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Aus dem Institut für Mikrobiologie
Zentrum für Infektionsmedizin
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
___________________________________________________________________________
Konstruktion und Charakterisierung einer isogenen
Actinobacillus pleuropneumoniae hlyX- Mutante
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades
eines Doktors der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Mohamed N’diaye
Kayes, Mali
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. G.-F. Gerlach
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. T. Leeb
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. G.-F. Gerlach
Tag der mündlichen Prüfung: 26.05.2005
Gefördert durch ein Stipendium des Projekts “Programme d’Appui aux Services Agricoles
et aux Organisations Paysannes (PASAOP)" des Institut D’Economie Rurale, Mali
meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ................................................................................................. 11
2 Literaturübersicht................................................................................... 12
2.1 Actinobacillus pleuropneumoniae ........................................................................... 12
2.1.1 Bedeutung und Verbreitung .................................................................................... 12
2.1.2 Taxonomie .............................................................................................................. 13
2.1.3 Virulenzfaktoren ..................................................................................................... 14
2.1.4 Immunität und Vakzination .................................................................................... 19
2.2 Anaerobe Genregulation.......................................................................................... 20
3 Material und Methoden.......................................................................... 23
3.1 Bakterienkulturen .................................................................................................... 23
3.1.1 Bakterien und Plasmide ................................................................................... 23
3.1.2 Kultivierungsbedingungen ............................................................................... 23
3.2 Ermittlung der Zelldichte......................................................................................... 23
3.3 Isolierung, Reinigung und Quantifizierung von DNA ............................................ 24
3.3.1 Präparation chromosomaler DNA von A. pleuropneumoniae ......................... 24
3.3.2 Alkalilysis-Verfahren zur Präparation von Plasmid DNA............................... 27
3.3.3 DNA-Aufreinigung mit “Nucleospin-Extract” (Macherey-NAGEL
GmbH&CO. Düren Deutschland) ................................................................... 27
3.3.4 Aufreinigung mit dem „ GENE Clean“-KIT ................................................... 28
3.3.5 Bestimmung der DNA-Konzentration ............................................................. 28
3.3.6 Anaerobe Anzucht zum Vergleich verschiedener Stämme und
Bestimmung des Trocknengewichts der Pellet ............................................... 28
3.4 Plasmidkonstruktion ................................................................................................ 29
3.4.1 PCR 2.1-TOPO-Cloning ................................................................................ 29
3.4.2 Restriktionsenzymverdau................................................................................. 30
3.4.3 Auffüllen von Enden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase........ 30
3.4.4 Agarosegelelektrophorese................................................................................ 30
3.4.5 Ligation ............................................................................................................ 31
3.5 Transformation ........................................................................................................ 31
3.5.1 Herstellen von chemisch kompetenten Zellen ................................................. 31
3.5.2 Transformation von chemisch kompetenten E. coli DH5α Zellen mit
Plasmiden ........................................................................................................ 32
3.5.3 Elektrotransformation von Actinobacillus pleuropneumoniae ........................ 33
3.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) .......................................................................... 34
3.7 Konjugation von E. coli und A. pleuropneumoniae ................................................ 35
3.8 Saccharose-Gegenselektion ..................................................................................... 36
3.9 Southern Hybridisierung.......................................................................................... 36
3.9.1 Southern Blot ................................................................................................... 36
3.9.2 Herstellen einer Gensonde nach der „Random-Priming“ Methode ................. 38
3.10 Pulsfeld-Gel-Elektrophorese (PFGE) ...................................................................... 38
3.11 Sequenzierung.......................................................................................................... 40
3.12 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS) –Page .................... 40
3.13 Western Blot ............................................................................................................ 41
3.14 Aspartase Test.......................................................................................................... 42
3.15 Tierversuch .............................................................................................................. 42
3.15.1 Versuchstiere.................................................................................................... 42
3.15.2 Herstellen der Bakteriensuspension für die Aerosolbelastung ........................ 43
3.15.3 Aerosolkammer und Infektion ......................................................................... 43
3.15.4 Überwachung und Erhebung klinischer Parameter.......................................... 43
3.15.5 Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF) .................................................. 44
3.15.6 Bakteriologischer Erregernachweis aus BALF................................................ 44
3.15.7 Sektion ............................................................................................................. 44
3.15.8 Bakteriologische Organuntersuchung .............................................................. 45
3.15.9 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay ) ........................................... 45
3.15.10 Statistik............................................................................................................. 46
4 Ergebnisse ................................................................................................ 47
4.1 Konstruktion und Charakterisierung der A. pleuropneumoniae hlyX
Deletionsmutante .................................................................................................... 47
4.1.1 Konstruktion des Plasmids pHLYX701 für die Konjugation .......................... 47
4.1.2 Konstruktion der isogenen A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante..................... 49
4.1.3 Analyse der isogenen A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante............................. 49
4.2 Überprüfung von A. pleuropneumoniae ∆hlyX in der experimentellen
Aerosolinfektion...................................................................................................... 54
4.3 Humorale Immunantwort......................................................................................... 57
5 Diskussion ................................................................................................ 58
6 Zusammenfassung................................................................................... 62
7 Summary.................................................................................................. 63
8 Literaturverzeichnis................................................................................ 64
9 Anhang ..................................................................................................... 74
9.1 Material und Geräte ................................................................................................. 74
9.2 Zusammensetzung von Medien, Medienzusätzen und Puffer ................................. 75
9.3 Lösungen und Puffer................................................................................................ 77
9.3.1 Plasmidpräparation........................................................................................... 77
9.3.2 Präparation von chromosomaler DNA von Bakterien
(A. pleuropneumoniae).................................................................................... 78
9.4 Restriktionsverdau ................................................................................................... 79
9.5 Gel-Elektrophorese .................................................................................................. 79
9.6 Transformation ........................................................................................................ 80
9.7 Konjugation ............................................................................................................. 80
9.8 DNA-Transfer (Southern Blot)................................................................................ 80
9.9 Herstellen einer Gensonde nach der „Random-Priming“ Methode......................... 81
9.10 Southern-Hybridisierung ......................................................................................... 81
9.11 SDS-Page ( Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel)............................................. 82
9.12 Western Blot ............................................................................................................ 82
9.13 Aspartase-Essay....................................................................................................... 83
9.14 Pulsfeldgelelektrophorese........................................................................................ 83
9.15 Enzyme .................................................................................................................... 84
9.16 Chemikalien............................................................................................................. 85
9.17 Nukleotid- und Aminosäuresequenz des hlyX Gens von A. pleuropneumoniae ..... 87
8.14. Rohdaten .................................................................................................................. 93
9.18 Index der Abbildungen ............................................................................................ 94
9.19 Index der Tabellen ................................................................................................... 95
Abkürzungsverzeichnis
A. dest. Aqua destillata
A. bidest. Aqua bidestillata (zweifach destilliertes Wasser)
A. pleuropneumoniae Actinobacillus pleuropneumoniae
ATCC “American Type Culture Collection”
BALF bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit
BCIP 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat p-Toluidin
BSA bovines Serumalbumin
Bp Basenpaare
DAPI Diaminopimelinsäure
CAMP Christie, Atkins, Munch-Petersen
cDNA Komplementäre DNA
dATP Deoxyadenosintriphosphat
dCTP Deoxycytidintriphosphat
dGTP Deoxyguanosintriphosphat
dTTP Desoxythymidintriphosphat
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
DNase Desoxyribonuklease
dNTP Desoxynukleotidtriphosphat
E. coli Escherichia coli
et al. et alii
EDTA Ethylendiamin-Tetraessigsäure
EIVX Ersatz-IsoVitalex
ELISA engl. enzyme-linked immunosorbent assay
(Enzymgekoppelter Immunabsorptionstest)
KBE Koloniebildende Einheiten
kbp Kilobasenpaare
IgG Immunglobulin G
LB Luria- Bertani
Lsg. Lösung
min Minute
M Molar
NaCl Natriumchlorid (Kochsalz)
NAD Nikotinamid-Adenindinukleotid
NBT Nitrotetrazoliumblauchlorid
NEB New England Biolabs
OD Optische Dichte
OLB Oligo Labeling Buffer
PBS Phosphate Buffered Saline
PCR Polymerase chain reaction
PFGE Pulsfeldgel-Elektrophorese
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
PPLO “Pleuropneumoniae Like Organism”
RFLP Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus
RNA Ribonukleinsäure
RNase Ribonuklease
rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)
RT-PCR Reverse-Transkriptase-PCR
SDS Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-
Elektrophorese
Sek Sekunde
Stammlsg. Stammlösung
SSC Sodium chloride Sodium citrate
TbpA Transferrin bindendes Protein A
TAE Tris Acetat EDTA
TBE Tris Borat EDTA
TE Tris EDTA
Tris Tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethan
U Unit
UV Ultraviolet
vol Volumen
v/v Volumen pro Volumen
w/v Gewicht pro Volumen
Einleitung
1 Einleitung
Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae ist der Erreger der wirtschaftlich bedeutsamen
Pleuropneumonie der Schweine, die mit zunehmender Intensivierung der Schweinehaltung an
Bedeutung gewonnen hat. Die Erkrankung verursacht infolge der hohen Mortalität und der
verminderten Gewichtzunahme chronisch kranker Tiere große wirtschaftliche Verluste. Die
Erkrankung verläuft perakut bis chronisch. Beim perakuten Verlauf stehen Apathie,
Erbrechen und plötzliche Todesfälle im Vordergrund. Hohes Fieber und ausgeprägte
respiratorische Störungen dominieren das klinische Bild in der akuten Phase. Die Ansteckung
erfolgt über Aerosole, wobei insbesondere chronisch infizierte Tiere Erregerreservoir und
Überträger sind.
Das Überstehen einer natürlichen Infektion hinterlässt einen serotypübergreifenden Schutz
vor Reinfektion, der Erreger persistiert jedoch über Monate hinweg in den
Lungenveränderungen, den Tonsillen und auf der Schleimhaut der Bronchien. Die
Anwendung der herkömmlichen serotypspezifischen Vakzinen reduziert die Morbidität und
die Mortalität, verhindert aber nicht die Kolonisierung der Lunge durch den Erreger. Der
Erreger überlebt trotz der verminderten Sauerstoffversorgung in nekrotischem
Lungengewebe. Diese Persistenz der Erreger in Geweben mit reduzierter Sauerstoffspannung
führte zu der Hypothese, dass die Fähigkeit des Erregers in anaeroben Sequestern zu
überleben, Virulenz und Erregerpersistenz beeinflusst.
Vorangegangene Arbeiten zeigten, dass Enzyme des anaeroben Stoffwechsels, z.B. eine
anaerobe Dimethylsulfoxidreduktase sowie eine Aspartase nach Zugabe von
bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit zum Kulturmedium vom Erreger vermehrt exprimiert
werden. Beide Enzyme werden vermutlich unter anaeroben Bedingungen durch das HlyX-
Protein reguliert. Das HlyX-Protein ist A. pleuropneumoniae-Homolog zu FNR („fumarate
and nitrate reduction“), einem globaler anaeroben Regulator von Escherichia (E.) coli. Da
eine Deletion der Dimethylsulfoxidreduktase- und Aspartase-kodierenden Gene zu einer
deutlichen Attenuierung von A. pleuropneumoniae führte, soll in der vorliegenden Arbeit
untersucht werden, welchen Einfluss die HlyX-vermittelte Genregulation auf die
Überlebensfähigkeit des Erregers unter Bedingungen mit verminderter Sauerstoffspannung
und auf die Virulenz hat.
11
Literaturübersicht
2 Literaturübersicht
2.1 Actinobacillus pleuropneumoniae
2.1.1 Bedeutung und Verbreitung
Actinobacillus pleuropneumoniae ist ein obligat pathogener Erreger des Respirationstraktes
von Schweinen (TAYLOR 1999). Er wurde 1957 in Großbritannien als Verursacher der
kontagiösen Pleuropneumonie beim Schwein identifiziert (PATTISON et al. 1957). Der
Erreger ist streng wirtsspezifisch und kann aus Nasenhöhlen, Tonsillen und Lungen infizierter
Tiere isoliert werden (DOM et al. 1994). Der Erreger überlebt nicht lange in der Umwelt
(FENWICK u. HENRY 1994; TAYLOR 1999). Die Übertragung erfolgt per Aerosol oder
mittels Tröpfchen bei direktem Kontakt (JENSEN et al. 1999; LECHTENBERG et al. 1994).
Die indirekte Übertragung durch unbelebte oder belebte Vektoren spielt in der Verbreitung
der Erkrankung eine geringere Rolle (FENWICK u. HENRY 1994). Zwei Biotypen wurden
beschrieben, wobei der Biotyp I auf Nikotinamid-Adenindinukleotid (NAD; V-Faktor)
angewiesen ist (TAYLOR 1999). Fünfzehn Serotypen werden aufgrund der unterschiedlichen
Polysaccharidantigene dem Biotyp I zugeordnet (BLACKALL et al. 2002; MACLEAN et al.
2004). In Deutschland treten vor allem die Serotypen 2, 3, 7 und 9 auf (BUNKA et al. 1990).
Actinobacillus pleuropneumoniae-Erkrankungen wurden bisher in allen europäischen
Ländern, den USA, Kanada, Mexiko, Japan Taiwan und Australien registriert (NICOLET
1992).
Die Actinobacillus-Pleuropneumonie ist eine hämorrhagisch-nekrotisierende Pleuro-
pneumonie mit adhäsiver Pleuritis (SEBUNYA u. SAUNDERS 1983). Die Erkrankung
verläuft perakut bis chronisch; alle Altersgruppen können betroffen werden. Die Heftigkeit
des Verlaufs hängt vom infizierenden Serotyp, vom Immunstatus des Wirtstieres und von der
Erregerzahl ab (ROGERS et al. 1990). Beim perakuten Verlauf stehen Apathie, Erbrechen
und plötzliche Todesfälle im Vordergrund. Hohes Fieber und ausgeprägte respiratorische
Störungen dominieren das klinische Bild in der akuten Phase. Bei einem typischen
Actinobacillus.pleuropneumoniae-Ausbruch kann die Morbidität bei über 50% liegen, wobei
die Mortalität von 1 bis 10% schwankt (FENWICK u. HENRY 1994). Chronisch infizierte
Tiere zeigen ein vermindertes Wachstum und geringere Gewichtszunahmen. Bei adäquaten
Management- und Umweltfaktoren in Abwesenheit anderer Erkrankungen ist die
Wahrscheinlichkeit des Auftretens einer A. pleuropneumoniae-Erkrankung reduziert
12
Literaturübersicht
(FENWICK u. HENRY 1994). Das Überstehen einer natürlichen Infektion hinterlässt einen
soliden Schutz wobei der Erreger jedoch in den Lungenveränderungen, den Tonsillen und auf
der Schleimhaut der Bronchien persistiert und weiterhin ausgeschieden wird (FENWICK u.
HENRY 1994). Diese rekonvaleszenten wie auch chronisch und latent infizierte Tiere spielen
epidemiologisch eine große Rolle bei der Verbreitung des Erregers in bisher
Actinobacillus. pleuropneumoniae-freie Bestände (FENWICK u. HENRY 1994).
2.1.2 Taxonomie
Actinobacillus pleuropneumoniae ist ein gram-negatives, fakultativ anaerobes Stäbchen aus
der Familie der Pasteurellaceae (MANNHEIM 1994). Zwei Biotypen werden beschrieben.
Isolate des Biotyps I sind auf NAD (V-Faktor) angewiesen (NIVEN u. LÉVESQUE 1988).
Isolate des Biotyps II können in Anwesenheit von spezifischen Pyridinnucleotiden NAD
synthetisieren (NIVEN u. LÉVESQUE 1988). Zwei Serotypen (2 und 9) sind bei Biotyp II
bekannt (NIELSEN 1988). Serotype 13 und 14 wurden später zu Biotyp II zugeordnet
(NIELSEN et al. 1997). Der Serotyp 15 wurde bei Biotyp I beschrieben (BLACKALL et al.
2002); Die Serotypenunterteilung beruht auf Kapselpolysacchariden und auf zellulären
Lipopolysacchariden (BLACKALL et al. 2002; MACLEAN et al. 2004; NICOLET 1992).
Die Serotypen 1 und 5 wurden jeweils aufgrund von Unterschieden in der
Polysaccharidstruktur in die Subtypen 1a, 1b, 5a und 5b unterteilt (JOLIE et al. 1994).
Weiterhin kommen zwischen verschiedenen Serotypen Kreuzreaktivitäten vor (EUZÉBY
1998; JOLIE et al. 1994). Alle Serotypen sind hämolytisch, zeigen ein positives Christie-
Atkins-Munch-Petersen (CAMP)-Phänomen mit Staphylococcus aureus (EUZÉBY 1998;
TAYLOR 1999) und sind in der Lage, eine Pleuropneumonie hervorzurufen; dabei
unterscheiden sich die einzelnen Serotypen in ihrer Virulenz (FREY 1995; ROSENDAL et al.
1981). Die Virulenzunterschiede der Serotypen sind unter anderem auf die Produktion von
verschiedenen Kombinationen von APX-Toxinen zurückzuführen (FREY 1995). Die
Oberflächen-Polysaccharide tragen ebenfalls hierzu bei (ROSENDAL u. MACINNES 1990).
Isolate der Spezies A. pleuropneumoniae können anhand biochemischer Eigenschaften von
anderen Actinobacillus-Spezies unterschieden werden (EUZÉBY 1998). So ist die Spezies
Actinobacillus.pleuropneumoniae durch eine starke Ureaseaktivität sowie durch das
Vermögen, Nitrat, Nitrit, Glucose, Saccharose, Mannit und Xylose abzubauen, charakterisiert.
Reaktionen mit Indol und Katalase sind negativ (EUZÉBY 1998). Isolate des Biotyps I sind
13
Literaturübersicht
H2S positiv, Isolate des Biotyps II sind H2S und Laktose negativ sowie Galaktose positiv
(EUZÉBY 1998).
2.1.3 Virulenzfaktoren
2.1.3.1 Kapsel
Die Kapsel von A. pleuropneumoniae besteht meist aus nur einem Polysaccharidbaustein und
bildet eine Hülle um die Bakterienzelle. Die meisten Kapselpolysaccharide sind stark
hydrophil und haben eine negative Oberflächenladung, die zur Verhinderung der Aufnahme
der Bakterien durch die ebenso geladenen Phagozyten führt (HACKER u. HEESEMANN
2000). Die Kapsel verhindert die Auflagerung des Komplementfaktors C3b auf die
Bakterienoberfläche somit wird einerseits die Komplement-vermittelte Lyse durch den
terminalen membranan-greifenden Komplex (MAC) verhindert, anderseits die Opsonierung
durch Komplement und Antikörper mit anschließender Phagocytose umgangen (HACKER u.
HEESEMANN 2000). Somit schützt die Kapsel A. pleuropneumoniae vor bakteriziden
Serumbestandteilen und verhindert die frühzeitige Eliminierung des Erregers (FENWICK u.
HENRY 1994; INZANA et al. 1988). Sie spielt weiterhin eine Rolle in der Virulenz
(JACQUES et al. 1988). So soll die Variation in der Virulenz der einzelnen Serotypen zum
Teil auf Unterschieden in der Kapselstruktur beruhen (JACQUES et al. 1988). Es wurde
gezeigt, dass A. pleuropneumoniae Stämme mit dickeren Kapseln virulenter sind als die mit
dünneren Kapseln (JENSEN u. BERTRAM 1986; ROSENDAL u. MACINNES 1990).
2.1.3.2 RTX-Toxine
RTX-Toxine sind porenformende, zytolytische Proteine, die bei vielen pathogenen gram-
negativen Bakterien vorkommen (FREY 1995). Sie besitzen die Fähigkeit, Erythrozyten und
kernhaltige Zellen zu lysieren (JANSEN et al. 1995; THOMPSON et al. 1993). Die von
Actinobacillus.pleuropneumoniae gebildeten RTX- Toxine werden als Apx-Toxine
bezeichnet.
Das ApxI-Toxin wird von den Serotypen 1, 5a, 5b, 9, 10 und 11 produziert. Das ApxII-Toxin
wird von allen Serotypen außer Serotyp 10 produziert. Das ApxIII-Toxin wird von den
Serotypen 2, 3, 4, 6 und 8 produziert (FREY et al. 1993b; SCHALLER et al. 1999). Das
ApxIV-Toxin wird von allen Serotypen produziert (BOSSE et al. 2002; SCHALLER et al.
1999).
14
Literaturübersicht
Tabelle 1.: Apx-Toxin Produktion der verschiedenen A. pleuropneumoniae Serotypen (BOSSE et
al. 2002)
Operon Aktivität Aktivator Struktur Export hämolytisch zytotoxisch
MW (kDa)
Serotypen
ApxI ApxI C ApxI A ApxIBD stark stark 105-110 1, 5a,5b, 9, 10, 11
ApxII ApxII C ApxII A Nein schwach mild 103-105 alle außer 10
ApxIII ApxII C ApxIII ApxIIIBD kein stark 120 2, 3, 4, 6, 8ApxIV ORF 1?C ApxIVa Kein schwach unbestimmt 200 alle
Das ApxI-Toxin ist stark hämolytisch, das ApxII-Toxin zeigt eine langsamere hämolytische
Aktivität. Beide Toxine sind auch zytotoxisch (FREY et al. 1993a; PRIDEAUX et al. 1999).
Das ApxIII-Toxin ist nicht hämolytisch aber stark zytotoxisch (KAMP et al. 1991; MAIER et
al. 1996; RYCROFT et al. 1991a). Das ApxI-Toxin zeigt die höchste porenbildende Aktivität,
gefolgt von dem nicht hämolytisch aber stark zytotoxisch wirkenden ApxIII- und dem ApxII-
Toxin (MAIER et al. 1996). Das ApxIV-Toxin ist schwach hämolytisch (BOSSE et al. 2002;
SCHALLER et al. 1999). Die Apx -Toxine sind verantwortlich für die charakteristischen
hämorrhagischen Läsionen der A. pleuropneumoniae-Erkrankung (FREY et al. 1993b). Sie
sind für die Virulenz von A. pleuropneumoniae sowie für die Pathogenese von großer
Bedeutung (FREY 1995; FREY u. NICOLET 1988). Unterschiede in der Virulenz der Actino-
bacillus. pleuropneumoniae Serotypen sind zum Teil auf die verschiedenen Kombinationen
von Apx-Toxinen zurückzuführen, wobei die virulentesten Serotypen ApxI und ApxII
produzieren (FREY 1995). Serotypen, die zusätzlich zum ApxIV-Toxin noch zwei andere
Apx-Toxine bilden, sind stärker virulent als jene, welche nur ein zusätzliches Apx-Toxin
sezernieren (FREY u. NICOLET 1988; KAMP et al. 1991). Die ApxI- und ApxII-Toxine
induzieren einen oxidativen “burst“ der neutrophilen Granulozyten (JANSEN et al. 1995).
Eine spontan aufgetretene Serotyp 7 Mutante von A. pleuropneumoniae ohne die Fähigkeit
ApxII zu sezernieren, ist apathogen für Schweine (ANDERSON et al. 1991). Eine chemisch
induzierte A. pleuropneumoniae Serotyp 2 Mutante, die nur ApxIII sezeniert, ist weniger
virulent als der Wildtyp (RYCROFT et al. 1991b; TONPITAK et al. 2002).
Für die Produktion und Sekretion von Apx-Toxinen im Allgemeinen wird die Aktivität von
vier Genen (apxC, apxA, apxB und apxD) benötigt (ISSARTEL et al. 1991). Die für die
Synthese von ApxI- und ApxII-Toxin verantwortlichen Gene sind in Operons kodiert, die aus
vier durchgängigen Genen (apxCABD) bestehen und von einem am 5’-Ende vor dem apxC-
15
Literaturübersicht
Gen gelegenen Promotor kontrolliert werden. Das ApxII-Operon enthält nur die apxA- und
apxC-Gene; für den Membrantransport sind die apxBD Gene des apxI- oder apxIII-Operons
erforderlich.
Die Apx-Toxine sind für die Induktion einer protektiven Immunität von Bedeutung
(DEVENISH et al. 1990). Rekonvaleszente Schweine sind nach einer Infektion mit
Actinobacillus. pleuropneumoniae gegen die Infektion mit einem homologen Serotyp
geschützt, ebenso, jedoch weniger effektiv, gegen Infektionen mit heterologen
Actinobacillus. pleuropneumoniae-Serotypen (CRUIJSEN et al. 1995). Nicht hämolysierende
Mutanten können diese kreuzprotektive Immunität nicht induzieren (INZANA et al. 1988).
2.1.3.3 Äußere Membranproteine (OMP)
Zahlreiche äußere Membranproteine wurden identifiziert und einige davon sind stamm- oder
serotypspezifisch (FENWICK u. HENRY 1994). Manche dieser Proteine sind nur unter
bestimmten spezifischen Wachstumsbedingungen exprimiert, so dass sie nicht in den
gebräuchlichen Vakzinen enthalten sind (FENWICK u. HENRY 1994). Zwei eisenregulierte
Membranproteine (TbpA und TbpB) wurden identifiziert (NIVEN u. LÉVESQUE 1988), die
eine wesentliche Rolle bei der Verwertung von Transferrin-gebundenem Eisen und beim
Vermitteln einer protektiven Immunität spielen (GERLACH et al. 1992; GONZALEZ et al.
1990; RAPP u. ROSS 1986; WILKE et al. 1997) haben verschiedene äußere
Membranproteine (OMPs) zwischen 45 und 67 kDa, und über 94 kDa nachgewiesen. Diese
Proteine wurden im Western Blot von Rekonvaleszentenseren erkannt. Ein weiteres OMP von
40 kDa, OmlA („outer membrane lipoprotein A“) genannt, wurde von GERLACH et al.
(GERLACH et al. 1993) für Serotyp 1, später für Serotyp 5 beschrieben (BUNKA et al.
1995).
Die OMPs können auch zur Typisierung benutzt werden (RAPP u. ROSS 1986). So lassen
sich innerhalb der Referenzstämme für die Serotypen 1 bis 9 sieben verschiedene
Proteinmuster der äußeren Membran unterscheiden (RAPP u. ROSS 1986). Dabei weisen die
Stämme eines Serotyps ähnliche oder identische OMP-Muster auf. Diese OMPs erwiesen sich
weiterhin als immunogen (RAPP u. ROSS 1986). Bei den Serotypen 1 bis 8 wurden drei
immunologisch dominierende äußere Membranproteine von 17, 32, und 42 kDa
nachgewiesen (MACINNES u. ROSENDAL 1987). Ein OMP von 42 kDa wurde bei einigen
Serotypen nachgewiesen und wird auch in vivo exprimiert (DENEER u. POTTER 1989).
16
Literaturübersicht
2.1.3.4 Adhäsine
Infektiöse Prozesse beginnen in der Regel mit der Kolonisierung von Wirtsgeweben und
Zellverbänden durch pathogene Mikroorganismen. Bei dieser Kolonisierung kommt es zu
einer Haftung der Erreger an spezifische Wirtsrezeptoren, die durch Adhäsine vermittelt
werden (HACKER u. HEESEMANN 2000). Bei dieser Besiedlung sind Gewebespezifität und
Wirtsspezifität sehr entscheidend (MADIGAN et al. 2003). Adhäsine werden von allen
pathogenen Erregern produziert und stellen Proteine dar, die spezifisch mit
Kohlenhydratrezeptoren von Wirtszellen interagieren (HACKER u. HEESEMANN 2000;
SAUER et al. 2000).
Nach HACKER 2000 sind folgende Adhärenzfaktoren zu unterscheiden:
- Fimbrienadhäsine (Pili) sind ungefähr 2 µm lange und 2-8 nm dicke filamentöse
Strukture aus ca. 1000 Proteinuntereinheiten. Fimbrienadhäsine werden oft von
großen Genclustern kodiert, die auf Plasmiden oder auf dem Chromosom lokalisiert
sein können.
- Fibrillen. Es sind Zellwandanhänge mit dünnerer und feinerer Struktur als bei den
Fimbrien.
- Nicht-Fimbrienadhäsine (NFA) oder „A-Fimbrienadhäsine“ (AFA). Es sind adhäsive
Proteine, die als integrale Membranproteine oder Proteine, die der bakteriellen
Membran aufgelagert sind, vorkommen.
- Mikrobielle Saccharide: Lipopolysaccharide (LPSs) oder Lipooligosaccharide
(LOSs) können mit Rezeptoren interagieren.
- Lipoteichonsäure (LTAs); Sie spielen eine Rolle bei der Adhärenz von Streptokokken
an Wirtszellen.
Fimbrien exprimierende Stämme von E. coli sind viel häufiger Ursache von
Harnwegsinfektionen als Stämme ohne Fimbrien. Enteropathogene E. coli Stämme besitzen
spezifische Oberflächenstrukturen (Kolonisierungsfaktorantigene [CFA]), die die
Kolonisierung des Dünndarmes ermöglichen und zu Diarrhoe führen (MADIGAN et al.
2003).
Versuche haben gezeigt, dass A. pleuropneumoniae besser den unteren Teil des
Respirationstrakts (Bronchen und Alveolen) als den oberen Teil besiedeln kann (DOM et al.
1994). Die Ausbildung von Fimbrien durch Isolate von A. pleuropneumoniae zeigte keine
lokalisationsbedingten Unterschiede zwischen der Lunge, den Nasenhöhlen und den
17
Literaturübersicht
Tonsillen. Die Fimbrien scheinen die gleiche Bedeutung an diesen verschiedenen Stellen zu
haben (BOSSE u. MACINNES 2000).
2.1.3.5 Lipopolysaccharide
Lipopolysaccharide (LPS) sind Bestandteile der äußeren Membran gramnegativer Bakterien
und bestehen aus dem O-Antigen, dem „core“-Zucker (HACKER u. HEESEMANN 2000)
und dem Lipid A (BAARSCH et al. 1995) und besitzen immunogene Eigenschaften
(HACKER u. HEESEMANN 2000). Die als O-Antigen-Einheiten bezeichneten Module aus
drei bis sechs Zuckern können ein- bis 40-fach wiederholt vorkommen und bestimmen damit
die Länge des LPS-Moleküls. (HACKER u. HEESEMANN 2000). Der starke
Polymorphismus des O-Antigens innerhalb einer bakteriellen Spezies führt zur Bildung
verschiedener Serotypen; Bakterienmutanten mit verkürztem O-Antigen besitzen eine
verminderte Virulenz im Infektionsmodell (HACKER u. HEESEMANN 2000). So haben
virulente A. pleuropneumoniae Serotyp 5 Isolate 10 mg LPS mehr pro g Erregertrockenmasse
als die avirulenten Isolate vom gleichen Serotyp (JENSEN u. BERTRAM 1986).
Untersuchungen an Teilen von LPS haben gezeigt, dass die Lipidfraktion für die Toxizität
verantwortlich ist, während der Polysaccharidanteil die Wasserlöslichkeit und die
Immunogenität des Komplexes bedingt (MADIGAN et al. 2003). Lipid A ist auch an der
Bindung von Hämoglobin an die LPS-Oberfläche beteiligt und trägt damit zur
Eisenversorgung von Actinobacillus. pleuropneumoniae bei (BELANGER et al. 1995). Die
Freisetzung von LPS aus lysierten Bakterien bei Infektionen mit gramnegativen Erregern
stimuliert eine übermäßige Auschüttung von Zytokinen, die zum septischen Schock führen
kann (HACKER u. HEESEMANN 2000).
LPS spielt auch eine Rolle bei der Adhärenz von A. pleuropneumoniae an
Schweinetrachealringen (BELANGER et al. 1990). Dabei hängt die Stärke der Adhärenz von
der Struktur der Lipopolysaccharide ab. Die A. pleuropneumoniae-Serotypen 2, 4 und 7 mit
glatter LPS heften stärker an Wirtszellen an als Serotyp 1 mit LPS mit semi-rauhen Kulturen
oder die Serotypen 3 und 6 mit mit rauhen Kulturen (EUZÉBY 1998). Actinobacillus
pleuropneumoniae-Stämme mit glatter Koloniemorphologie zeigten auch eine stärke
Anheftung an Trachealringe (BELANGER et al. 1990). Zwei Mutanten von
Actinobacillus. pleuropneumoniae-Serotyp 1 mit strukturellen LPS-Anomalien zeigten eine
verminderte Adhärenz und abgeschwächte Virulenz (EUZÉBY 1998).
18
Literaturübersicht
2.1.3.6 Urease
Die Urease wird von mehreren pathogenen und apathogenen Bakterien gebildet. Sie spaltet
durch Hydrolysierung Harnstoff, was zu einer Alkalisierung des Milieus und damit zu einer
Verbesserung der Wachstumbedingungen für die Mikroorganismen in Habitaten wie
Harnwegen (Staphylococcus saprophyticus) oder Magen (Helicobacter pylori) führt
(HACKER u. HEESEMANN 2000).
Actinobacillus pleuropneumoniae-Feldisolate sind in der Regel stark ureasepositiv
(BLANCHARD et al. 1993). Urease ist nicht notwendig für die Entstehung einer
Actinobacluus.pleuropneumoniae-Infektion (TASCON CABRERO et al. 1997). Dieses wurde
durch die Isolierung eines ureasenegativen A. pleuropneumoniae Wildtypstamms bei einem
akuten Infektionsgeschehen mit A. pleuropneumoniae bewiesen (BLANCHARD et al. 1993).
Die genaue Rolle der Urease in chronischen A. pleuropneumoniae Infektionen ist nicht
vollständig geklärt. Allerdings konnte die ureasenegative isogene Mutante
Actinobacillus. pleuropneumoniae ∆ureC 21 Tage nach der Belastung in intaktem
Lungengeweben nicht mehr nachgewiesen werden, was auf eine Bedeutung bei der
Besiedlung intakten Epithels hinweist (BALTES et al. 2001). Ureasenegative
Actinobacillus. pleuropneumoniae konnte keine Infektion bei einer geringeren
Belastungsdosis hervorrufen (BOSSE u. MACINNES 2000). GATERMANN et al.
(GATERMANN et al. 1989) zeigten, dass ureasepositive Organismen im experimentellen
Tiermodell besser als die isogene ureasenegative Mutante kolonisieren und überleben.
2.1.4 Immunität und Vakzination
Natürliche Infektionen mit A. pleuropneumoniae führen zur Bildung von Antikörpern, die als
maternale Antikörper auch saugende Ferkel mehrere Wochen über das Kolostrum weitgehend
schützen (BOSSE et al. 1992; HAESEBROUCK et al. 1997). Es handelt sich in erster Linie
um gegen Apx-Toxine gerichtete, neutralisierende Antikörper (CRUIJSEN et al. 1995). Die
durch die Infektion erworbene Immunität schützt zuverlässig vor einer erneuten Infektion
durch einen homologen Serotyp, aber nicht unbedingt gegen eine Infektion mit einem
heterologen Serotyp (CRUIJSEN et al. 1995; FENWICK u. HENRY 1994). Tiere, die eine
Actinobacillus pleuropneumoniae-Infektion überstanden haben, beherbergen weiterhin
Actinobacillus. pleuropneumoniae im nekrotischen Gewebe (Sequester) in den Lungen und
19
Literaturübersicht
sind ernstzunehmende Infektionsquellen für einen erneuten Ausbruch der Krankheit
(EUZÉBY 1998; FENWICK u. HENRY 1994; RIOUX et al. 1997).
Durch die herkömmlichen Serotyp-spezifischen Vakzinen können die Morbidität, die
Mortalität und das Ausmaß der Lungenveränderungen reduziert werden, aber die Besiedlung
der Lungengewebe durch den Erreger wird nicht verhindert (FENWICK u. HENRY 1994).
Weiterhin führt die Immunisierung mit einem Inaktivatimpfstoff aus einem Serotyp nicht zu
einer protektiven Immunität gegen heterologe Serotypen (JOLIE et al. 1992). Eine orale
Immunisierung mit inaktiviertem und lebendem bzw. attenuiertem A. pleuropneumoniae
Serotyp 9 führte zu einer Reduzierung der Morbidität nach Belastung mit dem homologen
Serotyp (HENSEL et al. 1995). Eine Immunisierung per Aerosol mit einer Actinobacillus
pleuropneumoniae Serotyp 2 Inaktivatvakzine führt zu einer starken, IgA-geprägten
Immunantwort in bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF), in Nasalflüssigkeit und im
Serum, die geimpfte Tiere nach Belastung mit homologen Serotypen gegen eine
schwerwiegende Pleuropneumonie schützt (LOFTAGER et al. 1993).Tiere, die mit einer
lebenden bzw. attenuierten A. pleuropneumoniae Vakzine immunisiert wurden, zeigten
höhere Antikörpertiter (IgA, IgM und IgG) als Tiere, die mit Inaktivatvakzinen immunisiert
wurden (HENSEL et al. 1995). Mit lebendem, nicht bekapselten A. pleuropneumoniae
Serotyp 1 oder Serotyp 5 Impfung waren die Tiere vor klinischer Erkrankung nach Belastung
mit homologen oder heterologen Serotypen geschützt, während Tiere in den Kontrollgruppen
starben (INZANA et al. 1993). Eine aerosole Immunisierung mit A. pleuropneumoniae ureC
und apxIIA Doppelmutante schützt vor Lungenkolonisierung.und die Doppelmutante war
attenuiert (TONPITAK et al. 2002). Immunisierte Schweine mit rekombinantem OmlA-
Protein von A. pleuropneumoniae Serotyp 1 immunisierte Schweine zeigten nach Belastung
mit dem homologen Serotyp signifikant niedrigere Mortalität, mildere klinische Symptome
sowie geringer ausgeprägte Lungenläsionen als Tiere der Kontrollgruppe. Allerdings konnte
Actinobacillus. pleuropneumoniae aus der Lunge aller immunisierten Schweinen isoliert
werden (GERLACH et al. 1993).
2.2 Anaerobe Genregulation
Eine Möglichkeit der Energieerzeugung in Abwesenheit von Sauerstoff ist eine Variation der
Atmung, bei der andere Elektronenakzeptoren als Sauerstoff verwendet werden. Zu diesen
Elektronenakzeptoren gehören Nitrat (NO3-), dreiwertiges Eisen (Fe3+), Sulfat (SO4
2-),
Carbonat (CO32-) und bestimmte organische Verbindungen (MADIGAN et al. 2003).
20
Literaturübersicht
Bakterien, die zu anaerober Atmung befähigt sind, besitzen im allgemeinen
Elektronentransportsysteme, die Cytochrome, Chinone, Eisenschwefelproteine und andere
typische Elektronentransportproteine enthalten (MADIGAN et al. 2003).
In E. coli werden viele unter anaeroben Bedingungen exprimierte Gene vom globalen
Regulator FNR reguliert (SHAW u. GUEST 1982). Das FNR (fumarate and nitrate
reduction)-Protein von E. coli ist ein ca. 30 kDa großes Protein; es enthält vier Eisen-
Schwefel-Gruppen und induziert die Regulation vieler Gene, wie z. B. der DMSO-Reduktase
(SPIRO u. GUEST 1990; UNDEN u. DUCHENE 1987; WEINER et al. 1992), die am
anaeroben Stoffwechsel beteiligt sind; gleichzeitig wird die Expression von Genen, die am
aeroben Metabolismus beteiligt sind unterdrückt. Escherichia coli besitzt Enzyme zur
Nutzung von DMSO und anderen Substraten als Elektronenakzeptoren und wächst unter
anaeroben Bedingungen auf Minimalmedium mit Glyzerol als Kohlenstoff- und Energiequelle
sowie DMSO als terminalem Elektronenakzeptor (BILOUS u. WEINER 1985). Die DMSO-
Reduktaseaktivität kann durch die Anwesenheit von Nitrat oder Sauerstoff unterdrückt
werden. Andererseits induziert anaerobes Wachstum auf DMSO als terminalem
Elektronenakzeptor die Aktivität von Nitrat, Fumarat und Trimethylamin-N-Oxid Reduktase
(BILOUS u. WEINER 1985). Ein Abfall des Sauerstoffspiegels, aber auch andere Faktoren
wie Wachstumsphase und Kohlenstoffquelle spielen eine wichtige Rolle bei der FNR-
Expression von E. coli (SOLTES u. MACINNES 1994).
Das HlyX Protein von A. pleuropneumoniae ist homolog zum FNR-Protein von E. coli
(JERLSTROEM et al. 1987; MACINNES et al. 1990; WOODS u. GUEST 1987). Wie FNR
enthält auch HlyX vier Eisen-Schwefel-Gruppen, die für das DNA-Bindungsvermögen des
Proteins verantwortlich sind (GREEN u. BALDWIN 1997). MACINNES et al. (1990) haben
die Nukleotidensequenz des hlyX-Gens analysiert und dabei einen offenen Leserahmen mit
einer Länge von 720 bp identifiziert, der von Länge und Sequenz her dem des fnr-Gens
entspricht. Der offene Leserahmen kodiert für ein Protein mit einer molekularen Masse von
27,1 kDa. Die Nukleotidsequenz liegt unter der Zugangsnummer M34443 bei GenBank vor.
Der Vergleich der Nukleotidsequenz von hlyX mit der von fnr zeigt, dass beide zu 65%
identisch sind. Im hlyX-Gen sind Glycin, Isoleucin und Leucin vorwiegend durch CAA, ATT
und TTA kodiert, während bei fnr GAG, ATG und CTG die häufigsten Kodierungstripletts
sind. Die abgeleiteten Proteinsequenzen von FNR und HlyX sind sehr ähnlich, 71% von 239
Aminosäuren sind identisch. Vier Cysteinreste (Positionen 14, 18, 21 und 27) sind am
aminoterminalen Ende von sowohl HlyX als auch FNR vorhanden. Weiterhin ist auch die
Erkennungssequenz von HlyX der von FNR sehr ähnlich (15 von 18 Basen sind identisch).
21
Literaturübersicht
Die Konsensussequenz für HlyX-Bindungsstellen ist TTGAT----ATCAA und die
Erkennungssequenz von FNR ist TTGAT----ATCAG (GREEN u. BALDWIN 1997). Die
vergleichbare Aktivität von HlyX und FNR wurde auch dadurch bestätigt, dass eine FNR-
Mutante mit HlyX komplementiert werden konnte (GREEN u. BALDWIN 1997;
MACINNES et al. 1990). Anders als das FNR-Protein war das HlyX-Protein aber in der
Lage, die Synthese einer hämolytischen Aktivität bei E. coli unter anaeroben Bedingungen zu
induzieren (SOLTES u. MACINNES 1994); dieses Ergebnis weist auf Unterschiede der
beiden Proteine in ihrem DNA-Bindungsvermögen hin. Die Anwesenheit von HlyX oder
FNR sind für das Wachstum von E. coli (∆fnr) auf einem Glycerol-Nitrat Minimalmedium
unter anaeroben Bedingungen essentiell. Im Gegensatz dazu werden weder HlyX noch FNR
beim Wachstum auf demselben Medium mit Fumarat gebraucht (SOLTES u. MACINNES
1994).
Es wird vermutet, dass A. pleuropneumoniae ein ähnliches hierarchisches System für die
Expression der Gene im sauerstoffarmen Milieu wie E. coli hat (MACINNES et al. 1990).
Bisher wurde gezeigt, dass die DMSO-Reduktase und die Aspartase bei A. pleuropneumoniae
im ex vivo Modell (Zusatz von BALF zum Kulturmedium) hochreguliert sind und dass die
kodierenden Gene über potentielle HlyX-Bindungsstellen verfügen (BALTES et al. 2003;
JACOBSEN et al. 2005). Die Deletion des dmsA-Genes führt zur Attenuierung von
Actinobacillus. pleuropneumoniae in der akuten Phase der Infektion (BALTES et al. 2003).
Eine A. pleuropneumoniae ∆aspA∆dmsA Doppelmutante zeigte in Kultur reduziertes
Wachstum unter anaeroben Bedingungen sowie einen milderen klinischen Verlauf nach
Aerosol-Infektion als der Wildtypstamm und konnte nur selten in intakten Lungengeweben
nachgewiesen werden (JACOBSEN et al. 2005). Der A. pleuropneumoniae Wildtypstamm
konnte jedoch in großer Anzahl aus unverändertem Lungengeweben isoliert werden. Diese
Ergebnisse zeigen, dass mit der DMSO-Reduktase und der Aspartase zwei mögliche Vertreter
des HlyX-Regulons an Pathogenese und Persistenz beteiligt sind. Daraus lässt sich die
Hypothese ableiten, dass HlyX-regulierte Gene allgemein von grosser Bedeutung für die
Pathogenese und Persistenz von A. pleuropneumoniae im Respirationstrakt sind. In der
vorliegenden Arbeit sollte diese Hypothese überprüft werden. Dazu sollte eine hlyX-negative
Mutante von A. pleuropneumoniae erstellt und im Aerosolinfektionsmodell am Schwein auf
ihre Virulenz hin überprüft werden.
22
Material und Methoden
3 Material und Methoden
Die Zusammensetzung von Medien, Medienzusätzen und Puffern ist im Anhang aufgeführt
(Kapitel 9.2). Die benutzten Geräte, Enzyme und Chemikalien sind ebenfalls im Anhang
aufgeführt (Kapitel 9.1, 9.15 und 9.16)
3.1 Bakterienkulturen
3.1.1 Bakterien und Plasmide
Die in der Arbeit verwendeten Bakterienstämme und Plasmide sind in der Tabelle 2
aufgeführt.
3.1.2 Kultivierungsbedingungen
E. coli wurde in Luria-Bertani (LB) Medium im Schüttelinkubator (Incubator Shaker Series
25, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) oder auf LB-Agar im Brutschrank
(Memmert GmbH + Co. KG, Schwalbach) kultiviert. Je nach Kultivierungsziel wurden
Zusätze hinzugefügt.
Actinobacillus. pleuropneumoniae wurde in PPLO-Medium bzw auf PPLO-Agar mit
bestimmten Zusätzen kultiviert.
Für anaerobe Kulturen wurden 36 ml Medium mit 4 ml einer Übernachtkultur beimpft und im
Schüttler bis zu einer optischen Dichte bei 660 nm (OD660) von 0,3 inkubiert. Anschließend
wurde die Kultur in zwei Aliquots von 20 ml aufgeteilt. Ein Aliquot wurde normal im
Schüttler als aerobe Kontrolle weiter bebrütet und das zweite Aliquot wurde als anaerobe
Anzucht im Anaerobiertopf (OXOID, Wesel, Deutschland) für 3 Stunden inkubiert. Für die
Trockengewichtegewinnung wurden die Kulturen 16 Stunden in der Anaerobierkammer
inkubiert.
3.2 Ermittlung der Zelldichte
Die Zelldichte wurde durch die Messung der optischen Dichte der Flüssigkulturen bei 660 nm
(OD660) bestimmt.
23
Material und Methoden
3.3 Isolierung, Reinigung und Quantifizierung von DNA
Puffer und Lösungen zur Reinigung und Quantifizierung der DNA sind im Anhang aufgeführt
(Kapitel 9.3)
3.3.1 Präparation chromosomaler DNA von A. pleuropneumoniae
1. Bakterien von einer gut bewachsenen Platte wurden in 2,5 ml TE-Puffer resuspendiert.
2. EDTA (10 mM, 25 µl), SDS (1%, 125 µl) und Proteinase K (500 µg/ml, 32 µl)
wurden zugegeben, gemischt und bei 55°C im Wasserbad inkubiert.
3. RNAse (100 µg/ml, 19 µl) wurde zugegeben und 30 min im Wasserbad 37°C
inkubiert.
4. Phenol (250 µl) in TE-Puffer wurde hinzugefügt, gemischt und bei -70°C über Nacht
eingefroren.
5. Das Gemisch wurde vorsichtig bei 55°C aufgetaut und Chloroform:Isoamylalkahol
(24:1)–Gemisch (500 µl) wurde anschließend zur Trennung der Phasen dazugegeben.
6. Der Ansatz wurde bei 10.000 rpm (SA600-Rotor), bei 4°C für 5 min zentrifugiert, der
Überstand wurde mit einer Plastik-Pasteurpipette entnommen und in ein neues
Polypropylen-Röhrchen pipettiert.
7. Die Phenol/Chloroform Extraktion mit 500 µl (ca. 1/5 des Volumens)
Chloroform:Isoamyl (24/1)-Gemisch wurde wiederholt und bei 10.000 rpm, 4°C 10
min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Plastikröhrchen überführt.
8. Die DNA wurde mit 3M Na-Acetat pH 5,2 (250 µl, ca. 1/10 des Volumens) und
Isopropanol (2,5 ml, ca. 1 Volumen) ausgefällt.
9. DNA-Fasern wurden mittels einer Pipettenspitze aufgewickelt, in 70% Ethanol für 5
min gewaschen und luftgetrocknet.
10. Die DNA wurde in 200 µl A. bidest. resuspendiert.
11. Die DNA wurde anschließend im Kühlschrank über Nacht aufbewahrt.
12. Die DNA wurde durch Elektrophorese von 1 µl der Präparation auf einem Agarosegel
quantifiziert.
24
Material und Methoden
25
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Material und Methoden
26
Material und Methoden
3.3.2 Alkalilysis-Verfahren zur Präparation von Plasmid DNA
Drei ml Übernachtkultur (Schüttler) wurden abzentrifugiert.
1. Das Pellet wurde in 300 µl Tris-EDTA ( 50 mM Tris-HCl [pH 8,0]; 10 mM EDTA,
1 mg/ml RNAse) resuspendiert.
2. Dreihundert µl NaOH-SDS-Lösung (0,2 M NaOH, 1% [w/v] SDS) wurden
hinzugegeben und bis zur Lyse der Bakterien bei Raumtemperatur (längstens 3 min)
inkubiert.
3. Dreihundert µl 3,2 M K-Acetat-Puffer (pH 5,5) wurden zugegeben, die Suspension
wurde gründlich gemischt und für 10 min bei 13.000 rpm zentrifugiert.
4. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt.
5. Die Präzipitation erfolgte durch Zugabe von 600 µl eiskaltem Isopropanol bei
Raumtemperatur.
6. Nach 10 min Zentrifugation bei 13.000 rpm wurde das Pellet getrocknet.
7. Das Pellet wurde in 25 µl A. dest. resuspendiert.
3.3.3 DNA-Aufreinigung mit “Nucleospin-Extract” (Macherey-NAGEL GmbH&CO.
Düren Deutschland)
1. Das DNA Fragment wurde unter UV-Licht (280 nm) aus einem TAE-Agarosegel
ausgeschnitten und gewogen.
2. Dreihundert µl NT1-Puffer/100 mg Gel wurden zugegeben und im Wasserbad bei
50°C bis zum vollständigen Lösen des Gels inkubiert.
3. Das aufgelöste Gel wurde auf ein Nucleospin-Säulchen geladen bei 10.000 rpm für
1 min zentrifugiert und die Flüssigkeit verworfen.
4. Fünfhundert µl NT2-Puffer wurden zugegeben und bei 13.000 rpm für 1 min
zentrifugiert und das Eluat verworfen.
5. Sechshundert µl NT3-Puffer wurden zugegeben, bei 13.000 rpm für 1 min
zentrifugiert und das Eluat verworfen.
6. Zweihundert µl NT3-Puffer wurden zugegeben und bei 13.000 rpm für 5 min
zentrifugiert und das Eluat verworfen.
7. Das Säulchen wurde in neues Reagenzgefäss überführt, 25-50 µl A. bidest. wurden
hinzugegeben und 2 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die aufgereinigte DNA
wurde durch Zentrifugieren bei 11.000 rpm für 1 min eluiert.
27
Material und Methoden
3.3.4 Aufreinigung mit dem „ GENE Clean“-KIT
1. Mit steriler Skalpellklinge wurden die Blöckchen möglichst „knapp“ aus dem
Agarosegel ausgeschnitten und in ein Reaktionsgefäß überführt.
2. Das Reaktionsgefäß mit Blöckchen wurde gewogen, das Gewicht des Blöckchens
wurde als Differenz zum Leergewicht ermittelt.
3. Die dreifache Menge des Blöckchengewichtes an Natriumjodidlösung wurden
zugegeben und ca 3 min bei 55°C inkubiert (bis zum Auslösen der Blöckchen).
4. Drei µl vollständig in Suspension gebrachte Glassmilch wurden zugegeben und
30 min bei Raumtemperatur stehengelassen.
5. Es wurde 20 sek. mit voller Geschwindigkeit (13000 rpm) zentrifugiert.
6. Der Überstand wurde abgenommen und verworfen, 500 µl „New Wash“ wurden
zugegeben und die Glassmilk wurde durch gründliches Pipettieren resuspendiert.
7. Es wurde wieder 20 sek. zentrifugiert und der Überstand verworfen.
8. Das Waschen mit „New Wash“ wurde noch 2 mal wiederholt.
9. Nach dem letzten Abpipettieren des Überstands wurde 3 min mit voller
Geschwindigkeit zentrifugiert und der Überstand mit einer gelben Pipettenspitze
restlos abgenommen.
10. Die Glassmilch wurde in 27 µl A. dest. resuspendiert und 3 min bei 55°C inkubiert.
11. Es wurde 3 min mit voller Geschwindigkeit zentrifugiert und 25 µl Überstand
wurden in ein neues Reaktionsgefäß überführt.
3.3.5 Bestimmung der DNA-Konzentration
Die DNA–Konzentration wurde im Spektrophotometer Ultrospec III bei 260 nm gemessen.
Der Leerwert wurde mit A. dest. eingestellt.
3.3.6 Anaerobe Anzucht zum Vergleich verschiedener Stämme und Bestimmung des
Trocknengewichts der Pellet
Tag 1:
1. PPLO-Medium wurde mit der adäquaten Menge EIVX und Tween 80 versetzt,
100 ml wurden mit einem Messzylinder abgemessen und in 200 ml Kolben
gefüllt.
28
Material und Methoden
2. Das Medium wurde in die Anaerobenkammer eingeschleust, die Deckel wurden
etwas gelockert und das Medium wurde dort für mindestens 2 Tage stehen
gelassen.
Tag 2:
PPLO-Platten wurden mit den zu untersuchenden A. pleuropneumoniae wt und
Actinobacillus pleuropneumoniae ∆hlyX-Stämmen beimpft.
Tag 3:
Beimpfte Platten und sterile Ösen wurden in die Kammer eingeschleust und das
Medium wurde beimpft.
Tag 4:
1. Nach 16 Stunden Inkubation wurden die Kulturen ausgeschleust.
2. Zur Reinheitskontrolle wurde eine Öse des Kulturmaterials auf Blutagar
ausgestrichen.
3. Kulturen wurden in Zentrifugenbecher überführt und bei 4°C, 8.000 rpm für
10 min abzentrifugiert. Kulturmaterial, dass am Kolbenboden klebte, wurde
mittels abgeflammter Glaspipette gründlich abgeschwemmt
4. Die gummiartigen Pellets wurden nach dem Zentrifugieren mit 5 ml steriler
physiologischer NaCl-Lösung in zuvor gewogene Polypropylenröhrchen
überführt.
5. Röhrchen wurden bei 4°C, 8,000 rpm, 10 min zentrifugiert.
6. Der Überstand wurde verworfen und die Röhrchen wurden 24 Stunden bei 80°C
inkubiert.
Tag 5:
1. Die Reinheitskontrolle wurde überprüft.
2. Die Röhrchen mit den getrockneten Pellets wurden gewogen und die Trockengewichte der
Pellets wurden anschließend berechnet.
3.4 Plasmidkonstruktion
3.4.1 PCR 2.1-TOPO-Cloning
1. Zu 2 µl des PCR 2.1-TOPO -Produkts wurden 1 µl Salzlösung, 1 µl steriles A. dest und
1 µl Vektor 2.1- TOPO hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 10 min inkubiert.
29
Material und Methoden
2. Fünfzig µl kompetenter E. coli wurden in ein Reaktionsgefäß pipettiert, die oben
inkubierte Lösung wurde hinzugegeben und auf Eis für 10 min stehen gelassen.
3. Das Gemisch wurde anschließend im Thermoblock bei 42°C für 20 sek. Inkubiert und
anschlissend auf Eis gestellt.
4. Zweihundertfünfzig µl SOC-Medium (Zusammensetzung im Anhang, Chapitel 8.2)
wurden nach dem Hitzeschock dazu pipettiert und dann wurden die Zellen für 1 Stunde
bei 37°C geschüttelt.
5. Auf LB-Platten mit Ampicillinzusatz wurden 25 µl X-Gal Lösung (25 mg/l,Verdünnung:
25 µl X-Gal Stammlösung + 125 µl A. dest) ausplattiert.
6. Die Bakterien wurden auf Platten (Platte 1: 200 µl, Platte 2: 100 µl) ausplattiert und im
Brutschrank bei 37°C über Nacht inkubiert.
7. Am nächsten Tag wurden die Platten überprüft und an weiβen Kolonien wurde eine PCR
zum Nachweis des Inserts durchgeführt.
3.4.2 Restriktionsenzymverdau
Die Zusammensetzung der angewendeten Puffer sind im Anhang aufgeführt (Chapitel 8.4).
Die Restriktionsenzymverdaus wurden in 25 µl Ansätzen (0,5 bis 1 µg DNA) durchgeführt.
Die DNA wurde mit A. dest., den jeweiligen Restriktionsendonukleasen, 10 × Carlos Puffer
und DTT-Puffer (10 mM) und BSA (1 mg/ml) gemischt und bei 37°C für 2 Stunden inkubiert.
Der Verdau wurde anschließend auf ein Agarosegel geladen und bewertet.
3.4.3 Auffüllen von Enden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase
Nach dem Restriktionsverdau mit den Enzymen BglII und XcmI wurden 0,5 µl einer dNTP-
Stammlösung (je 10 mM dATP, dCTP, dTTP und dGTP) und 0,4 µl T4 – Polymerase/Klenow
Fragment (Biolabs, Schwalbach Taunus, England) in den Ansatz (25 µl) gegeben und im
Wasserbad (12°C) für 20 min inkubiert.
3.4.4 Agarosegelelektrophorese
Die Puffer, die Lösungen und der Marker sind im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.5)
1. Je nach Größe wurden die DNA-Fragmente im 0,8-1,5 %igen Gel aufgetrennt.
2. Für das Gießen eines Gels wurde die erforderliche Menge der Agarose in entsprechendem
Puffer (1 x TAE/0,5 x TBE) unter Kochen gelöst, in einem 55°C Wasserbad abgekühlt
und mit Ethidiumbromid (1 µl Stammlösung [10 mg/ml] pro 50 ml) versetzt.
30
Material und Methoden
3. Das Gel wurde in eine Gelkammer gegossen
4. Nach dem Erstarren wurde das Gel in eine Elektrophoresekammer mit Laufpuffer
eingelegt.
5. Die Proben wurden mit entsprechenden Ladepuffer versetzt und, genauso wie HindIII-
verdaute λ-DNA als Größenstandard, in die Geltaschen geladen.
6. Die Stromspannung und die Zeit der Auftrennung wurden entsprechend Größe und
Konzentration des Gels und der Größe der DNA-Fragmente eingestellt (180V für große
und 80V für kleine Gele und 1 Stunde).
7. Nach Auftrennung wurden die DNA-Fragmente unter UV-Licht beurteilt oder mit einer
Polaroid-Kamera bzw. mit dem Biorad MultiAnalyst-System fotografiert.
3.4.5 Ligation
Zur Ligation wurden Vektor (0,1 µg DNA), Insert (im Überschuss), A. dest., 2 x Ligasepuffer
und T4-DNA-Ligase in einem 20 µl Ansatz gemischt und bei 16°C für über Nacht inkubiert.
Ein Ansatz ohne Insert mit Ligase diente als negative Kontrolle.
Tabelle 3: Zusammensetzung des Ligationsgemisches
Ansätze 1 2 3 4 Vektor 2,5 µl 2,5 µl 2,5 µl 2,5 µl Insert 7,5 µl 2,5 µl - -
A. dest - 5 µl 7,5 µl 7,5 µl 2 x Ligasepuffer 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl
Ligase + + + -
3.5 Transformation
Die Puffer und die Medien zur Transformationsdurchführung sind im Anhang aufgeführt
(Kapitel 9.2 und 9.6).
3.5.1 Herstellen von chemisch kompetenten Zellen
1. Escherichia coli DH5α wurde auf LB-Agar ausplattiert und im Brutschrank bei 37°C über
Nacht bebrütet.
31
Material und Methoden
2. Eine Einzelkolonie wurde in 3 ml LB-Medium mit 20 mM MgCl2 angeimpft und als
Standkultur bei 37°C über Nacht inkubiert.
3. 150 ml LB-Medium mit 20 mM MgCl2 (über Nacht vorgewärmt) wurden mit der
Standkultur beimpft und bei starkem Schütteln bebrütet.
4. Bei OD660 von 0,3-0,4 wurde die Kultur auf Eis gestellt und in vorgekühlter Zentrifuge
(4°C) 4000 x G, 10 min pellettiert.
5. Der Überstand wurde verworfen; das nach dem Abgießen verbleibende Restmedium
wurde vorsichtig mit einer Pipette entfernt.
6. Das Pellet wurde in 30 ml TFB1 (eiskalt, pH 5,8) resuspendiert und mindestens 90 min
auf Eis gestellt.
7. Die Bakterien wurde bei 4°C 4000 x G, 10 min pelletiert, der Überstand verworfen und
das Restmedium mit einer Pipette abgenommen.
8. Das Pellet wurde in 5 ml TFB2 Lösung (pH 6,5) resuspendiert und für maximal 30 min
auf Eis gehalten.
9. Das Abfüllen erfolgte in vorgekühlte Eppendorfreaktionsgefäße (Aliquots ca.250 µl/-
Reaktionsgefäß) und die Aliquots wurden bei – 70°C eingefroren.
3.5.2 Transformation von chemisch kompetenten E. coli DH5α Zellen mit Plasmiden
1. Kompetente Zellen (DH5αF’) wurden aus – 70°C entnommen und auf Eis aufgetaut.
2. Zu 100 µl kompetenten Zellen wurden 10 µl Ligationsansatz gegeben.
3. Das Gemisch wurde für 1 Stunde auf Eis gestellt und anschließend im Thermoblock bei
42°C für 3 min inkubiert.
4. Nach dem Hitzeschock wurden die Ansätze für 2 min auf Eis gestellt.
5. Zweihundert µl LB-Medium wurden zugegeben und die Suspension wurde im
Brutschrank bei 37°C für eine Stunde inkubiert.
6. Die Bakterien wurden auf ½ vorgetrocknete Agarplatte mit entsprechendem Antibiotikum
ausplattiert und mit der Öse fraktioniert.
7. Die Platten wurden bei 37°C inkubiert und Kolonien nach 12 – 16 Stunden beurteilt.
32
Material und Methoden
3.5.3 Elektrotransformation von Actinobacillus pleuropneumoniae
3.5.3.1 Herstellen elektrokompetenter Zellen
1. Fünfzig ml supplementiertes PPLO-Medium mit 0,1% Tween80 wurden mit einer
Einzelkolonie beimpft und über Nacht bei 37°C mit 5% CO2 inkubiert; 250 ml
supplementiertes PPLO-Medium mit 0,1 % Tween80 wurden über Nacht bei 37% mit
5% CO2 vorgewärmt.
2. Die 250 ml Medium wurden mit 25 ml der Übernachtkultur beimpft und bei 37°C im
Schüttler bis zu einer OD600 von 0,3 – 0,4 inkubiert.
3. GYTT-Medium wurde für 20-30 min zum Vorkühlen auf Eis gestellt.
4. Die Bakterien wurden bei 4°C in der vorgekühlten Zentrifuge bei 5.000 rpm für 10 min
abzentrifugiert, der Überstand wurde verworfen.
5. Das Bakterienpellet wurde dreimal vorsichtig mit eiskaltem GYTT-Medium (50 ml,
30 ml, 20 ml) gewaschen und der Überstand wurde nach dem Zentrifugieren (5.000 rpm,
4°C, 10 min) jeweils mit einer Pipette abgenommen.
6. Die Bakterien wurden in einem Endvolumen von 1,5-2 ml eiskaltem GYTT aufgenommen
und am selben Tag transformiert.
7. Die Reinheit der transformierten Bakterien wurde auf supplementiertem PPLO-Agar und
auf Blutagar überprüft.
3.5.3.2 Durchführung der Elektrotransformation von Actinobacillus pleuropneumoniae
1. Die Elektroporationsküvetten wurden auf Eis gestellt, supplementiertes PPLO-Medium
wurde in 5% CO2 bei 37°C vorgewärmt (1 ml je Ansatz).
2. 2-5 µg (10 µl) dialysierte DNA und 200-300 µl kompetente Zellen wurden in die
vorgekühlten Küvetten gegeben und 20-30 min auf Eis gestellt.
3. Der Genpulser wurde auf 2,5 KV, 25 µFD und 1000 Ω eingestellt.
4. Wassertropfen an der Außenseite der Küvette wurden vor dem Einstellen in den Gen-
Pulser getrocknet und die Elektroporation wurde durchgeführt.
5. Sofort nach der Elektroporation wurde 1 ml vorgewärmtes PPLO-Medium in die Küvetten
gegeben und gemischt. Der Gesamtinhalt wurde in Polypropylen-Röhrchen überführt und
für 2 – 3 Stunden bei 37°C bebrütet.
6. Transformierte Zellen wurden anschließend auf Agar mit den entsprechenden Antibiotika
ausplattiert und über Nacht bei 37°C, 5% CO2 inkubiert.
33
Material und Methoden
7. Platten wurden am nächsten Tag beurteilt.
3.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Verwendete Primer sind in der Tabelle 2 aufgeführt.
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde wie folgende durchgeführt:
1. Fünf µl Template (DNA oder Kolonie [in 100 µl 0,1% TE]) wurden in PCR-Gefäße
pipettiert.
2. Der Mastermix wurde erstellt (Tabelle 4); 0,1 µl Taq-Polymerase pro Ansatz wurde zum
auf Eis gekühlten Mastermix gegeben.
3. Zwanzig µl Mastermix mit Taq-Polymerase wurden in die PCR-Gefäße pipettiert.
4. Die PCR-Reaktionen (mit Positiv- und Negativkontrollen) wurden in den Thermocycler
gestellt und das HLYX5 Programm (94°C 3 min; [94°C 30 sek., 55°C 1 min, 72°C 2 min
30 sek.] x 32 Zyklen; 72°C 10 min) wurde anschließend gestartet.
5. Nach Beendigung der PCR wurden die Proben entnommen und auf Agarose Gele (1,5 %)
geladen oder bei – 20°C eingefroren.
34
Material und Methoden
Tabelle 4: Mastermix-Zusammensetzung
Datum: Template: [ ] Plasmid [ ] chrom.
DNA [ ] Kolonie
Primer:
Volumen und benötigte Mengen/ Ansatz:
Mastermix [ ] 25
µl [ ] 50
µl [ ] anderes: _____ µl
benötigte Ansätze:
____ PCR- Puffer 10
x 2,5 µl 5 µl ___ µl ___ µl
MgCl 0, 75 µl 1,5 µl ___ µl ___ µl
dNTPs 10 mM/each 0,5 µl 1 µl ___ µl ___ µl
Primer 1 5 pM/each
2,5 µl 5 µl ___ µl ___ µl
Primer 2 5 pM/each
2,5 µl 5 µl ___ µl ___ µl
Bemerkungen:
H2O 11,15 µl 27,3 µl ___ µl ___ µl Cycler:
Taq 0,1 µl 0, 2 µl ___ µl ___ µl Programm:
Template 5 µl 5 µl ___ µl ___ µl Start: ___:___ Uhr
3.7 Konjugation von E. coli und A. pleuropneumoniae
Die verwendeten Puffer sind im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.7).
1. Donorstamm (E. coli ß2155 mit pEMOC2-Derivat) und Rezipientenstamm
(A. pleuropneumoniae wt) wurden auf festem Nährboden über Nacht (max. 14 Stunden)
kultiviert.
2. Die Kulturen wurden mit einem Wattetupfer von der Platte abgenommen, in 3 ml
vorgewärmtem TNM-Puffer resuspendiert und auf eine OD600 von 2 eingestellt.
3. Nitrozellulosefilter (Durchmesser 2,5 cm; Porenweite 0,45 µm) wurden auf Whatman
3MM Filterpapier gelegt (erwärmt auf 37°C); 50 µl Donorzellen und 400 µl
Rezipientenzellen wurden vorsichtig gemischt, auf die Nitrozellulosemembran
aufgebracht, über die gesamte Membran verteilt, und inkubiert, bis die auf der Membran
stehende Flüssigkeit in das darunterliegende Filterpapier gesaugt worden war.
35
Material und Methoden
4. Die noch leicht feuchten Membranen wurden auf vorgewärmtem PPLO Agar,
supplementiert mit 1% EIVX, 1 mM DAPI, 10 mM MgSO4 gelegt und ca. 7 Stunden bei
37°C und 5% CO2 inkubiert; für jede Membran wurde eine PPLO-EIVX-
Chloramphenicol (Cm, 5 µg/ml) Platte zum Vortrocknen in Inkubator gelegt.
5. Die Filter wurden abgenommen, in ERG verbracht und mit ca. 650 µl PPLO Medium
(supplementiert mit EIVX) durch vortexen abgewaschen.
6. Der Inhalt wurde auf eine vorgetrocknete supplementierte PPLO-EIVX-Cm-Platte
aufgebracht und bei 37°C, 5% CO2 inkubiert.
7. Die Trankonjuganten wurden durch PCR überprüft
3.8 Saccharose-Gegenselektion
Die verwendete Medien sind im Anhang aufgeführt (Chapitel 9.2).
1. Eine chloramphenicolresistente Kolonie wurde morgens in 1 ml vorgewärmtem
supplementiertem PPLO-Medium inokuliert und im Schüttler (37°C) für 2 Stunden (bis
zum Auftreten einer leichten Trübung) inkubiert.
2. Vierhundert µl 2,5-fach konzentriertes PPLO Medium 500 µl 40% Saccharose, 100 µl
steriles Pferdeserum und 10 µl EIVX wurden zugegeben.
3. Die Kultur wurde für 5-6 Stunden weiter geschüttelt. Im Anschluss wurden 50 µl von der
Kultur auf einer halben supplementierten PPLO-Platte ausplattiert, über die restliche
Hälfte der Platte fraktioniert und über Nacht bei 37°C im CO2-Inkubator (5 % CO2)
bebrütet.
3.9 Southern Hybridisierung
Puffer und Lösungen zum DNA-Transfer, zur Herstellung einer Gensonde und zur Southern-
Hybridisierung sind im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.8, 9.9 und 9.10).
3.9.1 Southern Blot
1. Die Depurinierung wurde in Depurinierungslösung für 15 min durchgeführt
2. Die Denaturierung der DNA erfolgte in Denaturierungslösung für 1 Stunde (3 x 20 min)
3. Die Neutralisation wurde in Neutralisierungslösung für 1 Stunde (3 x 20 min)
vorgenommen.
36
Material und Methoden
4. Der Unterbau in einer Plastikschale wurde mit 2 Lagen 3MM Filterpapier bedeckt und
unter Puffer gesetzt (10 × SSC) ; das Filterpapier wurde mit Puffer bedeckt.
5. Das Gel wurde mit Unterseite nach oben auf das Filterpapier gelegt.
6. Ein genügend großes Stück Tropilon–45 Membran (rundum ca. 2 mm größer als das Gel)
wurde mit A. dest. angefeuchtet und unter Vermeidung von Luftblasen aufgelegt.
7. Zwei Lagen Filterpapier (2 mm < Membran) wurden trocken aufgelegt.
8. Mehrere Lagen Papierhandtücher wurden als Saugkissen aufgelegt.
9. Ca. 500 g Gewicht wurde aufgelegt (je nach Gelgrösse; das Gewicht wurde so bemessen,
dass Papierhandtücher gerade eben zusammengedrückt sind).
10. Nach einer Blottingdauer von 0,5-15 Stunden wurden die Auflagen entfernt.
11. Das Gel wurde mit der Membran zusammen umgedreht, die Geltaschen (mit Bleistift) und
Seiten (Ecke abgeschnitten) wurden markiert.
12. Das Gel wurde abgezogen und entsorgt.
13. Die Membran wurde 5 min in 5 x SSC geschwenkt.
14. Die Membran wurde in Papierhandtüchern getrocknet und 2 Stunden bei 90°C gebacken.
15. Die gebackene Membran wurde in A. dest. angefeuchtet und in 6 x SSC Lösung für 2 min
geschwenkt.
16. Die Membran wurde eingerollt und mit ausreichend Hybrisierungspuffer (50 ml) in einer
Glasröhre für ca. 2 Stunden im Hybrisierungsofen inkubiert (Prähybridisierung).
17. Die Flüssigkeit wurde abgegossen, Hybrisierungspuffer (50 ml) und 5 min gekochte
Gensonde (ca. 50 µl) wurden dazugegeben, und die Membran wurde über Nacht (bei ca.
60 °C) hybridisiert.
Nach Abgießen des Hybridisierungspuffers und der Sonde wurde die Membran mit 1 x SSC +
0,5 % SDS ca. 1 Stunde (Waschpuffer 3 x gewechselt) gewaschen.
Zur Exposition der Membran auf Röntgenfilm wurde folgendermaßen vorgegangen:
1. Ein alter Film wurde als Unterlage mit Frischhaltefolie überzogen; die Blots wurden
darauf aufgelegt und mit Folie bedeckt.
2. Auf diese zweite Lage Frischhaltefolie wurden drei Stückchen Klebeband geklebt und mit
radioaktiver Tinte Kreuze als Markierung gemacht.
3. Die Blots wurden in eine Röntgenkassette eingelegt; der Film (Kodak X-OMAT AR,
SIGMA, Deisenhofen) wurde direkt auf Blots gelegt; eine Verstärkerfolie wurde darauf
gelegt, und der Film bei -70°C exponiert (Dauer je nach Aktivität des Blots).
37
Material und Methoden
3.9.2 Herstellen einer Gensonde nach der „Random-Priming“ Methode
Es wurden zusammenpipettiert:
5 µl OLB
1 µl acetyliertes BSA (10 mg / ml)
5 µl DNA (20 -30 ng ) vorher 5 min bei 100 °C, kurz auf Eis
10.5 µl A. dest.
1 µl T4-DNA-Polymerase (Klenow-Fragment)
2.5 µl dCTP-32*
25 µl Gesamtansatz
Das Gemisch wurde 4 -5 Stunden bei RT inkubiert, dann werden 100 µl STOP-Puffer
hinzugefügt.
3.10 Pulsfeld-Gel-Elektrophorese (PFGE)
Puffer, Lösungen und Marker sind im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.14)
1. Eine Platte supplementierte PPLO-Agar wurde am ersten Tag mit A. pleuropneumoniae
beimpft und im Brutschrank bei 37°C und 5 % CO2 bebrütet.
2. Das Koloniematerial wurde am zweiten Tag von der Platte abgeschwemmt und in 3 ml
Pett IV resuspendiert.
3. Die Suspension wurde auf eine OD600von 0,3 eingestellt.
4. Fünf ml Bakteriensuspension in Pett IV wurden bei 4°C und 4.000 rpm für 10 min
abzentrifugiert, der Überstand wurde abgegossen und das Pellet in 0,5 ml Pett IV
resuspendiert und gut durch Vortexen gemischt.
5. Das Röhrchen mit Bakteriensuspension wurde auf Eis gestellt.
6. Für je 10 Blöckchen wurde 1 ml einer 1,2% igen Agarose ( Biorad # 162-0135; Agarose
Chromosomal Grade Biorad, 25 g) angefertig und in einem 55°C Wasserbad aufbewahrt.
7. 0,5 ml warme Agarose wurde schnell in das Röhrchen mit der vorher vorgewärmten
Bakteriensuspension überführt und vorsichtig gemischt.
8. Mit einer 1 ml-Pipette wurden je 100 µl der agarosehaltigen Suspension in gereinigte
Gießförmchen pipettiert.
9. Die Förmchen wurden für 10 min in den Kühlschrank gestellt.
38
Material und Methoden
10. Nach Entfernung von überstehender Agarose von den Gießförmchen wurden je 5
Blöckchen mit umgebogenem Glas-„Pasteurhäkchen“ aus dem Gießstand gestoßen in ein
Röhrchen mit 3 ml Lysepuffer überführt
11. Die Blöckchen wurden in der Lysepufferlösung für 2 Stunden bei 37°C im Brutschrank in
Schräglage ohne schütteln inkubiert.
12. Die Lyselösung wurde abgegossen, jedem Röhrchen wurden 3 ml ESP-Puffer zugegeben
und über Nacht bei 55°C im Wasserbad ohne Schütteln inkubiert.
13. Der ESP-Puffer wurde abgegossen, die Blöckchen wurden mit 3 ml A. dest. gewaschen
und bei Raumtemperatur 15 min waagerecht sanft geschwenkt.
14. Das A. dest. wurde abgegossen und in jedes Röhrchen wurden 2 ml TE-PMSF-Gemisch
gegeben und 30 min bei Raumtemperatur sanft geschwenkt.
15. Der TE-PMSF-Puffer wurde abgegossen, 3 ml A. dest. wurden zugegeben und die
Röhrchen für 15 min bei Raumtemperatur sanft geschwenkt.
16. Das A. dest. wurde abgegossen, 3 ml TE-Puffer wurden hinzugefügt und die Röhrchen
wurden für 30 min bei Raumtemperatur waagerecht geschwenkt.
17. Der TE-Puffer wurde abgegossen und frischer TE-Puffer zugegeben und 30 min bei
Raumtemperatur geschwenkt.
18. Der TE-Puffer wurde abgegossen.
19. Fünf ml TE-Puffer wurden hinzugefügt und die Blöckchen über Nacht (oder länger) im
Kühlschrank aufbewahrt und anschließend verdaut (Tabelle 5).
20. Die Auftrennung der Makrorestriktionsfragmente erfolgte in einem 1%-igen TBE-
Agarose-Gel.
21. Zur Herstellung des Geles wurde die erforderliche Menge Agarose in 0,5 x TBE durch
Aufkochen gelöst und nach Abkühlen bei 55°C in eine Flachbettapparatur mit
eingesetztem PVC-Kamm zur Erzeugung der Probentaschen gegossen.
22. Der Kamm wurde nach Erstarren des Gels entfernt und die verdauten Blöckchen wurden
vorsichtig in die Slots eingesetzt.
23. Eine dünne Scheibe von Lambda Ladder PFG-Marker ( 50 µg/ml von NEB, Schwalbach,
Taunus, England) wurde als Größenstandard genutzt.
24. Befüllte Slots wurden mit erwärmter Agarose versiegelt und 15 min stehen gelassen.
25. Nach Befestigung der Umrandung in der PFGE-Kammer wurde das Gel in die Kammer
gelegt.
26. Der Laufpuffer wurde vorsichtig in die Kammer gegossen.
39
Material und Methoden
27. Das Programm wurde anschließend bei einer Temperatur von 12°C, einem
Spannungsgradienten von 6 V/cm bei eingeschlossenem Winkel von 120° auf Pulszeiten
von 10 bis 20 sek. (Block I, 14 Stunden) sowie von 35 bis 70 sek. (Block II, 12 Stunden)
eingestellt.
28. Nach der Beendigung der Auftrennung wurde das Gel in Ethidiumbromidlösung
(1:20.000; 25 µl Ethidiumbromidstocklösung [10 mg/ml] auf 500 ml A. dest.) für 15 min
gefärbt.
29. Das Entfärben erfolgte danach in A. dest. für 15 min.
Tabelle 5: Verdau der Blöckchen
ApaI Verdau AscI Verdau NotI Verdau Puffer (NEB) 25 µl 25 µl 25 µl BSA (NEB) 2,5 µl - 2,5 µl
ApaI 10 UI - - AscI - 10 UI _ NotI - - 10 UI
A. dest ad. 250 µl 250 µl 250 µl Ansätze mit ApaI wurden jeweils bei 25°C und Ansätze mit AscI und NotI bei 37°C über
Nacht inkubiert.
3.11 Sequenzierung
Die Nukleotidsequenzierung wurde von der Firma Seqlab (Göttingen, Deutschland) an einem
ABI-PRISM-Sequenziergerät (Modell 3700) mit der Kettenabbruchmethode nach SANGER
(SANGER et al. 1992) durchgeführt. Die Sequenzanalyse wurde mit dem HUSAR Programm
des deutschen Krebsforschungszentrums Heidelberg, Deutschland, durchgeführt.
3.12 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS) –Page
Die Puffer und die Lösungen zur SDS-Page Durchführung sind im Anhang aufgeführt
(Kapitel 9.11)
1. Supplementiertes PPLO-Medium mit 0,1% Tween80 (10 ml) wurde mit Actinobacillus.
pleuropneumonie AP76 und A. pleuropneumonie ∆hlyX beimpft und über Nacht inkubiert.
2. 40 ml vorgewärmtes Medium wurden mit 10 ml einer Übernachtkultur beimpft und im
Schüttler bis zu einer OD660 von 0,3 geschwenkt.
40
Material und Methoden
3. Bei Erreichen einer OD660 von 0,3 wurde eine Reinheitskontrolle durch Ausstreichen auf
Blutagar durchgeführt.
4. Zwanzig ml aerobe Kultur wurden abzentrifugiert und das Pellet wurde bei – 20°C
aufbewahrt; die verbleibenden 20 ml wurden für 3 Stunden in einen Anaerobiertopf
(OXOID, Wesel, Deutschland) verbracht.
5. Nach Messung der OD660 der anaeroben Kulturen wurde der Koeffizient berechnet, um
die OD an die der homologen aeroben Kulturen anzupassen.
6. Pellets der aeroben und anaeroben Kulturen wurden je in 200 µl A. dest resuspendiert;
7. Die Glasplatten wurden in einem Gießstand zusammengebaut.
8. Die Anfertigung der Gele erfolgte wie in Tabelle 6 beschrieben.
9. Die Gele wurden gegossen.
10. Zehn µl von jeder Bakteriensuspension und 10 µl Spaltpuffer wurden vermischt und bei
100°C für 5 min gekocht und anschliessend auf Eis gestellt.
11. Die Proben wurden geladen und die Elektrophorese im Mini-Protean II von BioRad bei
150 V für 1 Stunde durchgeführt.
Tabelle 6: Zusammensetzung des Polyacrylamidgeles
Trenngel Sammelgel A. dest.
1,5 Tris (pH 8,8) 0,5 Tris (pH 6,8)
SDS (10%) TEMED
Acrylamidlösung 10% APS
3,9 ml 2,5 mi
- 100 µl 10 µl 3,8 ml 100 µl
3,05 ml -
1,25 ml 50 µl 10 µl
0,65 ml 50 µl
3.13 Western Blot
Die Puffer, Lösungen und die Molekularmassenstandards sind im Anhang aufgeführt (Kapitel
9.12)
1. Die Gele wurden mittels Elektrotransfer in einer Biorad Transblot Apparatur auf
Nitrozellulosemembranen geblottet; die Membranen wurden in Blockpuffer gelegt und im
Kühlschrank über Nacht gelagert.
2. Der Blockpuffer wurde abgegossen und die Membran (ca. 100 cm2) wurde in 10 ml
Blockpuffer und 50 µl Kaninchen-anti-DmsA-Antiserum (Endkonzentration: 1:2000,
41
Material und Methoden
BALTES et al. 2003) eingelegt und auf dem Schüttler für 1 Stunde bei Raumtemperatur
geschwenkt.
3. Der Blockpuffer wurde abgegossen.
4. Die Membran wurde 3 x 5 min mit Waschpuffer gewaschen.
5. Zehn ml Waschpuffer und 20 µl 1 : 10 vorverdünntes alkalische Phosphatase-gekoppeltes
Ziege-anti-Kaninchen-Konjugat (Dianova, Hamburg) wurden auf die Membran gegeben
und auf dem Schüttler für 1 Stunde bei Raumtemperatur geschwenkt.
6. Die Membran wurde 2 x mit Waschpuffer gewaschen und anschließend 5 min mit
Substratpuffer gewaschen.
7. 10 ml Substratpuffer + 100 µl 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat [(BCIP), 5 mg/ml] +
100 µl Nitroblau Tetrazolium [(NBT), 10 mg/ml) wurden auf die Membran gegeben und
bis zum Erscheinen der Banden inkubiert.
3.14 Aspartase Test
Die Zusammensetzung des Aspartase-Puffers ist im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.13).
1. Der Test-Puffer wurde im Wasserbad auf 37°C vorgewärmt.
2. Das Photometer wurde auf 240 nm einstellt.
3. Ein ml Aspartase-Puffer wurde in Quarzküvetten eingefüllt und die Absorption gemessen
und notiert.
4. Es erfolgte die Zugabe von 50 µl Ganzzelllysat mit 1 mg /ml Proteingehalt.
5. Nach Messen des Nullwertes (Puffer) wurden die Werte alle 60 sek. gemessen.
3.15 Tierversuch
3.15.1 Versuchstiere
Die Untersuchungen wurden an 18 Schweinen der Rasse „Deutsche Landrasse“ im Alter von
7 bis 9 Wochen durchgeführt (Genehmigungsnummer für den Tierversuch: 009i-[neu]42502-
98/45). Die Tiere wurden durch Randomisierung in zwei Gruppen von je 9 Tieren eingeteilt
und in Isolierställen mit separatem Lüftungssystem gehalten. Die Luftfeuchtigkeit und
Temperatur wurden täglich kontrolliert. Die Tiere waren klinisch gesund und frei von
Actinobacillus. pleuropneumoniae. Die serologische Untersuchung der Versuchstiere auf eine
Actinobacillus. pleuropneumoniae Infektion erfolgte durch einen Enzyme-linked
42
Material und Methoden
Immunosorbent Assay (ELISA; (LEINER et al. 1999)). Sie wurden einmal täglich gefüttert
und erhielten Wasser ad libitum.
3.15.2 Herstellen der Bakteriensuspension für die Aerosolbelastung
Supplementiertes PPLO-Medium (je 10 ml) mit 0,1 % Tween 80 wurde jeweils mit
Actinobacillus. pleuropneumoniae wt und der A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante beimpft
und im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 über Nacht inkubiert. Diese Standkulturen von
Actinobacillus. pleuropneumoniae wt und A. pleuropneumoniae∆hlyX wurden am nächsten
Tag zur Inokulation von 90 ml supplementiertem PPLO-Medium mit 0,1 % Tween 80
verwendet; die Kulturen wurden im Schüttler bei 37°C bis zum Erreichen einer OD660 von 0,4
angezüchtet. Die Kulturen wurden auf Eis gestellt, mit eiskaltem NaCl (150 mM) 1:300
verdünnt und bis zur Belastung auf Eis aufbewahrt. Kurz vor der Belastung wurde eine
weitere Verdünnung 1:100 mit eiskaltem NaCl (150 mM) angefertigt; dann wurden 13 ml
dieser Bakteriensuspension pro 4 Schweine vernebelt (das enspricht etwa 1 x 105 Erreger/ml).
Bei dieser Vorgehensweise wird eine Erregerdichte von etwa 1 x 103 A. pleuropneumoniae
pro Liter Aerosol in der Kammer (siehe unten) erreicht.
3.15.3 Aerosolkammer und Infektion
Die Infektion erfolgte in einer Aerosolkammer, die vom Impfstoffwerk Dessau nach
Beschreibungen von JACOBSEN et al. (1996) gebaut wurde. Die Tiere wurden jeweils in
Gruppen von 4 oder 5 Tiere belastet, wobei 13 ml Bakteriensuspension (ca. 1 x 105 /ml) mit
einem Druck von 2 bar in ca. 2 min vernebelt wurden. Für das Vernebeln wurde die Düse
Modell Nr. 97058 (Schlick Duesen, Untersiemau, Deutschland) auf Position „5“ und das
Ventil auf Position „75“ eingestellt. Nach weiteren 10 min wurde das Aerosol mittels eines
Kompressors 20 min lang aus der Kammer abgepumpt. Anschließend wurden die Tiere in die
Ställe zurückgetrieben.
3.15.4 Überwachung und Erhebung klinischer Parameter
Einen Tag vor der Belastung wurde mit der Erhebung der klinischen Parameter begonnen;
dies wurde täglich bis Tag 7 nach der Belastung weitergeführt. Die klinischen Parameter
Körpertemperatur, Husten, Dyspnoe, Lethargie und Grad der Inappetenz wurden erhoben.
43
Material und Methoden
3.15.5 Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF)
Zur Gewinnung der BALF wurden die Tiere mit einem Gemisch von Azaperon (Stresnil,
Janssen GmbH, Neuss, Deutschland; 2mg/kg Körpergewicht) und Ketamin (Ursotamin,
Serumwerk Bernburg Ag, Bernburg; 15 mg/kg Körpergewicht) intramuskulär anästhesiert.
Nach Fixierung der Tiere wurde die BALF mit Hilfe eines flexiblen Bronchoskops (Typ
XP20, Fa. Olympus, Hamburg, Deutscland) nach Einführung bis zum Bronchus des rechten
Kraniallappens gewonnen. Einhundert ml lauwarme (30°C) NaCl-Lösung wurden in
Portionen von 20 ml eingegeben und wieder abgesaugt. Eine spezielle Saugpumpe
(Endoaspirator, Fa Georg Paudrach, Hannover, Deutschland) erzeugte ein Vakum von 0,2 bis
0,5 bar und gewährleistete somit die Rückgewinnung der Spülflüssigkeit (ca. 90 ml BALF
wurden pro Spülung und Tier gewonnen und bis zum Erregernachweis auf Eis gestellt).
3.15.6 Bakteriologischer Erregernachweis aus BALF
Ein ml BALF wurde bei 5.000 rpm für 2 Minuten zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde in
60 µl NaCl (150 mM) resuspendiert. Zwanzig µl dieser Suspension wurden auf Gassner-
Platte, Columbia Schafblut (CSB)-Agar und auf supplementiertem PPLO-Agar ausplattiert.
Die Platten wurden am nächsten Tag ausgewertet. A. pleuropneumoniae zeigt ein minimales
Wachstum mit Hämolyse auf der CSB-Platte und ein gutes Wachstum auf der
supplementierten PPLO-Agar-Platte. Erhaltene A. pleuropneumoniae-Kolonien wurden
gezählt, auf supplementiertem PPLO-Agar subkultiviert und mittels PCR-Analyse unter
Verwendung der Primer oHLYX6 und oHLYX7 bestätigt.
3.15.7 Sektion
Die Versuchtiere wurden nach BALF Gewinnung am Tag 21 mit einer intravenöse Injektion
von 10 ml Eutha 77 (Pentobarbital, Essex Pharma, München, Deutschland) euthanasiert.
Nach Eröffnung des Brustkorbes wurden die Organe entnommen und die Veränderungen
makroskopisch durch Adspektion und Palpation bewertet. Von jedem Lungenlappen wurde
eine Probe für die bakteriologische Untersuchung entnommen. Die Lungenveränderungen
wurden nach der Methode von HANNAN et al. (HANNAN et al. 1982) beurteilt. Die
Methode beruht auf einem “scoring“-System, wobei “scores“ von maximal 5 (komplett
verändert) für jeden Lappen und somit 35 (maximal) pro Lunge zu erreichen sind. Zur
Ermittlung des Lungen-„score“ sind die einzelnen Lungenlappen in Dreiecksfelder unterteilt
44
Material und Methoden
und einzelne Lungenläsionen werden auf den korrespondierenden Dreiecksfeldern markiert.
Die Zählung der veränderten Dreiecken ergibt den Grad der Läsion, der dann als „score“
ausgedrückt wird. Die Summe aller Lappen- „scores“ ergibt den “lung lesion score“
(HANNAN et al. 1982). Die Europäische Pharmakopoe schreibt diese Methode für Impfstoff-
Versuche mit A. pleuropneumoniae vor.
3.15.8 Bakteriologische Organuntersuchung
Proben von verändertem und intaktem Lungegewebe, von Tonsillen und von
Tracheobronchallymphknoten wurden zum bakteriologischen Erregernachweis verwendet.
Die Gewebeproben wurden nach dem Abflammen angeschnitten und auf CBS und
Selektivagar (Zusammensetzung im Anhang, Kapitel 9.2) fraktioniert ausgestrichen. Die
Platten wurden im Brutschrank bei 37°C, 5% CO2 über Nacht bebrütet. Die Platten wurden
folgendermaßen ausgewertet: (-) keine A. pleuropneumoniae -verdächtigen Kolonien, (+)
Actinobacillus. pleuropneumoniae-Kolonien nur im direkt beimpfen Bereich, (+ +)
Actinobacillus. pleuropneumoniae-Kolonien auch im Bereich der 1 Fraktionierung und (+ +
+) A. pleuropneumoniae-Kolonien auch im Bereich der 2. Fraktionierung).
Für die semiquantitative Bestimmung von A. pleuropneumoniae aus Lungenläsionen wurden
2 g Sequesternmaterial pro Tier aus 2 Läsionen entnommen und auf Eis gestellt. Hundert mg
des Materials wurden in Schraubdeckeleppendorfreaktionsgefäße abgefüllt und 5-6 große
Glaskugeln und 1 ml physiologische Kochsalzlösung wurden hinzugegeben. Das Gewebe
wurde mit dem FastPrep Gerät aufgeschlossen (Stufe 3, 40 sec). Von der Suspension wurden
20 µl entnommen und eine logarithmische Verdünnungsreihe (Doppelansatz) wurde angelegt.
Von den Verdünnungsstufen (unverdünnt bis 10-7) wurden je 25 µl auf supplementierten
PPLO-Agar aufgetropft und über Nacht inkubiert. Erhaltene A. pleuropneumoniae-Kolonien
wurden gezählt, auf supplementiertem PPLO-Agar subkultiviert und mittels PCR-Analyse
unter Verwendung der Primer oHLYX6 und oHLYX7 bestätigt.
3.15.9 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay )
Die Immunantwort der Versuchtiere wurde mittels eines ELISA ermittelt. Die Methode zur
Bestimmung des ApxIIA-Toxin-Antikörpertiters beruht auf einem standardisierten ELISA mit
einem rekombinanten A. pleuropneumoniae ApxIIA-Protein als Antigen (LEINER et al.
1999). Der ELISA wurde von der IVD (Innovative Veterinärdiagnostik, GmbH, Aninstitut,
Tierärztliche Hochschule Hannover) duchgeführt.
45
Material und Methoden
3.15.10 Statistik
Für die statistische Auswertung wurde das WinStat Plug-in Modul (R. Fitch Software,
Staufen, Deutschland) für Excel benutzt. Werte von p < 0,05 im Wilcoxon-Test wurden als
signifikant bewertet.
46
Ergebnisse
4 Ergebnisse
4.1 Konstruktion und Charakterisierung der A. pleuropneumoniae hlyX
Deletionsmutante
4.1.1 Konstruktion des Plasmids pHLYX701 für die Konjugation
Das hlyX-Gen wurde mit den Primern oHLYX5 und oHLYX6 innerhalb eines 2338 bp
großen Fragment amplifiziert (Abb. 1) und über eine Zwischenklonierung in einen pCR-2.1
TOPO Vektor in pBluescript Sk+ zur Konstruktion von pHLYX110 eingebaut. Dann wurden
883 bp des hlyX-Genes in pHLYX110 mit den Enzymen BglII und XcmI ausgeschnitten
(Abb. 1). Die Überhänge wurden mit Klenow-Fragment aufgefüllt und zu pHLYX111 ligiert
(Abb.2). Das deletierte hlyX-Gen wurde anschließend mit ApaI und NotI aus pHLYX111
herausgeschnitten und in den ebenso geschnittenen Konjugationsvektor pEMOC2 ligiert.
Hierbei entstand das Plasmid pHLYX701(Abb. 2).
Abbildung 1: hlyX Gen mit Primern und Restriktionssenzymschnittstellen
47
Ergebnisse
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Konstruktion von pHLYX701
48
Ergebnisse
4.1.2 Konstruktion der isogenen A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante
Das Plasmid pHLYX701 wurde in E. coli β2155 transformiert und anschließend in
Actinobacillus. pleuropneumoniae wt konjugiert. Transkonjuganden
(chloramphenicolresistente A. pleuropneumoniae Kolonien mit dem in das Chromosom
integrierten Plasmid) wurden mittels PCR mit den Primern oHLYX7 und oHLYX8 bestätigt;
diese Transkonjuganden wurden dann für die Saccharose Gegenselektion verwendet.
Saccharoseresistente Kolonien wurden auf Chloramphenicolsensitivität hin untersucht.
Saccharoseresistente, chloramphenicolsensitive Kolonien wurden mittels PCR auf die
Anwesenheit des deletierten hlyX-Gens hin überprüft.
4.1.3 Analyse der isogenen A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante
4.1.3.1 Genetische Überprüfung von A. pleuropneumoniae ∆hlyX
Saccharoseresistente chloramphenicolsensitive A. pleuropneumoniae ∆hlyX wurden mittels
PCR mit den Primern oHLYX6 und oHLYX7 mit dem Elternstamm A. pleuropneumoniae wt
Abbildung 3: A, PCR mit Primer oHLYX5 und oHLYX6; B, PFGE Analyse von
A. pleuropneumoniae wt und A. pleuropneumoniae ∆hlyX ; C, Southern Blot nach
Verdau mit DraI; 1, A. pleuropneumoniae AP76; 2, A. pleuropneumoniae ∆hlyX.
49
Ergebnisse
verglichen. Die korrekte Lokalisation der Deletion wurde am PCR-Produkt mittels
Nukleotidsequenzierung überprüft. Das deletierte hlyX-Gen weist eine Größe von 578 bp
gegenüber 1461 bp beim Wildtyp auf (Abb. 3A). Zusätzlich wurde eine
Pulsfeldgelelektrophorese nach Restriktionsverdau mit ApaI, AscI und NotI durchgeführt. Es
zeigte sich eine Übereinstimmung des Bandenmusters der A. pleuropneumoniae ∆hlyX-
Mutante mit dem von A. pleuropneumoniae wt (Abb. 3B). Weiterhin wurde genomische DNA
von A. pleuropneumoniae wt und A. pleuropneumoniae ∆hlyX mit DraI verdaut und im
Southern Blot durch Hybridisierung einer mit den Primern oHLYX5 und oHLYX6
konstruierten Gensonde überprüft. Die DraI-Schnittstelle liegt innerhalb der Deletion, was
dazu führt, dass im Blot beim A. pleuropneumoniae wt zwei (979 bp und 1368 bp) und bei
Actinobacillus pleuropneumoniae ∆hlyX nur eine Bande (1455 bp) zu sehen sind (Fig. 3C).
Eine anschließende Southern Blot Analyse erlaubte, die Lage des hlyX-Gen im Bereich der
Überlappung der Fragmente Asc3, ApaI und Not8 auf der physikalischen Genkarte zu
lokalisieren (Abb. 4).
Abbildung 4: Position des hlyX-Gen auf der physikalischen Karte von A. pleuropneumoniae AP76
50
Ergebnisse
4.1.3.2 Funktionelle Überprüfung der A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante
Da A. pleuropneumoniae unter anaeroben Bedingungen zur Verklumpung neigt, wurden die
Trockengewichte der Pellets für den Wachstumsvergleich herangezogen. Unter anaeroben
Verhältnissen zeigte A. pleuropneumoniae ∆hlyX ein signifikant reduziertes Wachstum nach
16 h Inkubationszeit zum Vergleich zu A pleuropneumoniae wt (p< 0,01). Das
Trockengewicht des Pellets der Mutante war im Vergleich zum Wildtyp um 37,3 % reduziert
(A. pleuropneumoniae wt 21,7 mg ± 1,15; A. pleuropneumoniae ∆hlyX 13,6 mg ± 0,5; p <
0,01; Abb. 5).
0
5
10
15
20
25
mg
Mittelwert
Pelletgewicht
A. pphlyX
Abbildung 5: Vergleich der Trockengewichte von A. pleuropneumoniae wt (A.pp) und
A. pleuropneumoniae ∆hlyX (hlyX) nach Kultivierung unter anaeroben Bedingungen;
dargestellt ist der Mittelwert aus 5 Untersuchungen.
Um die Spezifität der hlyX-Mutation zu überprüfen und um eventuelle polare Effekte
auszuschließen, wurde eine Komplementierung von A. pleuropneumoniae ∆hlyX mit dem
ganzen hlyX-Gen vorgenommen. Dazu wurde das hlyX-Gen mittels PCR mit den Primern
oHLYX9 und oHLYX10 auf einem 747 bp großen Fragment amplifiziert und in den
Plasmidvektor pLS88 transformiert; dieser Vektor hat ein breites Wirtsspektrum und kann in
E. coli und in A. pleuropneumoniae replizieren. Die beiden aus der Ligation resultierenden
Plasmide, pHLYX1300 (Orientierung in Richtung des vor der Ligationsstelle liegenden
51
Ergebnisse
Promotors) und pHLYX1301 (umgekehrte Orientierung) mit dem intakten hlyX-Gen, dienten
zur Komplementierung von A pleuropneumoniae ∆hlyX (Abb. 6).
Abbildung 6: Konstruktion der Plasmide für die Komplementierung der A. pleuropneumoniae lyX-
Mutante
52
Ergebnisse
Zur Überprüfung der Wiederherstellung der HlyX-Aktivität wurde zum einen die
Anwesenheit der DMSO-Reduktase durch Western Blot Analyse nach Anzucht unter
anaeroben Bedingungen geprüft; dabei wurde festgestellt, dass beide Plasmide eine
Transkription des dmsA Gens vermittelten (Abb. 7).
Abbildung 7: Western Blot Analyse der anaeroben DmsaA-Expression. A: Coomassie Blau
gefärbtes Gel; B: Western Blot Analyse; 1 A; pleuropneumoniae wt; 2
A. pleuropneumonie ∆hlyX, 3 A. pleuropneumonie ∆hlyX + pHLYX1300;
A. pleuropneumonie ∆hlyX + pHLYX1301 (links unter Standardbedingungen und
rechts unter anaeroben Bedingungen gewachsen).
Zum anderen wurde die Aktivität der Aspartase nach Anzucht unter anaeroben Bedingungen
untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass die Aspartase-Aktivität nur durch die
Komplementierung mit dem Plasmid pHLYX1300 (Orientierung in Richtung des vor der
Ligationsstelle liegenden Promotors) rekonstituiert werden konnte (Tabelle 7).
53
Ergebnisse
Tabelle 7: Überprüfung der Aspartaseaktivität in A. pleuropneumoniae wt, A. pleuropneumoniae
∆hlyX und A. pleuropneumoniae ∆hlyX komplementiert „in trans“ unter Verwendung
der Plasmide pHLYX1300 und pHLYX1301
Stämme Aspartaseaktivität anaerob
(relative Aktivität) A. pleuropneumoniae wt A. pleuropneumoniae ∆hlyX A. pleuropneumoniae ∆hlyX + pHLYX1300 A. pleuropneumoniae ∆hlyX + pHLYX1301
191a
106a
213 118
a Arithmetischer Mittelschnittwert von 3 unabhängigen Messungen von A. pleuropneumoniae wt und A. pleuropneumoniae ∆hlyX
4.2 Überprüfung von A. pleuropneumoniae ∆hlyX in der experimentellen
Aerosolinfektion
Die A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante wurde durch Aerosolinfektion im Tierversuch mit Actinobacillus. pleuropneumoniae wt verglichen. Die Belastungsdosis betrug 6,76 x 104
Bakterien für 4 Schweine in der Aerosolkammer in der A. pleuropneumoniae Wt-Gruppe und
5,98 x 104 in der A. pleuropneumoniae ∆hlyX-Gruppe. Die Infektion führte zu einer Erhöhung der Körpertemperatur auf 40°C oder höher am Tag 1 nach der Infektion bei 4 von 9 Tieren in
der A. pleuropneumoniae ∆hlyX-Gruppe gegenüber 6 von 8 Schweinen in der Actinobacillus. pleuropneumoniae wt-Gruppe. An den Tagen 2, 3 und 4 nach der Infektion
waren die Körpertemperaturen in der A. pleuropneumoniae ∆hlyX –Gruppe signifikant
niedriger ( p< 0,05) als in der A. pleuropneumoniae wt-Gruppe (Abb. 8). In der an Tag 21
post infectionem entnommenen BALF von Tieren in der A. pleuropneumoniae ∆hlyX–Gruppe
konnte A. pleuropneumoniae ∆hlyX nicht nachgewiesen werden. Dagegen wurde Actinobacillus. pleuropneumoniae wt aus der BALF von 5 Tieren in der A. pleuropneumoniae wt-Gruppe reisoliert. In der Wildtypgruppe starb ein Tier an infektionsbedingtem Kreislaufversagen 2 Tage nach der Belastung. Alle überlebenden Tiere wurden 21 Tage nach der Belastung euthanasiert. Bei
der Obduktion wiesen 6 von 9 Tieren aus der A. pleuropneumoniae ∆hlyX -Gruppe keinerlei makroskopisch erkennbaren Lungenläsionen auf; dagegen hatten nur 2 von 8 Tiere in der Actinobacillus. pleuropneumoniae wt-Gruppe keine sichtbaren Lungenveränderungen. Die vorhandenen Läsionen bei den verbleibenden Schweinen waren weniger ausgeprägt nach der
Infektion mit A. pleuropneumoniae ∆hlyX. Die histologische Untersuchungen zeigte keine
54
Ergebnisse
signifikanten Unterschiede zwischen beiden Gruppen. Die Unterschiede in den „lung lesion
scores“ waren statistisch signifikant (p< 0,05; Abb. 8).
Abbildung 8: Vergleich der Körpertemperaturen und „lung-scores“ bei Schweinen mit
A. pleuropneumoniae wt (AP76) und A. pleuropneumoniae ∆hlyX (hlyX) Infektionen;
A : Körpertemperatur der Tiere der A. pleuropneumoniae ∆hlyX und
A. pleuropneumoniae wt Gruppen nach der Infektion. Tag 0 ist der Tag der Infektion;
B: „lung-scores“ der Schweine der A. pleuropneumoniae ∆hlyX und
A. pleuropneumoniae wt Gruppen 21 Tage nach der Infektion; Sternchen zeigen
signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen an (p < 0,05).
Die A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante konnte nach der Infektion nur in verändertem Lungengeweben von 2 der 3 Tiere mit Lungenläsionen in Anzahlen von 2,6 x 105 und 3,4 x 105 KBE pro Gramm Gewebe reisoliert werden. Aus Tonsille und makroskopisch intakter
Lunge konnte A. pleuropneumoniae ∆hlyX nicht nachgewiesen werden. In der
Actinobacillus. pleuropneumoniae Wildtypgruppe wurde A. pleuropneumoniae in allen veränderten Lungengeweben von den 6 Tieren mit Lungenläsionen reisoliert. Die Anzahl der Erreger im veränderten Gewewebe war deutlich geringer bei Tieren aus der Actinobacillus. pleuropneumoniae hlyX-Gruppe als bei Tieren aus der A. pleuropneumoniae Wt-Gruppe. Die Bestimmung der Reisolierungskeimzahl war aufgrund des Vorliegens von Mischkulturen nur bei 4 Tieren erfolgreich und lag zwischen 4,6 x 106 und 4,0 x 107
koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Gramm Gewebe. Zusätzlich konnten von den 8 Tieren in der Wildtypgruppe A. pleuropneumoniae in makroskopisch unveränderten Lungen bei 7 Tieren, in tracheobronchalen Lymphknoten bei 4 Tiere und in den Tonsillen bei 6 Tiere nachgewiesen werden (von 6,2 x 104 KBE/g bis 3,0 x 107 KBE/g).
55
Ergebnisse
56
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lyX
Ergebnisse
4.3 Humorale Immunantwort
Eine Woche vor und 3 Wochen nach der Infektion wurden Serumproben gewonnen. In der
App∆hlyX-Gruppe waren nur die 3 Tiere mit Lungenläsionen serologisch positiv im ApxIIA-
ELISA-Test; dagegen waren alle überlebenden Tiere aus der Appwt-Gruppe serologisch
positiv.
57
Diskussion
5 Diskussion
Der Erreger A. pleuropneumoniae verursacht eine Pleuropneumonie, die infolge der hohen
Mortalität und der verminderten Gewichtzuhname chronisch kranker Tiere eine wirtschaftlich
bedeutsame Erkrankung in der Schweinehaltung darstellt. Die Persistenz von A. pleuro-
pneumoniae auch bei geimpften Tieren (FENWICK u. HENRY 1994) und die mangelnde
Kreuzprotektivität der Impfstoffe sind zwei Faktoren, die zunehmend an Bedeutung
gewonnen haben. Auch Tiere, die eine A. pleuropneumoniae-Erkrankung überlebt haben,
beherbergen trotz einer belastbaren Immunität weiterhin den Erreger und spielen als „Carrier“
eine entscheidende Rolle in der Verbreitung der Schweinepleuropneumonie (EUZÉBY 1998;
FENWICK u. HENRY 1994; RIOUX et al. 1997).
Im Rahmen der Entwicklung von Lebend-Markerimpfstoffen wurden bisher unter anderem
Deletionen in folgenden Genen erstellt und überprüft: eine nicht hämolysierende Mutante
(INZANA et al. 1991), eine ureasenegative Mutante (BALTES 2002; TASCON CABRERO
et al. 1997), eine ApxII-Toxin Mutante (PRIDEAUX et al. 1999), eine Urease und ApxII
Doppelmutante (TONPITAK et al. 2002), eine Urease- und ExbB-negative Doppelmutante
(BALTES 2002); eine dmsA Mutante (BALTES et al. 2003), eine hybB Mutante (BALTES u.
GERLACH 2004), eine TbpA und TbpB Doppelmutante (BALTES 2002), eine dmsA aspA
Doppelmutante (JACOBSEN et al. 2005).
Wie von BALTES et al. (2003) und von JACOBSEN et al. (2005) gezeigt wurde, werden die
Actinobacillus. pleuropneumoniae DMSO Reduktase und die Aspartase unter dem Einfluss
von BALF hochreguliert. Beide Enzymen sind an der anaerober Atmung beteiligt. Putative
HlyX-Bindungsstellen wurden bei dmsA und aspA gefunden. Die Deletion des dmsA und des
aspA Gens führen zur Attenuierung von A. pleuropneumoniae im Organismus (BALTES et al.
2003; JACOBSEN et al. 2005). Bei E. coli werden diese beiden Enzyme durch den globalen
Regulator FNR reguliert (COTTER u. GUNSALUS 1989; JERLSTROEM et al. 1987;
WOODS u. GUEST 1987). Das FNR-Protein enthält bei E. coli vier Eisen-Schwefel-Gruppen
und induziert die Expression vieler Gene, deren Produkte am anaeroben Stoffwechsel beteiligt
sind, bei gleichzeitiger Senkung der Expression von Genen, deren Produkte am aeroben
Stoffwechsel beteiligt sind (BAUER et al. 1999).
Bei A. pleuropneumoniae wurde HlyX als das Homolog von FNR identifiziert (MACINNES
et al. 1990). Die Analyse der Aminosäuresequenz von HlyX zeigt eine Region, die praktisch
identisch mit der DNA-Bindungsregion von FNR ist, und sich nur in einem einfachen
konservativen Aminosäureaustausch unterscheidet (MACINNES et al. 1990). Die
58
Diskussion
Hochregulierung von DMSO-Reduktase und Aspartase im ex vivo Modell (BALTES et al.
2003; JACOBSEN et al. 2005) führte zu der Hypothese, dass eine hlyX-Deletion eine
Attenuierung und Verhinderung der Persistenz herbeiführen könnte.Das Ziel der Arbeit war
es somit, die Rolle des hlyX-Genes in der Virulenz von A. pleuropneumoniae und bei der
Kolonisierung zu ermitteln.
Die Arbeit beruht auf der Konstruktion einer isogenen hlyX Mutante mit einer Deletion von
883 bp, die mittels Rekombination und anschließender Saccharose-Gegenselektion
(OSWALD et al. 1999) durchgeführt wurde. Die Deletion wurde durch PCR-Analyse und
nachfolgende Nukleotidsequenzierung des PCR-Produktes von A. pleuropneumoniae ∆hlyX
überprüft. Das deletierte hlyX-Gen hatte die vorhergesagte Grösse von 578 bp gegenüber
1461 bp beim Wildtyp. Der Verdau der genomischen DNA von A. pleuropneumoniae ∆hlyX
und von A. pleuropneumoniae wt mit DraI zeigte im Southern Blot wie erwartet zwei Banden
von 979 bp und 1368 bp bei dem Elternstamm und eine Bande von 1455 bp bei der Mutante.
Gleichzeitig zeigte die Übereinstimmung des Bandenmusters von A. pleuropneumoniae ∆hlyX
und A. pleuropneumoniae wt in der Pulsfeldgelelektrophorese, dass keine starken
genomischen Umlagerungen stattgefunden haben. Diese Ergebnisse belegen auf DNA-Ebene,
dass die gewünschte Mutante vorliegt.
Die isogene A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante zeigte ein reduziertes Wachstum in vitro
unter anaeroben Bedingungen, was zur Schlussfolgerung führt, dass der HlyX-Regulator
wichtig aber nicht unentbehrlich für die Anpassung von A. pleuropleuropneumoniae an
anaerobe Kulturbedingungen ist. Das Fehlen der DmsA-Expression, wie sie mittels Western
Blot-Analyse gezeigt wurde, sowie das Fehlen der Aspartase-Induktion bei der
Actinobacillus. pleuropneumoniae hlyX-Mutante wiesen darauf hin, dass beide Gene vom
globalen anaeroben Regulator HlyX reguliert werden. Um dieses Ergebnis zu belegen und
andere genomische Mutationen oder polare Effekte als Ursache auszuschließen, wurde das
hlyX-Gen in beiden Orientierungen mit Bezug auf den vektorständigen sulAB-Promotor auf
den Plasmiden pHLYX1300 und pHLYX 1301 in die A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante
transformiert und somit „in trans“ komplementiert. Die Expression der DMSO-Reduktase
konnte mit beiden Plasmiden wiederhergestellt werden. Die Induktion der Aspartase-Aktivität
gelang nur mit dem Plasmid, das das hlyX Gen in der richtigen Orientierung mit Bezug zum
vektorständigen Promotor enthält (pHLYX1300). Die Beobachtung, dass auch pHLYX1301
(vektorständiger Promotor ohne Einfluss) zu einer DmsA-Expression führt, könnte mit der
zufälligen Bildung eines schwachen Fusionspromotors im Plasmid pHLYX1301
59
Diskussion
zusammenhängen. Der Fusionspromotor könnte dann zu einer geringfügigen Expression von
HlyX führen, die ausreicht, um die dmsA-Transkription zu initiieren. Weiterhin könnte die
unterschiedliche Sequenz der vorhergesagten HlyX-Bindungsstellen vor dem aspA und dem
dmsA Gen insofern eine Rolle spielen, als das HlyX Protein möglicherweise eine höhere
Affinität zu der dmsA-assoziierten Sequenz besitzt. Zusätzlich könnte das Ergebnis auch
dadurch verursacht worden sein, dass die Western Blot-Analyse eine empfindlichere Analyse
der Genexpression als der Aspartase Assay erlaubt.
Nach Erstellung der Mutante wurde ihre Virulenz im Aerosolinfektions-Modell (JACOBSEN
et al. 1996) überprüft. Die Virulenz von A. pleuropneumoniae ∆hlyX war deutlich reduziert,
was sich an der geringeren Erhöhung der Körpertemperatur und an den weniger ausgeprägten
Lungenschädigungen in der entsprechenden Tiergrupppe zeigte. Dass 6 von 9 Tiere in der
Actinobacillus. pleuropneumoniae ∆hlyX-Gruppe keine makroskopischen Lungenläsionen
und keine messbaren Antikörpertiter aufwiesen, spricht für eine Verminderung des
Kolonisierungsvermögens von A. pleuropneumoniae ∆hlyX im Vergleich zum Wildtyp. Diese
Schlussfolgerung wird unterstützt durch die Ergebnisse der Resisolierung. So konnte
Actinobacillus. pleuropneumoniae ∆hlyX nach 21 Tagen weder in Tonsillen noch in
makroskopisch intaktem Lungengewebe nachgewiesen werden. Auch innerhalb von
Sequestern wurde der Erreger nur bei zwei von drei Tieren nachgewiesen und die Zahl der
Erreger im veränderten Gewebe war deutlich geringer als bei Tieren aus der Actinobacillus.
pleuropneumoniae wt-Gruppe. Diese Unterschiede sind vermutlich auf eine ineffektive
Anpassung von A. pleuropneumoniae ∆hlyX an die anaeroben Bedingungen in Sequestern und
in Tonsillen zurückzuführen, was eine zentrale Rolle des HlyX-Proteins bei der Regulation
anaerober Stoffwechselvorgänge auch bei A. pleuropneumoniae belegt. Die fehlende HlyX-
gesteuerte Repression der am aeroben Stoffwecksel beteiligten Gene zusammen mit der
gestörten Expression von Genen, deren Produkte an der anaeroben Atmung beteiligt sind,
führen vermutlich zu erheblichen Energieverlusten bei der A. pleuropneumoniae hlyX
Mutante. Diese Ergebnisse bestätigen die Schlussfolgerungen von BALTES et al. (2003) und
Jacobsen et al. (2005), dass Gene unter hlyX-Regulierung virulenzassozierte Proteine
induzieren, die vermutlich für das Überleben im anaeroberen Milieu erforderlich sind.
Eine mögliche Erklärung des Nicht-Persistierens der A. pleuropneumoniae Mutante in
Tonsillen und in intaktem Lungegewebe könnte der erhöhte Glutathionspiegel in der
„epithelial lining fluid“ (ELF) sein. Dieses Antioxidant wurde bei Menschen und bei
Säugetieren, unter anderem auch bei Schweinen, als eine Schutzmaßnahme gegen oxidative
60
Diskussion
Schäden bei entzündlichen Reizen im Respirationstrakt nachwiesen (CANTIN et al. 1987;
DAY et al. 2004; YAM u. ROBERTS 1980). Die ausreichende Menge von Glutathion in der
ELF der Schweinelunge, die zur Reduzierung des Sauerstoffs führt, sowie die
Beeinträchtigung der Expression von virulenzassoziierten Faktoren durch die hlyX-Deletion
könnten die Ursache für die beobachtete Verhinderung der Persistenz von Actinobacillus.
pleuropneumoniae∆ hlyX in Tonsillen und auf intaktem Lungenepithel sein. Diese Hypothese
ist besonders interessant, da ein erhöhter Glutathionspiegel in der ELF der Mäuselunge
während einer Pseudomonas aeruginosa-Infektion nachgewiesen wurde (CANTIN et al.
1987; DAY et al. 2004; YAM u. ROBERTS 1980). Allerdings scheint HlyX nicht allein
entscheidend für die Kolonisierung und die Persistenz verantwortlich zu sein, da die HlyX-
negative A. pleuropneumoniae Mutante eine deutliche Restvirulenz aufwies. Somit muss
Actinobacillus. pleuropneumoniae über zusätzliche Faktoren verfügen, die eine Kolonisierung
und Peristenz ermöglichen. Als Kandidat kommt beispielsweise der globale Regulator ArcAB
infrage, der bei dem verwandten Erreger Haemophilus influenzae wie auch bei Vibrio
cholerae mit der Virulenz unter anaeroben Bedingungen assoziiert wurde (SENGUPTA et al.
2003; SOUZA-HART et al. 2003). Um die Bedeutung dieser und anderer Faktoren für die
anaerobe Atmung sowie die Virulenz und Persistenz von A. pleuropneumoniae aufzuklären,
sind somit zukünftig weitere Untersuchungen erforderlich.
61
Zusammenfassung
6 Zusammenfassung
Konstruktion und Charakterisierung einer
Actinobacillus pleuropneumoniae hlyX- Mutante
(Mohamed N’diaye)
Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae ist der Erreger einer wirtschaftlich bedeutsamen
Pleuropneumonie der Schweine, die mit zunehmender Intensivierung der Schweinehaltung an
Bedeutung gewinnt. Sie verursacht infolge der hohen Mortalität und der verminderten
Gewichtzunahme chronisch kranker Tiere große wirtschaftliche Verluste. Das Persistieren des
Erregers trotz Impfung ist ein Faktor der zunehmend an Bedeutung gewonnen hat. Die
mangelnde Fähigkeit der bisherigen Impfstoffen, die Kolonisierung mit dem Erreger zu
verhindern und die entscheidende Rolle dieser „carrier“ bei der Verbreitung der
Schweinepleuropneumonie, führen zu einer verstärkten Untersuchung der Pathogenese in der
Hoffnung, über die Aufklärung der Mechanismen der Kolonisierung und Persistenz besser
wirksame Vakzinen herstellen zu können.
Basierend auf der Hypothese, dass die Fähigkeit des Erregers in sequestriertem
Lungengewebe zu überleben, die Virulenz und die Persistenz beeinflusst, wurde das hlyX-Gen
im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Dazu wurde eine A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante
konstruiert und charakterisiert. Die Mutante zeigte ein verringertes Wachstum unter
anaeroben Kulturbedingungen und war im Tierversuch deutlich attenuiert. So war der
klinische Verlauf der Erkrankung wie auch die Schwere der Lungenveränderungen deutlich
herabgesetzt. Unerwarteterweise zeigte die A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante nicht nur eine
reduzierte Kolonisierungsfähigkeit im anaeroben Milieu von Lungensequestern und Tonsillen
sondern auch im aeroben Milieu des unveränderten Lungenepithels.
62
Summary
7 Summary
Construction and characterization of an Actinobacillus pleuropneumoniae hlyX mutant
(Mohamed N'diaye)
Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae is the etiologic agent of an economically important
pleuropneumonia of pigs which has gained importance due to the increase of intensive pig
farming. The disease causes significant economic losses, resulting from high mortality as well
as reduced weight gain in chronically infected animals. The ability of the organism to persist
even in vaccinated animals has steadily gained significance. Presently available vaccines are
unable to prevent colonization, and carrier animals play a crucial role in the spreading of
porcine pleuropneumonia. This has led to intensive research on the pathogenesis, aiming at
the elucidation of the mechanisms of colonization and persistence, which in turn will
hopefully facilitate the development of more efficacious vaccines.
Based on the hypothesis that the ability of the organism to persist in sequestered lung tissue
influences virulence and persistence, the hlyX gene was the subject of this thesis. An
Actinobacillus. pleuropneumoniae hlyX mutant was constructed and characterized. The
mutant showed reduced growth under anaerobic culture conditions, and it was attenuated in
an infection experiment. Clinical disease as well as lung lesions were reduced in severity.
Unexpectedly, the A. pleuropneumoniae mutant exhibited not only reduced ability to colonize
in the anaerobic environment of lung sequesters and tonsils, but also in the aerobic
environment of the pulmonary epithelium.
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73
Anhang
9 Anhang
9.1 Material und Geräte
Geräte Firmen Thermocycler BioRad MultiAnalyst-System Elektrophoresekammer Easy CastTM Elektro- phoresis System Sorvall-Kuhlzentrifuge Mini Hybridisation Oven Multi-Block Heater UV-Transilluminator GEX-TFX-20M Vortex Genie2 Orbital-Schüttler 3011 Wasserbäder 37°C, 55°C, 16°C Spektralphotometer Ultrospec III PFGE-Gerät Chef DRIII Filterpapier Gel-Blotting-Papier Nylonmembran Positive Membran Polaroidkamera Gene Clean II Kit Bio 101 Nucleospin Extrakt Kit Film Kodak X-OMAT AR Gefrierschränke –20°C Gefrierschränke -70°C Incubator Shaker Series 25 Mircocentrifuge MC 13
Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland BioRad, München, Deutschland MWG, München, Deutschland Bad Homburg, Pharmacia, Freiburg Appligene, Illkirch, Frankreich Lab-line Instr., inc., Illinois, USA GmbH, Heidelberg, Deutschland Bender und Hobein, Schweiz GFL, Burgwedel, Deutschland GFL, Burgwedel, Deutschland Pharmacia, Freiburg, Deutschland BioRad, München, Deutschland Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland Appligene, Illkirch, Frankreich GmbH, Heiderberg, Deutschland Dianova, Hamburg, Deutschland Macherey-NAGEL GmbH&CO.,Deutschland Amicon, Heraeus Instr.Osterode, DeutschlandLiebherr, Ochsenhausen, Deutschland Heraeus, Osterode, Deutschland New Brunswick, Scientific Co, USA Heraeus, Osterode, Deutschland
74
Anhang
9.2 Zusammensetzung von Medien, Medienzusätzen und Puffer
Medien
LB-Medium
Bacto-Trypton (Roth, Karlsruhe, Deutschland) 10,0 g
Hefeextrakt (Roth, Karlsruhe, Deutschland) 5,0 g
NaCl 5,0 g
Aqua dest. ad 1000 ml
PPLO-Medium 21 g
A. dest. ad 1000 ml
PPLO-Agar
PPLO-Agar (Difco, le Pont de Claix, Frankreich) 35 g / l Agar
Agar-Agar (Roth, Karlsruhe, Deutschland) 2-3 g
Blut-Agar, Columbia Sheep Blood Agar, OXOID (Wesel, Deutschland)
PPLO ohne NaCl-Zusatz
Sechsundvierzig g BactoBeef Heart in 1 Liter A. dest gelöst und bei 50°C für 1 h inkubiert;
Die Lösung wird in der Mikrowelle für 3 min aufgekocht und bei Raumtemperatur abgekühlt.
Nach dem Filtrieren der Suspension werden 7,4 g Bacto Peptone zugegeben. Ein pH-Wert
von 7,4 wird mit 1 M NaOH eingestellt. Die Lösung wird anschliessend sterilfiltriert.
SOC-Medium
Bacto-Trypton 2 %
Hefe-Extrakt 0,5 %
NaCl 10 mM
KCl 2,5 mM
Nach Lösen und Autoklavieren, Zugabe von:
MgCl2 10 mM
MgSO4 10 mM
Glucose 20 mM
75
Anhang
GYTT-Medium
Glycerin 100,0 ml
Hefe-Extrakt 1,25 g
Tryptone 2,5 g
Tween 80 0,2 ml
A. dest ad 1000 ml
Selektivblut-Agar
In Blut-Agar zugegeben: Kristalviolett, 1 µg/ml
Lincomycin, 1 µg/ml
Nystatin, 50 µg/ml
Bacitracin, 100 µg/ml
Antibiotika-Stammlösungen und andere Zusätze
Ampicillin-Stammlösung:
Einhundert mg/ml in 30% des Endvolumens A. dest. lösen, dann mit Ethanol auf 100%
auffüllen (Gebrauchskonzentration: 100 µg/ml, d.h. 1 µl/ml Medium)
Kanamycin: 50 mg/ml in 50% des Endvolumens von A. dest. lösen, dann mit 50% Glycerin
auf 100% auffüllen und sterilfiltrieren (Gebrauchskonzentration: 50 µg/ml für E. coli, 25 µg/-
ml für A. pleuropneumoniae)
Chloramphenicol: 100 mg/ ml in Ethanol lösen (100 µg/ ml für die Plasmidamplifikation,
25 µg/ ml für Wachstum von E. coli mit Plasmid, 5 µg/ ml für die Kultivierung von
Actinobacillus pleuropneumoniae-„single-crossing-overs“)
Diaminopimelinsäure (DAPI): Stammlösung 100 mM (100fach konzentriert);
Gebrauchskonzentration ist 1 mM. Sie wird durch Lösen der Stammlösung in A. dest
hergestellt. Unter Rühren wird 1 M HCl tropfenweise bis die Mischung klar wird hinzugefügt.
Anschliessend wird die Lösung sterifiltriert und in 10 ml portioniert und –70°C gelagert.
Die DAPI-Lösung wird als Zusatz für die Anzucht DAPI-auxotropher E. coli Stämme
( z. B. β2155) benötigt.
76
Anhang
Ersatz-IsovitaleX (Stammlösung; 100fach konzentriert) besteht aus
Glutamin: 10 g
NAD: 1 g
L-Cystein-HCl: 26 g
L-Cystin-dihydrochlorid: 1 g
100 g Glukose ad 1000 ml
X – Gal (5 – Bromo-4-chloro-3-indolyl-galactosid): 25 mg / l
Tween 80: 0,1%
MgSO4: 10 mM
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG): 1 mM
9.3 Lösungen und Puffer
EDTA-Lösung 0,5 M (pH 8,0)
CaCl2- Lösung 1 M
TrisHCl,- Lösung 1 M (pH 7,5)
TrisHCl,- Lösung 1 M (pH 8,0)
SDS- Lösung 20%
NaCl- Lösung 3 M
Na-Acetat- Lösung 3 M (pH 6,0)
Ethanol- Lösung 96%
Glyzerin- Lösung (50%)
9.3.1 Plasmidpräparation
Lösung 1:
TrisHCl 50 mM (pH 8,0);
EDTA 10 mM;
RNAse 1 mg/ml
Lösung 2:
NaOH 0,2 M;
SDS 1%
Lösung 3:
K-Acetat-Puffer 3,2 M (pH 5,5)
77
Anhang
9.3.2 Präparation von chromosomaler DNA von Bakterien (A. pleuropneumoniae)
EDTA- Lösung 0,5 M (pH 8,0) (Endkonzentration 10 mM)
SDS- Lösung 10 % (Endkonzentration 1%)
Proteinase K- Lösung 20 g/ml (Endkonzentration 500 µg/ml)
RNAse- Lösung 10 mg/ml (Endkonzentration 100 µg/ml)
Phenol in TE-Puffer- Lösung pH 7,8 (Roti-Phenol)
Chloroform:Isoamyl- Lösung (24:1)
Na-acetat- Lösung, 3 M (pH 5,2)
78
Anhang
9.4 Restriktionsverdau
Carlos-Puffer (10 x)
TrisHCl, pH 8,0 330 mM
Kaliumacetat 660 mM
Magnesiumacetat 100 mM
Spermidin 30 mM
BSA 1 mg/ml
DTT 10 mM
BSA 1 mg/ml
9.5 Gel-Elektrophorese
Blau-Marker: Bromphenolblau, 0,25%
Xylene Cyanol, 0,25%
Glycerin, 30,0% in A. bidest
10 × TBE: Tris Base, 1 M
Borsäure, 1 M
EDTA, 20 mM (pH 8,0)
50× TAE: Tris Base, 2 M
Essigsäure, 1 M
EDTA, 50 mM (pH 8,0)
DNA-Längenstandards: Lambda DNA, HindIII-verdaut (NEB)
Lambda Ladder PFG-Marker: 50 µg/ml von Biolabs
79
Anhang
9.6 Transformation
TFB1: K-Acetat, 30 mM
RbCl, 100 mM
CaCl2, 10 mM
MnCl2, 50 mM
50 % Glycerin, 30,0 ml
A. dest, ad 100,0 ml
TFB2 Mops, 10 mM
RbCl, 10 mM
CaCl2, 75 mM
50 Glycerin, 30,0 ml
9.7 Konjugation
TNM-Puffer TrisHcl, pH 7,2, 1 mM
NaCl, 100 mM
MgSO4, 10 mM
9.8 DNA-Transfer (Southern Blot)
Depurinierungslösung: HCl, 0,25 M
Denaturierungslösung: NaCl, 1,5 M
NaOH, 0,5 M
Neutralisierungslösung: Tris-HCl, 1 M (pH 8,0)
NaCl, 1,5 M
20 x SSC: NaCl, 3 M
Tri-Natriumcitrat, 0,3 M
80
Anhang
9.9 Herstellen einer Gensonde nach der „Random-Priming“ Methode
OLB-Puffer: 100 Teile Puffer A,
250 Teile Puffer B,
150 Teile Puffer C
Puffer A: 1 ml Lösung O‚
625 µl 2 M Tris-HCl (pH 8,0)
125 µl 1 M MgCl2,
250 µl A. bidest
18 µl 2-Mercaptoethanol
je 5 µl 0,1 M dCTP, dGTP, dTTP
Puffer B: 2 M Hepes (pH 6.6)
Puffer C: Hexadeoxyribonucleotides (90 OD units/ml = 4,5 mg/ml in TE)
Stop-Puffer: 20mM NaCl,
20mM Tris-HCl (pH 7,5)
2 mM EDTA,
0,25% SDS,
1µM dCTP
9.10 Southern-Hybridisierung
Hybridisierungspuffer: 6 x SSC (6 ml 20 x SSC)
0,01 M EDTA (0,4 ml 0,5 M EDTA)
5 x Denhardt’s (2 ml D’S Stamm 50 x)
0,5% SDS (0,5 ml 20% SDS)
A. dest ad. 20 ml 11 ml
50 x Denhardt’s-Lösung: 5 g Ficoll,
Polyvinylpyrrolidon 5 g
BSA (Fraktion V) 5 g
81
Anhang
9.11 SDS-Page ( Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel)
Anfertigung der Gele
Trenngel Sammelgel A dest
1,5 Tris pH 8,8 0,5 Tris pH 6,8
SDS (10%) TEMED
Acrylamid 10% APS
3,9 ml 2,5 mi
- 100 µl 10 µl 3,8 ml 100 µl
3,05 ml -
1,25 ml 50 µl 10 µl
0,65 ml 50 µl
Lauf-Puffer II für SDS-Gele nach Lämmli: 30,0 g Tris,
144 g Glycin,
10 g SDS,
A. dest ad 1000 ml.
Acrylamid-Bisacrylamid-Stammlösung Acrylamid (Serva 10675), 60 g
NN’-Methylen-Bisacrylamid
(Serva 29195), 0,8 %, 1,6 g
A. dest, ad 200 ml
Die Lösung wurde filtriert und bei 4°C aufbewahrt.
9.12 Western Blot
Transfer-Puffer: 3,0g Tris,
8,5g Glycin,
200 ml Methanol,
ad 1000 ml A. dest
PBST, pH 7,2 (Waschpuffer): 8,0 g NaCl,
0,2 g KH2PO4,
1,44 g Na2HPO4,
0,2 g KCl,
0,5 ml Tween 20,
A. dest ad 1000 ml
82
Anhang
PBST-Gelatine (Blockpuffer): 500 ml PBST (1 × ),
2,5 g Gelatine (0,5%)
Substrat-Puffer für Alkalische Phosphatase: 100,0 ml 1 M Tris (pH 9,5)
100,0 ml 1 M NaCl,
5,0 ml 1 M MgCl2,
A. dest ad 1000 ml.
9.13 Aspartase-Essay
Aspartase-Puffer MgCl2, 3 mM
L-Aspartat, 0,1 M
TrisHCl, pH 9, 0,1 M
9.14 Pulsfeldgelelektrophorese
Pett IV-Puffer: NaCl-Lösung, 1 M
Tris Lösung , 10 mM (pH 8,0)
EDTA (Dinatriumsalz, Titriplex III
von Merck)-Lösung, 10 mM
Lysepuffer: NaCl, 1 M
Tris, 10 mM (pH 8,0)
EDTA, 200 mM
N-lauroyl-sarcosin Sigma, L 5125,
0,5 %
Sodium deoxycholate- Lösung
(Sigma, D 5670), 0,2 %
RNAse-Stocklösung: 10 mg/ml in Aq. bidest.
Lysozym-Stocklösung: 50 mg/ml in Aq. bidest.
ESP-Lösung: EDTA, 0,5 M
N-lauroyl-sarcosin Sigma, L 5125,
1 %
Proteinase K (Endkonz. 0,65
mg/ml)
Proteinase K-Stocklösung: 20 mg/ml in A. bidest.
83
Anhang
TE-Puffer: Tris- Lösung, 10 mM (pH 8,0)
Na2-EDTA-Lösung, 1 mM (pH
8,0)
PMSF: Phenyl-methyl-sulfonyl-fluorid,
7 mg in 1 ml Isopropanol gelöst
9.15 Enzyme
Enzyme
Restriktionsendonukleasen Firmen ApaI AscI BamHI BglII BsrI DraI EcoRI EcoRV HindIII MfeI NotI PspomI PstI SacI TaqI XcmI XhoI Lysozym DNase, RNase frei RNase T4 DNase-ligase Klenow Enzym Taq-DNA-Polymerase
NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus SIGMA, Deisen Boehringer, Mannheim Boehringer, Mannheim Boehringer, Mannheim Boehringer, Mannheim Stratagene, Heidelberg
84
Anhang
9.16 Chemikalien
Chemikalien Firmen Acrylamid Agar-Agar Agarose Ampicillin Bacto Tryptone BCIP (5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate) Bovine Serum Bovine Serum albumin (BSA) Bromphenol Blau Chloramphenicol Chloroform α32 P-dCTP L-Cysteine hydrochloride monohydrate DAPI Diethanolaminiethanolamin ACS Reagenz Diethylamin Dimethylsulfoxide (DMSO) EDTA Ethidium bromid Ethanol Glycerin Gelatine Hefeextrakt HCl IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalactosid) Isoamyl alkohol Isopropanol Kanamycin Magnesiumsulfat Methanol Mineral oil NaCl NaOH Phenol Phenyl-methyl-sulfonyl-fluoride (PMSF) Phosphorsäure (reinst)
Serva, Heidelberg Roth, Karlsruhe Appligene,Illkirch, Frankreich SIGMA, Deisen Difco, Augsburg SIGMA, Deisen WDT, Hoyerhagen New England Biolabs, Schwalbach SIGMA, Deisen SIGMA, Deisen Roth, Karlsruhe NEN, Boston, MA, U.S.A SIGMA, Deisen Merck, Darmstadt Sigma, Deisen Sigma, Deisen Sigma, Deisen Roth, Karlsruhe SIGMA, Deisen SIGMA, Deisen Elch-Apotheke, Hannover Roth, Karlsruhe SIGMA, Deisen Roth, Karlsruhe Merck, Darmstadt Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe SIGMA, Deisen Merck, Darmstadt SIGMA, Deisen Roth, Karsruhe Roth, Karsruhe SIGMA, Deisen SIGMA, Deisen Roth, Karlsruhe Serva, Heidelberg
85
Anhang
PPLO-Agar Saccharose Sarcosyl (N-lauryl-sarcosine) SDS (Laurylsulfat) Sodium acetat Sodium Chlorid Tirs (hydroxymethylaminomethane) Tris-acetat Tris-HCl TCA (flüssig) TCA (fest) Tween 20 X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-galactosid)
Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Difco, Augsburg Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe SIGMA, Deisen SIGMA, Deisen SIGMA, Deisen SIGMA, Deisen SIGMA, Deisen SIGMA, Deisen SIGMA, Deisen SIGMA, Deisen Roth, Karlsruhe Serva, Heidelberg Merck, Darmstadt Roth, Karlsruhe SIGMA, Deisen
86
Anhang
9.17 Nukleotid- und Aminosäuresequenz des hlyX Gens von A. pleuropneumoniae
-
taaagtttaaatgccacttcgcccgaaagcgtattgttttcaacttttgtcagagcatct
1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60
tctaataatgccaaaccacgctcaagcgtgcgcgcaaattgttcttcttccgcttttaat
61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120
gttttttgaatatgcgcttgtttttgcgttaaaacttcgccggcatgacccattacggtt
121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180
gcaagtgtcggtactaatttatagaagaacgcttcttttgcacctaaaaggttaccgtga
181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240
cgaaccgcacgacggataatacgacgtaacacatagccacgaccttcatttgacggaact
241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300
acgccatccgcaattaagtacgaacacgcacgaatatggtctgccactacacgtaacgat
301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360
ttattatctaaatcgcttacattcaataaaccggcaacttccttgatgagcgtttggaaa
361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420
atatccgtttcatagtttgagttcacgtgttgcattacagcggtcatacgctctaaaccc
421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480
atccccgtatctacggacggtttcggtaatttttccatcgtaccgtctgccaaacggtta
481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 540
aattgcataaatacgatattccacacttcgatataacgatcgccgtcttcttccggacta
541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600
cccggtaaaccgccccagaaagtttcgccgtgatcatagaagatttccgtacaaggaccg
601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 660
cacggaccggtgtcacccattgcccagaagttatccgaagcatacggtgcacctttgtta
661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 720
tcaccgatacgaataatatgatcggtcggaacacctacgattttattccaaatgtcatag
721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 780
87
Anhang
gcttcatcatccgtttcataaacggttacatataatttttctttcggcagaccaagccat
781 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 840
tgcggagaagttaaatattcccaaccgaattgaatcgcatcatgtttgaagtaatcaccg
841 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900
aaactgaagttacccatcatttcaaaaaatgtatggtggcgcgcggtatagcctacgttt
901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 960
tctaaatcattatgtttaccgccggcacgcacgcaacgttgtgcggtggtcgcacgagta
961 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1020
taaggacgtttttctaagccgagaaaaacatctttaaattgattcatcccggcattagtg
1021 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1080
aataataaggtagggtcattttcaggtaccaatgagctactcggtacaacggtatgtcct
1081 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1140
ttactgtggaagaaatccaagaaagattgtctgatttctgaagttgttttcatttaataa
1141 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200
cactctaaataatgtataagtaaataactagtgataaatgcctttattctacacgttttt
1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1260
cattcctttgataattgactacggcttttttaatgaaaaacttcttatatttactataat
1261 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1320
ttattaaaaaacaaccgcttgaaaagctaaagaacttttaagcggttgagtttaaggtta
1321 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1380
tttatctgcttttatatcaatgttttttagcattagcgttattcgtcggctaacggcacc
1381 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1440
acaagcatatctacggtaacgttgttcattacttggcgagtggacgacataaacttactc
1441 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500
cagaaatcctgatgatgaccggtaattaataagtcaattttgtgttttgccacggcgtct
1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1560
tccaatacctgactgaaatcgcccgtgccgttaagacgttccgaaaccggataattcact
1561 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1620
88
Anhang
ttagccgataattcggctaacgctttagtggtttcttccagtacgctatcttgtactgaa
1621 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1680
gacatattaatatcaattaatcccgtataaagatcggagaaattaacgtccacatgaatc
1681 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1740
aaagaaagttttgcgccgcatttttccgctaaatccgcgcctttacgaagtaaaacaaga
1741 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800
ctttcttcagagagatcaaccgcaactaaaatatgtttatacataaatagactccttctt
1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1860
gtatgcctaatcattttttgtttgaagatactagcatattctttttagagaaaacttgag
1861 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1920
ctagatctcatttttgaaaaaacatttcaatgtctgaaatattttttaattcggagcata
1921 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1980
taagcataagattgaaaataactttttaagggtaaataaaccgattaccgactttattat
1981 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2040
cctaataaataatgttaaaatttgcttgaaatcaaacttttacctattttaaaagacggt
2041 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100
agcccttatgaaaattgtatctgacgctaaacatacaggccgaacggcttgcactattca
2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2160
M K I V S D A K H T G R T A C T I H
ttgccagaattgcagtattagccaactttgcttaccttttacgttgagcgaacacgaatt
2161 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2220
C Q N C S I S Q L C L P F T L S E H E L
aactcagcttgacaatattatcgaacgcaaaaaaccggttcaaaaatctcaaatcatttt
2221 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2280
T Q L D N I I E R K K P V Q K S Q I I F
89
Anhang
ccaatccggcgatgaacttcgttccatctatgcgattcgttcaggtacaattaaaagcta
2281 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2340
Q S G D E L R S I Y A I R S G T I K S Y
tacgattagcgaaagcggcgaagaacaaattacggcgttccatttacccggtgatctggt
2341 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400
T I S E S G E E Q I T A F H L P G D L V
cggatttgatgcgattatgaatatgaaacatgtcggtttcgcacaagcgctcgaaacgtc
2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2460
G F D A I M N M K H V G F A Q A L E T S
gatgatttgcgagattccatttgatattttagacgatctcgccggcaagatgcctaaaat
2461 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2520
M I C E I P F D I L D D L A G K M P K I
ccgtcatcaaattatgcgtttgatgagtaatgaaattaaaagcgatcaagaaatgatttt
2521 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2580
R H Q I M R L M S N E I K S D Q E M I L
attactttcaaaaatgagtgcggaagaaaagttagcggcgtttttacataatttatctca
2581 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2640
L L S K M S A E E K L A A F L H N L S Q
EcoRI
acgttatgcggcacgcggtttttccgctcgtgaattccgtctgactatgactcgcggcga
2641 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700
R Y A A R G F S A R E F R L T M T R G D
tatcggcaactatctcggtttaaccattgaaactatcagtcgtttattaggacgtttcca
2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2760
I G N Y L G L T I E T I S R L L G R F Q
90
Anhang
gaaaagcggtatgattacggtacaaggtaaatatattaccatcaatcgtatggacgaact
2761 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2820
K S G M I T V Q G K Y I T I N R M D E L
gaccgatatggcgggtgtaacacgttcacaaattccggtaatacaaacggcataagcctt
2821 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2880
T D M A G V T R S Q I P V I Q T A *
ataaaaacaaaaataccactattttctaatagtggtatttttttgttcggaacatatttg
2881 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2940
caaataacttaagaaatttaaccgcttatttatctatttgactaatttcaaatgtgtcgg
2941 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000
ttttttcttagctttaggcttactttcttctctgtcggcttgctgattaaccctttcgct
3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3060
atatgcttgttcactataataagcctcgtcttggaacataattccgtcgccggtttcttg
3061 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3120
cgcataaatggcttccgttgcaccaaaaggaatataaatatcacgcaacatcccttggaa
3121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3180
acgagcattaaagctgattgactcgtcattaatcacatattgtccgatggaacgcggtgc
3181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3240
gatattcaaaataattttgccgtcccgaacaaattcgaccggcacatccacatccggata
3241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300
ttccgcatttactaataaataaggcgtattatcgttatctaaaatccagttgtagtacgc
3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3360
gtggtaaagataagggcgcaaaggtttcattagtctttatcatccattaagtgtttcgga
3361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3420
gccgcaccgccgatagactgaacgaagctctcacgttggaatacgcgagtcatataggtt
3421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3480
91
Anhang
ttaattgccttactgcccgcaccggtaaattcaatacctaaactgtgcattttccataat
3481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3540
EcoRI
|
aacggcgcaacgtaacaatcgaccaaactgaattcttcgctcataaaatacggtgttgcg
3541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3600
gcaaagacaggacctaatgccaacatttcgtcacgaagttccatcaacgcttttttcgct
3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3660
tctttagattcaggatctttgtttgcaatatcaattaatgagtaccaatcttgttcgata
3661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3720
cggtgcatggttaaacgacatttaccgcgtaataccggatagaccggcattaacggcgga
3721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3780
tgaggaaaacgctcgtctaagtattccataatgatacgtgaattaaataatactaaatcg
3781 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3840
cgatcaactaatgtcggtacattaccgtatgggtttacttccaccaaatcttcagaaatc
3841 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3900
gtatcaggactaatattttcaatttcataaggaacgcccttctctgccaatacgatacgt
3901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3960
acttgatgactgaaaatatcgtttttatctgaaaaaaggg
3961 ---------+---------+---------+---------+ 4000
Primerpositionen
Primer Position
OHLYX5
oHLYX6
oHLYX7
oHLYX8
oHLYX9
oHLYX1O
1121 – 1141
3458 - 3438
1600 - 1619
3060 - 3041
2087 - 2110
2833 - 2814
92
Anhang
9.18 Rohdaten
Tabelle: Tierversuches mit A. pleuropneumoniae AP76 und A. pleuropneumoniae ∆hlyX
Reisolation
Gruppe Tier- Nummer
LungenScores
ELISA
ApxII
(EU) Veränd. Lunge
Unver.Lunge
Lymph-knoten Tonsillen
A pleuropneu-moniae AP76
63126368 6433 6441 6442 6443 6448 6774 6474 6435
5,3 5,0 0,52
0 10,26 3,37
0 7,13
0
25 54 57 21 1 28 10 43
+ + + + + +
+ *
+ + + + + *
+ + + *
+ + + - -
** ** + **
+ + +
+ + + - - + - - +
+ +
- ++ +
- + +
- *** + + + +
+ + +
A pleuropneu-moniae ∆hlyX
5071 6428 6429 6432 6439 6449 6465 6471 6472
2,74 0 0
1,25 3,63
0 0 0 0
34 1 1 1 1 2 28 17 53
+ * * + - * * * *
- - - -
** - - - -
- - - - - - - - -
- - - - - - - - -
(-) keine App-verdächtigen Kolonien, (+) App nur im direkt beimpfen Bereich; (+ +) auch im
Bereich der 1. und (+ + +) auch im Bereich der 2. Fraktionierung, (*) keine Lungen-
veränderungen bei diesen Tieren, (**) Lungen beiderseitig verändert, (***) nicht auswertbar
(Mischkulturen).
93
Anhang
9.19 Index der Abbildungen
Abbildung 1: hlyX Gen mit Primern und Restriktionssenzymschnittstellen.......................... 47
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Konstruktion von pHLYX701......................... 48
Abbildung 3: A, PCR mit Primer oHLYX5 und oHLYX6; B, PFGE Analyse von
A. pleuropneumoniae wt und A. pleuropneumoniae ∆hlyX ; C, Southern Blot nach
Verdau mit DraI; 1, A. pleuropneumoniae AP76; 2, A. pleuropneumoniae ∆hlyX. ........ 49
Abbildung 4: Position des hlyX-Gen auf der physikalischen Karte von A.
pleuropneumoniae AP76.................................................................................................. 50
Abbildung 5: Vergleich der Trockengewichte von A. pleuropneumoniae wt und A.
pleuropneumoniae ∆hlyX nach Kultivierung unter anaeroben Bedingungen;
dargestellt ist der Mittelwert aus 5 Untersuchungen........................................................ 51
Abbildung 6: Konstruktion der Plasmide für die Komplementierung der A.
pleuropneumoniae lyX-Mutante....................................................................................... 52
Abbildung 7: Western Blot Analyse der anaeroben DmsaA-Expression. A: Coomassie
Blau gefärbtes Gel; B: Werstern Blot Analyse; 1 A; pleuropneumoniae wt; 2 A.
pleuropneumonie ∆hlyX, 3 A. pleuropneumonie ∆hlyX + pHLYX1300; A.
pleuropneumonie ∆hlyX + pHLYX1301 (links unter Standardbedingungen und
rechts unter anaeroben Bedingungen gewachsen). .......................................................... 53
Abbildung 8: Vergleich der Körpertemperaturen und „lung-scores“ bei Schweinen mit
A. pleuropneumoniae wt und A. pleuropneumoniae ∆hlyX Infektionen; A :
Körpertemperatur der Tiere der A. pleuropneumoniae ∆hlyX und
A. pleuropneumoniae wt Gruppen nach der Infektion. Tag 0 ist der Tag der
Infektion; B: „lung-scores“ der Schweine der A. pleuropneumoniae ∆hlyX und
A. pleuropneumoniae wt Gruppen 21 Tage nach der Infektion; Asterisks zeigen
signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen an (p < 0,05)...................................... 55
94
Anhang
9.20 Index der Tabellen
Tabelle 1.: Apx-Toxin Produktion von den verschiedenen A. pleuropneumoniae
Serotypen (BOSSE et al. 2002)........................................................................................ 15
Tabelle 2: Verwendete Bakterienstämme und Plasmide................................................... 25
Tabelle 3: Zusammensetzung des Ligationsgemisches.................................................... 31
Tabelle 4: Mastermix-Zusammensetzung ......................................................................... 35
Tabelle 5: Verdau der Blöckchen...................................................................................... 40
Tabelle 6: Zusammensetzung des Polyacrylamidgeles ..................................................... 41
Tabelle 7: Überprüfung der Aspartaseaktivität in A. pleuropneumoniae wt, A.
pleuropneumoniae ∆hlyX und A. pleuropneumoniae ∆hlyX komplementiert „in
trans“ unter Verwendung der Plasmide pHLYX1300 und pHLYX1301 ........................ 54
Tabelle 8: Virulenzvergleich zwischen A. pleuropmeumoniae wt und A.
pleuropmeumoniae ∆hlyX ................................................................................................ 56
95
Danksagung
An der Stelle möchte ich mich herzlich bedanken bei:
Prof. Dr. Gerald-F. Gerlach für die Überlassung des Themas, die Bereitstellung des
Arbeitsplatzes, die zeitaufwendige Betreuung und für den engagierten Einsatz für das
Erhalten meines Ausreisevisum,
Dr. Nina Baltes für die wissenschaftliche Betreuung und für die Unterstützung und die
fachliche Beratung bei der Durchführung der Tierversuche,
Jörg Merkel für die Hilfe bei der Edition
Allen Mitarbeiter und Mitdoktoranden für die Zusammenarbeit,
Frau Ledwoch für ihre allgegenwärtige und freundliche Hilfsbereitschaft,
Meinem Institut für die Bereitstellung des Stipendiums,
Meiner Familie für ihr Verständnis und ihre Unterstützung.