Aus dem Institut für Pathologie

Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. med. Moll

des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg

in Zusammenarbeit mit dem Klinikum Kassel

Mikrosatelliteninstabilität und Mismatch-Repairgenexpression in Adenomen bei erblichen Dickdarmkarzinom (HNPCC)

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades

der gesamten Humanmedizin in dem Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg

vorgelegt von

Carmen Beckmann aus

Hamburg

Marburg, 2008

Angenommen vom Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg am: 08.04.2008

Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs.

Dekan: Prof. Dr. Rothmund

Referent: Prof. Dr. Rüschoff

1. Korreferent: Frau Prof. Dr. Bauer

InhaltsverzeichnisInhaltsverzeichnis............................................................................................................ 3Inhaltsverzeichnis............................................................................................................ 3Abkürzungsverzeichnis...................................................................................................5Abkürzungsverzeichnis...................................................................................................5Kapitel 1 Einleitung und Fragestellung.........................................................................6Kapitel 1 Einleitung und Fragestellung.........................................................................6

1.1 Epidemiologie Tumorerkrankungen...................................................................... 61.2 Epidemiologie gastrointestinaler Tumore.............................................................. 61.3 Erblichkeit gastrointestinaler Tumore....................................................................7

1.3.1 sporadische vs. genetisch determinierte gastrointestinale Tumore................ 71.3.2 Klassifikation genetisch determinierter gastrointestinaler Tumore................ 71.3.3 Arten der vererbten gastrointestinalen Tumore............................................. 7

1.4 Hereditäres non-polypöses Kolonkarzinoms (HNPCC)........................................ 81.4.1 Definition........................................................................................................ 81.4.2 Diagnosekriterien des HNPCC....................................................................... 81.4.3 Pathogenese des HNPCC-Syndroms............................................................ 101.4.4 Pathohistologie des HNPCC......................................................................... 131.4.5 Adenome beim HNPCC................................................................................14

1.5 Fragestellung....................................................................................................... 16Kapitel 2 Material und Methoden................................................................................18Kapitel 2 Material und Methoden................................................................................18

2.1 Material................................................................................................................ 182.2 Methoden..............................................................................................................18

2.2.1 Mikrosatellitenanalyse.................................................................................. 182.2.2 (Laser-) Mikrodissektion ..............................................................................212.2.3 Immunhistochemische Darstellung der Proteine MLH1-, MSH2-, MSH6-

und PMS2................................................................................................... 222.2.3.1 Methode................................................................................................... 222.2.3.2 Reagenzien...............................................................................................222.2.3.3 Lösungen..................................................................................................222.2.3.4 Vorbehandlung....................................................................................... 232.2.3.5 Färbevorgang.......................................................................................... 232.2.3.6 Auswertungskriterien...............................................................................24

Kapitel 3 Ergebnisse......................................................................................................26Kapitel 3 Ergebnisse......................................................................................................26

3.1 Allgemeine Daten.................................................................................................263.2 Adenomhäufigkeit................................................................................................263.3 Histologie der Adenome...................................................................................... 293.4 Mikrosatellitenstatus der Adenome im Vergleich zu den Karzinomen............... 293.5 MMR Proteinexpression der Adenome................................................................323.6 Immunhistochemie der Adenome im Vergleich zu den Karzinomen..................333.7 Lokalisation der Adenome................................................................................... 353.8 Zeitliche Zusammenhänge................................................................................... 373.9 Lokalisation Adenome zu ihren Karzinomen...................................................... 38

Kapitel 4 Diskussion...................................................................................................... 39

Kapitel 4 Diskussion...................................................................................................... 394.1 Allgemeine Daten.................................................................................................394.2 Mutationsanalysen................................................................................................394.3 Tumorentstehung unter dem Einfluss der MMR - Gene......................................394.4 Adenome und HNPCC.........................................................................................404.5 Immunhistochemische Untersuchungen des Mikrosatellitenstatus..................... 40

4.5.1 Aufbau von Mikrosatelliten.......................................................................... 404.5.2 Mikrosatelliten(in)stabilität bei HNPCC-Patienten...................................... 40

4.6 Grundlage jeder HNPCC – Diagnostik: Die Anamnese...................................... 414.7 Ziele der Arbeit.................................................................................................... 414.8 Zeitliche Zusammenhänge zwischen Adenomen und Karzinomen..................... 424.9 Mikrosatellitenstabilität in Adenomen und Karzinomen..................................... 424.10 Immunhistochemische Zusammenhänge zwischen Adenomen und Karzinomen

......................................................................................................................... 424.11 Lokalisationen von Adenomen und Karzinomen...............................................434.12 Zusammenfassung und Schlußfolgerungen....................................................... 44

Kapitel 5 Zusammenfassung ....................................................................................... 45Kapitel 5 Zusammenfassung ....................................................................................... 45Chapter 6 Summary ..................................................................................................... 47Chapter 6 Summary ..................................................................................................... 47Kapitel 7 Literatur und Abbildungsnachweis............................................................ 49Kapitel 7 Literatur und Abbildungsnachweis............................................................ 49Kapitel 8 Anhang I (Gensequenzen)............................................................................ 53Kapitel 8 Anhang I (Gensequenzen)............................................................................ 53

8.1 MSH2............................................................................................................... 538.2 MSH6............................................................................................................... 548.3 MLH1...............................................................................................................558.4 PMS2................................................................................................................56

Kapitel 9 Anhang II.......................................................................................................589.1 Tabellarischer Lebenslauf.................................................................................... 589.2 Verzeichnis der akademischen Lehrer................................................................. 599.3 Danksagung..........................................................................................................619.5 Ehrenwörtliche Erklärung.................................................................................... 62

Abkürzungsverzeichnis

Abkürzung BedeutungAPC-Gen Adenomatosis Polyposis Coli -GenCA KalifornienCE KolektomieCRC Kolorektales KarzinomDNA DesoxyribonukleinsäureE. coli Escherichia coli (Darmbakterium)EDTA Ethylendiamin tetraacetic acidFAP familiäre adenomatöse PolyposisGI-Trakt Gastrointestinal-TraktHE - Färbung Hämatoxilin – Eosin - FärbungHNPCC hereditäres non-polypöses KolonkarzinomICG International Cancer GroupIGFRIIR Insulin-like growth factor receptor IIhMLH humanes MutL HomologMMR Mismatch ReparaturgenehMSH humanes MutS HomologMSI MikrosatelliteninstabilitätMSI-H hochgradige (high) MikrosatelliteninstabilitätMSI-L geringgradige (low) MikrosatelliteninstabilitätMSS MikrosatellitenstabilitätNIH national institute of healthPBS Phosphate buffered salinePCR PolymerasekettenreaktionhPMS humanes postmeiotic segragation increasedPSA Prostataspezifisches AntigenRT-PCR Reverse Transkriptase PolymerasekettenreaktionTGF Transforming growth factorZ.n. Zustand nach

Kapitel 1 Einleitung und Fragestellung

1.1 Epidemiologie TumorerkrankungenSeit Jahren gibt das statistische Bundesamt die Altersstruktur der deutschen Bevölkerung heraus, und daraus ist ersichtlich, daß die Bevölkerung eine steigende Lebenserwartung hat (Statistisches Bundesamt, 2005). Konform zu dieser Entwicklung steigen die Neuerkrankungen an Neoplasien stetig an. Die Todesursachenstatistik für das Jahr 2004 zeigt die Mortalität an Malignomen an zweiter Stelle (Statistisches Bundesamt, 2005). Dieser Trend ist zum einen zurückzuführen auf die gestiegene Lebenserwartung, zum anderen aber auch auf den Lebensstandard, wie Ernährungs- und Bewegungsweise und nicht zuletzt spielt auch der medizinische Fortschritt eine bedeutende Rolle in dieser Entwicklung, da das Auftreten vieler Neoplasien mit zunehmendem Alter ansteigt.

1.2 Epidemiologie gastrointestinaler TumoreBezogen auf die Häufigkeit stehen Malignome des Gastrointestinaltrakts an zweiter Stelle, gleich hinter den Malignomen des Bronchialsystems (Statistisches Bundesamt 2005).Im Gastrointestinalsystem ist das Kolon am häufigsten von Tumoren befallen (34%), gefolgt vom Magen mit 22% und dem Rektum mit 18% (Abb. 1). Dies macht in der Summe mit 64% weit mehr als die Hälfte aller gastrointestinalen Tumore aus. Abb.1.1 Inzidenz gastrointestinaler Tumorerkrankungen (Prozent Neuerkrankungen/Jahr)

Kolon34% Leber

5%

Ösophagus4%

Gallenblase6%

Magen22%

Pankreas11%

Rektum18%

1.3 Erblichkeit gastrointestinaler Tumore

1.3.1 sporadische vs. genetisch determinierte gastrointestinale TumoreDie Tumore des Gastrointestinaltraktes lassen sich in sporadische und genetisch determinierte einteilen. Unter den sporadischen Tumoren des Gastrointestinaltraktes versteht man Tumore, die ohne genetische Vorbelastung, entstehen. Mit rund 65% sind diese Tumoren zwar in der Mehrzahl, dies bedeutet aber auch, dass bei 35% der Patienten, die an einem gastrointestinalen Tumor erkranken, eine genetische Belastung vorliegt, die unterschiedlich ausgeprägt ist (Rüschoff et al.. 2004).

1.3.2 Klassifikation genetisch determinierter gastrointestinaler TumoreBetrachtet man nur die Patienten, die durch eine genetische Prädisposition an einem gastrointestinalen Tumor erkrankt sind, so fällt auf, dass der überwiegende Teil, rund 90%, eine polygene Vererbung aufweist. Polygene Vererbung bedeutet, dass sich diese Tumore nicht auf eine Genveränderung zurückführen lassen und dass in der Regel auch Faktoren wie Lebensweise die Manifestation eines Karzinoms mit beeinflussen. Etwa 10% werden monogen vererbt, d.h. sie lassen sich auf eine Mutation in einem bestimmten Gen zurückführen. Dabei zeichnen sich Betroffene durch eine hohe z.T. bis 100%ige Penetranz (Manifestation weitgehend unabhängig von Umweltfaktoren) aus (Rüschoff et al.. 2004). Während die genetischen Grundlagen bei letzteren Formen relativ gut aufgeklärt sind, ist dies bei den polygenetischen Formen noch weitgehend ungeklärt.Unabhängig davon kommt der Familienanamnese eine zentrale Rolle bei der Aufdeckung von Tumorhäufungen und möglicherweise einer erblichen Belastung zu.

1.3.3 Arten der vererbten gastrointestinalen TumoreSo auch bei dem hereditären nicht – polypösen Kolonkarzinom (HNPCC). Auch wenn in den letzten Jahren die ursprünglich angenommene Inzidenz von 5% auf zwischen 2 und 4% korrigiert wurde, stellt dieses den größten Anteil des erblichen Dickdarmkrebses dar, gefolgt von der familiären adenomatösen Polyposis (FAP), die mit bis 2% die zweithäufigste vererbte Karzinomerkrankung des Gastrointestinaltraktes ist ( Rüschoff et al.. 2004) (Abb. 2).Im Unterschied zum HNPCC ist die FAP gekennzeichnet durch das Auftreten hunderter von Adenomen im Kolon. Der Erkrankungsbeginn liegt schon im Kindesalter, so daß bei Koloskopien bis zu hundert Adenome gleichzeitig gefunden werden können. Diese Blickdiagnose ermöglicht ein frühes Einschließen von Patienten und deren Angehörige in effektive Vorsorgeprogramme. Die Krankheit ist begründet in einem Defekt des APC-Gens und führt letztendlich zur Entartung der multiplen Adenome (Friedl W 2002).

Abb. 1.2: Häufigkeit der vererbaren Kolonkarzinome in Prozent

1.4 Hereditäres non-polypöses Kolonkarzinoms (HNPCC)

1.4.1 DefinitionErstmalig wurde das HNPCC - Syndrom im Jahr 1913 von Warthin beschrieben. Aldred Warthin war Pathologe an der Universität von Michigan in Ann Arbor (USA). Angeregt durch die Aussage seiner Schneiderin, sie werde an Unterleibs- oder Darmkrebs sterben, untersuchte er schon seit 1895 diese Familie. Seine Schneiderin sollte Recht behalten, sie verstarb in jungen Jahren an einem Endometriumkarzinom. Warthin veröffentlichte erstmals seine Unter-suchungsergebnisse in seiner Publikation als Familie G (Warthin, 1913). Auffällig an dieser Familie waren das gehäufte Auftreten von Tumoren im Bereich des Magen-Darm- und Urogenitaltraktes, sowie das junge Erkrankungsalter der Familienmitglieder. Warthin versuchte, in seinen Untersuchungen eine Verbin-dung zwischen Krebserkrankung und familiärer Prädisposition zu finden. Seit Warthins Veröffentlichung 1913 haben verschiedene Autoren sich mit dieser Familie G beschäftigt und deren Stammbaum ergänzt. So auch Lynch, der in einem follow – up 1966 nochmals diese Familie untersuchte (Lynch et al.., 1966) und das Lynch – Warthin – Syndrom definierte, heute auch als HNPCC benannt. 1991 wurde von der "International Collaborative Group on Hereditary Non– Polyposis Colorectal Cancer" die Amsterdam-Kriterien I festgelegt (Vasen et al.., 1991). Diese ermöglichen eine Diagnosestellung des HNPCC nach anamnestischen und klinischen Angaben (Tab. 1). Später zeigte sich, daß die Amsterdam-Kriterien I nicht ausreichend sind, da häufig bei Patienten mit HNPCC extraintestinale Tumore auftreten. In einer erweiterten Definition, den Amsterdam-Kriterien II (Vasen et al.., 1999), werden diese Tumore mit eingeschlossen.

1.4.2 Diagnosekriterien des HNPCCDie Diagnose eines HNPCC Syndroms basiert auf den sog. Amsterdam I und II Kriterien (Tab. 1).

Polygen93%

Hamartomatöse Polypöse

Tumorsyndr.1%

FAP2%

HNPCC4%

Amsterdam I KriterienMindestens drei Personen in einer Familie mit kolorektalem Karzinom und Erfüllung aller folgenden Kriterien:• Einer der drei Patienten ist ein Verwandter 1. Grades der beiden anderen

Erkrankten.• Mindestens zwei aufeinanderfolgende Generationen sind betroffen.• Mindestens ein Betroffener ist jünger als 50 Jahre bei

Karzinommanifestation.• Ausschluß einer familiären adenomatösen Polyposis und• Tumoren sind histopathologisch verifiziert.

Amsterdam II Kriterien Mindestens drei Personen in einer Familie mit einem HNPCC-assoziierten Tumor und Erfüllung aller folgenden Kriterien, wobei neben kolorektalen Karzinomen auch extrakolische Malignome wie Karzinome des Endometriums, des Dünndarms und der ableitenden Harnwege oder des Nierenbeckens gleichwertig berücksichtigt werden:• Einer der 3 Patienten ist ein Verwandter 1. Grades der beiden anderen

Erkrankten.• Mindestens 2 aufeinander folgende Generationen sind betroffen.• Mindestens ein Betroffener ist jünger als 50 Jahre bei

Karzinommanifestation.• Ausschluß einer familiären adenomatösen Polyposis und • Tumoren sind histopathologisch verifiziert.

Tab. 1 Amsterdam-Kriterien zur Diagnose des HNPCC SyndromsMit Aufklärung der molekulargenetischen Grundlagen des HNPCC Syndroms kann die Diagnose nicht nur klinisch - anamnestisch sondern auch mittels Nachweis einer Mutation in den heute bekannten Genen (Keimbahnanalyse) nachgewiesen werden (Die genauen Gene und Mutationsloci werden in Kapitel 1.3 beschrieben). Da sich die Mutatationsanalyse allein kostenbedingt nicht zum Screening eignet, ist es notwendig die Risikopatienten, bei denen eine Keimbahnanalyse sinnvoll ist, vorab zu selektieren. Dazu wurden 1994 die so genannten Bethesda – Kriterien eingeführt (Rodriguez – Bigas et al., 1997). Diese wurden inzwischen anläßlich eines weiteren Expertentreffens in Bethesda überarbeitet (Tab.2). Hiermit wird festgelegt, von welchen Patienten Tumorproben auf Mikrosatelliteninstabilität geprüft werden sollten, womit dann die Indikation zur Keimbahnanalyse auf einen HNPCC typischen Gendefekt gestellt werden kann.Bethesda Kriterien• Patienten, die die Amsterdam – Kriterien I/II erfüllen• Patienten mit synchronen / metachronen Tumoren aus dem HNPCC –

Spektrum• Patienten mit kolorektalem Karzinom und Verwandte 1. Grades mit

Karzinom aus dem HNPCC – Spektrum vor dem 45. Lebensjahr oder mit kolorektalem Adenom vor dem 45. Lebensjahr

• Patienten mit kolorektalem Karzinom oder Endometriumkarzinom vor dem 45. Lebensjahr

• Patienten mit rechtsseitigem, wenig differenziertem kolorektalem Karzinom vor dem 45. Lebensjahr

• Patienten mit kolorektalem Karzinom vom Siegelringzelltyp vor dem 45. Lebensjahr

• Patienten mit kolorektalem Adenom vor dem 45. Lebensjahra Karzinome des Endometriums, der Ovarien, des Magens, hepatobiliären Systems, DünndarmsTab. 2 Aktualisierte Bethesda Kriterien:

1.4.3 Pathogenese des HNPCC-SyndromsBei dem HNPCC - Syndrom handelt es sich um eine autosomal - dominant ver-erbte Erkrankung. Aufgrund einer Keimbahnmutation kommt es zu einem Funk-tionsverlust in einem der Mismatch Repairgene (MMR). Bis heute sind 6 MMR-Gene (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, PMS1, MLH3) bekannt, von denen die vier Erstgenannten ursächlich dem HNPCC Syndrom zugrunde liegen. Dabei sind in nahezu 90% der Fälle die Gene MLH1 oder MSH2 betroffen. Fehler, die in der Replikation der DNA in Form von Basenfehlpaarungen und Leserasterwechsel auftreten, werden vom MMR-System erkannt, ausgeschnitten und repariert. In E. coli sind im MMR-System drei Gene beteiligt: MutS, MutL und MutH (Lahue et al.., 1989). Das MutS Protein erkennt als Homodimer Basenfehlpaarungen und bindet an diesen, so daß sie als "loop" aus dem neu synthetisierten Strang herausragen. In Verbindung mit MutL aktiviert MutS MutH, welche zusammen den Strang mar-kieren, so daß Exonukleasen das fehlerhafte DNA-Segment herausschneiden und die DNA Polymerase zusammen mit der DNA Ligase die so entstandene Lücke ergänzen (Mara und Schär, 1999). In Eukaryonten gibt es im Wesentlichen zwei Unterschiede zum E. coli Modell: Zum einen wird das MMR-System lediglich durch Strang-Diskontinuitäten an die zu reparierende Stelle gelenkt und nicht wie bei E. coli über hemimethylierte Basenpaare. Daraus folgend wurden auch keine MutH-Analoga in Eukaryonten gefunden. Zum anderen sind die MutS und MutL Homologe nicht Homodimere wie in E. coli, sondern als Heterodimere tätig. Es finden sich mindestens sechs MutS Homologe und fünf MutL Homologe, die als MSH und MLH bezeichnet werden. MSH2-MSH6 Heterodimere erkennen und reparieren Basenpaar-fehlbildungen und "loops" bis zu zwei Basenpaaren, wo hingegen MSH2-MSH3 Heterodimere Basenfehlbildungen verschiedener Größe reparieren (Luiz et al.., 2003). In Abb. 3 ist ein Schema dieses Reparationsvorganges dargestellt.

Abb. 3 MismatchrepairDas MMR - System ist speziell für Reparaturen in so genannten Basenrepeats zuständig. Zu einem endgültigen Ausfall des MMR - Systems und damit zu einer Tumor-Entstehung, muss zum ererbten Ausfall des einen Allels eine zufällige somatische Mutation zum Ausfall des anderen Allels führen, entsprechend der "two hit"- Hypothese von Knudson (Knudson, 1971). Die durch Mutation des MMR - Systems entstandene Mikrosatelliten - Instabilität (MSI) ist ein wichtiges Diagnosekriterium für ein HNPCC. Mikrosatelliten sind repetetive DNA-Sequenzen mit einer Sequenzlänge bis zu 6 Basen. Mikrosatelliten - DNA ist am häufigsten in Introns lokalisiert, allerdings gibt es auch codierende Abschnitte der menschlichen DNA, die Mikrosatelliten enthalten. Die vom National Cancer Institute Workshop und den International Cancer Group (ICG) – HNPCC (Boland et al.., 1998; Umar et al.., 2004) international veröffentlichten Mikrosatelliten - Loci, BAT25, BAT26, D5S346, D2S123, D17S250, sind bei Instabilität ein molekularbiologischer Anhalt für ein HNPCC - Syndrom. Für den molekularbiologischen Verdacht eines HNPCC sollten nach den Empfehlungen des National Institute of Health (NIH) zwei dieser fünf Mikrosatelliten instabil sein, also eine hochgradige MSI bestehen (MSI – H). Im Gegensatz dazu treten Mikrosatelliten-Instabilitäten (MSI) bei den sporadischen Formen erst in späteren Tumorstadien auf. Eine MSI kann auch bei Tumoren ohne Störung des MMR - Systems auftreten, die Ausprägung ist dann allerdings deutlich geringer, so daß man zur Unterscheidung dort von einem Tumor mit leichter MSI (MSI – L) spricht. Zusätzlich gibt es noch die Möglichkeit Tumoren mit einem stabilen Mikrosatellitensystem zu haben, diese Tumore werden als MSS bezeichnet.Wie sporadische CRC entstehen HNPCC - assoziierte Tumore in der so genannten Dysplasie - Adenom - Karzinom - Sequenz. Dabei spielt ein schrittweiser Verlust von wachstumsbegrenzenden Faktoren eine wichtige Rolle (Vogelstein, 1988).

neu synthetisierter Strang

MutS

mismatc

h

MutH

M

utH

Neusynthes

e

Bei HNPCC assoziierten CRC sind vor allem BAX, TGFβRII (transforming groth factor – β receptor II), IGFRIIR (insulin – like growth factor receptor II) , sowie MSH3 betroffen. In geringerer Häufigkeit treten Mutationen in den Genen c – K – ras und p53 auf. Bei sporadischen CRC sind im wesentlichen APC, K – ras und p53 mutiert. Bei sporadischen CRC kommt es mit zunehmender Akkumulation von genetischen Schäden zum Verlust eines Allels und Mutation des anderen Allels, also zur Akkumulation grober genetischer Schäden, die nicht selten mit Verlusten und/oder Zugewinnen ganzer Chromosomen und Chromosomenteilstücke mit Ausbildung einer Aneuploidie führen können. Im Gegensatz dazu betreffen die Mutationen bei MSI-H Tumoren nur kleine DNA Sequenzabschnitte, so dass diese Tumoren häufiger einen diploiden Chromosomensatz aufweisen (Perucho M, 1996). Sind beide Genallele eines Reparaturgens ausgeschaltet, lässt sich dies in den meisten Fällen immunhistochemisch als fehlende Expression im Tumorgewebe erfassen. In etwa 70-80% der HNPCC - Fälle ist ein solcher Genexpressionsausfall vor allem in den Genen MSH2 oder MLH1 nachweisbar. Dabei konnte gezeigt werden, dass ein Ausfall von MSH2 in der Regel von einer verminderten Expression von MSH6 begleitet ist. Analog ist eine verminderte Expression von PMS2 bei einem Ausfall von MLH1 zu erwarten (Rüschoff et al. 2006).Als Beispiel für HNPCC-assoziierte Gene sei hier MSH2 beschrieben. Bisher entdeckte Mutationen liegen größtenteils im codierenden Bereich des Gens. Das Gen ist auf dem kurzen Arm von Chromosom 2 lokalisiert und besteht aus insgesamt 16 Exons mit 2804 Basenpaaren. Das Genprodukt besteht aus 935 Aminosäuren, das ungefähr in der Mitte des Proteins eine DNA Bindungsdomäne und am C-Peptid lokalisierte ATP-ase Aktivität besitzt. Die genauen Basensequenzen der Gene MSH2 und MSH6, sowie MLH1 und PMS2 sind in Abb. I bis IV (s. Anhang) beschrieben.Da die im Anschluß beschriebenen pathohistologischen und makroskopischen Aspekte der Tumore nicht ausreichen, um mit Sicherheit die Diagnose eines HNPCC zu stellen, wird bei einem entsprechendem Verdacht (Amsterdam- und Bethesda- Kriterien) eine molekulargenetische Untersuchung angestrebt. Zunächst wird eine Untersuchung zur Analyse des Expressionsverlustes von MSH2, MLH1, MSH6 und PMS2 empfohlen (Rüschoff et al. 2004). Diese wird routinemäßig mit entsprechenden Antikörpern und den entsprechenden Färbungen durchgeführt. Der definitive Nachweis einer Keimbahnmutation erfolgt somit nach immunhistochemischer Charakterisierung der entsprechenden Gene. Hierbei empfiehlt es sich, das Gen auf eine Mutation hin zu untersuchen, das in der immunhistochemischen Färbung einen Verlust der Expression des Proteins gezeigt hat. Da bis zum heutigen Tage keine bevorzugten Mutationsorte ("hot-spots") der betroffenen Gene bekannt sind, muß jeweils das gesamte Gen analysiert und sequenziert werden (Peltomäki et al., 1997). Daraus resultiert ein aufwendiges "Screening"-Verfahren für die alltägliche Praxis. Ein weiteres Problem des Nachweises einer Keimbahnmutation besteht in der geringen eindeutigen Mutationsnachweisrate von 50-60% bei den durch die Amsterdam-Kriterien anamnestisch definierten HNPCC-Erkrankten (Park et al.., 2002).

1.4.4 Pathohistologie des HNPCCHNPCC-Tumore zeigen histologisch ein zu den sporadisch auftretenden Tumorformen differentes Bild. Sporadische Tumoren sind in der Regel eher nicht muzinös und aneuploid, wohingegen HNPCC assoziierte Tumoren muzinös / solid erscheinen und euploid sind. (Rüschoff et al.., 1998). Als häufiges Merkmal ist eine sogenannte Siegelringzellform zu verzeichnen, die durch eine verstärkte Schleimproduktion der Zelle und konsekutiver Verdrängung des Zellkernes entsteht. Weiterhin konnten Jass et al.. (Jass et al., 1998) zeigen, daß ein signifikant höherer Anteil an HNPCC-Tumoren eine sogenannte "CROHN´s like lesion", also eine lymphozytäre Infiltration in den Randzonen des Tumors beinhaltet (Abb. 9). Als letztes histologisch auffälliges Merkmal ist eine zunehmende Dedifferenzierung des Tumors zu vermerken (Abb. 10).

Abb. 9 Rektum HE frühes muzinöses Adeno Karzinom mit Crohn's like lesion.

Abb.10 Beispiel für eine zunehmende Dedifferenzierung (solid medulläres Karzinom, PAS)

1.4.5 Adenome beim HNPCCWar man zu Beginn der Erforschung des HNPCC-Syndroms noch der Meinung, daß das Auftreten von Adenomen ein sehr seltenes Ereignis ist, so ist man heute eher der Ansicht, daß die Häufigkeit von Adenomen bei dieser Erkrankung zumindest denen der Allgemeinbevölkerung gleichzusetzen ist (Iino et al.., 2000).Im Gegensatz zum sporadischen CRC ist die Adenom-Karzinom-Sequenz deutlich beschleunigt. Beträgt die Zeitspanne vom Auftreten des Adenoms bis zur Entstehung des Karzinoms bei sporadischen CRC in der Regel 8-10 Jahre, so haben im Vergleich hierzu Untersuchungen gezeigt, daß sich die Entartung der Adenome bei HNPCC-Patienten innerhalb von drei Jahren vollzieht (Lynch und Chapelle, 2003). Festzustellen ist, daß die Adenome bei HNPCC-Erkrankten deutlich im früheren Lebensalter auftreten, im Median bei 43,3 Jahren (De Jong et al.., 2004), als dies der Fall bei sporadischen CRC ist (Altersgipfel bei 65 Jahren). Auffällig ist dabei die fehlende Expression der MMR-Proteine in den meisten Adenomen (De Jong et al.., 2004). Dies ist ein guter Ansatzpunkt, um ein frühzeitiges Erkennen von HNPCC-Tumoren in der Vorsorge zu ermöglichen.Histopathologisch kann man bei Adenomen von HNPCC-Erkrankten zumeist eine höhergradige Dysplasie der Adenome finden, als es der Fall bei Adenomen von Patienten mit sporadischen Karzinomen ist (Lynch et al.., 1989; Mecklin und Jarvinen, 1986; Mecklin et al..,1986a; Muto et al..,1985). Zusätzlich sind diese Adenome größer und haben häufig eine tubulo-villöse Architektur (De Jong et

al.., 2004, Iino et al.., 2000). In Abbildung 11 ist ein Adenom eines Patienten mit sporadischen CRC, in Abbildung 12 ein Adenom eines HNPCC-Patienten dargestellt.

Abb. 11 niedriggradig dysplastisches Adenom

Abb. 12 hochgradig dysplastisches Adenom

1.5 FragestellungIn der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob sich Adenome als Untersuchungsmaterial für ein HNPCC - Screening eignen. Adenome stellen die erste Stufe der Karzinomentstehung dar. Dabei ist die Adenom-Karzinom-Sequenz bei HNPCC - erkrankten Patienten zeitlich deutlich verkürzt. Aus diesem Grund war die Fragestellung dieser Arbeit, ob durch molekulargenetische Analyse in Form von Mikrosatelliteninstabilität und die immunhistochemische Färbung an Adenomen ein Hinweis auf HNPCC geben kann. Im Umkehrschluss muss geklärt werden, ob ein MSS - Status automatisch ein Ausschluss eines HNPCC - Syndroms bedeuten kann, oder ob hier zusätzlich auch ein sporadisches Adenom aufgetreten sein kann. Durch Untersuchung von syn- oder metachronen Adenomen bei gesicherten HNPCC - Patienten wurde, unter Zuhilfenahme von Lasermikrodissektion und immunhistochemischer Färbung, dieser Fragestellung Rechnung getragen. Die Beurteilung der Ergebnisse der Mikrosatellitenanalyse und immunhisto-chemischen Färbung soll zeigen, inwieweit es sich hierbei um verläßliche Unter-suchungsmethoden in der Praxis handelt, die zum Beispiel in Form eines Screening-Verfahrens für Risiko-Patienten routinemäßig angewendet werden sollten.

Kapitel 2 Material und Methoden

2.1 MaterialDas in dieser Arbeit verwendete Untersuchungsgut stellt Normalgewebe, Tumor-gewebe und Adenomgewebe aus dem Gastrointestinaltrakt dar. Die Gewebeblöcke stammen aus der Pathologie des Klinikums Kassel, die im Rahmen der Verbundstudie zum erblichen Dickdarmkarzinom der Deutschen Krebshilfe gesammelt worden sind (Patienten- und Follow-up Details, s. Ergebnisteil).An diesen Geweben wurden Mikrosatellitenanalysen, Lasermikrodissektion und immunhistochemische Analysen durchgeführt.

2.2 Methoden

2.2.1 MikrosatellitenanalyseFür die Mikrosatellitenanalyse wurde DNA aus Normal- und Tumor- bzw. Adenomgewebe mit den vom National Cancer Institute Workshop und den ICG-HNPCC (Boland et al., 1998; Umar et al., 2004) empfohlenen und zuvor von Dietmaier et al. (1997) validierten 5 Primerpaaren untersucht. Hierbei handelte es sich um die folgenden Mikrosatellitenloci: zwei Mononukleotidrepeats (BAT 25, BAT 26) und drei Dinukleotidrepeats (D2S123, D5S346, D17S250). Zusätzlich wurde bei der Lasermikrodissektion der Locus BAT40 untersucht. Die Normal - DNA stammte entweder aus unauffälliger Darmmucosa, die an den Tumor grenzte, oder aus isolierter DNA aus dem Blut des jeweiligen Patienten.Aus den Paraffingewebeblöcken wurden mehrere 5 µm dicke Gewebeschnitte angefertigt. Hiervon wurde ein Schnitt mittels Hämatoxylin - Eosin (HE) gefärbt und vier Schnitte für die immunhistochemische Analyse verwandt.Weitere 5 µm dicke Schnitte von in Paraffin eingebetteten Karzinom-, Adenom und angrenzendes Normalgewebe wurden auf Objektträger gezogen.Zur Entparaffinisierung werden die Objektträger ca. 20 Minuten bei 80° C im Wärmeschrank inkubiert. Durch eine absteigende Xylol/Ethanolreihe wird das verflüssigte Paraffin aus dem Gewebe entfernt. Dies geschieht, indem die Schnitte nach 10- und 5-minütiger Inkubation in 100% Xylol für jeweils eine Minute in 100%, 96%, 80%, 70% und 70% Ethanollösung überführt werden. Im Anschluß werden sie kurz mit destilliertem Wasser gespült.Mit Hilfe des korrespondierenden HE-Präparates wurden die Tumorareale mit einer sterilen Skalpellklinge vom Objektträger gekratzt und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß gegeben, das zuvor mit 100 µl Lysepuffer beschickt wurde. Danach wurde zur Gewinnung der Gesamt-DNA das High Pure PCR Template Preparation Kit der Firma Roche Diagnostics GmbH (Mannheim) verwendet. Die einzelnen Komponenten des Kits mit ihrer Zusammensetzung und Funktion ist in Tabelle 1 aufgeführt. Nach Zugabe von 200 µl tissue lysis buffer und 40 µl Proteinase K und kurzem Durchmischen wurden die Ansätze bei 50° C und kontinuierlichem Schütteln auf einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) über Nacht inkubiert.

Am nächsten Tag wurden pro Ansatz 200 µl Binding buffer pipettiert und diese für 10 Minuten bei 72° C inkubiert. Es folgte durch die Zugabe von 100 µl Isopropanol die Aufreinigung der DNA. Die Lysate wurden nachfolgend in ein mit einem Filtervlies versehenes filter tube gegeben und bei 6800 g eine Minute zentrifugiert (Eppendorf Tischzentrifuge 5810 R, Hamburg). Anschließend wurden die Gefäße mit 500 µl Waschpuffer versetzt und nochmals bei 6800 g zentrifugiert. Dieser Schritt wurde zweimal durchgeführt. Nach Leerung des Auffanggefäßes erfolgte ein erneutes Zentrifugieren für 10 Sekunden bei 18000 g. Nun wurde das filter tube in ein frisches Reagiergefäß eingesetzt und mit 100 µl elution buffer versetzt. Der elution buffer wurde zuvor auf 72° C erwärmt. Es schloß sich eine erneute Zentrifugation bei 6800 g für eine Minute an. Das gewonne Eluat entspricht der gereinigten DNA. Die gereinigte DNA konnte nun weiterverarbeitet werden oder bei 4° C bzw. –20° C gelagert werden. Für die weitere Verarbeitung der gereinigten DNA wurde das HNPCC Micro-satellite Instability Test-Kit der Firma Roche Diagnostics GmbH (Mannheim) verwendet. Hierfür wurde zu einem auf Eis stehenden 0,5 ml Reaktiongefäß 10 µl steriles H2O (PCR grade) hinzugegeben. Anschließend wurden 4 µl Multi-Primer Mix (5fach konzentriert), dann 4 µl Enzyme Master Mix (5fach konzentriert) und zum Abschluß 2 µl Tumor-, Adenom- bzw. Normal-DNA hinzupipettiert. Es folgte das Vermischen (Vortex) und das anschließende kurze Zentrifugieren der Reaktionsansätze. Nun wurden die Gefäße im Thermocycler plaziert und die Polymerasenkettenreaktion (PCR) gestartet.Bei der PCR handelt es sich um ein automatisiertes, enzymatisches Verfahren zur exponentiellen Vermehrung spezifischer DNA-Sequenzen. Diese wurde nach einem modifizierten Originalprotokoll (Saiki et al., 1988) durchgeführt. Charakeristisch ist das zyklische Durchlaufen dreier Reaktionsschritte, die i. d. R. bei definierten Temperaturen stattfinden (PCR-Programm). Initial werden die DNA-Stränge von einander getrennt (Denaturierung bei 94° C). Im folgenden Schritt lagern sich distal und proximal der zu amplifizierenden Sequenz Oligonukleotide (Primer) an (Annealing, bei 52° C), an die beim jeweiligen Temperaturoptimum (72° C) der verwendeten DNA-Polymerase Nukleotide entsprechend der zu kopierenden Sequenz synthetisiert werden (Elongation). Bei den durchlaufenden PCR-Zyklen stehen jeweils zunehmend jene Stränge für die Kopie zu Verfügung, die die betreffende DNA-Sequenz umfassen. Das Ergebnis ist eine exponentielle Anreicherung der Ziel-DNA im Reaktiongemisch.In Tabelle 2 ist das verwendete PCR-Programm aufgeführt. Anschließend erfolgte die Analyse mit dem ABI Prism 310 Genetic Analyzer, hierfür wurden zu jeweils 2 µl PCR-Produkt, 15 µl entionisiertes Formamid und 0,5 µl Längen-standard (GS500TAMRA) gegeben und gemischt. Das Gefäß wurde mit einem Septum verschlossen und der Reaktionsansatz bei 94° C für zwei Minuten denaturiert. Bis zum Auftragen wurden die PCR-Produkte bei 4° C auf Eis gelagert.Bezeichnung Funktion ZusammensetzungTissue Lysis Buffer Gewebelyse 4 M Harnstoff, 200 mM Tris, 20

mM NaCl, 200 mM EDTA, pH

7,4Binding Buffer

optimales Bindeverhalten der DNA an das Glasvlies

6 M Gunanidiniumhydrochlorid, 10 mM Harnstoff, 10 mM Tris-HCl, 20% Triton X-100 (v/v), pH 4,4

Proteinase K Proteinabbau LyophilisatWash Buffer Entfernung von

überschüssigen Zellbestandteilen

80% Ethanol, 20 mM NaCl, 2 mM Tris, HCl, pH 7,5

Elution Buffer Elution der DNA vom Glasvlies 10 mM Tris, pH 8,5

High Pure Filter Tubes

Polypropylen Gefäße mit Glasfieber-Fleece

Collection tubes Auffanggefäße PolypropylenTab.1: Komponenten des High Pure PCR Template Preparation KitSchritt Dauer/Temperatur WiederholungDenaturierung 2 min 94° C 1x

Amplifikation10 s 94° C Denaturierung30 s 52° C Annealing30 s 72° C Elongation

35x

Final Elongation 7 min 72° C 1xAbkühlung 4°C

Tab. 2: PCR-Programm

Abb. 1 Mikrosatelliteninstabiles Adenom

Abb. 2 Mikrosatellitenstabiles Adenom

2.2.2 (Laser-) Mikrodissektion Für die Lasermikrodissektion kommen in Paraffin eingebettete Gewebestücke zum Einsatz, die Karzinom-, Adenomgewebe und korrespondierendes Normal-gewebe enthalten. Mit einem Mikrotom werden von diesen Paraffin-gewebeblöcken 5 µm dicke Schnitte angefertigt. Jeweils ein Schnitt wird auf einen membranmontierten Objektträger (Polyethylenmembran fixiert mit Rubber-cement (Fixogum, Marabuwerke, Tamm, Deutschland)) gezogen und einer Hämatoxilin – Eosin - Färbung (HE - Färbung) mit dem Färbeautomat (Tissue Stainer cot, Fa. Medite, Burgdorf) unterzogen. Zu jedem Tumor wurde zusätzlich ein Querschnitt angefertigt und mit PAS (periodic acid Schiff) gefärbt.Zunächst wurde mit Hilfe des HE - Schnittes das betreffende Tumor- bzw. Adenomareal markiert, welches mikrodisseziert werden soll. Das Areal besteht aus mindestens 1 cm2 Größe. Für die manuelle Dissektion wird der zu unter-suchende Zellverband vom Objektträger gekratzt, für die Laserdissektion mit dem Laser gelöst und mit Proteinase K in einer Konzentration von 2 µg/ml (Fa. Qiagen, Valencia, CA), der Verdauung unterzogen. Die DNA wird mit dem QIAamp DNA Mini Kit (Fa. Qiagen, Valencia, CA) gemäß der Herstellerangaben extrahiert und mit dem PCR Template Preparation Kit (Fa. Roche, Mannheim) gereinigt. Die Schnitte werden mit Xylene entparaffinisiert und durch eine absteigende Alkoholreihe rehydriert, analog zu der Mikrosatellitenanalyse.Für die Lasermikrodissektion kam das Leica AS LMD System (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland) zum Einsatz. Hierbei wurden ca. 100 bis 200 Epithelzellen entnommen. Bei der Entnahme der Zellen wurde darauf geachtet, daß jeweils Adenomanteile mit verschiedenen Dysplasiegraden (D1-D3) des Adenoms zur Analyse kamen. Für jeden Dysplasiegrad wurden jeweils zwei unabhängige Zellgruppen entnommen. Diese Epithelzellen wurden in ein Reagenzglas getan und mit 20 µl Lysis buffer versetzt. Der Lysis buffer setzt sich aus 10% Proteinase K 2 mg/ml (Fa.Roche, Mannheim, Deutschland), 0,5% Tween 20 (Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland) und einmal Taq PCR Buffer (Fa. Roche, Mannheim, Deutschland) zusammen. Anschließend fand der

Verdau für 18 Stunden bei 50°C statt. Nach dieser Zeit wurde die Proteinase K durch die Inkubation für 10 Minuten bei 94°C gestoppt.Zur DNA Isolierung siehe oben.

2.2.3 Immunhistochemische Darstellung der Proteine MLH1-, MSH2-, MSH6- und PMS2

2.2.3.1 MethodeNach dem heutigen Wissensstand führt eine Mutation in der Keimbahn eines der Mismatch-Repair(MMR)-Gene zu einem Stopcodon. Daraus resultiert eine fehler-hafte Transkription bzw. es kommt zu einem Basenabbruch und somit zur Unfähigkeit, das entsprechende Protein zu synthetisieren und als Antigen zu präsentieren. Dieses Phänomen macht sich die immunhistochemische Analyse zu eigen, da bei einer Mutation der entsprechende Antikörper nicht mehr an das Antigen binden kann. In der vorliegenden Arbeit wurden Schnitte von Tumor-, Adenom- und korrespondierendem Normalgewebe des Darms verwendet und Primärantikörper gegen das hMLH1-, hMSH2- und hMSH6- und hPMS2-Protein für die immunhistochemische Darstellung eingesetzt (Tab. 3).

2.2.3.2 Reagenzien• Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4), Fa. Merck, Darmstadt,

Deutschland• Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4), Fa. Merck, Darmstadt,

Deutschland• Citronensäure-Monohydrat (C6H8O7), Fa. Merck, Darmstadt,

Deutschland• Trinatriumcitratdihydrat (C6H5O7Na3), Fa. Merck, Darmstadt,

Deutschland• Tween 20, Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland• EDTA, Fa. Sigma

2.2.3.3 Lösungen• Phosphate Buffered Saline (PBS)-Puffer pH 7,4• 12,4g KH2PO4 + 43,1g Na2HPO4 x 2H2O + 42,5g NaCl in 5l Aqua dest.

lösen, mit 1M NaOH auf pH 7,4 einstellen.• Phosphate Buffered Saline (PBS)-Puffer pH 7,4 mit Tween (PBS/Tween)• 12,4g KH2PO4 + 43,1g Na2HPO4 x 2H2O + 42,5g NaCl in 5l Aqua dest.

lösen, mit 1M NaOH auf pH 7,4 einstellen. 2,5ml Tween 20 zufügen.• 10mM Citratpuffer pH 6,0• 21,01g C6H8O7 x 2H2O in 1000ml Aqua dest. lösen = 0,1M

Zitronensäure = Stammlösung A• 29,41g C6H5O7Na3 x 2H2O in 1000ml Aqua dest. lösen = 0,1M

Natriumcitrat = Stammlösung B• 9ml Stammlösung A + 41ml Stammlösung B mit 450ml Aqua dest. auf

500ml auffüllen.

• 1mM EDTA pH 8,0• 0,37g EDTA in 1000ml Aqua dest. lösen und mit NaOH auf pH 8,0

einstellen.

2.2.3.4 VorbehandlungFür die Untersuchung werden 4 µm dicke Schnitte von Tumor-, Adenom- und korrespondierendes Normalgewebe des Darms auf silanisierte Objektträger gezogen. Konnte kein Normalgewebe in der Nähe des Tumors bzw. Adenoms verwendet werden, wurde ein zusätzlicher Gewebeschnitt von einem anderen Block angefertigt. Das Normalgewebe diente zur Positivkontolle und wurde für 30 Minuten bei 60° C sowie über Nacht bei 38° C getrocknet.Es folgt die Entparaffinierung der Schnitte, indem die Objektträger zweimal 5 Minuten in Xylol überführt, anschließend zweimal 5 Minuten in Aceton und abschließend zweimal 5 Minuten in Aqua dest. getaucht werden. Zur Antigen-demaskierung werden die Gewebeschnitte für die hMLH1- und hMSH2-Analyse in eine mit EDTA Lösung gefüllte Küvette überführt und in der Mikrowelle bei 250 W für 30 Minuten gekocht. Schnitte, die einer hMSH6- und hPMS2-Analyse unterzogen werden, werden in eine Küvette mit Citratpuffer überführt und im Autoklaven bei 120° C für 20 Minuten hitzebehandelt. Danach werden die Küvetten der Mikrowelle bzw. dem Autoklaven entnommen und für 30 Minuten bei Raumtemperatur abgekühlt.Es folgte das Abspülen der Objektträger mit Aqua dest. Für die Blockierung endogener Peroxidasen werden die Objektträger für 20 Minuten bei Raum-temperatur einem 0,3%igen H2O2-Methanol-Bad unterzogen, danach mit Aqua dest. gespült und anschließend für 5 Minuten in PBS/Tween überführt.

2.2.3.5 FärbevorgangDie Färbetechnik erfolgte mit Hilfe des Tecan-Immunostainers Genesis RSP 200 unter Verwendung der EnVision+-Methode (Fa. DAKO) nach Herstellerangaben. Die Schnitte wurden zweimal mit PBS/Tween für 7 Minuten gespült und mit dem Primärantikörper (hMLH1-, hMSH2-, hMSH6- oder hPMS2-Antikörper; Verdünnung siehe Tab.3) für 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Inkubation wurde mit 100 µl/Objektträger PBS/Tween gestoppt. Danach wurden die Schnitte mit 1400 µl PBS/Tween für 7 Minuten gewaschen und anschließend für 30 Minuten mit 120 µl anti-mouse EnVision HRP (Fa. DAKO) inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde der Vorgang mit 100 µl PBS/Tween gestoppt. Es folgte ein 7 minütiges Spülen der Objektträger mit 1400 µl PBS/Tween. Hiernach wurden die Schnitte für 10 Minuten mit 120 µl DAB-Chromogen (1:50 Verdünnung in Substratpuffer (Fa. DAKO)) inkubiert.Die DAB-Inkubation wurde mit 100 µl PBS/Tween gestoppt und die Objektträger wurden mit 1400 µl PBS/Tween für 7 Minuten gespült. Anschließend wurden die Objektträger dreimal in einem Abstand von zwei Stunden mit PBS/Tween gespült. Am Ende schloss sich das Spülen der Objektträger mit Aqua dest. an.Die Objektträger wurden zur Gegenfärbung für 10 Sekunden in Harris Hämatoxylin (Fa. Merck) überführt, 5 Minuten in warmem Wasser gebläut und abschließend mit Pertex (Fa. Medite) eingedeckt.

Antikörper Verdünnung Klon Firma Katalog-Nummer

hMLH1 1 : 100 Clon G 168-15 BD PharMingen 551091hMSH2 1 : 50 AB-2 Calbiochem NA 27hMSH6/GTBP 1 : 50 44 Becton-Dickinson 610919hPMS2 1 : 25 A16-4 BD PharMingen 556415

Tab. 3: Für die immunhistochemische Darstellung verwendete Antikörper, deren Verdünnung und Herstellernachweis.

2.2.3.6 AuswertungskriterienDie mikroskopische Kontrolle soll bei positiver Färbung eine Kernfärbung zeigen, da sich die DNA-Mismatch-Repair-Proteine im Kern nachweisen lassen. Dies ist gleichbedeutend mit einer regelrechten Antiköperbindung an das entsprechende Protein und einer ungestörten Proteinexpression im Zellkern. Bewertet wurden die Kerne der Basalzellen in den Krypten der Normalmucosa bzw. des Stromas und der Entzündungszellen. Zeigte sich im Bereich des Tumors bzw. Adenoms eine Kernfärbung von weniger als 10%, dann wurde dies als eine fehlende Proteinexpression gewertet. Eine inkomplette Kernfärbung von 10-50% oder nur eine partielle Färbung wurde als positiv gewertet. Zur Positivkontolle wurde das angrenzende Normalgewebe oder der zusätzlich angefertigte Gewebeschnitt des Normalgewebes herangezogen.

Abb. 1 Beispiel für eine negative Anfärbung (MLH1 negatives Karzinom)

Abb. 2 Beispiel für eine positive Anfärbung (MLH1 positives Adenom desselben Patienten)Darstellung einer immunhistochemischen Färbung von Tumorgewebe und Normalgewebe eines HNPCC Patienten. Im Tumorgewebe ist keine Anfärbung der Kernregion durch den verwendeten Antikörper gegen MLH1 darzustellen, im Normalgewebe färben sich die Kernregionen braun an.

Kapitel 3 Ergebnisse

3.1 Allgemeine DatenDie vorliegenden Daten entstammen dem Patientenkollektiv der Verbundstudie der Deutschen Krebshilfe der Pathologie Kassel in den Jahren 01/1998 bis 08/2003. Insgesamt wurden für die hier vorliegende Arbeit bei 122 Patienten Karzinome auf MSI und Expression der MMR Gene untersucht, die auf Grund der Lokalisation und Voranamnese für ein HNPCC-Syndrom verdächtig waren. Bei 40 dieser Patienten waren neben dem Karzinomgewebe ein oder mehrere Adenome verfügbar. Diese Patienten und die entsprechenden Adenome wurden in die weiteren Untersuchungen aufgenommen (40/122 = 32,78%). Bei genauer Anamnese-Erhebung erfüllten von diesen 40 Patienten 36 (36/40 = 90%) die Bethesda Kriterien, so daß diese 15 Frauen und 21 Männer in die Studie aufgenommen wurden (w:m = 1:1,4). Das mittlere Alter dieser Patienten bei der Erstuntersuchung betrug 46 (24-78) Jahre. Abb. 1 Untersuchungsgut. a.) Pat., die die Kriterien erfüllten b.) Geschlechterverteilung

3.2 AdenomhäufigkeitVon 22 Patienten lag im Untersuchungszeitraum von 5,5 Jahren ein Adenom vor, bei 14 Patienten waren in diesem Zeitabschnitt mehrere Adenome aufgetreten (1:1,57).Insgesamt gab es 38 multiple Adenome, von denen 22 synchron und 16 metachron auftraten (1,375 : 1).Bei 28 Patienten wurden die Adenome zeitgleich mit dem Karzinom entfernt, bei fünf (17,8%) wurde erst das Karzinom diagnostiziert und dann im weiteren Krankheitsverlauf neu auftretende Adenome entfernt. Lediglich drei Patienten (10,7%) fielen zuerst durch ein Adenom auf und hatten im späteren Verlauf ein Karzinom.

-20 30 80 130

Pat insg.

Pat.Amst

Pat.Amst/Beth.

58%

42%MännerFrauen

Abb. 3 zeitlicher Zusammenhang Adenom/Karzinom

3.3 Histologie der AdenomeVon den 71 untersuchten Adenomen waren die überwiegende Mehrzahl tubulär (45/71 = 63,38%). Gefolgt wurde diese Gruppe von den tubulo-villösen Adenomen (15/71 = 21,12%) und einer Gruppe von Adenomen (10/71 = 14,08%), deren Wachstumsform nicht sicher näher bestimmt werden konnte, da nicht genügend Material zur Verfügung stand.Zusätzlich fanden wir ein Adenoma serratum. (1/71 = 1,4%)

1,40%

14,08%

21,12%

63,36% t ADt-v ADADAD serratum

Abb. 4 Histologischer Adenomtyp

3.4 Mikrosatellitenstatus der Adenome im Vergleich zu den KarzinomenVon den 44 untersuchten tubulären Adenomen wurde bei 18 Proben der Mikrosatellitenstatus bestimmt. Es fand sich kein MSI - L Adenom.

78%

8%

14%

synchron erst Adenom erst Carzinom

Die Mehrzahl der tubulären Adenome waren MSI – H (12/18 = 66,6%), gefolgt von MSS (6/18 = 33,3%), wobei alle tubulären Adenome am Rande eines Karzinoms jeweils wie das Karzinom MSI – H waren.Dagegen traten MSS Adenome jeweils getrennt vom Karzinom auf, dies 1x synchron und 5x metachron zum jeweils instabilen Karzinom.

Abb. 5 Mikrosatellitenstatus der AdenomeBei den tubulo-villösen Adenomen fanden sich in der überwiegenden Mehrzahl MSI - H Adenome, somit dem MSI Status der Karzinome entsprechend (13/15 = 86,6%), ein Adenom war MSI - L und ein Adenom MSS. Interessant ist hier, daß der Mikrosatellitenstatus der übereinstimmenden Adenome immer mit dem der Karzinome übereinstimmte, obwohl sogar ein Karzinom nicht im Darm sondern im Uterus (Endometriumarzinom) gefunden wurde.Bei der drittgrößten Gruppe, den nicht näher klassifizierten Adenomen, waren 6 MSI – H (75%) und 2 MSI – L. Das Adenoma serratum war MSI – L bei MSI – H Karzinom. Somit waren nur in 73,8% (31/42) der bei gesichertem HNPCC aufgetretenen Adenome MSI-H, während die ebenfalls aufgetretenen Karzinome jeweils den MSI-H Phänotyp aufwiesen.

Abb. 6 Verteilung der Mikrosatellitenstabilität bei den Adenomen

13%

13%

74% MSI - HMSI - LMSS

0

2

4

6

8

10

12

MSI - HMSS

Abb. 7 Zeitlicher Zusammenhang Adenome und Karzinom

05

10152025303540

synchron m etachron

MSI- H

MSI- LMSS

Abb. 8 Zusammenhang zwischen MS – Status und zeitlichem Auftreten

3.5 MMR Proteinexpression der AdenomeInsgesamt wurden 51 Adenome immunhistochemisch auf Expression der MMR Gene MSH2, MSH6, MLH1 und PMS2 hin untersucht. Darunter waren 40 hochinstabile Adenome, 1 leicht instabiles Adenom und 10 mikrosatellitenstabile Adenome.Bei den MSI-H Adenomen hatten 20 einen Ausfall im MSH2/6 System (50%), 11 einen Ausfall im MLH1/PMS2 System (27,5%) und 9 (22,5%) waren in keiner Expression negativ. Das MSI-L Adenom war im MLH1/PMS2 System negativ.Den Bezug der immunhistiochemischen Befunde zum MSI Status verdeutlicht Abb. 9.

75%25%

synchronm etachron

Abb. 9 MMR Proteinexpression und MSI Status

3.6 Immunhistochemie der Adenome im Vergleich zu den KarzinomenBei der größten Gruppe den tubulären Adenomen zeigten 12/23 Adenome einen Expressionsausfall mindestens eines Repairgens (12/23= 52,2%). Die Hälfte der Fälle zeigten einen Ausfall von MSH2 und MSH6 (6/12 = 50%). In 4 Fällen waren auch die Karzinome derselben Patienten MSH2 und MSH6 negativ (Kongruenz 67%), bei den zwei übrigen Karzinomen war nur MSH2 komplett negativ (33%). Insgesamt ergibt sich für die Gruppe der MSH2 und MSH6 negativen Adenome, ein entsprechender Befund bei den Karzinomen, die entweder nur einen MSH2 oder auch einen MSH6 Ausfall aufwiesen.

9

3

12

0

2

4

6

8

10

12

14

MSH 2/6negativ

MLH 1neg

positiv

Abb. 10 IHC Status der AdenomeIn der Gruppe der MLH1 negativen tubulären Adenome (4/13 = 30%) waren auch alle Karzinome MLH1 negativ (100% Kongruenz).Elf tubuläre Adenome (47,8%) waren in allen untersuchten Expressionen positiv.Bei den tubulo-villösen Adenomen war die Mehrzahl der Adenome MSH2 negativ (3/5 = 60%), die Karzinome waren hier MSH6 (2/3 = 67%) und MSH2 negativ (33%), also eine direkte Kongruenz von 33%. Ein tubulo-villöses Adenom war MSH6 negativ das entsprechende Karzinom war ebenfalls MSH6 negativ.

2

20

11

1179

0

5

10

15

20

25

MSI-H MSI-L MSS

MSH2/6 neg.

MLH1/PMS2neg.kein Ausfall

Insgesamt bestätigte sich auch hier wieder die Beobachtung, daß bei MSH2 und MSH6 negativen Adenomen die Karzinome auch entweder MSH2 oder MSH6 negativ sind, bei einer direkten Kongruenz von 50%.Zwei tubulo-villöse Adenom waren MLH1 negativ, hier war auch das entsprechende Karzinom jeweils MLH1 negativ.Bei den Adenomen, die aufgrund von ungenügendem Material nicht näher bestimmt werden konnten, waren 4 MLH1 negativ, 2 MSH2 negativ und 2 MSH2 und MSH6 negativ. Alle Karzinome entsprachen direkt den Adenomen (100% Kongruenz).Das Adenoma serratum war durchweg positiv, bei einem MLH1 negativen Karzinom.In der Gruppe der Adenome ergibt sich also eine direkte immunhistochemische Kongruenz von insgesamt 14/19 (73,7%), zählt man die Gruppe MSH2 und MSH6 zusammen sowie MLH1 ergibt sich ein Kongruenz von 100% (19/19). Bei einem MSH 2+6 /MLH1 Verhältnis von 13/6 = 2,16/1).Abb. 11 Immunhistochemische Kongruenz Adenom/Karzinom

Abb. 12 Anzahl der MSH2/6 neg. bzw. MLH1 neg. AdenomeMSH 2/6 negativ

Entspr. Karzinom negativ

Kongruenz in %

MLH1 negativ

Entspr. Karzinom negativ

Kongruenz in %

Pos. Adenome bei neg. Karzinomen

Tubuläre Adenome

6 6 100 4 4 100 11

Tubulo villöse Adenome

4 4 100 2 2 100

Adenoma serratum

1

Tabelle 1 Zusammenhang MSH /MLH Status der Adenome und der entsprechenden Karzinome (MSH 2 und MSH6 wurden zu einer Gruppe zusammengefasst).Wie man aus Tabelle 1 deutlich erkennen kann, ist der Zusammenhang zwischen Adenomen und Karzinomen deutlich zu sehen. Jedoch sind immer wieder einzelne Adenome vorhanden, die immunhistochemisch keinen Bezug zum Karzinom zu haben scheinen.

26%

74%

nicht kongruent kongruent02468

101214

Anzahl

MSH

MLH

3.7 Lokalisation der AdenomeVon den tubulären Adenomen waren 11 vor der rechten Kolonflexur (11/31 = 35,5%), 8 im Kolon transversum (8/31 = 25,8%) und 12 nach der linken Kolonflexur (12/31 = 38,7%) lokalisiert. Bei 13 tubulären Adenomen war die genaue Lokalisation nachträglich nicht mehr eruierbar.Bei den tubulo-villösen Adenomen waren 3 Adenome vor der rechten Kolonflexur (3/10 = 30%) und 7 Adenome nach der linken Kolonflexur. Zwei tubulo-villöse Adenome konnten keiner genauen Lokalisation zugeordnet werden. In der Gruppe der durch Materialmangel nicht als tubulär oder villös näher bestimmbaren Adenome war die Mehrzahl nach der linken Kolonflexur (4/6 = 66,7%)lokalisiert. Vor und nach der rechten Kolonflexur befand sich jeweils ein Adenom und bei einem weiteren Adenom konnte die Lokalisation nicht mehr nachvollzogen werden.

Abb. 13 Lokalisation der Adenome bezogen auf die HistologieBei den synchronen Adenomen (unabhängig von der Histologie) waren 15 Adenome (15/44 = 34,1%) vor der rechten Kolonflexur, 7 (7/44 = 15,9%) im Kolon transversum und 22 (22/44 = 50%) hinter der linken Kolonflexur lokalisiert. Sieben Adenome konnten nachträglich nicht mehr einer genauen Lokalisation zugeordnet werden.Bei den metachronen Adenomen war kein Adenom vor der rechten Kolonflexur, zwei nach der rechten Kolonflexur (2/7 = 28,6%) und fünf nach der linken Kolonflexur (5/7 = 71,4%). Acht der metachronen Adenome konnten auch hier wieder nicht zugeordnet werden.

0

2

4

6

8

10

12

t AD AD tv AD

vor re Kolonflexur vor li Kolonflexur nach li Kolonflexur nicht bestimmt

Abb. 14 Lokalisation der Adenome bezogen auf den zeitlichen ZusammenhangBei den MSI-H Adenomen waren 11(11/26 = 42,3%) vor der rechten Kolonflexur, 3 (3/26 = 8,7%) nach der rechten Kolonflexur und 12 (12/26 = 46,2%) nach der linken Kolonflexur. 12 MSI – H Adenome konnten nicht mehr zugeordnet werden.

Abb. 15 Lokalisation der Adenome bezogen auf die ImmunhistochemieBei den MSS Adenomen waren 2 vor der rechten Kolonflexur (2/8 = 25%), 1 vor der linken Kolonflexur ( 1/8 = 12,5%) und 5 nach der linken Kolonflexur (5/8 = 62,5%). Zwei der MSS Adenome konnten nicht mehr zugeordnet werden.

12%

46%42%

vor re Kolonflexurvor li Kolonflexur

nach li Kolonflexur

0

5

10

15

20

25

synchron m etachron

vor re Kolonflexur vor li Kolonflexur nach li Kolonflexur nicht zugeodnet

Abb. 16 Lokalisation der Mikrosatellitenstabilen Adenome

Von den im Mikrosatellitenstatus nicht bekannten Adenome waren vor der rechten Kolonflexur 4 (4/19 = 21%), vor der linken Kolonflexur 4 (4/19 = 21%) Abb. 17 Lokalisation der histologisch nicht bestimmten Adenome

Adenome und nach der linken Kolonflexur waren 11 (11/19 = 28,9%) Adenome. 3 Adenome konnten auch hier nicht weiter zugeordnet werden.

3.8 Zeitliche ZusammenhängeIn der Gruppe der tubulären Adenome waren die meisten synchron zum Karzinom (33 /43 = 76,7%), 23,2% (10/43) waren metachron.Bei den tubulo - villösen Adenomen waren 12 synchron (12/15 = 80%) und 3 metachron (3/15 = 20%).Bei den aufgrund von Materialmangel nicht näher bestimmten Adenomen (10/10 = 100%) entwickelten sich alle synchron mit dem Karzinom.Das Adenoma serratum war metachron.Die hoch mikrosatelliteninstabilen Adenome erwiesen sich als überwiegend synchron (30/36 = 83,3%), 6 dieser Adenome entstanden metachron (6/36 = 16,6%). Das leicht mikrosatelliteninstabile Adenom stellte sich als synchron dar.

62%13%

25%

vor re Kolonflexur

vor li Kolonflexur

nach li Kolonflexur

58%21%

21%

vor re Kolonflexurvor li Kolonflexur

nach li Kolonflexur

Von den mikrosatellitenstabilen Adenomen entwickelten sich 8 synchron (8/10 = 80%), zwei metachron (2/10 = 20%).Von den MSH 2 negativen Adenomen traten 7 synchron (7/12 = 58,3%) und 5 metachron (5/12 = 41,7%) auf. Von den MSH6 negativen Adenomen kamen alle 3 synchron vor.Von den MSH2 und 6 negativen Adenomen stellten sich 5 synchron (5/6 = 83,3%) und 1 metachron (1/6 = 16,7%) dar. Insgesamt enthielt diese Gruppe 15 (15/21 = 71,4%) synchron und 6 (6/21 = 28,6%) metachron entstandene Adenome. Von den MLH1 negativen Adenomen traten alle 13 synchron auf.Von den in allen untersuchten Expressionen positiven Adenomen entwickelten sich 13 synchron (13/17 = 76,5%) und 4 metachron (4/17 = 23,5%).

3.9 Lokalisation Adenome zu ihren Karzinomen12 Adenome wurden im Karzinom lokalisiert. In einem Abstand bis zu 5 cm vom Karzinom entfernt waren 28 Adenome. Mehr als 5 cm vom Karzinom entfernt, fanden wir 31 Adenome.Metachron aufgetretene Adenome fanden sich nur in der Gruppe der mehr als 5 cm entfernt vom Karzinom aufgetretenen Adenome (12/31 = 38,7%).Alle Adenom in Karzinom aufgetretenen Adenome waren zu 100% kongruent in ihrem Mikrosatellitenstatus zum Karzinom.In der Gruppe der bis zu 5 cm entfernten Adenome boten die meisten denselben Mikrosatellitenstatus wie die Karzinome (25/28 = 89,3%), jedoch gab es hier auch drei mikrosatellitenstabile Adenome (3/28 = 10,7%).In der Gruppe der mehr als 5 cm entfernten Adenome waren 24/31 = 77,4% kongruent zum Karzinom, allerdings gab es auch hier insgesamt sieben mikrosatellitenstabile Adenome (7/31 = 22,5%).In der MMR-Expression waren sowohl in der Adenom in Karzinom Gruppe, als auch in der Gruppe der Adenome weniger als 5 cm entfernt vom Karzinom alle Adenome dem Karzinom analog. In der Gruppe der mehr als 5 cm entfernten Adenome war die Mehrzahl der Adenome ebenfalls kongruent zu ihrem jeweiligen Karzinom (18/31 = 58,1%), jedoch gab es hier auch deutliche Unterschiede zum Karzinom (13/31 = 41,9%). Diese Adenome entsprachen in ihrer Expression dem „gesunden“ Normalgewebe.

Kapitel 4 Diskussion

4.1 Allgemeine DatenDie im Kolon und Rektum lokalisierten Karzinome bilden die größte Gruppe der gastrointestinalen Tumore. Davon sind etwa 10% genetisch fixiert, wobei die vom Typ des hereditären nicht mit Polyposis assoziierten Kolonkarzinoms (HNPCC) die derzeit größte Gruppe genetisch verankerter vererbbarer Kolonkarzinome darstellen.

4.2 MutationsanalysenDas HNPCC Syndrom wird durch Mutationen im Mismatchrepair (MMR-) System verursacht, so daß die betroffenen Patienten früher und häufiger an Karzinomen erkranken als Patienten ohne diese Mutation. Dies zeigte auch die Altersverteilung in unserer Studie: das mittlere Alter bei Erstmanifestation der Erkrankung betrug 46 Jahre, der jüngste Patient war 24 Jahre, der älteste 78 Jahre. In den meisten Fällen ist eine Mutation in den Genen MLH1 oder MSH2 beschrieben. Diese Mutation ist bereits durch das Genom der Patienten fixiert, durch ein molekulargenetisches Screening müsste man also bis zu 90% der Patienten identifizieren können. 10% der Patienten haben eine Mutation in anderen Genen, z.B. PMS2 oder MSH6. Wie Zilinski et al (2002) jedoch zeigen konnten, ist ein Mutationsscreening zur Detektion insbsondere von noch nicht erkrankten Mutationsträgern aufgrund unterschiedlicher Schwierigkeiten (noch) nicht zu empfehlen:Derzeitig liegt die Nachweisrate von Keimbahnmutationen bei klinisch oder auch durch Nachweis von MSI und MMR Proteinausfall definierten HNPCC Patienten nur bei etwa 60%. Eine Ursache dafür scheint zu sein, daß verschiedene Genloci von der Mutation betroffen sein können. Bisher wurden allein 120 verschiedene Keimbahnmutationen beschrieben, den größten Teil stellen dabei die Mutation in den MSH2- und MLH1-Genen (Hahn und Schmiegel 1995). In den bislang durchgeführten Untersuchungen zu diesen beiden Genen, konnten keine bevorzugten Loci, sog. hot spots, für eine Mutation ausgemacht werden. Daher müssen jeweils die gesamten Gene mit einer Länge von entweder 2,5Kb für das MSH2 Gen oder 2,7Kb für das MLH1 Gen sequenziert werden.Durch ein molekulargentisches Mutationsscreening ist es somit bisher weder möglich HNPCC Patienten eindeutig zu identifizieren noch sie definitiv auszuschließen.

4.3 Tumorentstehung unter dem Einfluss der MMR - GeneDie Tumorentstehung wird durch verschiedene Gene begünstigt. Am besten untersucht sind die zuerst entdeckten Onkogene. Sie liegen als Protoonkogene in der Zelle vor und sind bei Aktivierung für das unkontrollierte Wachstum der Zelle verantwortlich.Die als nächste für die Tumorentstehung verantwortlich entdeckte Gruppe von Genen sind die Tumorsupressorgene, die bei normaler Funktion die Zellproliferattion unterdrücken. Bei einem Ausfall dieser Gene teilt sich die Zelle unkontrolliert.

Anhand von Untersuchungen von HNPCC-Patienten fand sich eine dritte Gruppe von Genen, die für eine Tumorentstehung verantwortlich sein können, die MMR-Gene. Parson et al (1993) konnten zeigen, daß Patienten einen Ausfall in diesen Genen auf einem Allel haben. Auch hier reicht jedoch der vererbte Ausfall eines Genes nicht aus, um ein Karzinom entstehen zu lassen. Es muß zu einer erworbenen Veränderung des anderen Allels kommen, analog zu der Hypothese von Knudson ("two hit Hypothese") (Knudson AG (1971)).Die MMR Gene haben einen Einfluß auf verschiedene Enzyme, z.B. den TGF-beta-II-Rezeptor. Wie bei Lynch et al. (1999) und Vasen et al.(1999) beschrieben, ist HNPCC die häufigste autosomal dominant vererbte Störung. Auch die in unserer Studie gefundene nahezu gleiche Verteilung Männer zu Frauen (1:1,4) spricht für eine autosomal vererbte Störung.

4.4 Adenome und HNPCCBisherige Untersuchungen zu HNPCC richten sich vor allem auf die Karzinogenese und somit auf die Untersuchung der Karzinome. Erst in letzter Zeit finden zunehmend auch die Adenome Beachtung. Wie beim sporadischen Karzinom sind auch beim HNPCC auftretende Adenome Vorläufer der sich daraus entwickelnden Karzinome. Daher wird HNPCC Patienten auch ein enger Vorsorgeplan mit regelmäßig stattfindenden Koloskopien zur frühzeitigen Entdeckung und Entfernung der Adenome angeraten. Hiermit erhofft man sich ein Ausbrechen der Tumorart frühzeitig verhindern zu können. Ein weiterer Vorteil der frühzeitigen Diagnose einer HNPCC – Erkrankung vor Auftreten des Tumors ist die Möglichkeit einer primären Prävention. Wie Arbeiten von Jarvinen et al gezeigt haben kann so die Entstehung von Karzinomen beim HNPCC – Syndrom bis zu 62% gesenkt werden (Jarvinen et al, 2000). Zusätzlich konnten Bliss et al. zeigen, daß diese Untersuchungsmethode im frühzeitigen Krankheitsverlauf nicht nur positiv für den Krankheitsverlauf, sondern auch kosteneffektiv ist (Bliss et al., 2004)

4.5 Immunhistochemische Untersuchungen des Mikrosatellitenstatus

4.5.1 Aufbau von MikrosatellitenMikrosatelliten sind kurze sich wiederholende Sequenzen, vorwiegend der Basen Adenosin und Tyrosin. Diese Basen sind in kurzen Gruppen von drei bis fünf Basen angeordnet. Ihre Funktion ist bisher noch nicht geklärt, beim HNPCC Syndrom scheinen sie eine wichtige Rolle bei der Genomstabilisierung zu spielen. Akiyama et al konnten in 57% der untersuchten Adenome bei HNPCC-Patienten eine Veränderung des Poly-A-Repeats zeigen (Akiyama et al 1996).

4.5.2 Mikrosatelliten(in)stabilität bei HNPCC-PatientenHNPCC Karzinome können sowohl immunhistochemisch auf Expression der MMR Proteine MSH2, MSH6, MLH1 und PMS2 als auch auf Mikrosatellitenstabilität hin untersucht werden. Die alleinige Bestimmung der

Immunhistochemie schließt die Tumore aus der Erfassung aus, die einen Aktivitätsverlust, jedoch kein Expressionsverlust haben. Dies führte zu den allgemeinen Empfehlungen, bei hochgradig HNPCC verdächtigen Patienten bei Erkrankungsverdacht und/oder immunhistochemisch festgestelltem Ausfall einer Komponente des MMR Systems den Mikrosatellitenstatus zu bestimmen. Folgerichtig wurde bei den uns zugänglichen Patienten zusätzlich im Rahmen des molekulargenetischen Screenings der Mikrosatelliten-Status bestimmt. Eine hohe Mikrosatelliteninstabilität wurde dabei durch einen Ausfall von mindestens zwei der untersuchten Sequenzabschnitte definiert. Untersucht wurden insgesamt fünf Sequenzabschnitte, welche als Referenzpanel vom National Cancer Institute empfohlen wurden (Dietmaier Cancer Res; Umar JNCI 2004).HNPCC-Erkrankte haben in bis zu 90% einen Störung im Mikrosatelliten-System, im Umkehrschluß heißt das jedoch auch, das 10% der HNPCC-Erkrankten einen unauffälligen Mikrosatelliten-Status an den untersuchten Loci haben (Aaltonen et al 1994). Im Gegensatz dazu haben Patienten mit sporadischen Karzinomen nur in 15% eine Mikrosatelliteninstabilität (Peltomäki et al 1993).In der anfänglichen Bestimmung von Mikrosatelliteninstabilitäten gab es große Unterschiede in der Inzidenz, was sich durch einen Uneingikeit in der Anzahl der analysierten Mikrosatellitenmarker, der unterschiedlichen Repeattypen und der Uneinigkeit, ab welcher Anzahl von positiven Markern ein Tumor als instabil zuwerten war, erklärte. Diese Uneinigkeiten führten 1998 zu den allgemein gültigen Kriterien, die auch in unserer Studie berücksichtigt wurden (Boland et al 1998).

4.6 Grundlage jeder HNPCC – Diagnostik: Die AnamneseDer Beginn jeder Diagnosestellung eines HNPCC-Syndroms ist jedoch neben dem molekulargenetischen Screening die genaue Anamneseerhebung, die spätestens bei der Verdachtsdiagnose nachgeholt werden muß, da die typische klinische Symptomatik, wie z.B. die Polyposis oder Augenhintergrundveränderung bei der FAP, fehlt, noch das es typische Laborbefunde wie z.B. das erhöhte PSA (prostataspezifisches Antigen) beim Prostatakarzinom gibt. Der entscheidende Nachteil der bisherigen Diagnosestellung ist, daß zur Diagnose bereits ein Tumor vorliegen muß. Daher wurde, auch in der Klinik, in letzter Zeit immer mehr Augenmerk auf die präkanzerösen Adenome gelegt. Das, soweit es in das allgemeine Screening Einzug halten sollte, hat eine wichtige Folge: Die Diagnose HNPCC kann bei durch die Familienanamnese vorbelasteten Patienten früher gestellt werden und mögliche Karzinomentstehung gegebenenfalls verhindert werden. Die Voraussetzung für alle Screening – Überlegungen ist aber, dass immer alle Adenome bei HNPCC – Patienten den genetischen Defekt aufweisen.

4.7 Ziele der ArbeitDie hier vorliegende Arbeit widmet sich insbesondere der genauen Beschreibung der Adenome im zeitlichen, histologischen und genetischen Zusammenhang unter verstärktem Augenmerk auf die klinische Relevanz und die möglichen praktischen Konsequenzen.

Um eine wirkungsvolle Prävention zu erreichen muß der Patient einen Arztkontakt vor Auftreten der Krankheit (in diesem Fall vor Karzinomentstehung) haben.

4.8 Zeitliche Zusammenhänge zwischen Adenomen und KarzinomenIn unseren Daten sind zumeist die Adenome zeitgleich mit dem Karzinom entfernt worden (78%). In 14% der Fälle wurde zuerst das Karzinom entfernt und erst im weiteren Krankheitsverlauf die Adenome diagnostiziert. Insgesamt ergibt dies eine Patientengruppe von immerhin 92%. Diese Patienten hatten keine Möglichkeit einer früheren Diagnosestellung über die Untersuchung ihrer bereits bestehenden Adenome.Lediglich bei 8% der Patienten wurde zuerst eine Adenomentfernung vor Diagnose der Karzinomerkrankung durchgeführt. Diese Patienten haben eine effektive Vorsorge erfahren. Für die zukünftige Versorgung der HNPCC- Patienten wäre es wünschenswert, wenn noch mehr HNPCC vorbelastete Patienten in die engmaschige Vorsorge einbezogen werden könnten.

4.9 Mikrosatellitenstabilität in Adenomen und KarzinomenBei der Bestimmung der Mikrosatellitenstabilität ergaben sich teilweise große Ähnlichkeiten zwischen Adenomen und Karzinomen der jeweiligen Patienten. Die Mehrzahl der Adenome entsprach in der Mikrosatellitenstabilität den Karzinomen. Jedoch waren auch hier komplett mikrosatellitenstabile Adenome zu finden. Dies ist umso mehr von Bedeutung, als dass bisher eine Mikrosatelliteninstabilität als Kriterium für eine HNPCC-Diagnose unumgänglich war, wie auch Untersuchungen von Rüschoff et al. (1995), Boland et al. (1998), Lamberti et al und Loukola et al zeigen konnten (Rüschoff et al, 1995, Boland et al,1998, Lamberti et al, 1994, Loukola et al, 2001). Dem schließt sich auch die Untersuchung Iino et al und Peroni et al an, die die Hypothese vertreten, daß MSI eine frühe Stufe der Karzinogenese in HNPCC ist (IIno et al, 2000, Pedroni et al, 2001).Wie bisher dargestellt wurde, sind die Adenome bei HNPCC zuerst mikro-satelliteninstabil und dann genetisch verändert. Daher ist es wahrscheinlich, daß wir "echte" sporadische Adenome erfaßt haben und nicht, wie es ebenfalls möglich wäre, Adenome vor dem second hit.Nicht unerwähnt soll in diesem Zusammenhang bleiben, daß in beiden Gruppen die Adenome sowohl zeitgleich mit dem Karzinom (synchron), als auch unabhängig von der Karzinomentfernung (metachron) aufgetreten waren.

4.10 Immunhistochemische Zusammenhänge zwischen Adenomen und KarzinomenDie meisten der entfernten Adenome, gleich welcher genauen histologischen Kategorisierung, entsprachen in ihrer immunhistochemischen Färbung den Karzinomen entweder genau oder wiesen Ausfälle im entsprechenden Gegenpartner der Reparaturgene (MSH2/MSH6, PMS2/MLH1) auf. Die Karzinome sind in unserer Studie durchweg MSI-H gewesen, was den Daten von

Peltomäki et al. (Peltomäki, 2001) entspricht, in deren Untersuchung 90% der HNPCC-Karzinome MSI-H waren, wohingegen dies nur bei 15 % der sporadischen Karzinome der Fall war. In den immunhistochemischen Färbungen ergaben sich zwei Konstellationen von Enzymausfällen. In dem einen Fall war der Komplex MSH2 / MSH6 ganz oder teilweise betroffen, der andere Teil wurde von dem Paar MLH1 und PMS2 gestellt. So war in der immunhistochemischen Färbung immer festzustellen, daß bei Adenomen mit einem Ausfall in der MSH2 und/oder MSH6 Expression auch die Karzinome entsprechende Defizite vorwiesen. Analog dazu hatten die MLH1 defizitären Adenome auch MLH1 negative Karzinome. Interessanterweise hatten wir in der uns zugänglichen Patientengruppe kein Adenom, welches alleinig einen Ausfall in der Expression von PMS2 gezeigt hat.Besondere Aufmerksamkeit soll hier auf den Punkt gelenkt werden, daß es in allen Subklassen der Adenome Adenome mit positiver MMR Genexpression gab. Dies hat große Konsequenzen für den möglichen Ausschluß für Patienten aus Vorsorgeprogrammen, bei nachgewiesenen positiven Adenomen und somit falsch negativer HNPCC - Ausschlußdiagnose.

4.11 Lokalisationen von Adenomen und KarzinomenDie klassische Lokalisation für das HNPCC – Karzinom ist das Kolon und das Rektum. In der Mehrzahl der Fälle waren sie nach der linken Flexur lokalisiert, also im Kolon descendes, Sigma oder Rektum. An dieser anatomischen Lokalisation ist auch eine sporadische Adenomentstehung am wahrscheinlichsten.Nicht unerwähnt bleiben darf die zweithäufigste Lokalisation, das Endometrium. Im Gegensatz zum Kolon ist die Möglichkeit der Früherkennung durch Adenome hier jedoch deutlich schlechter. Eine Nichtbeachtung dieser Lokalisation hätte aber eine deutliche Unterdiagnostik der Erkrankung zur Folge. Ebenso diskutiert werden müssen die anderen möglichen Lokalisationen, wie z.B. Karzinome des Urogenitaltraktes, des Dünndarms oder des Ovars, die in deutlich kleinerer Fallzahl vorliegen, jedoch unzweifelhaft mit zum HNPCC Syndrom gezählt werden müssen (Jarvinen et al 1995, Menko et al 1993, Toribara und Schleisinger 1995). So fanden sich bei Untersuchungen von Vasen et al 1990 an HNPCC Familien 104 Kolonkarzinome und 65 extrakolische Karzinome (62,5%). Eine früher häufig aufgetretene Lokalisation des HNPCC, das Magenkarzinom, spielt heute nur noch eine untergeordnete Rolle. Dies scheint die Hypothese von Knudson et al. zu bestätigen, daß zur Karzinogenese ein Mutation im zweiten DNA – Strang eintreffen muß. Dieser "zweite Schlag" (two hit Hypothese) ist durch Umweltfaktoren beeinflußbar und tritt demzufolge auch an den Lokalisationen auf, die auch von sporadischen Karzinomen, oft ebenfalls mit Umweg über ein entsprechend sporadisches Adenom, am häufigsten betroffen sind.Besonderes Augenmerk sollte in diesem Zusammenhang auf die Adenome, die mehr als 5 cm entfernt vom Karzinom lokalisiert sind, gerichtet werden. Sie sind meist jenseits der linken Flexur, alle jedoch jenseits der rechten Flexur gelegen.

Dies spricht, abgesehen von den häufigeren Unterschieden in der Genexpression und dem MSI-Status, für eine sporadische Entstehung dieser Adenome. Interessanterweise sind alle Patienten mit diesen Adenomen eindeutig HNPCC-Patienten, die auch „HNPCC-typische“ Adenome haben.

Abb. 1 Vergleich zweier räumlich entfernter, synchroner Adenome desselben Patienten

4.12 Zusammenfassung und SchlußfolgerungenAll diese Fakten sprechen für eine zusätzliche eigenständige Adenomentstehung bei HNPCC- Patienten, also eine sporadische Adenomentstehung zusätzlich zur HNPCC- assoziierten Adenomentstehung.Da bei Patienten mit einer entsprechenden Vorgeschichte ein engeres Screening dringend empfohlen wird, liegt in der Entfernung von sporadischen Adenomen eine mögliche Fehlerquelle für eine falsch negative Diagnose, sollte diese als beweisend für einen Ausschluss einer HNPCC-Erkrankung gelten.

Kapitel 5 Zusammenfassung Das hereditäre non – polypöse Kolonkarzinom stellt unter den bösartigen Erkrankungen des Magen – Darm – Traktes mit 2 – 5%, in einigen Studien sogar bis zu 30%, die größte Gruppe der ererbten Tumorerkrankungen. Es scheint sich dabei um eine polymorph vererbte Erkrankung zu handeln, deren Diagnose trotz zahlreicher Fortschritte immer noch schwierig ist. Die große Schwankungsbreite in der Epidemiologie ergibt sich aus der schwierigen Diagnosestellung, die sich vor allem auf die Anamneseerhebung stützt, deren Grundlagen von A. Warthin 1913 gelegt wurden und die heute mittels der Amsterdam – und Bethesda – Kriterien verfeinert fortgeführt wird. Hier sind, vor allem bei unvollständiger Anamneseerhebung, die Möglichkeiten einer falsch negativen Diagnose recht groß, insbesondere durch die uneinheitliche Einbeziehung der verschiedenen Tumorlokalisationen.Die Diagnose einer HNPCC – Erkrankung wird wesentlich durch laborchemische Methoden unterstützt. Hierbei wird besonderes Augenmerk auf Mutationen in Mismatch – repair Genen und auf Mikrosatelliteninstabilitäten gelegt.In bis zu 90% der Fälle ist bei einer HNPCC – Erkrankung eine Mutation in den Mismatch repair Genen MSH2 und MLH1 zu finden, was jedoch auch bei sporadischen Karzinomen der Fall sein kann. Daher folgt im Anschluß an die immunhistochemische Diagnostik eine Bestimmung der Mikrosatellitenstabilität, die als hoch instabil bei einem Ausfall von mindestens zwei der untersuchten fünf Loci gilt.Eine, im positiven Fall beweisende Methode der Diagnosesicherung, ist die Durchführung eines genetischen Screenings. Da noch nicht alle Genloci sicher bekannt sind (polymorph vererbte Erkrankung), ist diese Methode mit einem Risiko einer falsch negativen Diagnose behaftet. Lediglich in 60% der Fälle mit einer HNPCC Diagnose mittels Anamnese und entsprechendem MSI Status kann eine Mutation nachgewiesen werden.Eine sichere Diagnose einer HNPCC Erkrankung kann also nur durch eine gute Zusammenarbeit der Kliniker mit dem Pathologen und dem entsprechend ausgerüsteten Labor gestellt werden. Besonders wichtige Diagnosekriterien sind dabei die Anamnese, die histologische Begutachtung und die genaue Untersuchung der Gewebeschnitte auf Veränderungen im MMR System und im MSI Status. Bislang wird die Diagnose HNPCC allerdings meist nur bei bereits vorliegendem Karzinom durch die oben erläuterte Stufendiagnostik gestellt. Ein wesentlicher Schritt wäre die Diagnosestellung vor Manifestation des Karzinoms.Eine Karzinomerkrankung im GI-Trakt hat den großen Vorteil über Zwischenstufen stattzufinden, nämlich vom Normalgewebe über das Adenom zur Endstufe dem Karzinom. So könnte mithilfe eines entsprechenden Adenoms auf eine folgende Karzinomerkrankung geschlossen werden. Diese Vorstufen, die Adenome, werden im Moment leider noch unzulänglich untersucht, obwohl in ihnen der Schlüssel für die oben definierten Problemstellungen liegen könnte und sie mittels Koloskopie relativ leicht zugänglich sind.

In dieser Arbeit wurden Adenome und deren Mikrosatellitenstatus bei diagnostizierten HNPCC-Patienten im zeitlichen, immunhistochemischen und histologischen Zusammenhang betrachtet. Es wurden nur Patienten in die Studie eingeschlossen, bei denen sicher von einer HNPCC Erkrankung ausgegangen werden konnte. Erwartungsgemäß entsprachen die meisten Adenome in ihrer Immunhistochemie und dem MSI-Status, den durch die HNPCC Erkrankung erwarteten oder gefundenen Karzinomen, unabhängig vom Ort der Entstehung und vom zeitlichen Zusammenhang. Jedoch wurden auch in allen Mikrosatellitenstabilitäten, immunhistochemischen, zeitlichen und histologischen Zusammenhängen Adenome gefunden, deren Pathologie am ehesten sporadischen Adenomen entspricht. Diese Adenome wurden mehr als 5 cm vom Primärtumor entfernt gefunden. Es wäre also eine mögliche Schlußfolgerung, daß sporadische Adenome unabhängig von der genetischen Disposition, dem zeitlichen Zusammenhang und der Histologie bei allen Patientengruppen auftreten können. Das MSI – und IHC – Screening auf HNPCC an Adenomen ist also mit einer, den Karzinomen um mindestens 20 Prozent höheren, falsch-negativ Rate behaftet.Dies ist umso mehr von Bedeutung, als daß das Auftreten von sporadischen Adenomen oft als Ausschlußkriterium für eine HNPCC Erkrankung galt. Nach unseren Untersuchungen kann dies ein falscher Rückschluß sein, da es durchaus möglich ist, daß auch bei HNPCC – Patienten unabhängig von der Grunderkrankung sporadische Adenome vorliegen können.

Chapter 6 Summary Among the malignant diseases of the gastro-intestinal (GI) tract, the hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC) builds the largest group of hereditary tumor diseases, with percentages ranging from with 2-5% up to 30%, depending on the study. The (HNPCC) seems to be a polymorphic inherited disease; despite progress, diagnosis is still difficult. The large variability of prevalences in epidemiological studies results from these diagnostic difficulties. Diagnosis is based on the anamnesis, initially developed 1913 by A. Warthin and later refined by the Amsterdam– and Bethesda-Criteria. Consideration of tumor localization is not standardized, such that the probability for a false diagnosis is relatively high, especially if anamnesis is incomplete. Diagnosis of HNPCC is mainly supported by laboratory chemical methods, with a special emphasis on mutations in mismatch-repair genes and instabilities of microsatellites.A mutation in mismatch- repair genes MSH2 and MLH1 can be found in up to 90% of all cases. Such a mutation, however, can also be observed in sporadic carcinoma. Therefore, the immuno- histochemical diagnosis is followed by an examination of the microsatellite stability, which is judged as highly instable if there is a drop-out of at least two of the five examined locations.Genetic screening is a method that proofs a diagnosis if the outcome is positive. However, since not all gene localizations are known (polymorphic inherited disease), this method suffers from the risk of a false negative diagnosis. Using anamnesis and MSI status, a mutation can only be detected in 60% of all cases with a HNPCC diagnosis. Thus, a safe diagnosis of HNPCC is only possible in cooperation between a clinician and a pathologist with a laboratory equipped for the required examinations. Important criteria for diagnosis are anamnesis, histological report and a careful examination of changes in the MMR system and the MSI status in tissue sections.So far, diagnosis of HNPCC is typically based on the diagnostic steps described above. An important step is the diagnosis before the manifestation of a carcinoma.The advantage of a carcinoma in the GI-tract is that it proceeds in several steps from normal tissue over adenoma up to the final stage of a carcinoma. Accordingly, an adenoma could help to predict a future carcinoma.Adenoma might bear the key to the problems described above, and they are relatively easy to examine using coloscopy, but at the moment they are not adequately examined.This study aims at examining temporal, immuno-histochemical and histological perspectives of adenoma and their microsatellite status in patients with a HNPCC diagnosis.Only patients with a safe diagnosis of HNPCC were included in the study.As expected, immuno-histochemical results and MSI status of most adenoma corresponded well with the carcinoma detected or expected due to HNPCC. This result was independent of source location and temporal aspects of the disease.However, adenoma with a pathology close to sporadic adenoma were also observed in all micro-satellite stabilities, immuno-chemical, temporal and

histological relationships. These adenoma were detected more than 5 cm away from the primary tumor.A possible conclusion is that sporadic adenoma can appear irrespective of genetic disposition, temporal relationships and the histology of patient groups. Accordingly, the false-negative rate of MSI- and ICH-screenings for HNPCC using adenoma is at least 20% than the false-negative rate using carcinoma.This is an important finding since so far sporadic adenoma were often used as an exclusion criterion for HNPCC. Our study suggests that this might be a wrong conclusion since HNPCC patients can have sporadic adenoma irrespective of the primary disease.

Kapitel 7 Literatur und AbbildungsnachweisAaltonen LA, Sankila R, Mecklin JP, Jarvinen H, Pukkala E, Peltomaki P, de la Chapelle AL (1994): A novel approach to estimate the proportion of hereditary nonpolyposis colorectal cancer of the total cancer burden. Cancer Detec Prev 18:57-63Akiyama Y, Iwanaga R, Ishikawa T, Sakamoto K, Nishi N, Nihei Z, Iwama T, Saitoh K, Yuasa Y (1996): Mutations of the transforming growth factor-beta type II receptor gene are strong related to sporadic proximal colon carcinomas with microsatellite instability. Cancer 78:2478-2484Al-Taie O, Mörk H, Seufert J, Treis H, Jakob F, Scheurlen M (2001): Hereditäres Non-Polyposis kolorektales Karzinom (HNPCC), Aktuelle Übersicht zur Ätiologie, Klinik, Diagnostik und Therapie. Med Klin 96:529-38Boland CR, Sato J, SaitoK, Carethers JM, Marra G, Laghi L, Chauhan DP (1998): Genetic instability and chromosomal aberrations in colorectal cancer: a review of the current models. Cancer Detect Prev 22:377-382 Boland CR, Thibodeau SN, Hamilton SR, Sidusky D, Eshlena JR, Burt RW, Meltzer SJ, Rodriguez-Bigas MA, Fodde R, Ranzani GN, Srivastava S (1998): A national Cancer Institute workshop on microsatellite instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res 58:5248-5257Bliss C, Schroy III P: Endoscopic Diagnosis and Management of Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer. Curr Opin Gastroenterol 20(5): 468-473Dietmaier W, Wallinger S, Lassotta I, Wegele P, Bocker T, Kullmann F, Fishel R, Rüschoff J (1997): Diagnostic microsatellite instability: definition and correlation with mismatch repair expression. Cancer Res 57:4749-4756Fishel R, Wilson T (1997): DNA repair and molecular carcinogenesis. Curr Opin Genet Dev 7:105-113Hahn SA, Schmiegel WH (1995): Mutationen der Gene hMSH2 und hMLH1 sind für 90% der hereditären kolorektalen Karzinome verantworltich. Z Gastroenterol 33:135-137Iino H, Simms L, Young J, Arnold J, Winshio IM, Webb SI, Furlong KL, Leggett B, Jass JR (2000): DNA microsatellite instability and mismatch repair protein loss in adenomas presenting in hereditary non-polyposis colorectal cancer. Gut 47: 37-42Jarvinen HJ, Mecklin JP, Sistonen P (1995): Screening reduces colorectal cancer rate in families witch hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Gastroenterology 108:1405-1411Jarvinen HJ, Aarnio M, Mustonen H, Aktan-Collan K, Aaltonen LA, Peltomäki P, De La Chapelle A, Mecklin JP (2000): Controlled 15-year trial on screening for colorectal cancer in families with hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Gastroenterology 118 (5):969-71Jass JR, Do KA, Simms LA, Iino H, Wynter C, Pillay SP, Searle J, Radford – Smith G, Young J, Leggertt B (1998): Morphology of sporadic colorectal cancer with DNA replication errors. Gut (in press)

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Kapitel 8 Anhang I (Gensequenzen)

8.1 MSH21 ggcgggaaac agcttagtgg gtgtggggtc gcgcattttc ttcaaccagg aggtgaggag61 gtttcgacat ggcggtgcag ccgaaggaga cgctgcagtt ggagagcgcg gccgaggtcg121 gcttcgtgcg cttctttcag ggcatgccgg agaagccgac caccacagtg cgccttttcg181 accggggcga cttctatacg gcgcacggcg aggacgcgct gctggccgcc cgggaggtgt241 tcaagaccca gggggtgatc aagtacatgg ggccggcagg agcaaagaat ctgcagagtg301 ttgtgcttag taaaatgaat tttgaatctt ttgtaaaaga tcttcttctg gttcgtcagt361 atagagttga agtttataag aatagagctg gaaataaggc atccaaggag aatgattggt421 atttggcata taaggcttct cctggcaatc tctctcagtt tgaagacatt ctctttggta481 acaatgatat gtcagcttcc attggtgttg tgggtgttaa aatgtccgca gttgatggcc541 agagacaggt tggagttggg tatgtggatt ccatacagag gaaactagga ctgtgtgaat601 tccctgataa tgatcagttc tccaatcttg aggctctcct catccagatt ggaccaaagg661 aatgtgtttt acccggagga gagactgctg gagacatggg gaaactgaga cagataattc721 aaagaggagg aattctgatc acagaaagaa aaaaagctga cttttccaca aaagacattt781 atcaggacct caaccggttg ttgaaaggca aaaagggaga gcagatgaat agtgctgtat841 tgccagaaat ggagaatcag gttgcagttt catcactgtc tgcggtaatc aagtttttag901 aactcttatc agatgattcc aactttggac agtttgaact gactactttt gacttcagcc961 agtatatgaa attggatatt gcagcagtca gagcccttaa cctttttcag ggttctgttg1021 aagataccac tggctctcag tctctggctg ccttgctgaa taagtgtaaa acccctcaag1081 gacaaagact tgttaaccag tggattaagc agcctctcat ggataagaac agaatagagg1141 agagattgaa tttagtggaa gcttttgtag aagatgcaga attgaggcag actttacaag1201 aagatttact tcgtcgattc ccagatctta accgacttgc caagaagttt caaagacaag1261 cagcaaactt acaagattgt taccgactct atcagggtat aaatcaacta cctaatgtta1321 tacaggctct ggaaaaacat gaaggaaaac accagaaatt attgttggca gtttttgtga1381 ctcctcttac tgatcttcgt tctgacttct ccaagtttca ggaaatgata gaaacaactt1441 tagatatgga tcaggtggaa aaccatgaat tccttgtaaa accttcattt gatcctaatc1501 tcagtgaatt aagagaaata atgaatgact tggaaaagaa gatgcagtca acattaataa1561 gtgcagccag agatcttggc ttggaccctg gcaaacagat taaactggat tccagtgcac1621 agtttggata ttactttcgt gtaacctgta aggaagaaaa agtccttcgt aacaataaaa1681 actttagtac tgtagatatc cagaagaatg gtgttaaatt taccaacagc aaattgactt1741 ctttaaatga agagtatacc aaaaataaaa cagaatatga agaagcccag gatgccattg1801 ttaaagaaat tgtcaatatt tcttcaggct atgtagaacc aatgcagaca ctcaatgatg1861 tgttagctca gctagatgct gttgtcagct ttgctcacgt gtcaaatgga gcacctgttc1921 catatgtacg accagccatt ttggagaaag gacaaggaag aattatatta aaagcatcca1981 ggcatgcttg tgttgaagtt caagatgaaa ttgcatttat tcctaatgac gtatactttg2041 aaaaagataa acagatgttc cacatcatta ctggccccaa tatgggaggt aaatcaacat2101 atattcgaca aactggggtg atagtactca tggcccaaat tgggtgtttt gtgccatgtg2161 agtcagcaga agtgtccatt gtggactgca tcttagcccg agtaggggct ggtgacagtc2221 aattgaaagg agtctccacg ttcatggctg aaatgttgga aactgcttct atcctcaggt2281 ctgcaaccaa agattcatta ataatcatag atgaattggg aagaggaact tctacctacg2341 atggatttgg gttagcatgg gctatatcag aatacattgc aacaaagatt ggtgcttttt2401 gcatgtttgc aacccatttt catgaactta ctgccttggc caatcagata ccaactgtta2461 ataatctaca tgtcacagca ctcaccactg aagagacctt aactatgctt tatcaggtga2521 agaaaggtgt ctgtgatcaa agttttggga ttcatgttgc agagcttgct aatttcccta

2581 agcatgtaat agagtgtgct aaacagaaag ccctggaact tgaggagttt cagtatattg2641 gagaatcgca aggatatgat atcatggaac cagcagcaaa gaagtgctat ctggaaagag2701 agcaaggtga aaaaattatt caggagttcc tgtccaaggt gaaacaaatg ccctttactg2761 aaatgtcaga agaaaacatc acaataaagt taaaacagct aaaagctgaa gtaatagcaa2821 agaataatag ctttgtaaat gaaatcattt cacgaataaa agttactacg tgaaaaatcc2881 cagtaatgga atgaaggtaa tattgataag ctattgtctg taatagtttt atattgtttt2941 atattaaccc tttttccata gtgttaactg tcagtgccca tgggctatca acttaataag3001 atatttagta atattttact ttgaggacat tttcaaagat ttttattttg aaaaatgaga3061 gctgtaactg aggactgttt gcaattgaca taggcaataa taagtgatgt gctgaatttt3121 ataaataaaa tcatgtagtt tgtggAbb.I Basensequenz hMSH2 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide& val=4557760 NM_000251

8.2 MSH61 atttcccgcc agcaggagcc gcgcggtaga tgcggtgctt ttaggagctc cgtccgacag61 aacggttggg ccttgccggc tgtcggtatg tcgcgacaga gcaccctgta cagcttcttc121 cccaagtctc cggcgctgag tgatgccaac aaggcctcgg ccagggcctc acgcgaaggc181 ggccgtgccg ccgctgcccc cggggcctct ccttccccag gcggggatgc ggcctggagc241 gaggctgggc ctgggcccag gcccttggcg cgatccgcgt caccgcccaa ggcgaagaac301 ctcaacggag ggctgcggag atcggtagcg cctgctgccc ccaccagttg tgacttctca361 ccaggagatt tggtttgggc caagatggag ggttacccct ggtggccttg tctggtttac421 aaccacccct ttgatggaac attcatccgc gagaaaggga aatcagtccg tgttcatgta481 cagttttttg atgacagccc aacaaggggc tgggttagca aaaggctttt aaagccatat541 acaggttcaa aatcaaagga agcccagaag ggaggtcatt tttacagtgc aaagcctgaa601 atactgagag caatgcaacg tgcagatgaa gccttaaata aagacaagat taagaggctt661 gaattggcag tttgtgatga gccctcagag ccagaagagg aagaagagat ggaggtaggc721 acaacttacg taacagataa gagtgaagaa gataatgaaa ttgagagtga agaggaagta781 cagcctaaga cacaaggatc taggcgaagt agccgccaaa taaaaaaacg aagggtcata841 tcagattctg agagtgacat tggtggctct gatgtggaat ttaagccaga cactaaggag901 gaaggaagca gtgatgaaat aagcagtgga gtgggggata gtgagagtga aggcctgaac961 agccctgtca aagttgctcg aaagcggaag agaatggtga ctggaaatgg ctctcttaaa1021 aggaaaagct ctaggaagga aacgccctca gccaccaaac aagcaactag catttcatca1081 gaaaccaaga atactttgag agctttctct gcccctcaaa attctgaatc ccaagcccac1141 gttagtggag gtggtgatga cagtagtcgc cctactgttt ggtatcatga aactttagaa1201 tggcttaagg aggaaaagag aagagatgag cacaggagga ggcctgatca ccccgatttt1261 gatgcatcta cactctatgt gcctgaggat ttcctcaatt cttgtactcc tgggatgagg1321 aagtggtggc agattaagtc tcagaacttt gatcttgtca tctgttacaa ggtggggaaa1381 ttttatgagc tgtaccacat ggatgctctt attggagtca gtgaactggg gctggtattc1441 atgaaaggca actgggccca ttctggcttt cctgaaattg catttggccg ttattcagat1501 tccctggtgc agaagggcta taaagtagca cgagtggaac agactgagac tccagaaatg1561 atggaggcac gatgtagaaa gatggcacat atatccaagt atgatagagt ggtgaggagg1621 gagatctgta ggatcattac caagggtaca cagacttaca gtgtgctgga aggtgatccc1681 tctgagaact acagtaagta tcttcttagc ctcaaagaaa aagaggaaga ttcttctggc1741 catactcgtg catatggtgt gtgctttgtt gatacttcac tgggaaagtt tttcataggt1801 cagttttcag atgatcgcca ttgttcgaga tttaggactc tagtggcaca ctatccccca1861 gtacaagttt tatttgaaaa aggaaatctc tcaaaggaaa ctaaaacaat tctaaagagt1921 tcattgtcct gttctcttca ggaaggtctg atacccggct cccagttttg ggatgcatcc

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8.3 MLH11 attggctgaa ggcacttccg ttgagcatct agacgtttcc ttggctcttc tggcgccaaa61 atgtcgttcg tggcaggggt tattcggcgg ctggacgaga cagtggtgaa ccgcatcgcg121 gcgggggaag ttatccagcg gccagctaat gctatcaaag agatgattga gaactgttta181 gatgcaaaat ccacaagtat tcaagtgatt gttaaagagg gaggcctgaa gttgattcag

241 atccaagaca atggcaccgg gatcaggaaa gaagatctgg atattgtatg tgaaaggttc301 actactagta aactgcagtc ctttgaggat ttagccagta tttctaccta tggctttcga361 ggtgaggctt tggccagcat aagccatgtg gctcatgtta ctattacaac gaaaacagct421 gatggaaagt gtgcatacag agcaagttac tcagatggaa aactgaaagc ccctcctaaa481 ccatgtgctg gcaatcaagg gacccagatc acggtggagg acctttttta caacatagcc541 acgaggagaa aagctttaaa aaatccaagt gaagaatatg ggaaaatttt ggaagttgtt601 ggcaggtatt cagtacacaa tgcaggcatt agtttctcag ttaaaaaaca aggagagaca661 gtagctgatg ttaggacact acccaatgcc tcaaccgtgg acaatattcg ctccatcttt721 ggaaatgctg ttagtcgaga actgatagaa attggatgtg aggataaaac cctagccttc781 aaaatgaatg gttacatatc caatgcaaac tactcagtga agaagtgcat cttcttactc841 ttcatcaacc atcgtctggt agaatcaact tccttgagaa aagccataga aacagtgtat901 gcagcctatt tgcccaaaaa cacacaccca ttcctgtacc tcagtttaga aatcagtccc961 cagaatgtgg atgttaatgt gcaccccaca aagcatgaag ttcacttcct gcacgaggag1021 agcatcctgg agcgggtgca gcagcacatc gagagcaagc tcctgggctc caattcctcc1081 aggatgtact tcacccagac tttgctacca ggacttgctg gcccctctgg ggagatggtt1141 aaatccacaa caagtctgac ctcgtcttct acttctggaa gtagtgataa ggtctatgcc1201 caccagatgg ttcgtacaga ttcccgggaa cagaagcttg atgcatttct gcagcctctg1261 agcaaacccc tgtccagtca gccccaggcc attgtcacag aggataagac agatatttct1321 agtggcaggg ctaggcagca agatgaggag atgcttgaac tcccagcccc tgctgaagtg1381 gctgccaaaa atcagagctt ggagggggat acaacaaagg ggacttcaga aatgtcagag1441 aagagaggac ctacttccag caaccccaga aagagacatc gggaagattc tgatgtggaa1501 atggtggaag atgattcccg aaaggaaatg actgcagctt gtaccccccg gagaaggatc1561 attaacctca ctagtgtttt gagtctccag gaagaaatta atgagcaggg acatgaggtt1621 ctccgggaga tgttgcataa ccactccttc gtgggctgtg tgaatcctca gtgggccttg1681 gcacagcatc aaaccaagtt ataccttctc aacaccacca agcttagtga agaactgttc1741 taccagatac tcatttatga ttttgccaat tttggtgttc tcaggttatc ggagccagca1801 ccgctctttg accttgccat gcttgcctta gatagtccag agagtggctg gacagaggaa1861 gatggtccca aagaaggact tgctgaatac attgttgagt ttctgaagaa gaaggctgag1921 atgcttgcag actatttctc tttggaaatt gatgaggaag ggaacctgat tggattaccc1981 cttctgattg acaactatgt gccccctttg gagggactgc ctatcttcat tcttcgacta2041 gccactgagg tgaattggga cgaagaaaag gaatgttttg aaagcctcag taaagaatgc2101 gctatgttct attccatccg gaagcagtac atatctgagg agtcgaccct ctcaggccag2161 cagagtgaag tgcctggctc cattccaaac tcctggaagt ggactgtgga acacattgtc2221 tataaagcct tgcgctcaca cattctgcct cctaaacatt tcacagaaga tggaaatatc2281 ctgcagcttg ctaacctgcc tgatctatac aaagtctttg agaggtgtta aatatggtta2341 tttatgcact gtgggatgtg ttcttctttc tctgtattcc gatacaaagt gttgtatcaa2401 agtgtgatat acaaagtgta ccaacataag tgttggtagc acttaagact tatacttgcc2461 ttctgatagt attcctttat acacagtgga ttgattataa ataaatagat gtgtcttaac2521 ataaAbb.III Basensequenz hMLH1http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=28559089 NM_000249

8.4 PMS21 cgaggcggat cgggtgttgc atccatggag cgagctgaga gctcgagtac agaacctgct61 aaggccatca aacctattga tcggaagtca gtccatcaga tttgctctgg gcaggtggta121 ctgagtctaa gcactgcggt aaaggagtta gtagaaaaca gtctggatgc tggtgccact181 aatattgatc taaagcttaa ggactatgga gtggatctta ttgaagtttc agacaatgga

241 tgtggggtag aagaagaaaa cttcgaaggc ttaactctga aacatcacac atctaagatt301 caagagtttg ccgacctaac tcaggttgaa acttttggct ttcgggggga agctctgagc361 tcactttgtg cactgagcga tgtcaccatt tctacctgcc acgcatcggc gaaggttgga421 actcgactga tgtttgatca caatgggaaa attatccaga aaacccccta cccccgcccc481 agagggacca cagtcagcgt gcagcagtta ttttccacac tacctgtgcg ccataaggaa541 tttcaaagga atattaagaa ggagtatgcc aaaatggtcc aggtcttaca tgcatactgt601 atcatttcag caggcatccg tgtaagttgc accaatcagc ttggacaagg aaaacgacag661 cctgtggtat gcacaggtgg aagccccagc ataaaggaaa atatcggctc tgtgtttggg721 cagaagcagt tgcaaagcct cattcctttt gttcagctgc cccctagtga ctccgtgtgt781 gaagagtacg gtttgagctg ttcggatgct ctgcataatc ttttttacat ctcaggtttc841 atttcacaat gcacgcatgg agttggaagg agttcaacag acagacagtt tttctttatc901 aaccggcggc cttgtgaccc agcaaaggtc tgcagactcg tgaatgaggt ctaccacatg961 tataatcgac accagtatcc atttgttgtt cttaacattt ctgttgattc agaatgcgtt1021 gatatcaatg ttactccaga taaaaggcaa attttgctac aagaggaaaa gcttttgttg1081 gcagttttaa agacctcttt gataggaatg tttgatagtg atgtcaacaa gctaaatgtc1141 agtcagcagc cactgctgga tgttgaaggt aacttaataa aaatgcatgc agcggatttg1201 gaaaagccca tggtagaaaa gcaggatcaa tccccttcat taaggactgg agaagaaaaa1261 aaagacgtgt ccatttccag actgcgagag gccttttctc ttcgtcacac aacagagaac1321 aagcctcaca gcccaaagac tccagaacca agaaggagcc ctctaggaca gaaaaggggt1381 atgctgtctt ctagcacttc aggtgccatc tctgacaaag gcgtcctgag acctcagaaa1441 gaggcagtga gttccagtca cggacccagt gaccctacgg acagagcgga ggtggagaag1501 gactcggggc acggcagcac ttccgtggat tctgaggggt tcagcatccc agacacgggc1561 agtcactgca gcagcgagta tgcggccagc tccccagggg acaggggctc gcaggaacat1621 gtggactctc aggagaaagc gcctgaaact gacgactctt tttcagatgt ggactgccat1681 tcaaaccagg aagataccgg atgtaaattt cgagttttgc ctcagccaac taatctcgca1741 accccaaaca caaagcgttt taaaaaagaa gaaattcttt ccagttctga catttgtcaa1801 aagttagtaa atactcagga catgtcagcc tctcaggttg atgtagctgt gaaaattaat1861 aagaaagttg tgcccctgga cttttctatg agttctttag ctaaacgaat aaagcagtta1921 catcatgaag cacagcaaag tgaaggggaa cagaattaca ggaagtttag ggcaaagatt1981 tgtcctggag aaaatcaagc agccgaagat gaactaagaa aagagataag taaaacgatg2041 tttgcagaaa tggaaatcat tggtcagttt aacctgggat ttataataac caaactgaat2101 gaggatatct tcatagtgga ccagcatgcc acggacgaga agtataactt cgagatgctg2161 cagcagcaca ccgtgctcca ggggcagagg ctcatagcac ctcagactct caacttaact2221 gctgttaatg aagctgttct gatagaaaat ctggaaatat ttagaaagaa tggctttgat2281 tttgttatcg atgaaaatgc tccagtcact gaaagggcta aactgatttc cttgccaact2341 agtaaaaact ggaccttcgg accccaggac gtcgatgaac tgatcttcat gctgagcgac2401 agccctgggg tcatgtgccg gccttcccga gtcaagcaga tgtttgcctc cagagcctgc2461 cggaagtcgg tgatgattgg gactgctctt aacacaagcg agatgaagaa actgatcacc2521 cacatggggg agatggacca cccctggaac tgtccccatg gaaggccaac catgagacac2581 atcgccaacc tgggtgtcat ttctcagaac tgaccgtagt cactgtatgg aataattggt2641 tttatcgcag atttttatgt tttgaaagac agagtcttca ctaacctttt ttgttttaaa2701 atgaaacctg ctacttaaaa aaaatacaca tcacacccat ttaaaagtga tcttgagaac2761 cttttcaaac cAbb. IV Basensequenz hPMS1http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=11125773 NM_000535

Kapitel 9 Anhang II

9.1 Tabellarischer LebenslaufName: B E C K M A N NVorname: Carmen, Birga, AndreaGeburtsdatum: 28.08.1968Geburtsort: HamburgAnschrift: 37079 Göttingen Kopernikusstraße 21

Schulbesuch: 1975 - 1979 Grundschule in Rellingen; 1979 - 1985 Realschule in Burg/Dithmarschen; 1985 - 1988 Fachgymnasium sozialwirtschaftlicher Zweig in Heide;

Studium / 1988 - 1990 Sportstudium Deutsche Sporthochschule Köln;Ausbildung: 1990 - 1992 Krankengymnastikschule Damp; 1995 - 1997 schulische Ausbildung zur Heilpraktikerin und

Sportheilpraktikerin (Deutsche Paracelsus Schule Hamburg / Kassel)

1998-2006 Studium der Humanmedizin an der Georg-August-Universität Göttingen

Tätigkeiten: 1992 - 1993 Anerkennungsjahr Ostseeklinik Damp 1993 - 1994 Krankengymnastin in der Ostseeklinik Damp 1994 - 1995 Krankengymnastin in einer Praxis in Heide, Schleswig-

Holstein 1995 - 1997 Krankengymnastin in einer Praxis in Göttingen 1997 Krankengymnastin in einer Praxis in Felsberg 1997 - 2000 Honorardozentin an der Dr. Rohrbach-Schule in Kassel

2000 Krankengymnastin in einer Praxis in Kassel2000 - 2001 studentische Aushilfe in der Stroke Unit im

Universitätsklinikum Göttingen2003 - 2005 studentische Aushilfe im Schlaflabor des

Universitätsklinikums Göttingen, Abt. Prof. Dr. med. Hasenfuß

seit 2005 Honorardozentin an der Profess und Hippokratesschule Kassel

1997-2006 freie Mitarbeiterin in einer krankengymnastischen Praxis in Göttingen

seit 2006 Assistenzärztin in der Chirurgie am Albert-Schweitzer-Krankenhaus Northeim

Göttingen, 04. November 2007

Carmen Beckmann

9.2 Verzeichnis der akademischen Lehrer

Meine akademischen Lehrer waren an der Georg-August-Universität in Göttingen:

Prof. Dr. med. Baer (Neurologie)

Prof. Dr. med. Brockmöller (Pharmakologie)

Prof. Dr. med. Brunner (Biomathematik)

Prof. Dr. med. Buchfelder (Neurochirurgie)

Prof. Dr. med. Burckhardt (Physiologie)

Prof. Dr. rer. nat. Dönecke (Biochemie)

Prof. Dr. rer. nat. Drabent (Biochemie)

Prof. Dr. med. Emons (Gynäkologie)

Prof. Dr. med. Friedrich (Psychologie)

Prof. Dr. med. Füzesi (Pathologie)

PD Dr. med. Gottschalk (Klinische Chemie)

Prof. Dr. med. Groß (Mikrobiologie)

Prof. Dr. med. Grunewald (Innere Medizin)

Prof. Dr. med. Hasenfuß (Kardiologie)

Prof. Dr. med. Hellige (Notfallmedizin)

Prof. Dr. med. Herken (Anatomie)

Prof. Dr. med. Knepel (Pharmakologie)

Prof. Dr. med. Kochen (Allgemeinmedizin)

Prof. Dr. med. Kuhn (Anatomie)

Prof. Dr. med. Kunze (Pathologie)

Prof. Dr. med. Lakomek (Pädiatrie)

Prof. Dr. med. Markus (Chirurgie)

Prof. Dr. rer. nat. Nägerl (Physik)

Prof. Dr. med. Neumann (Dermatologie)

Prof. Dr. med. Oellerich (Klinische Chemie)

Prof. Dr. med. Paul (Pädiatrie)

Prof. Dr. med. Peters (Mikrobiologie)

Prof. Dr. med. Poser (Psychiatrie)

Prof. Dr. med. Radzun (Pathologie)

Prof. Dr. med. Richter (Anatomie)

Prof. Dr. med. Ringert (Urologie)

Prof. Dr. med. Schmidberger (Radiologie)

Prof. Dr. med. Schmidt (klinische Medizin)

Prof. Dr. med. Schulz (Orthopädie)

Prof. Dr. med. Seidl (Anatomie)

Prof. Dr. med. Steiner (HNO)

Prof. Dr. rer. nat. Tischner (Biologie)

Prof. Dr. med. Wiesemann (Terminologie)

Prof. Dr. rer. nat. Zeeck (Chemie)

9.3 DanksagungAllen, die durch ihre Hilfe und Unterstützung zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben, möchte ich ganz herzlich meinen Dank aussprechen:Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. med. Joseph Rüschoff für die Überlassung des Themas und seiner steten Unterstützung.Den medizinisch technischen Assistentinnen aus den Laboren.Frau Dr. rer. nat. Westphal für ihre freundschaftliche und verlässliche Hilfe.Frau Dr. med. Müller, die mich besonders in den schwierigen Anfängen unterstützt hat.Ein besonderer Dank gilt meiner Familie, die mir auch in schwierigen Zeiten im Studium sowie in der Doktorarbeit stets beiseite standen und mich immer wieder motiviert haben, durchzuhalten und beides erfolgreich abzuschließen.

9.5 Ehrenwörtliche ErklärungIch erkläre ehrenwörtlich, dass ich die dem Fachbereich Medizin Marburg zur Promotionsprüfung eingereichte Arbeit mit dem Titel „Mikrosatelliteninstabilität und Mismatch-Repairgenexpression in Adenomen bei erblichen Dickdarmkarzinom (HNPCC)“ im Institut für Pathologie der Klinik Kassel unter Leitung von Herrn Prof. Rüschoff ohne sonstige Hilfe selbst durchgeführt und bei der Abfassung der Arbeit keine anderen als die in der Dissertation aufgeführten Hilfsmittel benutzt habe. Ich habe bisher an keinem in- oder ausländischen Medizinischen Fachbereich ein Gesuch um Zulassung zur Promotion eingereicht, noch die vorliegende oder eine andere Arbeit als Dissertation vorgelegt.

Vorliegende Arbeit wurde in folgendem Publikationsorgan: Int J Colorectal Dis (2006) 21: 632–641 veröffentlicht.

Carmen Beckmann, Göttingen, den 04.11.2007