Konfokale Raman-Mikrospektroskopie zur Untersuchung ... · Danksagung Die Fertigstellung dieser Arbeit ist für mich ein Rückblick auf den zurückgelegten Pfad und damit verbunden

RUHR-UNIVERSITÄT

FAKULTÄT FÜR

LEHRSTUHL

BOCHUM

CHEMIE UND BIOCHEMIE

PHYSIKALISCHE CHEMIE II

Konfokale Raman-Mikrospektroskopie zur

Untersuchung plasmabehandelter DNA und

einzelner, lebender humaner Spermatozoen

unter physiologieähnlichen Bedingungen

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften

Dr. rer. nat.

der Fakultät für Chemie und Biochemie

der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Eugen Edengeiser

Juni 2014

Eidesstattliche Erklärung

Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum Oktober 2010 bis Juni 2014 unter der

Leitung von Prof. Dr. Martina Havenith am Lehrstuhl für Physikalische Chemie II an

der Fakultät für Chemie und Biochemie der Ruhr-Universität Bochum angefertigt.

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig verfasst,

und keine unzulässigen Hilfsmittel verwendet habe. Zusätzlich erkläre ich, dass mit

dieser Dissertation weder in vorliegender noch in anderer Form ein Promotionsver-

such an einer anderen Fakultät oder Hochschule unternommen wurde.

Eugen Edengeiser, Juni 2014

Betreuende Hochschullehrerin: Prof. Dr. Martina Havenith

Referentin: Prof. Dr. Martina Havenith

Korreferent: Prof. Dr. Christian Herrmann

Danksagung

Die Fertigstellung dieser Arbeit ist für mich ein Rückblick auf den zurückgelegten

Pfad und damit verbunden die Frage nicht wie der Ziel- sondern der Startpunkt

erreicht worden ist. Für immer verbunden mit der vorliegenden Dissertation, die im

Zeitraum von Oktober 2010 bis Juni 2014 entstanden ist, sind viele Menschen, die

mir geholfen haben diesen Weg erfolgreich zu bewältigen:

Zuallererst gebührt Martina Havenith ein „Danke!“ dafür, dass sie mir die Freiheit

gegeben hat vom Grundstudium an verschiedenste Projekte zu verfolgen. Die

Kombination aus Freiheit und Orientierungshilfe zurück zum Wesentlichen wird mir

immer positiv in Erinnerung bleiben.

Christian Herrmann dafür, dass er sich bereit erklärt hat, das Zweitgutachten

der vorliegenden Arbeit zu übernehmen.

Meinen Eltern dafür, dass sie mit Mitte 20 Familie und Freunde zurückgelassen

haben, um mit mir ein neues Abenteuer zu beginnen. Ihr Mut, ihr Optimismus und

Durchhaltevermögen waren und sind eine schier unendliche Quelle der Motivation.

Erik Bründermann, der viel mit meinem oben erwähnten Startpunkt in der Phy-

sikalischen Chemie II zu tun hat (in Form einer Diskussion um einen Bericht zum

Physikalisch-chemischen Grundpraktikum im Sommer 2007). Für das Begleiten

meines wissenschaftlichen Werdegangs mit steter konstruktiver Kritik, Unterstützung

und wertvollen Feedbackloops. Keine Frage, die er nicht mit ein oder zwei Sätzen

beantworten kann. Herzlichen Dank! Auch für die Durchsicht der Arbeit, letztlich bin

ich jedoch allein verantwortlich für Fehler in dieser Dissertation.

Gerhard Schwaab für seine Unterstützung und die wertvollen Diskussionen.

Julia Bandow, Jan Lackmann und Simon Schneider für die ausgezeichnete Ko-

operation mit der mikrobiellen Antibiotikaforschung im Bereich Plasma-behandelter

DNA.

Ebenso Eike Spielberg, Anja Mudring, Van-Son Dang und Anjana Devi für die

gemeinsamen Projekte im Bereich Anorganische Chemie.

Steffen Büning und Simon Ebbinghaus für die geduldige Unterstützung bei den

Fluoreszenz-Messungen.

Jeder der Konrad „Konna“ Meister kennt, kann zweifellos bestätigen, dass er

ein unvergleichlich guter Ratgeber in allen Belangen ist. Danke!

Für die vielfältige Unterstützung der Informations- und Koordinationszentrale

der Physikalischen Chemie II Sylke Kohlpoth, Sabine Weiß und besonders Ulla

Knieper.

Dem technischen Team Dennis Riemenschneider, Christian Fester, Solveig

Förster und Hannelore Sommer.

Neben der Zeit, die wir gemeinsam im Büro und manchmal auch im Labor

verbracht haben, herzlichen Dank an Konna, Jessi und Peppe für die „musika-

lischen“ Abende im Bandkeller, die dazu geführt haben, eine Menge interessanter

Menschen kennenzulernen.

Dem gesamten Lehrstuhl der PC II sowie im Speziellen den Mikroskopikern

um Diedrich Schmidt, Giuseppe Di Florio, Konstantin Kartaschew, Christina

Klinkhammer, Meike Mischo und Fouad Ballout für die tolle Atmosphäre!

Christoph, Jan, Sebastian, Eric, Nils und vor allem Dominic für die jahrelange

Freundschaft und die erheiternden Abende nicht nur im TS!

Letztlich gilt mein besonderer Dank Inga, Nadine, Steffi und Daniel mit denen

ich Seite an Seite das gesamte Studium und mehr meistern durfte.

Veröffentlichungen

Der Autor hat zu folgenden Publikationen beigetragen:

• Effects of the Effluent of a Microscale Atmospheric Pressure Plasma Jet

Operated with He/O2 Gas on Bovine Serum Albumin.

J.-W. Lackmann, E. Edengeiser, S. Schneider, J. Benedikt, M. Havenith, J.E.

Bandow. (Accepted in Plasma Medicine)

• (C4C1py)[Cu(SCN)2]: Coordination Polymer and Liquid.

E.T. Spielberg, E. Edengeiser, B. Mallick, M. Havenith, A.-V. Mudring. Che-

mistry - A European Journal 2014, 20, 5338-5345.

(DOI 10.1002/chem.201302777)

• Photons and particles emitted from cold atmospheric-pressure plasma inacti-

vate bacteria and biomolecules independently and synergistically.

J.-W. Lackmann, S. Schneider, E. Edengeiser, F. Jarzina, S. Brinckmann, E.

Steinborn, M. Havenith, J. Benedikt, J.E. Bandow. Journal of the Royal Society

Interface 2013, 10, 20130591. (DOI 10.1098/rsif.2013.0591)

• Electrical and optical properties of TiO2 thin films prepared by plasma-en-

hanced atomic layer deposition.

V.-S. Dang, H. Parala, J.H. Kim, K. Xu, N.B. Srinivasan, E. Edengeiser, M.

Havenith, A.D. Wieck, T. de los Arcos, R.A. Fischer, A. Devi. physica status

solidi (a), 2013, 2, 416-424. (DOI 10.1002/pssa.201330115)

Konferenzbeiträge (als Erstautor)

• Synergetic effects found in cold atmospheric plasma treatment of biomacro-

molecules explored with Raman spectroscopy.

E. Edengeiser, J.-W. Lackmann, S. Schneider, F. Jarzina, S. Brinckmann, E.

Steinborn, E. Bründermann, J. Benedikt, J.E. Bandow, M. Havenith. [Poster]

Bunsentagung, Karlsruhe, 09.05. - 11.05.2013

• Chemical Micro- and Nanomicroscopy Applications for ANKA-IR2 Nanoscope.

E. Edengeiser, M. Mischo, E. Bründermann, D.A. Schmidt, J. Steinmann, B.

Gasharova, Y.-L. Mathis, D. Moss, M. Havenith. [Poster]

ANKA/KNMF Users’ Meeting, Karlsruhe, 10.10. - 11.10.2012 - 1. Preis - Best

Poster

Konferenz-Veröffentlichungen

• The ANKA-IR2 nanoscope and micro- and nanospectroscopy applications.

E. Bründermann, D.A. Schmidt, B. Gasharova, Y.-L. Mathis, D. Moss, J. Stein-

mann, E. Edengeiser, M. Mischo, M. Havenith.

Proceedings of: 38th International Conference on Infrared, Millimeter, and Tera-

hertz Waves (IRMMW-THz), 2013 (DOI 10.1109/IRMMW-THz.2013.6665734)

Einleitung

Die vorliegende Dissertation behandelt konfokale Raman-Spektroskopie und -Mikro-

spektroskopie als neuartiges analytisches Werkzeug, um zwei physikochemische

Fragestellungen anhand biologischer Proben zu adressieren:

• Wie wird Desoxyribonukleinsäure durch Behandlung mit einer nicht-thermi-

schen, unter Atmosphärendruck arbeitenden Plasma-Quelle inaktiviert?

• Können einzelne, lebende humane Spermatozoen chemisch evaluiert werden

auf eine nicht-invasive Art und Weise unter physiologieähnlichen Bedingun-

gen?

Diese Arbeit wurde zur Beantwortung dieser Fragestellungen in 5 Kapitel unterteilt.

• Kapitel 1 liefert eine theoretische Betrachtung der Grundlagen der hier ausge-

arbeiteten Experimente.

• Kapitel 2 dient der Beschreibung der in dieser Arbeit verwendeten Materialien

und Methoden, insbesondere des Aufbaus des in dieser Arbeit hauptsächlich

verwendeten konfokalen Raman-Mikrospektroskops.

• Kapitel 3 befasst sich mit der Fragestellung, wie DNA durch Plasmabehandlung

inaktiviert werden kann.

• Kapitel 4 betrachtet die konfokale Raman-Mikrospektroskopie immobilisierter,

lebender Spermatozoen unter physiologieähnlichen Bedingungen.

• Kapitel 5 soll anhand zweier Anwendungsbeispiele im Bereich der anorgani-

schen Chemie die Interdisziplinarität der Raman-Spektroskopie aufzeigen.

Zusammenfassung

Nicht-thermische Atmosphärendruck-Plasmen werden im Bereich Wundheilung

evaluiert und gewinnen an Bedeutung in Desinfizierungsprozessen speziell in Anbe-

tracht multiresistenter Bakterien. Obwohl das Potential für technische Anwendungen

offensichtlich scheint, ist viel weniger über die zugrundeliegenden Mechanismen der

Inaktivierung von Bakterien und der Wundheilung bekannt. In dieser Arbeit wurde der

Effekt von reaktiven Partikeln und UV Photonen untersucht, die beide Bestandteile

von Plasma darstellen, um den Beitrag der einzelnen Komponente zu spezifizieren.

Unter Verwendung der X-Jet Technologie wurden Plasma-generierte reaktive Partikel

und Photonen, entstehend in der Plasma-Quelle, voneinander separiert, was eine

Untersuchung der einzelnen Effekte auf DNA Oligomere auf molekularer Ebene mög-

lich macht. Mit nicht-invasiver Raman-Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass

Plasma-generierte Partikel und emittierte Photonen unterschiedliche Modifikationen

in DNA-Einzel- und -Doppelsträngen einführt. Überraschenderweise führte eine

Behandlung mit einer Kombination aus Partikeln und Photonen nicht ausschließlich

zu kumulativen Effekten sondern zu synergistischen Effekten beider Komponenten.

Profilometrie in Kombination mit Raman-Spektroskopie behandelter DNA Doppel-

stränge bestätigt, dass Ätzen allein nicht den Hauptbeitrag der beobachteten DNA

Schäden in vitro liefert.

Konfokale Raman-Mikrospektroskopie wurde zum ersten mal verwendet, um che-

mische, farbkodierte Bilder einzelner, lebender und immobilisierter menschlicher

Spermatozoen unter physiologieähnlichen Bedingungen zu erstellen. Dafür wurde

eine neue Kombination von Spermienaufreinigung, Messsubstrat und Substratbe-

schichtung entwickelt. Die Auswirkung der Exposition von Spermatozoen durch

Laserstrahlung während der Durchführung von Raman-Messungen mit unterschied-

licher Laserleistung wurde untersucht. Fluoreszenz-Mikroskopie zeigte, dass sich

30 mW Laserleistung für 160 s als schädlich für die Zellmembran der untersuchten

Spermien erwiesen. Eine Bestrahlung mit einer Leistung von 15 mW über die selbe

Zeit resultierte in keinen beobachtbaren Schäden an der Zellmembran, was die

untersuchten Zellen chemisch nicht unterscheidbar macht von nicht bestrahlten

Zellen. Mehrere einzelne Spermatozoen wurden vollständig automatisiert chemisch

untersucht. Die farbkodierten Raman-Bilder wurden in Echtzeit mit einer Messzeit

von ca. 1 Zelle pro 60 s erstellt. Als Sicherheitsfaktor wurde die Mess- und damit

Laserbestrahlungszeit während der automatisierten Messungen um 60% verringert

verglichen mit den Parametern, die sich als nicht schädlich herausstellten. Dieser

neuartige Ansatz zeigt, dass konfokale Raman-Mikrospektroskopie in der Lage ist,

chemische Informationen einzelner und lebender menschlicher Spermatozoen zu

sammeln. Mit den besonders deutlich separierten Zellkompartimenten stellen Sper-

matozoen ein besonderes Modellsystem für konfokale Raman-Mikrospektroskopie

dar, die allgemein gut zur Untersuchung vieler Zelltypen geeignet ist. Dies hebt das

Potential der Technik im Bereich der künstlichen Befruchtung hervor.

Abkürzungsverzeichnis

µAPPJ . . . . . . . . . . microscale atmospheric-pressure plasma jet

(C4C1py) . . . . . . . 1-Butyl-4-methyl-pyridinium

a. dest. . . . . . . . . . aqua destillata

ACES . . . . . . . . . . . N-(2-Acetamido)-2-aminoethansulfonsäure

ART . . . . . . . . . . . . Assisted reproductive technology

bb . . . . . . . . . . . . . . backbone

CAP . . . . . . . . . . . . Cold atmospheric-pressure plasma

CCD . . . . . . . . . . . . Charge-coupled device

cNB . . . . . . . . . . . . coupled nucleobases

CRM . . . . . . . . . . . . Confocal Raman microspectroscopy

FRET . . . . . . . . . . . Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Laser . . . . . . . . . . . Light amplification by stimulated emission of radiation

PDB . . . . . . . . . . . . Protein database

PI . . . . . . . . . . . . . . . Phosphidiumiodid

PMT . . . . . . . . . . . . Photo multiplier tube

RF . . . . . . . . . . . . . . Radiofrequenz

RMS . . . . . . . . . . . . Root mean square

S/N . . . . . . . . . . . . . Signal to noise

sccm . . . . . . . . . . . Standard-Kubikzentimeter pro Minute

slm . . . . . . . . . . . . . Standard-Liter pro Minute

STED . . . . . . . . . . . Stimulated emission depletion

STORM . . . . . . . . . Stochastic optical reconstruction microscopy

WHO . . . . . . . . . . . World Health Organization

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis 16

1 Theoretische Grundlagen & Einführung 1

1.1 Raman-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.2 Optische und konfokale Mikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.3 Konfokale Raman-Mikrospektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.4 Fluoreszenz-Mikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.5 Desoxyribonukleinsäure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2 Material und Methoden 16

2.1 Konfokale Raman-Mikrospektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

2.1.1 Konfiguration für Messungen mit 488 nm Anregungswellenlänge 17

2.1.2 Konfiguration für Messungen mit 532 nm Anregungswellenlänge 18

2.1.3 Konfiguration für Messungen bei 785 nm Anregungswellenlänge 18

2.2 Plasma-Quelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

2.3 Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

2.3.1 Synthetische DNA Homo-Oligomere . . . . . . . . . . . . . . 18

2.3.2 Ätzraten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2.3.3 Lebende humane Spermatozoen . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2.3.4 Beschichtung von CaF2-Substrat mit Concanavalin A Typ IV . 19

2.3.5 Percoll-Dichtegradienten-Zentrifugation . . . . . . . . . . . . 19

2.3.6 Automatisierte konfokale Raman-Mikrospektroskopie . . . . . 20

2.3.7 Vorbehandlung der aufgenommen Datensätze . . . . . . . . 20

2.3.8 LIVE/DEAD Sperm Viability Kit zur Fluoreszenz-Markierung

von Spermatozoen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.4 Fluoreszenz-Mikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

i

3 Effekte der Behandlung von DNA mit einem nicht-thermischen Atmos-

phärendruck-Plasma 23

3.1 Einführung und Motivation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

3.2 Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

3.3 Diskussion und Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

4 Konfokale Raman-Mikrospektroskopie immobilisierter, lebender Sper-

matozoen unter physiologieähnlichen Bedingungen 38

4.1 Einführung und Motivation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

4.2 Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

4.3 Diskussion und Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

5 Anwendungen konfokaler Raman-Spektroskopie 58

5.1 Konfokale Raman-Spektroskopie von TiO2-

Dünnschichten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

5.2 Temperaturabhängige Raman-Spektroskopie von

(C4C1py)[Cu(SCN)2] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

6 Abbildungs- & Tabellenverzeichnis 66

7 Literaturverzeichnis 76

ii

The important thing in science

is not so much to obtain new facts

as to discover new ways

of thinking about them

Sir William Lawrence Bragg

1Theoretische Grundlagen & Einführung

Nicht-invasive und nicht-destruktive Methoden zur Charakterisierung kleiner Mole-

küle, von Zellen bis hin zu Geweben werden zunehmend sowohl in akademischen

als auch industriellen Umgebungen geschätzt. Schwingungsspektroskopische Tech-

niken zu denen Raman-Spektroskopie gezählt wird, liefern einen Ansatz wie die

oben formulierten Ziele mit einer hohen Sensitivität erreicht werden können. Die-

ses Kapitel dient der Einführung in die Raman-Spektroskopie und beginnt folglich

mit einer theoretischen Beschreibung der zugrundeliegenden Prinzipien, die den

Abhandlungen in [1–3] folgt. Dabei wird sowohl auf das klassische als auch auf

das quantenmechanische Bild eingegangen. Anschließend wird beschrieben wie

diese Technik mit Hilfe der Kombination mit klassischer konfokaler Lichtmikroskopie

zu konfokaler „Raman-Mikrospektroskopie“ erweitert wurde. Als komplementäre

Messtechnik wird auf Fluoreszenz-Mikroskopie eingegangen.

1.1 Raman-Spektroskopie

Der Beobachtung Arthur Comptons 1923 folgend, dass die Energie von Röntgen-

strahlen, die an Elektronen gestreut worden sind, abnehmen kann (Compton-Effekt),

postulierten Raman und Krishnan 1928 einen ähnlichen Vorgang für sichtbares Licht,

welches an Materie gestreut wird [4, 5].

Der Raman-Effekt wird beschrieben als Wechselwirkung elektromagnetischer

1

Raman-Spektroskopie 1

Strahlung mit einer Probe, in der entweder ein Schwingungsquantum angeregt

(Stokes-Streuung) oder ausgelöscht wird (Anti-Stokes-Streuung). Der Großteil der

Photonen wird elastisch gestreut (Rayleigh-Streuung). Folglich besitzt die Streu-

strahlung die gleiche Energie wie die Anregungsstrahlung. Wird ein Photon auf

inelastische Art und Weise gestreut, äußert sich dies darin, dass sich die Energie

des gestreuten Photons von der des Anregungsphotons unterscheidet. Inelastische

Stöße zeichnen sich durch unterschiedliche Anfangs- und Endzustände aus und sind

also immer mit einer Änderung der Energie verbunden. Ist der Anfangszustand der

Schwingungsgrundzustand und der Endzustand ein angeregtes Schwingungsniveau,

wird dies als Stokes-Streuung bezeichnet. Ist der Anfangszustand energetisch höher

liegend als der Endzustand wird dies als Anti-Stokes-Streuung bezeichnet (Abb. 1.1).

v=0

v’=1

v=0

v’=1

v=0

v’=1

h�L h( - )� �L vib h�L h�Lh�L

h�L h�L

h( + )� �L vib

inelast. Stoß

(STOKES) elast. Stoß

inelast. Stoß

(Anti-STOKES)

RAYLEIGH-Bande

elast. StoßE

Abbildung 1.1: Erläuterung des Raman Effekts (- - - steht für ein virtuelles Energieniveau).Adaptiert nach [3].

Klassischerweise beginnt die theoretische Betrachtung des Raman Effekts ausge-

hend von dem induzierten Dipolmoment P. Für ein eingestrahltes, sich mit der Zeit

änderndes elektrisches Feld E (Laser-Anregungsstrahlung mit Frequenz νL) führt

2


die Polarisierbarkeit α zum induzierten Dipolmoment [3]:

P = α ·E = α ·E0 cos(2πνLt). (1.1)

Die molekülabhängige Größe α gibt an, wie leicht die Elektronenwolke des Moleküls

verformt werden kann. Schwingt das betrachtete Molekül mit einer Frequenz νvib

folgt daraus eine Modulierung der Polarisierbarkeit α (Gleichung 1.3) entlang der

Normalkoordinate q (Gleichung 1.2) der Schwingung (beides aus [3]).

q = q0 · cos(2πνvibt), (1.2)

α ≈ α0 +

(∂α

∂q

)q = α0 +α1q. (1.3)

Gleichung 1.3 gilt dabei für kleine interatomare Auslenkungen nach Taylorreihen

Entwicklung und α0 gibt die mittlere Polarisierbarkeit in der Gleichgewichtslage an.

Gleichung 1.3 in Gleichung 1.1 eingesetzt ergibt [3]:

P = (α0 +α1q0 cos(2πνvibt))E0 cos(2πνLt) (1.4)

= α0E0 cos(2πνLt)+α1q0E0 cos(2πνvibt)cos(2πνLt). (1.5)

Gleichung 1.5 lässt sich mit Hilfe trigonometrischer Additionstheoreme vereinfachen

zu [3]:

P = α0E0 cos(2πνLt)+12

α1q0E0[cos(2π(νL +νvib)t)+ cos(2π(νL−νvib)t)]. (1.6)

Daraus folgt, dass das gestreute Licht sowohl Anteile mit der Frequenz νL der Laser

-Anregungsstrahlung (erster Term, Rayleigh) aufweist, als auch die Frequenzen

νL +νvib (zweiter Term, Anti-Stokes) und νL−νvib (dritter Term, Stokes) detektiert

werden können. Des Weiteren muss als Auswahlregel gelten [3]:(∂α

∂q

)q 6= 0. (1.7)

Die Polarisierbarkeit des Moleküls muss sich für ein Raman-Signal im Verlauf der

Schwingung ändern. In einer quantenmechanischen Betrachtung wird das Matrix

Element zwischen Anfangszustand i (initial) und Endzustand f (final) untersucht. Die

Quantenübergänge sind wiederum von der Polarisation P aus einem eingestrahlten,

3


elektrischen Feld E abhängig. Wir schreiben [1]:

Pf i = 〈 f |P|i〉= 〈 f |ε0χP|i〉. (1.8)

Die Polarisation α wird in dieser Betrachtung als Suszeptibilität (Fähigkeit zur elektri-

schen Polarisierung) im Feld E behandelt. Unter der Annahme, dass die Wellenlänge

des eingestrahlten Lichtes viel größer ist, als die interatomaren Abstände wird das

elektrische Feld E als konstant betrachtet und Gleichung 1.8 kann geschrieben

werden als [1]

[χmn] f i = 〈 f |χmn|i〉, (1.9)

mit χmn als Übergangs-Suszeptibilität, die probenabhängig ist.

Für die Wellenfunktionen, die das vibronische System (Vibrations- und elektroni-

sche Energie) beschreiben, wird die adiabatische Annäherung verwendet, in der

die Wellenfunktion ψ(r,R) aus einer Wellenfunktion für die Elektronen mit den Ko-

ordinaten r und einer Wellenfunktion für die Atome mit den Koordinaten R besteht

[1]:

ψ(r,R) = ζ (r,R)ρ(R). (1.10)

Für [χmn] f i ergibt sich [1]:

[χmn] f i =∫

ρ∗f (R)ζ

∗f (r,R)χmnζi(r,R)ρi(R)drdR. (1.11)

Unter Betrachtung der Integration über die Elektronen-Koordinaten r und der

Annahme, dass die elektronischen Zustände des Anfangs- und Endzustands gleich

sind, ergibt sich der elektronische Teil χmn(R) der Übergangs-Suszeptibilität. Die

Einführung von Normalkoordinaten qk und Betrachtung nur des linearen Terms

resultiert in [1]:

[χmn] f i = (χmn)0〈ρ f k|ρik〉+∑k(∂ χmn

∂qk)0〈ρ f k|qk|ρik〉, (1.12)

mit der Klammerschreibweise als gesamte Schwingungs-Wellenfunktionen aus dem

Integral aus Gleichung 1.11. Die Erwartungswerte sind [1]:

〈ρ f k|ρik〉=

0 für ρ f k 6= ρik

1 für ρ f k = ρik

(1.13)

4


und [1]

〈ρ f k|qk|ρik〉=

0 für ρ f k = ρik√

ρik +1√

h2qk

für ρ f k = ρik +1√

ρik

√h

2qkfür ρ f k = ρik−1

(1.14)

Wegen der Orthogonalität der Wellenfunktionen können alle Erwartungswerte aus

Gleichung 1.12 in der Form von Gleichung 1.13 und Gleichung 1.14 ausgedrückt

werden. Das bedeutet, dass sich im ersten Term in Gleichung 1.12 der Quantenzu-

stand für ρ f k = ρik nicht geändert hat (Rayleigh-Streuung). Der zweite Term steht

für Raman-Streuung und ist ungleich 0 wenn ρik = ρik±1 und führt zur Übergangs-

Suszeptibilität in der Form [1]:

[χmn]ρik+1,ρik =√

ρik +1

√h

2qk

(∂ χmn

∂qk

)0

(1.15)

und [1]

[χmn]ρik−1,ρik =√

ρik

√h

2qk

(∂ χmn

∂qk

)0. (1.16)

Aus Gleichung 1.15 und Gleichung 1.16 werden die Stokes- beziehungsweise Anti-

Stokes-Streuprozesse ersichtlich. Ähnlich zu Gleichung 1.7 ergibt sich nun eine

Auswahlregel [1] (∂ χmn

∂qk

)6= 0 (1.17)

In einem Raman-Spektrum wird die Intensität des gestreuten Lichts auf der Y-Achse

gegen den Energieunterschied zwischen Anregungslicht und gestreutem Licht auf

der X-Achse aufgetragen. Die Lage einer Raman-Bande wird üblicherweise in Wellen-

zahlen (1 cm−1) angegeben. Sie steht folgendermaßen mit dem Energieunterschied

relativ zum Anregungslicht in Zusammenhang [6]:

ν =1λ0− 1

λg(1.18)

λ0 und λg Wellenlänge des Anregungslichts bzw. des gestreuten Lichts in cm.

Abbildung 1.2 zeigt ein schematisches Raman-Spektrum. Charakteristisch ist,

dass es symmetrisch zur Rayleigh-Linie aufgebaut ist und dass die Anti-Stokes-Linie

eine geringere Intensität aufweist als die Stokes-Linie. Aus der der Untersuchung der

Strahlenstärke eines Dipols im Fernfeld kann die Intensität I des gestreuten Lichts

als proportional zur vierten Potenz der Frequenz des Anregungslichts betrachtet

5


0-2000 2000

Rayleigh

Stokes

Anti-Stokes

Ram

anin

tensität /w

illk. E

inh.

Wellenzahl /cm-1

Abbildung 1.2: Schematisches Raman-Spektrum.

werden [2]:

I ∼ ν4L . (1.19)

Aus Gleichung 1.6 kann folgende, stark vereinfachte Annahme formuliert werden [2]:

IS ∼ (νL−νvib)4; IAS ∼ (νL +νvib)

4. (1.20)

Die Intensität der Anti-Stokes-Linien sollte also größer als die der Stokes-Linien sein.

Experimentelle Beobachtungen liefern jedoch das Gegenteil. Um dieses Phänomen

zu untersuchen, kann das quantenmechanische Bild herangezogen werden. Da sich

das Molekül für Anti-Stokes-Streuung in einem angeregten Schwingungszustand

befinden muss, dessen Besetzung nach Boltzmann-Verteilung bei Raumtemperatur

im Vergleich zum Schwingungsgrundzustand sehr gering ist, können die relativen In-

tensitäten mit dem exponentiellen Term der Boltzmann-Verteilung berechnet werden

[6]:IAnti−Stokes

IStokes∼ e−

hνvkbT ·

(νL +νvib

νL−νvib

)4

. (1.21)

Bei Raumtemperatur dominiert der Exponential-Term die Gleichung und damit ergibt

sich:

IStokes > IAnti−Stokes. (1.22)

Der analytische Wert des Raman-Effekts liegt darin begründet, dass der beob-

6


achtete Energieunterschied des Anregungsphotons und des inelastisch gestreuten

Photons für die im Streuprozess beteiligten Atome und chemischen Strukturen cha-

rakteristisch ist. Raman-Spektroskopie stellt daher eine komplementäre Technik zu

der Infrarot-Spektroskopie dar, bei der sich das elektrische Dipolmoment bei der

Schwingung ändern muss. So ist mit der Raman-Spektroskopie zum Beispiel die

symmetrische Streckschwingung von CO2 beobachtbar.

Aus diesen Überlegungen ergibt sich, dass der Raman-Effekt nicht-invasiv genutzt

werden kann. Proben müssen in der Regel nicht vorbehandelt werden und können

ohne Weiteres als Feststoff oder in Lösung chemisch evaluiert werden, da Wasser

nur intensitätsschwache Banden zeigt, ganz im Gegensatz zur starken Absorption

von Wasser in der Infrarot-Spektroskopie. Tabelle 1.1 gibt an, welche Eigenschaften

von Stoffen in festem Aggregatzustand aber auch in Lösung über die Analyse der

charakteristischen Raman-Banden untersucht werden können:

Tabelle 1.1: Auswahl von mit Raman-Spektroskopie messbaren Eigenschaften.

Eigenschaften Ramanbande Literatur

Identifikation Frequenz [7–9]Orientierung Polarisitonsabhängigkeit [10–12]Kristallinität Breite [13–15]

Menge Intensität [16–18]

Die Hauptverwendung der Raman-Spektroskopie liegt in der Analyse der „chemi-

schen Fingerabdrücke“, also der charakteristischen Bandenmuster in den Raman-

Spektren mit denen sich chemische Strukturen eindeutig nachweisen lassen. Die

Orientierung von Fasern oder anderen orientierungsabhängigen Strukturen lässt

sich durch polarisationsabhängige Banden und Messungen visualisieren. Kristal-

linität verschiedener Stoffe geht in der Regel mit Banden einher, die in der Breite

(zum Beispiel Halbwertsbreite) variieren. Die Intensität bestimmter Banden lässt

sich häufig dazu verwenden, um semi-quantitative Abschätzungen über einen zu

untersuchenden Stoff anzustellen.

7

Optische und konfokale Mikroskopie 1

1.2 Optische und konfokale Mikroskopie

Die zentrale Technik auf der die heute angewandten Mikroskopiearten basieren,

stellt die optische Mikroskopie dar. Mitte des 17. Jahrhunderts berichtete Robert

Hooke in „Micrographia“ [19] seine Beobachtungen, die er bei der Betrachtung von

Korkschnitten in seinem Lichtmikroskop gesammelt hatte. Die „Wände“, die er in

Pflanzen gesehen hatte, führten zur Prägung des Begriffs „Zelle“.

Die Vergrößerung in einem optischen Mikroskop geschieht mit Hilfe von sichtba-

rem Licht, dessen Strahlengang ein Linsensystem passiert. Im Bereich der Zellbiolo-

gie wird klassische Lichtmikroskopie routinemäßig zur Beurteilung der Qualität von

Zellkulturen eingesetzt oder dient der Beobachtung morphologischer Phänomene

zum Beispiel während der Zellteilung unter verschiedenen Bedingungen [20].

Gut zweihundert Jahre später im späten zwanzigsten Jahrhundert änderte sich

die Form der Bildgebung durch die Erfindung des konfokalen Mikroskops (Patent US

3013467 A) fundamental. Eine Probe im klassischen Licht-Mikroskop muss in seiner

Gesamtheit gleichmäßig von Licht bestrahlt und abgebildet werden. Im konfokalen

Mikroskop wird fast ausschließlich nur Licht aus der Brennebene detektiert. Um ein

Gesamtbild zu erhalten, muss ein ausgewählter Bereich Punkt für Punkt abgerastert

werden. Abbildung 1.3 zeigt den prinzipiellen Aufbau eines konfokalen Mikroskops.

Abbildung 1.3: Schematischer Aufbau und Strahlengang eines Konfokalmikroskops. Adap-tiert nach [6].

In einem Konfokal-Mikroskop wird eine Lichtquelle (in der Regel ein Laser) über

8

Optische und konfokale Mikroskopie 1

ein Objektiv in die Probe fokussiert. In der vorliegenden Arbeit wurde ein frequenzver-

doppelter Nd:YAG Festkörperlaser, der Licht einer Wellenlänge von 532 nm emittiert

oder single-frequency Diodenlaser mit einer Wellenlänge von 488 nm beziehungs-

weise 785 nm. Das Streulicht aus der Brennebene der Probe (grüner Strahl) wird

über einen Strahlteiler und ein weiteres Objektiv auf eine Lochblende fokussiert und

auf einen Detektor weitergeleitet. Der Durchmesser der Lochblende wird so gewählt,

dass fast ausschließlich nur Licht aus der Brennebene durch die Lochblende treten

kann und zum Detektor weitergeleitet wird (Konfokalität). Abb. 1.3 zeigt, dass Licht,

das nicht aus der Brennebene stammt (gestrichelte rote Linie) nicht die Lochblende

passiert. So kann ein Bild einer Probe in allen drei Dimensionen erstellt werden und

die laterale Auflösung um einen Faktor bis zu√

2 verbessert werden [21].

Die Auflösung ist begrenzt durch Beugungs-Effekte. Das Rayleigh-Kriterium gibt

dabei den kleinsten Abstand an, bei dem zwei Punktobjekte noch separat detektiert

werden können (beide aus [6]):

∆x =1.22 · f ·λ

D(1.23)

mit Auflösung ∆x, Brennweite f des Objektivs und Durchmesser des Objektivs D.

∆x =0.61 ·λ

NA=

0.61 ·λnsin

(θ

2

) . (1.24)

NA des verwendeten Wassereintauch-Objektivs ist in Wasser 1 (1.0W). Die Auf-

lösung ist also von der Wellenlänge des verwendeten Lichts und der numerischen

Apertur des Objektivs abhängig. Bei Verwendung von Licht einer Wellenlänge von

532 nm als Anregungswellenlänge ergibt sich aus Gleichung 1.24 eine laterale Auflö-

sung des in dieser Arbeit verwendeten Mikroskops von etwa 325 nm. Die Auflösung

in Richtung der optischen Achse beträgt etwa 750 nm.

Zeigt eine Probe Fluoreszenz (also die Emission von Photonen aus einem elektro-

nisch angeregten Zustand des untersuchten Moleküls), führt dies zu einem intensiven

und breiten Hintergrundsignal. Da der klassische Fluoreszenz-Mechanismus um Grö-

ßenordnungen stärker ist als der relativ schwache Raman Effekt, dominiert dieser

üblicherweise die Raman-Banden im Spektrum. Möglichkeiten dem entgegenzuwir-

ken, sind das zu untersuchende Molekül auszubleichen (Abnahme der Fluoreszenz

mit der Zeit der Bestrahlung mit dem Anregungslicht) oder die Fluoreszenz durch

Zugabe eines Quenchers zu unterdrücken.

9

Konfokale Raman-Mikrospektroskopie 1

1.3 Konfokale Raman-Mikrospektroskopie

Obwohl der Raman-Effekt bereits 1928 postuliert worden ist, war die Entdeckung

und Entwicklung zweier kritischer Komponenten notwendig, um Raman-Experimente

durchführen zu können, wie sie heute routinemäßig in industriellen und akade-

mischen Laboren realisiert werden. Die Quelle für die für Raman-Spektroskopie

benötigte monochromatische elektromagnetische Strahlung mit hoher Intensität

stellte lange eine Quecksilberdampflampe dar, bis Theodore Maiman 1960 eine

neuartige Quelle für Licht einer bestimmten Wellenlänge mit hoher Intensität und

Stabilität, den ersten erfolgreichen Laser (light amplification by stimulated emission

of radiation, Laser), erfand [22].

Die zweite kritische Komponente, die ersetzt wurde, befand sich im Detektorteil der

Raman-Instrumente. Die üblich verwendeten Photomultiplier Tubes, PMT konnten

ersetzt werden mit CCD-Kameras (Charge-coupled device) [23]. Im PMT konnte stets

nur eine Bande von Interesse beobachtet werden, die über den Ausgangsschlitz im

Spektrometer eingestellt werden konnte. Als Detektor ersetzte die aus dem Halbleiter

Silizium bestehenden CCD-Kameras den Ausgangsschlitz und machten damit den

Übergang von Einkanal- zu Mehrkanalmessungen möglich. Die Kombination mit

konfokaler Mikroskopie ermöglichte es Raman-Spektren Bildpunkt für Bildpunkt mit

hoher Genauigkeit in allen drei Dimensionen einer Probe zu messen und führte

letztendlich zur Technik der „Konfokalen Raman-Mikrospektroskopie“.

1.4 Fluoreszenz-Mikroskopie

Die am weitesten verbreitete mikroskopische Technik zur Untersuchung zellulärer

Vorgänge ist die Fluoreszenz-Mikroskopie. Einerseits ist es von Vorteil, dass bereits

eine Bandbreite an verschiedensten hochspezifischen Fluoreszenzsonden existiert

[24, 25], andererseits bringt es den Nachteil mit sich, dass die zu untersuchenden

Proben mit genau diesen Fluoreszenzsonden gelabelt werden und an die Moleküle

binden müssen, was die physikochemischen Eigenschaften, gerade von relativ zur

Fluoreszenz-Sonde kleinen Molekülen ändern könnte [26].

Fluoreszenz basiert im Gegensatz zum Raman-Effekt auf der Absorption und

Emission von Photonen. Das Jablonski-Diagramm in Abb. 1.4 zeigt das zugrundelie-

gende Prinzip des Anregungs- und des Emissionsprozesses.

Links sind die Singulettzustände aufgetragen, in denen die Elektronen mit entge-

gengesetztem Spin gepaart vorliegen. S0 stellt den elektronischen Grundzustand

10

Fluoreszenz-Mikroskopie 1

S2

AbsorptionsspektrumEmissions-spektrum

Wellenlänge /nm

300 400 500 600

0123

0123

S1

S0

Abbildung 1.4: Prinzip der Anregung und Emission der Fluoreszenz. Adaptiert aus [27].

dar, entspricht also einem Molekül, das nicht durch elektromagnetische Strahlung

angeregt ist. S1 und S2 sind elektronisch angeregte Zustände, in denen äußere

Elektronen in ein anderes Orbital angehoben worden sind. S2 liegt energetisch höher

als S1 und S1 höher als S0. Die minimale Energie, die ein Fluorophor absorbieren

muss, um zu fluoreszieren ist die Energie, die benötigt wird, um ein Elektron von S0

zu S1 anzuregen. Ist die Energie höher, kann in höher liegende Vibrations- und Rota-

tionszustände, oder sogar in höhere elektronisch angeregte Zustände (S2) angeregt

werden. Ist das Molekül angeregt, bestehen mehrere Möglichkeiten, wie das Molekül

wieder in den elektronischen Grundzustand übergeht. Neben strahlungslosen Über-

gängen wie Vibrationsrelaxation, ist hier die Emission eines Photons von Interesse,

dessen Energie dem Abstand des niedrigsten Vibrationszustandes in S1 und jedem

anderen Vibrations- oder Rotationszustand in S0 entspricht. Die Wellenlänge des

emittierten Photons ist somit in der Regel größer als die des Anregungsphotons

(Rotverschiebung) [27].

Ein Molekül verbringt Zeitspannen in der Größenordnung von Nanosekunden im

angeregten Zustand, bevor Photonen emittiert werden. Ist ein anderer Fluorophor in

der unmittelbaren Umgebung des angeregten Moleküls, kann diese Lebensdauer

noch dadurch verkürzt werden, dass ein Energieübertrag auf den anderen Fluo-

11


rophor stattfindet und dieses elektronisch anregt (Fluoreszenz-Energie-Resonanz-

Transfer, FRET). Bedingung ist, dass das Emissions-Spektrum des Energie-Donors

und das Absorptions-Spektrum des Akzeptors einen spektralen Überlapp aufwei-

sen. Der strahlungslose Energieübertrag resultiert in der Emission eines Photons

größerer Wellenlänge durch den Akzeptor. Der Energietransfer findet über Dipol-

Dipol-Wechselwirkungen statt mit der Wechselwirkungsenergie EDD [3]:

EDD =1

R3n2L( ~µD ~µA−

3R2 ( ~µD~R)(µAR)) (1.25)

mit dem Brechungsindex nL, dem Dipolmoment des Donors ~µD bzw. dem Dipol-

moment des Akzeptors ~µA und dem Abstand zwischen Donor und Akzeptor ~R.

Während Dipol-Dipol-Wechselwirkungen also generalisiert mit 1R3 abnehmen, ist

die Geschwindigkeitskonstante ktrans dem Quadrat der Wechselwirkungsenergie

proportional [3]:

ktrans =1

n4LR6 µ

2Dµ

2AK2 (1.26)

mit einer Zusammenfassung der Vektortherme zu K2. Unter Berücksichtigung der

Quantenausbeute Q, der Lebensdauer des Donors ohne Akzeptor τD und des

spektralen Überlapps J ergibt sich [3]:

ktrans = konst.(

K2JQn4

LR6τD

). (1.27)

Zusammenfassung der Konstanten zum Förster-Radius R0 folgt [3]:

ktrans =1

τD

(R0

R

)6

. (1.28)

Zur Bestimmung des Abstandes zwischen Donor und Akzeptor wird die Effizienz

des Energietransfers Etrans gemessen [3]:

Etrans =1

1+(

RR0

)6 . (1.29)

Ist R = R0 werden 50% der absorbierten Energie vom Donor auf den Akzeptor über-

tragen. R0 liegt häufig zwischen 2.5 nm und 5 nm [3]. Die starke Distanzabhängigkeit

des FRET-Prozesses erlaubt eine Untersuchung der intermolekularen Abstände

innerhalb einer oder mehrerer Proben in Dimensionen weit unter dem Beugungslimit

der Lichtmikroskopie [27].

12

Desoxyribonukleinsäure 1

Die Technik der klassischen konfokalen Fluoreszenz-Mikroskopie wurde seit Mitte

der 1990er Jahre konsequent um Methoden, die es ermöglichen, das Beugungslimit

und die damit verbundene laterale Auflösung von ungefähr 300 nm und axiale Auf-

lösung von 800 nm zu umgehen oder zu durchbrechen, erweitert. Die Referenzen

[28, 29] und [30] geben eine gute Übersicht über die damit verbundenen Metho-

den der 4π-, STORM (stochastic optical reconstruction microscopy)- und STED

(stimulated emission depletion)-Mikroskopie.

1.5 Desoxyribonukleinsäure

Mit „We wish to suggest a structure for the salt of deoxyribose nucleic acid (DNA)“ be-

richteten Watson und Crick 1953 von der doppelhelikalen Struktur der DNA [31]. DNA

besteht aus zwei Strängen aus sich wiederholenden Nukleotiden. Eine Nukleotidein-

heit besteht dabei aus einer Phosphatgruppe, einer Zuckerstruktur (Desoxyribose)

sowie üblicherweise einer von vier Basen (Abb. 1.5). In der Doppelhelix formen

Adenin und Thymin als Basenpaare zwei Wasserstoffbrückenbindungen miteinander,

Guanin und Cytosin drei. In Zellen, die sich nicht im Mitosestadium befinden, liegt

die DNA als Chromatin, einer hochkondensierten Faser aus Protein und DNA, vor.

13

Desoxyribonukleinsäure 1

Abbildung 1.5: Schematischer Aufbau von DNA, dargestellt im Solvens Wasser (rote Punk-te): Die beiden aüßeren Bänder symbolisieren die beiden Zucker-PhosphatRückgrate, während die davon horizontal abgehenden Stufen Basenpaaredarstellen, die die Stränge über Wasserstoffbrückenbindungen zusammen-halten. Struktur aus PDB-Eintrag 1BNA [32].

14

2Material und Methoden

2.1 Konfokale Raman-Mikrospektroskopie

Abbildung 2.1 zeigt den schematischen Aufbau zusammen mit dem angedeuteten

Strahlengang des in dieser Arbeit verwendeten konfokalen Raman- Mikrospek-

troskops alpha300 RAS (WITec, Ulm). Als punktförmige Lichtquelle dient ein fre-

quenzverdoppelter Nd:YAG Festkörperlaser, der Licht einer Wellenlänge von 532 nm

emittiert oder ein single-frequency Diodenlaser mit einer Wellenlänge von 785 nm

(1). Die Laserstrahlung wird über eine wellenlängenspezifische single-mode-Glasfa-

ser (2) in das Mikroskop eingekoppelt (3) und anschließend durch das Mikroskop-

Objektiv (4) in die Probe fokussiert. Für Messungen in wässrigen Lösungen wurde

ein Wassereintauchobjektiv verwendet (60x/NA=1.0W, Arbeitsabstand = 2.0 mm,

Nikon, Chiyoda, Japan). Die Probe befindet sich auf einem Objekttisch (5), der

über eine piezoelektronische Einheit (6) in x- und y-Richtung bewegt werden kann.

Ein Schrittmotor (7) erlaubt durch Bewegung des Mikroskops eine Fokussierung in

z-Richtung. Das Streulicht wird durch das gleiche Objektiv wieder aufgenommen

und durchläuft einen holographischen Filter (8), der die Rayleigh-Strahlung, d.h.

reflektiertes Laserlicht reduziert, bevor es in eine multi-mode-Glasfaser fokussiert

wird (9+10). Der Kern der multi-mode-Glasfaser liefert dabei die Lochblende und

ermöglicht eine konfokale Messung. Die aus der multi-mode-Glasfaser austretende

Strahlung wird anschließend in einem Gitterspektrometer dispergiert bevor der Strahl

16

Konfokale Raman-Mikrospektroskopie 2

12

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Abbildung 2.1: Schematischer Aufbau des Raman-Mikroskops alpha300R (WITec, Ulm).Der Strahlengang ist in grün angedeutet. Adaptiert nach [6].

zur Detektion auf eine auf −60 ◦C gekühlte CCD-Kamera gelenkt wird (11). Eine

spektrale Auflösung von 2 cm−1 bis 4 cm−1 je nach verwendeter CCD-Kamera kann

über einen Bereich von −100 cm−1 bis 3750 cm−1 erzielt werden. Für temperaturab-

hängige Messungen wurde ein Peltier Thermostat PE 120 (Linkam, Surrey, England)

verwendet.

2.1.1 Konfiguration für Messungen mit 488 nm Anregungswellenlänge

Laserlicht einer Wellenlänge von 488 nm wurde zur Anregung verwendet (Leistung

P bis zu 40 mW). Der Laserstrahl wurde über eine single-mode Glasfaser in das

Mikroskop eingekoppelt und über ein 100X Objektiv (NA=0.9) in die Probe fokussiert.

Das inelastisch gestreute Licht wurde über das selbe Objektiv wieder aufgesammelt

und nach Durchlauf einer multi-mode Glasfaser (25 µm Durchmesser) und einem

optischen Gitter (600 Spalten pro mm) über einen rückwärtig belichteten CCD-Chip

detektiert (200 x 1600 Pixel, temperiert auf −60 ◦C).

17

Plasma-Quelle 2

2.1.2 Konfiguration für Messungen mit 532 nm Anregungswellenlänge



Mikroskop eingekoppelt und über ein 60X Objektiv (NA=1.0W) in die Probe fokussiert.





2.1.3 Konfiguration für Messungen bei 785 nm Anregungswellenlänge



Mikroskop eingekoppelt und über ein 100X Objektiv (NA=0.9) in die Probe fokussiert.





2.2 Plasma-Quelle

Plasma-Jets wurden mit 1.4 slm He mit 8.4 sccm O2 in einer He-Atmosphäre betrie-

ben, gesteuert durch 13.56 MHz Radiofrequenz (RF)-Spannung bei einer root mean

square (RMS) Spannung von URMS ∼ 230 V. Zur Ablenkung von Partikeln wurde ein

He-Fluss von 5.6 slm verwendet. Eine doppelt gewundene Düsengeometrie wurde

vor dem Partikel-Jet verwendet, um V(UV) Photonen zu blockieren (Abb. 3.1).

2.3 Proben

2.3.1 Synthetische DNA Homo-Oligomere

Synthetische DNA Homo-Oligomere (Thermo Fischer Scientific, Ulm) bestehend

aus 18 Nukleotiden (Desoxyribose-Adenin18 (dA18), Desoxyribose-Thymin18 (dT18),

Desoxyribose-Guanin18 (dG18), Desoxyribose-Cytosin18 (dC18)) wurden als Ein-

zelstrang verwendet oder hybridisiert, um Doppelstränge zu bilden (dA18:dT18,

dG18:dC18). Proben (1 mM in destilliertem Wasser (aqua destillata, a. dest.)) wurden

18

Proben 2

auf einem Glasobjektträger getrocknet und nach Behandlung für 30 min mit einem

der Jets gemessen. Kontrollproben wurden mit He/O2-Gas behandelt.

2.3.2 Ätzraten

Zur Bestimmung von Ätzraten wurden 60 µL von dA18, dG18, dC18 und dT18 (1 mM

in a. dest.) auf Silizium-Wafern (Siegert Consulting, Aachen) getrocknet. Profile

wurden vor und nach der Behandlung mit den unterschiedlichen Jets (Dauer: 600 s)

mit einem DEKTAK 6M Profilometer (Veeco, New York, USA) gemessen und Pro-

benhöhen bestimmt.

2.3.3 Lebende humane Spermatozoen

Für konfokale Raman-Mikrospektroskopie wurden lebende Spermatozoen eines

gesunden, menschlichen Spenders verwendet. Das so erhaltene Ejakulat wurde vor

weiterer Verwendung für 30 min bei 35 ◦C temperiert (swim up).

2.3.4 Beschichtung von CaF2-Substrat mit Concanavalin A Typ IV

Der verwendete CaF2 Objektträger (Korth, Kiel) wurde zunächst mit a. dest. und

anschließend mit 70%igem Ethanol gereinigt. Concanavalin A Typ IV (Sigma-Aldrich,

Seelze) wurde in 50 mM ACES (Sigma-Aldrich, Seelze) zu einer Konzentration von

0.9 M aufgenommen. Nach Beschichtung des Substrats mit der Proteinlösung wurde

das Substrat für 2 h bei Raumtemperatur getrocknet. Im folgenden Waschschritt

wurde in umgekehrter Reihenfolge mit 70%igem Ethanol und a. dest. gewaschen.

Anschließend wurde wieder für 2 h bei Raumtemperatur getrocknet. Für Verwendung

am selben Tag wurde das Substrat für 2 h bei 37 ◦C temperiert. Eine Lagerung des

Substrats ist bei 4 ◦C möglich.

2.3.5 Percoll-Dichtegradienten-Zentrifugation

Percoll-Dichtegradienten-Zentrifugation wurde ausgehend von einer isotonischen

Percoll-Lösung (Percoll in 10% 1.5 M NaCl)( beides Sigma-Aldrich, Seelze) durch-

geführt. Aus dieser wurden 55%ige bzw. 80%ige Percoll-Lösung in Ham’s nutrient

mixture F12 (Sigma-Aldrich, Seelze) hergestellt und auf 35 ◦C temperiert. Pro 1 mL

Ejakulat wurden in einem 15 mL Falcon-Tube Zentrifugenröhrchen (VWR, Darm-

stadt) 2 mL 80%ige Percoll-Lösung mit 2 mL 55%iger Percoll-Lösung überschichtet.

Darauf wurde unter Vermeidung von Schlierenbildung 1 mL Ejakulat geschichtet

19

Proben 2

und für 30 min bei Raumtemperatur bei 500 g zentrifugiert. In einem Waschschritt

wurde danach der Überstand verworfen und das Pellet mit 5 mL Ringer-Lösung

(8.6 g NaCl, 0.3 g KCl, 0.32 g CaCl2 in 1 L a. dest., alles Sigma-Aldrich, Seelze),

gespült. Anschließend wurde für 15 min bei Raumtemperatur bei 500 g zentrifugiert.

Nach erneutem Verwerfen des Überstands wurden 2 mL Ringer-Lösung zum Pellet

gegeben und auf die gewünschte Konzentration verdünnt.

2.3.6 Automatisierte konfokale Raman-Mikrospektroskopie

Konfokale Raman-Mikrospektroskopie wurde unter der Konfiguration wie sie in

Abschnitt 2.1.2 beschrieben ist, durchgeführt. 1 mL der isolierten Spermatozoen-

Lösung wurde auf das CaF2 aufgetragen, mit vorgewärmter Ringer-Lösung (35 ◦C

überschichtet und sofort im Mikroskop betrachtet. Für automatisierte Messungen wur-

de das „Sample Raster“ Feature von WITec Control 1.56 (2010) verwendet. Punkte in

der Probe wurden manuell ausgewählt, in denen automatisierte Messungen mit vor-

eingestellter Geometrie und Integrationszeit pro Spektrum durchgeführt wurden. Die

Summenfilteranalyse integriert über die Intensitäten ausgewählter Raman-Banden

in den gemessenen Spektren und erstellt farbkodierte Raman-Bilder in Echtzeit.

2.3.7 Vorbehandlung der aufgenommen Datensätze

Raman-Spektrendatensätze wurden mit WITec Project 2.10 (2012) analysiert. Vor

Datenanalyse wurden die Spektren von Störbeiträgen kosmischer Strahlung befreit.

Für eine Hintergrundkorrektur wurden Bereiche im Raman-Spektrum ausgewählt, in

denen keine Raman-Banden zu erkennen sind und die Intensitätswerte in diesen

Bereichen über je nach verwendeter CCD-Kamera über 6 cm−1 bzw. 12 cm−1 gemit-

telt. Andere Bereiche wurden linear interpoliert, resultierend in einem Hintergrund,

der abgezogen werden konnte.

2.3.8 LIVE/DEAD Sperm Viability Kit zur Fluoreszenz-Markierung von

Spermatozoen

Eine 20 µM Stammlösung von SYBR-14 (Molecular Probes, Leiden, Niederlan-

de) in DMSO (Sigma-Aldrich, Seelze) wurde verwendet. Eine Endkonzentration

von 100 nM wurde zu den immobilisierten Spermatozoen gegeben und für 10 min

inkubiert. Für eine Fluoreszenz-Doppelmarkierung lebendiger und chemisch geschä-

digter Zellen wurde SYBR-14 entfernt und 12 µM Propidiumiodid (PI) (Molecular

20


Probes, Leiden, Niederlande) zu den Zellen gegeben und für 10 min inkubiert.

2.4 Fluoreszenz-Mikroskopie

Nach Waschen der Zellen mit Ringer-Lösung wurden die Spermatozoen in einem

Axio Observer.Z1 Fluoreszenz-Mikroskop (Zeiss, Jena) beobachtet. SYBR-14 in

den Zellen wurde mit Licht einer Wellenlänge von 470 nm oder 555 nm angeregt.

Fluoreszenz-Bilder wurden mit Hilfe eines 10X Plan-Neofluar Objektivs (Zeiss, Jena)

und den Filter Sets 38HE und 63HE (Zeiss, Jena) aufgenommen.

21

3Effekte der Behandlung von DNA mit

einem nicht-thermischen

Atmosphärendruck-Plasma

3.1 Einführung und Motivation

Plasma kann beschrieben werden als partiell ionisiertes Gas, welches freie Elektro-

nen, Ionen und neutrale Partikel enthält. Thermische Plasmen unterscheiden sich

von nicht-thermischen Plasmen in dem Sinne, dass ihre Elektronentemperatur signi-

fikant höher ist, als die Gastemperatur (ungefähr Raumtemperatur). Radiofrequenz-

gesteuerte kalte Atmosphärendruck-Plasma-Jets (microscale atmospheric pressure

plasma, µAPPJ) sind bekannte Beispiele nicht-thermischer Plasmen. Das Gas, wel-

ches für diesen Plasma-Jet verwendet wurde, ist He-Gas mit einem Zusatz von

0.6% O2(v/v) resultierend in O Atomen, metastabilem O2 sowie O3 als reaktive

Sauerstoffspezies [33].

Neue Entwicklungen im Bereich der kalten Atmosphärendruck-Plasmen (cold

atmospheric pressure plasma, CAP) haben zu einem verstärkten Interesse in deren

medizinischen Anwendungen, das heißt in deren desinfizierenden Eigenschaften,

geführt [34]. CAPs sind in der Lage Mikroorganismen zu inaktivieren und Biomakro-

moleküle, wie Proteine und DNA chemisch zu modifizieren [35–38].

23

Einführung und Motivation 3

Trotz des klinischen Erfolgs der Plasma-Medizin ist wenig über die Mechanismen,

die zu diesen Modifikationen führen, bekannt. Gegenstand der Forschung ist es, Ein-

sicht in die Inaktivierungs-Mechanismen von Plasmen in vitro und in vivo zu erhalten.

Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Auswirkung der separierten Kom-

ponenten einer spezifischen Plasmaquelle auf die Struktur des Bio-Makromoleküls

DNA in vitro.

Als Plasmaquelle wurde ein µAPPJ verwendet, der in [33] beschrieben und

charakterisiert wurde (Abb. 3.1). In diesem experimentellen Aufbau wurden die

untersuchten DNA Oligomere nicht direkt dem Plasma, sondern separat den ein-

zelnen Plasma-emittierten Komponenten ausgesetzt. Die Verwendung der X-Jet-

Abbildung 3.1: Schema der drei µAPPJs, die in dieser Arbeit verwendet wurden, um dasBio-Makromolekül DNA zu behandeln. Entnommen aus [38].

Technologie [39, 40] ermöglicht eine Trennung der reaktiven Partikel (Ionen, Radi-

kale) von dem Photonenanteil der Plasmaquelle. Folglich ist eine systematische

Untersuchung von unabhängigen, kumulativen und synergistischen Effekten mög-

lich.

DNA dient als Modellverbindung, um die Effekte einer Plasma-Behandlung zu

untersuchen. Synthetisch hergestellte DNA Homo-Oligomere bestehend aus 18

identischen Nukleobasen sowie deren entsprechende Doppelstränge wurden als

System reduzierter Komplexität ausgewählt. Dies ermöglicht es, systematisch die

24


Effekte einer Plasma-Behandlung zu untersuchen, speziell im Hinblick auf jede

der vier Nukleobasen und das Desoxyribose-Phosphat-Rückgrat. Homo-Oligomere

wurden zusätzlich deshalb ausgewählt, um einen möglichen stabilisierenden Effekt

von gestapelten Nukleobasen über Wasserstoffbrückenbindungen zu untersuchen.

Während manche Modifikationen exklusiv unter den hier beschriebenen in vitro

Behandlungsbedingungen stattfinden, besteht die Möglichkeit, dass andere Effekte

nur in vivo in einer funktionierenden Zellumgebung beobachtet werden können [38].

Raman-Spektroskopie wurde verwendet, um die Plasma-induzierten Effekte auf

die DNA-Struktur auf eine nicht-destruktive, nicht-invasive Art und Weise zu klassifi-

zieren. Des Weiteren erlaubt Raman-Spektroskopie eine Korrelation mit Ätzeffekten,

indem die Gesamtintensität der gemessenen Raman-Spektren mit den Ergebnissen

aus Profilometrie-Experimenten verglichen wird. Die vorliegende Arbeit stellt einen

Schritt in Richtung Verständnis der Plasma-induzierten molekularen Prozesse an

biologischen Materialien dar.

25

Ergebnisse 3

3.2 Ergebnisse

Konfokale Raman-Spektroskopie wurde verwendet um Modifikationen von DNA

Homo-Oligomeren, bestehend aus 18 identischen Nukleobasen (dG18, dC18, dA18,

dT18) zu untersuchen, welche durch die emittierten Komponenten eines kalten

Atmosphärendruck-Plasmas eingeführt worden sind. Einzelpunkt Raman-Spektren

wurden sowohl von Kontrollproben als auch von DNA Homo-Oligomeren gemessen,

die zuvor mit den spezifischen Plasma-Jets (UV-Jet, Partikel-Jet, Komplett-Jet, 3.1)

für jeweils 30 min behandelt wurden. Die so erhaltenen Raman-Spektren wurden

durch Vergleich mit den Referenzen [41–46] analysiert und sind zum besseren

Vergleich auf der Y-Achse gegeneinander versetzt. Abbildung 3.9 zeigt die Auf-

stellung der 16 Raman-Spektren der unbehandelten Kontrollen der Einzelstrang

Homo-Oligomere und den -Oligomeren behandelt mit den spezifischen Plasma-

Jets. Jedes Spektrum wurde durch 24 Wiederholungen für jeweils 2.5 s erzeugt

(Gesamtintegrationszeit: 60 s, Anregungswellenlänge λ = 785 nm).

Vier unterschiedliche Arten von Banden wurden in den Spektren aller Oligonu-

kleotide annotiert:

1. Nukleobasen-spezifische Banden (üblicherweise im Bereich von 300 cm−1 bis

1600 cm−1) bezeichnet als Ax, Tx, Gx, Cx

2. v(PO2), eine hochstabile Struktur des Phosphat-Rückgrats für Referenzie-

rungszwecke (1092 cm−1)

3. Eine Bande entstehend aus der Schwingung gekoppelter Nukleobasen (cou-

pled nucleobases, cNB; 925 cm−1)

4. Eine Bande bei 1440 cm−1 generiert aus dem Desoxyribose-Teil der DNA

(backbone, bb) .

Bei dem Vergleich der Spektren von dA18 behandelt mit dem UV-Jet oder dem

Partikel-Jet allein wurden Änderungen in relativen Bandenintensitäten der Nukleo-

basen-Banden (bezeichnet mit A1 - A4) verglichen mit der Referenz-Bande bei

1092 cm−1 beobachtet (Abb. 3.2). Die relative Intensität der Bande der gekoppelten

Nukleobasen cNB nimmt auf eine ähnliche Art und Weise nach separater UV- und

Partikel-Behandlung ab. Im Gegensatz dazu konnte ein starker Abfall der relativen

Intensität der meisten Banden nach 30 minütiger Behandlung mit dem Komplett-Jet

beobachtet werden. Der deutlichste Effekt ist für die cNB-Bande sichtbar.

26

Ergebnisse 3

400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

r��(PO2)

bbA

4

A3

A2 Kontrolle

UV-Jet

Partikel-Jet

Ram

an

Inte

nsität/w

illk.E

inh.

Wellenzahl /cm-1

Komplett-Jet

cNB

A1

Abbildung 3.2: Raman-Spektren behandelter und unbehandelter dA18 DNA Oligomere.cNB: gekoppelte Nukleobasen, r-v(PO2): Referenzbande aus dem Phosphat-Rückgrat, bb: Desoxyribose-Rückgrat, A1 - A4: Adenin spezifisch. Jedesgezeigte Spektrum wurde durch 24 Wiederholungen für je 2.5 s generiert(Gesamtintegrationszeit: 60 s, Anregungswellenlänge λ = 785 nm).

400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

bb

cNBr - �(PO

2)T

3T2

Ram

an

Inte

nsität/w

illk.E

inh.

Wellenzahl /cm-1

T1

T4

Kontrolle

UV-Jet

Partikel-Jet

Komplett-Jet

Abbildung 3.3: Raman-Spektren behandelter und unbehandelter dT18 DNA Homo-Oligomere. cNB: gekoppelte Nukleobasen, r-v(PO2): Referenzbande ausdem Phosphat-Rückgrat, bb: Desoxyribose-Rückgrat, T1 - T4: Thymin spe-zifisch. Jedes gezeigte Spektrum wurde durch 24 Wiederholungen für je2.5 s generiert (Gesamtintegrationszeit: 60 s, Anregungswellenlänge λ =785 nm).

27

Ergebnisse 3

Die strukturellen Modifikationen, die durch die Behandlung mit den unterschied-

lichen Plasma-Jets in dT18 eingeführt wurden, sind in Abb. 3.3 gezeigt. Während

einige der relativen Bandenintensitäten einem ähnlichen Trend folgen wie in dA18

abgebildet (Abb. 3.2) - wie der komplette Verlust der cNB Bande bei 925 cm−1 nach

Komplett-Jet Behandlung - steigt die relative Intensität der cNB Bande nach Behand-

lung mit dem Partikel-Jet an. Abbildung 3.4 zeigt die Raman-Spektren von dC18.

Eine Behandlung mit dem UV-Jet resultiert in Modifikationen der relativen Banden-

intensitäten der Nukleobasen spezifischen Banden C1 und C3. Modifikationen der

Zuckerrückgrat Banden konnten nach Partikel-Jet Behandlung beobachtet werden,

resultierend in einer Abnahme der relativen Bandenintensität bei 1440 cm−1. Wieder

ist der Verlust der relativen Intensität der cNB Bande bei 925 cm−1 nach Komplett-Jet

Behandlung besonders ausgeprägt. Ähnliche Effekte wurden für dG18 gefunden

(Abb. 3.5). Ergebnisse werden hier zum Vergleich gezeigt. [38]. Die Bestimmung der

Ätzeffekte für die verschiedenen Jets soll die beobachtete Abnahme der Gesamt-

signalintensität speziell nach Komplett-Jet Behandlung ergänzen. Eine mögliche

Ursache für die beschriebene Abnahme liefert Ätzen, das heißt Plasma-induziertes

Entfernen von Probenmaterial. Beschleunigte Plasma-generierte Spezies intera-

gieren mit der Probe durch das Entfernen von Atomen (und deshalb Substanz)

aus der Probe. Es wurde bereits untersucht, dass der X-Jet dazu in der Lage ist,

Proteinproben zu Ätzen [39]. Hier wurde das Entfernen von Homo-Oligonukleotiden

untersucht. Die Ätzraten unter Berücksichtigung der Trocknungseffekte sind in Ta-

belle 3.1 dargestellt.

Tabelle 3.1: Ätzraten des X-Jets in (nmmin−1) von DNA Homo-Oligonukleotide.

UV-Jet Partikel-Jet Komplett-Jet

Beobachtete Ätzrate 280 380 660Trocknungseffekt 220 220 220

Tatsächliche Ätzrate 60 160 440

Der UV-Jet zeigt mit 60 nmmin−1 den geringsten Ätzeffekt. Mit 160 nmmin−1

ätzt der Partikel-Jet effektiver. Der Komplett-Jet liefert den größten Ätzbeitrag mit

440 nmmin−1. Trocknungseffekte von 220 nmmin−1 wurden zur Berechnung der

genannten Werte abgezogen. Es konnten keine signifikanten Unterschiede für die

vier unterschiedlichen Oligomere beobachtet werden.

Die durch Profilometrie bestimmten Ätzeffekte wurden anschließend mit den

Raman Signalintensitäten verglichen, die über das Integral (algebraische Sum-

28

Ergebnisse 3

400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

C3

C2C

1bb

Ram

an

Inte

nsität/w

illk.E

inh.

Wellenzahl /cm-1

cNB

r - �(PO2)

Kontrolle

UV-Jet

Partikel-Jet

Komplett-Jet

Abbildung 3.4: Ramanspektren behandelter und unbehandelter dC18 DNA Homo-Oligomere. cNB: gekoppelte Nukleobasen, r-v(PO2): Referenzbande ausdem Phosphat-Rückgrat, bb: Desoxyribose-Rückgrat, C1 - C3: Cytosin spe-zifisch. Jedes gezeigte Spektrum wurde durch 24 Wiederholungen für je2.5 s generiert (Gesamtintegrationszeit: 60 s, Anregungswellenlänge λ =785 nm).

400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

�(PO2)

bb

cNB

G3

G2

Ram

an

Inte

nsität/w

illk.E

inh.

Wellenzahl /cm-1

G1

r - �(PO2)

Kontrolle

UV-Jet

Partikel-Jet

Komplett-Jet

Abbildung 3.5: Ramanspektren behandelter und unbehandelter dG18 DNA Homo-Oligomere. cNB: gekoppelte Nukleobasen, r-v(PO2): Referenzbande ausdem Phosphat-Rückgrat, bb: Desoxyribose-Rückgrat, G1 - G3: Guanin spe-zifisch. Jedes gezeigte Spektrum wurde durch 24 Wiederholungen für je2.5 s generiert (Gesamtintegrationszeit: 60 s, Anregungswellenlänge λ =785 nm).

29

Ergebnisse 3

me der Trapeze) jedes gemessenen Raman-Spektrums von xi (300 cm−1) bis x f

(1800 cm−1) berechnet wurden [47]:

∫ x f

xi

f (x)dx≈f−1

∑i=1

(xi+1− xi)12[ f (xi+1)+ f (xi)] (3.1)

Für einen akkurateren Vergleich wurden die Werte der Integrale der Kontroll-

spektren auf 1 gesetzt und alle anderen Spektren dazu normiert. Abbildung 3.6

zeigt die Ergebnisse der berechneten Integrale für jedes der Spektren abgebildet

in Abb. 3.2 bis 3.5. Die X- und Y-Achse zeigen die Ergebnisse einer Behandlung

mit Kontroll-Gas oder einem der drei Jets. Symbole repräsentieren dabei die vier

Einzelstrang DNA Homo-Oligomere (dA18, dT18, dG18, dC18). Die Behandlung mit

dem UV-Jet resultiert in einem Integral von 1.25±0.15 verglichen zur jeweiligen

gasbehandelten Kontrolle. Partikel-Jet Behandlung zeigt ein kleineres Integral mit

einem größeren Änderungsbereich von 1.0±0.2 über die vier Homo-Oligomere,

während Komplett-Jet Behandlung in einer deutlichen Abnahme des berechneten

Integrals resultiert: 0.45±0.25.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

0,0 0,5 1,0 1,5 2,00,0

0,5

1,0

1,5

2,0

0,00,51,01,52,0

Partikel-Jet

UV-Jet

Kontrolle

Kompett-Jet

dA18

dT18

dG18

dC18

Abbildung 3.6: Ein Sterndiagramm bildet das Integral (algebraische Summe der Trapeze,Glg. 3.1) von 300 cm−1 bis 1800 cm−1 ab. Auf jeder Achse sind die Werteder Integrale der Spektren nach Behandlung mit Helium-Gas (Kontrolle)oder einem der drei Jets aufgetragen. Die Symbole repräsentieren dabeidie vier DNA Einzelstrang Homo-Oligomere (dA18, dT18, dG18, dC18). DieWerte der Integrale der Kontrollspektren wurden auf 1 normiert.

30

Ergebnisse 3

Für die nachfolgende Analyse wurde der Wert von I(cNB)/I(v(PO2)) berechnet.

Dazu wurde der Wert der maximalen Intensität der cNB-Bande jedes Spektrums divi-

diert durch die jeweils korrespondierende Referenz-Bande I(v(PO2)). I(cNB)/I(v(PO2))

wurde in einem Sterndiagramm aufgetragen, in dem jede Achse das Ergebnis für die

Kontrollprobe beziehungsweise für die Behandlung mit dem UV-, dem Partikel- oder

dem Komplett-Jet widerspiegelt (Abb. 3.7). Unterschiedliche Symbole repräsentieren

die vier DNA Einzelstrang Homo-Oligomere (dA18, dT18, dG18, dC18). Eine starke

Abnahme von I(cNB)/I(v(PO2)) kann nach Komplett-Jet Behandlung für alle vier

untersuchten DNA Homo-Oligomere beobachtet werden. In dT18 und dG18 nimmt

die Intensität von I(cNB)/I(v(PO2)) nach Partikel-Jet Behandlung zu. Änderungen

in der Nukleobasen-Geometrie resultieren folglich entweder in einer Ab- oder einer

Zunahme der relativen Bandenintensität.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

0,0 0,5 1,0 1,5 2,00,0

0,5

1,0

1,5

2,0

0,00,51,01,52,0

I(cNB)/I(�(PO2))

Partikel-Jet

UV-Jet

Kontrolle

Komplett-Jet

dA18

dT18

dG18

dC18

Abbildung 3.7: Ein Sterndiagramm bildet I(cNB)/I(v(PO2)) ab. Auf jeder Achse istI(cNB)/I(v(PO2)) nach Behandlung entweder mit Helium-Gas (Kontrolle)oder einem der drei Jets aufgetragen. Die Symbole repräsentieren dabei dievier DNA Einzelstrang Homo-Oligomere (dA18, dT18, dG18, dC18). Um einenbesseren Vergleich der Änderungen nach Behandlung mit einem der dreiJets zu gewährleisten wurde I(cNB)/I(v(PO2)) der Kontrollspektren ebenfallsauf 1 normiert.

Um mögliche stabilisierende Effekte doppelsträngiger DNA zu untersuchen, wurde

in dieser Arbeit ebenfalls hybridisiertes dA18:dT18 auf gleiche Art und Weise mit dem

Komplett-Jet behandelt wie die korrespondierenden Einzelstränge A18 und T18. Die

Ergebnisse sind in Abb. 3.8 dargestellt.

31

Ergebnisse 3

400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

r - �(PO2)

Differenz

T2

cNB

T3A

1bb

A4

Ram

an

Inte

nsität/w

illk.E

inh.

Wellenzahl /cm-1

Kontrolle

Komplett-Jet

T1

Abbildung 3.8: Normalisierte Raman-Spektren behandelter und unbehandelter doppelsträn-giger dA18:dT18 DNA. A1, A14, T1 bis T3: Nukleobasen spezifisch (Anno-tation entnommen aus Abb.3.9), cNB: gekoppelte Nukleobasen, r-v(PO2):Referenz-Bande aus dem Phosphat-Rückgrat, bb: Desoxyribose-Rückgrat.Das Kontroll- und Komplett-Jet-Spektrum wurde generiert durch 24 Wie-derholungen bei je 2.5 s (Gesamtintegrationszeit: 60 s, Anregungswellen-länge λ = 785 nm). Das Differenz-Spektrum (unten) der doppelsträngigendA18:dT18 DNA behandelt mit dem Komplett-Jet und der unbehandeltendA18:dT18 DNA zeigt hauptsächlich Rauschbeiträge.

32

Ergebnisse 3

Sowohl das Kontroll- als auch das Spektrum nach Behandlung mit dem Komplett-

Jet zeigen Beiträge der Nukleobasen Adenin und Thymin im Bereich von 300 cm−1

bis 1700 cm−1. Die cNB-Bande zeigt eine schwache Intensitätsabnahme, während

andere spektrale Charakteristika annähernd unverändert nach Komplett-Jet Be-

handlung bleiben. Dies ist illustriert im Differenzspektrum (IKontrolle - IKomplett-Jet), das

hauptsächlich Rauschen aufweist.

33

Ergebnisse 3

40

06

00

80

01

00

01

20

01

40

01

60

01

80

04

00

60

08

00

10

00

12

00

14

00

16

00

18

00

40

06

00

80

01

00

01

20

01

40

01

60

01

80

04

00

60

08

00

10

00

12

00

14

00

16

00

18

00

r -

�(P

O2)

(C)

(B)

A4

A3

A2

RamanIntensität/willk.Einh.

cN

B

A1

(A)

r -

�(P

O2)

Kontr

olle

UV

-Jet

Part

ikel-Jet

Kom

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tt-J

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bb

bb

cN

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3T

2

T1

T4

r -

�(P

O2)

Kontr

olle

UV

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t

Part

ikel-Jet

Kom

ple

tt-J

et

(D)

cN

BC

3

C2

C1

bb

RamanIntensität/willk.Einh.

We

llenzahl /c

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cN

B

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olle

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Kontr

olle

UV

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Part

ikel-Jet

Ko

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llenzahl /c

m-1

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G1

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3

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wel

lenl

änge

λ=

785

nm).

34

Diskussion und Ausblick 3

3.3 Diskussion und Ausblick

Ein Ziel dieser Arbeit war es Effekte der Plasma-emittierten Komponenten auf ein

in vitro DNA-Modellsystem zu untersuchen. Die Verwendung des X-Jets, der eine

Separierung reaktiver Partikel von Photonen vereinfacht, erlaubte dabei eine Unter-

suchung separater, kumulativer und synergistischer Mechanismen mit konfokaler

Raman-Spektroskopie.

Die Diskussion der molekularen Mechanismen und Effekte der individuellen Plas-

ma Komponenten basiert auf den bereits beschriebenen Mechanismen, nament-

lich Ätzen durch Ionen sowie Rückgrat-Modifikationen und Vernetzung von DNA

[38, 39]. Ätzeffekte können als chemische Oxidationsprozesse betrachtet werden.

Die Plasma-emittierten reaktiven Spezies führen zu Bindungsbrüchen, speziell in

Kohlenwasserstoffen. Diese offenen Bindungsstellen werden weiter modifiziert zu

molekularen Fragmenten und leicht flüchtigen Strukturen [48]. Es wurde gezeigt,

dass UV-Jet Behandlung einer amorphen Kohlenstoffschicht nicht zu Ätzeffekten

führt, während Ätzen für den Partikel- und den Komplett-Jet beobachtet wurde [38].

Ein ähnlicher Trend kann beobachtet werden, wenn die Integrale der gemessenen

Raman-Spektren mit Ätzraten bestimmt für DNA verglichen werden.

Wenn DNA Einzelstränge bestehend aus 18 identischen Nukleotiden (A,T,G oder

C) mit dem Komplett-Jet behandelt wurden, konnte ein synergistischer Effekt zwi-

schen UV Photonen und Partikeln für alle vier Typen untersuchter Einzelstrang DNA

beobachtet werden. Der in dieser Arbeit beobachtete synergistische Effekt der kom-

binierten (V)UV Photonen und reaktiven Partikel kann verstanden werden, wenn die

cNB-Bande bei 925 cm−1 analysiert wird. Behandlung allein mit dem UV- oder dem

Partikel-Jet führt kleinere Änderungen in die gekoppelte Nukleobasen-Geometrie ein,

mit der größten - wenn auch absolut gesehen kleinen - Änderung für dT18. Während

das Intensitätsverhältnis I(cNB)/I(v(PO2)) nach Behandlung mit dem Partikel-Jet

zunahm, wurde ein kompletter Verlust der cNB-Bande nach Komplett-Jet Behand-

lung beobachtet. Kleine Änderungen in der gekoppelten Nukleobasen-Geometrie

wurden in DNA Einzelsträngen in vitro sowohl durch den UV- als auch durch den

Partikel-Jet induziert. Die Kombination aus V(UV) Photonen und Partikeln führt

überraschenderweise zu einem nicht-kumulativen, synergistischen Effekt, der sich

durch den vollständigen Verlust der cNB Bande in dT18 und dG18 und dem nahezu

vollständigen Verlust in dC18 und dA18 äußert. Gekoppelte Nukleobasen- Geometrie-

und Nukleobasen/Rückgrat-Modifikationen gehen Hand in Hand, resultierend im

beobachteten synergistischen Mechanismus.

35


Werden die Ätzraten des Komplett-, UV- und Partikel-Jets des µAPPJ von DNA

verglichen mit den Integralen der Spektren (Abb. 3.6) und der Abnahme der cNB-

Bande bei 925 cm−1 (Abb. 3.7), kann ausgeschlossen werden, dass Ätzen der aus-

schließliche Mechanismus für die Inaktivierung der DNA ist. Die erhöhte strukturelle

und chemische Stabilität von Doppelstrang-DNA resultiert in verringerten chemi-

schen Modifikationen durch die Plasma-emittierten Komponenten. Das Spektrum der

Doppelstrang-DNA ist bis auf eine relative schwache Abnahme der cNB-Bande an-

nähernd unbeeinflusst von der Plasma Behandlung, obwohl Ätzen des Komplett-Jets

von DNA beobachtet wurde.

In komplexeren biologischen Systemen, wie eukaryotischen und prokaryotischen

Zellen, umgibt die Zellmembran beziehungsweise Zellwand die in der Zelle befindli-

chen Nukleinsäuren. Studien an B. subtilis behandelt mit der selben Plasma-Quelle

wie in dieser Arbeit, zeigten, dass nach 30 min Behandlung mit dem Komplett-Jet

Ätzeffekte in einem Radius von 3 mm um die zentrale Jet-Achse [38] beobachtet

werden konnten. Das Bakterienwachstum war jedoch auf einer weit größeren Fläche

der gesamten Petrischale (Radius 43.5 mm) inhibiert. Behandlung mit dem Partikel-

Jet zeigte ähnliche Ergebnisse, während nach Behandlung mit dem UV-Jet keine

Ätzeffekte und eine Inhibitionszone mit einem kleineren Radius von nur 1.5 mm be-

obachtet wurden. Zusätzlich wurde B. subtilis in Flüssigkultur in Umgebungsluft für

30 min mit dem Komplett-Jet behandelt. Die Expression von Stressindikator-Genen

für DNA (recA) zeigte eindeutig eine auf DNA-Schädigungen folgende Stressantwort

der Zellen [38]. Diese Ergebnisse unterstützen die in dieser Arbeit aufgestellte Hy-

pothese, dass Ätzen nicht der Hauptmechanismus für die beobachteten Effekte des

Komplett-Jets ist, sondern dass die Kombination aus (V)UV Photonen und reaktiven

Spezies auf synergistische Art und Weise, zum Beispiel durch eine chemische Akti-

vierung der reaktiven Partikel durch die (V)UV Photonen, chemische Modifikationen

in DNA einführen kann und damit in der Lage ist, diese zu inaktivieren.

Diese Ergebnisse stellen ein solides Fundament für zukünftige Studien von Effek-

ten in flüssiger und damit komplexerer Umgebung sowohl in vitro als auch in vivo

dar. DNA Schäden können in komplexeren biologischen Proben (bösartige Säuger-

zellen und -gewebe) untersucht werden. Die Verwendung anderer Plasma-Quellen

mit einer erhöhten Varianz reaktiver Spezies und Wechselwirkungen (dielektrische

Barriereentladung, X-Jet in Umgebungsluft) kann systematisch in Betracht gezogen

werden. Des Weiteren kann Chemie in flüssigen Proben analysiert werden.

36

4Konfokale Raman-Mikrospektroskopie

immobilisierter, lebender

Spermatozoen unter

physiologieähnlichen Bedingungen

4.1 Einführung und Motivation

Unfruchtbarkeit betrifft 3% bis 17% der Paare in industrialisierten Ländern und wurde

als öffentliches Gesundheitsproblem von der Weltgesundheitsorganisation (World

Health Organization, WHO) eingestuft [49]. In über 30% der Fälle von Infertilität

wurde der männliche Partner als alleinige oder maßgeblich beitragende Ursache

identifiziert [50]. Ergebnisse aus Studien, die nicht nur exklusiv in entwickelten

Ländern durchgeführt wurden, unterstützen die Theorie, dass aus verschiedensten

Gründen eine Abnahme in männlicher Fruchtbarkeit stattfindet [51]. In einer Studi-

enpopulation von 26609 französischen Männern nahm die Spermienkonzentration

bei Männern für ein Durchschnittsalter von 35 Jahren von 73.6 Millionen Spermien

pro ml 1989 auf einen Wert von 49.9 Millionen Spermien pro ml im Jahr 2005 ab

[52]. Dieser Wert liegt unter dem WHO-Kriterium von 55 Millionen Spermien pro ml

resultierend in verlängerten Zeiten für eine erfolgreiche Befruchtung [53].

38


Abbildung 4.1 zeigt den schematischen Aufbau der männlichen Keimzelle, des

Spermatozoons. Dem flachen, scheibenförmigen Kopfteil mit haploidem Zellkern

(DNA) folgt der Mittelteil, in dem sich die zur Fortbewegung durch die Geissel nötigen

Mitochondrien befinden [54, 55].

KopfMittelteilGeissel

Mitochondrien

Abbildung 4.1: Schematischer Aufbau eines humanen Spermatozoons. Der hochkonden-sierte haploide Zellkern befindet sich im Kopf. An den Mittelteil, der Mit-ochondrien beinhaltet, schließt sich die Geissel an, die der Fortbewegungder Zelle dient.

Zentral für die gesamte Disziplin der Abschätzung männlicher Fruchtbarkeit ist das

Konzept der Verwendung standardisierter Laboranalysen humaner Spermatozoen,

wie die regelmäßig von der WHO herausgegebenen, global eingesetzten Standards,

um den morphologischen Status von Spermatozoen zu beurteilen [53]. Aber nicht

nur konventionelle Parameter wie Spermien-Morphologie, Motilität und Konzentration

müssen betrachtet werden, wenn männliche Fruchtbarkeit quantifiziert wird, sondern

auch biochemische Modifikationen wie fragmentierte nukleäre DNA, gerade wenn

Beides nicht offensichtlich miteinander verknüpft auftaucht. Das bedeutet, dass

Spermien, die zunächst eine „normale“ Morphologie und Motilität wie von den WHO-

Kriterien beschrieben aufweisen, trotzdem nicht in der Lage sein können, eine

Schwangerschaft zu erzielen (Idiopathie) [56].

Während ein Arsenal an Methoden vorhanden ist, unterschiedliche chemische

Eigenschaften von Spermatozoen zu untersuchen, ist keine davon komplett nicht-

invasiv oder nicht-schädigend für die untersuchte Probe, was eine weitere Verwen-

dung der untersuchten Zellen für künstliche Befruchtung (assisted reproductive tech-

nology, ART) augenblicklich ausschließt [57, 58]. Daraus schlussfolgernd wird eine

Methode benötigt, mit der es möglich ist, den biochemischen Status eines einzelnen,

lebenden Spermiums im klinischen Rahmen zu evaluieren, um einen bestmöglichen

Ausgang bezüglich Fruchtbarkeit in ART zu gewährleisten. Dieses Problem wurde

39


kürzlich in zwei Reviews von Sanchez et al. und Jasensky et al. [59–61] beschrieben,

in denen eine Aktualisierung bezüglich des klinischen Wertes, aktuelle Anforde-

rungen und Perspektiven verschiedener Aspekte der Spermien-Analyse adressiert

wurde. Verdeutlicht wurde noch einmal die Notwendigkeit neuartiger bildgebender

Verfahren, um Gameten und Embryos nicht-invasiv für ART selektieren zu können.

Konfokale Raman-Mikrospektroskopie (confocal Raman microspectroscopy, CRM)

ist eine nicht-invasive Methode mit hoher räumlicher Auflösung im Sub-Mikrometer

Regime, die eine chemische Beurteilung kleiner Moleküle, verschiedener Arten

von Zellen und ganzen Geweben ermöglicht. Die Referenzen [62–64] geben eine

gute Übersicht über CRM im Gebiet zellulärer Mikroskopie. Die erste Studie von

Raman-Spektroskopie, die verwendet wurde, um Spermien zu untersuchen kann

in [65] gefunden werden, in dem Kubasek et al. erfolgreich das Raman-Spektrum

aufgereinigter Spermien DNA aus Lachs aufnehmen konnte. Dieser Arbeit folgend,

erschienen mehrere Studien, die die Realisierbarkeit von CRM als wertvolles analyti-

sches Werkzeug für die Untersuchung von Spermatozoen herausarbeiteten.

Huser et al. entfernte Membranen und Geisseln von menschlichen Spermatozoen,

um Unterschiede in den Spektren von Chromatin zu untersuchen [66]. Darauf

folgend konnte Meister et al. [67] den schädlichen Einfluss von UV Photonen auf die

unterschiedlichen Organellen von Spermien in luftgetrockneten Spermien-Schmieren

beobachten. Ebenfalls luftgetrocknete Spermien-Schmiere wurden von Mallidis et al.

analysiert, resultierend in der Fähigkeit UV-bestrahlte Proben von nicht behandelten

Zellen über einen Shift der DNA Phosphat-Rückgrat-Bande von 1095 cm−1 nach

1045 cm−1 zu unterscheiden [68]. Multivariate Analysemethoden wurden angewandt,

um zu zeigen, dass Samenplasma von normalen und abnormalen Spermien mittels

CRM unterschieden werden können [69]. Künstlich induzierte oxidative Schäden

in Spermien sind unter Hinzunahme von Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie

und Durchflusszytometrie durch die Frequenzshifts der Banden im Bereich DNA

Phosphat-Rückgrat elaboriert worden [70]. Multivariate Datenanalyse zusammen

mit einem neuartigen Substrat erlaubte wiederum eine Trennung von normalen und

abnormalen Spermatozoen [71, 72].

Jede der genannten Studien analysierte chemische Schäden an Spermien mit

Raman-Spektroskopie als (luftgetrocknete) Schmiere oder Zellkomponenten-Extrak-

te, was wiederum die Notwendigkeit neuer Routinen und Methoden verdeutlicht, um

einzelne, lebende Spermatozoen unter physiologischen Konditionen nicht-invasiv

chemisch zu evaluieren.

Einzelne, lebende Spermatozoen konnten bisher nicht unter Bedingungen, die

40


für deren Physiologie relevant wären, chemisch evaluiert werden. Ebenfalls unbe-

kannt ist der Einfluss der Laserbestrahlung von Spermatozoen während Raman-

Experimenten mit dafür typischen Parametern.

In dieser Arbeit wurden erfolgreich lebende menschliche Spermatozoen unter

physiologieähnlichen Bedingungen mit CRM chemisch untersucht und eine neue

Methode entwickelt, die eine schnelle Messung einzelner, immobilisierter Spermato-

zoen ermöglicht. Des Weiteren wurde das Risiko bewertet, Spermien der Strahlung

des Anregungslasers während Raman-Messungen auszusetzen.

41

Ergebnisse 4

4.2 Ergebnisse

Bevor in diesem Abschnitt auf die Ergebnisse automatisierter CRM immobilisierter,

lebender Spermatozoen unter physiologieähnlichen Bedingungen eingegangen wird,

folgt zunächst eine Beschreibung wie die im Folgenden gezeigten Bilder aus den

gemessenen hyperspektralen Datensätzen erstellt wurden. Für die Bilderzeugung

wurde die univariate Methode der Summenfilteranalyse angewandt. In der univaria-

ten Analyse wird ein einzelnes Spektrum dafür benutzt, um einen damit verbundenen

Datenpunkt (Pixel) im Bild zu erzeugen. Jedem gemessenen Spektrum in einem

Datensatz wird also ein Pixel im daraus erzeugten Bild zugeordnet [21]. Die hier ver-

wendete Summenfilteranalyse stellt ein Beispiel einer solchen univariaten Methode

zur Bildgebung dar, auf die hier kurz eingegangen werden soll.

Die Summenfilteranalyse basiert auf der Integration der Intensitäten einer spezifi-

schen Bande von Interesse im Raman-Spektrum. Der Summenfilter summiert also

alle Intensitätswerte I(v) im Bereich der Wellenzahlen vn1 und vn1 auf:

Summe =n2

∑i=n1

I(vi) (4.1)

Der Vorteil dieser Art der Analyse ist die Umwandlung multidimensionaler Da-

tensätze zu einem einzigen Ergebnis in Form eines summierten Intensitätswertes.

Durch diese Methode wird also jedes einzelne gemessene Spektrum in einen sum-

mierten Intensitätswert der ausgewählten Schwingungsbande umgewandelt. Wird

diesem Intensitätswert eine Farbe auf einer Farbskala zugewiesen, kann Pixel für

Pixel ein farbkodiertes Bild aus den gemessenen Spektren erstellt werden. Das

Prinzip dieser Art der Datenanalyse ist in Abbildung 4.2 dargestellt.

Abbildung 4.3 (A) zeigt eine optische Aufnahme von mehreren lebenden, im-

mobilisierten Spermatozoen auf CaF2 bei physiologieähnlichen Bedingungen. Die

Spermatozoen weisen eine normale Morphologie auf. Die Raman Bilder in Abb. 4.3

(B) - (S), erstellt durch Summenfilteranalyse, zeigen drei voneinander unterscheidba-

re Bereiche: Die komplette Zelle wurde durch Integration der Intensitäten im Bereich

von verschiedenen Kohlenwasserstoffschwingungen von 2800 cm−1 bis 3000 cm−1

visualisiert (Abb. 4.3 (B) - (G)). Der Kopfteil der Spermatozoen konnte durch Ver-

wendung des Frequenzbereiches von 1090 cm−1 bis 1100 cm−1 dargestellt werden

(Abb. 4.3 (H) - (M)). Das Mittelstück, positioniert direkt hinter dem Kopf, erscheint

bei Verwendung des Summenfilters von 745 cm−1 bis 755 cm−1 (Abb. 4.3 (N) - (S)).

Die Durchschnittsspektren (siehe Gleichung 4.2 verschiedener Bereiche der Zelle

42

Ergebnisse 4

A

B

C

767

0

33

18

0

0

600 1200 1800 2400 3000 3600

Ra

ma

nIn

ten

sitä

t/w

illk

.E

inh

.

rel. Wellenzahl /cm-1

600 1200 1800 2400 3000 3600

Ra

ma

nIn

ten

sitä

t/w

illk

.E

inh

.


600 1200 1800 2400 3000 3600

Ra

ma

nIn

ten

sitä

t/w

illk

.E

inh

.


Abbildung 4.2: Prinzip der Summenfilteranalyse. (A) zeigt Links ein Einzelpunkt-Spektrumaus einem Raman-Spektrendatensatz. In blau ist der Arbeitsbereich desSummenfilters hervorgehoben, also der Bereich in dem in jedem Spektrumdes Datensatzes die Intensitätswerte aufsummiert wurden. Daneben ist dasdaraus entstandene farbkodierte Raman-Bild eines kompletten Spermiumsgezeigt mit der korrespondierenden Farbskala, der die summierten Inten-sitäten in jedem Pixel des Bildes zugewiesen worden sind. (B) zeigt dasErgebnis der Summenfilteranalyse mit einem anderen Arbeitsbereich, derin der Visualisierung einer Struktur im Kopf des Spermiums resultiert. (C)zeigt ein weiteres Beispiel der Aufsummierung der Intensitäten einer Bandemit der sich das Mittelstück der Zelle darstellen lässt.

in Abb. 4.3 (B) ist in Abb. 4.4 dargestellt. Das unten angeordnete Spektrum (schwarze

Linie, Abb. 4.4) zeigt das verwendete CaF2-Substrat mit zwei Raman-Banden bei

320 cm−1 und 640 cm−1. Die intensivste Raman-Bande aus dem „Mittelteil“ der

Zelle, (grünes Spektrum) ist bei 750 cm−1 zu finden. Prominente Banden im darüber

gezeigten Spektrum (rote Linie) („Kopf“ ) aus dem Kopfteil des Spermiums sind

43

Ergebnisse 4

AB

CD

EF

G

HI

JK

LM

NO

PQ

RS

TU

VW

XY

Ab

bild

un

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3:O

ptis

che

Auf

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jede

Zel

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0µ

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10µm

bei3

33nm

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(B)

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H-S

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(280

0cm

−1

bis

3000

cm−

1),

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Kop

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1090

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und

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bis

755

cm−

1).

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nen

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eche

n1

µmin

(B)

-(S

)un

d2

µmin

(T)

-(Y

).

44

Ergebnisse 4

zwei Raman-Banden bei 785 cm−1 und 1095 cm−1. Das Spektrum der verschieden

Kohlenwasserstoffschwingungen in der Zelle (schwarze Linie, Abb. 4.4) zeigt Banden

aller anderen darunter gezeigten Spektren. Tabelle 4.1 zeigt den Vergleich der

Peakpositionen der Raman-Banden dieser Arbeit mit bisherigen Studien.

Tabelle 4.1: Vergleich und Zuordnung charakteristischer Banden im Raman-Spektrum zellu-lärer Komponenten in bisherigen Studien (Ref.) und dieser Arbeit [EE].

Wellenzahl / cm−1 Ref. Zuordnung Wellenzahl /cm−1

2850 - 2950 [73] v(CH), v(CH2), v(CH3) [EE] 2850 - 30001092 ±7 [68] v(PO2), DNA, Kopf [EE] 1095 ±2785 [66] DNA Rückgrat, Kopf [EE] 785 ± 2751 ±2 [67] Mitochondrien, Mittelteil [EE] 750 ±2

750 cm-1

1095 cm-1

2900 cm-1

Wellenzahl /cm-1

400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2850 3000

Ram

an Inte

nsität /w

illk. E

inh.

CH

Kopf

Mittelteil

CaF2

Abbildung 4.4: Durchschnittsspektren der chemischen Bilder aus Abb. 4.3 (B) ver-schiedene CH-Schwingungen (2800 cm−1 bis 3000 cm−1, Kopfregion1090 cm−1 bis 1100 cm−1 und Mittelstück (745 cm−1 bis 755 cm−1) sowieein Spektrum des CaF2-Substrates (schwarz). Schattierungen geben dieArbeitsbereiche der verwendeten Summenfilteranalyse an. Die Spektrensind zum besseren Vergleich auf der Y-Achse gegeneinander versetzt.

Die drei Punkte mit der jeweils höchsten Intensität aus der Summenfilteranalyse

aus den Kopfregionen und aus dem Mittelstück der Zellen in den Teilbildern in Abb.

4.3 (H) - (S) wurden zur weiteren Datenanalyse ausgewählt und sind in Abb. 4.5

45

Ergebnisse 4

gezeigt. Die normalisierten Raman Intensitäten aus der Summenfilteranalyse der

Banden bei 750 cm−1 und 1095 cm−1 in den Kopfregionen (rote Datenpunkte) und

Mittelstücken (schwarze Datenpunkte) sind als Datenpunkte gegeneinander aufge-

tragen. Fehlerbaken repräsentieren den jeweiligen Standardfehler des Mittelwertes.

Die sechs Datenpunkte der Mittelstückregionen deuten bereits darauf hin, dass die

Intensität der Bande bei 750 cm−1 verhältnismäßig höher ist als in den Kopfregionen.

Dieser Trend wurde auf statistische Signifikanz mit einem „Unabhängige Proben

Mann-Whitney“ Test untersucht (Abb. 4.6).

0,00 0,25 0,50

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

Normalisierte Intensitäten @ 1095 cm-1

(willk. Einh.)Norm

alis

iert

e Inte

nsitäte

n @

750 c

m-1

(will

k. E

inh.)

Abbildung 4.5: Normalisierte Intensitäten der Banden bei 750 cm−1 und 1095 cm−1 aus denKopfregionen (rot) in Abb. 4.3 (H) – (M) und aus den Mittelstückregionen(schwarz) in Abb. 4.3 (N) – (S). Jeweils drei normalisierte Mittelwerte mit derhöchsten Intensität aus der Summenfilteranalyse wurden in jedem Teilbildbestimmt, um die Daten als I(750 cm−1) als Y- und I(1095 cm−1) als X-Werte nach Normalisierung darzustellen. Fehlerbalken entsprechen demStandardfehler des jeweiligen Mittelwertes.

Der Unterschied der Raman-Intensitäten der Banden bei 750 cm−1 und 1095 cm−1

aus den Kopfregionen (Abb. 4.3 (B) - (G)), (linke Box) und aus den Mittelstücken

(Abb. 4.3 (N) - (S)) (rechte Box) sind in Abb. 4.6 evaluiert. Die horizontalen Linien

stellen den jeweiligen Median dar, während die Fehlerbalken das 95 % Konfidenzin-

tervall des jeweiligen Medians zeigen. Grau hinterlegt ist der jeweilige Interquartil-

Bereich. Die Sternlinie *** ist P < 0.0001 gleichzusetzen. Der Intensitätsunterschied

|I(750 cm−1) - I(1095 cm-1)| in den Kopfregionen und in den Mittelstücken zeigt

46

Ergebnisse 4

einen signifikanten Unterschied, der durch einen „Unabhängige Proben Mann-

Whitney“ Test berechnet wurde.

0

50

100

150

200

250

Kopf Mittelstück

***|I(7

50

cm

) -

(I(1

09

5cm

)| /

will

k.

Ein

h.

-1-1

Abbildung 4.6: Box Plot der absoluten Werte der Differenz I(750 cm-1) – I(1095 cm−1) ausden Kopfregionen in Abb. 4.3 (B) – (G) (linke Box) und aus den Mittelstück-bereichen Abb. 4.3 (N) – (S) (rechte Box). Horizontale Linien geben denMedianwert an. Fehlerbalken sind repräsentativ für das 95 % Konfidenzin-tervall des jeweiligen Median. Grau hinterlegt ist der jeweilige Interquartil-Bereich. Die Sternlinie *** steht für P < 0.0001 aus dem „UnabhängigeProben Mann-Whitney“ Test.

Abbildung 4.7 zeigt die detektierte Fluoreszenz der selben Spermatozoen an der

gleichen Position, die vorher mit CRM gemessen worden sind mit einer Laserleistung

von 30 mW über einen Zeitraum von 160 s pro Zelle (entsprechend 4.8 J). Die

Fluoreszenz in diesen Zellen nimmt verglichen zu Zellen in der nahen Umgebung, die

keiner Laserstrahlung durch Raman Messungen ausgesetzt worden sind, deutlich ab

(Abb. 4.7 (G) - (I)). Rote Fluoreszenz ausgehend von der Propidiumiodid-Sonde (PI)

nimmt in den Zellen, die dem Laserlicht in den vorhergehenden Raman Experimenten

ausgesetzt worden sind zu (Abb. 4.7 (J) - (L)).

Ähnlich zu Abb. 4.7 zeigt Abb. 4.8 nachfolgende Raman- und Fluoreszenz-

Experimente, jedoch bei der halben Laserleistung von 15 mW ebenfalls für 160 s

(4.8 J). In Abb. 4.8 (A) sind drei lebende, immobilisierte Spermatozoen auf dem

beschichteten CaF2-Substrat gezeigt. Die Raman-Bilder, die als Teilbilder eingefügt

dargestellt sind, zeigen die drei unterschiedlichen Bereiche, die zuvor auch in Abb.

47

Ergebnisse 4

A B C

D E F G H I J K L

Abbildung 4.7: Detektierte Fluoreszenzsignale der selben Spermien an der selben Positionnach Laserbestrahlung mit 30 mW. (A) Optisches Bild, das immobilisierteSpermien zeigt (Sichtfeld zum Vergleich zu Abb. 5.5). Vierecke in rot, grünund blau geben die Messbereiche an, in denen automatisierte CRM von ein-zelnen Spermien mit einer Laserleistung von 30 mW durchgeführt wordensind. (B) Spermien mit intakter Membran fluoreszieren hellgrün. (C) Zellenmit beschädigter Zellmembran fluoreszieren rot. (D) - (F) Digitale Zoomsder drei Spermatozoen von Interesse aus (A). (G) - (I) Digitale Zooms derSpermatozoen von Interesse aus (B). Das detektierte Fluoreszenzsignalder drei Spermien, die Laserstrahlung aus CRM ausgesetzt worden sind, istdeutlich geringer verglichen mit den Zellen in der Umgebung, die keinem La-serlicht ausgesetzt wurden. (J) - (L) Digitale Zooms der Spermatozoen vonInteresse aus (C). Rote Fluoreszenz konnte für die Spermien detektiert wer-den, die vorher mit CRM gemessen und damit Laserstrahlung ausgesetztworden sind.

4.3 gefunden worden sind (von links nach rechts: gesamte Zelle, Kopfregion und

Mittelstück). In Abb. 4.8 (B) ist ein ähnliches Sichtfeld dargestellt wie in Abb. 4.8 (A),

aufgenommen mit dem verwendeten Fluoreszenz-Mikroskop. Abb. 4.8 (C) zeigt das

SYBR-14 Fluoreszenzsignal in dem Bereich der Spermatozoen, der vorher schon

mit CRM gemessen worden ist (1), neben anderen Zellen (2),(3), die vorher nicht

durch Laserstrahlung aus CRM chemisch untersucht worden sind. Abb. 4.8 (D) zeigt

keine Fluoreszenz der PI-Sonde.

In Abb. 4.9 sind die farbkodierten Raman Bilder von 35 einzelnen Spermatozoen

gezeigt, die vollständig automatisiert gemessen worden sind. Die Farbskala ent-

spricht jener aus Abbildung 4.3. Jedes Teilbild einer Zelle ist aus 400 Datenpunkten,

die einzelnen Raman-Spektren entsprechen, zusammengesetzt. Die Geometrie der

Bilder beträgt dabei 13 µm x 13 µm mit einer Messzeit pro Spektrum von 0.15 s.

Diese Parameter resultieren in einem Durchsatz von ungefähr einer Zelle und einem

chemischen Bild pro 60 s mit einer lateralen Auflösung von 650 nm pro Pixel.

Um das erzielte Signal-zu-Rausch Verhältnis in jedem Teilbild von Abb. 4.9 zu

berechnen, wurde zunächst für jedes Teilbild der Punkt mit der höchsten Intensität

aus der Summenfilteranalyse für die Kohlenwasserstoffschwingungen bestimmt. In

48

Ergebnisse 4

A B C D

1

2

3

1

23

Abbildung 4.8: Raman-chemische Bilder und detektierte Fluoreszenz aus SYBR 14 undPI des selben Spermiums an der selben Position. (A) Optisches Bild,das immobilisierte Zellen darstellt. Viereck in Grün gibt den Messbereichan, in dem eine automatisierte CRM Messung mit einer Laserleistungvon 15 mW durchgeführt worden ist. Teilbilder sind die Raman chemi-schen Bilder rekonstruiert aus Summenfilteranalyse der Zelle markiertin (A) mit (1). Von links nach Rechts: Verschiedene CH-Schwingungen(2800 cm−1 bis 3000 cm−1), Kopfregion (1090 cm−1 bis 1100 cm−1) unddem Mittelstück (745 cm−1 bis 755 cm−1). Maßstabsbalken sind 2 µm. (C)Detektierte Fluoreszenz von SYBR-14. Das Spermatozoon (1), welchesvorher mit CRM gemessen worden ist erscheint als heller Punkt nebenanderen Zellen in der Umgebung (2),(3) die nicht vorher Laserstrahlung ausCRM Messungen ausgesetzt worden sind. (D) Kein Fluoreszenzsignal derPI-Sonde wurde detektiert.

jedem der so erhaltenen Raman-Spektren wurde daraufhin das Signal-zu-Rausch

(signal to noise, S/N) Verhältnis über Gleichung 4.2 berechnet. Die gemittelte In-

tensität in jedem Spektrum bei vB (spektraler Bereich ohne Signale, entsprechend

dem Hintergrundsignal, 2597 cm−1 bis 2603 cm−1) wurde dafür von der gemittelten

Intensität bei vCH (Kohlenwasserstoffbande, 2937 cm−1 bis 2943 cm−1) abgezogen

und durch das „Rauschen“ SB dividiert:

S/N =I(vCH)− I(vB)

SB(4.2)

mit

SB =

√1

N−1

N

∑i=1

(I(vi)− IB)2 (4.3)

und

IB =1N

N

∑i=1

I(vi) (4.4)

wobei vi zwischen 2597 cm−1 bis 2603 cm−1 variiert.

Abbildung 4.10 zeigt das S/N für jedes Teilbild in Abb. 4.9 und zeigt, dass das S/N

in einer laufenden automatisierten Messung von Teilbild zu Teilbild um einen Faktor

bis zu 2 schwanken kann.

Dieser Effekt wurde in mehreren unabhängigen automatisierten Messungen be-

49

Ergebnisse 4

Abbildung 4.9: Farbkodierte Raman-Bilder von 35 individuellen, lebenden Sperma-tozoen bei physiologieähnlichen Bedingungen, die vollständig auto-matisiert gemessen und per Summenfilteranalyse rekonstruiert wor-den sind. Blaue Farbskala entspricht den verschiedenen Kohlenwas-serstoffschwingungen (2800 cm−1 bis 3000 cm−1), grün den Mittel-stückbereichen (745 cm−1 bis 755 cm−1) sowie rot den Kopfregionen(1090 cm−1 bis 1100 cm−1). Die gezeigten Maßstabsbalken entsprechen2 µm. Geometrie: 13 µm x 13 µm, 20 Punkte pro Linie, 20 Linien pro Bild,0.15 s Messzeit pro Spektrum, 15 mW Laserleistung. Gesamtmesszeit proZelle mit Hintergrund: 60 s.

50

Ergebnisse 4

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36

0

50

100

150S

ign

al-

zu

-Ra

usch

/will

k.E

inh

.

Laufende # der Probe in einer automatisierten Messung

Abbildung 4.10: S/N für jedes Teilbild in Abb. 4.9 aufgetragen gegen die laufende Nummerder Zelle.

obachtet und soll anhand von Abb. 4.11 erläutert werden. Die Teilbilder 15 bis 17

erscheinen in einem schlechten S/N (hohes Hintergrundsignal in blau), in denen

nur in Teilbild 17 Mitochondrien aufgelöst werden konnten. Nach Abbruch des au-

tomatisierten Scans nach Zelle 17 und manueller Refokussierung des Mikroskops

in z-Richtung in die Probe erscheinen die Teilbilder 18 bis 20 wieder in drastisch

verbessertem S/N mit klarer Abgrenzung von Zelle, Mitochondrien und DNA vor

einem gleichmäßig dunklen Hintergrund.

15 16 17 18 19 20

Manuelle Refokussierung

Abbildung 4.11: Die letzten sechs farbkodierten Teilbilder einer automatisierten Messungimmobilisierter Spermatozoen. Nach Zelle 17 wurde das Mikroskop manu-ell in z-Richtung in die Probe refokussiert.

Im Kontrollexperiment wurden, wie in Kapitel 2 beschrieben, Spermatozoen per

Percoll Dichtegradientenzentrifugation aufgereinigt und auf dem CaF2 Substrat

immobilisiert. Statt die Zellen einer Laserstrahlung durch Raman-Messungen aus-

51

Ergebnisse 4

zusetzen wurden die Spermatozoen für 4 h bei 35 ◦C temperiert und anschließend

analog zu den bereits gezeigten Zellen in Abb. 4.7 und Abb. 4.8 einem Viabilitätstest

per LIVE/DEAD Sperm Viability Kit unterzogen. In Abb. 4.12 ist das Ergebnis in zwei

Teilbildern dargestellt. Abbildung 4.12 (A) zeigt die SYBR-14 Fluoreszenz nach 4 h

Lagerung bei 35 ◦C, während Teilabbildung (B) die Fluoreszenz der PI-Sonde zeigt.

In Teilabbildung (A) ist ein Fluoreszenz-Signal zu erkennen, während in Teilabbildung

(B) kein Fluoreszenz-Signal der PI-Sonde detektiert werden konnte.

A B

Abbildung 4.12: Detektierte SYBR-14 und PI Fluoreszenzsignale von Spermatozoen nachPercoll-Dichtegradienten-Zentrifugation, Immobilisierung und Lagerung für4 h bei 35 ◦C. (A) Fluoreszenzsignal des SYBR-14/DNA Komplexes zeigtmehrere helle Punkte. (B) Ein Fluoreszenz-Signal des PI/SYYBR-14/DNAKomplexes wurde nicht detektiert.

Im zweiten Kontrollversuch wurde die Motilität der Geissel der zu immobilisie-

renden Spermatozoen bei verschiedenen Zeitpunkten nach Transfer auf das CaF2

Substrat beobachtet. Abb. 4.13 zeigt die Position der Geissel zum Zeitpunkt t = 0 s

kurz nach Transfer auf das CaF2 Substrat. Während der Kopf sofort immobilisert ist,

variiert die Position der Geissel in einer Zeitskala von Sekunden bis zur kompletten

Immobilisierung.

52

Ergebnisse 4

t =

0 s

t =

1 s

t =

2 s

t =

3 s

t =

4 s

Ab

bild

un

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13:

Opt

isch

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Auf

brin

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aufd

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ubst

rat.

53


4.3 Diskussion und Ausblick

Die hyperspektralen Datensätze, die verwendet wurden, um die chemischen Bilder

in Abb. 4.3 durch Summenfilteranalyse zu erzeugen zeigen mehrere prominente

Banden unterschiedlicher chemischer Spezies (siehe Durchschnitts-Spektren in Abb.

4.4). Die Spektren, die in den Kopfregionen in Abb. 4.3 (H) - (M) aufgenommen

worden sind, zeigen Banden, die durch Vibrationen des DNA Phosphat Rückgrates

entstehen (1095 cm−1 [41]). Eine Bande bei 750 cm−1 kann sowohl im Mittelstück

als auch in den Kopfregionen der untersuchten lebenden Zellen gefunden werden

(Abb. 4.3 (N) - (S)).

Um zu evaluieren, ob die in dieser Arbeit verwendete Summenfilteranalyse in der

Lage ist eine mögliche Ambiguität mit statistischer Signifikanz aufzulösen, wurden

in jeder Region in jedem Teilbild die drei Pixel mit der höchsten Intensität der

Bande bei 750 cm−1 bzw. bei 1095 cm−1 ausgewählt. Werden die normalisierten

Intensitäten beider Banden in den Kopf- und in den Mittelstückregionen miteinander

verglichen, indem sie gegeneinander aufgetragen werden, ist bereits deutlich, dass

die Intensität der Bande bei 750 cm−1 verglichen zu der Bande bei 1095 cm−1 höher

in den Mittelstückbereichen ist als in den Kopfregionen (Abb. 4.5).

Dieser beobachtete Unterschied wurde auf statistische Signifikanz untersucht,

indem die absoluten Werte von I(750 cm−1) - I(1095 cm−1) in den Kopf- und Mit-

telstückbereichen in Abb. 4.3 (H) - (S) berechnet und über einen „Unabhängige

Proben Mann-Whitney“ Test miteinander verglichen wurden. Die Ergebnisse, die

in dem Box-Whisker Plot in Abb. 4.6 dargestellt sind, zeigen mit einer statistischen

Signifikanz von P < 0.0001, dass die Peak-zu-Peak Intensitätsdifferenz beider Ban-

den zu Gunsten der Bande bei 750 cm−1 höher in den Mittelstückbereichen ist, als

in den Kopfregionen der untersuchten Zellen. Als Schlussfolgerung dieses Ergeb-

nisses kann angenommen werden, dass obwohl die Bande bei 750 cm−1 sowohl

in den Spektren der Kopf- als auch der Mittelstücke der Spermatozoen gefunden

werden kann, der Ursprung der Bande von vollständig unterschiedlichen chemi-

schen Strukturen herrühren muss, die in den beiden untersuchten Bereichen der

Spermatozoen auftauchen. Die Bande bei 750 cm−1 wird folglich in dieser Arbeit

mitochondrialem Cytochrom c zugeordnet, während der Ursprung der Bande in den

Kopfbereichen der Nukleobase Thymin zugewiesen wird [41]. Diese Zuweisung ist

in guter Übereinstimmung mit früheren Studien, in denen CRM verwendet wurde,

um mitochondriale Cytochome zu untersuchen, zum Beispiel in HeLa-Zellen oder

Kardiomyozyten ([74, 75]). Die in dieser Arbeit verwendete Summenfilteranalyse

54


erlaubt die Visualisierung von Mitochondrien über die Integration der Bande bei

750 cm−1 in einer automatisierten Routine mit statistischer Signifikanz.

Spermatozoen inklusive ihrer DNA und der enthaltenen Mitochondrien können

mit CRM bei physiologieähnlichen Bedingungen per Summenfilteranalyse visuali-

siert werden. Der folgende Abschnitt behandelt die Diskussion möglicher negativer

Folgen, Spermatozoen Laserlicht in Raman-Messungen auszusetzen, zum Beispiel

Membranschädigungen oder nukleäre DNA Fragmentierung.

Viabilität und damit Fruchtbarkeit von Spermatozoen wurde per LIVE/DEAD Sperm

Viability Kit direkt im Anschluss an Raman-Messungen untersucht. Grundsätzlich

sind die Spermatozoenmembranen durchlässig für den Fluoreszenzfarbstoff SYBR-

14, was in einem detektierbaren (grünen) Fluoreszenzsignal in unbeschädigten

Zellen resultiert. Die Zugabe von PI führt zu drastisch reduzierter Fluoreszenz von

SYBR-14 in beschädigten Zellen, was letztlich zu einem rotorangenen Fluoreszenzsi-

gnal führt. PI ist in der Lage nur in Spermatozoen einzudringen, deren Zellmembran

beschädigt ist und formt dort einen SYBR-14/PI/DNA-Komplex und quencht dadurch

per Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer die Fluoreszenz des SYBR-14 ([76]).

Die Ergebnisse in Abb. 4.7 zeigen, dass eine Laserleistung von 30 mW in Verbin-

dung mit Messzeiten von 160 s pro Zelle bereits zu Schäden in der Zellmembran

führt. Dies ist durch die rote Fluoreszenz, detektiert in Abb. 4.7 (J) - (L) in den Zellen

illustriert, die Laserstrahlung während einer Raman-Messung mit einer Leistung von

30 mW ausgesetzt waren.

CRM-Experimente sind daher mit einer geringeren Laserleistung von 15 mW

wiederholt worden (Abb. 4.8). Die Fluoreszenz von SYBR-14 (s. Abb. 4.8 (C))

zeigt, dass die Raman-Messung keine schädliche Wirkung durch Bestrahlung der

Zellen mit Laserlicht zur Folge hatte. Dies ist weiter durch die Kontrolle des nicht

vorhandenen Fluoreszenz-Signals der PI-Sonde in Abb. 4.8 (D) unterstützt.

Der Diskussion folgend, wie chemische Bilder von einzelnen, lebenden Spermato-

zoen mit CRM unter Verwendung von 15 mW auf eine nicht-invasive Art und Weise

unter physiologieähnlichen Bedingungen gewonnen werden können, behandelt der

abschließende Teil der vorliegenden Arbeit die Optimierung der automatisierten Mes-

sungen. Chemische Bilder von 35 einzelnen, immobilisierten Spermatozoen wurden

über eine automatisierte Messmethode erstellt (Abb. 4.9). Die dafür verwendete

Summenfilteranalyse läuft dabei in Echtzeit während der Messungen. In mehreren

automatisierten Messungen wurden Variationen des S/N Verhältnisses beobachtet

und manuell durch Anpassen der z-Position des Raman-Mikroskops verbessert, da

so eine mögliche Schieflage des CaF2 korrigiert wurde. Während die chemische

55


Komposition (verschiedene Kohlenhydrate, DNA, Cytochrom c in Mitochondrien)

generell mit einem guten Signal-zu-Rausch-Verhältnis visualisiert werden konnte,

konnten DNA und Mitochondrien in zwei Fällen nicht aufgelöst werden (Abb. 4.9,

Zelle Nummer 27 und Nummer 32). Dies kann dadurch erklärt werden, dass die

Zellen in diesen Fällen nicht in der gleichen Position in z-Richtung lagen, was zu

einer Verschlechterung des Signal-zu-Rausch Verhältnisses führt, da ein konfokales

Mikroskopiesystem für die automatisierte Messung verwendet wurde. Dies ist ferner

mit dem schwankenden S/N in einer Anzahl von 35 automatisiert gemessenen

Spermatozoen in Abb.4.10 dargestellt. Es wurde zusätzlich nachgewiesen, dass die

z-Fokussierung Ursache der Verschlechterung des S/N ist, indem eine automatische

Messung vor Messungen der letzten drei Spermatozoen unterbrochen wurde, und

manuell in z-Richtung optimiert wurde, bevor die letzten drei Spermatozoen gemes-

sen wurden. Eine deutliche Verbesserung im S/N wurde für die letzten drei Zellen

erreicht, erkennbar im gleichmäßig dunklen Hintergrund und guten Kontrast (s. Abb.

4.11). Dies kann in zukünftigen Studien dadurch vermieden verwenden, dass ein

„automatischer Fokus“ in die Routine aufgenommen wird, der in einer Zeitskala von

ms pro untersuchter Zelle durchgeführt werden kann. Hierbei wird die integrierte

Intensität einer frei wählbaren Bande im Raman-Spektrum in 50 äquidistanten Punk-

ten der Probe in z-Richtung gemessen. Das Mikroskop wird daraufhin automatisch

zu der z-Position gefahren, in der das maximale Signal der integrierten Intensität

gefunden worden ist.

Die vorliegende Arbeit zeigt zum ersten mal, wie die selben lebenden Spermato-

zoen mit automatisierter CRM unter physiologieähnlichen Bedingungen chemisch

untersucht und anschließend mit Fluoreszenz-Mikroskopie die nicht-invasive Natur

der CRM Messungen validiert wurde. Die hier gezeigte neuartige Kombination von

Substrat und Beschichtung ermöglichte die automatisierte Messung einzelner Zellen

in einer Zeitskala von ca. 60 s pro Zelle. Diese Ergebnisse ermöglichen es in zukünf-

tigen Studien eine Vielfalt an unterschiedlichen Parametern bei physiologieähnlichen

Bedingungen zu untersuchen, zum Beispiel den Einfluss oxidativen Schadens, der

Bestrahlung mit UV Photonen oder einer bakteriellen Infektion auf die nukleäre DNA

von lebenden Spermatozoen. Des Weiteren zeigt die hier vorgestellte Methode das

Potential, um nach weiterer stringenter Evaluierung in eine Routine eingearbeitet zu

werden, die nicht-invasiv individuelle, chemisch unbeschädigte Spermatozoen für

die ART auswählt.

56

5Anwendungen konfokaler

Raman-Spektroskopie

Dieses Kapitel beschreibt die Anwendung konfokaler Raman-Spektroskopie im

Rahmen interdisziplinärer Forschung anhand zweier Beispiele aus dem Bereich

anorganischer Chemie. Für Raman-Spektroskopie ist von besonderer Bedeutung

geeignete Substrate auszuwählen, um die Zuordnung von Raman-Banden zu er-

möglichen. Dies ist hier im ersten Beispiel anhand der Substrate Silizium und Glas

gezeigt (vgl. auch Kap. 4, CaF2 als besonders geeignetes Substrat für biologische

Proben). Schichtdicken der untersuchten Dünnschichten von (100±10) nm reichen

bereits für die Detektion von Raman-Banden aus, verglichen zum Beispiel mit den

in Kapitel 4 diskutierten Geisseln menschlicher Spermatozoen mit einem typischen

Durchmesser von 500 nm.

Der Einbau eines Peltier-Thermostats PE 120 (Linkam, Surrey, England) in das

konfokale Raman-Mikrospektroskop erlaubte temperaturabhängige in-situ Mes-

sungen des Hybridmaterials aus Koordinationspolymer und ionischer Flüssigkeit

(C4C1py)[Cu(SCN)2] als Feststoff und Schmelze. Die hier gezeigten Beiträge sind in

[13] und [14] publiziert und zeigen wie die in Tabelle 1.1 genannten Eigenschaften

mit Hilfe konfokaler Raman-Spektroskopie chemisch untersucht und identifiziert

werden können.

58

Konfokale Raman-Spektroskopie von TiO2-Dünnschichten 5

5.1 Konfokale Raman-Spektroskopie von TiO2-

Dünnschichten

„Titandioxid (TiO2)-Dünnschichten sind wegen der hohen Dielektrizitätskonstan-

te von bis zu 100 von großem technologischen Interesse in Anwendungen als

Transistor“[13]. Die Dielektrizitätskonstante von TiO2 ist stark abhängig davon, ob

die Dünnschicht in amorpher oder kristalliner Form vorliegt.

Daher wird in diesem Abschnitt auf konfokale Raman-Spektroskopie zur Bestim-

mung der Kristallinität von per Plasma-unterstützer Atomlagenabscheidung herge-

stellten TiO2-Dünnschichten eingegangen. Die hier gezeigten Messungen sollten

der Identifikation einer möglichen polykristallinen Phase nach Wärmebehandlung

der Dünnschichten (annealing) von 500 ◦C für 3 h dienen. Die Schichtdicke der

untersuchten Dünnschichten betrug (100±10) nm.

Abbildung 5.1 zeigt Einzelpunkt Raman-Spektren des Silizium-Substrats (blaue

linie), der abgeschiedenen Dünnschicht (grüne Linie) sowie der bei 500 ◦C für 3 h

wärmebehandelten Dünnschicht (rote Linie).

0 100 200 300 400 500 600 700 800

Ra

ma

nin

ten

sitä

t /w

illk.

Ein

h.

Wellenzahl /cm-1

500 °C WB

abgesch.

Silizium

194 A(Eg)

397 A(B1g)

636 A(Eg)

Abbildung 5.1: Raman-Spektren von Silizium und TiO2-Dünnschichten auf Silizium. BlaueLinie: Spektrum von Silizium, grüne Linie: Abgeschiedene Dünnschichtauf Silizium, rote Linie: Wärmbehandelte Dünnschicht. Gesamtintegrations-zeit: 60 s (24 Wiederholungen je 2.5 s, 12 mW, Anregungswellenlänge λ =488 nm).

Sowohl im Spektrum des Silizium-Substrats als auch im Spektrum des abgeschie-

59

Konfokale Raman-Spektroskopie von TiO2-Dünnschichten 5

denen Dünnfilms sind keine der Raman-Banden einer Anatas-Phase zu erkennen.

Im Spektrum der wärmebehandelten Dünnschicht sind drei Raman-Banden bei

194 cm−1, 397 cm−1 und 636 cm−1 zu erkennen, die den Anatas-Moden A(Eg),

A(B1g) und A(Eg) zugeordnet werden können [77].

In Abb. 5.2 ist als Substrat Glas gewählt worden. Dargestellt sind die Einzelpunkt

Raman-Spektren des Substrats (blaue Linie), der abgeschiedenen Dünnschicht

(grüne Linie) sowie der bei 500 ◦C für 3 h wärmebehandelten Dünnschicht (rote

Linie).

0 100 200 300 400 500 600 700 800

Ra

ma

nin

ten

sitä

t/w

illk.E

inh

.

abgesch.

Glass

Wellenzahl /cm-1

500 °C WB

397 A(B1g) 519 A

639 A(Eg)

Abbildung 5.2: Raman-Spektren von Glas und TiO2-Dünnschichten auf Glas. Blaue Linie:Spektrum von Glas, grüne Linie: Abgeschiedene Dünnschicht auf Glas, roteLinie: Wärmbehandelte Dünnschicht. Gesamtintegrationszeit: 60 s (24 Wie-derholungen je 2.5 s, 12 mW, Anregungswellenlänge λ = 488 nm). Spek-tren sind auf der Y-Achse gegeneinander versetzt.

In den Spektren des Glas-Substrats und der abgeschiedenen Dünnschicht sind

keine Banden der Anatas-Phase sichtbar. Im Spektrum der wärmebehandelten

Dünnschicht sind dagegen Raman-Banden bei 397 cm−1, 519 cm−1 und 636 cm−1

zu erkennen. Bei Verwendung des Glas-Substrats (Abb. 5.2) konnte eine Raman-

Bande bei 519 cm−1 identifiziert werden, die bei einem Si-Substrat durch die in-

tensive Bande bei 521 cm−1 von Silizium überdeckt war. Die Bande bei 519 cm−1

kann ebenfalls einer Raman-Bande der Anatas-Phase zugewiesen werden. Raman-

Banden der Rutil-Phase konnten in den Spektren in Abb. 5.1 und Abb. 5.2 nicht

detektiert werden. Dies lässt darauf schließen, dass die Wärmebehandlung der

Dünnschichten zur Bildung einer reinen Anatas-Phase geführt hat, die in der Regel

unter 600 ◦C gebildet wird [78].

60

Temperaturabhängige Raman-Spektroskopie von(C4C1py)[Cu(SCN)2] 5

5.2 Temperaturabhängige Raman-Spektroskopie von

(C4C1py)[Cu(SCN)2]

„(C4C1py)[Cu(SCN)2] ((C4C1py)=1-Butyl-4-methyl-pyridinium) stellt ein Hybridma-

terial aus Koordinationspolymer und ionischer Flüssigkeit dar, deren Einsatz zum

Beispiel als lumineszenter molekularer Draht eine Rolle spielt“ [14]. Lumineszenz

bezeichnet den Überbegriff aller Prozesse, bei denen Photonen emittiert werden als

Resultat einer Relaxation eines Systems von einem elektronisch angeregten in den

elektronischen Grundzustand (s. Abb. 1.4). Die Lumineszenz des hier vorgestellten

Hybrid-Materials ist stark abhängig von der Temperatur und der damit verbundenen

vorliegenden Struktur von (C4C1py)[Cu(SCN)4]. Konfokale Raman-Spektroskopie

wurde daher über Messungen bei verschiedenen Temperaturen zur Aufklärung der

jeweils vorliegenden Strukturen verwendet.

Die Abbildungen 5.3 und 5.4 zeigen Raman-Spektren von (C4C1py)[Cu(SCN)4] bei

verschiedenen Temperaturen und unter Verwendung der Anregungswellenlängen

von 488 nm und 785 nm.

1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 3250 3500

100 °C - 488 nm

10 °C - 488 nmRa

ma

nin

ten

sitä

t/w

illk

.E

inh

.

Wellenzahl /cm-1

2097

Abbildung 5.3: Raman-Spektren von (C4C1py)[Cu(SCN)2]. Blaue Linie: In-situ-Messung bei10 ◦C, rote Linie: In-situ-Messung bei 100 ◦C. Gestrichelte vertikale Linie:Raman-Bande bei 2097 cm−1. Gesamtintegrationszeit: 60 s (24 Wiederho-lungen je 2.5 s, 25 mW, Anregungswellenlänge λ = 488 nm). Spektren sindauf der Y-Achse gegeneinander versetzt.

Um physikochemische Eigenschaften von Feststoffen und Schmelzen untersu-

chen zu können wurden in-situ unterschiedliche Temperaturen von 10 ◦C und 100 ◦C

bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm sowie 20 ◦C und 100 ◦C bei einer An-

61

Temperaturabhängige Raman-Spektroskopie von(C4C1py)[Cu(SCN)2] 5

300 600 900 1200 1500 1800

Ra

ma

nin

ten

sitä

t/w

illk

.E

inh

.

Wellenzahl /cm-1

100 °C - 785 nm

20 °C - 785 nm

758

Abbildung 5.4: Raman-Spektren von (C4C1py)[Cu(SCN)2]. Blaue Linie: In-situ-Messung bei20 ◦C, rote Linie: In-situ-Messung bei 100 ◦C. Gestrichelte vertikale Liniemarkiert Banden, deren Lage in beiden Spektren übereinstimmt. Gesam-tintegrationszeit: 60 s (24 Wiederholungen je 2.5 s, 100 mW, Anregungs-wellenlänge λ = 785 nm). Spektren sind auf der Y-Achse gegeneinanderversetzt.

regungswellenlänge von 785 nm verwendet. Abb. 5.3 zeigt die Spektren bei 10 ◦C

und 100 ◦C bei 488 nm Anregungswellenlänge. Die intensivste Bande ist in bei-

den Spektren bei 2097 cm−1 zu erkennen, die ν(CN) zugeordnet wurde [79, 80].

Aufheizen in-situ von 10 ◦C auf 100 ◦C geht mit einer Verbreiterung dieser Bande

einher, sowie einer zusätzlich beobachtbaren Bande bei 2800 cm−1, die verschiede-

nen ν(CH) Schwingungen zugewiesen wurde [81]. Während die Banden-Form bei

2097 cm−1 und 10 ◦C eher einem Lorentz-Profil entspricht, ist die Bande bei 100 ◦C

eher Gauß-förmig.

Die Bande bei 2097 cm−1 ist mit der Konfiguration des Raman-Mikrospektroskops

für 785 nm Anregungswellenlänge nur schwach detektierbar (Abb. 5.4). Das Spek-

trum aufgenommen bei 20 ◦C zeigt neben anderen Banden eine intensive Bande

bei 758 cm−1, die durch ν(CS) Schwingungen entsteht [82]. Der Vergleich mit den

Banden im Raman-Spektrum aufgenommen bei 100 ◦C zeigt, dass die meisten

Banden in guter Übereinstimmung mit dem Spektrum bei 20 ◦C liegen. Nur die

Bande bei 758 cm−1 verliert stark an Intensität.

Die in Abb. 5.3 gezeigte Linienverbreiterung der Bande bei 2097 cm−1 nach

Aufheizen der Probe in-situ von 10 ◦C zu 100 ◦C deutet „bei Schmelzen auf das

Entstehen langer, poly-anionischer Fragmente statt eines kompletten Bruchs in

Dimere und Monomere“ hin [14].

62

Anhang

Abbildung 5.5: Optisches Bild aufgenommen mit dem konfokalen Raman-Mikroskop zeigteinzelne, immobilisierte, lebende Spermatozoen (Vergleich mit Abb. 4.7).Blaue, rote und grüne Vierecke geben Bereiche an, in denen automatisierteCRM Messungen durchgeführt worden sind mit einer Laserleistung von30 mW.

64

6Abbildungs- & Tabellenverzeichnis

66

Abbildungsverzeichnis

1.1 Erläuterung des Raman Effekts (- - - steht für ein virtuelles Energieni-

veau). Adaptiert nach [3]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.2 Schematisches Raman-Spektrum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

1.3 Schematischer Aufbau und Strahlengang eines Konfokalmikroskops.

Adaptiert nach [6]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.4 Prinzip der Anregung und Emission der Fluoreszenz. Adaptiert aus [27]. 11

1.5 Schematischer Aufbau von DNA, dargestellt im Solvens Wasser (ro-

te Punkte): Die beiden aüßeren Bänder symbolisieren die beiden

Zucker-Phosphat Rückgrate, während die davon horizontal abgehen-

den Stufen Basenpaare darstellen, die die Stränge über Wasserstoff-

brückenbindungen zusammenhalten. Struktur aus PDB-Eintrag 1BNA

[32]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

2.1 Schematischer Aufbau des Raman-Mikroskops alpha300R (WITec,

Ulm). Der Strahlengang ist in grün angedeutet. Adaptiert nach [6]. . . 17

3.1 Schema der drei µAPPJs, die in dieser Arbeit verwendet wurden, um

das Bio-Makromolekül DNA zu behandeln. Entnommen aus [38]. . . 24

3.2 Raman-Spektren behandelter und unbehandelter dA18 DNA Oligo-

mere. cNB: gekoppelte Nukleobasen, r-v(PO2): Referenzbande aus

dem Phosphat-Rückgrat, bb: Desoxyribose-Rückgrat, A1 - A4: Adenin

spezifisch. Jedes gezeigte Spektrum wurde durch 24 Wiederholungen

für je 2.5 s generiert (Gesamtintegrationszeit: 60 s, Anregungswel-

lenlänge λ = 785 nm). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

67

3.3 Raman-Spektren behandelter und unbehandelter dT18 DNA Homo-

Oligomere. cNB: gekoppelte Nukleobasen, r-v(PO2): Referenzban-

de aus dem Phosphat-Rückgrat, bb: Desoxyribose-Rückgrat, T1 -

T4: Thymin spezifisch. Jedes gezeigte Spektrum wurde durch 24

Wiederholungen für je 2.5 s generiert (Gesamtintegrationszeit: 60 s,

Anregungswellenlänge λ = 785 nm). . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

3.4 Ramanspektren behandelter und unbehandelter dC18 DNA Homo-


de aus dem Phosphat-Rückgrat, bb: Desoxyribose-Rückgrat, C1 -

C3: Cytosin spezifisch. Jedes gezeigte Spektrum wurde durch 24



3.5 Ramanspektren behandelter und unbehandelter dG18 DNA Homo-


de aus dem Phosphat-Rückgrat, bb: Desoxyribose-Rückgrat, G1 -

G3: Guanin spezifisch. Jedes gezeigte Spektrum wurde durch 24



3.6 Ein Sterndiagramm bildet das Integral (algebraische Summe der Tra-

peze, Glg. 3.1) von 300 cm−1 bis 1800 cm−1 ab. Auf jeder Achse sind

die Werte der Integrale der Spektren nach Behandlung mit Helium-

Gas (Kontrolle) oder einem der drei Jets aufgetragen. Die Symbole

repräsentieren dabei die vier DNA Einzelstrang Homo-Oligomere

(dA18, dT18, dG18, dC18). Die Werte der Integrale der Kontrollspektren

wurden auf 1 normiert. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

3.7 Ein Sterndiagramm bildet I(cNB)/I(v(PO2)) ab. Auf jeder Achse ist

I(cNB)/I(v(PO2)) nach Behandlung entweder mit Helium-Gas (Kontrol-

le) oder einem der drei Jets aufgetragen. Die Symbole repräsentieren

dabei die vier DNA Einzelstrang Homo-Oligomere (dA18, dT18, dG18,

dC18). Um einen besseren Vergleich der Änderungen nach Behand-

lung mit einem der drei Jets zu gewährleisten wurde I(cNB)/I(v(PO2))

der Kontrollspektren ebenfalls auf 1 normiert. . . . . . . . . . . . . . 31

68

3.8 Normalisierte Raman-Spektren behandelter und unbehandelter dop-

pelsträngiger dA18:dT18 DNA. A1, A14, T1 bis T3: Nukleobasen spe-

zifisch (Annotation entnommen aus Abb.3.9), cNB: gekoppelte Nu-

kleobasen, r-v(PO2): Referenz-Bande aus dem Phosphat-Rückgrat,

bb: Desoxyribose-Rückgrat. Das Kontroll- und Komplett-Jet-Spektrum

wurde generiert durch 24 Wiederholungen bei je 2.5 s (Gesamtinte-

grationszeit: 60 s, Anregungswellenlänge λ = 785 nm). Das Differenz-

Spektrum (unten) der doppelsträngigen dA18:dT18 DNA behandelt

mit dem Komplett-Jet und der unbehandelten dA18:dT18 DNA zeigt

hauptsächlich Rauschbeiträge. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

3.9 Raman-Spektren von behandelten und unbehandelten Einzelstrang

DNA Homo-Oligomeren. cNB: gekoppelte Nukleobasen, r-v(PO2):

Referenz-Bande aus dem Phosphat-Rückgrat, bb: Desoxyribose-

Rückgrat, (A) dA18 1 - A4: Adenin (B) dT18: T1 - T4: Thymin (C) dC18:

Cytosin (D) dG18 G1 - G3: Guanin, Daten zum Vergleich aus [38].

Jedes gezeigte Spektrum wurde durch 24 Wiederholungen für je 2.5 s

generiert (Gesamtintegrationszeit: 60 s, Anregungswellenlänge λ =

785 nm). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

4.1 Schematischer Aufbau eines humanen Spermatozoons. Der hoch-

kondensierte haploide Zellkern befindet sich im Kopf. An den Mittelteil,

der Mitochondrien beinhaltet, schließt sich die Geissel an, die der

Fortbewegung der Zelle dient. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

4.2 Prinzip der Summenfilteranalyse. (A) zeigt Links ein Einzelpunkt-

Spektrum aus einem Raman-Spektrendatensatz. In blau ist der Ar-

beitsbereich des Summenfilters hervorgehoben, also der Bereich in

dem in jedem Spektrum des Datensatzes die Intensitätswerte auf-

summiert wurden. Daneben ist das daraus entstandene farbkodierte

Raman-Bild eines kompletten Spermiums gezeigt mit der korrespon-

dierenden Farbskala, der die summierten Intensitäten in jedem Pi-

xel des Bildes zugewiesen worden sind. (B) zeigt das Ergebnis der

Summenfilteranalyse mit einem anderen Arbeitsbereich, der in der

Visualisierung einer Struktur im Kopf des Spermiums resultiert. (C)

zeigt ein weiteres Beispiel der Aufsummierung der Intensitäten einer

Bande mit der sich das Mittelstück der Zelle darstellen lässt. . . . . . 43

69

4.3 Optische Aufnahme und biochemische Komposition immobilisier-

ter, lebender individueller menschlicher Spermatozoen bei physio-

logieähnlichen Bedingungen. (A) Optische Aufnahme zeigt meh-

rere immobilisierte Spermien. Vierecke in Weiß geben die Mess-

bereiche an, in denen automatisierte CRM Messungen einzelner

Spermien durchgeführt worden sind. Messparameter sind für jede

Zelle: 10 µm x 10 µm bei 333 nm Auflösung pro Pixel, 15 mW La-

serleistung sowie 500 ms Integrationszeit pro Spektrum. (B) - (S)

Chemische Bilder rekonstruiert aus hyperspektralen Datensätzen

durch Summenfilteranalyse. (B) - (G) entspricht verschiedenen CH-

Schwingungen (2800 cm−1 bis 3000 cm−1), (H) - (M) der jeweiligen

Kopfregion 1090 cm−1 bis 1100 cm−1 und (N) - (S) dem Mittelstück

(745 cm−1 bis 755 cm−1). (T) - (Y) Überlagerung der Teilbilder (B) -

(S). blaue Farbskala entspricht der gesamten Zelle, grün dem Mittel-

stück und rot der Kopfregion. Maßstabsbalken entsprechen 1 µm in

(B) - (S) und 2 µm in (T) - (Y). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

4.4 Durchschnittsspektren der chemischen Bilder aus Abb. 4.3 (B) ver-

schiedene CH-Schwingungen (2800 cm−1 bis 3000 cm−1, Kopfregion

1090 cm−1 bis 1100 cm−1 und Mittelstück (745 cm−1 bis 755 cm−1)

sowie ein Spektrum des CaF2-Substrates (schwarz). Schattierungen

geben die Arbeitsbereiche der verwendeten Summenfilteranalyse an.

Die Spektren sind zum besseren Vergleich auf der Y-Achse gegen-

einander versetzt. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

4.5 Normalisierte Intensitäten der Banden bei 750 cm−1 und 1095 cm−1

aus den Kopfregionen (rot) in Abb. 4.3 (H) – (M) und aus den Mittel-

stückregionen (schwarz) in Abb. 4.3 (N) – (S). Jeweils drei normalisier-

te Mittelwerte mit der höchsten Intensität aus der Summenfilteranalyse

wurden in jedem Teilbild bestimmt, um die Daten als I(750 cm−1) als

Y- und I(1095 cm−1) als X-Werte nach Normalisierung darzustellen.

Fehlerbalken entsprechen dem Standardfehler des jeweiligen Mittel-

wertes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

70

4.6 Box Plot der absoluten Werte der Differenz I(750 cm-1) – I(1095 cm−1)

aus den Kopfregionen in Abb. 4.3 (B) – (G) (linke Box) und aus den

Mittelstückbereichen Abb. 4.3 (N) – (S) (rechte Box). Horizontale

Linien geben den Medianwert an. Fehlerbalken sind repräsentativ für

das 95 % Konfidenzintervall des jeweiligen Median. Grau hinterlegt

ist der jeweilige Interquartil-Bereich. Die Sternlinie *** steht für P <

0.0001 aus dem „Unabhängige Proben Mann-Whitney“ Test. . . . . . 47

4.7 Detektierte Fluoreszenzsignale der selben Spermien an der selben

Position nach Laserbestrahlung mit 30 mW. (A) Optisches Bild, das

immobilisierte Spermien zeigt (Sichtfeld zum Vergleich zu Abb. 5.5).

Vierecke in rot, grün und blau geben die Messbereiche an, in denen

automatisierte CRM von einzelnen Spermien mit einer Laserleistung

von 30 mW durchgeführt worden sind. (B) Spermien mit intakter Mem-

bran fluoreszieren hellgrün. (C) Zellen mit beschädigter Zellmembran

fluoreszieren rot. (D) - (F) Digitale Zooms der drei Spermatozoen

von Interesse aus (A). (G) - (I) Digitale Zooms der Spermatozoen

von Interesse aus (B). Das detektierte Fluoreszenzsignal der drei

Spermien, die Laserstrahlung aus CRM ausgesetzt worden sind, ist

deutlich geringer verglichen mit den Zellen in der Umgebung, die

keinem Laserlicht ausgesetzt wurden. (J) - (L) Digitale Zooms der

Spermatozoen von Interesse aus (C). Rote Fluoreszenz konnte für

die Spermien detektiert werden, die vorher mit CRM gemessen und

damit Laserstrahlung ausgesetzt worden sind. . . . . . . . . . . . . 48

71

4.8 Raman-chemische Bilder und detektierte Fluoreszenz aus SYBR

14 und PI des selben Spermiums an der selben Position. (A) Opti-

sches Bild, das immobilisierte Zellen darstellt. Viereck in Grün gibt

den Messbereich an, in dem eine automatisierte CRM Messung mit

einer Laserleistung von 15 mW durchgeführt worden ist. Teilbilder

sind die Raman chemischen Bilder rekonstruiert aus Summenfilter-

analyse der Zelle markiert in (A) mit (1). Von links nach Rechts: Ver-

schiedene CH-Schwingungen (2800 cm−1 bis 3000 cm−1), Kopfregion

(1090 cm−1 bis 1100 cm−1) und dem Mittelstück (745 cm−1 bis 755 cm−1).

Maßstabsbalken sind 2 µm. (C) Detektierte Fluoreszenz von SYBR-

14. Das Spermatozoon (1), welches vorher mit CRM gemessen wor-

den ist erscheint als heller Punkt neben anderen Zellen in der Um-

gebung (2),(3) die nicht vorher Laserstrahlung aus CRM Messungen

ausgesetzt worden sind. (D) Kein Fluoreszenzsignal der PI-Sonde

wurde detektiert. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

4.9 Farbkodierte Raman-Bilder von 35 individuellen, lebenden Sperma-

tozoen bei physiologieähnlichen Bedingungen, die vollständig au-

tomatisiert gemessen und per Summenfilteranalyse rekonstruiert

worden sind. Blaue Farbskala entspricht den verschiedenen Koh-

lenwasserstoffschwingungen (2800 cm−1 bis 3000 cm−1), grün den

Mittelstückbereichen (745 cm−1 bis 755 cm−1) sowie rot den Kopfre-

gionen (1090 cm−1 bis 1100 cm−1). Die gezeigten Maßstabsbalken

entsprechen 2 µm. Geometrie: 13 µm x 13 µm, 20 Punkte pro Linie,

20 Linien pro Bild, 0.15 s Messzeit pro Spektrum, 15 mW Laserleis-

tung. Gesamtmesszeit pro Zelle mit Hintergrund: 60 s. . . . . . . . . 50

4.10 S/N für jedes Teilbild in Abb. 4.9 aufgetragen gegen die laufende

Nummer der Zelle. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

4.11 Die letzten sechs farbkodierten Teilbilder einer automatisierten Mes-

sung immobilisierter Spermatozoen. Nach Zelle 17 wurde das Mikro-

skop manuell in z-Richtung in die Probe refokussiert. . . . . . . . . . 51

4.12 Detektierte SYBR-14 und PI Fluoreszenzsignale von Spermatozoen

nach Percoll-Dichtegradienten-Zentrifugation, Immobilisierung und

Lagerung für 4 h bei 35 ◦C. (A) Fluoreszenzsignal des SYBR-14/DNA

Komplexes zeigt mehrere helle Punkte. (B) Ein Fluoreszenz-Signal

des PI/SYYBR-14/DNA Komplexes wurde nicht detektiert. . . . . . . 52

72

4.13 Optische Aufnahmen eines einzelnen Spermatozoons direkt nach

Transfer auf das beschichtete CaF2 Substrat. Dargestellt ist die Motili-

tät der Geissel einer Zelle durch die verschiedene Position der Geissel

zu verschiedenen Zeitpunkten t nach Aufbringen auf das Substrat. . 53

5.1 Raman-Spektren von Silizium und TiO2-Dünnschichten auf Silizi-

um. Blaue Linie: Spektrum von Silizium, grüne Linie: Abgeschiedene

Dünnschicht auf Silizium, rote Linie: Wärmbehandelte Dünnschicht.

Gesamtintegrationszeit: 60 s (24 Wiederholungen je 2.5 s, 12 mW,


5.2 Raman-Spektren von Glas und TiO2-Dünnschichten auf Glas. Blaue

Linie: Spektrum von Glas, grüne Linie: Abgeschiedene Dünnschicht

auf Glas, rote Linie: Wärmbehandelte Dünnschicht. Gesamtintegra-

tionszeit: 60 s (24 Wiederholungen je 2.5 s, 12 mW, Anregungswel-

lenlänge λ = 488 nm). Spektren sind auf der Y-Achse gegeneinander

versetzt. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

5.3 Raman-Spektren von (C4C1py)[Cu(SCN)2]. Blaue Linie: In-situ-Messung

bei 10 ◦C, rote Linie: In-situ-Messung bei 100 ◦C. Gestrichelte ver-

tikale Linie: Raman-Bande bei 2097 cm−1. Gesamtintegrationszeit:

60 s (24 Wiederholungen je 2.5 s, 25 mW, Anregungswellenlänge λ

= 488 nm). Spektren sind auf der Y-Achse gegeneinander versetzt. . 61

5.4 Raman-Spektren von (C4C1py)[Cu(SCN)2]. Blaue Linie: In-situ-Messung

bei 20 ◦C, rote Linie: In-situ-Messung bei 100 ◦C. Gestrichelte ver-

tikale Linie markiert Banden, deren Lage in beiden Spektren über-

einstimmt. Gesamtintegrationszeit: 60 s (24 Wiederholungen je 2.5 s,

100 mW, Anregungswellenlänge λ = 785 nm). Spektren sind auf der

Y-Achse gegeneinander versetzt. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

5.5 Optisches Bild aufgenommen mit dem konfokalen Raman-Mikroskop

zeigt einzelne, immobilisierte, lebende Spermatozoen (Vergleich mit

Abb. 4.7). Blaue, rote und grüne Vierecke geben Bereiche an, in

denen automatisierte CRM Messungen durchgeführt worden sind mit

einer Laserleistung von 30 mW. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

73

Tabellenverzeichnis

1.1 Auswahl von mit Raman-Spektroskopie messbaren Eigenschaften. . 7

3.1 Ätzraten des X-Jets in (nmmin−1) von DNA Homo-Oligonukleotide. . 28

4.1 Vergleich und Zuordnung charakteristischer Banden im Raman-Spektrum

zellulärer Komponenten in bisherigen Studien (Ref.) und dieser Arbeit

[EE]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

74

7Literaturverzeichnis

[1] H. Kuzmany. Solid-State Spectroscopy. Springer, Heidelberg, 2009.

[2] J.M. Hollas. Modern Spectroscopy. Wiley-VCH, Weinheim, 2004.

[3] R. Winter and F. Noll. Methoden der Biophysikalischen Chemie. Teubner

Studienbuecher, Wiesbaden, 1998.

[4] A.H. Compton. A quantum theory of the scattering of x-rays by light elements.

Physical Review, 21:483–502, May 1923.

[5] C.V. Raman and K.S. Krishnan. A new type of secondary radiation. Nature,

121:501–502, 1928.

[6] WITec. WITec Project. WITec, Ulm, 2007.

[7] K. Meister, J. Niesel, U. Schatzschneider, N. Metzler-Nolte, D.A. Schmidt, and

M. Havenith. Label-free imaging of metal-carbonyl complexes in live cells

by raman microspectroscopy. Angewandte Chemie. International Edition in

English, 49(19):3310–3312, Apr 2010.

[8] C. Matthaeus, T. Chernenko, L. Quintero, L. Milan, A. Kale, M. Amiji, V. Torchilin,

and M. Diem. Raman microscopic imaging of cells and applications monitoring

the uptake of drug delivery systems. Biophotonics: Photonic Solutions For

Better Health Care, 6991:99106–99106, 2008.

76

[9] C. Matthaeus, A. Kale, T. Chernenko, V. Torchilin, and M. Diem. New ways

of imaging uptake and intracellular fate of liposomal drug carrier systems

inside individual cells, based on raman microscopy. Molecular Pharmaceutics,

5(2):287–293, 2008.

[10] G. Di Florio, E. Bruendermann, N. S. Yadavalli, S. Santer, and M. Havenith.

Polarized 3d raman and nanoscale near-field optical microscopy of optically

inscribed surface relief gratings: chromophore orientation in azo-doped polymer

films. Soft Matter, 10(10):1544–1554, 2014.

[11] P. J. Pauzauskie, D. Talaga, K. Seo, P. D. Yang, and F. Lagugne-Labarthet. Po-

larized raman confocal microscopy of single gallium nitride nanowires. Journal

of the American Chemical Society, 127(49):17146–17147, December 2005.

[12] N. J. Everall. Measurement of orientation and crystallinity in uniaxially drawn po-

ly(ethylene terephthalate) using polarized confocal raman microscopy. Applied

Spectroscopy, 52(12):1498–1504, December 1998.

[13] V.-S. Dang, H. Parala, J.H. Kim, K. Xu, N.B. Srinivasan, E. Edengeiser, M. Ha-

venith, A.D. Wieck, T. de los Arcos, R.A. Fischer, and A. Devi. Electrical and

optical properties of tio2 thin films prepared by plasma-enhanced atomic layer

deposition. physica status solidi (a), 211:416–424, 2013.

[14] E.T. Spielberg, E. Edengeiser, B. Mallick, M. Havenith, and A.V. Mudring. (1-

butyl-4-methyl-pyridinium)[cu(scn)2 ]: A coordination polymer and ionic liquid.

Chemistry, 20(18):5338–5345, April 2014.

[15] F. Rull, A. C. Prieto, J. M. Casado, F. Sobron, and H. G. M. Edwards. Estimati-

on of crystallinity in polyethylene by raman-spectroscopy. Journal of Raman

Spectroscopy, 24(8):545–550, August 1993.

[16] B. P. Gaber and W. L. Peticolas. Quantitative interpretation of biomembrane

structure by raman-spectroscopy. Biochimica Et Biophysica Acta, 465(2):260–

274, 1977.

[17] M. J. Pelletier. Quantitative analysis using raman spectrometry. Applied Spec-

troscopy, 57(1):20A–42A, January 2003.

[18] N. C. Deno and M. J. Wisotsky. Quantitative raman spectroscopy for deter-

mination of base strengths of weak organic bases. Journal of the American

Chemical Society, 85(12):1735–&, 1963.

77

[19] R. Hooke. Micrographia. Royal Society, London, 1665.

[20] E. Robbins and N. K. Gonatas. Histochemical + ultrastructural studies on hela

cell cultures exposed to spindle inhibitors with special reference to interphase

cell. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 12(9):704–&, 1964.

[21] T. Dieing, O. Hollricher, and J. Toporski. Confocal Raman Microspectroscopy.

Springer, Heidelberg, 2010.

[22] T. H. Maiman. Stimulated optical radiation in ruby. Nature, 187(4736):493–494,

1960.

[23] W. S. Boyle and G. E. Smith. Charge coupled semiconductor devices. Bell

System Technical Journal, 49(4):587, 1970.

[24] J. Zhang, R. E. Campbell, A. Y. Ting, and R. Y. Tsien. Creating new fluorescent

probes for cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 3(12):906–918,

December 2002.

[25] L. Brand and J. R. Gohlke. Fluorescence probes for structure. Annual Review

of Biochemistry, 41:843, 1972.

[26] Hazel H. Szeto, Peter W. Schiller, Kesheng Zhao, and Guoxiong Luo. Fluo-

rescent dyes alter intracellular targeting and function of cell-penetrating tetra-

peptides. FASEB journal : official publication of the Federation of American

Societies for Experimental Biology, 19(1):118–20, January 2005.

[27] J. W. Lichtman and J. A. Conchello. Fluorescence microscopy. Nature Methods,

2(12):910–919, December 2005.

[28] S. W. Hell and J. Wichman. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated-

emission - stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics

Letters, 19(11):780–782, June 1994.

[29] S. W. Hell. Toward fluorescence nanoscopy. Nature Biotechnology,

21(11):1347–1355, November 2003.

[30] S. W. Hell. Microscopy and its focal switch. Nature Methods, 6(1):24–32,

January 2009.

[31] J. D. Watson and F. H. C. Crick. Molecular structure of nucleic acids - a structure

for deoxyribose nucleic acid. Nature, 171(4356):737–738, 1953.

78

[32] H.R. Drew, R.M. Wing, T. Takano, C. Broka, S. Tanaka, K. Itakura, and R. E.

Dickerson. Structure of a b-dna dodecamer - conformation and dynamics

.1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of

America-biological Sciences, 78(4):2179–2183, 1981.

[33] D. Ellerweg, J. Benedikt, A. von Keudell, N. Knake, and V. Schulz-von der

Gathen. Characterization of the effluent of a he/o-2 microscale atmospheric

pressure plasma jet by quantitative molecular beam mass spectrometry. New

Journal of Physics, 12:013021, January 2010.

[34] M. Laroussi. Nonthermal decontamination of biological media by atmospheric-

pressure plasmas: Review, analysis, and prospects. IEEE Transactions on

Plasma Science, 30(4):1409–1415, August 2002.

[35] D. O’Connell, L. J. Cox, W. B. Hyland, S. J. McMahon, S. Reuter, W. G. Graham,

T. Gans, and F. J. Currell. Cold atmospheric pressure plasma jet interactions

with plasmid dna. Applied Physics Letters, 98(4):043701, January 2011.

[36] X. T. Deng, J. J. Shi, and M. G. Kong. Protein destruction by a helium atmos-

pheric pressure glow discharge: Capability and mechanisms. Journal of Applied

Physics, 101(7):074701, April 2007.

[37] S. Schneider, J. W. Lackmann, D. Ellerweg, B. Denis, F. Narberhaus, J. E.

Bandow, and J. Benedikt. The role of vuv radiation in the inactivation of bacteria

with an atmospheric pressure plasma jet. Plasma Processes and Polymers,

9(6):561–568, June 2012.

[38] J.W. Lackmann, S. Schneider, E. Edengeiser, F. Jarzina, S. Brinckmann,

E. Steinborn, M. Havenith, J. Benedikt, and J.E. Bandow. Photons and par-

ticles emitted from cold atmospheric-pressure plasma inactivate bacteria and

biomolecules independently and synergistically. Journal of the Royal Society,

Interface, 10(89):20130591, Dec 2013.

[39] J.W. Lackmann, S. Schneider, F. Narberhaus, J. Benedikt, and J. E. Ban-

dow. Plasma for Bio-Decontamination, Medicine and Food Security. Springer,

Heidelberg, 2012.

[40] S. Schneider, J. W. Lackmann, F. Narberhaus, J. E. Bandow, B. Denis, and

J. Benedikt. Separation of vuv/uv photons and reactive particles in the effluent

of a he/o-2 atmospheric pressure plasma jet. Journal of Physics D: Applied

Physics, 44(29):295201, July 2011.

79

[41] B. Prescott, W. Steinmetz, and G. J. Thomas. Raman spectral studies of nucleic-

acids 23. characterization of dna structures by laser raman-spectroscopy. Biop-

olymers, 23(2):235–256, 1984.

[42] E. W. Small and W.L. Peticolas. Conformational dependence of raman scat-

tering intensities from polynucleotides 3. order-disorder changes in helical

structures. Biopolymers, 10(8):1377–1416, 1971.

[43] G. J. Thomas, J. M. Benevides, S. A. Overman, T. Ueda, K. Ushizawa, M. Saitoh,

and M. Tsuboi. Polarized raman-spectra of oriented fibers of a-dna and b-dna -

anisotropic and isotropic local raman tensors of base and backbone vibrations.

Biophysical Journal, 68(3):1073–1088, March 1995.

[44] H. Deng, V. A. Bloomfield, J. M. Benevides, and GJ Thomas, Jr. Dependence

of the raman signature of genomic b-dna on nucleotide base sequence. Biopo-

lymers, 50(6):656–666, Nov 1999.

[45] G. J. Lee, Y. W. Kwon, Y. H. Kim, and E. H. Choi. Raman spectroscopic study of

plasma-treated salmon dna. Applied Physics Letters, 102(2):021911, January

2013.

[46] J. G. Duguid, V. A. Bloomfield, J. M. Benevides, and G. J. Thomas. Dna mel-

ting investigated by differential scanning calorimetry and raman spectroscopy.

Biophysical Journal, 71(6):3350–3360, December 1996.

[47] J. Mueller, W. Ibach, K. Weishaupt, and O. Hollricher. Confocal raman micros-

copy. Microscopy and Microanalysis, 9:1084–1085, 8 2003.

[48] K. Fricke, I. Koban, H. Tresp, L. Jablonowski, K. Schroder, A. Kramer, K. D. Welt-

mann, T. von Woedtke, and T. Kocher. Atmospheric pressure plasma: A high-

performance tool for the efficient removal of biofilms. Plos One, 7(8):e42539,

August 2012.

[49] J. Boivin, L. Bunting, J. A. Collins, and K. G. Nygren. International estimates

of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for

infertility medical care. Human Reproduction, 22(6):1506–1512, June 2007.

[50] V. M. Brugh and L. I. Lipshultz. Male factor infertility evaluation and manage-

ment. Medical Clinics of North America, 88(2):367–385, March 2004.

80

[51] D. Mukhopadhyay, A. C. Varghese, M. Pal, S. K. Banerjee, A. K. Bhattacharyya,

R. K. Sharma, and A. Agarwal. Semen quality and age-specific changes: a study

between two decades on 3,729 male partners of couples with normal sperm

count and attending an andrology laboratory for infertility-related problems in

an indian city. Fertility and Sterility, 93(7):2247–2254, May 2010.

[52] M. Rolland, J. Le Moal, V. Wagner, D. Royere, and J. De Mouzon. Decline

in semen concentration and morphology in a sample of 26 609 men close to

general population between 1989 and 2005 in france. Human Reproduction,

28(2):462–470, February 2013.

[53] World Health Organization. WHO laboratory manual for the Examination and

processing of human semen. World Health Organization, Genf (Schweiz), 2010.

[54] W. Schoenfeld. Um die entdeckung der menschlichen samenfaeden. Archiv

fuer Dermatologie und Syphilis, 178(3):358–372, 1938.

[55] L. Stryer. Biochemistry. Freeman, New York, 1995.

[56] C. Avendano, A. Mata, A. M. J. Villanueva, N. Battello, C. A. S. Sarmiento, and

S. Oehninger. Dna fragmentation of sperm subpopulations with different head

morphology. implications for icsi treatment. Fertility and Sterility, 96(3):S160–

S160, September 2011.

[57] X. D. Zhang, R. Balhorn, J. Mazrimas, and J. Kirz. Measuring dna to protein

ratios in mammalian sperm head by xanes imaging. Journal of Structural

Biology, 116(3):335–344, May 1996.

[58] G. S. Bench, A. M. Friz, M. H. Corzett, D. H. Morse, and R. Balhorn. Dna and

total protamine masses in individual sperm from fertile mammalian subjects.

Cytometry, 23(4):263–271, April 1996.

[59] V. Sanchez, J. Wistuba, and C. Mallidis. Semen analysis: update on clinical

value, current needs and future perspectives. Reproduction, 146(6):R249–R258,

December 2013.

[60] J. Jasensky and J. E. Swain. Peering beneath the surface: Novel imaging

techniques to noninvasively select gametes and embryos for art. Biology of

Reproduction, 89(4):105, October 2013.

81

[61] C. Mallidis, V. Sanchez, and J. Wistuba. Raman microspectroscopy: a method

with great promise but which also needs circumspection. Human Reproduction,

28(9):2595–2596, September 2013.

[62] D.A. Schmidt, I. Kopf, and E. Bruendermann, E.ndermann. A matter of scale:

from far-field microscopy to near-field nanoscopy. Laser & Photonics Reviews,

6(3):296–332, 2012.

[63] J. Chan, S. Fore, S. Wachsman-Hogiu, and T. Huser. Raman spectroscopy and

microscopy of individual cells and cellular components. Laser Photonics Rev.,

2(5):325–349, October 2008.

[64] M. Diem, M. Romeo, S. Boydston-White, M. Miljkovic, and C. Matthaus. A

decade of vibrational micro-spectroscopy of human cells and tissue (1994-

2004). Analyst, 129(10):880–885, 2004.

[65] W. L. Kubasek, Y. Wang, G. A. Thomas, T. W. Patapoff, K. H. Schoenwaelder,

J. H. Vandersande, and W. L. Peticolas. Raman-spectra of the model b-dna

oligomer d(cgcgaattcgcg)2 and of the dna in living salmon sperm show that

both have very similar b-type conformations. Biochemistry, 25(23):7440–7445,

November 1986.

[66] T. Huser, C.A. Orme, C.W. Hollars, M.H. Corzett, and R. Balhorn. Raman

spectroscopy of dna packaging in individual human sperm cells distinguishes

normal from abnormal cells. Journal of Biophotonics, 2(5):322–332, May 2009.

[67] K. Meister, D.A. Schmidt, E. Bruendermann, and M. Havenith. Confocal raman

microspectroscopy as an analytical tool to assess the mitochondrial status in

human spermatozoa. Analyst, 135(6):1370–1374, Jun 2010.

[68] C. Mallidis, J. Wistuba, B. Bleisteiner, O. S. Damm, P. Gross, F. Wuebbeling,

C. Fallnich, M. Burger, and S. Schlatt. In situ visualization of damaged dna in

human sperm by raman microspectroscopy. Hum. Reprod., 26(7):1641–1649,

Jul 2011.

[69] Z. Huang, X. Chen, Y. Chen, J. Chen, M. Dou, S. Feng, H. Zeng, and R. Chen.

Raman spectroscopic characterization and differentiation of seminal plasma.

Journal of Biomedical Optics, 16(11):110501, Nov 2011.

[70] V. Sanchez, K. Redmann, J. Wistuba, F. Wubbeling, M. Burger, H. Oldenhof,

W. F. Wolkers, S. Kliesch, S. Schlatt, and C. Mallidis. Oxidative dna damage

82

in human sperm can be detected by raman microspectroscopy. Fertility and

Sterility, 98(5):1124, November 2012.

[71] Z. F. Huang, X. W. Chen, G. N. Chen, J. H. Chen, J. Wang, J. Q. Lin, H. S. Zeng,

and R. Chen. Characterization and differentiation of normal and abnormal sper-

matozoa via micro-raman spectroscopy. Laser Physics Letters, 10(3):035601,

March 2013.

[72] F. Liu, Y. Zhu, Y. F. Liu, X. B. Wang, P. Ping, X. Y. Zhu, H. L. Hu, Z. Li, and

L. He. Real-time raman microspectroscopy scanning of the single live sperm

bound to human zona pellucida. Fertility and Sterility, 99(3):684, March 2013.

[73] C. Krafft, T. Knetschke, R. H. W. Funk, and R. Salzer. Identification of organelles

and vesicles in single cells by raman microspectroscopic mapping. Vibrational

Spectroscopy, 38(1-2):85–93, July 2005.

[74] N. A. Brazhe, M. Treiman, A. R. Brazhe, N. L. Find, G. V. Maksimov, and

O. V. Sosnovtseva. Mapping of redox state of mitochondrial cytochromes in

live cardiomyocytes using raman microspectroscopy. Plos One, 7(9):e41990,

September 2012.

[75] M. Okada, N.I. Smith, A.F. Palonpon, H. Endo, S. Kawata, M. Sodeoka, and

K. Fujita. Label-free raman observation of cytochrome c dynamics during

apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United

States of America, 109(1):28–32, Jan 2012.

[76] W. Grundler, P. Dirscherl, W. Beisker, F. Weber, R. Stolla, and H. Bollwein.

Quantification of temporary and permanent subpopulations of bull sperm by an

optimized sybr-14/propidium iodide assay. Cytometry Part A, 60A(1):63–72,

July 2004.

[77] T. Ohsaka, F. Izumi, and Y. Fujiki. Raman-spectrum of anatase, tio2. Journal of

Raman Spectroscopy, 7(6):321–324, 1978.

[78] F. Dachille, P. Y. Simons, and R. Roy. Pressure-temperature studies of anatase

brookite rutile and tio2-2. American Mineralogist, 53(11-1):1929, 1968.

[79] G. A. Bowmaker and D. A. Rogers. Infrared and raman-spectra of some

bis(thiocyanato)cuprate(i) and bis(thiocyanato)aurate(i) complexes. Journal of

the Chemical Society - Dalton Transactions, (9):1873–1876, 1982.

83

[80] R.A. Bailey and T.W. Michelse. Infrared-spectra of mixed metal thiocyanate

complexes. Journal of Inorganic & Nuclear Chemistry, 34(8):2671–2673, 1972.

[81] J.J. Cael, J.L. Koenig, and J. Blackwel. Infrared and raman-spectroscopy of

carbohydrates .4. identification of configuration-sensitive and conformation-

sensitive modes for d-glucose by normal coordinate analysis. Carbohydrate

Research, 32(1):79–91, 1974.

[82] H. Krautscheid, N. Emig, N. Klaassen, and P. Seringer. Thiocyanato complexes

of the coinage metals: synthesis and crystal structures of the polymeric pyridine

complexes [agxcuy(scn)(x+y)(py)(z)]. Journal of the Chemical Society-dalton

Transactions, (18):3071–3077, September 1998.

84

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Konfokale Raman-Mikrospektroskopie zur Untersuchung ... · Danksagung Die Fertigstellung dieser Arbeit ist für mich ein Rückblick auf den zurückgelegten Pfad und damit verbunden