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Doz. Dr. H. Woidich Dr.-Ing. W. Pfannhauser Forsch.-Inst. der Ernahrungswirtschaft A-1190 Wien XIX Blaasstr. 29

Lokalisierung einiger Enzyme in den Skeletmuskel-Mitochondrien des Schweins

REINER HAM~, AHMED A. EL-BADAWI* u n d L~:Is]~ T]~TZLAFF

Mitteilung aus dem Institut fiir Chemie und Physik der Bundesanstalt fiir Fleischforschung, Kulmbach (BRD)

Eingegangen am 9. Marz 1972

Localizat ion of Some Enzymes in the Mitochondria of Porcine Skeletal Muscle Summary. The localization of aconitase (AC), fumarase (FU), malate dehydrogenase (1VIDH),

glutamate dehydrogcnase (GLDH), succinate dehydrogenase (SDH), lactate dehydrogenase (LDH), aspartate aminotransferase (GOT) and alanine aminotransferase (GPT) in mitochondria isolated from porcine skeletal muscle was investigated using different treatments including homogenization with phosphate buffer plus triton X-100, suspension in dest. water or saccharose- tris-buffer with and without added digitonin, ultrasonic treatment, freezing and thawing. The results show that AC, FU, M])H, LDtt and GOT are more or less tightly associated with mito- chondrial membranes. GPT seems to be at least partially localized in the intracristae space. GLDH is dissolved in the mitochondria] matrix. SDtI is tightly integrated within the mitochondrial structure. The results are discussed with regard to the different metabolic functions of the enzymes of the citrate cycle, of GLDt{ and of the amino-transferases.

Zusammeniassung. Die Lokalisierung yon Fumarase (FU), Aconitase (AC), Malatdehydro- genase (MDtt), Glutamatdehydrogenase (GLDH), Lactatdehydrogenase (LDtt), Succinodehydro- genase (SDtt), Aspartat-Aminotransferase (GOT) und Alanin-Aminotransferase (GPT) in isolier- ten Mitoehondrien der Skeletmuskulatur des Schweins wurde dureh folgende Behandlung der Mitochondrien ermittelt: Homogenisieren in Phosphatpuffer-Triton-X-100, Suspendieren in dest. Wasser sowie in Saccharose-Trispuffer mit und ohne Digitonin, Ultrasehallbehandlung, Gefrieren und Auftauen. Aus den Resultaten geht hervor, dab AC, FU, MDH, LDH und GOT mehr oder weniger stark mit den Mitochondrien-Membranen assoziiert sind. GPT scheint mindestens teil- weise im intracristalen Raum lokalisiert zu sein, wahrend GLDH in der Matrix des Mitochondriums gelSst ist. SDt{ ist lest in die Mitochondrienstruktur integriert. Die Ergebnisse werden im Hin- blick auf die unterschiedliche Funktion der Enzyme des Citrat-Cyclus, der GLDtI und der Aminotransferasen im Stoffweehsel diskutiert.

* Stipendiat der Alexander-von-Humboldt-Stiftung. Jetzige Adresse: University of Assiut, Faculty of Agriculture, Assiut, VAR.

Einleitung Zahlreiehe der im Skeletmuskel enthaltenen Enzyme, insbesondere die des CRrat-

Cyelus, der Atmnngskette und der oxydativen Phosphorylierung, sind in den Mito- chondrien der Muske]zelle enthalten. Es ist mSglieh, dab Qualitgtsverluste des Fleisehes w/ihrend der Lagerung des frisehen, des aufgetauten oder des gefrier- getroekne~en Materials anf einer Freisetzung dieser Enzyme aus den Mitoehondrien dureh Seh&digung der subeelluli~ren Strukturen des Gewebes beruhen. DaB Mito- ehondrien-Enzyme dureh Gefrieren und Auftauen des Muske]gewebes freigesetzt werden und in des Sarkoplasma fibertreten, konnten wir im Falle der Aspartat- Aminotransferase bei der Muskulatur yon Rind [1], Sehwein [1], Geflfigel [2] und Fiseh [3] naehweisen. Es ist wahrseheinlieh, dab die fre~gesetzten Enzyme raseher und leiehter zu den betreffenden Substraten gelangen als die an Partikeln gebundenen und yon Membranen umhfillten Enzyme und dab sic so zu einer besehleunigten J~nderung der Fleisehbesehaffenheit beizutragen vermSgen. Ffir ein Verst/indnis dieser Ver~nderungen und ffir die Vermeidung yon Qualit/itsverlusten ist daher ein Studium des Einflusses der Lagerung, des Gefrierens und Auftauens und anderer Behandlungs- verfahren auf die subeellulgre Verteilung der Mitochondrien-Enzyme notwendig. Aus solchen Untersuehungen kava ferner auf Art und Ausma8 der Veri~nderung der Muskelmitoehondrien gesehlossen werden [1]. SehlieBlieh kann das Ubertreten yon Mitoehondrien-Enzymen in d~s Sarkoplasma zum Naehweis bestimmter Behandlungs- verfahren dienen. So ist es mSglieh, aufgrund der Freisetzung des mitoehondrialen Isozyms der Aspartat-Aminotransferase zwisehen frisehem Fleiseh und aufgetautem Gefrierfleiseh zu unterseheiden [1, 2, 4].

Die bisher nur im Falle der Aspartat-Aminotransferase und der Alanin-Aminotransferase durchgeffihrten Untersuchungen fiber den EinfluB des Gefrierens und Auftauens yon Muskel- gewebe auf die subcellul/ire Verteilung yon Mitochondrien-Enzymen sollten auch auf andere Mitochondrien-Enzyme ausgedehnt werden. Wir wihlten hierzu folgende Enzyme ausl:

Aconitase (AC; E.C.4.2.1.3), Fumarase (FU; E.C.4.2.1.2), Malatdehydrogenase (MDIt; E.C.1.1.1.37), Glutamatdehydrogenase (GLDH; E.C.I.&.I.2) und Sueeinodehydrogenase (SDH; E.C.1.3.99.1). Was die Verteilung dieser Enzyme in der 1VIuskelzelle betrifft, so liegen SDtt und GLDH ausschlieBlieh an Mitochondrien gebunden vet [5--7], wiihrend MDH sich in Form ver- schiedener Isozyme sowohl in den Mitoehondrien als auch im Sarkoplasma befindet [6, 7]. FU and AC sind zweifellos in den Mitochondrien des Muskels enthalten [6--9], doeh seheint aueh eine mehr oder weniger grebe Aktivit~t dieser Enzyme im Sarkoplasma naehweisbar zu sein [6, 9].

Um den Zusammenhang zwisehen einer Freisetzung dieser Enzyme und der Art der Mitoehondrien-Sch~digung riehtig interpretieren zu kSnnen, mul~ man wissen, ob des Enzym mehr oder weniger lest yon den Membr~nen des Mitoehondriums gebunden wird oder ob es in der Mitoehondrien-Matrix ]okalisiert ist. Da im Gegen- satz zu Lebermitochondrien fiber die Bindungsart der genannten Enzyme in den Mitoehondrien des gestreiften Skeletmuskels kaum etwas bekannt ist, befaBten wir uns mit der Lokalisierung dieser Enzyme in den aus Psoasmuskel des Schweins isolierten Mitoehondrien. AuBer den oben angeffihrten Enzymen warden noeh einige weitere Enzyme in diese Untersuchnng mit einbezogen.

Im tIinblick auf nnsere erwi~hnten Arbeiten fiber den EinfluB des Gefrierens und Auftauens des Skeletmuskels auf die subeellulEre Verteilung yon Transaminasen interessierte der Bindungs- zustand der Aspartat-Aminotransferase (Glutamat-Oxalacetat-Transaminase; GOT; E.C.2.6.1.1.) und der Alanin-Aminotransferase (Glutamat-Pyruvat-Transaminase; GPT; E.C.2.6.1.2) im lgitoehondrinm. GOT ist in Form seiner Isozyme in den Mitochondrien wie im Sarkoplasma ent- halten [10--12]. Auch die GPT-AktivitEt ist zwischen Sarkoplasma und subeelluliren Strukturen verteilt [7, 10]. SchlieBlich war auch die Laetatdehydrogenase (LDH; E.C.1.1.1.27) yon Interesse, da man in neuerer Zeit fend, dai] LDH nich$, wie man friiher angenommen hatte, ausschlieBlich im Sarkoplasma, sondern aueh in subcellul~ren Partikeln [6, 13, 14], vor allem in Mitochondrien [13, 15, 16] vorhanden ist.

l~aeh Klingenberg u. Pfaff [17] lassen sieh die 1Vlitochondrien-Enzyme in drei Gruppen ein- teilen: 1. ,,locker gebundene" Enzyme; 2. lest eingeschlossene Enzyme; 3. strukturgebundene Enzyme. Die Enzyme der 1. Gruppe lessen sich dutch SalzlSsungen, wie z. ]3. Phosphatpuffer

1 Herra Prof. Dr. D. E. Green, University of Wisconsin, Madison (USA) sind wir ffir An. regungen zu dieser Auswahl zu Dank verpflichtet.

extrahieren, die der 2. Gruppe - - vor allem Enzyme der Matrix - - treten naeh meehanischer Zer- stSrung der Mitochondrienstruktur (z. B. dureh Ultraschall) aus, w~hrcnd die Enzyme der 3. Gruppe nur dutch Anwendung yon Detergentien (z. B. Triton) in Freiheit gesetzt werden. Zwisehen den ,,locker" gebundenen und den lest in die Struktur eingebauten Enzymen gibt es w~hrscheinlich Abstufungen in der ]~indungs~estigkeit, und es h~ngt yon der Art der Behandlungs- methode ab, ob ein Enzym als ,,frei" oder ,,gebunden" erscheint [18].

Es ist ferner m6glieh, das -con der ~uBeren und inneren mitochondrialen Membran begrenzte Kompartiment (intracristaler Raum) und das yon der innerenMembran umschlossene Komparti- ment (Matrix-l~aum) getrennt zu er6ffnen nnd die in beiden Kompartimenten vorhandenen 16s- lichen Enzyme getrennt freizusetzcn [19]. Die Anwendung yon Digitonin gestattet ohne wesent- lithe Seh~digung tier irmeren mitoehondrialen Membran eine Er6ffnung bzw. Abl6sung der /iuBeren mitochondrialen Membran [19, 20]. Die EuGere Membran ist auch dureh drastische Quellung der Mitochondrien in dest. Wasser abl6sbar [21]. Rasches Einfrieren der Mitochondrien in schwach hypertonischem 1VIedium soll einen ~hnlichen Effekt wie Digitonin austiben, da der in einem hypertonisehem Saceharose-Medium stark gequollene intracristale Raum beim Einfrieren durch EinreiBen dcr EuBeren Membran eher erSffnet wird als der unter diesen Bedingungen ge- schrumpfte Matrixraum [19].

Aufgrund dieser Tatsachen wurde versucht, die Lokalisierung der Enzyme in den Mito- ehondrien des Skeletmuskels durch folgende Behandiungsarten zu ermitteln: Suspension dcr Mitochondrien in a) Saceharose-Trispuffer, b) Saecharose-Trispuffer unter Zusatz yon Digitonin, e) dest. Wasser; Behandiung einer Suspension der Mitochondrien in Saeeharose-Trispuffcr a) mit Ultraschall, b) Gefrieren bei - -8 ° C, c) Gefrieren bei --80 ° C. ~tir eine maximale Extraktion tier EnzymaktivitEten aus den Mitoehondrien wurde die kombinierte Einwirkung yon Zerkleinerung, Phosphatpuffer und Triton-X-100 angewendet.

Durchliihrung der Versuehe ~

Isolierung der Muskelmitochondrien [10]. l~och warmer, schlachtfrischer Psoas-Muskel des Sehweins (4 Tiere) in der KElte mit dem Fleischwolf (2 mm-Loehseheibe) zerkleinern. 20 g unter Eiskfihlung im Apparat nach Potter-Elvehjem mit 40 ml 0,01 m-Tris-HC1-Puffer (pH 7,6), welcher 0,3 tool Saccharose enthElt, homogenisieren; 160 ml Saccharose-Trispuffer zugeben. Nach Filtration durch eine doppelte Gazeschicht zur Sedimentation yon l~uskelfasern, Myofibrillen und Zellkernen zweimal je 7 rain bei 220 × g zentri/ugieren. Uberstand zweimal je 10 rain bei 14000 × g zentrifugieren; beide Rfickst~nde vereinigen und dureh Zentrifugieren bei 14000 × g zweimal mit 30 ml Saccharose-Tris-Puffer waschen. Alle Operationen in der K~lte ausffihren. ~itochondrien-Fraktion durch mikroskopische Priifung und aufgrund dcr Suceinodehydrogenase- Aktiviti~t, nachgewiesen durch den ,,Nitro-BT-Test" [22], priifen.

Herstellung der Ansdtze. Aliquote Teile der Mitochondrienmasse suspendieren a) in 15 ml 0,1 m-Phosphatpuffer yore pH 7,6 mit 0,1°/o Triton-X-100 (Oetylphenoldeca~thylenglykol~ther; Fa. Serva Entwicklungslabor, Heidelberg), b) in Saccharose-Trispuffer yon pH 7,6 (0,01 m-Tris- hydroxymethyl-aminomethan, pro anal., Fa. Merck, Darmstadt; 0, 30 m-Saecharose), e) in dest. Wasser. Gehalt der AnsEtze an trischer Mitoehondrienmasse etwa 30 mg/ml.

Homogenisieren. Phosphatpuffer-Triton-Ansatz im Biihler-Homogenisator (Fa. Bfihler, Tfibingen) 2 × 1 min unter Eiskiihlung bei Stellung 60 homogenisieren.

Digitouin-Behandlung [19]. Saceharose-Trispuffer-Ansatz mit 2 mg Digitonin (krist., l~a. Merck, Darmstadt)/10 mg Mitochondrienprotein versetzen und 20 rain unter Riihren bei -k4 ° C incubieren.

Ultraschall-Behandlung. Saecharose-Trispuffer-Ansatz im Branson-Sonifier-GerEt S-75 (20 kc/sec; Branson Sonifier Power, Danbury, Conn., USA) unter Eiskfihlung 5 × 10 see bei Stellung 5 beschallen.

Ge/rieren. Saecharose-Trispuffer-Ansatz a) 24 Std bei - -8 ° C, b) 30 rain bei --80 ° C, dann 24 Std bei --20 ° C einfrieren und bei Zimmertemperatur auftauen.

Proteinbestimmung. Proteingehalt der Mitoehondrienmasse mittels der Kjeldahl-l~[ethode, Proteingehalt der Uberst~nde der verschiedenen AnsEtze mit der Biuret-Methode [23] bestimmen.

Bestimmung der Enzymaktivit~iten. Alle AnsEtze in der Kiihlzentrifuge bei 35000 × g zentri- fugieren. In aliquoten Teilen des ~berstandes EnzymaktivitEten bei 25 ° C (Thermostat), im Falle yon GOT und GPT bei 37 ° C bestimmen. Aconitase nach Morrison [8] ; Einheit ~ Zunahme der Absorption bei 240 nm pro rain bei pH 7,7. ~umarase naeh Alberty [24]; Einheit ~ J~nderung der Absorption bei 250 nm × 10 a pro 10 see. Malatdehydrogenase mit der ,,Biochemica-Test- Combination" (Fa. C. A. ]~oehringer u. S6hne, Mannheim); Internationale Einheit. Glutamat- dehydrogenase mit der ,,Biochemica-Test-Combination" (Boehringer); internationale Einheit. Succinodehydrogenase nach Slater [5]; Einheit ~ VerEnderung der Absorption bei 420 nm um 1,00 in 10 rain. Lactatdehydrogenase mit der ,,Biochemiea-Test-Combination" (Boehringer); Einheit. : Umsetzung. yon. 1 _~mol Pvruvat__ _oro rain,. As~oartat_ -Aminotrans]erase und Alanin-, Ammotrans]erasemlt,,Bmehemica.Test_Combination' (Boehringer); Einheit ~ Bfichereinheiten.

2 Frau W. Pechwitz danken wir iiir ihre wertvolle Assistenz.

10

Ergebn i s se u n d D i s k u s s i o n 3

_&us den Longissimus dorsi-Muskeln yon vier Schweinen wurden vier Mitoehon- drienloraparate hergestellt, die folgende Proteingehalte aufwiesen: 3,28 ~o (Versuch I), 9,70% (Versuch II), 10,72% (Versueh III ) , 9,88% (Versuch IV). Da ein Homo- genisieren der Pr~parate in Phosphatpnffer muter Zusatz yon Triton-X-100 eine maximale l~reisetzung der Enzyme aus den Mitochondrien gew~hrleisten sollte (s. o.), wurde die ira Ubcrstand dieser Ansi~tze ermittelte Aktivitat zunachst als die gesamte, in den Mitochondrien enthaltene Aktiviti~t betrachtet. Wie unten noch gezeigt wird, trifft diese Annahme fiir GLDH und SDH nicht zu. In Tab. 1 - 3 sind diese ,,Gesamt- Aktivitaten" fiir die Hydratasen oder Hydro-Lyasen (AC, FU), Dehydrogenasen (MDH, GLDH, SDtI, LDH) und Transaminasen (GOT, GPT), bezogen sowohl auf Mitoehondriengewicht als auch auf Mitochondrienprotein (spezifische Aktivitat), angegeben.

Tabelle 1. ,,Gesamtaktivitiit" der ttydratasen (Hydro-Lyasen) in lV[itochondrien, extrahiert nach Homogenisieren in Phosphatpuffer unter Zusa~z yon Triton-X-100. Versuehe I--IV mit Mito-

ehondrien aus der Skeletmuskulatur yon vier Tieren

Enzym Versuch Nr.

Aktiviti~t pro 0,1 g Mitochondrienmasse Aktivitgt pro mg Mitochondrienprotein

Aconitase (Einheiten) Fumarase (Eimheiten) I I I I I I IV I I I I I I IV

198,5 253 ,7 731 ,8 330 ,4 713 ,8 810 ,9 4 3 2 , 7 1298,1

60,5 26,2 68,3 33,4 217,5 83,7 40,4 131,1

Tabelle 3. ,,Gesamtaktivit~t" der Transaminasen in Nitochondrien. Dieselben Priiparate wie in Tab. 1

Enzym

Versuch Nr.

Aktivitgt pro 0,1 g Miotchondrienmasse Aktivitgt pro mg Mitochondrienprotein

Aspartat-Aminotransferase Alanin-Aminotransferase (Einheiten) (Milli-Einheiten) I II III IV I II III IV

369,1 589 ,1 730 ,6 412 ,3 7027,6 15869,0 20910,0 7872,1

112,5 60,8 68,3 41,6 2389,4 1637,8 1954,2 795,2

Sieht man die Aktivit&t der 8DH Ms ,,Indikator" ffir die Mitochondrien-Kon- zentration an, so folgt aus Tab. 2, dab das Pr£1oarat yon Versuch I besonders reich an MitochondrJen war, denn es wies die h6ehste spezifisehe SDH-Aktivitat auf. Damit steht im Einklang, dab die spczifischen Aktivit£ten auch der/ibrigen unter- suehten Enzyme in diesem Praparat wesentheh h6her waren, als in den fibrigen drei Pr&paraten; letztere waren offenbar mi~ Proteinen verunreinigt, welche nieht aus Mitochondrien stammten.

Die vier ~¢iitochondrienpr~parate wurden folgenden sieben Behandlungsverfahren unter- worfen: 1. Homogenisieren in Phosphatpuffer unter Zusatz yon Triton-X-100; 2. Suspendieren in dest. Wasser; 3. Sedimentieren in Saceharose-Trispuffer; 4. Digitonin-Zusatz zur Saccharose- Trispuffer-Suspension; 5. Ultrasehall-Behandlung der Saccharose-Trispuffer-Suspension; 6. Ein- frieren der Saeeharose-Trisl~uffer-Susl0ension bei --8 ° C und 7. bei --80 ° C.

Die Resultate dieser Versuche sind in Tab. 4, 5 und 6 wiedergegeben. Unter der bereits erwahnten Annahme, dag die kombinierte Wirkung yon Phosphatpuffer, Triton-X-100 und ~Iomogenisieren eine maximale Freisetzung der Mitochondrien- Enzyme erm6glicht, wurde die naeh dieser ]3ehandiung fin Uberstan4 gemessene

3 Abkiirzungen: AC = Aeonitase; FU = l%marase, 5IDH = NIalatdehydrogenase; GLDI-I Glutamatdehydrogenase; SDI-I = Succinodehydrogenase; LDH = Lactatdehydrogenase;

GOT = Asl~artat-Aminotransferase; GPT = Alanin-Aminotransferase.

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Enzymaktivit/Lt als Bezugsgr58e mit 100% bezeiehne~; es sind also die bei den fibrigen Behandlungsverfahren (2. bis 7.) im Uberstand bestimmten Aktivitgten hierauf bezo- gen. Als sehonendste Behandlungsweise, welehe die geringste Freisetzung yon Enzymen aus den Mitoehon- drien erwarten l~St, ist die Suspension der Mitochondrien in der gleichen Saeeharose-Trispuffer-LSsung anzusehen, die aueh fiir die Isolierung der Mitoehondrien verwendet wurde (3. Behandlungsmethode). Im folgenden werden die fiir die aeht untersuchten Enzyme erhaltenen Ergebnisse (Tab. 4 - 6 ) diskutiert.

Aconitase (Tab. 4). S/£mtliehe Behandlungsverfahren - auSer tIomogenisieren in Phosphatpuffer-Triton-X-100 - fiihrten nur zu einer verh/£1tnism~l~ig geringen Frei- setzung des Enzyms. Daraus kann gefolgert werden, dal~ AC ziemlich stark mit den Membranen des 1VIitoehon- driums assoziiert ist. Um einen festen Einbau der AC in die Mitoehondrienstruktur kann es sieh jedoch nieht handeln, da AC durch Itomogenisieren der Mitoehondrien in Phosphatpuffer-Triton-X-100 im Gegensatz zu SDtI (Tab. 5) offenbar weitgehend in Freiheit gesetzt ~-ird.

Brdiczka u. a. [19] folgerten aus ihren Untersuehun- gen an Lebermitoehondrien, dab die Enzyme des Citrat- Cyelus zusammen mit GLDtI nieht im Intraeristae- Raum, sondern in der Mitochondrien-Matrix lokalisiert sind. Dies kann ffir die l~ier untersuehten Skeletmuskel- Mitoehondrien kaum zutreffen, da die AC in ihrer Extrahierbarkei~ sieh grunds£tzlieh anders verh/~lt als die GLDt t (s. n.). AC ist wesentlieh fester an die Mito- chondrien gebunden als GLDt t and di~rfte wohl kaum in der Matrix gelSst sein. DaB AC zumindest zum grSl]e- ten Teil nieht im intracristalen l%aum gelSst ist, ist allerdings aueh aus unseren Versuehen zu sehlieSen, denn die {)ffnung der ~uBeren Membran dutch Digitonin oder Quellen in dest. Wasser ffihrte zu einer wesentlieh geringeren Freisetzung yon AC als dies bei einem Intra- eristae-Enzym wie etwa Adenylatl~Jnase [19] der Fall is$.

Gefrieren and Auftauen der Mitoehondriensuspen- sion bedingte eine gewisse, yon der Gefriertemperatur unabh~ngige Freisetzung yon AC.

.Fumarase (Tab. 4). Der Bindungszustand dieser Hyd- ratase ist ganz ~hnlieh demjenigen yon AC. Ein Unter- sehied besteht lediglich darin, dab FU dureh Ultrasehall- Behandlung der Mitoehondrien wesentlieh st/~rker frei- gesetzt wird als AC. Daraus is$ zu folgern, dab die Assoziation der FU mit den Membranen des Mitoehon- driums etwas loekerer ist als die der AC.

Aus der weitgehenden Freisetzung der FU aus Leber- mitoehondrien durch Ultrasehallbehandlung sehlieBen Brdiezka u. a. [19], dab sich FU im gleiehen Komparti- ment befindet wie GLDtt . Vergleieht man jedoeh das Ver- halten der FU (Tab. 4) mit demjenigen der GLDtI (Tab. 5), so zeigen die beobaehteten Untersehiede, dab dies kaum der Fall sein diirfte. Im fibrigen gilt das gleiehe,

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was oben fiber die Lokalisierung yon AC gesagt wurde, auch ffir die FU. Die Frei- setzung dureh Gefrieren und Auftauen war bei FU/~hnlieh wie bei AC; sie war bei - 8 ° C etwas s~/~rker als bei - 8 0 ° C.

Malatdehydrogenase (Tab. 5). MDtI verhglg sieh hinsiehtlich seiner Freisetzung ans den Mnskelmitoehondrien dureh die versehiedenen Behandlungsverfahren ~hnlieh wie AC. Aueh dieses Enzym is~ verh/fltnism~Big stark mit den Mitoehondrienstruk- turen assoziier~. Aus den bereits bei der Disknssion der AC-Resultate erw/~hnten Grfinden dfirfte MDIt weder im intracristalen Raum lokalisiert noeh in der Mito- chondrien-~Iatrix gel6st sein. Unsere Ergebnisse stehen somit im Gegensatz zu den Befunden yon Brdiczka u. a. [19] an Lebermitochondrien, naeh denen sieh MDtt im gleichen Kompart iment wie GLDIt befinden soll. Gefrieren und Auftauen ffihrten nur bei - 8 ° C, niehg jedoeh bei - 8 0 ° C zu einer - wenn aueh nttr geringen - Frei- setzung yon MDIt.

Glutamatdehydrogenase (Tab. 5). Eine maximale Aktivit/~t dieses Enzyms wurde im l~berstand der Suspension der Mitoehondrien in Saceharose-Trispuffer (3. Behand- lungsverfahren) gefunden. Offenbar fSrdert selbst die verhgl~nism/~Big geringe Schgdigung, welehe die Mitochondrien w~hrend ihrer Isolierung erfahren hatten, die- Extrahierbarkei~ des Enzyms. Die nach ttomogenisieren der Mitoehondrien in Phosphatpuffer-Tri~on-X-100 im l~berstand gemessenen GLD~-Aktivi tgt ist wesen~- rich geringer als die Aktivit/it naeh Suspendieren der Mitoehondrien in Saeeharose- Trispuffer. Darans ist zu folgern, dab GLDIt als verh/~ltnism/~l~ig empfindliehes Enzym durch den HomogenisierungsprozeB eine partielle Inaktivierung erf/~hrt. Noeh wesentlieh st/~rker wird MDIt durch Ultraschallbehandlung inaktiviert, denn dureh Besehallung nimmt die Enzymaktivi~/~g im Uberstand nieht zu, sondern ab, in Versueh I I sogar auf den Wert 0. Die hohe GLDII-Aktivit/~ im l~berstand der Saeeharose-Trispuffer-Ans/~tze mit und ohne Digitonin sprieht daffir, daB dieses Enzym nieh~ an Membranen gebunden ist, sondern in der Mitochondrien-~atrix gelSs~ ist. Dieses Ergebnis stimmt mit den Beobachtungen yon Brdiezka u. a. [19] an Lebermitoehondrien tiberein. Naeh diesen Autoren ist GLDH nieht im Intraeristae- Raum lokalisiert. Gleiehes 1/~l~t sich insofern aueh aus unseren Resultaten schlieBen, als Digitoninbehandlung und Quellung der Mitoehondrien in reinem Wasser zu keiner nennenswerten ErhShung der GLDH-Aktivitgg im Uberstand f/ihren. Gefrieren und Auftauen der Mitoehondrien braehten keine eindeutige Ver~nderung der GLDH- Aktivitgt im l~berstand mit sieh. Bei der Empfindliehkeit dieses Enzyms is~ damit zu reehnen, dab Gefrieren und Auftauen zwar eine Freisetzung, gleiehzeitig aber aueh eine gewisse Inaktivierung der GLDtt bedingen.

Sztccinodehydrogenase (Tab. 5). Ultrasehallbehandlung ffihrte zu einer wesentlieh s~/irkeren Freisegzung dieses reeht stabilen Enzyms als Homogenisieren in Phosphat- puffer-Triton-X-100. Das letztere Behandlungsverfahren seheint also das Enzym nieht v6]]ig ans den Strnkturen in Freiheit zu setzen. Diese Beobaehtungen sowie die sehr geringe Aktivit/~t der SDH im l~bers~and der Suspension der Mitoehondrien in dest. Wasser und Saccharose-Trispuffer (mit und ohne Digitonin) lassen auf einen festen Einbau der SDH in die Membranen des Mitoehondriums schlieBen. Ffir Leber- mitochondrien lieB sieh En~sprechendes feststellen [19]. Gefrieren und Auftauen der Mitochondrien hatten eine yon der Gefriertemperatur unabhgngige merkliehe Frei- setzung des Enzyms zttr Folge.

Lactatdehydrogenase (Tab. 5). Wenn auch LD H nicht als spezifisehes Mito- ehondrien-Enzym anznsehen ist, so fand sieh doeh in allen Mitoehondrienpr~paraten eine ziemlieh gleiehmgl3ige spezifisehe LDIt-Aktivit/~t (Tab. 1). Da die Extrahierbar- kei~ der LDIt-Aktivit~t dnreh die versehiedenen Behandlungsverfahren - mit Ausnahme des Homogenisierens in Phosphatpuffer-Triton-X-100 - verh/~ltnism/il3ig gering war, seheint dieses Enzym mit der Mitoehondrienstruktur assoziiert und nieht

15

in der Matrix gel6st zu sein. In ihrem BindungszusSand ahnelt die LDII der FU. L DH wurde durch Gefrieren und Auftauen in gewissem Umfang freigesetzt, wobei die Gefriertemperatur keine Rolle spie]te.

Aspartat-Aminotrans/erase (T~b. 6). Die verhaltnismaBig geringe Freisetzung der GOT dureh die versehiedenartige Behandlung der Mitoehondrien laBt auf eine Khnlich starke Assoziation dieses Enzyms mit den Mitochondrienstrukturen sehlieBen wie sie fiir AC gefunden wurde. GOT befindet sich offenbar weder im intraeristalen l%aum noeh in der Matrix der Mitochondrien. Eine gewisse Freisetzung der GOT dureh Gefrieren and Auftauen der Mitochondrien-Suspension war bei - 8 ° C, nicht jedoch bei - 8 0 ° C zu beobaehten.

Alanin.Aminotranslerase (Tub. 6). Es fallt auf, dab GPT loekerer gebunden ist als GOT. Ultraschallbehandlung bedingte eine starke Freisetzung der GPT aus den Mitochondrien. Auch dutch Quellung der Mitochondrien in reinem Wasser und dureh Digitoninbehandlung wird GPT wesentlich starker freigesetzt als GOT. Man mSchte hieraus folgern, dub zumindest ein Tefl der GPT-Aktivitiit im Intracristae-l~aum des Mitochondriums lokalisiert ist. Da auf Grund des unterschiedliehen Verhaltens der beiden Enzyme GPT kaum fin gleiehen Kompart iment vorliegt wie GLDH, ist GPT wahrscheinlieh nieht in der Mitochondrien-Matrix gelSst. Dutch Gefrieren und Auf- tauen wurde ein Teil der GPT-Aktivitat aus den Mitoehondrien freigesetzt, und zwar bei - 8 ° C starker als bei - 8 0 ° C.

Allgemeine Diskussion Aus den vorliegenden Resultaten ]aBt sich der allgemeine SchluB ziehen, dab die

untersuchten Enzyme des Citrat-Cyclus (AC, FU, MDtt) mit Ausnahme der SDI-I mehr oder weniger locker mit den Mitochondrien-5[embranen assoziiert sind und sich weder iiberwiegend im intracristalen Raum noch in der eigentlichen Mito- chondrien-Matrix befmden. Das gleiche gilt auch fiir GOT, die nicht im I~Iauptweg des Citrat-Cyclus wirkt, sondern eine auf der Stufe des Ketoglutarats bzw. Oxalacetats abzweigende Nebenreaktion katalysiert, welche Beziehungen zum Aminosaurestoff- wechsel herstellt. Im I-Iinbhck auf die sehr ahnliche Lokalisierung dieser Enzyme ist es bemerkenswert, dab die Aktivit/iten der GOT und diejenigen der Enzyme des Citrat-Cyclus bei den Mitochondrien verschiedener Gewebe in konstantem Verhaltnis zueinander stehen [25].

Die gilt nieht ffir die GLDIt, deren Aktivitat in keiner konstanten Proportion zu den Aktivit/tten der Citrat-Cyclus-Enzyme steht [25]. Naeh Pette [25] ist GOT Vertreter einer mitochondrialen ,,Normalfunktion", GLDI:[ hingegen Vertreter einer mitochondrialen ,,Spezialfunktion". Damit steht mSghcherweise in Zusammen- hang, dab GLDH im Gegensatz zu den Enzymen des Citrat-Cyelus and der GOT in der Matrix des Mitochondriums lokalisiert ist. Die Meinung yon Landriseina [26], dab GOT ebenso wie GLDI:[ in dcr Matrix lokalisiert sei, fund sich dutch unsere Versuche nicht bestKtigt. I~ach histologischen Befunden yon Lee [27] soll GOT yon I-Ierzmuskel-Mitochondrien in den Cristae, und zwar in der Membran, welche die Cristae yon der Matrix trennt, ]okalisiert sein. Aueh an den umhfi]lenden auBeren und inneren Membranen stellte er GOT-AktivitKt lest.

Andersartig ist die Bindung yon GPT, die zumindest teflweise in dem Intra- cristae-Raum der Mitochondrien ]okalisiert zu sein scheint. Zu diesem Unterschied zwischen GPT und GOT steht mSglicherweise die Tatsache in Beziehung, dub sich beide Enzyme in der Proportion ihrer Aktivitat gegenfiber der Aktivitat anderer Muskelenzyme betrachtlich unterscheiden [28]. Die spezifischen und veranderhehen Proportionen der GPT weisen auf eine spezifische Funktion dieses Enzyms im Ab- schnitt des Alaninstoffwechsels bin, wahrend die dem Cytochrom c-Gehalt vergleich- bare und nnveranderhche Proportion der GOT deren allgemeine Funktion im funda- mentalen System energetischer Transformationen erkennen laBt.

16

Im Einklang mit unseren Befunden steht die Beobaehtung yon Ziegler u. Lyrmane an Rinderherz-Mitochondrien [16], dab AC, MDH und LDH erst naeh Seh/~digung tier Mitoehondrienstruktur bestimmbar werden und im intakten Mitoehondrinm an Strukturen gebunden sind, w/~hrend die GLDH-Aktivit~t auch mit intakten 5iito- ehondrien nachweisbar ist.

Im Gegensatz zu allen iibrigen untersuehten Enzymen ist SDH lest in die Mite- chondrienstruktur integriert. Dies steht damit in Zusammenhang, dab das Flare- protein SDH in die Atmungskette eingebaut ist. Es sei bemerkt, dal3 isolierte Frag- mente yon Mitoehondrienmembranen (Leber) die Enzyme der gesamten Atmungs- kette enthalten, aber nieht den Citrat-Cyclus katalysieren, da die meisten Enzyme des Citrat-Cyclus nut locker an die Membranen gebunden sind und daher verh/~ltnis- m/~Big leieht in gelSster Form extrahier~ werden [29].

Was den Einflu$ des Gefrierens der Mitoehondrien betrifft, so ffihrt es zu einer mehr oder weniger ausgepr~gten Freisetzung aller untersuchten Enzyme. Nach Lusena [30, 31] werden Lebermitoehondrien dutch Gefrieren in zwei Stufen ge- sch/~digt: Eine Stufe erfolgt raseh und betrifft die Membranstrukturen des Mito- ehondriums, w~hrend die andere Stufe langsam vor sieh geht und eine Freisetzung yon Matrix-Enzymen zur Folge hat. Etwas fiberraschend ist die verh/~ltnismaBig geringe Freisetzung yon GOT dureh Gefrieren und Auftauen der Mitoehondrien; die bei Gefrieren und Auftauen yon Skeletmuskelgewebe zu beobaehtende Freisetzung yon mitoehondrialer GOT [1] l£Bt einen st~rkeren Effekt des Gefrierens und Auf- tauens erwarten. Es ist jedoeh mSglieh, dab die im Gewebe lokalisierten und gewisser- maBen fixierten Mitoehondrien dutch die mit der Eisbfldung verbundenen Ver/~nde- rungen st/~rker gesch/~digt werden als die in einer LSsung suspendierten Mitochondrien. Erw/~hnt sei in diesem Zusammenhang, dab Bhargava u. Sreenivasan [32] dutch Gefrieren und Auftauen yon Rattenleber-Mitochondrien eine sehr starke Zunahme der GOT-Aktivit/~t fanden, die sic einer Desintegration tier Mitoehondrienstruktur, wie sic auch dureh Triton-X-100 oder Besehallung erreieht wird, zusehrieben.

Unsere Resultate lassen nieht erkermen, an welehe Art yon Mitoehondrien- Membranen die Enzyme gebunden sind. Jedes Mitoehondrinm besteht aus einer umhiillenden ,,~uSeren" Membran und einer den inneren Raum (Matrix) ein- sehlieBenden ,,inneren" Membran. Im Matrixraum befindet sieh ferner eine variieren- de Zahl membranartiger Strukturen (Cristae), die entweder frei oder mit der inneren Membran verbunden sind [33, 34]. W/~hrend die Sehule yon D. E. Green der Auf- fassung ist, dab die Enzyme des Citrat-Cyclus in den Lebermitochondrien spezifisch mit der /~uBeren Membran assoziiert sind [35, 36], fanden Parsons u. a. [37] bei Mitoehondrien der Meersehweinehen-Leber dab MDH, AC, FU und SDH mit der inneren Membran in Zusammenhang stehen. Aueh Ernster u. Kuylenstierna [34] wider- spreehen der Meinung yon Green u. Mitarb. Sic sind wie Borst [21] und Woijtezak u. a. [38] der Ansicht, dab sieh diese Enzyme innerhalb der inneren Membran, also in der Matrix, befinden mit Ausnahme yon SDH, die in die innere Membran selbst integriert sein solh Gehen wit davon aus, alas GLDH in der Matrix lokalisiert ist, so spreehen unsere Ergebnisse an Muskelmitochondrien wegen tier st~rkeren Bindung dieser Enzyme nieht ffir eine Lokahsierung der Enzyme des Citrat-Cyelus in tier Matrix, also in jenem Kompartiment, in welehem sieh die GLDH befindet. Ernster u. Kuylenstierna [34] halten es ffir m6glich, dab Enzyme, die nach experimenteller Abl6sung der inneren nnd /~uBeren Membran als ,,15slich" gefunden werden, im intakten Mitoehondrinm an Membranen gebunden sind. Ubereinstimmend mit nnseren Befunden fanden Papa n. Francavilla [39], dab MDH in einem anderen Komparthnent des Mitoehondrinms lokalisiert ist als GLDIt, die nach Bremer u. a. [40] zu 91% im 15slichen Antefl des Mitochondrinms (Leber) vorliegt.

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Prof. Dr. Reiner Harem Dr. Ahmed A. E1-Badawi Luise Tetzlaff Inst. fiir Chemie und Physik der Bundesanst. ffir Fleischforsch. D-8650 Kulmbach Blaich 4

2 Z. Lebensmit t . -Untersuch. , Band 149