ANALYSE DER INOSIN-5'-MONOPHOSPHAT-DEHYDROGENASE-AKTIVITÄT UND DER

IMPDH1-GENEXPRESSION IN DEN LYMPHOZYTEN VON MYCOPHENOLAT-MOFETIL-

BEHANDELTEN NIERENPATIENTEN

Masterseminar – Marc Müller6. November 2013

1 Grundlagen 1.1 Anatomische Grundlagen und Aufgaben der Niere

1.2 Einblick in die aktuelle nephrologische Statistik Deutschlands

1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien

1.4 GMP-Synthese-Pathway humaner Zellen

2 Immundiagnostik der Inosin-5'-Monophosphat-Dehydrogenase (IMPDH) 2.1 IMPDH als Target immunsuppressiver Medikamente

2.2 Methodenentwicklung zur IMPDH-Aktivitätsmessung

3 Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens

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Inhalt

1.1 Anatomische Grundlagen und Aufgaben der Niere

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1 Grundlagen

Quelle: http://www.jameda.de/gesundheits-lexikon/bilder/

1.1 Anatomische Grundlagen und Aufgaben der Niere

Lokalisierung und Besonderheiten: Knapp unterhalb der Rippenbögen in Höhe des 12. Brustwirbels jeweils rechts und links Neben der Lunge einziges Organ in doppelter Ausführung Form einer Bohne mit Einbuchtung in der Mitte

Einmündung der Nierenarterie

Ausmündung der Nierenvene, Lymphgefäße und Harnleiter

physiologische Hauptaufgaben:Reinigung des Blutes von harnpflichtigen Substanzen: Harnsäure, Harnstoff, toxische Metabolite

(= glomeruläre Filtration)Regulation des Wasserhaushalts ↔ BlutdruckRegulation der ElektrolytkonzentrationenGluconeogenese Hormonsynthese → u.a. Erythropoetin, Renin und Calcitriol (Vitamin D)

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1 Grundlagen

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1.2 Einblick in die aktuelle nephrologische Statistik Deutschlands

Exemplarische Nephropathien

diabetische Nephropathie als Folge von Typ I und II - Diabtetes Glomerulonephritiden / Glomerulopathie (Autoimmunentzündung der Nieren) Tubulointerstitielle Nierenerkrankungen (bakteriell, viral oder toxisch) Fehlbildungen der Nierengefäße Tumore (Nierenzellkrazinom oder Onkozytom) …

1 Grundlagen

Datenquelle:

1.2 Einblick in die aktuelle nephrologische Statistik Deutschlands

Inzidenz: 210 neue Dialysepatienten pro 1 Million Einwohner ( ≈ 16900 bezogen auf deutsche Gesamtbevölkerung)

Häufigkeit einer starken Niereninsuffizienz (Stufe 5): 0,13 % der deutschen Gesamtbevölkerung einer von 1000 Bürgern

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1 Grundlagen

GFR = glomeruläre Filtrationsrate

Datenquelle:

1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien

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1 Grundlagen

Dialyse / Blutwäsche Nierentransplantation

Quelle: Fresenius Medical Care AG

1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien

Problematik: Potenzielle Transplantatabstoßung! → induziert durch Immunantwort beim Transplantat-Empfänger

Gefahr des Misserfolgs der Nierenersatztherapie

Potentielle Lebensgefährdung für den Transplantat-Empfänger

Lösung:

Rejektionsprophylaxe durch eine immunsuppressive medikamentöse Therapie

→ gezielte Down-Regulation des Immunsystems des Transplantat-Empfängers

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1 Grundlagen

Nierentransplantation

1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien

Wichtige immunsuppressive Medikamente

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1 Grundlagen

Azathioprin

Prodrug → Thiopurinmethyltransferase (TPMT) metabolisiert diese zu 6-Mercaptopurin

6-Mercaptopurin interferiert als atypisches Nukleosid mit der DNA-/RNA-Synthese

Inhibierung der Proliferation von B- und T-Lymphozyten

1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien

Wichtige immunsuppressive Medikamente

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1 Grundlagen

Calcineurin-Inhibitoren

z.B. Ciclosporin

Hemmung der Phosphatase Calcineurin

dephosphoryliert und aktiviert den T-Lymphozyten Transkriptionsfaktor NF-AT (nuclear factor of activated T cells)

Quelle: C.R.Kissinger et al. (1995). Crystal structures of human calcineurin and the human FKBP12-FK506-calcineurin complex.. Nature, 378, 641-644.

1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien

Wichtige immunsuppressive Medikamente

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1 Grundlagen

Mycophenolat-Mofetil (MMF)

Prodrug 2-Morpholinoethylester der Mycophenolsäure (MPA) selektiver, nicht-kompetitiver und reversibler Hemmer der

Inosinmonophosphat-Dehydrogenase (IMPDH) Greift in den Guanosinmonophosphat (GMP) – Stoffwechsel von B-

und T-Lymphozyten ein

aktiver immunsuppressiver Metabolit (MPA)

inaktive Prodrug (MMF)

1.4 GMP-Synthese-Pathway humaner Zellen

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1 Grundlagen

Quelle: http://www.uni-koeln.de/medfak/biochemie

2.1 IMPDH als Target immunsuppressiver Medikamente13

2 Immundiagnostik der Inosin-5'-Monophosphat-Dehydrogenase (IMPDH)

IMPDH-abhängige Oxidation von IMP zu

XMP

Angriffspunkt für immunsuppressive MMF-Therapie nach

einer NierentransplantationQuelle:

http://www.uni-koeln.de/medfak/biochemie

2.2 Methodenentwicklung zur IMPDH-Aktivitätsmessung

Methodenentwicklung zur quantitativen Analytik der katalytischen Restaktivität des Plasmaenzyms Inosinmonophosphat-Dehydrogenase (IMPDH) in peripherem Blut mittels RP-IP-HPLC nach Hemmung mit dem Immunsuppressivum Mycophenolat

RP-IP-HPLC = reversed-phase ion-pairing high perfomance liquid chromatography

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2 Immundiagnostik der Inosin-5'-Monophosphat-Dehydrogenase (IMPDH)

Quelle:chem.uft.uni-bremen.de

2.2 Methodenentwicklung zur IMPDH-Aktivitätsmessung

Prinzipielle Idee (keine Details! → Betriebsgeheimnis):

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2 Immundiagnostik der Inosin-5'-Monophosphat-Dehydrogenase (IMPDH)

Isolation der Lymphozyten-Fraktion aus

Patienten Vollblut

(Li-Heparin)

Zellaufschluss und

Enzymisolation

durch ein geeignetes

Inkubationsverfahren:IMPDH-

induzierter Umsatz des

Substrats IMP zum Produkt

XMP

Messung der Analyte mittels RP-IP-HPLC und

Berechnung der IMPDH-

Restaktivität

beim Menschen: zwei Gene welche für IMPDHs codieren (IMPDH-1 u. IMPDH-2)

mehrere Isoformen von IMPDH-1 bekannt → alternatives Splicing der mRNA!

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3 Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens

Quellen: Prosise GL, Luecke H (February 2003), Crystal structures of Tritrichomonasfoetus inosine monophosphate dehydrogenase in complex with substrate, cofactor and analogs: a structural basis for the random-in ordered-out kinetic mechanism

National Human Genome Research Institute

Ziel: Beitrag zur Beantwortung grundlegender Fragen zur Förderung der Verständnisses hinsichtlich IMPDH-Immundiagnostik Korrelation der IMPDH-Genexpressionsaktivität und IMPDH-Enzymaktivität Bezug zwischen Transkriptom und Proteom bei der IMPDH-

Immundiagnostik Inwiefern beeinflusst die MMF-Medikation die IMPDH-Genexpression und -

regulation …

Analyse mittels qRT-PCR = quantitativer reverse-Transkriptase Polymerase Kettenreaktion

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3 Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens

Analyse mittels qRT-PCR = quantitativer reverse-Transkriptase Polymerase Kettenreaktion

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3 Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens

Isolation des

Transkriptoms (mRNA)

Generierung von cDNA mittels RT

Amplifikation von

IMPDH-Gen-Transkripten durch das

Design geeigneter

Primer

Detektion und

Quantifizierung von

IMPDH-Gen-Transkripte

n

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