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KULTIVIERUNG VON MIKROORGANISMEN

Verfahren, das Bakterien außerhalb

des natürlichen Standortes zur

Vermehrung bringt (unbelebte

Substrate oder Zellkulturen)

KULTIVIERUNG VON MIKROORGANISMEN

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Voraussetzungen für Bakterienwachstum

n Nährmedium

n Temperaturoptimum

n pH-Wert

n Sauerstoff

(aerob/anaerob)

Bakterienwachstum durch binäre Teilung

Pro Stunde = 2 Teilungen Anfangskeimzahl 1Ø1 Stunde 4Ø2 Stunden 16Ø3 Stunden 64Ø4 Stunden 256Ø5 Stunden 1024Ø6 Stunden 4096Ø7 Stunden 16384Ø8 Stunden 65536Ø9 Stunden 262144Ø10 Stunden 1048576Ø11 Stunden 4194304Ø12 Stunden 16777216Ø13 Stunden 67108864Ø14 Stunden 268435456Ø15 Stunden 1073741842Ø16 Stunden 4294967296Ø17 Stunden 17179869184

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Identifizierung von Bakterien

n Morphologische Merkmale– Gramverhalten– Form– Größe– Kapsel– Kolonieform– Farbe

n Physiologische Merkmale– Nachweis verschiedener Enzyme (Bunte Reihe, API)

n Chemische Merkmale– Zellwand– Antigene– DNA

n Bakterien bilden auf festen Nährböden Kolonien. Man versteht

darunter mit bloßem Auge sichtbare Teilaggregationen, die infolge

einer einzelnen Bakterienzelle entstanden sind.

n Kolonien entstehen nicht nur unter Laborbedingungen (künstlichen

Bedingungen), sondern auch unter natürlichen Bedingungen auf

Substraten mit fester Oberfläche (z.B. auf Kartoffeln, Fleischwaren,

Früchten).

n Form, Struktur und Farbe der am Kolonieaufbau beteiligten Einzelzellen

bestimmen u.a. die Koloniemerkmale (Morphologie).

KULTIVIERUNG VON MIKROORGANISMEN

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KULTIVIERUNG VON MIKROORGANISMEN

n Farbe:

n Koloniegröße:

n Oberfläche:

n Konsistenz:

n Geruch:

n Profil:

n Kolonieform:

n Kolonierand:

KEIMZAHLBESTIMMUNGEN

n Verdünnungsreihen müssen angelegt werden, um bei der

späteren Kultivierung auswertbare Koloniezahlen auf dem Agar

zu erhalten.

n In der Praxis ist die dezimale Verdünnung am gebräuchlichsten.

n Zum Anlegen einer Verdünnungsreihe wird die Originalprobe

(Verdünnungsstufe 0) 1:10 verdünnt.

n 10 g auf 100 ml mit Verdünnungsflüssigkeit auffüllen,

Verdünnungsstufe 1.

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KEIMZAHLBESTIMMUNGEN

n Aus dieser Stufe wird 1 ml entnommen und zu 9 ml

Verdünnungsflüssigkeit pipettiert (Verdünnungsstufe 2).

n Nach dem Durchmischen auf dem Reagenzglasschüttler werden weitere

Dezimalverdünnungen angelegt.

n Für jede Verdünnungsstufe wird eine frische Pipette verwendet.

n Benutzte Pipetten werden in einer Desinfektionslösung abgestellt.

n Aus der zuvor hergestellten Verdünnungsreihe werden genau

abgemessene Mengen zur Anzüchtung von Mikroorganismen verwendet

(1ml für Plattengussverfahren und 0,1 ml für Oberflächenverfahren.

Stufe 0 Stufe 1 Stufe 2 Stufe 3 Stufe 4 Stufe 5 Stufe 6

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• 1 ml einer Verdünnungsstufe wird mit einer sterilen Pipette in eine leere, sterile Petrischale eingebracht.

• Dazu gibt man ca. 10-15 ml verflüssigten und ca. 40°C warmen Agar (z. B. PCA).

• Diese beiden Lösungen werden durch kreisende Bewegungen (in Form einer 8) verteilt.

• Die verschlossene Petrischale bleibt bis zum Erstarren des Nährbodens stehen und wird anschließend mit dem Deckel nach unten bebrütet.

Plattengussverfahren

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• 0,1 ml einer Verdünnungsstufe wird mit einer sterilen Pipette auf eine fertig gegossene Agarplatte aufgebracht.

• Der Tropfen wird mit einem sterilen gebogenen Glasstab (Drigalski-Spatel) gleichmäßig auf der Platte verteilt.

• Die Petrischale wird mit dem Deckel verschlossen. • Erst wenn der Ausstrich getrocknet ist, wird die

Schale mit dem Deckel nach unten bebrütet.

Oberflächenspatelverfahren

Plattengussverfahren

Oberflächenspatelverfahren

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VERDÜNNUNGSREIHE (Gruppenbeispiel)DI

Ü4

STUFE Gesamt Keimzahl PCA, 22°C/2d

Coliforme Bakterien/E. coli CCA,37°C/ 1d

EnterokokkenKANA, 44°C/1d

S. aureusBP, 37°C/1d

0 /

1 /

2 /

3 /

4 /

Ergebnis (Mittelwert)KBE/ml

/

n Anlegen einer Verdünnungsreihe aus einer Mischkultur (0rginal Probe, 1, 2, 3, 4)n Bestimmung der Kolonie Bildende Einheiten KBE/ml einer Keimsuspension mittels

Koch'schem Plattenverfahren– Gesamtkeimzahl (OF, PCA Agar, 22°C), – E. coli und coliformen Bakterien (OF, CCA Agar, 37°C), – Enterokokken (OF, KANA Agar, 44°C), – S. aureus (OF, BP Agar, 37°C).

Gesamtkeimzahl (PCA)n Auswertung

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Coliforme, E. coli (CCA)n Auswertung

Staphylokokken (BP)n Auswertung

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Enterokokken (KANA)n Auswertung

Berechnung am Beispiel PCA

Stufe Wert

2 418 x 102 = 418 x 1023 34 x 103 = 340 x 1024 4 x 104 = 400 x 102

1158 x 102Mittelwert bilden 1158 x 102 :3 = 386x102

Ergebnis 3,9 x 104

n Auswertung