Analyse von Exon 1 des OTC-Gens der Familie 59. Die
weibliche Indexpatientin 59.1 zeigt verglichen mit der Mutter (59.2), dem Vater (59.3)
und der Schwester (59.4), eine Abweichung vom normalen Bandenmuster. Erkennbar
ist dies durch das Vorhandensein einer zusätzlichen Homoduplexbande und zwei
Heteroduplexbanden neben der Wildtyp-Homoduplexbande. Durch direkte
Sequenzierung von Exon 1 wurde die Mutation R23X in heterozygoter Form bei
Patientin 59.1 nachgewiesen (Bild 3-40B). Die Substitution der Base Cytosin durch
Tyrosin an Position 67 der cDNA des OTC-Gens verändert das Codon Nr. 23, welches
für die Aminosäure Arginin (CGA) kodierte, zu einem Stopcodon (TGA).
Kapitel III – C: Analyseergebnisse 95
60.2 60.1 60.3 60+ 60.4
Homoduplex- Wildtyp Homoduplex-Polymorphismus
HeteroduplexHeteroduplex
59.1 59.2 59.3 59.4
Homoduplex- Wildtyp Homoduplex- Mutation
Heteroduplex Heteroduplex
Bild 3-40A: Exon 1 der DGGE von Fam.59. Bild 3-40B: Auszug der Sequenzanalyse von Exon 1 mit der Mutation R23X als Stern gekennzeichnet.
Exon 1- R23X
Indexpatient 60 Wir analysierten die gesamte kodierende Region des OTC-Gens sowie angrenzende
Intronabschnitte mittels DGGE beim Indexpatienten 60.1, der Mutter 60.2, beim Fetus
60.3 und beim Vater 60.4. Eine vollständige Sequenzierung inkl. der 5’-nicht-
translierten Region führten wir beim Indexpatienten 60.1 durch sowie beim Fetus
Sequenzierung der 5’-nicht-translierten Region und Exon 2, 4, 5 und 10. Bei der Mutter
erfolgte ebenfalls die Sequenzierung der 5’-nicht-translierten Region und von Exon 2
und 4.
In der DGGE-Analyse von Exon 1 bis 10 des OTC-Gens der Familie 60 fand sich in
Exon 2 eine Abweichung vom Bandenmuster eines Wildtyps (Bild 3-41). Erkennbar
sind zwei Homoduplexbanden und zwei Heteroduplexbanden bei der Mutter (60.2)
sowie unterschiedliche Homoduplexbanden bei dem Indexpatienten (60.1) und dem
Fetus (60.3) einerseits sowie beim Vater (60.4) andererseits.
Bild 3-41 DGGE-Analyseausschnitt von Exon 2 des OTC-Gens. Die Reihenfolge der Proben von links nach rechts ist wie folgt: 60.2-Mutter, 60.1-Männl.Patient, 60.3-Fetus, 60+-Männl.Patient und Fetus gemischt, 60.4-Vater. Eine Mischung der Probe 60.1 und 60.3 erfolgte unter der Vorstellung, eine Allelidentität der männlichen Geschwister im kodierenden Bereich des OTC-Gens zu prüfen.
Kapitel III – C: Analyseergebnisse 96
Der Vergleich mit bereits bekannten Bandenmustern (siehe Bild 3-7-Kapitel B) legte
die Vermutung nahe, dass es sich um den bekannten Polymorphismus K46R
heterozygot bei der Mutter und hemizygot beim Indexpatienten und dem Fetus handelt.
In der Sequenzanalyse wurde dies bestätigt. Die DGGE Analyse der übrigen Exons
zeigte keine vom Wildtyp abweichenden Bandenmuster. Wir schlossen nachfolgend
eine direkte Sequenzanalyse der gesamten kodierenden Region des OTC-Gens, inklusiv
angrenzender Intronabschnitte und der 5’-nicht-translierten Region, zunächst beim
Indexpatienten an. Dabei wurde hemizygot neben dem Polymorphismus K46R in Exon
2, in der 5’-nicht-translierten Region die Sequenzvariante c.-176c>g, in Exon 4 der
Polymorphismus F101L, im Intron 4 der Polymorphismus IVS4-7a>g und Intron 9 der
Polymorphismus IVS9-12g>t nachgewiesen. Die fetale DNA ist in den durchgeführten
Untersuchungen identisch mit der DNA des Indexpatienten 60.1. Insbesondere finden
sich ebenfalls die Sequenzvarianten c.-176c>g, K46R, F101L, IVS4-7a>g und IVS9-
12g>t. Bei der Mutter zeigte die Sequenzanalyse der 5’-nicht-translierten Region, von
Exon 2 und Exon 4 die Variante c.-176c>g heterozygot, den Polymorphismus K46R
heterozygot, IVS3-8a>t heterozygot, F101L homozygot. Darüber hinaus fanden wir
mehrere heterozygote Sequenzvarianten in der 5’-nicht-translierten Region.
Einen Hinweis auf eine potentiell krankheitsauslösende Mutation in der Familie fanden
wir nicht.
Tabelle III-2 Zusammenfassung der Analyseergebnisse vom Indexpatienten 60.1, der Mutter 60.2 und des Fetus 60.3.
Mutation: assoziierte Polymorphismen und andere Varianten:
60.1-Indexpatient nicht nachweisbar c.-176c>g, K46R, F101L, IVS4-7a>g, IVS9-12g>t
60.3-Fetus nicht nachweisbar c.-176c>g, K46R, F101L, IVS4-7a>g, IVS9-12g>t
60.2-Mutter nicht nachweisbar c.-176c>g, K46R, F101L, , IVS3-8a>g
Kapitel III – C: Analyseergebnisse 97
Sequenzanalyse
c.-176c>g
IVS-8a>T und F101L
Indexpatient 61 In der DGGE-Analyse fand sich in Exon 5 eine Abweichung vom normalen
Bandenmuster beim Indexpatienten 61.1 (männlich), der Mutter des Patienten 61.2 und
der Schwester des Patienten 61.3. Im Vergleich zur Wildtyp-Kontrolle K mit einer
Homoduplexbande, erkennt man bei dem männlichen Patienten eine höher gelegene
einzelne Homoduplexbande. Bei der Mutter und Schwester des Patienten kommt zu
dieser Homoduplexbande noch eine weitere Heteroduplexbande. Beispielhaft illustriert
dies das Erscheinungsbild einer hemizygot oder heterozygot vorliegenden Mutation.
A B
Bild 3-42 Darstellung der Sequenzvariante c.-176c>g in der 5’-nichttranslierten Region: Hemizygot in A beim Indexpatienten 60.1. Heterozygot in B bei der Mutter 60.2.
Bild 3-43 Darstellung der nachgewiesenen PolymorphismenIVS3-8a>t und F101L in Exon 4 bei der Mutter.
IVS3-8 F101L
Kapitel III – C: Analyseergebnisse 98
134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 A ATG GCA GAT GGA GTA TTG TAT TGG CTC GAG TGT ATA A Met Ala Asp Gly Val Leu Tyr Trp Leu Glu Cys Ile
134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 B ATG GCA GAT GCA GTA TTG GCT CGA GTG TAT AAA CAA Met Ala Asp Ala Val Leu Ala Arg Val Tyr Lys Gln
A137G InsTATTG
Exon 5- A137G; A140fsins
Bild 3-44 DGGE-Analyseausschnitt von Exon 5 des OTC-Gens.
Die direkte Sequenzanalyse von Exon 5 zeigte die Substitution der Base Cytosin durch
Guanin an der Position 410 der cDNA des OTC-Gens sowie eine Duplikation von 5
Basen an der Position 417 der cDNA des OTC-Gens. Weil die Insertion nicht durch 3
teilbar ist, kommt es zu einer Verschiebung des Leserasters (Frameshift) und zu einer
Veränderung der nachfolgenden Aminosäuren im Genprodukt (Siehe Bild 3-45).
Bild 3-45 Sequenzanalyseausschnitt im Bereich der Mutation A137G sowie der Insertion von 5 Basen TATTG in Exon 5 des OTC-Gens. A: Darstellung des mutierten Sequenzausschnittes. B: Kontrollsequenz. In der ersten Zeile ist jeweils die Nummer des Codons, in der zweiten die Sequenz und in der dritten die resultierende Aminosäure angegeben. Der rote Balken kennzeichnet die Mutation und Insertion. Die veränderten Aminosäuren sind in roter Schriftfarbe zu sehen.
Indexpatient 62 Die DGGE-Analyse von Exon 1-10 des OTC-Gens der ungarischen Familie 62, zeigte
im Exon 7/8 bei der Indexpatientin 62.1 eine Abweichung vom normalen
Bandenmuster. Die Analyse der Eltern war unauffällig, speziell war bei keinem der
Eltern die Mutation/ Homoduplexbande nachweisbar.
Homoduplex- MutationHomoduplex- Wildtyp
Heteroduplex
K 61.1 61.2 61.3
Kapitel III – C: Analyseergebnisse 99
In der direkten Sequenzanalyse wurde bei der Patientin in Exon 7 die Basensubstitution
Guanin zu Tyrosin an Position 717 der cDNA des OTC-Gens identifiziert. Diese
Basensubstitution betrifft die letzte Base in Exon 7; sie liegt bei der Patientin
heterozygot vor.
Exon 7- E239D
Bild 3-46 DGGE-Analyseausschnitt von Exon 7/ 8 des OTC-Gens.
Bild 3-47 Sequenzanalyseausschnitt.*Substitution der Base G durch T im Exon 7 des OTC-Gens: Heterozygot bei der Indexpatientin in Bild A. Wildtyp bei der Mutter und beim Vater als Kontrollsequenz in Bild B.
Homoduplex- MutationHomoduplex- Wildtyp
Heteroduplex
Heteroduplex
62.1 62.2 62.3
B *A
Kapitel III – C: Analyseergebnisse 100
Lym
phoz
yten
Patient Eltern Fi
brob
last
en
Vol
lblu
t 63.1 63.2 63.3
Homoduplex- Mutation Homoduplex- Wildtyp
Heteroduplex Heteroduplex
Indexpatient 63 Bei dem männlichen Patienten 63.1 sowie bei der Mutter 63.2 und dem Vater 63.3
wurde eine DGGE-Analyse der DNA aus Vollblut durchgeführt. Später wurde die
DGGE Analyse beim Indexpatienten in DNA aus Fibroblasten und isolierten
Lymphozyten wiederholt. In Exon 10 des OTC-Gens zeigte sich beim Indexpatienten
eine anscheinend heterozygot auftretende Abweichung im Bandenmuster sowohl im
Vollblut als auch in Fibroblasten und Lymphozyten. Wie in Bild 3-48 dargestellt, ist bei
dem männlichen Patienten 63.1 von der Wildtyp-Homoduplexbande deutlich eine
zusätzliche Homoduplexbande und zwei Heteroduplexbanden abgrenzbar. Die DGGE-
Analyse der Eltern war durch das Auftreten eines dem Wildtyp entsprechenden
Homoduplexes unauffällig.
Bild 3-48 DGGE-Analyseausschnitt von Exon 10 des OTC-Gens. Das Auftreten von zwei verschiedenen Allelen in unterschiedlichen Zellpopulationen bei einem männlichen Patienten mit unauffälligem Karyotyp impliziert das Vorliegen eines somatischen Mosaikes bei dem Indexpatienten.
Kapitel III – C: Analyseergebnisse 101
In der sich anschließenden Sequenzanalyse von Exon 10, konnte bei dem Patienten die
bisher noch nicht beschriebene Stop-Codon Mutation X355L scheinbar heterozygot in
der DNA aus Vollblut, Fibroblasten und Lymphozyten identifiziert werden. In Bild 3-49
erkennt man beim Indexpatienten an Position 1064 der genomischen DNA eine
Überlagerung von 2 Peaks anstelle eines Peaks für die Base G. Der für die Base G
stehende Peak erscheint im Vergleich um ca. knapp die Hälfte der Höhe reduziert. In
der Sequenzanalyse aus Fibroblasten liegen beide Peaks in etwa gleicher Höhe,
während man in der Analyse aus Vollblut einen die Base G überragenden Peak erkennt.
In der Sequenzanalyse von Exon 10 der Eltern fand sich an entsprechender Position der
Wildtyp. Die Mutation X355L wird durch eine Substitution der Base Guanin durch
Tyrosin an cDNA-Position 1064 des OTC-Gens erzeugt. Das Codon Nr. 355 kodiert
somit nicht mehr für STOP (TGA) sondern für Leucin (TTA). Hierdurch werden 13
zusätzliche Aminosäuren bis zum nächsten Stopcodon TAA in das 3'-Ende des
Translationsproduktes eingefügt.
Bild 3-49 Sequenzanalyseausschnitt von Exon 10 des OTC-Gens beim Indexpatienten im Vergleich aus Fibroblasten, Lymphozyten und Vollblut. Substitution der Base Guanin durch Tyrosin an Position 1064 der cDNA des OTC-Gens. Die Sequenzanalyse der Eltern zeigte an entsprechender Position einen Wildtyp.
aus Fibroblasten aus Lymphozyten
aus Vollblut Sequenzanalyse der Eltern- Exon 10
Kapitel IV - A: Allgemeine Betrachtung der DGGE Analytik 102
KAPITEL IV : DISKUSSION
A Allgemeine Betrachtung der DGGE Analytik
Der erste Abschnitt der vorliegenden Dissertation beschäftigte sich mit der Validierung
der DGGE (Denaturierungs-Gradienten-Gel-Elektrophorese) als Methode zum
Screening von Mutationen im OTC-Gen. Für den Einsatz einer Screeningmethode in der
klinischen Diagnostik werden sowohl eine hohe Sensitivität als auch eine hohe
Spezifität gefordert. Begründet liegt dies in dem Ziel, mit dieser Methode möglichst alle
Mutationen erfassen zu können (hohe Sensitivität) und weitere diagnostische Schritte
auf ein Minimum einzugrenzen (hohe Spezifität). In der klinischen Routine sollten
darüber hinaus zum Mutationsnachweis zwei voneinander unabhängige Methoden
eingesetzt werden. Praktisch haben wir dies durch den Einsatz der DGGE und die
anschließende Sequenzierung realisiert.
Bei der DGGE-Analyse von insgesamt 53 DNA-Proben, konnte bei 48 von 48 Proben
die gesuchte DNA-Veränderung nachgewiesen werden. Bei 5 von 5 Negativproben
wurde das Fehlen einer pathologischen Mutation bestätigt. Aus diesen Daten ergibt sich
für diese Untersuchung eine Sensitivität von 100 Prozent, wobei jedoch nicht
ausgeschlossen werden kann, dass einzelne Mutationen im Sonderfall von der Methodik
nicht erfasst wurden.
Ob eine diagnostische Methode in der Routine eingesetzt wird oder nicht, ist nicht nur
von einer hohen Sensitivität und Spezifität abhängig. Es müssen sowohl Faktoren,
welche von der Erkrankung selbst bestimmt werden, als auch Faktoren, die Einfluss auf
die Praktikabilität einer Methode nehmen, berücksichtigt werden. Nicht an letzter Stelle
stehen natürlich auch Aufwand bzw. Kosten für eine molekulare Diagnostik in der
klinischen Routine.
Die DGGE ist eine effiziente und reproduzierbare Screeningmethode in der
Mutationsanalyse.
KAPITEL IV – A: Allgemeine Betrachtung der DGGE-Analytik 103
Hervorzuheben, insbesondere im Vergleich mit anderen in der Routine eingesetzten
Screeningverfahren, ist die sehr hohe Sensitivität bei zugleich überschaubarem
Kostenaufwand. In einer aktuellen Veröffentlichung wird beispielsweise die
Anwendung der DGGE zur Detektion von Mutationen in den beiden Brust-Krebs Genen
BRCA1 und BRCA2 als zuverlässiges, reproduzierbares und hochsensitives Verfahren
herausgestellt (Hout AH et al. 2006). Bei Anwendung der SSCP-Analyse liegt die
Sensitivität mit etwa 80% deutlich niedriger, wenngleich es sich bei dieser Methode
ebenfalls um eine kosteneffiziente Methode handelt (Cotton 2000). Die direkte
Sequenzanalyse ist zwar weiterhin der Goldstandard für die Mutationsdetektion, aber
für den OTC-Mangel mit einem im Verhältnis zur DGGE-Analyse eher ungünstigen
Kosten-Nutzen Aufwand.
Hemizygotie und Heterozygotie Durch den X-chromosomalen Vererbungsmodus sowie durch den hohen Anteil an
Neumutationen ergeben sich besondere Ansprüche an die DGGE als
Screeningverfahren zur Mutationsanalyse. Männliche Individuen sind hemizygote
Mutationsträger für den OTC-Mangel, entsprechend einer Homoduplexbande in der
DGGE, welche sich jedoch nicht immer von der Wildtypbande unterscheiden muß.
Weibliche Individuen sind durch das Vorhandensein von zwei unterschiedlichen Allelen
in der Regel heterozygot, entsprechend dem Auftreten von Homo- und
Heteroduplexbanden in der DGGE. Daraus ergibt sich, dass beim OTC-Mangel keine
Homozygotie für krankheitsverursachende Mutationen beobachtet wird. Bei männlichen
Patienten kann durch die Zugabe von Wildtyp-DNA mit anschließender Denaturierung
und Abkühlung die Bildung von Heteroduplexen bewirkt werden, da sich Einzelstränge
mit einer Mutation an die komplementären Einzelstränge des Wildtyp-Allels anlagern
können. In der DGGE lässt sich dann ein Bandenmuster mit Homo- und
Heteroduplexen erkennen. In Kapitel III-B Bild 3-36B ist das Bandenmuster für die
Mutation W332X für einen männlichen Patienten hemizygot sowie nach Mischung mit
Wildtyp-DNA heterozygot erscheinend und für eine weibliche Patientin heterozygot
beispielhaft gezeigt. Diese Kenntnisse waren eine große Hilfe bei der Interpretation des
DGGE-Ergebnisses von Indexpatient Nr. 63, bei welchem wir schon nach der DGGE
den Verdacht auf ein genomisches Mosaik stellten.
KAPITEL IV – A: Allgemeine Betrachtung der DGGE-Analytik 104
Mutationsspektrum Beim OTC-Mangel wird keine Prävalenz bestimmter Mutationen, wie zum Beispiel bei
der Cystischen Fibrose, beobachtet. Daraus ergibt sich, dass sich die Mutationsanalyse
nicht auf die Suche nach bestimmten, häufig auftretenden Mutationen beschränken darf
und möglichst umfassend erfolgen sollte.
Unter Berücksichtigung des Mutationsspektrums beim OTC-Mangel, nämlich dass ca.
84% Punktmutationen ausmachen, kleine Deletionen sowie Insertionen mit ca. 12% und
große Deletionen mit 4% einen im Verhältnis zwar geringen aber bedeutenden Anteil
einnehmen (Yamaguchi et al. 2006), stellte sich die DGGE zur Detektion von
verschiedenen Mutationstypen als ein besonders geeignetes Verfahren beim OTC-
Mangel heraus. Denn insbesondere das Auffinden von Deletionen gestaltet sich mit
vergleichbaren Screeningverfahren und sogar der Sequenzanalyse in der Regel
schwierig.
Wie im Kapitel III-B des Ergebnisteils dargestellt, konnten mit der DGGE 29
heterozygot und 16 hemizygot vorliegende Mutationen im OTC-Gen detektiert werden.
Am häufigsten handelte es sich um Substitutionen einzelner Basen. Daneben wurden
auch eine Deletion und drei Insertionen nachgewiesen, welche sich durch einen großen
Abstand zwischen Homo –und Heteroduplexbanden von Punktmutationen
unterscheiden ließen (siehe Bild 3-13; 3-24F; 3-34: c.727_730del und 3-44).
Transitionen und Transversionen Unter den hemizygot vorliegenden Mutationen waren 14 Transitionen (d.h. ein
Purinaustausch von G↔A oder ein Pyrimidinaustausch von C↔T) und 2
Transversionen T>A und C>A (d.h. Austausch eines Pyrimidins durch ein Purin oder
umgekehrt). Wie zu erwarten, lag bei den Transitionen von G>A und C>T die mutante
Homoduplexbande immer oberhalb der Wildtypbande, während bei den Transitionen
von A>G oder T>C die Bande unterhalb der Wildtypbande arretierte. Dieses Verhalten
ist durch das unterschiedliche Schmelzverhalten der Fragmente zu erklären. Aufgrund
der höheren Stabilität von G-C-Hybridisierungen bedingen Substitutionen von A nach
G bzw. T nach C eine erhöhte Schmelztemperatur des Fragmentes, so dass die mutante
Homoduplexbande im Bereich höherer Konzentration von denaturierenden Agens
stehen bleibt als die Wildtyp-Homoduplexbande mit niedrigerer Schmelztemperatur.
KAPITEL IV – A: Allgemeine Betrachtung der DGGE-Analytik 105
Auch bei der Substitution von A nach C lag die mutante Homoduplexbande deutlich
unterhalb der Wildtyp-Homoduplexbande, während bei der Substitution von C nach A
die mutante Homoduplexbande deutlich oberhalb der Wildtyp-Homoduplexbande
arretierte. Bei den Substitutionen von G nach C sowie T nach A und umgekehrt waren
dagegen eher geringe Höhenunterschiede zwischen der mutanten und der Wildtyp-
Homoduplexbande festzustellen. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass Transversionen
von G nach C sowie T nach A und umgekehrt in hemizygoter Form dem Nachweis
mittels DGGE entgehen könnten, da sich durch das ähnliche Schmelzverhalten der
jeweiligen Fragmente die mutante Homoduplexbande ggf. nicht oder schwer von einer
Wildtyp-Homoduplexbande unterscheiden lässt. Diese Schlussfolgerung ist konform
mit dem DGGE Ergebnis der Mutation D196E (Transversion von T>A) in Exon 6 bei
einem hemizygoten Patienten (siehe Bild 3-24C in Kapitel III-B) sowie der hemizygot
nachgewiesenen Mutation T343K (Transversion C>A) in Exon 10 (siehe Bild 3-39A in
Kapitel III-B).
Die Mutationen D196E, A208T, P225L, R277W, W332X wurden sowohl in
heterozygoter Form als auch in hemizygoter Form nachgewiesen. Die Auswertung des
Vergleiches der Höhe von mutanter Homoduplexbande im Vergleich zur Wildtyp-
Homoduplexbande ergab für die heterozygot vorliegenden Mutationen, dass sich die
mutante Homoduplexbande mit Ausnahme einer Mutation (Q180H) immer von der
Wildtyp-Homoduplexbande abgrenzen ließ. Bis auf die Mutation Q180H hätten alle von
uns untersuchten heterozygot vorliegenden Mutationen auch in hemizygoter Form
nachgewiesen werden können.
Bei der Mutation Q180H liegt beispielhaft eine Transversion von G>C vor. In der
DGGE Analyse (siehe Bild 3-17D, Kapitel III–B) sind neben einer in Höhe der
Wildtypbande arretierten Homoduplexbande zwei Heteroduplexbanden erkennbar, was
für das Vorhandensein von 2 unterschiedlichen Allelen spricht, und eine Heterozygotie
erkennen lässt. Der Nachweis in hemizygoter Form wäre durch fehlenden oder
minimalen Höhenunterschied im Vergleich zur Wildtypbande schwierig bzw. nicht
möglich. Schlussfolgernd können wir feststellen, dass Mutationen durch eine Transition
ausnahmslos sowohl in hemi - als auch heterozygoter Form nachweisbar sind.
Mutationen durch Transversionen können dagegen unter Umständen bei hemizygoten
Patienten dem Nachweis mittels DGGE entgehen.
KAPITEL IV – A: Allgemeine Betrachtung der DGGE-Analytik 106
Bei männlichen Patienten mit fehlendem Mutationsnachweis nach der DGGE oder
fraglichen Analyseergebnis, sollte zur Steigerung der Sensitivität die Mischung der
Probe mit Wildtyp-DNA erfolgen, da dann der Mutationsnachweis über die Bildung
von Heteroduplexen erfolgen kann.
Interpretation des Bandenmusters Eine Veränderung der DNA Sequenz kann unterschiedlichen Einfluss auf die
Schmelzeigenschaften des DNA-Fragmentes ausüben. Bedingt durch das Muster von
Homo- und Heteroduplexbanden entsteht im Gel eine Art „Fingerabdruck“ der
Mutation. Mit zunehmender Erfahrung ist es möglich, anhand des heterozygoten
Bandenmusters einer genetischen Veränderung im DGGE, unterschiedliche Mutationen
und Polymorphismen voneinander abzugrenzen (siehe Kapitel III, Teil B z.B. Exon
7/8). In der Regel erscheinen die jeweiligen Mutationen im DGGE reproduzierbar.
Abweichungen bei unterschiedlichen Analyseläufen sind beispielsweise in der
Lauflänge zu beobachten, was sich dann in einem gestreckt erscheinenden
Bandenmuster zeigt. Als Beispiel ist der Vergleich des Bandenmusters von
Polymorphismus K46R in Kapitel III-B, Exon 2 sowie in Kapitel III-C bei Indexpatient
Nr. 60 aufzuführen.
Andererseits können verschiedene Sequenzveränderungen im Bandenmuster innerhalb
eines Exons ähnlich bzw. gleich erscheinen, so dass eine sichere Unterscheidung von
verschiedenen Mutationen oder Polymorphismen anhand des Bandenmusters nicht
möglich ist.
In der DGGE könnte man ggf. durch Mischen der jeweiligen Probe mit einer Kontrolle
mit bekannter Mutation eine Unterscheidung erreichen. Die Denaturierung der
gemischten PCR-Produkte und anschließende langsame Abkühlung führt zur
Ausbildung von zusätzlichen Heteroduplexbanden, wenn die beiden mutanten
Fragmente nicht identisch sind. Wenn die üblichen Homo- und Heteroduplexbanden
ausgebildet werden, handelt es sich um die gleiche Mutation in beiden Proben. Darüber
hinaus kann natürlich mit Hilfe der Sequenzierung die zugrunde liegende DNA-
Veränderung genauer charakterisiert werden.
Lässt sich in der DGGE nur eine, aber im Vergleich zum Wildtyp abweichende
Homoduplexbande nachweisen, kann anhand dieser einzelnen Homoduplexbande in der
Regel keine Aussage getroffen werden, um welche Mutation es sich handelt.
KAPITEL IV – A: Allgemeine Betrachtung der DGGE-Analytik 107
Im direkten Vergleich mit dem Bandenmuster der gleichen Mutation von heterozygoten
Individuen, ist eine Zuordnung aufgrund der gleichen Höhe der mutanten
Homoduplexbande möglich (siehe Kapitel III-B, Bild 3-7A; 3-24D; 3-36B).
DGGE in der Routinediagnostik Mit Hilfe der DGGE als initiale Screeningmethode lässt sich in der Regel nicht nur die
Lokalisation einer Mutation bestimmen, sondern auch eine Vermutung bezüglich der
Relevanz der jeweiligen Veränderung treffen. Die Möglichkeit, auch bestimmte
Polymorphismen von anderen Mutationen zu unterscheiden, lässt in der
molekulardiagnostischen Routine eine gezieltere Sequenzierung der Exons zu. Die
Methode gewinnt somit an Aussagekraft, was ein weiteres Kriterium zur Bewertung der
Güte eines Tests darstellt. In unserem Fall waren mittels DGGE der Polymorphismus
K46R in Exon 2 sowie Q270R in Exon 8 sowohl hemizygot als heterozygot
nachweisbar, was sich durch das reproduzierbare Bandenmuster als besonders nützlich
zur Differenzierung von anderen Mutationen erwies. Die intronischen Polymorphismen
IVS3-8a>g, F101L, IVS4-7a>g und IVS9-12g>t werden bei der gewählten DGGE-
Methodik nicht erfasst, sondern wurden in der Sequenzanalyse identifiziert.
Die Nachteile der DGGE sind am ehesten im experimentellen Aufwand (wie z.B.
Herstellen der Gellösungen und die manuelle Herstellung der Gradientengele) sowie in
der Notwendigkeit spezieller Primer zu sehen. Dem Primerdesign mit einer
thermostabilen GC-Klammer kommt eine besonders große Bedeutung zu. Im Gen
vorhandene GC-reiche Sequenzen können dazu führen, dass sich der Doppelstrang
frühzeitig in die beiden Einzelstränge löst, und sich keine scharfen Banden ausbilden.
Mit Hilfe des Computerprogramms OLIGO Primer Analysis Software (MedProbe,
Oslo/Norwegen) haben wir die Schmelzeigenschaften der Fragmente mit GC-Klammer
an die Primer für Strang oder Gegenstrang simuliert und danach die Primerauswahl
getroffen. Unterschiedliche Schmelzdomänen im PCR-Produkt verhindern eine
gleichmäßige Denaturierung des Fragmentes, wodurch ein unscharfes Bandenmuster
resultiert. Dies kann auch dazu führen, dass manche Mutationen nicht dargestellt
werden können.
KAPITEL IV – A: Allgemeine Betrachtung der DGGE-Analytik 108
Wir haben in dieser Untersuchung gezeigt, dass uns in allen Fällen der Nachweis der
entsprechenden DNA-Veränderung gelungen ist. Dabei haben wir bei männlichen und
weiblichen Patienten neben einfachen Basensubstitutionen, auch Insertionen und
Deletionen detektiert. Daraus lässt sich ableiten, dass sich die detektierbaren
krankheitsverursachenden Mutationen mittels DGGE zu einem sehr hohen Prozentsatz,
wenn nicht vollständig, nachweisen können.
Konnte bei einem Patienten bzw. einer Patientin die krankheitsverursachende Mutation
nachgewiesen werden, ist bei Familienangehörigen (siehe z.B. Indexpatient Nr.61 im
Vergleich mit Mutter und Schwester im Kapitel III-C) die entsprechende genetische
Veränderung schon anhand des spezifischen Bandenmusters in der DGGE erkennbar.
Eine Sequenzierung ist dann nicht unbedingt notwendig.
Praktisches Vorgehen Für die Auswertung einer DGGE-Analyse beim OTC-Mangel ergibt sich folgende
Leitlinie:
1. Allgemein:
Zuordnung der Banden zu den jeweiligen Exons.
Entsprechen die Ergebnisse der mitgelaufenen Kontrolle den bekannten
Befunden? Sind von jedem Patienten alle Exons auswertbar?
2. Exonspezifische Auswertung:
▪ Vergleich der Bandenmuster der verschiedenen Patienten für jedes Exon
einzeln.
▪ Bei welchen Patienten sind Abweichungen von der Wildtypbande
erkennbar?
▪ Falls ja, liegt ein heterozygotes oder hemizygotes Bandenmuster vor?
→ Hemizygotie: eine Homoduplexbande. Heterozygotie bis zu 4
verschiedene Banden.
▪ Beurteilung der jeweiligen Homo- und Heteroduplexe:
→ Hinweise für Deletion oder Insertion: auffallend großer Abstand der
Heteroduplexe von den Homoduplexen.
▪ Ist das Ergebnis mit dem Geschlecht des Patienten konform?
KAPITEL IV – A: Allgemeine Betrachtung der DGGE-Analytik 109
3. Patientenspezifische Auswertung:
▪ Auflistung der vom Wildtyp abweichenden Veränderungen für Exon 1
bis Exon 10.
▪ Falls vorhanden, Vergleich mit Familienangehörigen.
▪ Ergibt sich bereits ein Verdacht auf eine potentiell krankheitsauslösende
Mutation bzw. einen Polymorphismus?
▪ Ev. Vergleich mit bekannten DGGE-Bildern.
4. Entscheidung, welche Proben und welche Exons sequenziert werden sollen.
5. Nach der Sequenzierung ist es für zukünftige DGGE-Analysen sinnvoll, das
Ergebnis der Sequenzanalyse mit dem Ergebnis der DGGE-Analyse
abzugleichen. Zu empfehlen ist auch ein digitaler Bildspeicher, in dem man
für jedes Exon die entsprechenden Mutationen / Polymorphismen ablegt, um
auf Vergleiche zurückgreifen zu können.
6. Bei fehlendem Mutationsnachweis bei einem männlichen Patienten mit
dringendem Verdacht auf OTC-Mangel oder bei einem fraglichen Befund,
sollte die Probe des jeweiligen Indexpatienten mit Wildtyp-DNA gemischt
werden und eine Wiederholung der DGGE-Analyse erfolgen. Unter
Umständen spart man damit die komplette Sequenzanalyse.
Kann bei einem Patienten mit einer für einen OTC-Mangel sprechenden klinischen
Symptomatik, welche zusätzlich durch biochemische Befunde gestützt wird sowie einer
unter Umständen auffälligen Familienanamnese keine Mutation nachgewiesen werden,
darf daraus keinesfalls die Schlussfolgerung gezogen werden, dass das Vorliegen eines
OTC-Mangels ausgeschlossen ist. In solch einem Fall ist die Bestimmung der
Enzymaktivität als invasive Methode zum Nachweis eines OTC-Mangels
empfehlenswert. Auch bei heterozygoten Frauen ist in aller Regel eine deutliche, jedoch
variable Verminderung der Enzymaktivität nachweisbar, obwohl falsch-negative
Messungen aufgrund des X-chromosomalen Inaktivierungsmosaiks nicht vollständig
auszuschließen sind. Gegebenenfalls ist die Entnahme mehrerer Biopsien sinnvoll, und
eine niedrig-normale Enzymaktivität sollte kritisch beurteilt werden.
Zu beachten ist ebenfalls, dass die Aussagekraft einer Enzymaktivitätsbestimmung
gemindert ist, wenn die Gewebeproben vom nicht mehr lebenden Patienten stammen.
KAPITEL IV – A: Allgemeine Betrachtung der DGGE-Analytik 110
In dem aktuell erschienenen Mutationsupdate wird erneut bestätigt, dass auch durch die
Kombination von verschiedenen Methoden (z.B. Southern Blot, SSCP-Analyse, DNA
Schmelzkurvenanalyse mittels Fluoreszenzsignal, Sequenzierung der 10 Exons
einschließlich angrenzender Intron – Exon Grenzen), nach wie vor Mutationen nur bei
ca. 80% der Patienten mit enzymatisch gesichertem OTC-Mangel nachweisbar sind
(Yamaguchi et al. 2006). Es scheint, als ob auch durch die stete Verbesserung
molekulargenetischer Strategien und Anwendung neuer molekulargenetischer
Methoden keine deutliche Verbesserung der Detektionsrate erzielt wird. Davon
ausgehend, sollten sich neue Ansätze nicht nur methodisch konzentrieren sondern auch
mit der Frage auseinandersetzen, was die restlichen 20% der krankheitsverursachenden
Mutationen ausmacht. Die Ausweitung der molekulargenetischen Diagnostik auf
regulatorische Bereiche des OTC-Gens erscheint als sinnvoller Aspekt, da diesbezüglich
bisher nur spärliche Informationen in der Literatur zu finden sind. Gestützt müssten
diese Analysen durch Expressionsanalysen werden, was vielleicht auch dem besseren
Verständnis des variablen klinischen Erscheinungsbildes dienen wird.
Kapitel IV - B: Familienbesprechung 111
B Familienbesprechung
Dieser Abschnitt umfasst eine eingehende Darstellung der Daten in den Familien, die
wir im Rahmen der Diagnostik untersuchten. Insbesondere sollen die
molekulargenetischen Befunde in Zusammenhang mit den zur Verfügung stehenden
klinischen und biochemischen Angaben diskutiert werden. Eine molekulare Diagnostik
zum Mutationsnachweis im OTC-Gen wurde bei insgesamt 10 Patienten mit der
Verdachtsdiagnose OTC-Mangel und 15 Familienangehörigen durchgeführt. Bei 5 der
Patienten, Nr. 54, Nr. 55, Nr. 56, Nr. 57 und Nr. 58, konnte keine Mutation
nachgewiesen werden.
Zu den Index-Patienten Nr. 54, Nr. 55 und Nr. 62 stehen keine oder unzulängliche
klinische und biochemische Angaben zur Verfügung und der molekulargenetische
Befund lässt sich bedauerlicherweise nur unzureichend beurteilen. Gleichzeitig wird
hiermit deutlich, welchen Stellenwert gute klinische Informationen in der molekularen
Diagnostik haben. Wie nachfolgend gezeigt, sind klinische und biochemische Angaben
bei Verdacht auf OTC-Mangel für die zuverlässige Interpretation des
molekulargenetischen Befundes unbedingt notwendig. Die variable Genotyp-Phänotyp-
Korrelation und die Heterogenität von Mutationen im OTC-Gen, bedingen das
pleomorphe Krankheitsbild beim OTC-Mangel.
Indexpatient Nr. 54 und Nr. 55 Bei diesen beiden weiblichen Patientinnen stehen uns weder klinische noch
biochemische Angaben zur Verfügung. Das Begleitschreiben enthielt lediglich die
Verdachtsdiagnose OTC-Mangel und die Information, dass beide Elternteile gesund
seien. In der molekulargenetischen Analyse konnten wir sowohl bei der Patientin Nr. 54
als auch bei Patientin Nr. 55 keine Mutation nachweisen. Diese Konstellation ist in der
diagnostischen Praxis nicht selten und stellt in doppelter Hinsicht ein Problem dar.
Zum einen könnte die Verdachtsdiagnose OTC-Mangel aufgrund nur vager klinischer
und biochemischer Befunde gestellt worden sein. In diesem Fall wäre der negative
Mutationsnachweis als relevanter Normalbefund zu werten. Zum anderen besteht die
Möglichkeit, dass es sich um einen falsch-negativen Befund handelt, sprich kein
Mutationsnachweis bei Vorliegen der Erkrankung.
Kapitel IV - B: Familienbesprechung 112
Eine Mutation lässt sich nur bei ca. 80% der Personen mit gesichertem OTC-Mangel
nachweisen. Bei dringendem klinischen Verdacht auf OTC-Mangel und negativem
Mutationsscreening wäre deshalb die Durchführung einer Leberbiopsie zur Bestimmung
der OTC-Aktivität zu überdenken.
Unter der Annahme, dass bei den beiden weiblichen Patientinnen tatsächlich ein OTC-
Mangel vorliegt, jedoch die verursachende Mutation nicht detektiert werden konnte,
würden sich keine sicheren Aussagen bezüglich anderer Familienmitglieder treffen
lassen. Die Angabe „Eltern gesund“, ist mit Neumutationen bei den Patientinnen
vereinbar. Es wäre aber auch gut möglich, dass die Mütter jeweils heterozygot mit
günstiger X-Inaktivierung sind.
Anhand dieser Patientinnen wird deutlich, dass der Befund einer Mutationsanalyse
immer kritisch beurteilt werden muss, vor allem wenn es sich wie beim OTC-Mangel,
auf Geno- und Phänotyp-Ebene um ein variables Krankheitsbild handelt. Obwohl die
Mutationsanalyse bei Verdacht auf OTC-Mangel in die Routinediagnostik
vorgedrungen ist, stellt sie bisher nur eine von verschiedenen diagnostischen
Maßnahmen dar. Gelingt der Nachweis einer krankheitsverursachenden Mutation nicht,
ist die Kombination aus klinischer Diagnostik, inklusiv einer gründlichen
Familienanamnese und biochemischer Diagnostik immer von großer Bedeutung.
Indexpatient Nr. 56 Bei diesem Kind kam man aufgrund einer in der zweiten Lebenswoche aufgetretenen
enzephalopathischen Krise mit Plasma-Ammoniakwerten bis 400 µmol/l, einer erhöhten
Orotsäureausscheidung von 3000 mmol/mol Kreatinin sowie nicht nachweisbarem
Citrullin im Plasma-Aminosäureprofil, zu der dringenden Verdachtsdiagnose eines
Neonatal-onset OTC-Mangels.
Unter einer mäßigen Eiweißrestriktion und oraler Substitution von Citrullin und
Natriumbenzoat fand sich eine Normalisierung der Ammoniakwerte. Der im Verlauf
durchgeführte Allopurinoltest war sowohl bei der Patientin als auch der Mutter
unauffällig.
Kapitel IV - B: Familienbesprechung 113
In der Familienanamnese fanden sich keine Hinweise auf Stoffwechselerkrankungen. In
der molekulargenetischen Untersuchung der Patientin, der Mutter und des Vaters fand
sich, bis auf einen heterozygoten Polymorphismus in Exon 2 bei der Mutter, keine
DNA-Veränderung; dieser Befund wurde unabhängig von einem weiteren Labor in der
Schweiz bestätigt.
Auffallend in diesem Fall war, dass Glutamin zu keinem Zeitpunkt erhöht
nachgewiesen werden konnte. Die Glutamin-Konzentration ist der empfindlichste
Parameter für eine gestörte Ammoniakentgiftung. Eine Reduktion der
Harnstoffbiosynthese führt zu einem Anstieg der Ammoniakkonzentration. Perivenöse
Hepatozyten können überschüssiges Ammoniak durch die Glutaminsynthetase an
Glutamat, unter Bildung von Glutamin, fixieren. Bei Umgehung der Leber wie beim
offenen Ductus venosus Arantii, kann Ammoniak weder zu Harnstoff noch zu Glutamin
entgiftet werden. Differentialdiagnostisch kämen bei einem kaum mehr bestimmbaren
Citrullinspiegel und Fehlen anderer spezifischer Aminosäuren neben dem OTC-Mangel
auch der Carbamylphosphatsynthetase oder der N-Acetylglutamatsynthetasemangel in
Frage, wobei man bei den beiden letztgenannten keine erhöhte Orotsäureausscheidung
erwarten würde.
Insgesamt bleibt die Diagnose in diesem Fall ohne Bestimmung der Enzymaktivität
ungeklärt.
Indexpatient Nr. 57 Bei dem zweijährigen Mädchen wurde eine diagnostische Mutationsanalyse des OTC-
Gens angefordert. Die klinische Vorgeschichte beinhaltet: Zustand nach
Schocksyndrom bei Sepsis, Panzytopenie, embolische Hirninfarkte, Tetraspastik,
extreme Osteoporose und Erhöhung der Orotsäure im Urin. Wir konnten keine
potentiell krankheitsauslösende Mutation nachweisen. Untersuchungsmaterial der Eltern
stand nicht zur Verfügung, laut Anforderungsschreiben seien sie gesund. Wenngleich
man bei weiblichen Patienten mit OTC-Mangel ein sehr variables klinisches
Erscheinungsbild beobachten kann, spricht die klinische Symptomatik nicht dringend
für einen OTC-Mangel.
Kapitel IV - B: Familienbesprechung 114
Indexpatient Nr. 58 In der molekulargenetischen Analyse des OTC-Gens mittels DGGE als
Mutationsscreeningverfahren, konnten wir bei dem 49jährigen männlichen Patienten
keine DNA-Veränderung detektieren. Aufgrund eines eher unsichern klinischen
Verdachts wurde keine weiterführende Diagnostik / Sequenzierung erbeten.
Indexpatient Nr. 59 Bei der weiblichen Patientin ergab die molekulargenetische Analyse des OTC-Gens die
Nonsense-Mutation R23X heterozygot in Exon 1. Sowohl bei den Eltern als auch der
Schwester der Patientin konnte diese Mutation nicht nachgewiesen werden.
Die Mutation R23X wurde erstmals von Grompe et al. (1991) beschrieben und führt mit
Sicherheit zu einem vollständigen Verlust der Enzymaktivität. Es handelt sich um eine
CpG-Mutation im Bereich der Signalsequenz in Exon 1 des OTC-Gens.
Bei männlichen Personen ist bei Hemizygotie für R23X eine schwerste neonatale
Manifestation anzunehmen. Bei weiblichen Personen ist die Schwere der Krankheit
vom Lyonisierungsmuster abhängig. Bei dem Kind wurde im Alter von 2 Jahren und 8
Monaten aufgrund einer Ammoniakerhöhung im Blut, rezidivierenden Erbrechens,
Somnolenz und intermittierender Ataxie die Verdachtsdiagnose OTC-Mangel gestellt.
Der fehlende Nachweis der Mutation bei der Mutter spricht für eine Neumutation, wie
sie bei vielen Mädchen mit heterozygotem OTC-Mangel beobachtet wird. Somit wäre
das Risiko für ein weiteres erkranktes Kind gering. Allerdings ist das Vorliegen der
Mutation in der Keimbahn der Eltern nicht ausgeschlossen. Der Genotyp der Schwester
der Patientin entsprach dem des OTC-Wildtyps; für die Kinder der Schwester ist ein
erhöhtes Risiko, von OTC-Mangel betroffen zu sein, auszuschließen.
Indexpatient Nr. 60 Bei der Familie konnte mittels molekulargenetischer Analyse des OTC-Gens keine
potentiell krankheitsauslösende Mutation identifiziert werden, wobei eine klinische
Bedeutung der neuen Variante c.-176c>g in der 5’-nicht-translierten Region nicht
auszuschließen ist.
Der Indexpatient zeigte eine neonatale Manifestation des OTC-Mangels, an deren
Folgen der Junge im Alter von 5 Tagen verstarb.
Kapitel IV - B: Familienbesprechung 115
Gesichert wurde die Diagnose durch Bestimmung der Enzymaktivität in einer
Leberbiopsie, die eine Restenzymaktivität von 5 µmol/min/mg Protein zeigte. Der bei
der Mutter durchgeführte Allopurinoltest lieferte keinen sicheren Hinweis auf einen
möglichen Überträgerstatus. Die Wahrscheinlichkeit, dass die Mutter des betroffenen
Knaben Überträgerin ist, ist dennoch groß (Pelet et al. 1990; Tuchman et al. 1995a).
Die molekulare Diagnose sollte vor allem im Rahmen einer Überträgerdiagnostik für
die Familie Sicherheit bringen. Dieses Fallbeispiel lässt die Grenzen der diagnostischen
Maßnahmen erkennen.
Da bislang nur etwa 80% der Mutationen bei Patienten mit gesichertem OTC-Mangel
identifiziert werden, sollte in diesen Fällen z.B. an eine Mutation in einem der Introns
oder in regulatorischen Domänen wie Promotor- oder Enhancer-Sequenzen gedacht
werden. Die zunächst bei unserem Indexpatienten und der Mutter festgestellte
Sequenzvariante in der Promotorregion des OTC-Gens, lässt allenfalls nur eine
spekulative Korrelation mit dem Phänotyp zu. Nach aktuellem Kenntnisstand wurde
diese Mutation noch nicht beschrieben. In der Literatur sind seit Erscheinen des letzten
Mutationsupdates von Tuchman et al. [2002] 4 Sequenzvarianten ohne pathogenen
Charakter in der 5’-nicht-translierten Region beschrieben; sie betreffen die Nukleotide
c.-512, c.-441, c.-365 und c.-339 (Azevedo et al. 2003). Um den pathogenen Charakter
der Mutation in der regulatorischen Sequenz abschätzen zu können, müsste zunächst bei
mindestens 100 gesunden Kontrollpersonen die molekulargenetische Analyse der
Promotorregion erfolgen. Läge die Mutation bei keiner Kontrolle vor, könnte dies auf
einen pathogenen Effekt der Mutation hindeuten. Circa 1% aller
krankheitsverursachenden Punktmutationen sind in der Promotorregion gelegen und
können die Genfunktion aufheben oder die Expression verändern (Cooper 2002).
Prinzipiell können Mutationen in regulatorischen Domänen, welche konstitutive
Promotorelemente, Enhancer, Repressoren, gewebespezifische und andere responsive
Elemente enthalten, zu einer quantitativen Änderung der Proteinproduktion führen.
Eine Untersuchung der Genexpression in der Leber bei Vorliegen dieser
Sequenzvariante im Bereich der regulatorischen Domäne über den Nachweis des
Genproduktes (Protein) oder des Transkriptes (mRNA), könnte Aufschluss geben, ob
und wie stark das OTC-Gen exprimiert wird.
Kapitel IV - B: Familienbesprechung 116
Unabhängig davon könnte für weitere Nachkommen im Rahmen einer vorgeburtlichen
Diagnostik die Analyse von informativen Polymorphismen und der c.-176 Variante
(Kopplungsanalyse) angeboten werden, um eine Aussage über das mutationstragende
Allel zu treffen. Als ultima ratio bliebe zur Abklärung in einer Schwangerschaft eine
fetale Leberbiopsie ab der 20. SSW zur Bestimmung der OTC-Aktivität, welche jedoch
mit einem hohen Fehlgeburtsrisiko verbunden wäre.
Indexpatient Nr. 61 Bei dem männlichen Indexpatienten wurde im Alter von 36 Stunden eine
Hyperammonämie mit Enzephalopathie festgestellt. Aufgrund einer massiv erhöhten
Orotsäure sowie einem nicht nachweisbaren Citrullin, kam man zu der dringenden
Verdachtsdiagnose OTC-Mangel. Wir führten bei dem Jungen, der Mutter und der
zweijährigen Schwester eine molekulargenetische Analyse der kodierenden Region des
OTC-Gens und angrenzender Intronabschnitte mittels Denaturierungsgradientengel-
Elektrophorese (DGGE) und Sequenzanalyse durch (siehe Ergebnisse-Teil C).
Der Indexpatient ist hemizygot für eine komplexe Mutation in Exon 5, formell zu
beschreiben als c.410C>G und c.417_418insTATTG (A137G; A140fs ins). Diese
Mutation ist im aktuellen Mutationsupdate noch nicht beschrieben (Yamaguchi et al.
2006). Im Heterozygotenstatus konnten wir die Mutation im Rahmen einer
Überträgerdiagnostik bei der Mutter und bei der Schwester des Indexpatienten
nachweisen. Somit ist der Konduktorinnenstatus der Mutter gesichert. Der genaue
Entstehungsmechanismus dieser Mutation ist unklar. Die Mutation verursacht eine
Verschiebung des Leserahmens und führt damit höchst wahrscheinlich zu einem
völligen Verlust der OTC Enzymaktivität. In unserem Fall lässt sich die schwere
neonatale Manifestation des OTC-Mangels bei dem Jungen mit der Schwere der
Mutation in Einklang bringen. Obwohl sowohl die Mutter als auch die Schwester des
Indexpatienten den selben Genotyp haben, ist die Ausprägung des Phänotyps
unterschiedlich.
Die Mutter ist klinisch gesund, die Schwester hat eine Late-onset Form des OTC-
Mangels. Dies ist mit großer Sicherheit Ausdruck eines ungleichen Musters der X-
Chromosom-Inaktivierung. Vermutlich erfolgt bei der Mutter die Expression des OTC-
Gens zugunsten des Wildtyp (gesunden)-Allels, während bei der Schwester die
Expression zugunsten des mutanten Allels erfolgt.
Kapitel IV - B: Familienbesprechung 117
Konsensussequenz der Spleißdonorstelle Exon Intron
CAG│GTAAGT A G
OTC-Wildtyp (62.2/3) GAG│GTATGC
c.717G>T GAT│GTATGC
Bild 4-1 Vergleich der Konsensussequenz der Spleißdonor- stelle mit der 5'-Spleißdonorstellensequenz von Intron 7 bei Wildtyp und Mutation c.717G>T.
Dieser Fallbericht zeigt beispielhaft, wie variabel - von Gesund über Late-onset-
Manifestation bis schwere neonatale Manifestation - das klinische Erscheinungsbild in
derselben Familie sein kann. In dieser Familie wäre aufgrund der molekularen
Diagnose, eine Pränataldiagnostik ohne Probleme möglich. Eine Voraussage bezüglich
der klinischen Schwere der Erkrankung ließe sich bei einem weiblichen Feten jedoch
nicht treffen.
Indexpatient Nr. 62 Mit der Verdachtsdiagnose OTC-Mangel erhielten wir Probematerial zur
molekulargenetischen DNA-Analyse einer ungarischen Familie; mit Indexpatientin,
Mutter und Vater. Uns wurden weder biochemische noch klinische Angaben zu dem
Erkrankungsverlauf der Patientin gegeben. Wir identifizierten bei der Analyse des OTC-
Gens mittels DGGE und Sequenzierung heterozygot bei der Patientin die Mutation
E239D in Exon 7. In der DNA-Analyse der Mutter und des Vaters fand sich an
entsprechender Position der Wildtyp. Die Mutation E239D ist bisher noch nicht
beschrieben worden. Aus
der Substitution der Base
Guanin durch Tyrosin
(GAG→GAT) an dritter
Position in Codon 239 lässt
sich ein Aminosäure-
austausch von Glutamat zu Aspartat ableiten. Allerdings betrifft die Mutation das letzte
Nukleotid in Exon 7, und es ist bekannt, dass solche Mutationen das korrekte Spleißen
des Introns beeinträchtigen oder verhindern können. Die Substitution der Base G nach
A an gleicher Position, die jedoch keinen Aminosäureaustausch bewirkt, wurde von
Tuchman et al. [1997] beschrieben und ist im Mutationsupdate von Tuchman et al.
[2002] und Yamaguchi et al. [2006] als Donor-Splice-Site Mutation enthalten. Der
Mechanismus des RNA-Spleißens beruht auf dem Erkennen von Nucleotidsequenzen,
die die Exon-Intron-Grenzen (Spleißstelle) bilden. Hierfür ist die GT-AG-Regel von
besonderer Bedeutung: Introns beginnen immer mit GT (=Spleißdonorstelle) und enden
mit AG (=Spleißakzeptorstelle). Bei den angrenzenden Nukleotiden hängt die
Wahrscheinlichkeit für erfolgreiches Spleißen von der Gesamtsequenz der Region ab.
Kapitel IV - B: Familienbesprechung 118
78 Prozent der Exons von Säugetieren enden mit der Base Guanin (G) und im OTC-Gen
endet praktisch jedes Exon mit der Base G (Shapiro et al. 1987). Ungefähr 13 Prozent
der Mutationen im OTC-Gen betreffen Konsensusspleißstellen im Intron oder das letzte
Nukleotid im Exon (Tuchman et al. 2002). Mutationen an Spleißstellen können durch
Verlust des Spleißens bzw. Verwendung kryptischer Spleißstellen, zu abgewandelten
Exons oder Überspringen von Exons führen. In unserem Fall könnte die Mutation
E239D das Spleißen von Intron 7 unterdrücken und somit zum Ablesen der
Intronsequenz führen, insbesondere weil das Intron 7 mit einer Größe von 80 Basen
sehr kurz ist. In diesem Fall könnte es zu einer Übernahme der Intronsequenz in die
reife mRNA kommen. Andererseits ist auch das Überspringen von Exons, in diesem
Fall von Exon 7, möglich. Beide Effekte würden wahrscheinlich mit einem völligen
Funktionsverlustes des Proteins einhergehen. Welchen Einfluss die Mutation auf den
Spleißvorgang jedoch im Einzelfall ausübt, lässt sich nur durch cDNA-Analysen klären.
Indexpatient Nr. 63 Der eindrucksvolle klinische Verlauf bei diesem Patienten gewährt einen Einblick in die
Heterogenität des Krankheitsbildes OTC-Mangel. Bei diesem Kind sprachen die
klinischen und biochemischen Befunde für das Vorliegen einer Late-onset Form des
OTC-Mangels. Bei männlichen Patienten kann es zu einer Manifestation des OTC-
Mangels nach der Neugeborenenperiode kommen, wenn eine hemizygote Mutation
vorliegt, die eine gewisse Restenzymaktivität gewährt. Dabei gibt es wie bei
heterozygoten Anlageträgerinnen eine große Variabilität sowohl hinsichtlich des
Manifestationszeitpunktes der Erkrankung als auch der jeweiligen Enzymaktivität
(McCullough et al. 2000). Die Aufklärung der Tertiärstruktur der humanen OTC sowie
der Vergleich der Aminosäuresequenz der OTC von über 30 verschiedenen Spezies,
lässt Spekulationen bezüglich des pathogenen Effektes einer Mutation zu. So genannte
„milde Mutationen“ mit Restenzymaktivität wie zum Beispiel R40H, Q180H, F354C,
sind häufig durch einen Aminosäureaustausch in Domänen abseits des aktiven
Zentrums oder auf der Oberfläche des Proteins bedingt.
Kapitel IV - B: Familienbesprechung 119
Die molekulargenetische Untersuchung des OTC-Gens des Patienten lieferte einen
überraschenden Befund. In der DGGE-Analyse der DNA aus Vollblut, Fibroblasten und
Lymphozyten, fand sich bei dem Knaben ein auffälliges Bandenmuster in Exon 10,
welches mit 2 Homo- und 2 Heteroduplexbanden dem Bild eines heterozygoten
Patienten entsprach. Die restlichen Exons zeigten Banden, welche einem Wildtyp
entsprechen. In der DGGE-Analyse der DNA aus Vollblut von den Eltern war jeweils
eine Wildtypbande nachweisbar. Normalerweise findet man bei einem hemizygoten
männlichen Patienten nur eine Bande. Der hier vorliegende Befund sprach dagegen für
das Vorliegen von zwei unterschiedlichen Allelen, was zunächst nicht zu einem
männlichen Chromosomensatz mit nur einem X-Chromosom passt. Als Erklärung des
Befundes kamen zwei Möglichkeiten in Frage: zum einen eine gonosomale
Chromosomenstörung mit einem überzähligen X-Chromosom wie das Klinefelter
Syndrom (XXY), oder zum anderen ein somatisches Mosaik. Die Chromosomenanalyse
bei dem Patienten ergab einen unauffälligen männlichen Karyotyp (46, XY), was für die
zweite Möglichkeit sprach.
In der nachfolgenden direkten Sequenzanalyse von Exon 10, wurde die bisher noch
nicht beschriebene Mutation X355L in scheinbar heterozygoter Form bei dem Knaben
detektiert. Die Sequenzanalyse der Eltern ergab an entsprechender Position den
Wildtyp. Das STOP-Codon Nr. 355 wird durch die Aminosäure Leucin ersetzt,
wodurch ein um 14 zusätzliche Aminosäuren verlängertes Translationsprodukt am C-
terminalen Ende entsteht, welches vermutlich die Proteinstruktur verändert.
Interessanterweise zeigten Mutation und Wildtyp sowohl in der DGGE als auch der
Sequenzierung Unterschiede in der relativen Intensität in unterschiedlichen Geweben.
Im DGGE erscheint die mutante Homoduplexbande in Vollblut stärker, während in
Fibroblasten die Intensität nicht unterschiedlich erscheint. Auch die Sequenzanalyse
zeigte im Vollblut eine unterschiedliche Peakhöhe zugunsten des mutanten Allels,
während in der Sequenzanalyse aus Fibroblasten die Peakhöhe nahezu identisch war.
Diese Befunde belegen das Vorliegen eines somatischen Mosaiks: Die Existenz von
zwei unterschiedlichen Zellpopulationen - eine mit der Mutation und eine ohne – ist in
diesem Fall nur durch eine postzygotische Mutation zu erklären, die durch einen
Mitosefehler in der frühen Embryogenese in einer pluripotenten Stammzelle aufgetreten
ist.
Kapitel IV - B: Familienbesprechung 120
Die identifizierte Verteilung in den beiden untersuchten Geweben lässt jedoch keine
Rückschlüsse auf die Verteilung in anderen Geweben zu. Für die genetische Beratung
der Eltern ergibt sich jedoch die wichtige Konsequenz, dass ein Wiederholungsrisiko
durch ein Keimbahnmosaik für zukünftige Kinder auszuschließen ist.
Aufgrund des Versterbens des Kindes an den Folgen eines hyperammonämischen
Komas, hat die Frage, welche Konsequenz sich aus der Mutation für die eigenen
Nachkommen ergeben hätte, nur theoretischen Wert. Weibliche Nachkommen wären
mit einer Wahrscheinlichkeit von vermutlich ca. 50% heterozygote Träger der Mutation
geworden, während Söhne nicht betroffen gewesen wären.
In zwei vorausgegangenen Publikationen wurde das Vorliegen eines Mosaiks bei
Jungen mit einer Deletion im OTC-Gen als Ursache für die Late-onset Form des OTC-
Mangels angenommen (Maddalena et al. 1988; Legius et al. 1990). Auch der hier
beschriebene Fall demonstriert, dass eine Late-onset Form des OTC-Mangels bei
männlichen Patienten sowohl durch eine Mutation mit resultierender Restaktivität als
auch durch das Auftreten eines somatischen Mosaiks verursacht werden kann.
Kapitel IV - C: Schlußbetrachtung 121
C Schlußbetrachtung
Die molekulargenetische Diagnostik ist mittlerweile als fester Bestandteil in die
Diagnosesicherung des OTC-Mangel eingegangen. In der vorliegenden Dissertation
wurde die DGGE mit anschließender Sequenzanalyse als hochsensitives und
kosteneffizientes Mutationsanalyseverfahren beim OTC-Mangel vorgestellt. Die
gleichzeitige Analyse mehrerer Probandengruppen ermöglicht einen großen
Probendurchlauf mit insgesamt kurzer Analysedauer. Neben dem Nachweis einzelner
Basensubstitutionen gelang auch die Detektion von Deletionen, Insertionen sowie eines
genomischen Mosaiks. In der DGGE können genetische Varianten bei männlichen
Individuen hemizygot und bei weiblichen Individuen heterozygot sowie homozygot
nachgewiesen werden. Da mit der DGGE zunächst keine genaue Charakterisierung der
detektierten Veränderung möglich ist, ergibt sich die Notwendigkeit der
Sequenzanalyse, die jedoch auf die Exons beschränkt werden kann, in denen sich im
DGGE ein auffälliges Bandenmuster fand. Der Ansatz erfüllt die Anforderung, aus
Qualitätssicherungsgründen eine Mutation in zwei unabhängigen Methoden
nachzuweisen. Eine umfassende Sequenzanalyse des OTC-Gens kann bei unauffälliger
DGGE sowie klinisch und biochemisch fundierten Verdachtsdiagnose eines OTC-
Mangels sinnvoll sein.
Eine fundierte Interpretation der Befunde ist erheblich erschwert oder unmöglich, wenn
Angaben zum klinischen Bild bzw. Krankheitsverlauf unzureichend sind oder fehlen.
Die Durchführung einer molekularen Diagnostik sollte immer im Kontext mit der
klinischen Symptomatik und auffälligen biochemischen Befunde stehen.
Kapitel IV : Aussichten 122
Aussichten
Im 20.Jahrhundert hat das Wissen um die Struktur des menschlichen Genoms unser Bild
über das Entstehen von Krankheiten außerordentlich verändert. Die Erkenntnis
formalgenetischer Aspekte beim Menschen im letzten Jahrhundert hatte erstmals
wissenschaftlich begründete Aussagen zur Wahrscheinlichkeit des Auftretens erblich
bedingter Erkrankungen erlaubt. Die Fortschritte der Molekulargenetik führen nun zu
einem wachsenden Verständnis der molekularen Grundlagen von Krankheiten und
eröffnen Möglichkeiten der bestätigenden oder prädiktiven Diagnostik. Die Tatsache,
dass immer mehr genetische Faktoren voraussehbar werden, ruft nach globalem
Verantwortungsbewusstsein. Im Februar 2001 wurde die Bestimmung der DNA-
Sequenz des Menschen als Meilenstein in der Medizin gefeiert. Das humane Genom
umfasst mehr als 3x 109 Basenpaare und circa 20 000-25 000 Gene. Aus dem Projekt, in
dem es galt, Base für Base zu lesen und aufzuzeichnen, ist ein Projekt mit vielfältigen
Forschungsansätzen zur Aufklärung der Genfunktion geworden, welche zu einem
besseren Verständnis der Krankheitsursachen und besseren Therapien führen sollen.
Erbliche Stoffwechselerkrankungen sind Paradigmen für monogene Erbkrankheiten, in
welchen ein Gen für ein Protein kodiert. Aber treten diese Erkrankungen mit einem
Phänotyp auf? Wie beim Ornithintranscarbamylase-Mangel als monogener Erkrankung
gezeigt, kann der Phänotyp einer multifaktoriell bedingten Erkrankung entsprechen. Als
Ursache konnten in dieser Arbeit neben einem durch die jeweilige Mutation bedingten
unterschiedlichen Genotyp, die X-Chromosom-Inaktivierung, das Vorliegen eines
somatischen Mosaiks sowie externe Faktoren wie die Stoffwechselsituation oder
Ernährung gezeigt werden. Neben diesen Faktoren werden noch andere, bisher
unverstandene Einflüsse angenommen, welche sich auf die Ausprägung des Phänotyps
auswirken. Beispielsweise wurde von Ausems und Kollegen ein Fall demonstriert, bei
denen die Mutation A208T, bei vergleichbar niedrig gemessenen Enzymaktivitäten
innerhalb einer Familie, zu einer extremen Variation des Phänotyps, von klinisch
asymptomatisch bis Versterben im Neugeborenenalter, führte (Ausems et al. 1997).
Kapitel IV : Aussichten 123
Weitere Mutationen im OTC-Gen, bei denen das Alter der Erstmanifestation des OTC-
Mangels sehr variabel ist, sind beispielsweise R40H (Manifestationen mit 2, 11, 18 und
37 Jahren beschrieben) und P225T (Manifestationen mit 8 und 62 Jahren beschrieben).
Die Beeinflussung der Expression durch bisher nicht bekannte genetische Faktoren und
Umwelteinflüsse sollte Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.
Trotz intensiver Bemühungen gelingt es aktuell nicht, bei allen Patienten mit
gesichertem OTC-Mangel Mutationen zu identifizieren. Dieses Missverhältnis wird sich
hoffentlich in der nächsten Zeit durch neue Erkenntnisse bereinigen lassen. Eine sich an
diese Arbeit anschließende mögliche Fragestellung wäre zum Beispiel, ob der Anteil an
Deletionen oder Duplikationen im OTC-Gen wirklich so gering ist, wie bisher
angenommen. Insbesondere bei heterozygoten Patientinnen ist der Nachweis von
Deletionen eines oder mehrerer Exons erschwert, wenn das mutante Allel kein Produkt
liefert und somit scheinbar nur das Wildtyp-Allel dargestellt wird. Da männliche
Patienten normalerweise hemizygot für X-chromosomale Gene sind, d.h. nur ein Allel
vorhanden ist, gestaltet sich der Nachweis von Deletionen in der Regel weniger
problematisch. Auch hier wird eine größere Deletion oder Duplikation jedoch mit
Standardmethoden nicht nachgewiesen, wenn ein somatisches Mosaik oder ggf. eine
Kontamination vorliegt. Die Anwendung der MLPA-Analyse (Multiplex-ligation-
dependent probe amplification) könnte darauf eine Antwort geben. Mit dieser Methode
kann man quantitativ die Anzahl der vorliegenden Zielsequenzen bestimmen (Schouten
et al. 2002). Für zahlreiche Gene wie beispielsweise das Dystrophin-Gen oder BRCA1-
Gen, hat sich diese Technik bewährt (Janssen et al. 2005, Gatta et al. 2005, Hartmann et
al. 2004, Hogervorst et al. 2003).
In einem aktuellen Fallbericht wurde auf die Bedeutung der Chromosomenanalyse als
Bestandteil der genetischen Analyse bei Patienten mit OTC-Mangel hingewiesen. In
diesem wurde bei monozygoten weiblichen Zwillingen mit schweren neonatalem OTC-
Mangel eine balancierte reziproke Translokation t(X;5)(p21.1;q11) als Ursache
festgestellt, welche das OTC-Gen auf einem X-Chromosom zerstörte (Zenker et al.
2005).
Kapitel IV : Aussichten 124
Festzuhalten ist jedoch, dass die Mutationsdetektionsrate seit vielen Jahren trotz
Einsatzes fortschrittlicher Analyseverfahren und Kombination verschiedener Techniken
nicht verbessert werden konnte. Es ergibt sich die Frage, ob sich das Defizit wirklich
durch methodische Lücken ergibt oder aber der Einfluss zusätzlicher, bislang
unbekannter Faktoren zu wenig Beachtung fand. Dieses Bild könnte sich schon durch
die Ausweitung der Untersuchung auf die Promotorregion in Kombination mit
Expressionsanalysen wandeln.
Die Durchführung einer molekulargenetischen Untersuchung bei Verdacht auf OTC-
Mangel ist von großer Bedeutung für die nicht-invasive Sicherung der Diagnose sowie
für die Durchführung einer Pränataldiagnostik. Die Bestimmung der Enzymaktivität aus
Lebergewebe ist dagegen an eine Punktion geknüpft. Der Mutationsnachweis
ermöglicht auch bei bisher asymptomatischen Verwandten eines Indexpatienten eine
frühe Diagnose und nachfolgend eine gezielte Intervention zur Vermeidung von
potentiell letalen Stoffwechselkrisen. Die Erkenntnisse aus Mutationsanalysen führen
auch zu einem besseren Verständnis der Erkrankung, woraus sich hoffentlich auch
therapeutische Konsequenzen ableiten lassen.
V Zusammenfassung 125
V Zusammenfassung Die Ornithintranscarbamylase (EC 2.1.3.3) dient als mitochondriales Matrixenzym im
zweiten Schritt des Harnstoffzyklus der Umwandlung von Ornithin und
Carbamylphosphat zu Citrullin. Die Hauptaufgabe des Harnstoffzyklus ist die Bildung
von Harnstoff als unschädlichem Stickstoffausscheidungsprodukt. Ist die Aktivität
dieses Stoffwechselweges eingeschränkt, resultiert eine Akkumulation von Stickstoff in
Form des neurotoxischen Ammoniaks in Blut und Gewebe. Das klinische Bild beim
OTC-Mangel ist sehr variabel und reicht von einem akuten, oft letalen neonatalen
hyperammonämischen Koma bis zum klinisch asymptomatischen Erwachsenen.
Der OTC-Mangel ist mit 1:14.000 der häufigste angeborene Harnstoffzyklusdefekt und
wird X-chromosomal vererbt. Das humane OTC-Gen ist auf dem kurzen Arm des X-
Chromosoms (Xp21.1) lokalisiert, 73 kb groß und enthält 10 Exons und 9 Introns. Es
unterliegt der X-Chromosom-Inaktivierung bei Frauen.
Ziel der vorliegenden Studie war die Etablierung und Evaluierung der
Denaturierungsgradientengel-Elektrophorese (DGGE) als hochsensitivem praktikablen
Screeningverfahren in der Routinediagnostik zur Mutationsanalyse im OTC-Gen. Im
ersten Schritt erfolgte bei 53 bereits typisierten DNA-Proben aus 3 Patientenkollektiven
die Mutationsanalyse der gesamten kodierenden Region des OTC-Gens und
angrenzender Intronabschnitte mittels DGGE. Zur genauen Charakterisierung einer
detektierten Veränderung erfolgte die exonspezifische Sequenzierung. Es konnten alle
48 gesuchten Mutationen nachgewiesen werden; bei 5 von 5 Negativproben wurde das
Fehlen einer krankheitsauslösenden Mutation bestätigt. Daraus ergibt sich für diese
Untersuchung eine Sensitivität von 100 Prozent. Insgesamt wurden mittels DGGE 36
unterschiedliche Mutationen nachgewiesen: 24 Missense-Mutationen, 5 Nonsense-
Mutationen, 4 Donorsplicesite-Mutationen sowie 2 Insertionen und 1 Deletion.
Im zweiten Schritt führten wir bei 10 Patienten mit Verdacht auf OTC-Mangel sowie 15
Familienangehörigen eine molekulargenetische Diagnostik mittels DGGE als
Screeningverfahren und exonspezifischer Sequenzierung oder ggf. Sequenzanalyse der
gesamten kodierenden Region des OTC-Gens und angrenzender Intronabschnitte sowie
der 5’-nicht-translierten Region durch.
V Zusammenfassung 126
Bei 5 Patienten mit nicht gesichertem OTC-Mangel konnte keine Mutation
nachgewiesen werden. Bei einem Patienten mit enzymatisch gesichertem OTC-Mangel
wurde in der 5’UTR die noch nicht beschriebene Sequenzvariante c.-176c>t
nachgewiesen. Bei 4 Patienten haben wir potentiell krankheitsverursachende
Mutationen nachgewiesen, welche bis auf die Mutation R23X noch nicht beschrieben
worden sind. Es handelt sich dabei um die bereits bekannte Mutation R23X in Exon 1,
sowie c.417_418insTATTG neben A137G in Exon 5, E239D in Exon 7 sowie die
Mutation X355L in Exon 10 bei einem männlichen Patienten mit einem genomischen
Mosaik.
Neben dem Nachweis einzelner Basensubstitutionen sowohl hemizygot bei männlichen
Individuen als auch heterozygot bzw. homozygot bei weiblichen Individuen, gelang
auch die Detektion von Deletionen, Insertionen sowie eines genomischen Mosaiks.
Aufgrund der Hemizygotie bei männlichen Patienten, sollte zur Sicherstellung einer
hohen Sensitivität eine Mischung der Probe mit Wildtyp-DNA erfolgen. Da mit der
DGGE zunächst keine genaue Charakterisierung der detektierten Veränderung möglich
ist, ergibt sich die Notwendigkeit der Sequenzanalyse, die jedoch auf die Exons
beschränkt werden kann, in denen sich im DGGE ein auffälliges Bandenmuster fand.
Der Ansatz erfüllt die Anforderung, aus Qualitätssicherungsgründen eine Mutation in
zwei unabhängigen Methoden nachzuweisen. Dennoch kann im Einzelfall eine
umfassende Sequenzanalyse des OTC-Gens trotz unauffälliger DGGE bei klinisch und
biochemisch fundiertem dringenden Verdachts auf einen OTC-Mangel sinnvoll sein.
Mittels DGGE und nachfolgender Sequenzanalyse erscheint es möglich, die
detektierbaren krankheitsverursachenden Mutationen vollständig nachzuweisen.
Trotz intensiver Bemühungen konnte die Mutationsdetektionsrate von bisher 80% bei
Patienten mit gesichertem OTC-Mangel bislang nicht gesteigert werden. Es scheint
möglich, dass einige Patienten Mutationen in der Promotorregion haben. Die
Ausweitung der Mutationsanalyse auf die Promotorregion wäre sinnvoll, um wichtige
regulatorische Elemente des Genes zu identifizieren und die Beeinflussung der
Expression zu untersuchen. Des Weiteren könnte man durch mRNA Analysen aus
Lebergewebe weitere Informationen, beispielsweise Splice-Fehler aufgrund von
intronischen Varianten, gewinnen.
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Zschocke/Hoffmann 2004: Vademecum Metabolicum. Diagnose und Therapie erblicher Stoffwechselkrankheiten. 3. Auflage, Schattauer, S.51, S.62
VII Verzeichnis der akademischen Lehrer 135
Akademische Lehrer Meine akademischen Lehrer waren die Damen und Herren, Professoren und Dozenten.
In Marburg:
Arnold, Aumüller, Aurich, Bandmann, Barth, Basler, Baum, Christiansen, Czubayko,
Daut, Doss, Elsässer, Feuser, Geus, Gotzen, Griss, Happle, Hasilik, Hellinger, Hesse,
Hoffmann, Hofmann, Jungclas, Kern, Kirchner, Klenk, Klose, Koolmann, Kretschmer,
Krieg, Lennartz, Maisch, Melsheimer, Moll, Moosdorfer, Müller, Mutters, Oertel,
Reichardt, Remschmidt, Rogausch, Röhm, Rothmund, Schäfer, Schmidt, Seitz,
Vohland, Voigt, Weihe, Werner, Westermann, Westphal, Zschocke
In Hamburg: Braun, Carstensen, Kremer, Mondt, Siemers
In Zürich: Dietrich, Genoni, Gürtler, Metzger, Platz, Schnider, Tavakoli, Turina
VIII Danksagung 136
Danksagung
Ich möchte mich bei meinem Doktorvater Prof. Dr. Dr. med. Johannes Zschocke für die
Überlassung des interessanten Themas sowie die zuverlässige Zusammenarbeit und
konstruktive Unterstützung herzlich bedanken. Er hat es in bezeichnender Weise immer
wieder geschafft, meine Begeisterung für meine Arbeit zu wecken und mich somit über
das Ziel hinaus gebracht.
Mein Dank gilt ebenso Prof. Dr. med. Prof. h.c. (RCH) Georg F. Hoffmann, der die
Bearbeitung des Themas in seiner Abteilung unterstützt hat.
Für die Bereitstellung der Proben möchte ich Herrn Dr. Bakker / Leiden (Niederlanden),
Herrn Dr. Santer / Kiel (Deutschland) sowie Herrn Prof. Dr. Wermuth / Bern (Schweiz)
sowie für die Zusammenarbeit Prof. Dr. G. Wolff, Institut für Humangenetik Freiburg
danken. Elfriede Quak möchte ich für die nette Zusammenarbeit im Labor danken.
Frau Dr. med. H. Marschner-Schäfer sowie Frau Dr. med. U. Peters und Frau Dr. med.
S. Kleier danke ich für die großzügige Unterstützung meiner Arbeit neben meiner
beruflichen Tätigkeit. Herrn Dr. rer. nat. M. Kutsche danke ich für das stets offene Ohr
zu Fragen fern von Heidelberg.
Besonderer Dank gilt meinen Eltern für die stets rückhaltlose Unterstützung meines
Werdeganges und meiner Schwester Kerstin, welche mich großartig bei den
Korrekturarbeiten des Manuskriptes unterstützt hat.
Nicht vergessen möchte ich die Großeltern meines Ehemannes, welche durch ihr immer
gezeigtes Interesse das Fertigstellen meiner Arbeit begleitet haben.
Von ganzem Herzen danke ich meinem lieben Ehemann Friedrich-Alexander, der mir
als begnadeter Optimist immer ein „halbvolles Glas“ signalisierte.