Kristallstruktur von [Fe]-Hydrogenase Hmdarchiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2007/0132/pdf/dop.pdfCluster aus gesehen distale Eisenatom ist nicht redoxaktiv, stellt vermutlich die H 2-Bindestelle

Kristallstruktur von [Fe]-Hydrogenase Hmd

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades

der Naturwissenschaften

(Dr. rer. nat.)

dem Fachbereich Biologie der

Philipps-Universität Marburg

vorgelegt von

Oliver Pilak

geboren in Lebach

Marburg/Lahn, April 2007

Die Untersuchungen zur vorliegenden Arbeit wurden in der Zeit von April 2004 bis

März 2007 am Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie in Marburg/Lahn

unter der Leitung von Professor Dr. Rudolf K. Thauer durchgeführt.

Vom Fachbereich Biologie der Philipps-Universtität in Marburg als Dissertation

angenommen am:

Erstgutachter: Prof. Dr. Rudolf K. Thauer

Zweitgutachter: Prof. Dr. Wolfgang Buckel

Tag der mündlichen Prüfung: 02. Mai 2007

Die Ergebnisse der Doktorarbeit sind in zwei Publikationen zusammengefasst, von

denen eine bereits erschienen ist und die andere als Veröffentlichungsentwurf

vorliegt. Die beiden Publikationen bilden den Ergebnisteil der Dissertationsschrift.

Pilak, O., Mamat, B., Vogt, S., Hagemeier, C. H., Thauer, R. K., Shima, S., Vonrhein,

C., Warkentin, E., Ermler, U., The Crystal Structure of the Apoenzyme of the Iron-

Sulphur Cluster-free Hydrogenase, Journal of Molecular Biology, 2006, 358 (3):

p. 798-809.

Pilak, O., Vogt, S., Schick, M., Warkentin, E., Thauer, R. K., Ermler, U. & Shima, S.,

The Active Site Crystal Structure of the Iron-Sulfur-Cluster-free Hydrogenase at

1.75 Å resolution (to be submitted)

Inhaltsverzeichnis 1

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis................................................................................................. 1

Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................ 2

1. Zusammenfassung............................................................................... 3

2. Einleitung.............................................................................................. 5

2.1. [FeFe]-Hydrogenase ............................................................................ 6

2.2. [NiFe]-Hydrogenase ............................................................................. 7

2.3. [Fe]-Hydrogenase (Hmd) ..................................................................... 8

3. Material und Methoden ...................................................................... 17

3.1. Verwendete Materialien ..................................................................... 17

3.2. Molekularbiologische Methoden ........................................................ 20

3.3. Sequenzierung der hmd-Gene aus Methanothermus fervidus und

Methanobrevibacter arboriphilus........................................................ 22

3.4. Reinigung von [Fe]-Hydrogenase ...................................................... 32

3.5. Reinigung von FeGP-Kofaktor ........................................................... 38

3.6. Rekonstitution von [Fe]-Hydrogenase ............................................... 39

3.7. Kristallografische Methoden............................................................... 41

4. Ergebnisse / Publikationen ................................................................ 45

4.1. The Crystal Structure of the Apoenzyme of the Iron-Sulfur-Cluster-

Free Hydrogenase ............................................................................. 47

4.2. The Active Site of [Fe]-Hydrogenase (Iron-Sulfur-Cluster-Free

Hydrogenase) at 1.75 Å Resolution................................................... 59

5. Diskussion.......................................................................................... 75

6. Literatur .............................................................................................. 88

Lebenslauf.......................................................................................................... 94

Danksagung ....................................................................................................... 95

Erklärung............................................................................................................ 96

Abkürzungsverzeichnis 2

Abkürzungsverzeichnis [Fe]-Hydrogenase H2-bildende Methylentetrahydromethanopterindehydro-

genase (Hmd) oder Eisen-Schwefel-Cluster-freie

Hydrogenase

Hmd

aHmd

fHmd

jHmd

kHmd

mHmd

[Fe]-Hydrogenase von

Methanobrevibacter arboriphilus

Methanothermus fervidus

Methanocaldococcus jannaschii

Methanopyrus kandleri

Methanothermobacter thermolithotrophicus

GP Guanylylpyridon

FeGP-Kofaktor Eisen-Guanylylpyridon-Kofaktor

H4MPT 5,6,7,8,-Tetrahydromethanopterin

Methenyl- H4MPT+ N5,N10-Methenyl- H4MPT

Methylen- H4MPT N5,N10-Methylen- H4MPT

Mtd F420-abhängige N5,N10-Methylentetrahydromethan-

opterin-Dehydrogenase

DTT Dithiotreitol

Zusammenfassung 3

1. Zusammenfassung

Hydrogenasen sind Enzyme, die die heterolytische Spaltung von H2

katalysieren. Man unterscheidet drei phylogenetisch nicht verwandte Typen von

Hydrogenasen, nämlich [NiFe]-Hydrogenase, [FeFe]-Hydrogenase und [Fe]-

Hydrogenase (Hmd). Während Kristallstrukturen von [NiFe]-Hydrogenase und

[FeFe]-Hydrogenase bereits seit einigen Jahren vorliegen, basieren die bisherigen

Kenntnisse zur Struktur des aktiven Zentrums von [Fe]-Hydrogenase im

Wesentlichen auf Infrarot-, Mössbauer- und Röntgenabsorptions-spektroskopischen

Untersuchungen, aus denen hervorgeht, dass im aktiven Zentrum von [Fe]-

Hydrogenase ein "Low Spin"-Eisen (0) oder -Eisen (II) von einem Schwefel-, zwei

CO- und einem oder zwei N/O-Liganden komplexiert wird. Das Eisen ist mit einem

Guanylylpyridon (GP) fest verbunden, mit dem es zusammen einen festen Komplex

(FeGP) bildet, der ein essentieller Kofaktor der [Fe]-Hydrogenase ist. Der FeGP-

Kofaktor kann in Gegenwart von Mercaptoethanol reversibel vom Enzym getrennt

werden, was es ermöglicht, aktives Holoenzym aus Apoenzym und FeGP-Kofaktor

zu rekonstituieren. Zu Beginn der vorliegenden Arbeit waren weder die Struktur des

FeGP-Kofaktors noch die des Apo- und Holoenzyms bekannt.

Es gelang als erstes, die Kristallstruktur von in E. coli heterolog produziertem

[Fe]-Hydrogenase-Apoenzym von Methanocaldococcus jannaschii bis zu 1.75 Å

Auflösung zu erhalten. Die Struktur zeigt, dass das Apoenzym ein funktionelles

Homodimer (2 x 38 kDa) mit einer zentralen Dömäne, in der die beiden C-terminalen

Hälften der beiden Untereinheiten sich umwinden, und zwei peripheren Domänen ist,

die jeweils nur von einer N-terminalen Hälfte der beiden Untereinheiten gebildet

werden und die eine Nukleotidbindestelle („Rossmann Fold“) enthalten. Zwischen

den drei Domänen finden sich zwei Taschen in einem Abstand von 50 Å, in deren

Tiefe die Thiolgruppe von Cystein176 zugänglich ist. Aus Mutationsanalysen war

bekannt, dass Cys176 essentiell für die Enzymaktivität ist, weshalb postuliert worden

war, dass die Seitengruppe dieser Aminosäure den Schwefel-Liganden zum Eisen im

aktiven Zentrum stellt. Anhand der Lage von Cys176 und der Nukleotidbindestelle

wurden Eisen und Guanylylpyridon in die Apoenzymstruktur modelliert.

Zusammenfassung 4

Geeignete Kristalle des [Fe]-Hydrogernase-Holoenzyms, die bis zu 1.75 Å

beugen, wurden erst ganz am Ende dieser Arbeit erhalten und zwar vom Holoenzym,

das aus Apoenzym von M. jannaschii und dem FeGP-Kofaktor des Enzyms von

Methanothermobacter marburgensis rekonstituiert worden war. Ebenfalls bis 1.75 Å

Auflösung konnte die Struktur des Cyanid-inhibierten Fe-Hydrogenase-Holoenzyms

von M. jannaschii gelöst werden. Aus den Elektronendichten lässt sich erkennen,

dass das Eisen im aktiven Zentrum mononuklear und quadratisch-pyramidal

koordiniert ist. Im Enzym ohne Cyanid bilden der Stickstoff des Pyridons die Spitze

der Pyramide und Schwefel von Cys176, zwei CO, die einen Winkel von 90o bilden,

und ein unbekannter Ligand (wahrscheinlich extrinsisches CO) die vier Ecken des

Quadrates. Im cyanidinhibiertem Enzym nimmt Cyanid die Stelle des unbekannten

Liganden ein. Diese Stelle dürfte daher auch die H2-Bindungsstelle sein. In der Nähe

des Eisens bietet die Enzymstruktur ausreichend Platz für die Bindung des zweiten

Substrats Methenyltetrahydromethanopterin, auf das im aktiven Zentrum ein Hydrid

vom H2 übertragen wird. Die genaue Bindestelle für Methenyltetrahydro-

methanopterin muss allerdings noch durch Kokristallisationsversuche verifiziert

werden.

Einleitung 5

2. Einleitung

Wasserstoff ist das häufigste Element der Biosphäre der Erde, aber nur wenig

Wasserstoff liegt in Form von Wasserstoffgas vor. Der überwiegende Teil ist in Form

von Wasser und Kohlenwasserstoffen gebunden. Wasserstoff wird seit einiger Zeit

als möglicher sekundärer Energieträger im Konzept einer Wasserstoffökonomie in

Betracht gezogen. In diesen Überlegungen würde Wasserstoff als Energieträger

beispielsweise in Brennstoffzellen eingesetzt [1].

Die Dissoziationsenergie der H-H-Bindung des Wasserstoffmoleküls beträgt

435 kJ/mol [2]. Wegen dieser starken Bindung ist das Wasserstoffmolekül unter

gewöhnlichen Bedingungen nicht reaktiv. Kann die Spaltung nicht unter hohem

Druck und hoher Temperatur durchgeführt werden, wird ein Katalysator benötigt. In

Brennstoffzellen ist dies Platin, das allerdings sehr teuer und nur in begrenzten

Mengen verfügbar [3] ist, weshalb die Suche nach einer günstigen Alternative zu

Platin große Bedeutung hat. Neue Wasserstoffkatalysatoren sollten günstig, effizient

und stabil gegenüber häufig auftretenden Verunreinigungen in einer Brennstoffzelle

wie beispielsweise Kohlenmonoxid sein. Als zum Nachbau geeignete Modelle

könnten daher die aktiven Zentren von wasserstoffspaltenden Enzymen, dienen [4-

7].

In anaeroben Ökosystemen entstehen durch Fermentation von organischen

Verbindungen und andere Prozesse etwa 108 Tonnen Wasserstoff pro Jahr. Die

Wasserstoffkonzentration anoxischer Lebensräume beträgt allerdings nur 0,1 µM [8],

da der überwiegende Teil des produzierten Wasserstoffs durch methanogene

Archäen, sulfatreduzierende oder azetogene Bakterien sofort wieder verbraucht wird.

In aeroben Lebensräumen wird Wasserstoff durch Knallgasbaktrien und Nitrifizierer

verbraucht. Alle genannten Organismen enthalten Hydrogenasen,

wasserstoffspaltende Enzyme.

Hydrogenasen werden entsprechend dem Aufbau ihrer aktiven Zentren in drei

phylogenetisch nicht miteinander verwandte Klassen eingeteilt: [NiFe]-Hydrogenase,

[FeFe]-Hydrogenase und [Fe]-Hydrogenase (früher: Eisen-Schwefel-Cluster-freie

Hydrogenase). [NiFe]- und [FeFe]-Hydrogenase katalysieren die Reduktion von

Einelektronenakzeptoren wie Methylviologen mit H2 [9] und in Abwesenheit eines

Elektronenakzeptors sowohl den einfachen als auch den doppelten

Einleitung 6

Isotopenaustausch zwischen H2 und H2O als auch die Umwandlung von para-H2 in

ortho-H2, weshalb für beide Hydrogenasen ein Ping-Pong-Reaktionsmechanismus

angenommen wird. Hydrogenasen dieser beiden Klassen besitzen neben einem

dinuklearen Zentrum (Nickel und Eisen bzw. Eisen und Eisen) auch immer

mindestens einen [4Fe-4S]-Cluster. Hydrogenasen der dritten Klasse, [Fe]-

Hydrogenase, hingegen besitzen ein mononukleares Fe-Zentrum und keine Eisen-

Schwefel-Cluster und katalysieren einen Hydridtransfer. [Fe]-Hydrogenase reduziert

kein Methylviologen. Sowohl die Umwandlung von para-H2 in ortho-H2 [10] als auch

der einfache und doppelte Isotopenaustausch von H2 mit H2O finden nur in

Anwesenheit des Hydridakzeptors Methenyltetrahydromethanopterin statt [11, 12].

2.1. [FeFe]-Hydrogenase

Die Kristallstrukturen von [FeFe]-Hydrogenase von Clostridium pasteurianum

[13] bei 1,8 Å und von Desulfovibrio desulfuricans [14] bei 1,6 Å zeigten das als H-

Cluster bezeichnete aktive Zentrum (Abb. 1). Der H-Cluster besteht aus einem

dinuklearen Eisenzentrum und einem [4Fe-4S]-Cluster, die über ein Cystein

miteinander verbunden sind. Die beiden Eisenatome des dinuklearen Zentrums

tragen Cyanid- und CO-Liganden und sind über zwei S-Atome eines noch

unbekannten kleinen Moleküls verbunden. Bei diesem Brückenliganden könnte es

sich um Di-(Thiomethyl)-Amin handeln, wobei anstelle des zentralen Stickstoffatoms

auch ein Kohlenstoff- oder Sauerstoffatom diskutiert werden [15]. Das vom [4Fe-4S]-

Cluster aus gesehen distale Eisenatom ist nicht redoxaktiv, stellt vermutlich die H2-

Bindestelle dar und verbleibt im Low-Spin-Fe(II)-Zustand während des

Reaktionszyklus [16]. An dieses distale Eisen bindet auch extrinsisches CO, das

[FeFe]-Hydrogenase inhibiert. Das proximale Eisen ist redoxaktiv. Die Hydrogenasen

der Clostridien enthalten zusätzlich zum [4Fe-4S]-Cluster des H-Clusters noch drei

[4Fe-4S]-Cluster und einen [2Fe-2S]-Cluster. Diese dienen dem Elektronentransport

vom aktiven Zentrum zu Ferredoxin [13]. Diese zusätzlichen Cluster finden sich nicht

in [FeFe]-Hydrogenase von Chlorella und Chlamydomonas [17]. Gaskanäle von der

Oberfläche des Enzyms führen zum aktiven Zentrum [18].

Einleitung 7

[FeFe]-Hydrogenase findet sich in anaeroben Bakterien und Eukrayoten, nicht

jedoch in Archäen [19]. Im Allgemeinen dient dieses Enzym der Bildung von

Wasserstoff als Endprodukt der Fermentation.

Abb. 1: Aktives Zentrum (H-Cluster) von [FeFe]-Hydrogenase aus Clostridium pasteurianum. Das dinukleare Eisenzentrum ist über ein Cystein mit einem [4Fe-4S]-Cluster verbunden. Beide Eisen

tragen intrinsische Cyanid- und CO-Liganden. Die chemische Struktur des Dithiolliganden zwischen

den beiden Eisenatomen ist noch unklar.

2.2. [NiFe]-Hydrogenase

[NiFe]-Hydrogenase wurde zuerst in methanogenen Archäen entdeckt [20, 21].

Mit Ausnahme von [Fe]-Hydrogenase Hmd sind alle Hydrogenasen der Archäen

Nickelenzyme. [NiFe]-Hydrogenase findet sich auch in gramnegativen Bakterien wie

beispielsweise E. coli [19].

[NiFe]-Hydrogenase besteht im Allgemeinen aus einer großen Untereinheit, die

das binukleare [NiFe]-Zentrum enthält, und einer kleinen Untereinheit mit drei [4Fe-

4S]-Clustern [22]. Die Kristallstrukturen von [NiFe]-Hydrogenase aus Desulfovibrio

gigas bei 2,85 Å [23], Desulfovibrio vulgaris bei 1,4 Å [24, 25] Desulfomicrobium

baculatum bei 2,15 Å [26] und Desulfovibrio desulfuricans bei 1,85 Å [27] enthüllten

das binukleares [NiFe]-Zentrum (Abb. 2). Die Kristallstruktur der [NiFe]-Hydrogenase

aus Desulfovibrio gigas zeigte, dass im binuklearen [NiFe]-Zentrum das Nickel- und

das Eisenatom über Cysteinyl-Schwefel-Liganden miteinander verbunden sind [23,

25, 28]. Das Nickelatom trägt noch zwei weitere Cysteinyl-Schwefel-Liganden und

das Eisenatom zwei CO- und einen Cyanid-Liganden [29]. Das Nickelatom ist

redoxaktiv und stellt vermutlich die H2-Bindestelle dar. Das Eisenatom ist nicht

redoxaktiv und verbleibt wie das distale Eisenatom des H-Clusters von [FeFe]-

Hydrogenase im Low-Spin-Fe(II)-Zustand während des Reaktionszyklus [22]. Der

Einleitung 8

Abstand zwischen [NiFe]-Zentrum und dem nächstgelegenen [4Fe-4S]-Cluster

beträgt 10 Å [23]. Ähnlich wie bei [FeFe]-Hydrogenase dienen die [4Fe-4S]-Cluster

von [NiFe]-Hydrogenase dem Elektronentransport zum Elektronenakzeptor. Es

konnte gezeigt werden, dass Wasserstoff über Gaskanäle durch konservierte

Aminosäurereste kontrolliert zum [NiFe]-Zentrum gelangt [30, 31].

Im Allgemeinen dient [NiFe]-Hydrogenase der Aufnahme und Spaltung von

Wasserstoff, wie beispielsweise bei Knallgasbakterien [32, 33]. Eine Ausnahme bildet

Hydrogenase 3 von E. coli in der Formiat-Hydrogen-Lyase-Reaktion [34].

Schon wegen ihrer Katalyse der Knallgasreaktion ist [NiFe]-Hydrogenase

weniger sauerstoffempflich als [FeFe]-Hydrogenase, die nur unter strikt anaeroben

Bedingungen arbeitet. Die spezifische Aktivität von [FeFe]-Hydrogenase ist allerdings

zehnmal höher als die von [NiFe]-Hydrogenase [22].

Abb. 2: Aktives Zentrum von [NiFe]-Hydrogenase aus Desulfovibrio gigas. Das Nickelatom trägt

vier Cysteinyl-Schwefel-Liganden. Zwei dieser Cysteinyl-Schwefel-Liganden verbinden das Nickel- mit

dem Eisenatom, das zusätzlich ein CO- und zwei Cyanidliganden besitzt. Der nächstgelegene [4Fe-

4S]-Cluster befindet sich in der kleinen Untereinheit des Enzyms und ist 10 Å vom binuklearen [NiFe]-

Zentrum entfernt.

2.3. [Fe]-Hydrogenase (Hmd)

Aus Methanothermobacter marburgensis isolierte [Fe]-Hydrogenase Hmd

konnte bereits bei ihrer Entdeckung keiner der beiden anderen

Hydrogenasenklassen zugeordnet werden, da sie als einzige Hydrogenase nicht die

Reduktion von Methylviologen katalysiert [12]. In [Fe]-Hydrogenase-Reinigungen

wurden zunächst stöchiometrische Mengen Eisen nachgewiesen [12]. Da die

Einleitung 9

Eisenmengen aber nicht mit der spezifischen Aktivität korrelierten, wurde später die

Anwesenheit von Eisen als Kontamination angesehen [11]. Auch die UV/Vis-

Spektrum gereinigter [Fe]-Hydrogenase zeigte bei 280 nm eine 2,8-mal höhere

Absorption als berechnet [11], weshalb schon früh die Anwesenheit einer

prosthetischen Gruppe nicht ausgeschlossen wurde.

2.3.1. Katalytische Eigenschaften

[Fe]-Hydrogenase katalysiert die reversible Reduktion von

Methenyltetrahydromethanopterin (Methenyl-H4MPT+) mit H2 zu

Methylentetrahydromethanopterin (Methylen-H4MPT) und H+ (∆G°’ = -5,5 kJ/mol)

(Abb. 3). Diese Reaktion ist an der Methanogenese aus H2 und CO2 beteiligt [35]

(Abb. 4). Die freie Energie der Reaktion unter Standardbedingungen liegt nahe null.

Die Standardreduktionspotentiale (E°’) sind für das H+/H2-Paar -414 mV und für das

Methenyl-H4MPT+ / Methylen-H4MPT-Paar -390 mV [12].

Abb. 3: Reaktion von [Fe]-Hydrogenase Hmd. [Fe]-Hydrogenase katalysiert die reversible

Reduktion von Methenyltetrahydromethanopterin mit H2 zu Methylentetrahydromethanopterin und H+.

Dabei wird nach heterolytischer Spaltung das Hydrid des Wasserstoffs in die pro-R-Position von

Methylentetrahydromethanopterin übertragen.

Das pH-Optimum der Hinreaktion liegt bei 7,5, dasjenige der Rückreaktion bei

6,5. Salzkonzentrationen von mindestens 100 mM sind nötig [12]. Der apparente Km-

Wert für Methylen-H4MPT beträgt 40 µM, der app. Km-Wert für Methenyl-H4MPT+

beträgt 50 µM. Der app. Vmax-Wert für Methylen-H4MPT beträgt 2040 U/mg und

Einleitung 10

derjenige für Methenyl-H4MPT+ 1360 U/mg. Der app. Km-Wert für H2 ist mit 60 %

oder 0,2 mM relativ hoch [11, 36].

2.3.2. Physiologische Rolle

Abb. 4: Stoffwechselweg der Methanogenese aus H2 und CO2 in Methanothermobacter marburgensis. CO2 wird schrittweise bis zum Methan reduziert. Während der Reduktion sind die C1-

Körper an die Coenzyme Methanofuran (MFR), Tetrahydromethanopterin (H4MPT) und Coenzym M

(HS-CoM) gebunden. Als Elektronenüberträger dienen Ferredoxin, Coenzym F420 und Coenzym B

(HS-CoB). Abkürzungen: Fd: Ferredoxin; Energie konvertierende Hydrogenasen: Eha und Ehb

([NiFe]-Hydrogenasen); Fmd: Formylmethanofurandehydrogenase; Hmd: H2-bildende N5,N10-

Methylen-H4MPT-Dehydrogenase; Mtd: F420-abhängige N5,N10-Methylen-H4MPT-Dehydrogenase; Frh:

F420-reduzierende Hydrogenase ([NiFe]-Hydrogenase); Mer: N5,N10-Methylen-H4MPT-Reduktase;

Mvh: Methylviologen reduzierende Hydrogenase ([NiFe]-Hydrogenase); Hdr: Heterodisulfidreduktase;

Mcr: Methyl-Coenzym-M-Reduktase. Grün: Nickelhaltige Enzyme, braun: Eisen-Schwefel-Protein, rot:

Hmd.

Einleitung 11

Die relativ hohe Km(H2) von [Fe]-Hydrogenase ist ein Grund dafür, dass unter

normalen Wachstumsbedingungen, insbesondere bei ausreichend Nickel im Medium,

die oben genannte Reduktion von Methenyl-H4MPT+ nicht von Hmd sondern von Mtd

(F420-abhängige Methylentetrahydromethanopterindehydrogenase), einem metall-

freien Enzym [37], und nicht mit H2 sondern mit reduziertem F420 durchgeführt wird.

F420 wird von Frh (F420-reduzierende Hydrogenase), einer [NiFe]-Hydrogenase,

reduziert. Der Km(H2) von Frh beträgt lediglich 0,01 mM und ist somit etwa

zwanzigmal niedriger als derjenige von Hmd [38]. Unter Nickellimitierung wird in

M. marburgensis keine Frh produziert. In diesem Fall übernehmen Mtd und Hmd

gemeinsam die Reduktion von F420 und ersetzen somit das Nickelenzym Frh [36].

Der höhere Km(H2) von Hmd im Vergleich zu Frh wird durch eine fünffach höhere

Hmd-Konzentration in M. -marburgensis-Zellen bei Wachstum unter Ni-Limitierung im

Vergleich zu unlimitiertem Wachstum kompensiert [36, 39]. Diese Entdeckung

ermöglichte die Reinigung von großen Mengen [Fe]-Hydrogenase aus Zellen von

M. marburgensis nach Wachstum unter Nickellimitierung.

2.3.3. Reaktionsmechanismus

[Fe]-Hydrogenase aus M. marburgensis ist ein Dimer aus zwei identischen

38 kDa großen Untereinheiten und enthält keine Eisen-Schwefel-Cluster [11]. [Fe]-

Hydrogenase katalysiert per se weder den einfachen noch den doppelten

Isotopenaustausch zwischen H2 und H2O und auch nicht die Umwandlung von para-

H2 in ortho-H2. Bei Anwesenheit des Substrates Methenyl-H4MPT+ katalysiert [Fe]-

Hydrogenase allerdings die genannten Reaktionen [10, 11]. Isotopenexperimente

zeigten, dass die H2-Aktivierung nicht der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der

Reaktion ist [40, 41]. Aufgrund dieser Ergebnisse und der

Konzentrationsabhängigkeit der Methenyl-H4MPT+-Reduktionsrate mit H2

(„intersecting reciprocal plots“) [40, 41] wurde als Katalysemechanismus ein ternärer

Komplexmechanismus und kein Ping-Pong-Mechanismus vorgeschlagen [42]. Mittels

Isotopenmarkierungs- und NMR-spektroskopischen Experimenten konnte

nachgewiesen werden, dass [Fe]-Hydrogenase den Re-seitenspezifischen Transfer

des Hydrids von H2 zum C14 von Methenyl-H4MPT+ katalysiert [43, 44]. Darüber

hinaus katalysiert [Fe]-Hydrogenase den Austausch des pro-R-Wasserstoffatoms der

Einleitung 12

Methylengruppe von Methylen-H4MPT mit Protonen des Wassers [43]. Durch

Nukleare Overhausereffektspektroskopie konnte gezeigt werden, dass sich die

Konformation des Substrates Methylen-H4MPT bei Bindung an [Fe]-Hydrogenase

ändert und das pro-R-Wasserstoffatom der Methylengruppe das reaktivere

Wasserstoffatom wird. In Lösung ist hingegen das pro-S-Wasserstoffatom der

Methylengruppe das reaktivere [45]. Aufgrund der genannten Ergebnisse wurde ein

Reaktionsmechanismus auf Basis der Carbokationenchemie von Alkanen in

supersauren Bedingungen vorgeschlagen [46, 47]. Dabei verhält sich das

Carbokation Methenyl-H4MPT+ wie eine Lewissäure (Elektronenpaarakzeptor) bei

der heterolytischen Spaltung von H2, sodass als Intermediat ein pentakoordinierter

Kohlenstoff in der Position C14 entsteht. Dieser Reaktionsmechanismus erfordert

keine Anwesenheit eines Metalls der Übergangsgruppen, weshalb der Name

metallfreie Hydrogenase eingeführt wurde [47].

Heterolog in E. coli produzierte [Fe]-Hydrogenase ist inaktiv. Wird jedoch native

[Fe]-Hydrogenase in Anwesenheit von Mercaptoethanol denaturiert und ultrafiltriert,

so aktiviert das dabei gewonnene Ultrafiltrat das heterolog produzierte Apoenzym.

Aufgrund dieser Entdeckung wurde die Anwesenheit eines [Fe]-Hydrogenase-

Kofaktors postuliert. Nach Bindung dieses Kofaktors an heterolog produziertes

Apoenzym kann aktives [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym rekonstituiert werden [48].

2.3.4. [Fe]-Hydrogenase-Kofaktor

Die Entdeckung des [Fe]-Hydrogenase-Kofaktors und die Möglichkeit [Fe]-

Hydrogenase in großen Mengen aus Zellen von M. marburgensis nach Wachstum

unter Ni-Limitierung zu gewinnen und die Entdeckung der Lichtempfindlichkeit von

sowohl [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym als auch -Kofaktor bei UV- und Blaulicht (320 –

500 nm) [49], ermöglichten eine Charakterisierung von [Fe]-Hydrogenase im Hinblick

auf den Metallgehalt und ihre Empfindlichkeit gegenüber Inhibtoren. Es zeigte sich,

dass [Fe]-Hydrogenase unempfindlich gegenüber Sauerstoff ist, jedoch durch O2-

und Kupferionen rasch inaktiviert wird. Pro mol [Fe]-Hydrogenase-Monomer wurde

ein mol Eisen nachgewiesen, das bei Lichtinaktivierung freigesetzt wird. Der Verlust

des Eisens korreliert mit dem Verlust der Aktivität. [Fe]-Hydrogenase wird durch CO

(Ki (CO) = 20 % (v/v)) und Cyanid (Ki (CN-)= 0,1 mM) inhibiert, wobei die Bindung

eines der beiden Inhibitoren die Bindung des jeweils anderen ausschließt [49]. Der Ki

Einleitung 13

(CO) ist etwa 100-mal höher als derjenige von [FeFe]-Hydrogenase und etwa 10-mal

höher als derjenige von [NiFe]-Hydrogenase.

Abb. 5: Photolyseprodukt des [Fe]-Hydrogenase-Kofaktors (FeGP-Kofaktors) nach Hitze- oder Lichtinaktivierung: Carboxymethyl-3,5-dimethyl-2-pyridon-4-yl)-(5’-guanosyl)-Phosphat (kurz:

Guanylylpyridon oder GP). Pro mol [Fe]-Hydrogenase-Kofaktor werden bei der Inaktivierung ein mol

Eisen und zwei mol CO freigesetzt.

Die Struktur des aktiven [Fe]-Hydrogenase-Kofaktors wurde nicht gelöst.

Jedoch bildete sich bei Lichtinaktivierung des Kofaktors ein stabiles

Photolyseprodukt, dessen Struktur mittels NMR und Massenspektroskopie aufgeklärt

wurde [50]. Es handelt sich dabei um (6-Carboxymethyl-3,5-dimethyl-2-pyridon-4-yl)-

(5’-guanosyl)-Phosphat oder kurz: Guanylylpyridon (GP) (Abb. 5). Pro mol [Fe]-

Hydrogenase-Kofaktor, der ab hier FeGP-Kofaktor genannt wird, wurden bei

Inaktivierung ein mol Eisen und zwei mol CO abgegeben [50].

2.3.5. Spektroskopische Untersuchungen

Mittels Fouriertransformationsinfrarotspektroskopie (FT-IR) wurde

nachgewiesen, dass zwei CO-Moleküle das Eisen des FeGP-Kofaktors sowohl in der

freien als auch in der enzymgebundenen Form ligieren. Beide CO-Moleküle stehen

im Abstand von 90 ° zueinander [51]. Bei Inhibition von [Fe]-Hydrogenase mit CO

oder Cyanid waren jeweils drei Banden im IR-Spektrum nachweisbar, die

charakteristisch gegeneinander verschoben waren. Daraus wurde geschlossen, dass

die beiden intrinsischen CO-Moleküle und die Inhibitoren an dasselbe Eisenatom

binden. Freier FeGP-Kofaktor bindet kein extrinsisches CO. Extrinsisches CO wird

Einleitung 14

nicht mit intrinsischem CO ausgetauscht. Die Affinität von [Fe]-Hydrogenase

gegenüber Cyanid ist höher als gegenüber CO [51]. Die Tatsache, dass drei CO-

Moleküle an das Eisen binden können, zeigt, dass das Eisen in einer stark

reduzierten Form vorliegen muss. Da [Fe]-Hydrogenase kein EPR-Signal zeigte,

kann Fe(I) ausgeschlossen werden. Die Mössbauerspektren von 57Fe-markierter

[Fe]-Hydrogenase und freiem Kofaktor sind am ehesten durch ein mononukleares

Eisenzentrum erklärbar und sagen aus, dass das Eisen diamagnetisch ist. Daher

liegt das Eisen vermutlich entweder im Low-Spin-Fe(0)- oder im Low-Spin-Fe(II)-

Zustand vor [52].

Abb. 6: Mononukleares Fe-Zentrum der [Fe]-Hydrogenase Hmd gemäß den FT-IR-, Mössbauer- und XAS-Messungen. Das Eisen hat im Fall von rekonstituiertem [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym aus

M. jannaschii und freiem FeGP-Kofaktor fünf Liganden: zwei CO, ein oder zwei O oder N und einen

Schwefel. Mutationsanalysen zeigten, dass Cystein176 wahrscheinlich den Schwefelliganden stellt.

XAS-Messungen und Mutationsanalysen bestätigten die Mössbauer- und FT-

IR-Daten. Zwei CO-Moleküle wurden als Liganden des Eisens des Kofaktors

nachgewiesen. Der Abstand von CO zu Fe beträgt jeweils 1,8 Å. Als zusätzliche

Liganden des Eisens bei Bindung des FeGP-Kofaktors an das [Fe]-Hydrogenase-

Apoenzym wurden ein Schwefel im Abstand von 2,3 Å und im Fall von

rekonstituiertem [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym aus M. jannaschii (jHmd) zwei N-

oder O-Liganden im Abstand von 2,0 Å nachgewiesen. Das Eisen des jHmd-

Holoenzyms trägt also fünf Liganden (Abb. 6). Das Gleiche gilt für freien Kofaktor.

Natives [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym aus M. marburgensis (mHmd) hat hingegen

vier Liganden, einen N/O-Liganden weniger als das rekonstituierte jHmd-Holoenzym

Einleitung 15

[53]. Mutationsanalysen waren ein Hinweis darauf, dass Cystein176 den

Schwefelliganden bei jHmd-Holoenzym stellt, da jHmd keine Aktivität zeigt, wenn das

konservierte Cystein176 durch Alanin ersetzt wird. Werden andere konservierte

Cysteine durch Alanin ersetzt, ist noch Teilaktivität vorhanden [53, 54].

2.3.6. Vorkommen

[Fe]-Hydrogenase Hmd findet sich nur in einigen hydrogenotrophen

methanogenen Archäen der Ordnungen Methanobacteriales, Methanopyrales und

Methanococcales [42]. Neben M. marburgensis wurde native [Fe]-Hydrogenase noch

aus Methanothermobacter thermoautotrophicus [55], Methanopyrus kandleri [56],

Methanothermobacter wolfei [11], Methanothermus fervidus, Methanococcus igneus

[40], Methanothermococcus thermolithotrophicus [57] und Methanocaldococcus

jannaschii (Seigo Shima, Oliver Pilak, unveröffentlicht) gereinigt. [Fe]-Hydrogenase-

Aktivität wurde darüber hinaus in Methanobacterium thermoformicicum

nachgewiesen [55]. Neben den genannten Organismen sind noch die Gensequenzen

von hmd aus Methanococcus voltae [42] und Methanococcus maripaludis [58]

bekannt.

2.3.7. Bisherige Kristallisationsversuche

Die Informationen über die aktiven Zentren der [NiFe]- und [FeFe]-

Hydrogenasen beruhen überwiegend auf Kristallstrukturen der jeweiligen Enzyme. Im

Fall von [Fe]-Hydrogenase erwies sich die Kristallisation aus vielerlei Gründen als

schwierig. Bereits kurz nach der Entdeckung von [Fe]-Hydrogenase Hmd wurde

natives Holoenzym aus M. marburgensis kristallisiert [59]. Die Kristalle waren für

Messungen allerdings zu klein. Während der nächsten Jahre wurde native [Fe]-

Hydrogenase aus M. marburgensis immer wieder unter verschiedenen Bedingungen

mit und ohne Methenyl-H4MPT+ sowohl aerob als auch anaerob und bei

verschiedenen Temperaturen kristallisiert. Trotz guter Reproduzierbarkeit und

ausreichender Größe der Kristalle erwies sich die Strukturlösung als unmöglich [60].

[Fe]-Hydrogenase aus M. marburgensis lag immer als perfekt merohedral

verzwillingte Kristalle vor. Native [Fe]-Hydrogenase konnte auch aus M. kandleri

Einleitung 16

gereinigt werden [56], ließ sich jedoch nicht kristallisieren. Nachdem die [Fe]-

Hydrogenase-Apoenzyme aus M. jannaschii und M. kandleri in E. coli heterolog

produziert werden konnten, wurde auch versucht, diese beiden Apoenzyme zu

kristallisieren. MAD-Experimente mit Selenomethionin-markierten Kristallen von

aerob produziertem [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym aus M. kandleri lieferten eine

vorläufige Struktur. Die Rcryst- und Rfree-Werte der Struktur betrugen 38 bzw. 40 und

eine weitere Verfeinerung erwies sich als unmöglich. Hohe B-Faktoren von 60

wiesen auf eine hohe thermische Flexibilität des kHmd-Apoenzyms hin. Die aerobe

Kristallisation von [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym aus M. jannaschii führte vereinzelt

zu Mikrokristallen, die für eine Strukturaufklärung zu klein waren [60]. Erst später

wurde die Sauerstoffempfindlichkeit des [Fe]-Hydrogenase-Apoenzyms aus

M. jannaschii erkannt [54]. Daher wurden im Verlauf dieser Arbeit auch alle

Reinigungen und alle Kristallisationsversuche zu den Apoenzymen anaerob

durchgeführt.

2.3.8. Ziel der vorliegenden Arbeit

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Strukturaufklärung von [Fe]-

Hydrogenase Hmd und ihres FeGP-Kofaktors mittels Röntgenstrukturanalyse. [Fe]-

Hydrogenase-Apoenzyme aus verschiedenen Organismen lassen sich mit dem leicht

zu präparierenden FeGP-Kofaktor aus M. marburgensis zu aktiven Holoenzymen

rekonstituieren. Daher wurden in dieser Arbeit möglichst viele Apo- und Holoenzyme

für Kristallisationsexperimente benutzt. Neben nativer [Fe]-Hydrogenase aus

M. marburgensis und M. jannaschii waren dies die Apoenzyme von [Fe]-

Hydrogenase aus M. jannaschii, M. kandleri und Methanothermococcus

thermolithotrophicus und die zugehörigen rekonstituierten Holoenzyme. Die hmd-

Gene von Methanobrevibacter arboriphilus und Methanococcus fervidus wurden im

Rahmen dieser Arbeit kloniert und die entsprechenden Apoenzyme heterolog

produziert.

Letztendlich gelang ausschließlich die Kristallisation und Strukturaufklärung von

[Fe]-Hydrogenase-Apoenzym und rekonstituiertem [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym

aus M. jannaschii und dadurch auch die Strukturaufklärung des FeGP- Kofaktors.

Material und Methoden 17

3. Material und Methoden

3.1. Verwendete Materialien

3.1.1. Chemikalien und Biochemikalien

Soweit nicht anders angegeben, wurden alle verwendeten Reagentien in der

höchsten erhältlichen Reinheit von den Firmen Sigma-Aldrich (München) und Merck

(Darmstadt) bezogen. Die verwendeten Kristallisationsmaterialien wie

Kristallisationskollektionen („Screens“), Platten und Zubehör stammten von den

Firmen Jena Bioscience (Jena) und Hampton Research (Aliso Viejo, USA).

Synthetische Oligonukleotide stammten von Thermoelectron (Ulm).

Restriktionsendonukleasen und sonstige DNA-modifizierende Enzyme stammten von

GE Healthcare (Freiburg), New England Biolabs (Frankfurt am Main), Roche

(Mannheim) und Stratagene (Amsterdam, Niederlande).

Die Koenzyme H4MPT und Methenyl-H4MPT+ wurden aus Zellen von

Methanothermobacter marburgensis von Herrn Reinhard Böcher und Frau Johanna

Moll gereinigt [61]. Methylen-H4MPT entstand durch spontane Reaktion von H4MPT

mit Formaldehyd und anschließende Lyophilisierung zur Abtrennung überschüssigen

Formaldehyds.

3.1.2. Gase, Anaerobenzelte, anaerobe Lösungen

Alle Gase wurden von Messer-Griesheim (Siegen) bezogen. H2 und N2 wurden

in Reinheiten von 99,999 % bez. 99,996 % eingesetzt.

Anaerobe Lösungen und Wasser wurden durch Membranfilter (0,45 µm, Pall,

Dreieich) filtriert und unter N2-Begasung gekocht. Die abgefüllten Flüssigkeiten

wurden danach über Nacht im Anaerobenzelt gerührt. Die Aufbewahrung erfolgte

unter 100% N2.


3.1.3. Mikroorganismen, Genbänke und Plasmide

Methanothermobacter marburgensis (DSMZ 2133) wurde von der Deutschen

Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen in Braunschweig bezogen. [Fe]-

Hydrogenase von M. marburgensis wurde aus unter Nickellimitierung gewachsenen

Zellen von Frau Manuela Kauß gereinigt [49]. Zellen von Methanocaldococcus

jannaschii wurden von Herrn Dr. Huber (Universität Regensburg) bezogen.

Escherichia coli BL21 (DE3) mit dem Plasmid pET24b(+) und dem hmd-Gen

aus Methanopyrus kandleri stammte von Frau Sonja Vogt. E. coli BL21 (DE3) mit

dem Plasmid pET24b(+) und dem hmd-Gen aus M. jannaschii stammte von Herrn

Dr. Seigo Shima [50].

Die Phagengenbank des Genoms von Methanothermus fervidus und die

Gensonde für den konservierten Bereich des hmd-Gens aus M. fervidus wurden von

Frau Sonja Vogt, die Phagengenbank des Genoms von Methanobrevibacter

arboriphilus und die Gensonde für den konservierten Bereich des hmd-Gens aus

M. arboriphilus wurden von Herrn Dr. Seigo Shima zur Verfügung gestellt.

Chromosomale DNA von M. fervidus und M. arboriphilus wurde von Herrn Dr.

Seigo Shima bereitgestellt.

Tabelle 1: Verwendete Plasmide

Plasmid Beschreibung Referenz

pET-24b(+) Expressionsvektor mit optionalem, C-

terminalem His-Tag, Kanr

Novagen (Heidelberg)

pET-24d(+) Expressionsvektor mit optionalem, C-

terminalem His-Tag, Kanr

Novagen (Heidelberg)

pET-24b(+)-jHmd pET-24b(+), in den das hmd-Gen aus

M. jannschii kloniert wurde

[48]

pET-24b(+)-kHmd pET-24b(+), in den das hmd-Gen aus

M. kandleri kloniert wurde

[54]

pET-24b(+)-fHmd pET-24b(+), in den das hmd-Gen aus

M. fervidus kloniert wurde

Diese Arbeit

pET-24d(+)-aHmd pET-24d(+), in den das hmd-Gen aus

M. arboriphilus kloniert wurde

Transmit (Marburg)

ZAP Express λ-Vektor, enthält pBK-CMV, Kanr Stratagene (Amsterdam)

pBK-CMV Klonierungsvektor für DNA-Einschübe

bis 12 kb, Kanr

Stratagene (Amsterdam)


Tabelle 2: Verwendete E.-coli-Stämme

Stamm Genotyp Referenz

DH5α supE44 ∆lac U169 (Φ80lacZ∆M15)

HsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1

Invitrogen (Groningen)

XL1 Blue MRF’ ∆mcrA183 ∆(mcrCD-hsdSMR-mrr)173

endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1

lac [F’ proABlacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr)] Su-

(nonsuppressing)λr (lambda resistant)


XLOLR ∆(mcrA)183 ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr)173

endA1 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac [F’

proAB lacIqZM∆15 Tn10 (Tetr)] Su-

(nonsuppressing)λr (lambda resistant)


BL21 (DE3) F- ompT hsdS (rB-mB

-) gal dcm (DE3) Novagen (Heidelberg)

HMS 174 (DE3) RecA1 hasdR rifr (DE3) Novagen (Heidelberg)

3.1.4. Medien

Tabelle 3 : Medien zur Stammhaltung und Kultivierung der E.-coli-Stämme

Name Komponente Menge pro Liter

Trypton 10 g

Hefeextrakt 5 g

LB-(Luria Bertani)-

Medium

NaCl 10 g

Trypton 20 g

Hefeextrakt 15 g

NaCl 8 g

Na2HPO4 2 g

TP-(Trypton-

Phosphat)- Medium

KH2PO4 1 g

Trypton 2 (w/v) %

Hefeextrakt 0,5 (w/v) %

NaCl 10 mM

KCl 2,5 mM

MgCl2 10 mM

MgSO4 10 mM

SOC-Medium

Glukose 20 mM

NZ-Amine 10 g

Hefeextrakt 5 g

NaCl 5 g

NZY-Medium

MgSO4 2 g


Alle in Tabelle 3 genannten Nährmedien wurden 20 min bei 121 °C und 2 bar

autoklaviert. Zur Herstellung fester Nährböden erfolgte die Zugabe von 20 g

Agar/Liter. Selektionsmedien wurden je nach Resistenz mit folgenden Antibiotika

versehen:

Ampicillin: 100 µg/ml

Kanamycin: 50 µg/ml

Chloramphenicol: 34 µg/ml

3.2. Molekularbiologische Methoden

3.2.1. Kultivierung von E. coli

Die verwendeten E.-coli-Stämme wurden bei 37 °C in den angegebenen

Medien kultiviert (3.1.4). Übernachtkulturen wurden in Reagenzgläsern in einem

Roller, Flüssigkulturen in Erlenmeyerkolben wurden auf einer Rundschüttelmaschine

bei etwa 130 UpM schüttelnd inkubiert. Agarplatten wurden über Nacht bei 37 °C

inkubiert und anschließend bei 4 °C gelagert. Zur Stammhaltung der Bakterien

wurden Flüssigkulturen mit 20 % (v/v) Glyzerin versetzt und bei -80 °C gelagert.

3.2.2. Herstellung elektrokompetenter Zellen und Elektroporation

Zur Herstellung elektrokompetenter Zellen wurde E. coli in 0,5 l LB-Medium bis

zu einer ∆OD578 von 0,6 bis 0,8 gezogen. Die Kultur wurde anschließend für 15 min

auf Eis gekühlt. Die Zellernte erfolgte mittels Zentrifugation für 20 min bei 4 °C und

5000 UpM. Die sedimentierten Zellen wurden in sterilem, 4 °C kaltem Wasser

resuspendiert und dreimal mit jeweils 500 ml des genannten Wassers gewaschen.

Nach Überführung in ein 50-ml-Reaktionsgefäß wurde das Zellpellet in 50 ml sterilem

Wasser aufgenommen. Nach einem abschließenden Zentrifugationsschritt (20 min,

4 °C, 5000 rpm) wurden die Zellen je nach Größe des Pellets in 1 – 3 ml 20%igem

Glyzerin resuspendiert und zu jeweils 60 µl aliquotiert. Die Lagerung erfolgte bis zur

Transformation bei -80 °C.


Zur Transformation wurden elektrokompetente Zellen zu je 60 µl auf Eis

aufgetaut. Die zu transformierende DNA (1 – 5 µl) wurde zuvor auf einem

Membranfilter für 30 min dialysiert und dann zu den Zellen gegeben. Die Zellen

wurden zusammen mit der DNA in sterile Elektroporationsküvetten (BioRad,

München) mit 1 mm Spaltenbreite überführt. Die Transformation erfolgte im

GenePulserII (BioRad, München) bei 1,8 kV, 225 Ω und 25 µF. Im direkten

Anschluss wurden 250 µl, auf 37 °C erwärmtes SOC-Medium zugegeben. Die

Suspension wurde 1 h bei 37 °C im Thermoblock schüttelnd inkubiert. Nach der

Inkubation wurden die Zellen auf Selektivagarplatten plattiert und über Nacht bei

37 °C inkubiert. Zur Kontrolle der Transformanden wurden am Folgetag je 4 ml LB-

Medium mit Kolonien beimpft und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag

wurde die Plasmid-DNA isoliert und mit PCR überprüft.

3.2.3. Plasmidpräparation, Restriktion und Gelelektrophorese

Plasmid-DNA wurde aus 4-ml-Kulturen mit Hilfe des Qiagen-Spin-Miniprep-Kits

(Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert. Die Konzentration und

Reinheit der DNA wurde fotometrisch mit einem LKB-Ultrospec-II-Fotometer

(Pharmacia, Freiburg) bei 260 nm und 280 nm bestimmt. Ein ∆A260-Wert von 1

entspricht einer DNA-Konzentration von 50 µg/ml. Die Restriktion von Plasmid-DNA

erfolgte in einem Ansatz von 60 µl. Je nach Plasmidgröße wurden 1 – 5 µg DNA mit

Restriktionsenzym und Puffer entsprechend der Herstellerangaben gemischt und für

3 h bei 37 °C inkubiert.

Die Auftrennung der DNA-Fragmente erfolgte mittels 1%iger Agarosegele in

TAE-Puffer (40 mM Tris/Azetat, pH 8,0, 1 mM EDTA). Als Größenstandard diente der

Smart-Ladder-Marker (Eurogentec, Seraing, Belgien). Nach der Elektrophorese

wurden die DNA-Fragmente in Ethidiumbromidlösung (2 µg/ml Wasser) gefärbt, kurz

gewässert und im UV-Durchlicht bei 302 nm fotografiert. Zur Extraktion der DNA-

Fragmente aus den Agarosegelen wurde das QIAquick-Extraktionskit genutzt

(Qiagen, Hilden). Für die Ligation wurde T4-DNA-Ligase nach Angaben des

Herstellers verwendet (Fermentas, St. Leon).


3.2.4. Polymerasekettenreaktion (PCR)

In der vorliegenden Arbeit diente die PCR häufig zur Kontrolle des

Vorhandenseins langer DNA-Sequenzen (4000 bis 5000 Basenpaare). Daher wurde

eine besonders lange Elongationszeit gewählt.

Tabelle 4: PCR-Programm zur Amplifikation von 4 – 5 kb großen Sequenzen

Zyklenzahl Reaktion Temperatur (°C) Zeit (s)

1 Denaturierung 95 300

30 Denaturierung 95 30

Hybridisierung 55 30

Elongation 72 900

1 Elongation 72 1800

1 Aufbewahrung 4 _

3.3. Sequenzierung der hmd-Gene aus Methanothermus fervidus und Methanobrevibacter arboriphilus

Zur Durchsicht der Phagenbänke der chromosomalen DNA von M. fervidus und

M. arboriphilus wurde das ZAP-Express-Vektor-Kit (Stratagene, Amsterdam) benutzt.

3.3.1. Plattierung der Phagengenbank und Membrantransfer

50 ml LB-Medium mit Tetrazyklin wurde mit 500 µl 1 M MgSO4, 500 µl 20%iger

Glucoselösung und 50 µl XL-1-Blue-MRF’-Vorkultur versetzt und bis zu ∆OD578 = 0,5

schüttelnd bei 37 °C inkubiert. Die Zellernte erfolgte durch Zentrifugation für 15 min

bei 5000 UpM. Die Zellen wurden in 10 mM MgSO4 bis zu ∆OD578 = 0,5

resuspendiert.

Die Phagengenbank besteht aus einer Phagensuspension, wobei ein Phage

etwa 8 kb der partiell verdauten genomischen DNA von M. fervidus oder

M. arboriphilus trägt. Die Phagengenbank wurde auf eine Konzentration von

250 pfu/µl mit SM-Puffer (50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 0,01 % Gelatine, 0,1 M NaCl,

0,008 M MgSO4) verdünnt. Es wurden 4 µl Phagensuspension mit 600 µl XL-1-Blue-

MRF’-Suspension vermischt und für 15 min bei 37 °C inkubiert. Die Zell-Phagen-


Suspension wurde mit 6,5 ml NZY-Top-Agar (0,7 % Agarose in NZY-Medium, auf

50 °C erwärmt), 60 µl 1 M MgSO4 und 60 µl 20 % (w/v) Maltose vermischt und sofort

auf NZY-Agarplatten gegossen. Nach dem Erhärten des NZY-Topagars wurden die

Platten über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag zeigte sich ein

gleichmäßiger Bakterienrasen mit etwa 1000 Löchern pro Platte. Am Folgetag

wurden die Platten zwei Stunden bei 4 °C gekühlt und für 2 min mit einer Hybond-N-

Membran (GE Healthcare, Freiburg) bedeckt. Die Membran wurde für 2 min mit

Denaturierungslösung (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH), für 5 min mit

Neutralisierungslösung (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris/HCl, pH 8,0) und dann zweimal 2 min

mit Waschlösung (0,3 M NaCl, 0,3 M Na-Citrat, 0,2 M Tris/HCl, pH 7,5) bedeckt. Die

Membran wurde getrocknet und im UV-Stratalinker 1800 (Stratagene, La Jolla, USA)

mit zweimal 120000 µJ bestrahlt. Die Membran wurde dann in 25 ml

Prähybridisierungslösung (0,75 M NaCl, 0,075 M Na-Citrat, 0,1 % Laurylsarkosin,

0,02 % SDS) und 1 % (w/v) Blockierungslösung (1 % (w/v) Blockierungsreagenz,

0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl, pH 7,5) für 1,5 h bei 70 °C inkubiert. Zur

Hybridisierung wurden 2,5 µl Digoxigenin-markierte Sonde (10 pmol/ml) zugegeben

und über Nacht bei 70 °C inkubiert. Am Folgetag wurde die Membran zweimal für

15 min bei 70 °C in 0,15 M NaCl, 0,015 M Na-Citrat, danach für 5 min in Waschpuffer

(0,3 % Tween 20, 0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl, pH 7,5) und dann 30 min in 1 %

(w/v) Blockierungslösung bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde 5 µl mit

alkalischer Phosphatase konjugierter Antidigoxygenin-Antikörper zugegeben und für

weitere 30 min inkubiert. Danach wurde die Membran zweimal für 15 min mit

Waschpuffer gewaschen und anschließend in alkalischem Puffer (0,1 M Tris/HCl,

pH 9,5, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl2) aufbewahrt.

3.3.2. Detektion der hybridisierten DNA

Zur Detektion wurde die Membran auf Klarsichtfolie gelegt, mit 1 ml 0,25 mM

CSPD-Lösung (Roche, Mannheim) und einer zweiten Lage Klarsichtfolie bedeckt und

für 5 min bei 37 °C inkubiert. CSPD wird von alkalischer Phosphatase

dephosphoryliert, wobei ein metastabiles Intermediat entsteht, das langsam zerfällt

und dabei Licht emitiert. Die Lumineszenz wurde durch 40-minütiges Auflegen von

Biomax-XAR-Röntgenfilm (Kodak, Stuttgart) bei Raumtemperatur detektiert. Nach

dem Entwickeln wurden die Röntgenfilme (Abb. 7) mit den NZY-Topagarplatten


verglichen, um die Löcher zu ermitteln, die den Flecken auf den Röntgenfilmen

entsprachen. Sogenannte positive Plaques entsprachen also jeweils einem

Phagenklon, dessen eingebaute DNA mit der Sonde für das konservierte hmd-Gen

des jeweiligen Organismus hybridisierte.

Abb. 7: Detektion von Phagen, die das hmd-Gen tragen mittels Röntgenfilm. Die schwarzen

Flecken stammen von Phagen, deren DNA mit der DNA-Sonde für das hmd-Gen aus M. fervidus oder

M. arboriphilus hybridisierte. Durch Vergleich des Röntgenfilms und der urspünglichen Agarplatte mit

den Phagenplaques konnten diejenigen Plaques identifiziert werden, die für die Hybridisierung

verantwortlich waren und somit das hmd-Gen enthielten.

3.3.3. Phagenisolation

Positive Plaques wurden samt Agar mit einer sterilen Plastikspitze

ausgestochen und in 500 µl SM-Puffer und 20 µl Chloroform überführt. Das Gemisch

wurde für 30 s geschüttelt und dann für 4 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach

nochmaligem Schütteln wurde die Suspension für 5 min in der Tischzentrifuge bei

Maximalgeschwindigkeit zentrifugiert. Der Überstand, die Phagensuspension, wurde

bei 4 °C aufbewahrt.


3.3.4. Ausschneiden des Phagemids pBK-CMV und Transformation

E.-coli-XL1-Blue-MRF’- und E.-coli-XLOLR-Zellen wurden, wie in 3.3.1 für

E. coli XL1-Blue-MRF’ beschrieben, kultiviert und mit 10 mM MgSO4 auf

∆OD578 = 1,0 resuspendiert. In einem sterilen Plastikgefäß wurden 200 µl XL1-Blue-

MRF’-Zellsuspension und 250 µl Phagensuspension (siehe 3.3.3) mit 1 µl ExAssist-

Helferphagensuspension gemischt und für 15 min bei 37 °C inkubiert. Nach Zugabe

von 3 ml LB-Medium, 30 µl 1 M MgSO4 und 30 µl 20 % (w/v) Maltose wurde die

Suspension weitere 3 h bei 37 °C inkubiert und danach für 20 min auf 65 °C erwärmt.

Dann wurde die Suspension für 15 min bei Maximalgeschwindigkeit in der

Tischzentrifuge zentrifugiert und der Überstand wurde in ein steriles Gefäß überführt.

Während der Inkubation bei 37° C fand eine Koinfektion von Phage und Helferphage

statt. Der Helferphage schnitt das Phagemid pBK-CMV samt eingebauter DNA aus

dem Phagenvektor ZAP Express aus. Bei 65 °C lysierten die Zellen und setzten das

Phagemid frei. Zu jeweils 100 µl der Phagemidlösung wurden 200 µl XLOLR-

Zellsuspension gegeben und das Gemisch wurde für 15 min bei 37 °C inkubiert.

Dann wurden 300 µl NZY-Medium zugegeben und es wurde weitere 45 min bei

37 °C inkubiert. Jeweils 100 µl der Zellsuspension wurden auf LB-Kanamyzin-Platten

plattiert und die Platten wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert. Das Phagemid pBK-

CMV mit eingebauter DNA wurde aus den Zellen, wie in 3.2.3 beschrieben, mittels

Plasmidpräparation gereinigt.

3.3.5. Kontroll-PCR zur Überprüfung der eingebauten DNA und Sequenzierung

Zur Kontrolle des Vorhandenseins des hmd-Gens im Phagemid pBK-CMV

wurde eine PCR mit Primern für die konservierte Region des hmd-Gens

durchgeführt. Pro Reaktion (Reaktionsvolumen = 50 µl) wurden 50 pmol jedes

Primers, 1,35 U Taq-Polymerase, 2 mM MgCl2, 0,2 mM jedes dNTPs und 100 ng

Plasmid-DNA eingesetzt. Für diese Kontroll-PCR wurde die in 3.2.4 genannte

Elongationszeit auf 90 s reduziert. Die amplifizierte DNA wurde mittels

Agarosegelelektrophorese detektiert und entsprach der erwarteten Größe

(400 Basenpaare). Zur Lokalisation des hmd-Gens (etwa 1000 Basenpaare) in der

eingebauten DNA (etwa 8000 Basenpaare) wurden die flankierenden Sequenzen zu


beiden Seiten des hmd-Gens amplifiziert. Hierzu wurden Primerpaare verwendet,

von denen ein Primer mit einem Ende der konservierten Region des hmd-Gens, aus

dem Gen herauszeigend, hybridisierte und der andere mit der bekannten

Vektorsequenz vor oder hinter der eingebauten DNA. Das PCR-Programm entsprach

dem in 3.2.4 genannten Programm. Die amplifizierte DNA wurde durch

Agarosegelelektrophorese detektiert. Anhand der Größe der amplifizierten DNA

konnte die Position des hmd-Gens in der eingebauten DNA bestimmt werden. Es

wurden jeweils drei Klone für jedes der beiden hmd-Gene untersucht. Bei jeweils

einem Klon war die PCR der flankierenden Bereiche erfolgreich. Die Länge betrug

3000 und 4500 Basenpaare (fhmd) (Abb. 8) bzw. jeweils 4000 Basenpaare (ahmd).

Die Klone wurden sequenziert (Agowa, Berlin).

Abb. 8: PCR zur Amplifikation des fhmd-Gens und seiner flankierenden Regionen zur Lokalisation des fhmd-Gens. M: Markerspur, Spur 1: Amplifikation der eingebauten DNA

einschließlich des fhmd-Gens im Phagemid pBK-CMV (7500 Basenpaare). Spur 3: Amplifikation der in

Leserichtung vor dem fhmd-Gen liegenden Region (3000 Basenpaare). Spur 4: Amplifikation der in

Leserichtung hinter dem fhmd-Gen liegenden Region (4500 Basenpaare). Die beiden amplifizierten

Regionen sind in der Summe genauso groß wie die insgesamt eingebaute DNA.

3.3.6. Vergleich aller bekannten hmd-Gensequenzen

Die Sequenzierung und Klonierung der hmd-Gene aus M. fervidus und

M. arboriphilus erfolgte nicht aus praktischen Erwägungen, also wegen des

Vorhandenseins von Genbänken, sondern wegen der nahen Verwandtschaft der


beiden Organismen zu M. marburgensis. Natives mHmd-Holoenzym konnte seit

Jahren reproduzierbar kristallisiert werden. Jedoch verhinderten die perfekte

merohedrale Zwillingskristallbildung sowie eine hohe thermische Flexibilität die

Strukturlösung [60]. Es wurde postuliert, dass die Aminosäuresequenzen von aHmd

und fHmd ähnlich derjenigen von mHmd seien, sodass möglicherweise die

entsprechenden rekonstituierten Hmd-Holoenzyme sich ähnlich gut kristallisieren

ließen wie mHmd-Holoenzym, aber wegen der Unterschiede in der

Aminosäuresequenz nicht die gleichen kristallografischen Probleme auftreten würden

wie im Fall von mHmd.

Abb. 9 zeigt die Abgleichung der Hmd-Aminosäuresequenzen aus

M. marburgensis, M. jannaschii, M. kandleri, M. thermolithotrophicus, M. maripaludis,

M. voltae, M. fervidus und M. arboriphilus. Alle für die Bindung des Hmd-Kofaktors

wichtigen Aminosäuren (siehe Ergebnisteil) sind auch in den beiden neuen Hmd-

Sequenzen konserviert: Das GAG-Motif zur Bindung des Mononukleotides (rot

gefärbt), Cystein 176 (gelb), das den Schwefelliganden des Eisens stellt, Aspartat 64,

Prolin 65, Aspartat 135, Leucin 149 (Phenylalanin bei mHmd und aHmd) und

Prolin 150 (alle rot), die mit dem GMP des Guanylylpyridons interagieren, sowie

Tryptophan 148 (rot), das in π-Wechselwirkung mit dem Pyridon steht. Es finden sich

darüber hinaus zwei konservierte Histidine (His14 und His201) und ein konserviertes

Lysin (Lys151) (alles grün gefärbt), die als mögliche Basen bei der Reaktion von [Fe]-

Hydrogenase in Frage kommen könnten (siehe Ergebnisteil).

Bei den Vertretern der Methanococcales (M. jannaschii, M. maripaludis,

M. voltae und M. thermolithotrophicus) finden sich die konservierten Cysteine 66,118

und 322 (nicht eingefärbt). Die [Fe]-Hydrogenase-Apoenzyme der Methanococcales

sind sauerstoffempfindlich. Es ist denkbar, dass diese zusätzlichen Cysteine im Fall

der Methanococcales Disulfidbrücken ausbilden könnten, die zu einer Präzipitation

der Apoenzyme führen (siehe Diskussion).

Alle Zahlenangaben beziehen sich auf die hmd-Sequenz von M. jannaschii.


Abb. 9: Vergleich der Aminosäuresequenzen von [Fe]-Hydrogenase aus verschiedenen Organismen. Rot: Konservierte Aminosäuren, die an der Bindung des GMP-Teils von

Guanylylpyridon beteiligt sind; gelb: konserviertes Cystein 176, das den Liganden an das Eisen stellt

(siehe Ergebnisteil); grün: konservierte Histidin 14 und 201 sowie Lysin 151, die mögliche

Protonenakzeptoren bei der Reaktion darstellen (siehe Ergebnisteil); dunkelgrau: alle übrigen

konservierten Aminosäuren. Der Vergleich der Aminosäuresequenzen von aHmd und fHmd zeigt,

dass alle zuvor bekannten konservierten Aminosäuren auch in diesen Sequenzen zu finden sind.


Tabelle 5 listet die paarweisen Sequenzidentitäten der Aminosäuresequenzen

von [Fe]-Hydrogenase aus den oben genannten Organismen auf. Hierbei zeigt sich,

dass die Hmd-Sequenzen sich umso mehr ähneln je näher die Organismen

phylogenetisch miteinander verwandt sind. Beispielweise zeigt die

Aminosäuresequenz von Hmd aus M. kandleri nur wenig mehr als 50 %

Übereinstimmung zu allen anderen Hmd-Aminosäuresequenzen auf, da M. kanderli

der einzige Vertreter der Methanopyrales ist. Die Hmd-Sequenzen von

M. marburgensis, M. fervidus und M. arboriphilus sind dagegen zu mehr als 70 %

identisch. Alle gehören zu den Methanobacteriales. Ebenfalls hohe

Sequenzidentitäten von über 70 % ihrer Hmd-Gene zeigen die Vertreter der

Methanococcales: M. maripaludis, M. voltae, M. thermolithotrophicus und

M. jannaschii.

Tabelle 5: Paarweise Sequenzidentitäten der Aminosäuresequenzen von [Fe]-Hydrogenase aus mehreren Organismen (Prozent identische Aminosäuren)

3.3.7. Klonierung der hmd-Gene in Expressionsvektoren

Das hmd-Gen aus M. arboriphilus wurde von Transit (Marburg) in den

Expressionsvektor pET-24d(+) kloniert. Das hmd-Gen aus M. fervidus wurde in

dieser Arbeit in den Expressionsvektor pET-24b(+) kloniert. Hierzu wurde folgendes

Primerpaar (Thermoelectron, Ulm) verwendet:

Organismus M. arbori-

philus

M. fervidus M. jannaschii M. maripa

-ludis

M. voltae M. thermo

-litho.

M. kandleri M. marbur

-gensis

M. arboriphilus 100 73 61 58 63 61 53 78 M. fervidus 100 64 60 63 63 55 78 M. jannaschii 100 73 73 78 57 62 M. maripaludis 100 83 83 52 58 M. voltae 100 82 56 62 M. thermolitho. 100 55 60 M. kandleri 100 54 M. marburgensis 100


Primer in Kodierungsrichtung:

5’-GGATCCTTATTTCTTTTCTTTTTCTAAGTATTTAAATACAGTAGG-3’

Primer in Antikodierungsrichtung:

5’-CATATGGAAATAAAAAAAGTTGCAATATTAGGAGC-3’

Der Primer in Kodierungsrichtung enthielt eine BamHI-Schnittstelle und der

Primer in Antikodierungsrichtung eine NdeI-Schnittstelle (rot markiert). Die PCR-

Reaktion zur Amplifikation des fhmd-Gens (Reaktionsansatz = 50µl) enthielt 50 pmol

jedes Primers, 1,25 U Phusion-Polymerase (BioCat, Heidelberg), 0,2 mM jedes

dNTPs und einfach konzentrierten Phusionpuffer. Phusion-Polymerase erzeugt glatte

Enden und hat eine 3’-5’-Exonukleaseaktivität. Das PCR-Programm entsprach dem

in 3.2.4 beschriebenen Programm, wobei die Elongationszeit auf 120 s reduziert

wurde. Das PCR-Produkt wurde mittels Agarosegelelektrophorese detektiert und mit

dem QIAquick-Extraktionskit (Qiagen, Hilden) aus dem Gel extrahiert. Mittels des Kits

Zero Blunt PCR Cloning (Invitrogen, Groningen) wurde das PCR-Produkt in den

Vektor pCR Blunt kloniert. Hierzu wurde 1 µl der Vektor mit 1,5 µl PCR-Produkt

(entsprach 70 ng DNA), 4 U T4-DNA-Ligase und einfach konzentriertem

Ligationspuffer in einem Gesamtvolumen von 10 µl 1 h bei 18 °C inkubiert. Zu 50 µl,

auf Eis aufgetauten, E.-coli-TOP-10-Zellen (Invitrogen, Groningen) wurde 2 µl

Ligationsreaktion gegeben, durch kurzes Rühren mit der Pipettenspitze vermengt

und 30 min auf Eis inkubiert. Dann wurden die Zellen für 45 s bei 42 °C einem

Hitzeschock unterzogen und danach sofort 2 min auf Eis gekühlt. Es wurde 250 µl

TP-Medium zu den Zellen gegeben und die Zellsuspension wurde für 1 h bei 37 °C

inkubiert. Dann wurden je 10 µl und 100 µl der Zellsuspension auf LB-Platten mit

Kanamyzin plattiert und die Platten wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am

Folgetag wurde je 4 ml LB-Medium mit Kanamyzin mit Kolonien der Platten beimpft

(siehe 3.2.1). Mittels Plasmidpräparation (siehe 3.2.3) wurde der Vektor pCR Blunt

mit dem hmd-Gen isoliert. Dann wurden der Vektor pCR-Blunt mit hmd-Gen und der

Vektor pET-24b(+) mit den Restriktionsenzymen BamHI und NdeI geschnitten.

Hierzu wurden 4 U BamHI, 4 U NdeI, zweifach konzentrierter Tango-Puffer, 1 U

Antarktische Phosphatase, einfach konzentrierter Phophatasepuffer (Fermentas,

St. Leon) und 3 µg Plasmid-DNA in einem Gesamtvolumen von 50 µl für 3 h bei

37 °C inkubiert. Phosphatase und Phosphatasepuffer wurden nur im Fall von pET-


24b(+) eingesetzt. Mittels des QIAquick-Extraktionskits (Qiagen, Hilden) wurden der

geschnittene und dephosphorylierte Vektor pET-24b(+) und das hmd-Gen aus einem

Agarosegel extrahiert. Dann wurden 10 ng Vektor, 150 ng hmd-Gen, 4 U T4-DNA-

Ligase und einfach konzentrierter Ligationspuffer in einem Gesamtvolumen von 20 µl

über Nacht bei 18 °C inkubiert. Am Folgetag wurden der ligierte Vektor pET24b(+)-

fhmd durch Transformation, wie in 3.2.2 beschrieben, in elektrokompetente E.-coli-

Bl21-(DE3)-Zellen eingebracht.

3.3.8. Überexpression der fhmd- und ahmd-Gene

Es wurden 5 ml LB-Medium mit Kanamyzin und E. coli BL21 (DE3) mit

pET24b(+)-fhmd oder pET24d(+)-ahmd beimpft und über Nacht bei 37 °C inkubiert.

Am Folgetag wurden 100 ml TP-Medium mit Kanamyzin mit der Vorkultur beimpft

und bis zu einer ∆OD578 = 1 kultiviert. Durch Zugabe von IPTG

(Endkonzentration = 1 mM) wurde die Expression des hmd-Gens induziert. Zu den

Zeitpunkten 0 h, 1 h, 2 h und 3 h wurde jeweils 1 ml Kultur entnommen und mittels

der Tischzentrifuge bei Maximalgeschwindigkeit zentrifugiert. Die Zellpellets wurden

in jeweils so viel 50 mM Kaliumphophatpuffer, pH 7,0, aufgenommen, dass eine

OD578 = 4 erzielt wurde. Drei Stunden nach Induktion wurden die restlichen Zellen

der Kultur durch Zentrifugation für 20 min bei 12000 UpM sedimentiert, in anaerobem

Tris/HCl-Puffer, 50 mM, pH 7,8, 1 mM DTT resuspendiert und im Anaerobenzelt

mittels Ultraschall geöffnet. Der Zellextrakt wurde dann für 45 min bei 40000 UpM

zentrifugiert. Das Ultrazentrifugationspellet wurde im oben genannten Tris/HCl-Puffer

resuspendiert. Weder im Ultrazentrifugationsüberstand noch im resuspendierten

Ultrazentrifugationspellet noch im Zellextrakt konnte [Fe]-Hydrogenase-Aktivität

(siehe 3.4.4) nachgewiesen werden. Die verschiedenen Proben wurden mittels SDS-

Gelelektrophorese analysiert. Dabei zeigte sich eine deutliche Überproduktion von

fHmd und aHmd. Allerdings lag das [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym ausschließlich im

resuspendierten Ultrazentrifugationspellet und somit als unlösliche Einschlusskörper

vor. Auf Experimente zur Rückfaltung der Proteine aus den Einschlusskörpern wurde

verzichtet, da zur gleichen Zeit die Strukturaufklärung der rekonstituierten [Fe]-

Hydrogenase aus M. jannaschii gelang, womit die Rekonstitution von [Fe]-

Hydrogenase aus M. arboriphilus und M. fervidus im Rahmen dieser Arbeit keine

Bedeutung mehr hatte (siehe auch Error! Reference source not found.).


Abb. 10: Heterologe Produktion von aHmd-Apoenzym in E. coli. Spur M: Marker, Spur 1:

Zellextrakt vor Induktion, Spur 2: Zellextrakt 4 h nach Induktion; Spur 3:

Ultrazentrifugationsniederschlag; Spur 4: Ultrazentrifugationsüberstand.

3.4. Reinigung von [Fe]-Hydrogenase

3.4.1. SDS-Polyakrylamidgelelektrophorese

Zur denaturierenden Auftrennung von Proteingemischen wurde die

diskontinuierliche Polyakrylamidgelektrophorese nach Laemmli [62] verwendet. Dazu

wurden 12%ige SDS-Polyakrylamidgele benutzt. Die Elektrophorese wurde in der

Elektrophoreseapparatur Mini Protean II (Biorad, München) durchgeführt.

Tabelle 6: Zusammensetzung der SDS-Gele.

Lösung Trenngel Sammelgel

1 M Tris/HCl, pH 8,8, 1 % SDS 1850 µl -

1 M Tris/HCl, pH 6,8, 1 % SDS - 193,5 µl

Wasser 1000 µl 1200 µl

40 % Akrylamid / 1,1 % Bisakrylamid 1350 µl 255 µl

100 % TEMED 5 µl 5 µl

10 % APS 21 µl 6 µl

Die Proteinproben wurden vor der Elektrophorese mit SDS-Probenpuffer

(63 mM Tris/HCl, pH 6,8, 2 % (w/v) SDS, 10 % (w/v) Glyzerin, 16 mM Dithiothreitol,

0,01 % (w/v) Bromphenolblau) 1:2 verdünnt und für 5 min bei 95 °C denaturiert. Von


jeder Probe wurden 10 – 20 µl pro Geltasche aufgetragen und eine Spannung von

150 – 200 V angelegt bis der Marker das untere Ende des Gels erreichte. Als

Elektrolyt diente ein Tris/Glyzerin-Puffersystem (25 mM Tris/HCl, pH 8,8, 192 mM

Glyzin, 0,1 % (w/v) SDS). Als Molekularmassenstandard wurde der HMW-SDS

Marker (GE Healthcare, Freiburg) verwendet. Nach Beendigung der Elektrophorese

wurden die Gele für 2 h bei Raumtemperatur in 0,05 % (w/v) Coomassie Brillantblue

R250, 0,05 % (w/v) Crocein Scarlet 7B und 0,5 % (w/v) CuSO4, 25 % (v/v)

Isopropanol und 10 % Eisessig gefärbt. Das Entfärben erfolgte mit 0,5 % (w/v)

CuSO4, 12 % Isopropanol und 7 % Eisessig.

3.4.2. Reinigung von heterologem [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym

E.-coli-Stämme mit den in 3.1.3 genannten Plasmiden und den darin geklonten

hmd-Genen wurden in 1,5 l TP-Medium mit Kanamyzin aerob kultiviert. Bei

∆OD578 = 1 wurde durch Zugabe von IPTG die Expression des hmd-Gens induziert.

Nach 3,5 h wurden die Zellen geerntet durch Zentrifugation für 20 min bei 5000 UpM

sedimentiert und in Anaerobenzelte überführt. Dort wurden die Zellen in anaerober

0,9%iger NaCl-Lösung resuspendiert und nochmals wie oben beschrieben

sedimentiert. Dann wurden die Zellen in 50 ml 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,8, 1 mM

DTT resuspendiert und es wurden 0,8 ml DNase-I-Lösung (1 mg/ml) und 0,2 ml 2 M

MgCl2-Lösung zugegeben. Die Zellen wurden dann mittels Ultraschall im

Anaerobenzelt geöffnet. Der Zellextrakt wurde zur Abtrennung der

Membranbestandteile für 45 min bei 40000 UpM zentrifugiert. Auch die folgenden

Reinigungsschritte wurden unter anaeroben Bedingungen durchgeführt. Der

Ultrazentrifugationsüberstand wurde im Fall von [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym aus

M. jannaschii (jHmd-Apoenzym) im Wasserbad für 20 min bei 70 °C erhitzt. Im Fall

von Hmd aus M. kandleri (kHmd-Apoenzym) wurde der Zellextrakt zunächst mit

Ammoniumsulfat versetzt (Endkonzentration = 2 M) und dann für 30 min bei 80 °C

erhitzt. Präzipitiertes E.-coli-Protein wurde anschließend durch Zentrifugation für

20 min bei 12000 UpM sedimentiert. Im Falle von jHmd-Apoenzym wurde der

Überstand nach der Hitzefällung mit Ammoniumsulfat versetzt

(Endkonzentration = 2 M) und durch einen 0,45-µm-Filter filtriert. Die Proteinlösung

wurde bei beiden Apoenzymen auf die mit 50 mM MOPS/KOH, pH 7,0 und 2 M

Ammoniumsulfat, 1 mM DTT äquilibrierte Säule Hi Load Phenylsepharose (GE


Healthcare, Freiburg) aufgetragen. Die Säule wurde zunächst solange mit dem

Auftragspuffer gewaschen, bis keine erhöhte UV-Absorption durch Nukleinsäuren

mehr erkennbar war. Das adsobierte Protein wurde bei einer Flussrate von 5 ml/min

mit einem linear abnehmenden Salzgradienten (2 M NH4SO4 bis 0 M NH4SO4)

eluiert. Die Fraktionsgröße betrug 5 ml. jHmd-Apoenzym und kHmd-Apoenzym

eluierten zwischen 0,7 M und 0,2 M NH4SO4. Die Fraktionen wurden mittels SDS-

Polyakrylamidgelelektrophorese auf ihre Reinheit überprüft (Abb. 11). Die spezifische

Aktivität wurde durch Rekonstitution mit FeGP-Kofaktor gemessen (siehe 3.4.4).

Fraktionen, die den höchsten [Fe]-Hydrogenase-Apoenzymanteil zeigten, wurden

anschließend vereinigt und in einer Amicon-Ultrafiltrationskammer mit einer

Ausschlussgrenze von 10 kDa (Amicon, Witten) zu einer Endkonzentration von etwa

80 mg/ml konzentriert. Dabei wurde in 10 mM MOPS/KOH, pH 7,0, 1 mM DTT

umgepuffert. Gereinigtes [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym wurde aliquotiert und bis zur

Rekonstitution bei -80 °C aufbewahrt.

Abb. 11: SDS-PAGE zur Reinigung von heterologem [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym aus M. jannaschii. Spur M: Marker; Spur 1: Ultrazentrifugationsüberstand; Spur 2: Überstand nach

Hitzefällung; Spur 3: Vereinigte Fraktionen nach Phenylsepharose

3.4.3. Reinigung von nativem [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym aus M. jannaschii

Pro Reinigung wurden 40 g Zellen von M. jannaschii in etwa 150 ml anaerobem

50 mM Kaliumphophatpuffer, pH 7,0, 0,8 ml DNase-I-Lösung (1 mg/ml) und 0,2 ml

2 M MgCl2-Lösung resuspendiert und im Anaerobenzelt mittels Ultraschall geöffnet.

Zur Abtrennung von Membranbestandteilen und Zelltrümmern wurde für 45 min bei

40000 UpM zentrifugiert. Der Ultrazentrifugationsüberstand wurde mit


Ammoniumsulfat versetzt (Endkonzentration = 40 % Sättigung). Präzipitiertes Protein

wurde durch Zentrifugation für 20 min bei 12000 UpM abgetrennt. Der

Zentrifugationsüberstand wurde dann mit Ammoniumsulfat auf eine Endkonzentration

von 53 % Sättigung versetzt. Es folgte ein zweiter Zentrifugationsschritt wie oben

beschrieben. Der Zentrifugationsüberstand wurde dann auf die mit 50 mM Tris/HCl-

Puffer und 1 M Ammoniumsulfat äquilibrierte Säule Phenyl-Sepharose (GE

Healthcare, Freiburg) gegeben. Adsorbiertes Protein wurde mit einer Flussrate von

5 ml/min mit linear fallendem Salzgradienten (1 M bis 0 M Ammoniumsulfat) eluiert.

[Fe]-Hydrogenase-Holoenzym eluierte zwischen 0,8 M und 0,4 M Ammoniumsulfat.

Die Fraktionen (Fraktionsgröße 5 ml) wurden auf [Fe]-Hydrogenase-Aktivität getestet.

Die Fraktionen, die [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym enthielten, wurden vereinigt.

Mittels einer Amicon-Ultrafiltrationskammer mit einer Ausschlussgrenze von 10 kDa

(Amicon, Witten) wurde in 20 mM Mes/NaOH-Puffer, pH 6,0 umgepuffert. Die

Proteinlösung wurde dann auf die mit 20 mM Mes/NaOH-Puffer, pH 6,0, äquilibrierte

Säule Resource Q (GE Healthcare, Freiburg) aufgetragen. Adsorbiertes Protein

wurde mit einer Flussrate von 5 ml/min und linear steigendem Salzgradienten (0 M

NaCl bis 1 M NaCl) eluiert. [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym eluierte zwischen 0,4 M

und 0,6 M NaCl. Die Fraktionen, die [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym enthielten,

wurden vereinigt. Mittels einer Amicon-Ultrafiltrationskammer mit einer Ausschluss-

grenze von 10 kDa (Amicon, Witten) wurde in 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0,

umgepuffert. Die Proteinlösung wurde dann auf die mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer,

pH 7,0, äquilibrierte Säule Hydroxyapatit (GE Healthcare, Freiburg) aufgetragen.

Adsorbiertes Protein wurde mit einer Flussrate von 2 ml/min und linear steigender

Puffermolarität (10 mM bis 500 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0) eluiert. [Fe]-

Hydrogenase-Holoenzym eluierte zwischen 200 mM und 300 mM Kaliumphophat-

puffer.


Abb. 12: SDS-PAGE zur Reinigung von nativem [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym aus M. jannaschii. Spur M: Marker, Spur 1: Ultrazentrifugenüberstand, Spur 2: Überstand nach 40%iger

Ammoniumsulfatfällung, Spur 3: Überstand nach 53%iger Ammoniumsulfatfällung, Spur 4: Vereinigte

Fraktionen nach Phenylsepharose-Säule, Spur 5: Vereinigte Fraktionen nach Resource-Q-Säule,

Spur 6: Vereinigte Fraktionen nach Hydroxyapatit-Säule, Spur 7: Vereinigte Fraktionen nach

Superdex-200-Säule.

Tabelle 7: Reinigungstabelle zur Reinigung von nativem [Fe]-Hydrogenase–Holoenzym aus M. jannaschii.

Probe Aktivität [U]

Proteinkonzentration[mg/ml]

Spezifische Aktivität [U/mg]

Reinheit Ausbeute [%]

Ultrazentrifugen-Überstand

9850 18,3 8 1 100

Ammoniumsulfatfällung, 40 %, Überstand

6300 15,7 11 1,4 64

Ammoniumsulfatfällung, 53 %, Überstand

5400 10,5 12 1,5 55

Phenylsepharose 4900 3,1 46 6 50

Resource Q 3700 2,3 110 14 38

Hydroxyapatit 2500 1,9 158 20 25

Superdex 200 1950 14,9 190 24 19

Die Fraktionen, die [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym enthielten, wurden vereinigt,

auf etwa 1 ml konzentriert und auf die mit 50 mM MOPS/KOH, pH 7,0, 150 mM NaCl

äquilibrierte Säule Superdex 200 (GE Healthcare, Freiburg) aufgetragen. Protein

wurde mit einer Flussrate von 0,5 ml/min ohne Gradient mit dem

Äquilibrierungspuffer eluiert. Die Fraktionen, die [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym

enthielten, wurden vereinigt. Mittels einer Amicon-Ultrafiltrationskammer mit einer


Ausschlussgrenze von 10 kDa (Amicon, Witten) wurde die Proteinlösung in 10 mM

Kaliumphophatpuffer, pH 7,0 umgepuffert und schließlich auf etwa 0,5 ml konzen-

triert. Die Reinheit wurde durch SDS-Gelelektrophorese und Messung der spezifi-

schen Aktivität überprüft (Abb. 12).

3.4.4. Bestimmung der spezifischen [Fe]-Hydrogenase-Aktivität

Bestimmung der Proteinkonzentration Die Proteinbestimmung wurde mit dem Roti-Nanoquant-Mikroassay (Roth,

Karlsruhe) durchgeführt. Das Testprinzip beruht auf der Verschiebung des

Absorptionsmaximums von Coomassie Brillantblau G250 in saurer Lösung von

465 nm zu 595 nm durch die Bindung des Farbstoffs an Protein [63]. Die

Proteinproben (0 – 10 µg Protein/0,8 ml) und Rinderserumalbuminlösung als

Standard wurden mit 0,2 ml Farbstofflösung versetzt. Die Absorption bei 595 nm

wurde nach 15 – 30 min Inkubation bei Raumtermperatur mit dem Spektrometer

Ultrospec III (GE Healthcare, Freiburg) gemessen.

[Fe]-Hydrogenase-Aktivitätsmessung Zur Messung von Enzymaktivität wurden die verwendeten Quarzküvetten mit

einer Schichtdicke von 1 cm und einem Volumen von 1,5 ml mit Gummistopfen

verschlossen. Die Gasphase wurde durch mehrmaliges Ent- und Begasen mit

Stickstoffgas anaerobisiert. Die Zugabe von anaeroben Testkomponenten erfolgte

mit Hilfe von Mikroliterspritzen (Macherey-Nagel, Düren). Der Testansatz von 0,7 ml

enthielt 120 mM Kaliumphospatpuffer, pH 6,0, 1 mM EDTA und 20 µl Methylen-

H4MPT. Die Aktivität von nativem [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym wurde anhand der

Oxidation von Methylen-H4MPT zu Methenyl-H4MPT+ und molekularem Wasserstoff

bei 40 °C gemessen. Bei [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym wurde zusätzlich zu den

oben genannten Komponenten noch FeGP-Kofaktor in zehnfachem Überschuss zum

Apoenzym zu dem Testansatz gegeben. Die Reaktion wurde in beiden Fällen durch

Zugabe von Methylen-H4MPT gestartet. Die Bildung von Methenyl-H4MPT+ wurde

durch die Absorptionszunahme bei 336 nm (∆ε336 = 21,6 mM-1 x cm-1) fotometrisch

verfolgt [61]. Dabei entspricht 1 Unit der Umsetzung von 1 µmol Methylen-H4MPT zu

Methenyl-H4MPT+ pro Minute.


Zur Messung der Aktivität von heterologem [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym aus

M. kandleri wurde die Molarität des oben genannten Kaliumphophatpuffers im

Testansatz auf 1,5 M erhöht.

3.5. Reinigung von FeGP-Kofaktor

Alle Reinigungsschritte erfolgten, soweit nicht anders angegeben, anaerob bei

Rotlicht oder in braunen Glasflaschen und bei 4 °C.

3.5.1. Denaturierung von [Fe]-Hydrogenase und Kofaktorfreisetzung

Je Ansatz wurden 50 mg gereinigte [Fe]-Hydrogenase aus M. marburgensis in

einem Gesamtvolumen von 10 ml unter anaeroben Bedingungen und Rotlicht in

60 % (v/v) Methanol, 1 % Ammoniak und 1 mM Mercaptoethanol im Anaerobenzelt

bei 10 °C gemischt und über Nacht bei 4 °C anaerob außerhalb des Zeltes

denaturiert. Unter diesen Bedingungen wird der FeGP-Kofaktor von [Fe]-

Hydrogenase freigesetzt. Am Folgetag wurde die Lösung für 3 h bei 4 °C in einem

Filterröhrchen mit einer Ausschlussgröße von 10 kDa (Amicon, Witten) bei 5000 UpM

anaerob zentrifugierend filtriert. Die Lösung wurde dann bei 4 °C auf etwa 3 ml durch

Evaporation konzentriert und nochmals für 1 h wie oben beschrieben zentrifugierend

filtriert. Dann wurde die Lösung durch anaerobe Evaporation auf ein Restvolumen

von etwa 50 µl konzentriert und in 500 µl Ammoniumhydrogencarbonatpuffer, pH 9,0

und 10 mM Mercaptoethanol aufgenommen. Bis zur Rekonstitution wurde die FeGP-

Kofaktorlösung bei -80 °C aufbewahrt.

3.5.2. Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von FeGP-Kofaktor

UV/Vis-Spektroskopie zur Konzentrationsbestimmung UV/Vis-Spektren zur Konzentrationsbestimmung des FeGP-Kofaktors wurden

an dem Diodenarray-Fotometer Specord (Zeiss, Jena) bei Raumtemperatur

gemessen. Dazu wurde FeGP-Kofaktorlösung (mit Ammoniumhydrogenkarbonat-

puffer, pH 9,0 und 10 mM Mercaptoethanol verdünnt) in anaerobisierte Quarzküvet-


ten mit einer Schichtdicke von 0,3 cm überführt. Die UV/Vis-Spektren wurden in

einem Bereich von 200 – 650 nm aufgenommen. Anhand der Extinktionsdifferenz bei

300 nm, ε300 = 5,56 mM-1xcm -1, Schichtdicke und Verdünnungsfaktor wurde die

FeGP-Kofaktorkonzentration errechnet.

Bestimmung des Eisengehaltes des FeGP-Kofaktors Im Kofaktor gebundenes Eisen wurde duch Inkubation der FeGP-

Kofaktorlösung mit salzsaurer Kaliumpermanganatlösung freigesetzt, mit

Ascorbinsäure zu Fe2+ reduziert und anschließend als Ferrospektralkomplex

nachgewiesen. Im Test wurden 0,4 ml Probe oder Standardlösung (0,1 – 2,5 µg

Eisen) mit 0,2 ml Lösung A versetzt und für 2 h bei 60 °C inkubiert. Nach dem

Abkühlen auf Raumtemperatur wurde der Reaktionsansatz mit 40 µl Lösung B

versetzt und für weitere 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde

die Extinktion bei 562 nm bestimmt. Als Standard wurde eine 1%ige Fe-Lösung

verwendet [64].

Lösung A: 2,25%ige Kaliumpermanganatlösung in 0,6 M HCl

Lösung B: 6,5 mM Ferrospektral

13,1 mM Neocuproin

2 M Ascorbinsäure

5 M Ammoniumacetat

3.6. Rekonstitution von [Fe]-Hydrogenase

Alle Rekonstitutionsschritte erfolgten, soweit nicht anders angegeben, anaerob

bei Rotlicht oder in braunen Glasflaschen.

3.6.1. Rekonstitution ohne Inhibitor

Heterologes [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym von M. jannaschii und M. kandleri

bindet den FeGP-Kofaktor aus M. marburgensis, wodurch rekonstituiertes [Fe]-

Hydrogenase-Holoenzym entsteht, dessen Aktivität genauso hoch ist wie die Aktivität

von nativem [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym [48]. Die Bindungsaffinität ist sehr hoch,


da der extrapolierte, apparente Ks-Wert von [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym zu FeGP-

Kofaktor 10 nM [54] beträgt. In der vorliegenden Arbeit wurde [Fe]-Hydrogenase-

Apoenzym mit FeGP-Kofaktor im Verhältnis 1 : 3 ([Fe]-Hydrogenase-Monomer zu

FeGP-Kofaktor) im Anaerobenzelt bei 10 °C in 10 mM MOPS/KOH, pH 7,0, 1 mM

Dithiothreitol gemischt und mit einem Filterröhrchen mit einer Ausschlussgröße von

10 kDa (Amicon, Witten) auf ein Zehntel des Ausgangsvolumens konzentriert (2 ml

auf 200 µl). Dann wurde das Volumen des Konzentrates mit 10 mM MOPS/KOH,

pH 7,0, 1 mM Dithiothreitol wieder auf 2 ml erhöht und wieder konzentriert wie

beschrieben. Nach drei Durchgängen wurde das Volumen mit 10 mM MOPS/KOH,

pH 7,0, 1 mM Dithiothreitol soweit erhöht, dass die Konzentration des rekonstituierten

Holoenzyms 30 mg/ml betrug. Rekonstituiertes [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym wurde

aliquotiert und bei -80 °C aufbewahrt. Das mehrmalige Ankonzentrieren diente dem

Entfernen von möglicherweise vorhandenen niedermolekularen Kontaminationen aus

der ursprünglichen FeGP-Kofaktorpräparation. Nach jedem Durchgang wurde die

spezifische Aktivität des rekonstituierten Holoenzyms gemessen. Die Aktivität blieb

immer konstant und lag immer höher als die Aktivität des nativen [Fe]-Hydrogenase-

Holoenzyms. Somit konnte von einer vollständigen Rekonstitution des [Fe]-

Hydrogenase-Holoenzyms ohne Verlust von einmal gebundenem FeGP-Kofaktor bei

den Waschschritten ausgegangen werden. Bis zur weiteren Verwendung wurde die

[Fe]-Hydrogenase-Lösung bei -80 °C aufbewahrt.

3.6.2. Rekonstitution mit den Inhibitoren CN- oder Cu2+

Die Rekonstitution erfolgte wie in 3.6.1 beschrieben. Rekonstituiertes [Fe]-

Hydrogenase-Holoenzym in einer Endkonzentration von 30 mg/ml entspricht etwa

0,8 mM [Fe]-Hydrogenase-Monomer. Der extrapolierte, apparente Ki von [Fe]-

Hydrogenase-Holoenzym zu Cyanid beträgt 0,1 mM [51]. Daher wurde zum

rekonstituierten, 0,8-millimolaren [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym 100 mM KCN-

Lösung, pH 11,0, in einer Endkonzentration von 3 mM gegeben. Rekonstituiertes,

CN--inhibiertes [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym wurde aliquotiert und bei -80 °C

aufbewahrt. Der extrapolierte, apparente Ki von [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym zu

Cu2+ beträgt 1 µM (Seigo Shima, persönliche Mitteilung). Daher wurde zum

rekonstituierten 0,8-millimolaren [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym 100 mM CuSO4-

Lösung in einer Endkonzentration von 2,4 mM gegeben. Die so hergestellte Lösung


von [Fe]-Hydrogenase mit Inhibitor (Cu2+ oder CN-) wurde aliquotiert und bei -80 °C

aufbewahrt.

3.6.3. Rekonstitution mit Methenyl-H4MPT+ oder Imidazol

Die Rekonstitution erfolgte wie in 3.6.1 beschrieben. [Fe]-Hydrogenase-

Holoenzym in einer Endkonzentration von 30 mg/ml entspricht etwa 0,8 mM [Fe]-

Hydrogenase-Monomer. Der extrapolierte, apparente Km von [Fe]-Hydrogenase-

Holoenzym zu Methenyl-H4MPT+ beträgt 50 µM [11]. Daher wurde zum

rekonstituierten, 0,8-millimolaren [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym Methenyl-H4MPT+ in

einer Endkonzentration von 3 mM gegeben. Rekonstituiertes, mit Methenyl-H4MPT+

vesetztes [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym wurde aliquotiert und bei -80 °C aufbewahrt.

Der extrapolierte, apparente Ki von Imidazol beträgt etwa 50 – 100 mM (Sonja

Vogt, persönliche Mitteilung). Da Imidazol selbst Pufferkapazität besitzt wurde zur

Kristallisation von mit Imidazol inhibiertem Enzym, das in 3.6.1 beschriebene

rekonstituierte [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym unter den in 3.7.1 beschriebenen

Bedingungen kristallisiert, wobei statt 0,1 M Tris/HCl, pH 8,5 nun 0,05 – 0,2 M

Imidazol/HCl, pH 8,5 eingesetzt wurde.

3.7. Kristallografische Methoden

3.7.1. Proteinkristallisation

Alle Kristallisationsexperimente wurden als Dampfdiffusionsexperimente nach

der Methode des sitzenden Tropfens bei 10 °C im Anaerobenzelt durchgeführt (im

Fall von [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym unter Rot- statt Weißlicht). Zur Durchsicht

einer größeren Anzahl bekannter Kristallisationslösungen wurden die Kollektionen

Cristallization Basic & Extension Kit (Sigma-Aldrich, München), JBScreen Classic 1 –

10 (Jena Bioscience, Jena) und MPD Suite (Qiagen, Hilden) verwendet. Die

Reservoirlösungen wurden aerob in die Vertiefungen von 24-Loch-Platten gegeben

und in das Anaerobenzelt überführt. Hier wurden je 2 µl Proteinlösung mit je 2 µl

Reservoirlösung gemischt und in eine dafür vorgesehene kleine Vertiefung mit


Kontakt zur Reservoirlösung pipettiert. Die 24-Loch-Platten wurden mit

dazugehöriger Klarsichtklebefolie verschlossen und im Anaerobenzelt bei 10 °C

inkubiert. Zur Verfeinerung der Kristallisationsbedingungen wurden eigene, anaerobe

Lösungen benutzt. Im Fall von [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym aus M. jannaschii

erschienen nach etwa fünf Tagen, im Fall von [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym (mit und

die Inhibitoren CN- oder Imidazol) nach etwa zehn Tagen unter den unten

angeführten Bedingungen Kristalle (Abb. 13).

[Fe]-Hydrogenase-Apoenzym: 20 % (w/v) Polyethylenglykol 4000

0,1 M HEPES/NaOH, pH 7,5

5 % (v/v) Isopropanol

10 % Glyzerin

[Fe]-Hydrogenase-Holoenzym: 50 % (v/v) Methylpentandiol

0,1 M Tris/HCl, pH 8,5 (0,1 M Imidazol/HCl, pH 8,5

im Fall von imidazolinhibierten Kristallen)

50 mM Ammoniumdihydrogenphosphat

In beiden Fällen konnte auf die Herstellung eines kryoprotektiven Puffers

verzichtet werden, da diese Funktion bereits durch Glyzerin bez. Methylpentandiol

erfüllt wurde.

Abb. 13: Kristalle von [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym (a) und -Holoenzym (b). Im Fall von [Fe]-

Hydrogenase-Apoenzym ließen sich die besten Kristalle bei 20 % (w/v) Polyethylenglykol 4000, 0,1 M

HEPES/NaOH, pH 7,5, 5 % (v/v) Isopropanol und 10 % Glyzerin gewinnen, im Fall von [Fe]-

Hydrogenase-Holoenzym bei 50 % (v/v) Methylpentandiol, 0,1 M Tris/HCl, pH 8,5, 50 mM

Ammoniumdihydrogenphosphat. [Fe]-Hydrogenase-Apoenzymkristalle erschienen nach etwa 5 Tagen,

[Fe]-Hydrogenase-Holoenzymkristalle nach etwa 10 Tagen.


Zum Einfrieren wurden die Kristalle in eine auf einer Stahlnadel mit

Magnethalter fixierten Faserschlinge (Hampton Research, Aliso Viejo, USA) überführt

und in einen durch einen Kryostaten erzeugten tiefkalten Stickstoffstrahl gestellt. Die

Kristalle wurden für die weitere Verwendung in flüssigem Stickstoff gelagert.

3.7.2. Strukturbestimmung durch Molekularen Ersatz

Zur Durchsicht der Kristalle wurden Einzelbilder am Max-Planck-Institut für

Biophysik, Frankfurt am Main, mit Hilfe eines MSC-Rigaku-Ru-200-

Röntgengenerators, der mittels einer rotierenden Anode CuKα–Strahlung erzeugt,

und eines Mar345-Imageplatedetektors aufgenommen. Datensätze bis zu einer

Auflösung von 1,75 Å im Fall von [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym, [Fe]-Hydrogenase-

Holoenzym und CN--inhibiertem [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym wurden an der

Synchroton-Strahlenquelle PSII, SLS (Swiss Light Source), in Brugg (Schweiz)

aufgenommen. Nach einer ersten Aufnahme wurden auf der Basis von Mosaizität

und Beugungsgrenze der Kristalldetektorabstand und der Oszillationswinkel gewählt.

Um Daten in einem möglichst kleinen Oszillationsbereich zu sammeln und später zu

skalieren, wurden mit dem Programm STRATEGY die Mindestanzahl von

Einzelaufnahmen und der optimale Startwinkel berechnet [65]. Die

Datenprozessierung und Skalierung wurde mit den Programmen HKL [65] und XDS

[66] durchgeführt. Im Fall von [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym wurden Reflexionen bis

zu 1,75 Å Auflösung einbezogen, obwohl der Datensatz bei 1,9 Å Auflösung einen

Rsym-Wert unter 30 % und eine Durchschnittsintensität höher als 5 σ aufwies.

Die Phase für die Struktur von [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym aus M. jannaschii

wurde durch Molekularen Ersatz mit der vorläufigen Struktur von [Fe]-Hyrogenase-

Apoenzym aus M. kandleri [60] als Suchmodell (EPMR [67]). Für die Berechnung der

Phasen für die Strukturen von [Fe]-Hyrogenase Holoenzym und cyanidinhibiertem

[Fe]-Hydrogenase-Holoenzym wurde dann das Modell von [Fe]-Hydrogenase-

Apoenzym aus M. jannaschii als Suchmodell eingesetzt. Die Verfeinerung erfolgte

mit den Programmen O [68] und CNS [69]. Wassermoleküle wurden mit den Skripten

WATER-PRICK und WATER-DELETE in CNS eingefügt. Die weitere Verfeinerung

erfolgte mit dem TLS-Modell in REFMAC [70]. Letzte Modellfehler wurden mit den

Programmen CNS und PROCHECK [71] behoben


Die Datenprozessierung und die Strukturaufklärung wurden von Herrn Dr. Ulrich

Ermler und Herrn Dr. Eberhard Warkentin im Max-Planck-Institut für Biophysik,

Frankfurt am Main, durchgeführt.

Ergebnisse/Publikationen 45

4. Ergebnisse / Publikationen

Wie am Ende der Einleitung beschrieben (2.3.8) wurde [Fe]-Hydrogenase aus

folgenden Organismen für die Kristallisationsversuche in Betracht gezogen:

Methanothermobacter marburgensis (Wachstumstemperaturoptimum 65 °C),

Methanothermus fervidus (83 °C), Methanobrevibacter arboriphilus (37 °C) (alle

Methanobacteriales), Methanocaldococcus jannaschii (85 °C), Methanothermo-

coccus thermolithotrophicus (65 °C), Methanococcus voltae (37 °C) (alles

Methanococcales) und Methanopyrus kandleri (98 °C) (Methanopyrales).

Ziel war es, die Apoenzyme dieser Organismen heterolog in E. coli zu

produzieren, zu reinigen und anschließend direkt oder nach Rekonstitution zu

Holoenzym mit FeGP-Kofaktor des Enzyms aus M. marburgensis zu kristallisieren.

Dieser Weg wurde gegangen, da die Reinigung von [Fe]-Hydrogenase aus den

angesprochenen methanogenen Archaea außer aus M. marburgensis nur

unvollständig und in nicht-ausreichenden Mengen gelang. Außerdem wachsen die

hyperthermophilen Methanbildner nur zu niedrigen Zelldichten heran, was eine

Reinigung von nativer [Fe]-Hydrogenase aus diesen Organismen schwierig macht.

Das hmd-Gen aus den unterschiedlichen methanogenen Archaea ließ sich mit

Ausnahme des Gens aus M. marburgensis ohne Probleme in E. coli exprimieren.

Nach Anpassung des Codon-Gebrauchs gelang auch die Expression des hmd-Gens

aus M. marburgensis (Sonja Vogt, persönl. Mitteilung). Aber nur bei Expression des

hmd-Gens aus M. kandleri, M. jannaschii und M. thermolithotrophicus war das

gebildete Apoenzym löslich. In allen anderen Fällen kam es zur Ausbildung von

unlöslichen Einschlusskörpern.

Erste gute Kristalle von [Fe]-Hydrogenase-Apoenzyms gelangen im Fall von

M. jannaschii, weshalb die Kristallisation von [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym aus

diesem Organismus intensiv weiterverfolgt wurde. Die Kristallstruktur des [Fe]-

Hydrogenase-Apoenzyms bei 1,75 Å zeigte die Lage und die beteiligten

Aminosäurereste des aktiven Zentrums (siehe 4.1.). Durch einen Vergleich der

Struktur mit bekannten Nukleotidbindemotiven wurde eine mögliche FeGP-Kofaktor-

Bindestelle identifiziert. Durch Vergleich der Aminosäuresequenzen aller bekannten

[Fe]-Hydrogenasen wurden konservierte Aminosäurereste ermittelt, die

wahrscheinlich an der Bindung des FeGP-Kofaktors beteiligt sind.


Nach Erhalt der Kristallstruktur des Apoenzyms von [Fe]-Hydrogenase aus

M. jannaschii konzentrierte sich die Arbeit auf die Kristallisation des rekonstituierten

Holoenzyms, wobei parallel die Holoenzyme aus M. jannaschii, M. kandleri und

M. thermolithotrophicus untersucht wurden. Mit den verwendeten Kristallisations-

screens wurden erst gegen Ende der Doktorarbeit Holoenzymkristalle erhalten und

zwar von dem Enzym aus M. jannaschii. Die Struktur konnte mit dem Modell des

Apoenzyms durch Molekularen Ersatz gelöst werden. Die Auflösung von 1,75 Å

ermöglichte es, die Struktur des FeGP-Kofaktors in allen Einzelheiten zu sehen

(siehe 4.2.).


4.1. The Crystal Structure of the Apoenzyme of the Iron-Sulfur-Cluster-Free Hydrogenase













4.2. The Active Site of [Fe]-Hydrogenase (Iron-Sulfur-Cluster-Free Hydrogenase) at 1.75 Å Resolution
















Diskussion 75

5. Diskussion

Durch die Strukturaufklärung von [Fe]-Hydrogenase Hmd ist es gelungen, einen

Einblick in das aktive Zentrum dieses Enzyms zu gelangen (siehe Ergebnisteil). [Fe]-

Hydrogenase ist ein mononukleares Eisenenzym. Die durch NMR und

Massenspektroskopie bestimmte Struktur von Guanylylpyridon [50] passt genau in

die Elektronendichte und auch die Anzahl und die Art der Liganden des Eisens

stimmen mit den spektroskopischen Untersuchungen überein [51-53]. Das Eisen ist

in der Struktur von [Fe]-Hydrogenase pentakoordiniert, wobei eine Ligandenstelle

vermutlich durch niedrig besetztes CO eingenommen wird (siehe Diskussion des

Publikationsentwurfes). Die Ligandenzahl von fünf und die quadratisch-pyramidale

Koordination von Eisen sprechen für Fe(0) im aktiven Zentrum [72]. Eisen würde

dann als Lewisbase in der Reaktion fungieren. Das Vorhandensein einer Base im

aktiven Zentrum wurde schon vor der Entdeckung von Eisen in [Fe]-Hydrogenase

vorgeschlagen [47]. Fe(0)-Komplexe mit CO-Liganden sind bekannt [73], allerdings

keine mit zusätzlichen Schwefelliganden. Eisen im Oxidationszustand Fe(II) in [Fe]-

Hydrogenase kann nicht ausgeschlossen werden, da Fe(II)-Komplexe mit CO und S-

Liganden existieren [74]. Im Folgenden werden einige Punkte des Diskussionsteils

des Publikationsentwurfes aufgegriffen und zusätzliche Aspekte angesprochen.

Sauerstoffempfindlichkeit von [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym

[Fe]-Hydrogenase-Apoenzym aus Methanocaldococcus jannaschiii konnte bis

auf Kristalle eines Proteolysefragmentes nie aerob kristallisiert werden [60]. Erst mit

der Möglichkeit [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym zu rekonstituieren und Enzymaktivität

zu messen, wurde die Sauerstoffempfindlichkeit des [Fe]-Hydrogenase-Apoenzyms

aus M. jannaschii erkannt [54]. Unter aeroben Bedingungen erwies sich das

Apoenzym aus M. jannaschii nur unter Zugabe von DTT stabil. Ohne Zugabe eines

Reduktionsmittels präzipitiert das Apoenzym in kurzer Zeit und ist inaktiv. [Fe]-

Hydrogenasen der Methanococcales haben zusätzlich zu den drei konservierten

Cysteinen 10, 176 und 250 noch zwei weitere, nur innerhalb ihrer Ordnung

konservierte Cysteine (66 und 118) (Abb. 9, 3.3.6). In der Struktur von [Fe]-

Hydrogenase aus M. jannaschii liegen Cys66 und Cys118 3,7 Å auseinander. Es ist

Diskussion 76

vorstellbar, dass beide Cysteine eine Disulfidbrücke unter aeroben Bedingungen

ausbilden, was zu einer Konformationsänderung und Präzipitation des Enzyms führt

(Abb. 14). Nachdem die Sauerstoffempfindlichkeit erkannt worden war, wurde [Fe]-

Hydrogenase-Apoenzym unter anaeroben Bedingungen in Gegenwart von 1 mM

DTT gereinigt und kristallisiert, was letztlich zur Strukturaufklärung führte.

Abb. 14: Konservierte Cysteine in der Struktur von [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym aus Methanocaldococcus jannaschii. Die beiden nur innerhalb der Methanococcales konservierten

Cysteine 66 und 118 liegen 3,7 Å voneinander entfernt. Unter aeroben Bedingungen könnten beide

Cysteine eine Disulfidbrücke ausbilden, was die Sauerstoffempfindlichkeit des Apoenzyms erklären

würde.

Mononukleotidbindemotif in [Fe]-Hydrogenase

NAD(P)+-bindende Enzyme wie beispielsweise F420H2:NADP+-Oxidoreduktase

(Fno) besitzen ein spezielles Bindemotif, die sogenannte Rossmannbindetasche, die

aus einem parallelen, sechssträngigen ß-Faltblatt mit α–helikalen Insertionen besteht

(siehe Publikation). Als Sequenzmotif findet sich G(X)XGXXG, wobei das zweite

Glycin Wasserstoffbrücken mit dem Phosphat des Adenosins und das dritte Glycin

Wasserstoffbrücken mit dem Phosphat des Nikotinamids ausbildet. Die

Strukturähnlichkeit von NAD+-bindenden Enzymen ermöglichte die Überlagerung

aller bekannten Strukturen und Aussagen über konservierte Aminosäurereste [75,

76]. Neben dem genannten glycinreichen Motif finden sich immer hydrophobe

Aminosäurereste zu beiden Seiten des Adenins, die das Ringsystem stabilisieren,

Diskussion 77

und ein konserviertes Aspartat, das Wasserstoffbrückenbindungen zu den beiden

Hydroxylgruppen der Ribose ausbildet.

In [Fe]-Hydrogenase ist dieses Aspartat ebenfalls konserviert (Asp64) und zu

beiden Seiten des Guanosins sitzen konservierte Aminosäurereste (siehe

Publikation). Statt des Sequenzmotifs G(X)XGXXG findet sich in [Fe]-Hydrogenase

lediglich GXG, wobei das zweite Glycin Wasserstoffbrückenbindungen mit dem

Phosphat des FeGP-Kofaktors eingeht. Da kein zweites Phosphat vorhanden ist, ist

auch kein drittes Glycin konserviert. Somit handelt es sich in [Fe]-Hydrogenase nicht

um ein Dinukleotid-, sondern ein Mononukleotidbindungsmotif.

[Fe]-Hydrogenase zeigt keine signifikante Sequenzähnlichkeit zu anderen

Enzymen, aber eine hohe strukturelle Ähnlichkeit zu NAD+-bindenden

Oxidoreduktasen wie Hydroxyacyl-Dehydrogenase (siehe Publikation). Auf Basis der

Aminosäuresequenz der N-terminalen Domäne hat [Fe]-Hydrogenase jedoch

weniger als 20 % Ähnlichkeit zu anderen Enzymen. Daher kann nicht von einer

divergenten Entwicklung ausgegangen werden.

Die Struktur von Pyridon im aktiven Zentrum von [Fe]-Hydrogenase

Für Pyridon existieren zwei tautomere Formen (2-Pyridon und 2-Pyridinol,

Abb. 15A). Die Ausbildung einer der beiden tautomeren Formen von Pyridon hängt

von verschiedenen Faktoren ab. Ein polares Lösungsmittel wie Wasser begünstigt 2-

Pyridon. Für monosubstituierte 2-Pyridone ist der Substituent in der Position 6

entscheidend für die Ausbildung einer der beiden tautomeren Formen [77].

Elektronegative Substituenten wie F, Cl oder -OCH3 erniedrigen die Basizität des

Pyridonstickstoffes, sodass 2-Pyridinol begünstigt wird. Im Fall von FeGP-Kofaktor

sitzt jedoch Methylencarboxylat in Position 6, das elektronenschiebend ist. Allerdings

ist das 2-Pyridon des FeGP-Kofaktors nicht mono- sondern tetrasubstituiert

(Methylgruppen in Position 3 und 5 und Phosphat in Position 4), was die Vorhersage

für die Ausbildung einer tautomeren Form erschwert. Eisen liegt in der Struktur

genau auf der Höhe des Pyridons. Daher sollte der Stickstoff sp2-hybridisiert sein wie

im 2-Pyridinol. Wäre er sp3-hybridisiert wie im 2-Pyridon, so läge er außerhalb der

Ringebene. Der Pyridonteil von Guanylylpyridon liegt daher in der Kristallstruktur der

[Fe]-Hydrogenase wahrscheinlich als 2-Pyridinol vor (Abb. 15B).

Diskussion 78

Abb. 15: Strukturen des Tautomeriepaares 2-Pyridon und 2-Pyridinol (A) und Lage von Eisen und Guanylylpyridon in [Fe]-Hydrogenase (B). A: In 2-Pyridon ist der Stickstoff sp3-hybridisiert und

in 2-Pyridinol sp2-hybridisiert. B: In [Fe]-Hydrogenase ist der Pyridonstickstoff vermutlich sp2-

hybridisiert, da Eisen und Pyridon in derselben Ebene liegen.

Pyridone komplexieren Metalle der Übergangsgruppe mit dem Stickstoff der

Ringebene und der Ketogruppe in Position 2. Man unterscheidet je nach Anzahl der

komplexierten Metallatome mono-, di- und trinukleare Pyridonkomplexe. Im Fall von

[Fe]-Hydrogenase liegt ein mononuklearer Komplex vor. In mononuklearen

Komplexen wird das Metall entweder nur durch den Pyridonstickstoff oder nur durch

den Sauerstoff oder durch beide ligiert (Abb. 16).

Abb. 16: Strukturen von mononuklearen Metall-Pyridonkomplexen (M = Metall). Die

Komplexierungsart (mono-, di oder trinuklear) richtet sich nach der Anzahl der beteiligten Metallatome.

Hier sind nur mononukleare Metallpyridonkomplexe gezeigt. An der Komplexierung sind der

Pyridonstickstoff und der Sauerstoff beteiligt oder nur jeweils eines der beiden Atome [77].

Nur wenige mononukleare Eisenpyridonkomplexe sind beschrieben [78-80].

Dabei handelt es sich um mononukleare Eisenkomplexe, bei denen das Eisen durch

die Sauerstoffatome der Hydroxylgruppen von sechs 2-Pyridonen komplexiert wird

(Abb. 17A). Die Stickstoffatome der Ringebenen sind im Gegensatz zu [Fe]-

Diskussion 79

Hydrogenase nicht an der Komplexierung beteiligt. Dies ist allerdings für einen

mononuklearen Pd(II)-Komplex beschrieben worden, bei dem zwei Pyridonliganden

nur mittels ihrer Stickstoffatome PdCl2 komplexieren [81] (Abb. 17B). Am häufigsten

finden sich Pyridonliganden jedoch bei dinuklearen Metallkomplexen. Dabei ligiert

der Pyridonstickstoff eines der beiden Metallatome und die 2-Hydroxylgruppe das

andere. Abb 17C zeigt dies am Beispiel eines Di-Rheniumkomplexes [82]. In [Fe]-

Hydrogenase interagiert die 2-Hydroxylgruppe (die wegen der sp2-Hybridisierung des

Stickstoffs nicht als 2-Ketogruppe vorliegt) mit dem CO-Liganden und nicht mit einem

zweiten Metallatom (Abb 17D). Der Abstand zeischen dem Sauerstoff der 2-

Hydroxylgruppe und dem Sauerstoff des CO beträgt 2,7 Å, was der Distanz einer

Wasserstoffbrückenbindung entspricht. Durch diese Wasserstoffbrücke wird das CO

vom Pyridon weggeschoben, weswegen die quadratisch-pyramidale Koordination

des Eisens nicht perfekt ist (siehe Ergebnisteil). Durch diese Bindung wird die

Eisenkomplexierung durch das Guanylylpyridon stabilisiert.

Abb. 17: Struktur des mononuklearen Eisen-Pyridonkomplexes Fe(pyOH)6(NO3)3 (A), des mononuklearen Palladium-Pyridonkomplexes trans-[PdCl2(HL)2] (B), des dinuklearen Rheniumkomplexes [Re(chp)3Cl3] (C) und Aufsicht auf das aktive Zentrum von [Fe]-Hydrogenase (D). D: Der Pyridonstickstoff ligiert das Eisen, während die Hydroxylgruppe mit dem CO

interagiert, das dadurch in Richtung des Wassermoleküls geschoben wird. Dies hat Ähnlichkeit mit

den dinuklearen Metall-Pyridonkomplexen (C), wobei in [Fe]-Hydrogenase die Hydroxylgruppe mit

einem CO anstatt eines zweiten Metalls wechselwirkt.

Diskussion 80

Die IR-Banden der CO-Moleküle des freien FeGP-Kofaktors sind breiter als die

IR-Banden des rekonstituierten Enzyms, die wiederum breiter sind, als es von den

[FeFe]- und [NiFe]-Hydrogenasen bekannt ist [51] Dies kann daran liegen, dass die

dinuklearen Zentren der [FeFe]- und [NiFe]-Hydrogenasen im Inneren der Enzyme

liegen, wo die CO-Moleküle durch vielseitige hydrophobe Wechselwirkungen

stabilisiert sind. In [Fe]-Hydrogenase liegen die CO-Moleküle ebenfalls in einer

hydrophoben Tasche, sind aber vom Protein nicht eingeschlossen. Im freien FeGP-

Kofaktor hingegen sind sie von Wassermolekülen umgeben und beweglicher.

Eine weitere Besonderheit des Pyridons in der Kristallstruktur von [Fe]-

Hydrogenase ist das Fehlen der Carboxymethylgruppe. Die Elektronendichte an

dieser Stelle ist von den Dichten der beiden Methylgruppen des Pyridons nicht zu

unterscheiden (Abb. 17D). Ist die Carboxymethylgruppe tatsächlich vorhanden, so

muss sie eine hohe Flexibilität aufweisen und rotiert möglicherweise frei. Die

Ausbildung zweier alternativer Konformationen und zwar einmal vom Eisen entfernt

nach hinten zeigend, wie im Modell zu sehen, und zum anderen in der Form eines

Eisenliganden, würde auch die unbekannte Elektronendichte am Eisen erklären. In

einem solchen Fall müsste aber auch Elektronendichte zwischen der

Methylengruppe und der Carboxylatgruppe vorhanden sein. Diese fehlt aber.

Außerdem hat die Carboxymethylgruppe keine Wasserstoffbrücke zu Thr13

ausgebildet, obwohl die Hydroxylgruppe von Thr13 nur 2,4 Å vom Carboxylat entfernt

liegt. Daher ist es möglich, dass die Carboxylatgruppe in der Kristallstruktur gar nicht

vorhanden ist. Decarboxylierungen von Aminosäureresten durch die bei der

Röntgenstrukturanalyse eingesetzte Strahlung sind beschrieben worden [83].

NMR- und Massen-spektroskopische Experimente zur Ermittlung der Struktur

von Guanylylpyridon zeigten das Vorhandensein der Carboxymethylgruppe. Im

Verlauf der massenspektroskopischen Experimente trat meist auch der Verlust des

Carboxylats auf, allerdings immer zusammen mit dem Verlust des Eisencarbonyls

des FeGP-Kofaktors. Bei der Massenspektroskopie von Eisen-freiem Kofaktor, also

von Guanylylpyridon, hingegen war das Carboxylat meistens nachweisbar [50].

Daher wäre es möglich dass die Carboxymethylgruppe das Eisen in freiem FeGP-

Kofaktor komplexiert, in diesem Fall aber die C-C-Bindung zwischen Methylen und

Carboxylat schwach ist.

Diskussion 81

Wassermoleküle im aktiven Zentrum von [Fe]-Hydrogenase

In der Kristallstruktur von [Fe]-Hydrogenase wurde ein konserviertes

Wassermolekül 2,8 Å vom Eisen entfernt und auf Höhe des Pyridons liegend

entdeckt. Der Abstand ist zu groß für einen Liganden, aber ausreichend um eine

Wasserstoffbrückenbindung zum Eisen einzugehen. Die unbekannte Ligandendichte

gegenüber von CO in der Ebene des Pyridons ist möglicherweise auch Wasser oder

stammt von einem partiell besetzten CO (siehe Ergebnisteil). Die XAS-Messungen

lieferten keinen Hinweis auf ein drittes CO-Molekül, sondern sprechen auch eher für

ein Wasser oder ein Hydroxid als fünften Liganden (Wolfram Meyer-Klauke,

unveröffentlicht).

Konservierte Wassermoleküle und Cysteinreste stellen in den [FeFe]-

Hyrogenasen von Clostridium pasteurianum und Desulfovibrio desulfuricans einen

Protonentransportweg dar [13, 84]. [FeFe]-Hydrogenase aus C. pasteurianum trägt

einen putativen Wasserliganden am distalen Eisen (2,5 Å zwischen Sauerstoff und

Eisen) [13, 15], der bei CO-Inhibition durch CO verdrängt wird [85, 86] und am Ende

eines Gaskanales liegt, der von der Enzymoberfläche bis zum aktiven Zentrum reicht

[13]. Im Fall von [Fe]-Hydrogenase liegt im Abstand von 3 Å zum Wasser gegenüber

dem Pyridonstickstoff ein zweites konserviertes Wasser, das wiederum 3 Å vom

Peptidsauerstoff von Cys250 entfernt ist. Dies könnte eine Protonentransportkette

darstellen. Möglich ist aber auch, dass es lediglich mit dem elektronenreichen Eisen

über Wasserstoffbrückenbindungen interagiert. Sollte es gelingen Kokristalle mit

Methenyl-H4MPT+ zu erhalten, wäre es interessant zu sehen, ob das konservierte

Wassermolekül verdrängt wurde oder immer noch in der Struktur vorhanden ist.

Katalysemechanismus von [Fe]-Hydrogenase

Durch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit ist es erstmal möglich, einen

Katalysemechanismus von [Fe]-Hydrogenase auf Grundlage der Kristallstruktur des

Holoenzyms vorzuschlagen. Dieser unterscheidet sich schon wegen der Tatsache,

dass [Fe]-Hydrogenase nur die heterolytische Spaltung von H2 in ein Hydrid und ein

Proton katalysiert, grundlegend vom Ping-Pong-Reaktionsmechanismus der [NiFe]-

und [FeFe]-Hydrogenasen [19]. Diese beiden Hydrogenasetypen spalten H2

vollständig in Protonen und Elektronen und benötigen für diese Spaltung auch

Diskussion 82

lediglich ihr binukleares Metallzentrum. Für die H2-Spaltung benötigt [Fe]-

Hydrogenase neben dem aktiven Zentrum noch die Bindung des Substrates

Methenyl-H4MPT+. Aufgrund dieser Tatsachen wurde schon früh ein ternärer

Komplexmechanismus für [Fe]-Hydrogenase vorgeschlagen [40, 41, 47].

Die Ligandenzahl von fünf und die quadratisch-pyramidale Koordinierung von

Eisen in [Fe]-Hydrogenase, sowie die Tatsache, dass ein Wassermolekül mit dem

Eisen interagiert, sind Argumente für Fe(0) im aktiven Zentrum, auch wenn Fe(0)

unter aeroben Bedingungen in wässriger Lösung normalerweise nicht stabil ist. Bei

Fe(0) im aktiven Zentrum von [Fe]-Hydrogenase würde nach der heterolytischen

Spaltung das Proton an die Lewis-Base Fe(0) binden (Abb. 18), was einem

mononuklearen Fe(II)-Hydrid entsprechen würde. Mononukleare Fe(II)-Hydrid-

Komplexe sind beschrieben worden [87, 88].

Mössbauer-Untersuchungen an [Fe]-Hydrogenase zeigten, dass das Eisen

entweder als Fe(0) oder Fe(II) vorliegt [52]. Molekularer Wasserstoff ist eine sehr

schwache Säure (pK = 35). Bei Bindung an elektronenarme Kationen wie Fe(II) wird

H2 polarisiert und der pK-Wert erniedrigt. Der pK-Wert kann dabei bis auf -6 sinken.

In solchen Fällen bindet H2 seitlich an das Kation und das H-H-σ-Orbital gibt

Elektronendichte auf das freie d-Orbital des Kations ab [2, 89]. CO-Liganden sind

starke π-Elektronenakzeptoren und ziehen Elektronendichte vom Eisen ab. Damit

fördern sie zusätzlich den elektrophilen Charakter des Eisens. Für die Erhöhung der

Azidität von H2 kann CO in trans oder cis zu H2 stehen [90]. Bei den meisten

Modellverbindungen bindet das Hydrid nach der heterolytischen Spaltung an Fe(II)

und das entstehende Proton wird auf eine Base übertragen.

In [Fe]-Hydrogenase bindet nach heterolytischer Spaltung von H2 nicht das

Hydrid an das Eisen, sondern das Proton, da das Hydrid auf das Carbokation

Methenyl-H4MPT+ übertragen wird (Abb. 18). Im Fall von Fe(II) würde das Eisen bei

der Protonierung formal zu einem Fe(IV)-Hydrid oxidiert. Mononukleare Fe(IV)-

Hydrid-Komplexe sind bekannt [74]. Die Bindung von einem Proton an ein Fe(II), also

die Protonierung eines 16-Elektronen-Zentrums ist jedoch selten, da es die

Verbindung zweier Lewissäuren (Fe(II) und H+) bedeutet [90]. Ein Beispiel hierfür ist

die Protonierung des 16-Elektronen-Zentrums in W(CO)3(PR3)2 durch starke Säuren

[91]. Daher erscheint es unwahrscheinlich, dass das Eisen in [Fe]-Hydrogenase als

Fe(II) vorliegt und dabei als Base fungiert. In [FeFe]-Hydrogenasen würde bei der

Rückreaktion, der Bildung von Wasserstoffgas aus Protonen und Elektronen, ein

Diskussion 83

Proton an das Fe(II) binden müssen. Hier könnten allerdings die Elektronen der

Metall-Metall-Bindung ein Proton akzeptieren [92].

Abb. 18: Reaktionsmechanismus von [Fe]-Hydrogenase aufgrund der Kristallstruktur. [Fe]-

Hydrogenase katalysiert den stereoselektiven Hydridtransfer von H2 auf das C14a-Carbokation von

Methenyl-H4MPT+, das dabei zu Methylen-H4MPT reduziert wird. Das Substrat Methenyl-H4MPT+

bindet wahrscheinlich in der Lücke zwischen der C- und N-terminalen Domäne des [Fe]-Hydrogenase-

Dimers (siehe Ergebnisteil). Das C14a von Methenyl-H4MPT+ läge in diesem Modell etwa 6 Å vom

Eisen entfernt, wobei die unbekannte Ligandendichte oder Cyanidligandendichte (nichtinhibierte bzw.

cyanidinhibierte [Fe]-Hydrogenase) genau zwischen Eisen und C14a läge, was einen weiteren Hinweis

darstellt, dass dies auch die H2-Bindestelle ist. In diesem Modell fungiert das Eisen als Lewisbase und

ist im Oxidationszustand 0. Das Carbokation agiert als Lewissäure. H2 bindet zwischen beiden

Reaktionspartnern und wird heterolytisch gespalten [2, 89]. Falls Fe(II) vorliegt, sollte das Proton an

eine Base im aktiven Zentrum übertragen. Mutationsanalysen lassen darauf schließen, dass es sich

um His14 handeln könnte.

Im Fall von Fe(0) bindet das bei der H2-Spaltung entstehende Proton an Eisen,

im Fall von Fe(II) nicht an das Eisen sondern an eine Base im aktiven Zentrum. Fe(II)

dient dann lediglich der Polarisierung des Wasserstoffs. Mehrere konservierte

Aminosäuren wurden gegen Alanin ausgetauscht. Die Mutanten zeigten noch

signifikante Restaktivität (siehe Publikationsentwurf), mit Ausnahme der Mutante

His14Ala, deren sehr geringe Restaktivität (0,3 % der Wildtyp-Aktivität) ein Hinweis

ist, dass diese Aminosäure als Base im aktiven Zentrum fungieren könnte. Ihr

Abstand zum Eisen beträgt 6 Å. Neben der Funktion als Base könnte His14 auch zur

Stabilisierung des Pterinringes des Substrates dienen, wie es bei einem Histidin im

aktiven Zentrum von Formaldehyd-aktivierendem Enzym (Fae) der Fall ist [93].

Diskussion 84

Die Gene in den flankierenden Regionen von hmd

Abb. 19: hmd-Gene und Gene der flankierenden Regionen aus verschiedenen Organismen. Blau: hmd; rot: bioB?, Gen mit 25 – 30 % Identität zum Gen der Biotinsynthase aus E. coli; gelb:

unbekanntes, konserviertes Gen; braun: Gen für die δ-Untereinheit der methylviologenreduzierenden

Hydrogenase; andere Farben: Gene, die sich in den flankierenden Regionen in mindestens zwei der

genannten Organismen finden; dunkelgrau: Gene, die sich außer in einer flankierenden Region eines

der genannten Organismen noch im Genom von mindestens einem der anderen Organismen finden;

hellgrau: Gene, die sich nur im jeweils dargestellten Organismus finden.

Abb. 19 vergleicht die offenen Leserahmen in den flankierenden Regionen um

die [Fe]-Hydrogenase-Gene verschiedener Organismen einschließlich derjenigen von

M. fervidus und M. arboriphilus. Die meisten offenen Leserahmen stellen unbekannte

Gene da. Nur wenige dieser Gene (farbig) finden sich wenigstens ein weiteres Mal in

einer anderen flankierenden Region. Vielfach finden sich die Gene noch im Genom

eines anderen der genannten Organismen, soweit die Genomsequenz vorhanden ist,

allerdings weit vom hmd-Gen entfernt (dunkelgrau eingefärbt). Einige unbekannte

Gene finden sich sogar nur in einem der genannten Organismen (hellgrau

eingefärbt). Eine Funktion neben dem hmd-Gen lässt sich nur wenigen weiteren

Genen sicher zuordnen: δ-Untereinheit der methylviologenreduzierenden

Hydrogenase (braun eingefärbt), α-Untereinheit der Formiatdehydrogenase

Diskussion 85

(MTH1140), DNA-Helikase (MK0007), Aminosäure-Aminotransferase (MMP0132)

und Phosphoribosylglycinamidformyltransferase 2 (MMP0123).

Bis auf M. fervidus findet sich überall ein als bioB? bezeichnetes Gen, das 20 -

30 % Sequenzidentität zur Biotinsynthase aus E. coli hat. Biotin-Synthase ist ein

sogenanntes Radikal-S-Adenosylmethionin-Enzym (Radikal-SAM-Enzym) und baut

Schwefel in Dethiobiotin ein [94]. Radikal-SAM-Enzyme erzeugen mittels eines

[4Fe4S]-Clusters und S-Adenosylmethionin ein 5’-Desoxyadenosylradikal, das dann

für eine Vielzahl von Reaktionen genutzt wird, neben Biotinsynthese beispielsweise

auch bei der Lipoat- und Porphyrinogenbiosynthese [95]. Es wurde auch

vorgeschlagen, dass SAM-Radikal-Enzyme an der Biosynthese des dinuklearen

[FeFe]-Zentrums in [FeFe]-Hydrogenase beteiligt sind [96]. Die Gene hydE und hydG

von Chlamydomonas rheinhardtii sind essentiell für die Maturation von [FeFe]-

Hydrogenase in diesem Organismus, was anhand von Deletionsmutanten entdeckt

wurde, und ihre Expression in E. coli ist bei der heterologen Produktion von [FeFe]-

Hydrogenase notwendig [97]. HydE und HydG aus C. rheinhardtii sind

höchstwahrscheinlich SAM-Radikalenzyme, da homologe Proteine aus Thermotoga

maritima SAM reduktiv spalten können [98]. Die genaue Rolle von HydE und HydG

im Maturationsprozess von [FeFe]-Hydrogenase aus C. rheinhardtii ist nicht bekannt.

Wegen dieser Untersuchungen wäre es denkbar, dass das als bioB? bezeichnete

Gen ein Radikal-SAM-Enzym kodiert, das an der Biosynthese des FeGP-Kofaktors

mitwirkt. Wegen der fehlenden Verwandtschaft von FeGP-Kofaktor zu irgendeinem

anderen bekannten biologischen Kofaktor und der Einzigartigkeit von

Guanylylpyridon als Teil einer biologischen Verbindung ist kein analoger

Biosyntheseweg bekannt. Nur ein weiteres Gen neben bioB? wurde in allen

bekannten flankierenden Regionen gefunden (gelb eingefärbt in Abb. 19), das keine

signifikante Sequenzähnlichkeit mit bekannten Proteinen hat.

Ausblick

In nächster Zeit sollten verschiedene Kokristallisationsexperimente

weiterverfolgt werden, d. h. Kristallisation von [Fe]-Hydrogenase in Gegenwart des

Substrates Methenyl-H4MPT+ und der Inhibitoren CO, Cu2+ und Imidazol. Im Fall von

Cu2+ wurden bereits einige Kokristallisationsexperimente ohne Erfolg durchgeführt

(3.6.2). Diese Experimente sollten weiterverfolgt werden.

Diskussion 86

Imidazol stellt in hohen Konzentrationen (Ki = etwa 50 – 100 mM) einen

kompetitiven Inhibitor von [Fe]-Hydrogenase dar (Sonja Vogt, unveröffentlicht).

Wegen der geringen Größe von Imidazol im Vergleich zu Methenyl-H4MPT+ ist es

denkbar, dass Imidazol die Kristallisation weniger stark stört als es eventuell bei

Methenyl-H4MPT+ der Fall ist, das wegen seiner Größe bei Bindung an das Enzym

teilweise aus der Struktur herausragen würde. Es gelang im Verlauf dieser Arbeit

Datensätze von Imidazol-inhibierte [Fe]-Hydrogenase-Kristalle zu sammeln (siehe

auch 3.6.3 und 3.7.1). Die Strukturdaten zeigten keine Dichte für Imidazol an. Es

sollte allerdings versucht werden, die Imidazolkonzentration (gegenwärtig 50 –

200 mM) bei der Kokristallisation auf ein Vielfaches des Ki zu erhöhen. Fände sich

Imidazol in der Struktur in der Nähe des Eisens wieder, so könnte daraus auf die

Bindestelle von Methenyl-H4MPT+ geschlossen werden (Abb. 20).

Abb. 20: Strukturen vom Carbokationenteil von Methenyl-H4MPT+ (A) und von Imidazol (B). Wegen der Ähnlichkeit der Strukturen und der Tatsache, dass Imidazol ein kompetitiver Inhibitor von

[Fe]-Hydrogenase ist, ist eine Besetzung der Methenyl-H4MPT+-Bindestelle durch Imidazol vorstellbar.

Die unbekannte Ligandendichte in [Fe]-Hydrogenase stammt eventuell von CO,

das an einen Teil der Enzymmoleküle gebunden hat. Die Bindung dieses

zusätzlichen CO könnte abhängig von der Temperatur sein, da die Bindung von CO

an freien FeGP-Kofaktor bei den Mössbauer-Messungen (Probe bei -80 °C)

nachweisbar war, bei den IR-spektroskopischen Messungen (Probe bei +20 °C)

allerdings nicht. Daher sollte versucht werden, rekonstituierte [Fe]-Hydrogenase vor

der Kristallisation unter Stickstoffbegasung kurzzeitig zu erwärmen und danach zu

kristallisieren. Entsprechend könnte [Fe]-Hydrogenase vor der Kristallisation auch

unter einer CO-Atmosphäre inkubiert werden. Im ersten Fall sollten die Kristalle an

der putativen CO-Bindestelle keine Elektronendichte mehr aufweisen oder zumindest

Diskussion 87

eine geringere als bisher und im zweiten Fall eventuell Elektronendichte

entsprechend einer voll besetzten CO-Bindestelle.

Neben der Koordination von Eisen im aktiven Zentrum ist dessen

Oxidationszustand von großem Interesse, worüber die Kristallstruktur durch die

Ligandenzahl nur einen Hinweis geben kann. Daher wird demnächst versucht, den

Oxidationszustand durch redoxchemische Analysen, Kernresonanz-

vibrationsspektroskopische (NRVS)-Untersuchungen [99] und soft-EXAFS-

Messungen [100] zu bestimmen.

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99. Xiao, Y., et al., Now nitrogenase shakes - initial information of nitrogen-fixing (nifH) genes in alp prairie soil of Sanjiangyuan natural reserve. J Am Chem Soc, 2006. 128(23): p. 7608-12.

100. Drury, O.B., et al., The advantages of soft X-rays and cryogenic spectrometers for measuring chemical speciation by X-ray spectroscopy. Nuclear Instruments & Methods in Physics Research Section A, 2006. 559(2): p. 728-730.

Lebenslauf 94

Lebenslauf

Persönliche Daten Name Oliver Pilak

Geburtsdatum 05. Juni 1979

Geburtsort Lebach

Ausbildung Aug. 1989 - Juni 1998 Cusanus-Gymnasium des Landkreises St. Wendel

Juni 1998 Abitur

Wehrdienst Juli 1998 - April 1999 Fallschirmjägerbataillon 365, Lebach

Studium & Praktika Okt. 1999 - März 2004 Studium der Biologie and der Philipps-Universität,

Marburg

Okt. 2001 Vordiplom

Juli 2002 - Sep. 2002 Praktikum bei BASF AG, Ludwigshafen

April 2003 Diplomprüfungen in Mikrobiologie, Genetik,

Biochemie, Virologie

Mai 2003 - März. 2004 Diplomarbeit am Max-Planck-Institut für Terrestri-

sche Mikrobiologie, Marburg; Arbeitsgruppe von

Professor Dr. R. Thauer; Titel: Synthese von Hydro-

genase Hmd aus Methanothermobacter marbur-

gensis bei Wachstum unter Nickel-, Eisen- oder

Ammonium-Limitierung

Seit April 2004 Doktorarbeit am Max-Planck-Institut für Terres-

trische Mikrobiologie, Marburg; Arbeitsgruppe von

Professor Dr. R. Thauer, Titel: Kristallstruktur von

[Fe]-Hydrogenase Hmd

Danksagung 95

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Dr. Seigo Shima und Professor Dr. Rudolf K. Thauer

für die Überlassung des Themas und die Betreuung während der ganzen Zeit meiner

Doktorarbeit und für ihre Hilfe bei der Planung meiner weiteren beruflichen Laufbahn.

Professor Dr. W. Buckel danke ich herzlich für seine Bereitschaft, als

Zweitgutachter meiner Dissertation zur Verfügung zu stehen.

Mein Dank gilt allen Mitarbeitern der Arbeitsgruppen Thauer und Shima für die

ständige Diskussions- und Hilfsbereitschaft und die angenehme Arbeitsatmosphäre.

Sonja Vogt danke ich neben der Herstellung der [Fe]-Hydrogenase-Mutanten für das

tägliche Umschiffen vielfältiger Hindernisse im Labor, die Inkenntnissetzung über

aktuelle Entwicklungen im sozialen Berufsumfeld und die Planung meines Lebens im

Allgemeinen. Meinem designierten Nachfolger Michael Schick danke ich für die nette

Zusammenarbeit und wünsche ihm viel Erfolg mit der [Fe]-Hydrogenase.

Ich danke herzlich Dr. Ulrich Ermler und Dr. Eberhard Warkentin für die

Datenauswertung und Strukturaufklärung von [Fe]-Hydrogenase und den

Mitarbeitern des Paul-Scherrer-Institutes in Brugg (Schweiz) für die Hilfe bei der

Datenaufnahme.

Erklärung 96

Erklärung

Hiermit versichere ich, dass ich meine Dissertation mit dem Titel

„Kristallstruktur von [Fe]-Hydrogenase Hmd“

selbständig, ohne unerlaubte Hilfe angefertigt und mich dabei keiner anderen als der

von mir ausdrücklich bezeichneten Quellen und Hilfen bedient habe.

Die Dissertation wurde in der jetzigen oder einer ähnlichen Form noch bei keiner

anderen Hochschule eingereicht und hat noch keinen sonstigen Prüfungszwecken

gedient.

__________________ ___________________

Ort, Datum Oliver Pilak

Documents

Kristallstruktur von [Fe]-Hydrogenase Hmdarchiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2007/0132/pdf/dop.pdfCluster aus gesehen distale Eisenatom ist nicht redoxaktiv, stellt vermutlich die H 2-Bindestelle