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Aufnahme, Metabolismus und Export von Arzneimitteln in der Leber:
tripel- und quadrupeltransfizierte Zelllinien zur Analyse funktioneller Interaktionen
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Christina Anna Fahrmayr
aus Schwaz (Österreich)
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 19.07.2012
Vorsitzender der Promotionskommission: Professor Dr. Rainer Fink
Erstberichterstatter: Professor Dr. Martin F. Fromm
Zweitberichterstatter: Professor Dr. Kristina Leuner
Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ................................................................................ V
1. Zusammenfassung ............................................................................... 1
2. Summary .............................................................................................. 7
3. Einleitung ........................................................................................... 11
3.1. Die Bedeutung von Enzymen und Transportproteinen für die Pharmakokinetik
von Arzneistoffen .................................................................................................. 11
3.2. Der hepatische Arzneistoffmetabolismus und -transport ...................................... 14
3.2.1. Aufnahmetransporter der SLC-Superfamilie ............................................... 17
3.2.1.1. Organic Anion Transporting Polypeptide 1B1 (OATP1B1) ............... 18
3.2.2. Metabolisierung ........................................................................................... 19
3.2.2.1. Cytochrom-P450-3A4 (CYP3A4) ......................................................... 21
3.2.2.2. UDP-Glucuronosyltransferase 1A1 (UGT1A1) .................................. 23
3.2.3. Effluxtransporter der ATP-binding cassette-Superfamilie .......................... 24
3.2.3.1. Multidrug Resistance Protein 2 (MRP2) .............................................. 25
3.3. Bedeutung von in vitro-Zellmodellen zur Beschreibung der Pharmakokinetik
von Arzneistoffen .................................................................................................. 27
3.4. Verwendete Substrate für Transportversuche ....................................................... 30
4. Fragestellungen und Ziele dieser Arbeit ......................................... 35
5. Material und Methoden .................................................................... 37
5.1. Materialien ............................................................................................................ 37
5.1.1. Chemikalien ................................................................................................. 37
5.1.2. [3H]- und [14C]-markierte Chemikalien für Transportversuche ................... 38
5.1.3. Reaktionssysteme (Kit Systeme) ................................................................. 39
5.1.4. Enzyme ........................................................................................................ 39
5.1.5. Zellen ........................................................................................................... 39
5.1.6. Antikörper .................................................................................................... 40
5.1.7. Spezifische Oligonukleotidprimer ............................................................... 40
5.1.8. Plasmide ....................................................................................................... 41
II Inhaltsverzeichnis
5.1.9. Geräte und Software ..................................................................................... 41
5.1.10. Verbrauchsmaterialien .................................................................................. 42
5.2. Zellkultivierung ..................................................................................................... 43
5.2.1. HEK293-Zellen (Human Embryonic Kidney Cells) .................................... 45
5.2.2. MDCKII-Zellen (Madin Darby Canine Kidney II Cells) ............................. 46
5.3. Klonierung der cDNAs kodierend für UGT1A1 und CYP3A4 ............................ 47
5.3.1. UGT1A1 ....................................................................................................... 47
5.3.2. CYP3A4 ....................................................................................................... 49
5.3.3. Analytische Plasmidpräparation ................................................................... 49
5.3.4. Präparative Plasmidpräparation .................................................................... 50
5.3.5. Konzentrations- und Reinheitsbestimmung ................................................. 50
5.3.6. Analyse von DNA mittels Agarosegelelektrophorese .................................. 51
5.3.7. Aufreinigung von DNA-Lösungen mittels Gelelution und Ultrafiltration ... 52
5.3.8. Mutagenese ................................................................................................... 52
5.4. Etablierung von UGT1A1 stabil exprimierenden Zelllinien ................................. 53
5.5. Etablierung von CYP3A4 stabil exprimierenden Zelllinien ................................. 55
5.6. Bestimmung der mikrosomalen Enzymaktivität ................................................... 56
5.6.1. Bestimmung der NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase-Aktivität ........ 56
5.6.2. Bestimmung der Cytochrom-P450-3A4-Aktivität ......................................... 57
5.6.3. Quantifizierung von 1`-Hydroxymidazolam mittels LC-MS/MS ................ 58
5.7. Methoden der RNA-Analytik ................................................................................ 59
5.7.1. Isolierung von Gesamt-RNA ........................................................................ 59
5.7.2. Synthese von sscDNA .................................................................................. 60
5.7.3. Quantitative Real-time PCR ......................................................................... 61
5.8. Methoden der Proteinanalytik ............................................................................... 63
5.8.1. Zellaufarbeitung ........................................................................................... 63
5.8.2. Quantifizierung des Gesamtproteingehaltes ................................................. 64
5.8.3. Vorbehandlung der Proben für die SDS-Polyacrylamid-gelelektrophorese 64
5.8.4. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) ................................... 65
5.8.5. Immunblotanalyse ........................................................................................ 67
5.8.6. Entfernen von Antikörpern ........................................................................... 70
5.8.7. Densitometrische Auswertung...................................................................... 70
5.9. Transportversuche ................................................................................................. 71
5.9.1. Aufnahmeversuche ....................................................................................... 71
Inhaltsverzeichnis III
5.9.1.1. Aussaat und Induktion der Zellen ........................................................ 71
5.9.1.2. Versuchsdurchführung ......................................................................... 72
5.9.2. Transzelluläre Transportversuche ................................................................ 73
5.9.2.1. Aussaat und Induktion der Zellen ........................................................ 75
5.9.2.2. Versuchsdurchführung ......................................................................... 76
5.9.2.3. Flüssigkeitsszintillationszählung ......................................................... 78
5.9.2.4. Quantifizierung von Ezetimib und Ezetimib-Glucuronid mittels
LC-MS/MS .......................................................................................... 79
5.9.2.5. Bestimmung von Bosentan, dessen Phase-I-Metaboliten und
Bosentan-Glucuronid mittels HPLC gekoppelt mit Radiodetektor
und LC-MS .......................................................................................... 80
5.9.2.5.1. HPLC-Methode ................................................................................. 80
5.9.2.5.2. LC-MS-Methode ............................................................................... 81
5.10. Statistische Analyse .............................................................................................. 82
6. Ergebnisse .......................................................................................... 83
6.1. Identifizierung von Ezetimib, Etoposid und deren Metaboliten als Substrate von
MRP2 mittels einer OATP1B1-UGT1A1-MRP2 tripeltransfizierten MDCKII-
Zelllinie ................................................................................................................. 83
6.1.1. Etablierung und Charakterisierung einer MDCKII-Zelllinie, welche stabil
den Aufnahmetransporter OATP1B1, das Phase-II-Enzym UGT1A1 und
die Exportpumpe MRP2 exprimiert ............................................................. 83
6.1.2. Untersuchung zum Metabolismus und transzellulären Transport von
Ezetimib........................................................................................................ 87
6.1.3. Identifizierung von Etoposid als Substrat von OATP1B1 ........................... 94
6.1.4. Untersuchungen zum Metabolismus und transzellulären Transport von
Etoposid ........................................................................................................ 96
6.2. Identifizierung von Bosentan und dessen Metaboliten als Substrate von MRP2
mittels einer OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1-MRP2 quadrupeltransfizierten
MDCKII-Zelllinie ................................................................................................. 99
6.2.1. Etablierung und Charakterisierung einer MDCKII-Zelllinie, welche
stabil den Aufnahmetransporter OATP1B1, das Phase-I-Enzym
CYP3A4, das Phase-II-Enzym UGT1A1 und die Exportpumpe MRP2
exprimiert ..................................................................................................... 99
IV Inhaltsverzeichnis
6.2.2. Untersuchungen zur Bestimmung der mikrosomalen Enzymaktivität ....... 104
6.2.2.1. Bestimmung der NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase-
Aktivität .............................................................................................. 104
6.2.2.2. Bestimmung der Cytochrom-P450-3A4-Aktivität ............................... 105
6.2.3. Untersuchungen zum Metabolismus und transzellulärem Transport von
Bosentan ...................................................................................................... 107
7. Diskussion ......................................................................................... 113
7.1. Identifizierung von Ezetimib, Etoposid und deren Metaboliten als Substrate
von MRP2 mittels einer OATP1B1-UGT1A1-MRP2 tripeltransfizierten
MDCKII-Zelllinie ................................................................................................ 113
7.2. Identifizierung von Bosentan und dessen Metaboliten als Substrate von MRP2
mittels einer OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1-MRP2 quadrupeltransfizierten
MDCKII-Zelllinie ................................................................................................ 119
Literaturverzeichnis .................................................................................. 125
Veröffentlichungen .................................................................................... 157
Danksagung ................................................................................................ 159
Abkürzungsverzeichnis V
Abkürzungsverzeichnis
ABC ATP-binding cassette
ABCC2 Genbezeichnung für den MRP2-Transporter
AK Antikörper
ANOVA one-way analysis of variance
APS Ammoniumperoxodisulfat
ASBT Apical Sodium-dependent Bile Acid Transporter
ATP Adenosin-5`-triphosphat
AUC area under the plasma concentration time curve
BCA bicinchoninic acid
BCRP Breast Cancer Resistance Protein
Bcrp rodent Breast cancer resistance protein
BSEP Bile Salt Export Pump
Bsep rodent Bile salt export pump
BSP Sulfobromophthalein
CaCl2 Calciumchlorid
cDNA complementary desoxyribonucleic acid
CHO Chinese Hamster Ovary
COMT Catechol-O-Methyltransferase
cMOAT canalicular Multi-specific Organic Anion-Transporter
cMRP canalicular Multidrug Resistance Protein
cpm counts per minute
CT cycle threshold
CYP Cytochrom-P450
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat
D-PBS Dulbecco`s Phosphate Buffered Saline
DTT Dithiothreitol
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamin-N,N,N`,N`-tetraacetat
EMA European Medicines Agency
VI Abkürzungsverzeichnis
FDA U.S. Food and Drug Administration
G418 Geneticin
HCl Salzsäure
HEK293 Human Embryonic Kidney 293
HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N`-2-ethansulfonsäure
HMG-CoA Hydroxymethylglutaryl-Coenzym A
HPLC high performance liquid chromatography
HRP horseradish peroxidase
HUSAR Heidelberg Unix Sequence Analysis Resources
IgG Immunglobulin G
K2HPO4 di-Kaliumhydrogenphosphat
kb Kilobasen
KCl Kaliumchlorid
Km Michaelis-Menten-Konstante
LB lysogenic broth
LC liquid chromatography
LLOQ lower limit of quantification (untere Bestimmungsgrenze)
LSC liquid scintillation counting
LST1 Liver-specific Transporter 1
MCT Monocarboxylate Transporter
MDCK Madin Darby Canine Kidney
MDR Multidrug Resistance
MEM Minimal Essential Medium
MgCl2 Magnesiumchlorid
MgSO4 Magnesiumsulfat
mRNA messenger ribonucleic acid
MRP Multidrug Resistance Protein
Mrp rodent Multidrug resistance protein
MS mass spectrometry
NaCl Natriumchlorid
NaOH Natriumhydroxid
NTCP Na+/Taurocholate Cotransporting Polypeptide
NTCs no template controls
OAT Organic Anion Transporter
Abkürzungsverzeichnis VII
OATP Organic Anion Transporting Polypeptide
OCT Organic Cation Transporter
OD Optische Dichte
p p-Wert, Irrtumswahrscheinlichkeit
PBS phosphate buffered saline
PBST phosphate buffered saline tween
PCR polymerase chain reaction
PEPT Peptide Transporter
qRT-PCR quantitative Real-Time PCR
RNA Ribonukleinsäure
rpm revolutions per minute
RT Raumtemperatur
S.E.M. standard error of the mean
SDS Sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
SLC Solute-Carrier
SLCO Genbezeichnung für die OATP-Familie
sscDNA single-stranded complementary DNA
TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer
TEMED Tetramethylethylendiamin
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminoethan
UGT Uridin-5`-diphosphat-Glucuronosyltransferase, UDP-
Glucuronosyltransferse
v/v volume in volume
VK Vektorkontrolle
Vmax maximale Transportgeschwindigkeit
w/v weight in volume
X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid
ZNS Zentrales Nervensystem
Zusammenfassung 1
1. Zusammenfassung
Während man bereits die Bedeutung metabolisierender Enzyme für die Pharmakokinetik
eines Arzneistoffs gut untersucht und klar belegt hatte, vertrat man bis vor wenigen Jahren
noch die Meinung, dass die Membranpermeabilität eines Arzneistoffs hauptsächlich durch
dessen physikochemische Eigenschaften beeinflusst wird und dass Arzneistoffe
überwiegend durch passive Diffusion Membranbarrieren überwinden. Inzwischen hat man
allerdings erkannt, dass spezifische Transportproteine in Plasmamembranen die Aufnahme
eines Arzneistoffs in eine Zelle sowie seine Sekretion aus der Zelle vermitteln und somit
von entscheidender Bedeutung für die Resorption, die Verteilung und die Elimination eines
Arzneistoffs sein können. Diese Membranproteine werden entsprechend ihrer Funktion als
Aufnahme- oder Effluxtransporter bezeichnet. Die gleichzeitige Lokalisation von
Aufnahmetransportern in der basolateralen Membran (die der Basallamina zugewandte
Seite) sowie von Effluxtransportern in der apikalen Membran (die einem Lumen
zugewandte Seite) einer polarisierten Zelle ermöglicht zudem einen gerichteten
Stofftransport durch diese physiologische Barriere.
Zur Untersuchung einer transportervermittelten Aufnahme von Arzneistoffen in vitro
dienen Zellsysteme, welche nach Transfektion mit der cDNA des untersuchten
Transporters das Transportprotein überexprimieren. Weisen diese Zellsysteme bei
Inkubation mit einem Arzneistoff im Vergleich zu einer Kontrollzelllinie eine signifikant
stärkere Aufnahme des Arzneistoffs auf, so handelt es sich bei dem untersuchten
Arzneistoff um ein Substrat des Transporters. Des Weiteren war es bislang mit
entsprechenden Zellsystemen, welche sowohl Aufnahme- als auch Effluxtransporter
exprimieren, möglich, einen gerichteten Stofftransport in vitro zu untersuchen. Ohne
Beachtung blieb dabei bislang allerdings die Untersuchung des Zusammenspiels von
Transportproteinen mit metabolisierenden Enzymen wie beispielsweise Cytochrom-P450-
Enzymen oder Transferasen. Da in vivo aber häufig beide Vorgänge für die
Pharmakokinetik eines Arzneistoffs von Bedeutung sind, sie sich gegenseitig in ihrer
Kinetik beeinflussen können und oft erst Arzneistoffmetaboliten gute Substrate für
Effluxtransporter darstellen, sollte in der vorliegenden Arbeit zunächst geklärt werden, ob
es möglich ist, ein entsprechendes Zellmodell mit der parallelen, stabilen Expression von
Transportproteinen und metabolisierenden Enzymen zu etablieren. Als Vorbild für dieses
2 Zusammenfassung
vereinfachte Zellmodell sollte die für die Metabolisierung von Arzneistoffen bedeutendste
Zellgruppe der Hepatozyten dienen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher zunächst eine tripeltransfizierte MDCKII-Zelllinie,
welche den hepatischen Aufnahmetransporter OATP1B1 (Organic Anion Transporting
Polypeptide 1B1), das Phase-II-Enzym UGT1A1 (UDP-Glucuronosyltransferase 1A1)
sowie den an der kanalikulären Membran lokalisierten Effluxtransporter MRP2 (Multidrug
Resistance Protein 2) parallel exprimiert, etabliert und charakterisiert. Dabei wurde
bewusst zunächst ein Phase-II-Enzym ausgewählt, da Arzneistoffe durchaus ohne Phase-I-
Metabolismus einer direkten Konjugation unterliegen können, und Konjugate, nicht aber
Phase-I-Metaboliten, Substrate des Effluxtransporters MRP2 darstellen. Als Kontrollen
dienten mehrere Zelllinien, welche keines (MDCKII-VK), eines (MDCKII-OATP1B1)
oder zwei (MDCKII-OATP1B1-UGT1A1, MDCKII-OATP1B1-MRP2) der untersuchten
Proteine stabil exprimierten. Die durchgeführten Untersuchungen zur mRNA-Expression
der kodierenden Gene und zur Expression der entsprechenden Proteine zeigten, dass nur in
Zelllinien, welche mit der jeweiligen cDNA transfiziert wurden, auch eine entsprechende
Proteinexpression zu detektieren war. Zudem korrelierten die Ergebnisse der mRNA-
Expression sehr gut mit denjenigen der Proteinexpression und signifikante Unterschiede
konnten nur in der Expression von UGT1A1 zwischen der tripeltransfizierten Zelllinie und
der OATP1B1-UGT1A1 doppelttransfizierten Zelllinie detektiert werden.
Zur Überprüfung der Funktionalität der untersuchten Zelllinien dienten der
Cholesterolsenker Ezetimib und das Zytostatikum Etoposid. Bislang konnte für beide
Arzneistoffe eine Beteiligung von UGT1A1 an ihrer Glucuronidierung und für Ezetimib
eine Interaktion mit dem Aufnahmetransporter OATP1B1 nachgewiesen werden. Eine
Aufnahme von Etoposid mittels hepatischer OATPs war bislang unbekannt und ein MRP2-
vermittelter Export beider Arzneistoff-Glucuronide wurde zwar diskutiert, beide
Glucuronide wurden aber nicht abschließend an einem geeigneten in vitro-Modell direkt als
Substrate von MRP2 nachgewiesen.
Transzelluläre Transportversuche mit tritiummarkiertem Ezetimib ließen eine signifikant
verminderte intrazelluläre Akkumulation von Ezetimibäquivalenten (Ezetimib und
Ezetimib-Glucuronid) und eine signifikant erhöhte Akkumulation von
Ezetimibäquivalenten im apikalen Kompartiment der tripeltransfizierten Zelllinie im
Vergleich zu den Kontrollzelllinien erkennen. Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten
stieg auch die Radioaktivität im apikalen Kompartiment der OATP1B1-UGT1A1
doppelttransfizierten Zelllinie signifikant im Vergleich zu den restlichen Kontrollzelllinien
Zusammenfassung 3
an. Dies deutete darauf hin, dass vor allem intrazellulär gebildetes Ezetimib-Glucuronid in
das apikale Kompartiment der UGT1A1-exprimierenden Zelllinien transportiert wird.
Um diese Schlussfolgerung zu überprüfen, wurden analog zu den transzellulären
Transportversuchen mit tritiummarkiertem Ezetimib Versuche mit unmarkiertem Substrat
durchgeführt und die Menge an freiem Ezetimib und an gebildetem Ezetimib-Glucuronid
mittels einer LC-MS/MS-Methode quantifiziert. Hierbei zeigte sich, dass Ezetimib selbst
nur ein sehr schlechtes Substrat des Effluxtransporters MRP2 darstellt, da insgesamt nur
vergleichsweise geringe Mengen an freiem Ezetimib in den apikalen Kompartimenten
wiederzufinden waren. Weiterhin wurde sowohl im apikalen als auch im intrazellulären
Kompartiment der tripeltransfizierten Zelllinie signifikant weniger freies Ezetimib im
Vergleich zu den Kontrollzelllinien detektiert. Nach einer Inkubationszeit von 60 Minuten
nahm auch die intrazelluläre Konzentration von Ezetimib in der OATP1B1-UGT1A1
doppelttransfizierten Zelllinie im Vergleich zu den übrigen Kontrollzelllinien signifikant
ab. Bei beiden Zelllinien war dies auf eine Umsetzung von Ezetimib zum Ezetimib-
Glucuronid und auf einen Transport des gebildeten Glucuronids in das apikale
Kompartiment zurückzuführen. So konnte im apikalen Kompartiment beider Zelllinien
gebildetes Ezetimib-Glucuronid nachgewiesen werden, wobei die tripeltransfizierte
Zelllinie signifikant größere Mengen des Glucuronids auch nach Normalisierung der
Ergebnisse auf die unterschiedliche UGT1A1-Expression der beiden Zelllinien aufwies.
Daraus ließ sich schließen, dass nicht die signifikant höhere UGT1A1-Expression in der
tripeltransfizierten Zelllinie für die stärkere Translokation des Glucuronids in das apikale
Kompartiment dieser Zelllinie verantwortlich war, sondern die Überexpression des
humanen MRP2-Transporters. Im Falle der OATP1B1-UGT1A1 doppelttransfizierten
Zelllinie lässt sich die vorhandene, aber im Vergleich zur tripeltransfizierten Zelllinie
geringere Translokation des Glucuronids in das apikale Kompartiment der Zelllinie durch
die endogene Expression des Mrp2-Transporters in den MDCKII-Zellen erklären.
Abschließend ist davon auszugehen, dass nur das koordinierte Zusammenspiel des Phase-
II-Enzyms UGT1A1 und des Effluxtransporters MRP2 eine effektive Elimination von
Ezetimib vermitteln kann.
Nachfolgend sollte mithilfe der etablierten Zelllinien der Transport und Metabolismus des
Arzneistoffs Etoposid untersucht werden. Hierfür wurde Etoposid zuvor erstmals mittels
Aufnahmeversuche an stabil transfizierten HEK293-Zellen (HEK293-OATP1B1/-1B3/-
2B1) als Substrat der beiden hepatischen Aufnahmetransporter OATP1B1 (Km-Wert:
42,2 µM) und OATP2B1 identifiziert. Transzelluläre Transportversuche an der neu
4 Zusammenfassung
etablierten Zelllinie und den Kontrollzelllinien ergaben allerdings erstaunlicherweise keine
signifikanten Unterschiede in der intrazellulären Akkumulation von Etoposidäquivalenten
(Etoposid und Etoposid-Glucuronid) zwischen der Vektorkontrollzelllinie und der
OATP1B1 einzeltransfizierten Zelllinie. Dieses Ergebnis könnte auf einen
Auswärtstransport von Etoposid mittels endogen an der basolateralen Membran der
MDCKII-Zellen lokalisierter Transporter (z.B. Mrp3) zurückzuführen sein.
Des Weiteren ergaben die durchgeführten transzellulären Transportversuche eine
signifikant stärkere Akkumulation von Etoposidäquivalenten in den apikalen
Kompartimenten der tripeltransfizierten Zelllinie und der OATP1B1-MRP2
doppelttransfizierten Zelllinie im Vergleich zu den restlichen Kontrollzelllinien. Dies
bestätigte den aus einer früheren Studie gezogenen Schluss, dass Etoposid offensichtlich
auch ohne Konjugation ein Substrat des Effluxtransporters MRP2 ist. Obwohl der
Effluxtransporter MRP2 vor allem Glutathion- und Glucuronid-Konjugate transportiert,
konnte bereits eine MRP2-vermittelte Resistenz gegenüber den Chemotherapeutika
Vincristin, Vinblastin und Etoposid in Abhängigkeit von Glutathion gezeigt werden.
Zudem wurde bereits ein Cotransport von Arzneistoffen mit Glutathion mittels der
Effluxtransporter MRP1 und MRP4 beschrieben, was auf einen weiteren übergreifenden
Transportmechanismus der MRP-Transporterfamilie hinweist. Daher ist der Transport von
unkonjugiertem Etoposid im vorliegenden Fall am wahrscheinlichsten auf einen
Cotransport mit Glutathion zurückzuführen.
Inwieweit die tripeltransfizierte Zelllinie auch ein gebildetes Etoposid-Glucuronid in das
apikale Kompartiment transportiert, müsste analog zu den bereits vorgestellten Versuchen
mit unmarkiertem Substrat und einer LC-MS/MS-Methode zur Ermittlung des Anteils an
freiem und glucuronidiertem Etoposid untersucht werden.
Als Weiterführung sollte getestet werden, ob es mit einem entsprechenden Zellmodell
möglich ist, alle vier Phasen (Aufnahme, Phase-I-Metabolisierung, Phase-II-
Metabolisierung und Export) der hepatischen Elimination eines Arzneistoffs in vitro
untersuchen zu können. Hierfür wurde das etablierte tripeltransfizierte Zellmodell um ein
Phase-I-Enzym aus der Superfamilie der Cytochrom-P450-Enzyme (CYP3A4) erweitert.
Hierbei stand zunächst wieder die Frage im Vordergrund, ob eine Etablierung einer
MDCKII-Zelllinie mit der parallelen, stabilen Expression des Aufnahmetransporters
OATP1B1, des Phase-I-Enzyms CYP3A4, des Phase-II-Enzyms UGT1A1 und des
Effluxtransporters MRP2 durchführbar ist.
Zusammenfassung 5
Vor der stabilen Transfektion von CYP3A4 wurde mittels eines Reduktase-Assays in den
zur Transfektion dienenden Ausgangszelllinien eine Aktivität der NADPH-Cytochrom-
P450-Oxidoreduktase, welche für die Aktivität der Cytochrom-P450-Enzyme notwendig ist,
nachgewiesen. Als Kontrollzelllinien fanden in diesem Teil der Arbeit MDCKII-Zelllinien
mit der stabilen Expression keines (MDCKII-VK), eines (MDCKII-OATP1B1), zweier
(MDCKII-OATP1B1-MRP2) oder dreier (MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1,
MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2, MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-MRP2) Proteine
Verwendung. Die Untersuchungen zur mRNA-Expression der kodierenden Gene und zur
Expression der Proteine ergaben wiederum nur eine entsprechende Expression in
transfizierten Zelllinien. Insgesamt korrelierten auch hier die Daten zur mRNA- und
Proteinexpression mit Ausnahme der Expression von SLCO1B1/OATP1B1 in der
einzeltransfizierten und von ABCC2/MRP2 in der doppelttransfizierten Zelllinie. Deutliche
Unterschiede in der Expression der einzelnen Proteine innerhalb der verschiedenen
Zelllinien ergaben sich für die Expression von OATP1B1 in der einzeltransfizierten
Zelllinie, von CYP3A4 in der OATP1B1-CYP3A4-MRP2 und von UGT1A1 in der
OATP1B1-UGT1A1-MRP2 tripeltransfizierten Zelllinie.
Die Funktionalität von CYP3A4 wurde über die Umsetzung von Midazolam zum
1`-Hydroxymidazolam untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass nur Zelllinien mit
der Expression von CYP3A4 eine entsprechende Metabolisierung aufwiesen, wobei die
OATP1B1-CYP3A4-MRP2 tripeltransfizierte Zelllinie den geringsten Umsatz aufgrund
der geringeren Expression von CYP3A4 zeigte.
Analog zu dem bereits vorgestellten Projekt wurde auch hier abschließend mittels
transzellulärer Transportversuche die Funktionalität der neu etablierten Zelllinie untersucht.
Als Substrat diente dafür der Endothelinrezeptor-Antagonist Bosentan, dessen Phase-II-
Metabolismus und hepatische Sekretion nur unzureichend aufgeklärt ist. Die hepatische
Aufnahme von Bosentan mittels OATP1B1 und die Metabolisierung von Bosentan zu drei
Phase-I-Metaboliten (Hydroxy-, Phenol-, Hydroxyphenol-Metabolit) mittels der
Cytochrom-P450-Enzyme 3A4 und 2C9 ist hingegen hinreichend untersucht worden.
In diesen Transportversuchen konnte eine signifikant niedrigere Akkumulation von
Bosentanäquivalenten im intrazellulären Kompartiment und eine signifikant höhere
Akkumulation von Bosentanäquivalenten im apikalen Kompartiment von Zelllinien mit
einer Expression von MRP2 im Vergleich zu Zelllinien ohne diesen Transporter ermittelt
werden. Dies wies bereits darauf hin, dass Bosentan ein Substrat des MRP2-Transporters
sein könnte. In einer Kooperation mit der Firma Actelion Pharmaceuticals Ltd konnte der
6 Zusammenfassung
Metabolismus und Export von Bosentan genauer aufgeklärt werden. Proben aus
transzellulären Transportversuchen mit radioaktiv markiertem Bosentan wurden mittels
HPLC und LC-MS untersucht und ergaben, dass vor allem freies Bosentan in den
intrazellulären und apikalen Kompartimenten der Zelllinien akkumuliert. Somit konnte
zum ersten Mal gezeigt werden, dass Bosentan in vitro ein Substrat des Effluxtransporters
MRP2 ist. Wie bereits für Etoposid angenommen, erscheint auch für Bosentan ein
Cotransport mit Glutathion über MRP2 wahrscheinlich.
Mittels Strukturaufklärungsanalysen konnte des Weiteren ein direktes Glucuronid von
Bosentan in den intrazellulären Kompartimenten der UGT1A1-exprimierenden Zelllinien
und in den apikalen Kompartimenten der UGT1A1-MRP2-exprimierenden Zelllinien
nachgewiesen werden. Weiterhin wurden geringe intrazelluläre Mengen der Hydroxy- und
Phenol-Metaboliten von Bosentan in den CYP3A4-exprimierenden Zelllinien detektiert.
Glucuronide der Phase-I-Metaboliten konnten im Rahmen dieser Untersuchungen nicht
nachgewiesen werden, wahrscheinlich aufgrund der geringen Umsetzung von Bosentan zu
den Phase-I-Metaboliten. Weiterführende Untersuchungen müssen nun klären, ob
Änderungen an den Versuchsbedingungen zu einer vermehrten Bildung von Phase-I- und
Phase-II-Metaboliten führen und ob dann auch ein vermehrter MRP2-vermittelter
Transport dieser Metaboliten detektierbar ist oder ob auch andere UGT-Isoformen und
Effluxtransporter an der biliären Elimination von Bosentan beteiligt sind.
Zusammenfassend kann zunächst festgehalten werden, dass die Etablierung und
Charakterisierung von funktionell aktiven, mehrfachtransfizierten Zellsystemen mit der
parallelen, stabilen Expression von Transportproteinen und metabolisierenden Enzymen im
Rahmen der vorliegenden Arbeit gelungen ist. Des Weiteren ließ sich mittels der
durchgeführten transzellulären Transportversuche mit den Arzneistoffen Ezetimib,
Etoposid und Bosentan zeigen, dass sich das Zusammenspiel zwischen Arzneistofftransport
und -metabolismus mithilfe der neu etablierten, mehrfachtransfizierten Zelllinien in vitro
gut untersuchen lässt. Daraus lässt sich schließen, dass solche mehrfachtransfizierten
Zellsysteme, neben anderen in vitro-Modellen, Tiermodellen und klinischen Studien in
Zukunft einen Beitrag zum besseren Verständnis der Pharmakokinetik eines Arzneistoffs
liefern können.
Summary 7
2. Summary
It is commonly accepted that metabolizing enzymes play an important role for the
pharmacokinetics of a prescribed drug substrate. A few years ago it was still assumed that
only the physicochemical characteristics of a drug are decisive for its membrane
permeability. However, it has been recognized in the last years that specific membrane
proteins mediate the uptake of drugs into and their efflux out of cells thus affecting
absorption, distribution and elimination of a given drug substrate. Due to the simultaneous
localization of these transport proteins in the basolateral (facing the basal lamina) and in
the apical (facing the luminal surface) membrane of polarized cells a directed transport of
drug substrates occurs through this physiological barrier.
To investigate the transporter-mediated uptake of drugs in vitro, cell lines expressing the
investigated transport protein are used. If these cell lines show in comparison to control cell
lines a significantly higher uptake of a drug, the investigated drug is a substrate of the
transport protein. Furthermore, a directed transport of a drug could be investigated so far
using cell lines stably expressing uptake as well as efflux transporters. However, in vivo the
coordinate function of transport proteins and metabolizing enzymes is a crucial determinant
for the pharmacokinetics of a given drug.
Therefore, the first part of this thesis was to investigate if it is possible to establish a cell
line stably expressing a hepatic uptake and efflux transporter as well as a hepatic phase II
metabolizing enzyme. A MDCKII cell line with the simultaneous expression of the
basolateral localized uptake transporter OATP1B1 (Organic Anion Transporting
Polypeptide 1B1), the phase-II-enzyme UGT1A1 (UDP-Glucuronosyltransferase 1A1) and
the canalicular localized efflux transporter MRP2 (Multidrug Resistance Protein 2) was
therefore established and characterized. The transfection with a phase II enzyme was
chosen consciously because drugs can undergo a phase II metabolism without prior phase I
metabolism and because drug conjugates but not phase I metabolites are substrates of the
efflux transporter MRP2. Several cell lines with the expression of none (MDCKII-VK),
one (MDCKII-OATP1B1) or two (MDCKII-OATP1B1-UGT1A1, MDCKII-OATP1B1-
MRP2) proteins served as control cells. Messenger RNA and protein expression analyses
demonstrated that only transfected cell lines showed a respective expression and that just
the expression of UGT1A1 differed significantly between the expressing OATP1B1-
UGT1A1 double-transfected and the triple-transfected MDCKII cell line.
8 Summary
The functionality of the established cell lines was investigated using the cholesterol-
lowering drug ezetimibe and the anticancer agent etoposide in transcellular transport
assays. A contribution of UGT1A1 to the glucuronidation of both drugs has already been
described as well as an interaction of ezetimibe with the uptake transporter OATP1B1. In
contrast, the uptake of etoposide via hepatic OATPs has not been investigated so far and a
possible MRP2-mediated elimination of both drug glucuronides has been discussed but
both glucuronides were not been proven directly in a suitable in vitro cell model as
substrates of MRP2.
Transcellular transport studies with radiolabeled ezetimibe and subsequent experiments
with unlabeled ezetimibe revealed that ezetimibe itself is, if at all, a rather poor substrate of
MRP2, whereas ezetimibe glucuronide could be identified as substrate of this efflux
transporter.
Subsequently, the metabolism and transport of etoposide was investigated in transcellular
transport experiments using radiolabeled etoposide. For this purpose etoposide was firstly
tested as substrate of OATP1B1 (Km value: 42.2 µM) and OATP2B1 in uptake experiments
using stably transfected HEK293 cells. In transcellular transport assays, however, no
significant differences in the intracellular accumulation of etoposide equivalents (i.e.
etoposide plus etoposide glucuronide) could be observed between the control cell line and
the OATP1B1 single-transfected cell line. This result could be due to a back extrusion of
etoposide to the basolateral compartment mediated by endogenous efflux transporters (e.g.
Mrp3) localized in the basolateral membrane of MDCKII cells.
Furthermore, transcellular transport experiments revealed a significant accumulation of
etoposide equivalents in the apical compartments of the OATP1B1-MRP2 double-
transfected and of the triple-transfected cell line compared to the remaining cell lines.
These results confirmed the conclusion drawn from a former study that etoposide itself is a
substrate of MRP2. Although MRP2 is known as a transporter for glutathione and
glucuronide conjugates a MRP2-mediated resistance against the anticancer agents
vincristine, vinblastine and etoposide in dependency of glutathione has already been
shown. Moreover, a cotransport of endogenous compounds and drugs with glutathione
mediated by MRP1 and MRP4 has already been described indicating a further, common
transport mechanism of the MRP transporter family. Thus, the MRP2-mediated transport of
unconjugated etoposide in this case could probably also be due to a cotransport with
glutathione. If also etoposide glucuronide is transported into the apical compartment of the
triple-transfected cell line, has to be investigated in further transport experiments.
Summary 9
To enable the investigation of all four phases (uptake, phase-I-metabolism, phase-II-
metabolism and export) during the hepatic elimination of a drug, the newly established
triple-transfected cell line has been extended by the cytochrome P450 enzyme CYP3A4. In
this part of the thesis priority was initially given to the question of the feasibility of
generating such a cell system. Prior to transfection with the CYP3A4 cDNA NADPH-
cytochrome-P450-oxidoreductase activity which is crucial for the activity of cytochrome-
P450-enzymes was determined in the relevant cell lines.
Several cell lines expressing none (MDCKII-VK), one (MDCKII-OATP1B1), two
(MDCKII-OATP1B1-MRP2) or three (MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1, MDCKII-
OATP1B1-CYP3A4-MRP2, MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-MRP2) of the investigated
proteins were used as control cells in all experiments. Messenger RNA and protein
expression analyses revealed an expression of the respective cDNAs and proteins only in
transfected cell lines. Considerable differences in protein expression between the different
cell lines were detected for the expression of OATP1B1 in the single-transfected cell line,
of CYP3A4 in the OATP1B1-CYP3A4-MRP2 and of UGT1A1 in the OATP1B1-
UGT1A1-MRP2 triple-transfected cell line.
After selection, the functionality of CYP3A4 in the cell lines was determined via the
CYP3A-mediated metabolism of midazolam to 1`-hydroxymidazolam. These experiments
demonstrated that only CYP3A4-expressing cell lines were able to form the phase I
metabolite and that the OATP1B1-CYP3A4-MRP2 triple-transfected cell line showed the
lowest transformation due to the lowest expression of CYP3A4.
Finally, the functionality of the newly established cell line was investigated in transcellular
transport experiments using radiolabeled bosentan, a dual endothelin receptor antagonist, as
substrate. The hepatic uptake of bosentan via OATP1B1 and its subsequent metabolism via
CYP3A4 and CYP2C9 to three phase I metabolites (hydroxy-, phenol-, hydroxyphenol-
metabolite) have been elucidated already. Direct glucuronidation of bosentan and phase I
metabolites has previously been shown in human hepatocytes. However, the UGT isoform
mediating these processes and the relevant efflux transporter(s) for the export of formed
metabolites and/or parent compound could not be identified so far.
Transcellular transport experiments with radiolabeled bosentan revealed a significantly
lower accumulation of bosentan equivalents (i.e. bosentan and possible bosentan
metabolites) in the intracellular compartments and a significantly higher accumulation of
bosentan equivalents in the apical compartments of cell lines expressing MRP2 in
comparison to cell lines lacking this transporter. Thus, it could be assumed that bosentan
10 Summary
itself is a substrate of MRP2. In cooperation with Actelion Pharmaceuticals Ltd the
metabolism and export of bosentan could be clarified in more detail. Samples from
transcellular transport experiments were measured via HPLC and LC-MS and exhibited
mainly bosentan in the intracellular and apical compartments of the cell lines. Thus,
bosentan itself could be identified for the first time as substrate of the efflux transporter
MRP2 in vitro. As supposed for etoposide, a cotransport of bosentan with glutathione
seems to be a plausible explanation for MRP2-mediated transport of unconjugated
compounds.
In the intracellular compartments of UGT1A1-expressing cell lines and in the apical
compartments of UGT1A1-MRP2-expressing cell lines small amounts of a direct bosentan
glucuronide could be detected. Furthermore, also small intracellular amounts of the
hydroxy- and the phenol-metabolite were found in CYP3A4-expressing cell lines.
Glucuronides of the phase I metabolites could not be detected in these experiments possibly
due to a rather poor formation of phase I metabolites. Further investigations are necessary
to clarify, if altered experimental conditions can improve the formation of phase-I- and
possibly also of phase II metabolites and if an increased MRP2-mediated transport of these
metabolites can be detected then or if other UGT isoforms and efflux transporters are also
involved in the biliary elimination of bosentan and formed metabolites.
Taken together, the establishment and characterization of functional active, multiple-
transfected cell lines with the simultaneous expression of transport proteins and
metabolizing enzymes has been successful. Furthermore, transcellular transport
experiments using the drugs ezetimibe, etoposide and bosentan demonstrated that these
newly established cell lines are useful tools to investigate the interplay between drug
transport and metabolism. Therefore, it can be concluded that these multiple-transfected
cell lines besides other in vitro systems, animal models and clinical studies can decisively
contribute to a better understanding of the pharmacokinetics of drugs in the future.
Einleitung 11
3. Einleitung
3.1. Die Bedeutung von Enzymen und Transportproteinen für die Pharmakokinetik von Arzneistoffen
Unter der Pharmakokinetik eines Pharmakons versteht man im Allgemeinen die Wirkung
eines Organismus auf dieses Pharmakon, das heißt alle Prozesse im Organismus, die an
Konzentrationsveränderungen des Arzneistoffs im zeitlichen Verlauf beteiligt sind [1, 2].
Der Beschreibung dieser Prozesse dient das LADME-Modell. Unter diesem Begriff sind
fünf Teilprozesse zusammengefasst: Die Liberation (Freisetzung) des Arzneistoffs aus der
Arzneiform, die Absorption des Arzneistoffs, also seine Aufnahme in den Körper, die
Distribution (Verteilung) des Arzneistoffs im Körper, seine Metabolisierung und seine
abschließende Elimination aus dem Körper [1, 3]. Verfolgt man den Weg eines
Pharmakons nach peroraler Applikation, so gelangt es zunächst in den
Gastrointestinaltrakt, wo die Freisetzung des Arzneistoffs aus der Arzneiform sowie die
Resorption des Arzneistoffs in den Organismus erfolgen. Die über den Darm resorbierte
Menge an Arzneistoff gelangt über das Pfortaderblut in die Leber, von wo aus der
Arzneistoff entweder den systemischen Blutkreislauf erreicht, oder aber über die Galle
ausgeschieden wird. Auch der im Darm freigesetzte Arzneistoff kann bereits ohne
resorbiert zu werden fäkal exkretiert werden. Zudem können Metabolisierungsreaktionen
im Darm und in der Leber zu einer Inaktivierung des Arzneistoffs beitragen, sodass ein
gewisser Anteil des Arzneistoffs nach dieser ersten Passage bereits aus dem Blut entfernt
wird. Dieser Vorgang wird als First-pass Effekt bezeichnet [2]. Über den systemischen
Blutkreislauf erfolgen letztlich die Verteilung des Arzneistoffs im Organismus und die
Elimination über die Nieren in den Urin.
Bei allen beschriebenen Resorptionsvorgängen im Organismus muss der Arzneistoff
Membranen passieren. Lange vertrat man die Meinung, dass vor allem die
physikochemischen Eigenschaften eines Arzneistoffs wie Lipophilie, Molekülgröße und
Ladung seine Membranpermeabilität beeinflussen und dass Arzneistoffe überwiegend
mittels Diffusion Zellmembranen überwinden [4]. In den letzten Jahren wurde jedoch
deutlich, dass häufig nur dann Arzneistoffe in ausreichendem Maße in Gewebe
aufgenommen und aus diesen sekretiert werden, wenn Transportproteine in einer
Membrandomäne vorhanden sind [5-7]. Zwei Transporter-Superfamilien kommt dabei eine
12 Einleitung
besondere Bedeutung zu: der Solute-Carrier-Superfamilie (SLC-Superfamilie) und der
ATP-binding cassette-Superfamilie (ABC-Transporter) [8]. Zur SLC-Superfamilie gehören
unter anderem Aufnahmetransporter, welche einen Transport von Substanzen über
Zellmembranen hinweg als erleichterte Diffusion ohne ATP-Verbrauch vermitteln. Bislang
wurden in der SLC-Superfamilie 378 Transporter identifiziert, welche in 51 Familien
eingeteilt werden ([9], www.bioparadigms.org/slc/menu.asp). Effluxtransporter der ATP-
binding cassette-Superfamilie hingegen vermitteln einen primär-aktiven Transport häufig
einem Konzentrationsgefälle entgegengesetzt. Die Energie für diesen Prozess wird über die
Hydrolyse von ATP gewonnen [1]. Innerhalb der ATP-binding cassette-Superfamilie
konnten bislang 49 humane Transporter identifiziert werden, welche in sieben Familien
(ABCA-ABCG) eingeteilt werden (http://nutrigene.4t.com/humanabc.htm). Einen Überblick
über die Teilprozesse der Pharmakokinetik und über wichtige, an den einzelnen Prozessen
beteiligten Aufnahme- und Effluxtransporter bietet Abbildung 1.
Einleitung 13
Abbildung 1: Übersicht über die Lokalisation humaner Transportproteine in Dünndarm (A), Leber (B), Niere (C) und Gehirn (D). Aufnahmetransporter sind in blau und Effluxtransporter in pink dargestellt. Transportproteine der SLC-Superfamilie: ASBT = Apical Sodium-dependent Bile Acid Transporter (SLC10-Familie), NTCP = Na+/Taurocholate Cotransporting Polypeptide (SLC10-Familie), PEPT = Peptide Transporter (SLC15-Familie), MCT = Monocarboxylate Transporter (SLC16-Familie), OATP = Organic Anion Transporting Polypeptide (SLC21/SLCO-Familie), OCT = Organic Cation Transporter (SLC22-Familie), OAT = Organic Anion Transporter (SLC22-Familie). Transportproteine der ABC-Superfamilie: MDR = Multidrug Resistance Protein der ABCB-Familie (MDR1 = P-Glykoprotein), BSEP = Bile Salt Export Pump (ABCB-Familie), MRP = Multidrug Resistance Protein der ABCC-Familie, BCRP = Breast Cancer Resistance Protein (ABCG-Familie). Für die vorliegende Arbeit waren vor allem der hepatische Aufnahmetransporter OATP1B1 und der hepatische Effluxtransporter MRP2 von Bedeutung. (Abbildung modifiziert nach [10])
14 Einleitung
3.2. Der hepatische Arzneistoffmetabolismus und -transport
Die Leber stellt das zentrale Stoffwechselorgan des Organismus dar. Sie ist für die
Synthese (z.B. Cholesterol, Albumine), die Speicherung (z.B. Glucose, Triglyceride), die
Metabolisierung und die Ausscheidung von zahlreichen endogenen Stoffen (z.B. Bilirubin)
in die Galle verantwortlich [1, 11]. Wie bereits vorher beschrieben, können aber auch
Arzneistoffe über die Pfortader zur Leber gelangen und von dieser aufgenommen,
metabolisiert und ausgeschieden werden. Somit kommt der Leber eine bedeutende
Funktion bei der Entgiftung des Organismus zu. Sowohl die Pfortader (Vena portae) als
auch die Leberarterie (Arteria hepatica) treten als zuführende Blutgefäße über die
Leberpforte (Porta hepatis) in die Leber ein. In der Leber mischen sich dann arterielles und
venöses Blut und werden letztlich über die untere Hohlvene (Vena cava inferior) aus der
Leber abgeleitet. Dem Blutkapillarsystem entgegengesetzt, verlassen die beiden großen
Gallengänge (Ductus hepaticus dexter und sinister) an der Leberpforte von den
Leberlappen her kommend die Leber (siehe Abbildung 2, [11]).
Abbildung 2: Zwölffingerdarm, Pankreas, Milz, Leber und Gallenblase in der Ansicht von vorne [11](Abbildung aus [11]).
Die Leber ist aus einer Vielzahl (50 000-100 000) von Leberläppchen, welche aus vielen
radiär verlaufenden Strängen von Leberzellen (Hepatozyten) bestehen, aufgebaut [1]. Der
Feinbau der Leber in Leberläppchen ist in Abbildung 3 [11] dargestellt.
Einleitung 15
Abbildung 3: Aufbau der Leberläppchen. Blut aus der Pfortader und der Leberarterie fließt in jedes Leberläppchen und wird über die Lebervene abgeleitet. Als weiteres Kapillarsystem durchdringen Gallenkapillare die Leber [11](Abbildung aus [11]).
Die Zellgruppe der Hepatozyten nimmt hinsichtlich der Stoffwechselvorgänge in der Leber
eine bedeutende Rolle ein. Die Plasmamembran der Hepatozyten ist in zwei funktionelle
Membrandomänen eingeteilt, welche durch spezialisierte Membrankontaktstellen (Tight
Junctions) klar voneinander getrennt sind. Die den Lebersinusoiden, also dem Blut
zugewandte Membrandomäne wird als basolaterale Membran bezeichnet. An dieser
Membran kann ein Austausch von endogenen Stoffen und Xenobiotika vom Blut in die
Leberzelle und von Stoffwechselprodukten aus dem Hepatozyten zurück in das Blut
erfolgen. Die dem Gallenkanalikulus zugewandte zweite Membrandomäne wird als
kanalikuläre Membran bezeichnet und ermöglicht die Sekretion häufig von
Stoffwechselprodukten in die Galle. Aus dem Feinbau der Leber und der Ausstattung der
Hepatozyten mit einer Vielzahl von Aufnahme- und Effluxtransportern sowie einem
effektiven Enzymsystem wird die Bedeutung der Leber für die Verstoffwechslung und
Elimination von endogenen Stoffen und Xenobiotika wie Arzneistoffen klar. Im Folgenden
sollen die einzelnen Phasen dieser Arzneistoffelimination genauer beschrieben werden. Die
erste Phase, welche als Phase 0 bezeichnet wird, stellt die Aufnahme einer Substanz aus
dem Blut über die basolaterale Membran in den Hepatozyten dar. Anschließend an die
Aufnahme können die Phasen I und II der hepatischen Elimination folgen, während derer
die aufgenommenen Substanzen mittels metabolisierender Enzyme zu hydrophileren und
16 Einleitung
somit leichter ausscheidbaren Metaboliten umgesetzt werden. Die Phase I wird auch als
Funktionalisierungsreaktion und die Phase II als Konjugationsreaktion bezeichnet.
Letztlich erfolgt die Elimination dieser hydrophileren Substanzen oder der
Ausgangssubstanz über Effluxtransporter in die Galle oder zurück ins Blut [12]. Dieser
Eliminationsschritt wird als Phase III bezeichnet. Bei einer Elimination der Metaboliten
oder der Ausgangssubstanz zurück ins Blut, gelangen diese über die Vena cava inferior in
den systemischen Blutkreislauf und können in verschiedene Organe verteilt werden. Dabei
findet auch eine Ausscheidung besonders hydrophiler Stoffe über die Nieren in den Urin
statt. Stoffe, die in die Galle sezerniert werden, können entweder mit den Fäzes
ausgeschieden werden oder einem enterohepatischen Kreislauf unterliegen. Das bedeutet,
dass diese Stoffe nach biliärer Sekretion in den Zwölffingerdarm in tiefer liegenden
Darmabschnitten zurückresorbiert werden und über die Pfortader wieder in die Leber
gelangen [1]. Abbildung 4 stellt eine schematische Darstellung der vier Phasen der
hepatischen Elimination dar.
Abbildung 4: Schematische Darstellung der vier Phasen der hepatischen Arzneistoffelimination. Der Arzneistoff wird mittels Aufnahmetransporter aus dem Pfortaderblut in den Hepatozyten aufgenommen (Phase 0), in Funktionalisierungsreaktionen mittels Cytochrom-P450-Enzymen (Phase I) und Konjugationsreaktionen mittels Transferasen (Phase II) biotransformiert und letztlich mittels ATP-abhängiger Effluxtransporter in die Galle sekretiert (Phase III).
Im Folgenden sollen die jeweiligen Transporter und metabolisierenden Enzyme besprochen
werden, welche für die einzelnen Phasen von Bedeutung sind.
Einleitung 17
3.2.1. Aufnahmetransporter der SLC-Superfamilie
Wie bereits zuvor erwähnt, gehören zur SLC-Superfamilie Transportproteine, welche die
Aufnahme von Substanzen in Zellen im Sinne einer erleichterten Diffusion vermitteln. Bei
der Aufnahme in die Hepatozyten sind v.a. drei SLC-Familien von besonderer Bedeutung:
Die SLC22-Familie, welche als Organic Cation/Anion/Zwitterion Transporter Family
bezeichnet wird und zu welcher die hepatisch exprimierten Transporter OCT1 (Organic
Cation Transporter, [13]), OAT2 und OAT7 (Organic Anion Transporter, [14, 15])
gehören, die Sodium Bile Salt Cotransport Family (SLC10-Familie), zu welcher der
Natrium-unabhängige Gallensalztransporter NTCP gehört [16] und die SLC21/SLCO-
Familie (Organic Anion Transporter Family). Die Transporter dieser Familie werden als
Organic Anion Transporting Polypeptides (OATPs) bezeichnet und waren für die
vorliegende Arbeit von besonderem Interesse. Insgesamt besteht diese Transporterfamilie
aus 11 humanen Mitgliedern, welche in sechs Subfamilien eingeteilt werden (OATP1-
OATP6, [6, 17-19]). Die Aminosäuresequenz von Mitgliedern einer Subfamilie ist zu
≥ 40 % identisch. OATP-Transporter, welche in mindestens 60 % ihrer
Aminosäuresequenz identisch sind, werden in die gleiche Unterfamilie eingruppiert,
welche mit einem Buchstaben gekennzeichnet ist (z.B. OATP1B). Einzelnen
Transportproteinen innerhalb einer Unterfamilie werden zusätzlich arabische Zahlen
zugeordnet (z.B. OATP1B1, [5, 17]). OATP-Transporter werden in vielen verschiedenen
humanen Geweben exprimiert wie beispielsweise in der Leber, der Niere, dem Darm, dem
Gehirn, der Plazenta und den Hoden [5, 17, 20-28], wobei OATP1B1 und OATP1B3 fast
ausschließlich in der Leber vorkommen [29]. Zu dem Substratspektrum der OATP-
Transporter gehören amphipathische Moleküle, darunter endogene Stoffe wie zum Beispiel
Gallensäuren, Schilddrüsenhormone, sulfatierte und glucuronidierte Hormone, aber auch
Arzneistoffe wie beispielsweise HMG-CoA-Reduktaseinhibitoren, Antidiabetika,
Antibiotika oder Chemotherapeutika [6, 17, 30-32]. Die Aufnahme von Substraten mittels
dieser Transporter erfolgt Natrium-unabhängig [33-36]. Als Transportmechanismus der
OATPs wird eine Aufnahme der meist negativ geladenen Substrate durch eine zentrale,
positiv geladene Pore mittels eines Kippmechanismus postuliert [37]. Für die hepatische
Elimination von Arzneistoffen von Bedeutung sind die an der basolateralen Membran der
Hepatozyten lokalisierten OATP-Transporter: OATP1B1, OATP1B3 und OATP2B1.
Im Folgenden soll näher auf das Familienmitglied OATP1B1 eingegangen werden.
18 Einleitung
3.2.1.1. Organic Anion Transporting Polypeptide 1B1 (OATP1B1)
Der in der basolateralen Membran humaner Hepatozyten lokalisierte Aufnahmetransporter
OATP1B1 ist einer der am besten charakterisierten OATP-Transporter. Er wurde parallel
von drei Forschergruppen in der Leber identifiziert [21, 22, 38]. Ältere Bezeichnungen des
Transporters lauten auch OATP2 [22], LST1 (Liver-specific Transporter 1, [38]) oder
OATP-C [20]. Kodiert wird das 691 Aminosäuren große Protein vom SLCO1B1-Gen [5,
29]. Der OATP1B1-Transporter weist ein sehr breites Substratspektrum auf, welches von
endogenen Substanzen wie beispielsweise Gallensalze (z.B. Taurocholat [21, 38-40]),
konjugierten Steroiden (z.B. Estradiol-17ß-glucuronid [22, 23] oder Estron-3-sulfat [20,
41]) und Hormonen (z.B. Thyroxin [38, 42]) bis hin zu häufig verschriebenen
Arzneistoffen reicht. Zu diesen gehören unter anderem HMG-CoA-Reduktaseinhibitoren
wie Cerivastatin [43], Pravastatin [21] und Atorvastatin [44], Antibiotika wie Rifampicin
[45] und Benzylpenicillin [20], antineoplastisch wirksame Arzneistoffe wie Atrasentan [46]
und Methotrexat [38] oder Antihypertensiva wie Valsartan und Olmesartan [47-50]. Die
klinische Relevanz von Transportproteinen und metabolisierenden Enzymen kann mittels
zweier Mechanismen verdeutlicht werden: Zum einen können natürlich auftretende
Mutationen im kodierenden Gen zu einer veränderten Expression oder Funktionalität des
kodierten Proteins führen. Tritt eine bestimmte Mutation in einer Population mit einer
Häufigkeit von mehr als einem Prozent auf, so spricht man von einem Polymorphismus.
Führt dieser Polymorphismus zu einem Aminosäureaustausch, so wird dieser
Polymorphismus als nicht-synonym bezeichnet. Zum anderen kann die gleichzeitige Gabe
zweier oder mehrerer Arzneistoffe zu Arzneimittelinteraktionen an Transportern oder
metabolisierenden Enzymen führen. Solche Interaktionen treten insbesondere dann auf,
wenn es sich bei den applizierten Arzneistoffen um Substrate des gleichen Transporters
oder Enzyms handelt. Allerdings kann ein Arzneistoff auch ein Induktor oder ein Inhibitor
eines Enzyms oder Transporters sein, ohne selbst Substrat des Proteins zu sein. Beide
Mechanismen mit klinisch relevanten Folgen sind bereits für OATP1B1 beschrieben
worden. Bislang konnten im SLCO1B1-Gen 41 Mutationen identifiziert werden, welche zu
einem Aminosäureaustausch im OATP1B1-Protein führen [51]. Ein gut untersuchter und
mit 8-20 % relativ häufig in der europäischen Bevölkerung auftretender Polymorphismus
im SLCO1B1-Gen ist c.521T>C [51]. Dieser führt zu einer verminderten
Membranexpression und Funktionalität des OATP1B1-Transporters [51, 52]. In einer
genomweiten Assoziationsstudie konnte dieser Polymorphismus mit einem erhöhten
Einleitung 19
Auftreten von Myopathien bei der Einnahme von Simvastatin assoziiert werden [53]. Bei
Simvastatin handelt es sich um einen HMG-CoA-Reduktaseinhibitor, welcher zur
Behandlung der Hypercholesterolämie indiziert ist. Der Wirkort dieser Arzneistoffgruppe
ist die Leber, wo die Cholesterolbiosynthese inhibiert wird. Wird der Arzneistoff nicht
ausreichend von der Leber aufgenommen, kommt es einerseits zu einer
Wirkungsverminderung, andererseits zu einem verstärkten Auftreten von unerwünschten
Arzneimittelwirkungen, in diesem Fall das Auftreten von Myopathien und
Rhabdomyolysen, d.h. der Untergang von quergestreifter Muskulatur [53-55]. Auch für
andere Arzneistoffe konnte bereits eine verminderte Transportaktivität der c.521T>C-
Variante gezeigt werden, darunter Rifampicin, Pravastatin, Atorvastatin, Rosuvastatin,
Atrasentan und Ezetimib-Glucuronid [44-46, 51, 56-58]. Relevante
Arzneimittelinteraktionen am OATP1B1-Transporter ließen sich in Studien beispielsweise
bei der gleichzeitigen Gabe von Ciclosporin mit unterschiedlichen HMG-CoA-
Reduktaseinhibitoren zeigen. So erhöhte sich die Fläche unter der Plasmakonzentrations-
Zeit-Kurve (AUC, area under the plasma concentration time curve) für die HMG-CoA-
Reduktaseinhibitoren Rosuvastatin um das siebenfache [59], für Pravastatin um das fünf-
bis zehnfache [60-62] und für Pitavastatin um das fünffache [51] im Vergleich zur
alleinigen Gabe des Statins. Da diese Statine nicht signifikant über das Cytochrom-P450-
Enzym 3A4 verstoffwechselt werden, welches durch Ciclosporin inhibiert werden kann, ist
diese Interaktion auf eine Hemmung des OATP1B1-vermittelten Transportes der Statine
zurückzuführen [51]. Es ist also festzuhalten, dass sowohl genetische Variationen im
SLCO1B1-Gen als auch Arzneimittelinteraktionen am OATP1B1-Transporter einen
entscheidenden Einfluss auf die Pharmakokinetik von Arzneistoffen haben, woraus
ersichtlich wird, dass dieser Transporter in der hepatischen Elimination von Arzneistoffen
eine besondere Rolle spielt.
3.2.2. Metabolisierung
Das Ziel von Metabolisierungsreaktionen ist es unter anderem, lipophile Substanzen in
hydrophilere, leichter renal eliminierbare Verbindungen umzusetzen (Biotransformation),
da lipophile Stoffe in der Niere nach ihrer glomerulären Filtration wieder rückresorbiert
und somit nur sehr langsam in den Urin ausgeschieden werden können. Infolge dessen und
auch, weil erst Konjugate gute Substrate von Exportpumpen (z.B. MRP2) sind, könnte es
20 Einleitung
zu einer Akkumulation von lipophilen Verbindungen besonders im Fettgewebe des
Organismus kommen. Um dies zu verhindern, verfügt der menschliche Organismus über
Enzymsysteme, welche die Biotransformation von lipophilen Substanzen, darunter
endogene Stoffe wie Gallensäuren, aber auch Xenobiotika wie zum Beispiel Arzneistoffe,
katalysieren. Zwar laufen solche Biotransformationsreaktionen auch in anderen Organen
wie beispielsweise Darm, Niere oder Lunge ab, der größte Anteil dieser Prozesse findet
allerdings in der Leber statt. Die Biotransformation von Arzneistoffen wird, wie bereits
erwähnt, in zwei Phasen unterteilt. In Phase-I-Reaktionen werden Arzneistoffe mittels
Oxidation, Reduktion oder Hydrolyse so verändert, dass sie funktionelle Gruppen
präsentieren, an welchen in einer Phase-II-Reaktion endogene, energiereiche Gruppen wie
beispielsweise aktivierte Glucuronsäure oder aktiviertes Sulfat angebracht werden, welche
die Wasserlöslichkeit und somit die renale Eliminierbarkeit der Ursprungssubstanz
erhöhen. Die an beiden Reaktionen beteiligten Enzyme können entweder strukturgebunden
oder strukturungebunden vorliegen. Strukturgebundene Enzyme werden vor allem in den
Membranen des endoplasmatischen Retikulums (beispielsweise Uridin-5`-diphosphat-
Glucuronosyltransferasen oder Monooxygenasen) und in einem bestimmten Ausmaß auch
in den Mitochondrien exprimiert, wohingegen strukturungebundene Enzyme lösliche
Enzyme (zum Beispiel: Amidasen, Esterasen oder Sulfotransferasen) darstellen. Eine
übergeordnete Rolle an Phase-I-Reaktionen spielen Oxidationsreaktionen, welche von
Oxidasen, Monooxygenasen oder Dioxygenasen katalysiert werden. Die größte Bedeutung
für diese Reaktionen besitzen Monooxygenasen, welche Hämproteine vom Typ des
Cytochrom-P450 aufweisen, die Enzyme der Cytochrom-P450-Superfamilie [1, 63, 64]. 75 %
der Phase-I-Reaktionen verlaufen über diese Enzym-Superfamilie [65]. Enzyme, welche in
> 40 % ihrer Aminosäuresequenz übereinstimmen, werden der gleichen Familie zugeteilt,
welche mit einer Zahl gekennzeichnet ist (z.B. CYP3). In der gleichen Unterfamilie,
gekennzeichnet durch einen Buchstaben (z.B. CYP3A), befinden sich Enzyme mit einer
über 60 %igen Übereinstimmung in ihrer Aminosäuresequenz. Die einzelnen Enzyme
innerhalb einer Unterfamilie werden mit fortlaufenden Zahlen versehen (z.B. CYP3A4).
Innerhalb der Cytochrom-P450-Superfamilie sind vor allem die Familien CYP1-3 für die
Biotransformation von Arzneistoffen von Bedeutung. Eine übergeordnete Rolle für die
Oxidation von Arzneistoffen nimmt dabei das Enzym CYP3A4 ein. In Phase-II-Reaktionen
werden an Arzneistoffe oder deren Phase-I-Metaboliten mittels Transferasen energiereiche
Gruppen angebracht. Bei diesen Prozessen spielen vor allem Uridin-5`-diphosphat-
Glucuronosyltransferasen (auch: UDP-Glucuronosyltransferasen oder UGTs), welche die
Einleitung 21
Konjugation von aktivierter Glucuronsäure an eine Vielzahl von endogenen Verbindungen
(Bilirubin, Estradiol, Thyroxin, Eicosanoide [66]) als auch Xenobiotika (SN-38,
Paracetamol, Morphin, Mycophenolat [66-71]) katalysieren, eine bedeutende Rolle [72,
73]. Ähnlich wie bei den Cytochrom-P450-Enzymen weist auch bzgl. der UDP-
Glucuronosyltransferasen die Leber die höchste Enzymmenge auf [74], wobei auch eine
Expression dieser Enzyme unter anderem im Magen, Darm, Niere und Gehirn [73, 75-80]
zu detektieren ist. Bislang wurden 19 humane UDP-Glucuronosyltransferasen identifiziert,
welche in zwei Familien eingeteilt werden [66, 74, 81], die UGT1- und UGT2-Familie. Nur
die UGT2-Familie besitzt zwei Unterfamilien, welche analog zur Nomenklatur der
Cytochrom-P450-Superfamilie mit Buchstaben gekennzeichnet sind (UGT2A und UGT2B),
wohingegen die UGT1-Familie nur die Unterfamilie UGT1A aufweist. Für die
Bezeichnung einzelner Enzyme wird eine Zahl angefügt (zum Beispiel: UGT2B7 oder
UGT1A1). Innerhalb der UGT1-Familie weist das Enzym UGT1A1 mit einer relativen
mRNA-Expression von 37 % die höchste Expression in der Leber auf [82].
Da im Fokus dieser Arbeit die beiden Enzyme CYP3A4 und UGT1A1 standen, soll im
Folgenden näher auf die Bedeutung dieser Enzyme für die Pharmakokinetik von
Arzneistoffen bzw. für die Verstoffwechslung von endogenen Substanzen eingegangen
werden.
3.2.2.1. Cytochrom-P450-3A4 (CYP3A4)
Das Cytochrom-P450-Enzym CYP3A4 gehört zur Familie der Monooxygenasen, welche
oxidative Phase-I-Reaktionen von Arzneistoffen katalysieren. CYP3A4 stellt das
bedeutendste Enzym innerhalb der Cytochrom-P450-Enzyme dar, da es die Oxidation von
circa 50 % aller klinisch verwendeten Arzneistoffe katalysiert [65, 83-87] und die höchste
Expression in der Leber aufweist (ca. 25 % der Expression aller hepatischen Cytochrom-
P450-Enzyme [65]). Die Expression von CYP3A4 ist über mehrere Arzneistoffe und andere
Verbindungen induzierbar, dazu gehören unter anderem Antikonvulsiva wie Carbamazepin
[88], das Antibiotikum Rifampicin [65, 89-91] oder Johanniskraut [92]. Dies erklärt zum
Teil auch die starke interindividuelle Variabilität in der hepatischen Expression des
Enzyms [65]. Neben Induktoren des Enzyms sind auch bereits eine Reihe von Inhibitoren
identifiziert worden, zu welchen Azol-Antimykotika wie Ketoconazol [93, 94],
Makrolidantibiotika wie Troleandomycin [93, 94], HIV-Proteaseinhibitoren wie Saquinavir
[94], Antidepressiva wie Fluoxetin [95] oder der Inhaltsstoff 6`,7`-Dihydroxybergamottin
22 Einleitung
des Grapefruitsaftes [65, 96, 97] gehören. Eine detaillierte Tabelle bzgl. Substrate,
Induktoren und Inhibitoren von CYP3A4 findet sich auf der Internetseite:
http://medicine.iupui.edu/clinpharm/ddis/table.aspx. Des Weiteren sind für das CYP3A4-
Gen auch bereits eine Reihe von nichtsynonymen Genvarianten
(www.cypalleles.ki.se/cyp3a4.htm) beschrieben worden, welche jedoch klinisch kaum von
Relevanz zu sein scheinen [65]. Dafür ergibt sich über das breite Substratspektrum sowie
über die Anzahl an Inhibitoren und Induktoren für das CYP3A4-Enzym ein entsprechendes
Interaktionspotential. Als Beispiel sei die klinisch relevante Interaktion von Ciclosporin mit
Johanniskraut genannt. Bei Ciclosporin handelt es sich um ein Immunsuppressivum, dessen
Einnahme bei Organtransplantationen indiziert ist und dessen Biotransformation CYP3A4-
vermittelt abläuft. Bei gleichzeitiger Einnahme dieses Arzneistoffs mit Johanniskraut kam
es bei 35 nieren- und 10 lebertransplantierten Patienten zu einer signifikanten Verringerung
der Ciclosporin-Blutkonzentration um durchschnittlich 49 % (30-64 %) im Vergleich zur
alleinigen Einnahme des Immunsuppressivums. Johanniskraut wird bei milden
Depressionen eingesetzt, ist in der Apotheke frei verkäuflich zu erhalten und wirkt auf das
CYP3A4-Enzym als Induktor, steigert somit also die Enzymmenge und damit den Abbau
von Substraten des Enzyms. Bei einem nierentransplantierten und einem
lebertransplantierten Patienten kam es aufgrund der geringen Ciclosporinkonzentrationen
zu Abstoßungsreaktionen. Nach Absetzen des Johanniskrautes stiegen die Ciclosporin-
Blutspiegel wieder an, was zeigt, dass die beschriebene Interaktion auf die gleichzeitige
Einnahme dieser beiden Substanzen zurückzuführen ist [98]. Weitere Interaktionsfälle
zwischen Ciclosporin und Johanniskraut bei transplantierten Patienten mit
schwerwiegenden Folgen wurden auch von anderen Arbeitsgruppen beschrieben [99-102].
Zusätzlich zu der Induktion von CYP3A4 durch Johanniskraut wird als ein weiterer
möglicher Mechanismus für diese Interaktion ein induktiver Effekt des Johanniskrautes auf
den Effluxtransporter P-Glykoprotein im Darmepithel vermutet [102, 103]. Dieser
transportiert Substrate wie beispielsweise Ciclosporin aus den Enterozyten zurück ins
Darmlumen. Da die Expression von CYP3A4 und P-Glykoprotein auf ähnliche Weise
reguliert wird, werden beide Mechanismen an der beschriebenen Interaktion teilhaben.
Welcher Mechanismus dabei überwiegt, lässt sich nur schwer abschätzen [104].
Es lässt sich also festhalten, dass das Cytochrom-P450-Enzym 3A4 aufgrund seines breiten
Substratspektrums eine entscheidende Rolle für die Pharmakokinetik von Arzneistoffen
spielt. Besonders deutlich wird die Bedeutung dieses Enzyms bei Betrachtung von
Arzneimittelinteraktionen an diesem Enzym, wie die oben beschriebene.
Einleitung 23
3.2.2.2. UDP-Glucuronosyltransferase 1A1 (UGT1A1)
Das Enzym UGT1A1 gehört zur Familie der UDP-Glucuronosyltransferasen, welche die
Konjugation von aktivierter Glucuronsäure direkt an Arzneistoffe oder an deren Phase-I-
Metaboliten katalysieren. Hierdurch wird der Arzneistoff inaktiviert und zusätzlich leichter
aktiv eliminierbar, da Konjugate gute Substrate für Exportpumpen (z.B. MRP2) darstellen.
Innerhalb der UGT1A-Familie weist das UGT1A1-Enzym die stärkste hepatische
Expression auf (37 % mRNA-Expression [82]), wobei der Anteil dieses Enzyms an der
Gesamtexpression von UDP-Glucuronosyltransferasen in der Leber 11,3 % ausmacht [66,
72]. Weitere Gewebe, in denen das Enzym exprimiert wird, sind Darm und Magen [73, 78,
79]. Zu den endogenen Substraten des UGT1A1-Enzyms gehören Bilirubin [73], Estradiol
[105], Eicosanoide [106, 107] und Thyroxin [66, 108]. Von UGT1A1 verstoffwechselte
Arzneistoffe sind beispielsweise SN-38, der aktive Metabolit des Chemotherapeutikums
Irinotecan [69], das Analgetikum Paracetamol [68], die Opioide Buprenorphin [109, 110]
und Morphin [70] und der COMT- (Catechol-O-Methyltransferase) Hemmer Entacapon zur
Behandlung des Morbus Parkinson [67, 111]. Eine detaillierte Zusammenfassung von
Substraten des UGT1A1-Enzyms bietet eine Übersichtsarbeit von Kiang et al. [67].
Verschiedene Arzneistoffe konnten in vitro als Inhibitoren und Induktoren für UGT-
vermittelte Glucuronidierungen von Arzneistoffen identifiziert werden, allerdings konnte
bislang nicht gezeigt werden, welche spezifische UDP-Glucuronosyltransferase in vivo
inhibiert wird bzw. ob diese Interaktionen auch eine klinische Relevanz besitzen [67]. Die
klinische Relevanz von UGT1A1 wird bei der Betrachtung von genetischen
Polymorphismen im UGT1A1-Gen deutlich. Eine aktuelle Übersicht über Mutationen im
UGT1A1-Gen liefert folgende Internetseite: http://www.pharmacogenomics.pha.
ulaval.ca/cms/site/pharmacogenomics/ugt_alleles. Zwei Syndrome gehen auf Varianten der
UDP-Glucuronosyltransferase 1A1 mit einer verminderten Aktivität des Enzyms bzw. mit
einem Verlust der Enzymaktivität zurück: Das Gilbert`s Syndrom, gekennzeichnet durch
die UGT1A1*28-Variante, bei welchem es im Promoterbereich des Gens zu einem
Auftreten zweier zusätzlicher Basen (TA) im TATAA Element kommt [112] und das
Crigler-Najjar Syndrom Typ I und II. Während das Gilbert`s Syndrom, welches relativ
häufig homozygot in der kaukasischen Bevölkerung auftritt (7-19 % [67]), durch eine
verminderte Expression zu einer reduzierten Enzymaktivität führt, kommt es beim Crigler-
Najjar Syndrom I und II durch einen zum Teil vollständigen Funktionalitätsverlust des
Enzyms zu schwerwiegenden Hyperbilirubinämien. Diese erhöhten Serumspiegel mit
24 Einleitung
unkonjugiertem Bilirubin kommen dadurch zustande, dass das UGT1A1-Enzym als einzige
UDP-Glucuronosyltransferase in der Lage ist Bilirubin, welches ein Abbauprodukt des
roten Blutfarbstoffes darstellt, zu glucuronidieren [113]. Erwähnenswert ist zudem, dass
das UGT1A1-Enzym ein Gleichgewicht zwischen glucuronidiertem und unkonjugiertem
Bilirubin aufrechterhält, da unkonjugiertes Bilirubin antioxidativ und somit in gewissem
Maße vorteilhaft für den Organismus ist [113]. Zu hohe Serumbilirubinspiegel wirken
allerdings toxisch und führen zum Ikterus oder bei Passage des Bilirubins in das Gehirn
zum Auftreten eines Kernikterus mit nekrotischen Schädigungen von Neuronen und
Gliazellen [67]. Daher kann das Crigler-Najjar Syndrom Typ I, bei welchem diese hohen
Serumbilirubinspiegel auftreten, schon in der frühen Kindheit zum Tod führen [73].
Personen mit dem UGT1A1*28-Genotyp (Gilbert`s Syndrom) weisen zusätzlich eine
reduzierte Elimination von SN-38 [114-116], Paracetamol [117-119], Lamotrigin [120],
Lorazepam [121, 122] und Josamycin [67, 123] auf. Vor allem die Behandlung mit
Irinotecan ist entscheidend vom UGT1A1-Genotyp abhängig [124], da Patienten mit der
UGT1A1*28-Genvariante ein signifikant höheres Risiko für das Auftreten
schwerwiegender unerwünschter Arzneimittelwirkungen wie beispielsweise einer
Neutropenie aufweisen [73, 125-127]. Daher wurde von der FDA (U.S. Food and Drug
Administration) gefordert, vor Behandlung mit Irinotecan auf das Vorhandensein dieses
Polymorphismus zu testen [124, 125]. Aus diesen Untersuchungen lässt sich
schlussfolgern, dass die UDP-Glucuronosyltransferase 1A1 ebenfalls einen entscheidenden
Einfluss auf die Pharmakokinetik von Arzneistoffen ausübt.
3.2.3. Effluxtransporter der ATP-binding cassette-Superfamilie
Transporter der ATP-binding cassette-Superfamilie (kurz ABC-Transporter) vermitteln
einen primär aktiven Transport von Substraten, häufig einem Konzentrationsgefälle
entgegengesetzt. Die hierfür benötigte Energie wird aus der Hydrolyse von ATP gewonnen
[1]. Die ABC-Transporter weisen insgesamt ein sehr breites Substratspektrum auf. Von
Bedeutung ist dabei, dass einige dieser Transporter auch in der Lage sind, nicht nur
Arzneistoffe, sondern auch deren Phase-II-Metaboliten zu transportieren. Erst dadurch wird
eine gerichtete Elimination von Arzneistoffen möglich. Wichtige ABC-Transporter, welche
in der kanalikulären Membran von Hepatozyten exprimiert werden, sind unter anderem
drei Mitglieder der ABCB-Familie, darunter das P-Glykoprotein (auch MDR1 genannt,
Einleitung 25
ABCB1), welches für den Transport von lipophilen Kationen in die Galle verantwortlich ist
[128], der MDR3-Transporter (ABCB4), welcher den Phospholipidtransport vermittelt
[129] und der BSEP-Transporter (Bile Salt Export Pump, ABCB11), welcher Gallensalze in
die Galle transportiert [130]. Weitere wichtige hepatische Effluxtransporter stellen das
BCRP-Transportprotein (Breast Cancer Resistance Protein, ABCG2) dar, welches den
Transport von Sulfokonjugaten in die Galle vermittelt [131], sowie die Mitglieder der
MRP-Familie (Multidrug Resistance Protein, ABCC-Familie). Interessanterweise
lokalisiert innerhalb der hepatischen MRP-Transporter nur das MRP2-Transportprotein
(ABCC2) in der kanalikulären Membran [132]. Die übrigen hepatischen MRP-Transporter
wie das MRP3- (ABCC3), das MRP4- (ABCC4), das MRP5- (ABCC5) und das MRP6-
(ABCC6) Protein finden sich hingegen in der basolateralen Hepatozytenmembran [133-
138]. Entsprechend vermitteln diese Transporter einen Transport aus dem Hepatozyten
zurück ins Blut, wohingegen das MRP2-Transportprotein wie die anderen kanalikulären
Transporter für den Transport in die Galle verantwortlich ist. Für die vorliegende Arbeit
war das MRP2-Protein, welches im Folgenden näher beschrieben wird, von besonderer
Bedeutung.
3.2.3.1. Multidrug Resistance Protein 2 (MRP2)
Das MRP2-Protein wurde funktionell erstmals 1990 als ein spezifisches Transportsystem
für Glutathion-S-Konjugate beschrieben [139]. Es folgte die molekulare Beschreibung des
Transporters als cMOAT (canalicular Multi-specific Organic Anion-Transporter, [140-
144]) und als cMRP (canalicular Multidrug Resistance Protein, [145]). Nach der
Entdeckung weiterer MRP-Familienmitglieder kam es zu einer Vereinheitlichung ihrer
Nomenklatur, sodass heute diese Transporter mit dem Kürzel MRP und einer arabischen
Zahl, welche die Reihenfolge ihrer Identifizierung angibt, bezeichnet werden [146]. Der
MRP2-Transporter ist somit das zweite identifizierte Familienmitglied innerhalb der MRP-
Transporter. Das MRP2-Transportprotein lokalisiert in den apikalen (einem Lumen
zugewandten) Zellmembranen, so zum Beispiel in der kanalikulären Membran von
Hepatozyten [132, 142], in der apikalen Membran von polarisierten Zellen des proximalen
Tubulus der Niere [147, 148] und von polarisierten Zellen des Dünndarms [149], des
Dickdarms [150], der Gallenblase [151], der Lunge [144, 150] und der Plazenta [152]. Die
exklusive apikale Expression dieses Transporters in Organen wie Leber, Niere und Darm
und der dadurch bedingte Transport von Substraten in Galle, Urin und Darmlumen macht
26 Einleitung
seine Bedeutung für die Elimination von Substanzen aus dem Organismus deutlich. Zu den
Substraten des MRP2-Transporters gehören vor allem konjugierte endogene Stoffe wie
zum Beispiel Leukotrien C4 [153, 154], glucuronidiertes Bilirubin [155] oder Estron-3-
sulfat [156]. Die Anzahl an Arzneistoffen und deren Metaboliten, welche bislang eindeutig
als Substrate des humanen MRP2-Proteins identifiziert werden konnten, ist hingegen
begrenzt. Beispiele für solche Substrate stellen die Phase-II-Metaboliten des
Tumortherapeutikums Chlorambucil, Chlorambucil-Monoglutathion [157, 158] und des
Schleifendiuretikums Etacrynsäure, Etacrynsäure-S-Glutathion [158, 159] sowie der bei der
rheumatoiden Arthritis eingesetzte Arzneistoff Methotrexat [158, 160] oder das
Antibiotikum Erythromycin [161] dar. Untersuchungen zur Zellvitalität an MRP2-
überexprimierenden Zelllinien bei einer Inkubation mit Tumortherapeutika ergab, dass
diese Zellen eine Resistenz gegenüber den Arzneistoffen Etoposid, Vincristin,
Doxorubicin, Vinblastin und Epirubicin aufweisen [144, 153, 162]. Daraus lässt sich
schließen, dass die genannten Tumortherapeutika ebenfalls zum Substratspektrum des
MRP2-Transporters gehören. Eine mögliche Erklärung für den Transport von
unkonjugierten Arzneistoffen über diesen Transporter ist ein Cotransport mit Glutathion,
was bereits für endogene Stoffe als auch für Arzneistoffe am MRP1- und MRP4-
Transporter beschrieben wurde [163-166]. Eine Zusammenfassung über das komplette
Substratspektrum des Transporters liefert eine Übersichtsarbeit von Nies und Keppler [158]
sowie die entsprechenden Abschnitte folgender Bücher: Drug Transporters, ABC Proteins
From Bacteria to Man und The ABC Transporters of Human Physiology and Disease [138,
167, 168]. Klinisch relevante Inhibitoren des MRP2-Transporters wurden bislang nicht
beschrieben. Ein Induktor des Transporters mit möglicher klinischer Relevanz ist das
Antibiotikum Rifampicin [169]. Des Weiteren konnten bereits mehr als 200 natürlich
auftretende Sequenzvarianten im ABCC2-Gen identifiziert werden. Häufig handelt es sich
dabei um einzelne Mutationen in intronischen, aber auch in extronischen Bereichen des
Gens, welche nicht zu einer Veränderung in der Aminosäuresequenz des MRP2-Proteins
führen. Eine aktuelle Übersicht über Sequenzvariationen im ABCC2-Gen bietet folgende
Homepage: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP [158]. Mutationen, welche einen
Funktionalitätsverlust des MRP2-Proteins in der kanalikulären Membran von Hepatozyten
verursachen, führen zu dem Dubin-Johnson Syndrom [142, 144, 170-172]. Bei diesem
Syndrom handelt es sich um eine autosomal rezessiv vererbbare Störung des MRP2-
vermittelten Transportes von glucuronidierten organischen Anionen in die Galle. Zu diesen
gehört unter anderem glucuronidiertes Bilirubin. Als kompensatorische Maßnahme wird
Einleitung 27
infolge dessen das glucuronidierte Bilirubin mittels des an der basolateralen Membran des
Hepatozyten hochregulierten MRP3-Transportproteins in das Blut zurücktransportiert [133,
148]. Dort kommt es folglich zu einer Hyperbilirubinämie mit konjugiertem Bilirubin.
Erstmals wurde das Dubin-Johnson Syndrom 1954 beschrieben [144, 148, 173, 174].
Zusammenfassend bleibt festzuhalten, dass die Exportpumpe MRP2 einen entscheidenden
Beitrag zur Elimination von konjugierten und unkonjugierten organischen Anionen spielt.
Besonders Glucuronsäure- und Glutathion-Konjugate endogener Verbindungen stellen gute
Substrate des Transporters dar [158]. Es ist zu erwarten, dass die Bedeutung des
Transporters an der Elimination speziell von Arzneistoffen und deren Metaboliten genauso
groß ist wie für die von endogenen Substraten. Untersuchungen zur Bedeutung dieses
Transporters an der Arzneistoffelimination an bereits existierenden in vitro-Modellen
gestalten sich allerdings aus folgenden Gründen schwierig: Die Arzneistoffmetaboliten
können häufig nicht kommerziell erworben werden, Phase-II-Arzneistoffmetaboliten
passieren Zellmembranen nur in geringem Ausmaß mittels passiver Diffusion, weshalb
Untersuchungen an Monolayern von MRP2-exprimierenden Zelllinien problematisch sind
und Untersuchungen an MRP2-exprimierenden inside-out-Membranvesikeln sind sehr
aufwendig. Auch Untersuchungen an entsprechenden Tiermodellen weisen Limitationen
auf. Die Bedeutung dieser Tiermodelle als auch von in vitro-Zellmodellen zur
Beschreibung der Pharmakokinetik von Arzneistoffen soll im folgenden Abschnitt
besprochen werden.
3.3. Bedeutung von in vitro-Zellmodellen zur Beschreibung der Pharmakokinetik von Arzneistoffen
Untersuchungen zur Abschätzung der Beteiligung eines Transportproteins an der
Aufnahme und Sekretion von Arzneistoffen in Geweben oder der Beteiligung eines
Enzyms an der Biotransformation eines Arzneistoffs werden häufig an Knockout-Maus-
oder Rattenmodellen durchgeführt. Bei diesen Tiermodellen wird das dem zu
untersuchenden menschlichen Transporter oder Enzym entsprechende Protein in der Maus
oder in der Ratte (Ortholog) genetisch funktionsunfähig gemacht. Solche Modelle eignen
sich grundsätzlich gut zur Untersuchung der Fragestellung, ob ein Transportprotein oder
ein Enzym an Verteilungs- und Eliminationsprozessen eines Arzneistoffs beteiligt ist,
allerdings besitzen diese Modelle auch Limitationen. Eine Grundvoraussetzung für die
Übertragbarkeit der Daten aus solchen Tiermodellen ist zunächst, dass es ein Ortholog des
28 Einleitung
zu untersuchenden Proteins bei der Maus bzw. Ratte gibt. Für die beiden humanen,
hepatischen Aufnahmetransporter OATP1B1 und OATP1B3 existiert aber beispielsweise
kein entsprechendes Ortholog in einer anderen Spezies [29]. Zur Untersuchung beider
Proteine werden Oatp1b2-Knockout-Tiere verwendet, da dieser Transporter der einzige
Oatp1b-Transporter in der Maus bzw. der Ratte ist. Die Übereinstimmung in der
Aminosäurensequenz des humanen OATP1B1-Proteins zu dem Oatp1b2-Protein in der
Ratte bzw. Maus beträgt entsprechend lediglich 64 bzw. 65 % [5, 51, 175, 176]. Die
Übertragbarkeit der Ergebnisse aus diesen Tiermodellen auf die Situation im Menschen ist
daher häufig eingeschränkt [29]. Anders verhält es sich mit der Exportpumpe MRP2. Hier
existiert ein entsprechendes Ratten- bzw. Mausortholog, welches eine 78 %ige
Übereinstimmung in der Aminosäurensequenz zu dem humanen Protein aufweist [158].
Aus diesem Grund ist eine Übertragbarkeit der Daten aus diesen Tiermodellen auf die
humane Situation deutlich besser. Allerdings gibt es weitere limitierende Faktoren von
Tiermodellen. Dazu gehören beispielsweise das Auftreten kompensatorischer
Mechanismen in vivo, Unterschiede in den Expressionsniveaus des untersuchten Proteins in
Abhängigkeit von der Spezies (die hepatische Expression von Mrp2 in der Ratte ist
beispielsweise 10-fach höher als die von MRP2 im Menschen [8, 177]), Auswirkungen von
Unterschieden zwischen verschiedenen Tierstämmen [8, 178, 179] oder dem Geschlecht
der Tiere sowie Unterschiede in der Substratspezifität zwischen unterschiedlichen Spezies
[8, 180]. Vor allem auch der letzte Punkt macht deutlich, dass die Übertragbarkeit der
Ergebnisse aus solchen Tiermodellen auf die humane Situation eingeschränkt sein kann.
Mittlerweile ist es gelungen Mausmodelle zu generieren, welche das humane OATP1B1-
Protein [181] oder das humane CYP3A4-Enzym [182] exprimieren. Mit solchen
humanisierten Mausmodellen sollte es möglich sein, die Übertragbarkeit von Ergebnissen
aus Tiermodellen auf die humane Situation zu verbessern. Dennoch sollten die Daten aus
Tiermodellen durch Untersuchungen an geeigneten in vitro-Zellmodellen überprüft und
gegebenenfalls ergänzt werden [8]. Eine kürzlich erschienene, vorläufige Richtlinie der
FDA (U.S. Food and Drug Administration) für die Industrie empfiehlt bei der Entwicklung
neuer Arzneistoffe generell die Durchführung von Untersuchungen zur Beteiligung von
Transportern an der Pharmakokinetik des Arzneistoffs und zu Arzneimittelinteraktionen an
Transportern unter Zuhilfenahme von Zellsystemen, welche stabil Transportproteine
überexprimieren [183]. Entsprechende Forderungen werden auch von der europäischen
Zulassungsstelle EMA (European Medicines Agency) und dem International Transporter
Consortium gestellt [8, 184]. Zur Untersuchung der transportervermittelten Aufnahme von
Einleitung 29
Arzneistoffen in Zellen werden beispielsweise Zellsysteme, welche nach Transfektion mit
der cDNA des untersuchten Transporters das entsprechende Protein überexprimieren,
verwendet [21, 22, 40, 42]. Diese werden dann mit dem zu untersuchenden Arzneistoff
inkubiert und die Aufnahme des Arzneistoffs im Vergleich zu entsprechenden
Zellsystemen, welche jedoch nicht mit der Transporter-cDNA (Vektorkontrollzellen)
transfiziert wurden, ermittelt. Ist die Aufnahme in die Transporter-transfizierten Zellen
signifikant höher im Vergleich zu den Vektorkontrollzellen, so handelt es sich bei dem
untersuchten Arzneistoff um ein Substrat des Transporters [185]. Diese Zellsysteme eignen
sich zudem zu kinetischen Untersuchungen sowie zu Untersuchungen von
Arzneimittelinteraktionen an einem Transporter. Neben einzeltransfizierten Zellsystemen
finden auch doppelt- oder mehrfachtransfizierte Zellsysteme für funktionelle Analysen von
Transportproteinen Anwendung. Hierfür werden polar-wachsende MDCKII-Zellen (siehe
Abschnitt 5.2.2, [186]), welche mit der cDNA von einem (oder mehrerer)
Aufnahmetransporter und einem Effluxtransporter transfiziert wurden, verwendet. Diese
bilden, auf Filtersystemen ausgesät, sowohl eine basolaterale Membran aus, in welcher die
Aufnahmetransporter (z.B. OATP1B1/1B3/2B1) lokalisiert sind, als auch eine apikale
Membran, in welche der Effluxtransporter (z.B. MRP2) eingelagert ist [156, 187-189]. Auf
diese Weise kann nicht mehr nur die Aufnahme oder der Export einer Substanz als
getrennte Prozesse dargestellt werden, sondern es kann ein gerichteter, transzellulärer
Transport von Arzneistoffen untersucht werden. Somit lässt sich also ein Ausschnitt der
Transportvorgänge, welche an der Elimination von Arzneistoffen über den Hepatozyten in
die Galle beteiligt sind, in vitro analysieren [190-192]. Bislang weitgehend unerforscht ist
jedoch das Zusammenspiel von Transportern und metabolisierenden Enzymen in vitro.
Campbell et al. setzte drei tripeltransfizierte Zellsysteme, mit der Expression jeweils eines
hepatischen OATPs, des Phase-II-Enzyms UGT1A1 und des Effluxtransporters MRP2 zur
Untersuchung des vektoriellen Transportes von Porphyrinen ein, konnte jedoch eine
Glucuronidierung der verwendeten Substrate mittels UGT1A1 nicht nachweisen [193].
Entscheidend für die hepatische Elimination einer Vielzahl von Arzneistoffen ist jedoch
gerade das Zusammenspiel von Transportern und metabolisierenden Enzymen [194]. Als
Beispiel sei hier die Arzneimittelinteraktion zwischen Cerivastatin und Gemfibrozil, beides
lipidsenkende Arzneistoffe, genannt, welche zu einem erhöhten Auftreten von
unerwünschten Arzneimittelwirkungen wie Rhabdomyolysen und Myopathien führte [195].
Als Ursache dieser Interaktion konnten mehrere Mechanismen aufgeklärt werden: Zum
einen führt Gemfibrozil zu einer Inhibition der OATP1B1-vermittelten Aufnahme von
30 Einleitung
Cerivastatin in den Hepatozyten [43], zum anderen inhibiert Gemfibrozil zusätzlich die
Metabolisierung von Cerivastatin durch Blockade des Cytochrom-P450-Enzyms 2C8 und
der UDP-Glucuronosyltransferase 1A1 [196, 197]. Infolge dessen kam es zu einer bis zu
sechsfachen Erhöhung der Fläche unter der Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve (AUC) von
Cerivastatin und dadurch zum Auftreten der genannten unerwünschten
Arzneimittelwirkungen [198]. Es lässt sich also festhalten, dass die Pharmakokinetik eines
Arzneistoffs häufig durch ein komplexes Zusammenspiel von Transportern und
metabolisierenden Enzymen bestimmt wird und dass man allen Phasen der Elimination
eines Arzneistoffs Beachtung schenken sollte. Daher stellen Zellmodelle mit der parallelen
Expression von Transportern und metabolisierenden Enzymen wichtige neue Werkzeuge
zur Untersuchung dieses Zusammenspiels in vitro dar.
3.4. Verwendete Substrate für Transportversuche
Zur Testung der Funktionalität der MDCKII-OATP1B1 einzeltransfizierten Zelllinie wurde
das für die OATPs als Modellsubstrat bekannte Sulfobromophthalein (BSP) verwendet
[199]. Die Arzneistoffe Ezetimib, Etoposid und Bosentan wurden in transzellulären
Transportassays untersucht.
Bei Ezetimib handelt es sich um einen Arzneistoff, der zur Behandlung der
Hypercholesterolämie und Sitosterolämie zugelassen ist [200]. Ezetimib inhibiert selektiv
die Resorption von endogenem und exogenem Cholesterol und Phytosterolen in den
Enterozyten. Der Wirkmechanismus beruht dabei auf einer Hemmung des Niemann-Pick
C1 Like 1 Proteins, welches als intestinaler Cholesterol-Transporter identifiziert wurde und
eine wichtige Determinante der Cholesterolhomöostase darstellt [201, 202]. Eine
Biotransformation von Ezetimib über Phase-I-Enzyme findet kaum statt [200], allerdings
wird es mittels UDP-Glucuronosyltransferasen zu dem aktiven Metaboliten [1-O-[4-trans-
2S,3R)-1-(4-fluorophenyl)-4-oxo-3-[3(S)-hydroxy-3-(4-fluorophenyl)propyl]-2-azetidinyl]-
phenyl-ß-D-glucopyranuronic acid) glucuronidiert [2, 200, 203]. Die meisten Studien
gehen davon aus, dass die Glucuronidierung von Ezetimib zu diesem phenolischen
Glucuronid mittels des Enzyms UGT1A1 katalysiert wird [203, 204]. Ezetimib-Glucuronid
unterliegt einem ausgeprägten enterohepatischen Kreislauf und macht 80-90 % der
Gesamtkonzentration von Ezetimib im Plasma aus [200]. Es konnte bereits gezeigt werden,
dass sowohl Ezetimib als auch sein phenolisches Glucuronid mit dem hepatischen
Einleitung 31
Aufnahmetransporter OATP1B1 interagieren und dass Polymorphismen im SLCO1B1-Gen
mit einer veränderten Verteilung von Ezetimib assoziiert sind [57]. Des Weiteren deuten
Studien an Ratten- und Maus-Mrp2-Knockout-Tieren und in vitro-Untersuchungen an
MRP2-Membranvesikeln auf eine Beteiligung von MRP2 an der hepatischen Elimination
von Ezetimib-Glucuronid hin [205-207]. Bislang allerdings konnte Ezetimib-Glucuronid
noch nicht an einem geeigneten in vitro-Modell direkt als Substrat von MRP2 identifiziert
werden. Abbildung 5 stellt ein vereinfachtes Schema zur hepatischen Elimination von
Ezetimib dar.
Abbildung 5: Schematische Darstellung der möglichen Aufnahme, des Metabolismus und der möglichen Elimination von Ezetimib in der Leber. Bislang unzureichend aufgeklärte Mechanismen wurden mit einem Fragezeichen gekennzeichnet.
Bei Etoposid handelt es sich um ein Zytostatikum, welches in der Kombination mit anderen
antineoplastisch wirksamen Arzneistoffen zur Therapie von Bronchialkarzinomen, Non-
Hodgkin Lymphomen und des Morbus Hodgkin und in der Monotherapie zur Behandlung
des rezidivierten oder therapierefraktären Hodenkarzinoms und des fortgeschrittenen
Ovarialkarzinoms indiziert ist [208]. Die Wirkungsweise von Etoposid beruht auf einer
Hemmung der Topoisomerase II, eine Enzymklasse, welche an der Entwindung von
Chromosomenabschnitten beteiligt ist und deren Hemmung zur Apoptose (Zelltod) führt
[2, 209]. Es konnte bereits gezeigt werden, dass die UDP-Glucuronosyltransferase 1A1 für
die Glucuronidierung von Etoposid verantwortlich [210] und dass Etoposid ein Substrat der
humanen Effluxtransporter MRP2 und MRP3 ist [153, 211-213]. Des Weiteren lassen
Ergebnisse aus einer Studie an Mrp2-Knockout-Mäusen darauf schließen, dass neben
Etoposid auch Etoposid-Glucuronid ein Substrat von MRP2 darstellen könnte [214].
Bislang nicht untersucht ist die Frage nach der hepatischen Aufnahme von Etoposid und
auch die hepatische Elimination von Etoposid-Glucuronid mittels des humanen MRP2-
32 Einleitung
Transporters konnte bislang nicht abschließend gezeigt werden. In Abbildung 6 ist ein
vereinfachtes Schema zur hepatischen Elimination von Etoposid dargestellt.
Abbildung 6: Schematische Darstellung der möglichen hepatischen Aufnahme, des Metabolismus und der möglichen Elimination von Etoposid in der Leber. Bislang weitestgehend ungeklärte Mechanismen wurden mit einem Fragezeichen gekennzeichnet.
Bosentan ist ein dualer Endothelinrezeptor-Antagonist, welcher zur Behandlung der
pulmonalen arteriellen Hypertonie indiziert ist [215]. Es existieren zwei Typen von
Endothelinrezeptoren, ETA-Rezeptoren, welche an den Gefäßmuskelzellen und
Kardiomyozyten exprimiert werden und ETB-Rezeptoren, welche vor allem an
Endothelzellen, aber auch im ZNS und Intestinaltrakt vorkommen. Vor allem die
Aktivierung von ETA-Rezeptoren führt zu einer starken Vasokonstriktion, was zu einer
Erhöhung des Strömungswiderstandes im arteriellen System und somit zu einer Steigerung
des Blutdruckes führt [1, 216]. Bosentan hat eine hohe spezifische Affinität zu beiden
Endothelinrezeptoren und antagonisiert somit die Wirkung des natürlichen
Endothelinrezeptor-Agonisten Endothelin 1 [215-219]. Der Arzneistoff wird in der Leber
über die Cytochrom-P450-Enzyme 3A4 und 2C9 zu einem Phenol-Metaboliten (Ro 47-
8634), einem Hydroxy-Metaboliten (Ro 48-5033) und einem sekundären Hydroxyphenol-
Metaboliten (Ro 64-1056) umgesetzt [217, 218, 220]. Unter den gebildeten Metaboliten ist
der Hydroxy-Metabolit pharmakologisch aktiv und stellt wie Bosentan ein Substrat des
hepatischen Aufnahmetransporters OATP1B1 dar [218]. Die Elimination von Bosentan-
Metaboliten und möglicherweise von Bosentan selbst erfolgt zu 90 % biliär [221, 222]. Da
ADME-Studien am Menschen mit peroraler Applikation durchgeführt und nachfolgend nur
Urin- und Fäzesproben untersucht wurden, ist unklar, ob ein Anteil des in den Fäzes
wiedergefundenen Bosentans auch auf eine biliäre Elimination von Bosentan selbst
zurückzuführen sein kann oder ob das in den Fäzes gefundene Bosentan nur durch eine
Einleitung 33
unvollständige Resorption zu erklären ist. Die hepatische Sekretion von Bosentan-
Metaboliten als auch der Phase-II-Metabolismus des Arzneistoffs ist bislang ebenfalls nur
unzureichend geklärt [220, 221, 223, 224]. Abbildung 7 stellt ein vereinfachtes Schema zur
hepatischen Elimination von Bosentan dar.
Abbildung 7: Schematische Darstellung der Aufnahme, des Phase-I-Metabolismus, des möglichen Phase-II-Metabolismus von Bosentan und der möglichen Sekretion von Phase-II-Metaboliten und/oder Bosentan in der Leber. Bislang unzureichend aufgeklärte Mechanismen wurden mit einem Fragezeichen versehen.
Fragestellungen und Ziele dieser Arbeit 35
4. Fragestellungen und Ziele dieser Arbeit
Das koordinierte Zusammenspiel von Transportproteinen und metabolisierenden Enzymen
in der Leber stellt einen wichtigen Einflussfaktor für die Pharmakokinetik sehr vieler oral
verabreichter Arzneistoffe dar. Bislang gab es allerdings keine stabil transfizierten
Zellmodelle, um den Transport und die Metabolisierung eines Arzneistoffs und die
gegenseitige Beeinflussung dieser Prozesse in vitro untersuchen zu können.
Daher beschäftigte sich der erste Abschnitt dieser Arbeit mit der Fragestellung, ob es
möglich ist, mehrfachtransfizierte Zellmodelle mit der parallelen, stabilen Expression eines
Aufnahmetransporters (OATP1B1), eines Phase-II-Enzyms (UGT1A1) und einer
Effluxpumpe (MRP2) zu etablieren und funktionell zu charakterisieren.
Mithilfe dieser Zelllinie sollten im Anschluss folgende Fragestellungen bearbeitet werden:
• Stellt Ezetimib und/oder Ezetimib-Glucuronid ein Substrat für den hepatisch
exprimierten Effluxtransporter MRP2 in transzellulären Transportversuchen an
OATP1B1-UGT1A1-MRP2 stabil exprimierenden MDCKII-Zellen dar?
• Ist Etoposid ein Substrat für einen hepatischen OATP-Transporter?
• Stellt Etoposid und/oder Etoposid-Glucuronid in transzellulären
Transportversuchen an OATP1B1-UGT1A1-MRP2 stabil exprimierenden
MDCKII-Zellen ein Substrat für den Effluxtransporter MRP2 dar?
Als Fortführung des ersten Projektes beschäftigte sich der zweite Abschnitt dieser Arbeit
mit der Fragestellung, ob es möglich ist, ein mehrfachtransfiziertes Zellmodell mit der
parallelen Expression des Aufnahmetransporters OATP1B1, des Phase-I-Enzyms CYP3A4,
des Phase-II-Enzyms UGT1A1 und der Effluxpumpe MRP2 zu etablieren und funktionell
zu charakterisieren.
36 Fragestellungen und Ziele dieser Arbeit
Mithilfe dieser quadrupeltransfizierten Zelllinie wurden im Anschluss folgende
Fragestellungen untersucht:
• Werden Bosentan oder seine Phase-I-Metaboliten mittels der UDP-
Glucuronosyltransferase 1A1 glucuronidiert?
• Werden Bosentan und/oder mögliche Phase-II-Metaboliten des Arzneistoffs mittels
des hepatischen Effluxtransporters MRP2 transportiert?
Material und Methoden 37
5. Material und Methoden
5.1. Materialien
5.1.1. Chemikalien
Chemikalien Bezugsquelle Acetonitril hypergrade für LC-MS (LiChrosolv®) Merck KGaA, Darmstadt 30 % Acrylamid/Bis 37,5:1 (2,6 % C) Bio-Rad Laboratories GmbH, München Agarose GTQ (Roti®garose, gentechnologische Qualität)
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Ammoniumacetat Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Ammoniumperoxodisulfat (APS) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Ampicillin-Natriumsalz Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Barrycidal® 36 Biohit Deutschland GmbH, Rosbach BenchMark™ Pre-Stained Protein Ladder Invitrogen GmbH, Karlsruhe Blasticidin S InvivoGen, San Diego, Californien Bosentan Actelion Pharmaceuticals Ltd, Allschwil, Schweiz Bromphenolblau Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe tert-Butylmethylether Merck KGaA, Darmstadt Calciumchlorid Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablets
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Cytochrome c, Equine Heart Calbiochem®, Merck KGaA, Darmstadt Dimethylsulfoxid (DMSO) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Dithiothreitol (DTT) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 2-Log DNA Ladder New England Biolabs GmbH, Frankfurt D-PBS Pulver für 50 l Invitrogen GmbH, Karlsruhe D-PBS, -CaCl2, -MgCl2, steril Invitrogen GmbH, Karlsruhe E.coli FastMedia™ Blas Agar InvivoGen, San Diego, Californien, USA E.coli FastMedia™ Blas TB InvivoGen, San Diego, Californien, USA Eisessig Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Essigsäure Merck KGaA, Darmstadt Ethanol Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Ethidiumbromid Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Ethylendiamintetraessigsäure-di-Natriumsalz (EDTA)
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Etoposid Biotrend GmbH, Wangen, Schweiz Ezetimib Biotrend GmbH, Wangen, Schweiz Fetales Kälberserum Invitrogen GmbH, Karlsruhe GenAgarose LE Genaxxon Bioscience GmbH, Ulm Geneticin® (G418) Invitrogen GmbH, Karlsruhe Glucose Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Glycerol Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Glycin Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe HEPES Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 4-Hydroxychalcon Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München 1`-Hydroxymidazolam LGC Standards GmbH, Wesel 1`-Hydroxymidazolam-d4 LGC Standards GmbH, Wesel Hygromycin B Invitrogen GmbH, Karlsruhe Inulin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Isopropanol Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Kaliumcyanid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Kaliumchlorid Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
38 Material und Methoden
Kaliumdihydrogenphosphat Merck KGaA, Darmstadt di-Kaliumhydrogenphosphat Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe LB-Agar Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe LB-Medium Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Magermilchpulver Merck KGaA, Darmstadt Magnesiumchlorid Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Magnesiumsulfat Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe β-Mercaptoethanol Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Methanol Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Midazolam Lipomed GmbH, Weil am Rhein Minimum Essential Medium (MEM) Invitrogen GmbH, Karlsruhe NADPH-Tetranatriumsalz AppliChem GmbH, Darmstadt Natriumbutyrat Merck KGaA, Darmstadt Natriumchlorid Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Natriumdodecylsulfat (SDS) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Natriumhydroxid Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat Merck KGaA, Darmstadt Orange G Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Penicillin/Streptomycin Invitrogen GmbH, Karlsruhe Pepstatin (aus Streptomyces species) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Poly-D-Lysinhydrobromid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Ponceau S Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Protein Ladder 10-250 kDa New England Biolabs GmbH, Frankfurt Restore™ Western Blot Stripping Buffer Fisher Scientific GmbH, Schwerte RNA-Panel Human Total RNA Master Panel II Clontech Laboratories, Inc., Mountain View,
Californien, USA Saccharose Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Salzsäure 32 %, ROTIPURAN® Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe S.O.C.-Medium Invitrogen GmbH, Karlsruhe Sulfobromophthalein-Dinatriumsalz AppliChem GmbH, Darmstadt Szintillationsflüssigkeit Ultima Gold XR PerkinElmer LAS GmbH, Rodgau-Jügesheim Tetramethylethylendiamin (TEMED) AppliChem GmbH, Darmstadt Trichloressigsäure Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Tris-Base Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Tris-HCl Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Triton X-100 Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Trypsin-EDTA Invitrogen GmbH, Karlsruhe Tween 20 Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Water-Baker analyzed LC/MS-reagent Mallinckrodt Baker B.V., Deventer, Niederlande X-Gal Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Xylencyanol Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Zeocin™ Invitrogen GmbH, Karlsruhe
5.1.2. [3H]- und [14C]-markierte Chemikalien für Transportversuche
Chemikalien Spezifische Aktivität Bezugsquelle [14C]Bosentan 6 mCi/mmol Actelion Pharmaceuticals Ltd,
Allschwil, Schweiz [3H]Etoposid 20 Ci/mmol American Radiolabeled Chemicals,
Inc., St. Louis, Missouri, USA [3H]Ezetimib 45 Ci/mmol American Radiolabeled Chemicals,
Inc., St. Louis, Missouri, USA [3H]Inulin 2,25 Ci/mmol PerkinElmer LAS GmbH, Rodgau-
Jügesheim [3H]Sulfobromophthalein (BSP) 14 Ci/mmol Hartmann Analytic, Braunschweig
Material und Methoden 39
5.1.3. Reaktionssysteme (Kit Systeme)
Chemikalien Bezugsquelle Amersham™ ECL™ Western Blotting Detection Reagents GE Healthcare UK Ltd, Little Chalfont,
UK Antarctic Phosphatase Kit New England Biolabs GmbH, Frankfurt BCA™ Protein Assay Kit Fisher Scientific GmbH, Schwerte Effectene® Transfection Reagent Kit QIAGEN GmbH, Hilden GoTaq® Hot Start Polymerase Kit Promega GmbH, Mannheim iScript™ cDNA Synthesis Kit Bio-Rad Laboratories GmbH, München Light Cycler® FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I Kit Roche Diagnostics GmbH, Mannheim PureLink™ Quick Gel Extraction Kit Invitrogen GmbH, Karlsruhe PureYield™ Plasmid Miniprep System Promega GmbH, Mannheim QIAquick® Gel Extraction Kit QIAGEN GmbH, Hilden RNeasy® Mini Kit QIAGEN GmbH, Hilden Stratagene QuikChange® Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit
Agilent Technologies Sales & Services GmbH & Co.KG, Waldbronn
Stratagene QuikChange® Multi Site-Directed Mutagenesis Kit
Agilent Technologies Sales & Services GmbH & Co.KG, Waldbronn
T4 DNA Ligase Kit New England Biolabs GmbH, Frankfurt
5.1.4. Enzyme
Enzyme Bezugsquelle BamHI New England Biolabs GmbH, Frankfurt BglII New England Biolabs GmbH, Frankfurt EcoRI New England Biolabs GmbH, Frankfurt EcoRV New England Biolabs GmbH, Frankfurt ß-Glucuronidase (≥100 000 Fishman units/ml) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Lysozym (ca. 20 000 U/mg) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Ribonuklease T (ca. 23 500 U/ml) AppliChem GmbH, Darmstadt
5.1.5. Zellen
Zellen Bezugsquelle HEK293-VK G418 Institut für Experimentelle und Klinische Pharmakologie
und Toxikologie, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen
HEK293-VK Hygro Institut für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen
HEK293-OATP1B1 G418 Institut für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen
HEK293-OATP1B3 Hygro Institut für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen
HEK293-OATP2B1 G418 Institut für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen
40 Material und Methoden
MDCKII-VK G418 Deutsches Krebsforschungszentrum, Prof. Dr. D.Keppler, Heidelberg
MDCKII-OATP1B1 G418 Deutsches Krebsforschungszentrum, Prof. Dr. D.Keppler, Heidelberg
MDCKII-OATP1B1-MRP2 Deutsches Krebsforschungszentrum, Prof. Dr. D.Keppler, Heidelberg
MDCKII-OATP1B1-UGT1A1 Vorliegende Dissertation MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1 Vorliegende Dissertation MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2 Vorliegende Dissertation MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-MRP2 Vorliegende Dissertation MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1-MRP2
Vorliegende Dissertation
One Shot® TOP10 Chemically Competent E.coli
Invitrogen GmbH, Karlsruhe
XL10-Gold® Ultracompetent Cells Agilent Technologies Sales & Services GmbH & Co.KG, Waldbronn
5.1.6. Antikörper
Antikörper (AK) Bezugsquelle Monoklonaler Maus anti-humaner ß-Aktin Antikörper (Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys)
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
HRPO-konjugierter AffiniPure Ziege anti-Maus Antikörper IgG, Gesamtmolekül, Ziege, Maus, IgG (H+L), HRPO
Dianova GmbH, Hamburg
Aufgereinigtes polyklonales Kaninchen anti-humanes OATP1B1-Antiserum (ESL)
Institut für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen
Gereinigter polyklonaler Maus MaxPab anti-humaner CYP3A4 Antikörper (B01P)
Abnova, Taipei City, Taiwan
Polyklonaler Kaninchen anti-humaner UGT1A1 Antikörper (ab62600) Abcam, Cambridge, UK Polyklonaler Kaninchen anti-humaner MRP2 Antikörper (EAG5) Prof. Dr. D. Keppler,
Heidelberg HRPO-konjugierter Ziege anti-Kaninchen Antikörper IgG GE Healthcare UK Ltd,
Little Chalfont, UK
5.1.7. Spezifische Oligonukleotidprimer
Bezeichnung Verwendungs-
zweck Sequenz Bezugsquelle
ß-Actin.for qRT-PCR 5´-tgacggggtcacccacactgtgcccatcta-3´ biomers.net GmbH, Ulm ß-Actin.rev qRT-PCR 5´-ctagaagcatttgcggtggacgatggaggg-3´ biomers.net GmbH, Ulm OATP1B1-RT.for qRT-PCR 5´-tgcacttggaggcacctcac-3´ biomers.net GmbH, Ulm OATP1B1-RT.rev qRT-PCR 5´-cttcatccatgacacttccattt-3´ biomers.net GmbH, Ulm CYP3A4-RT.for qRT-PCR 5´-gcaagaagaacaaggacaacataga-3´ biomers.net GmbH, Ulm CYP3A4-RT.rev qRT-PCR /
Amplifikation 5´-agcagatctccttaggaaaattcag-3´ biomers.net GmbH, Ulm
UGT1A1-RT.for qRT-PCR 5´-gttacaaggagaacatcatg-3´ Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
Material und Methoden 41
5.1.8. Plasmide
Plasmide Bezugsquelle pCR®2.1-TOPO®-Vektor Invitrogen GmbH, Karlsruhe pCR®2.1-TOPO®-CYP3A4-RT Vorliegende Dissertation pCR®2.1-TOPO®-CYP3A4-NM Vorliegende Dissertation pCR®2.1-TOPO®-UGT1A1-RT Vorliegende Dissertation pCR®2.1-TOPO®-UGT1A1-NM Vorliegende Dissertation pcDNA3.1/Zeo(-) Invitrogen GmbH, Karlsruhe pcDNA3.1/Zeo(-)-UGT1A1 Vorliegende Dissertation pVITRO1-blasti-mcs(-) InvivoGen, San Diego, Californien, USA pVITRO1-blasti-mcs(-)-CYP3A4 Vorliegende Dissertation
5.1.9. Geräte und Software
UGT1A1-RT.rev qRT-PCR / Amplifikation
5´-cccacccacttctcaatggg-3´ Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
MRP2-RT.for qRT-PCR 5´-cttcggaaatccaagatcctgg-3 biomers.net GmbH, Ulm MRP2-RT.rev qRT-PCR 5´-tagaattttgtgctgttcacattct-3´ Biomers.net GmbH, Ulm CYP3A4-5`.for Amplifikation 5´-agatctgtaaggaaagtagtgatgg-3´ Biomers.net GmbH, Ulm UGT1A1-5`.for Amplifikation 5´-aaaggcgccatggctgtgga-3´ Sigma-Aldrich Chemie
GmbH, München CYP3A4-a209g Mutagenese 5´-ataagggcttttgtatgtttgacatggaatgtcat
aaaaagtatggaaaag-3´ Biomers.net GmbH, Ulm
CYP3A4-a560t Mutagenese 5´-ccctatcattgcccagtatggagatgtgttgg tga-3´
Biomers.net GmbH, Ulm
CYP3A4-a1435g Mutagenese 5´-acccagaaactgcattggcatgaggtttgct ctca-3´
Biomers.net GmbH, Ulm
CYP3A4-g1510a Mutagenese 5´-cttctccttcaaaccttgtaaagaaacacagatc ccc-3´
Biomers.net GmbH, Ulm
CYP3A4-t1584g Mutagenese 5´-aaaaacccgttgttctaaaggttgagtcaagggat ggc-3´
Biomers.net GmbH, Ulm
UGT1A1-t399c Mutagenese 5´-gcttttgtctggctgttcccacttactgcacaac aag-3´
Biomers.net GmbH, Ulm
UGT1A1-c1064t Mutagenese 5´-gaatcttgcgaacaacacgatacttgttaagtggc tac-3´
Biomers.net GmbH, Ulm
UGT1A1-g1161a Mutagenese 5´-cccatggtgtttatgaaagcatatgcaatggcg ttc-3´
Biomers.net GmbH, Ulm
CYP3A4-Seq1-for Sequenzierung 5´-gacaggcaagcctgtcaccttga-3´ Biomers.net GmbH, Ulm CYP3A4-Seq2-rev
Sequenzierung 5´-gattgttgagagagtcgatgttcac-3´ Biomers.net GmbH, Ulm
UGT1A1.seq1 Sequenzierung 5´-gcagcgggtgaagaacatgc-3´ Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
Geräte und Software Bezugsquelle CryoBox (NALGENE® System 100™) Fisher Scientific GmbH, Schwerte Einfrierbox NALGENE™ Cryo 1°C Freezing Container
A. Hartenstein Gesellschaft für Labor- und Medizintechnik mbH, Würzburg
Elektrophorese-Kammer Mini-PROTEAN 3 Cell Bio-Rad Laboratories GmbH, München Geldokumentationsimager Gel Jet Imager Intas Science Imaging Instruments GmbH,
Göttingen Gelelektrophorese-Kammer (Mini-) Sub Cell GT Bio-Rad Laboratories GmbH, München
42 Material und Methoden
5.1.10. Verbrauchsmaterialien
Verbrauchsmaterialien Bezugsquelle Acryl-Küvetten Sarstedt AG & Co., Nümbrecht CELLSTAR® Zellkultur Schale, 94x16 mm Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen CELLSTAR® 12 Well Zellkultur Multiwell Platte Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen Deckgläser für Haemacytometer (20x26 mm) Menzel GmbH & Co KG, Braunschweig Einfrierröhrchen NALGENE® Cryoware, Cryogenic Vials
Fisher Scientific GmbH, Schwerte
Gel Blotting Paper Schleicher & Schuell BioScience GmbH, Whatman Group, Dassel
Gel-Loadertips 1-200 µl A. Hartenstein Gesellschaft für Labor- und Medizintechnik mbH, Würzburg
Kanülen (20-Gauge, Sterican) B. Braun Melsungen AG, Melsungen LightCycler® Capillaries (20 µl) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Microcon Centrifugal Filter Devices YM-100 Millipore GmbH, Schwalbach/Ts. Multiwell™ 24 well Zellkulturplatte Becton Dickinson GmbH, Heidelberg Nitrocellulosemembran Whatman PROTRAN BA83, 0,2 µm
Schleicher & Schuell BioScience GmbH, Whatman Group, Dassel
Pasteurpipetten aus Glas, 150/230 mm Länge A. Hartenstein Gesellschaft für Labor- und Medizintechnik mbH, Würzburg
Pipettenspitzen Biosphere® Fil. Tip Sarstedt AG & Co., Nümbrecht Reagiergefäße (0,1/0,5/1/2 ml) Sarstedt AG & Co., Nümbrecht Rundbodengefäße (13 ml) Sarstedt AG & Co., Nümbrecht
Labcycler Compact/ Compact Gradient SensoQuest Biomedizinische Elektronik GmbH, Göttingen
LightCycler® 2.0 System Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Molecular Imager ChemiDoc XRS System Bio-Rad Laboratories GmbH, München Neubauer Zählkammer (Tiefe 0,1000 mm; 0,0025 mm2)
Paul Marienfeld GmbH & Co.KG, Lauda Königshofen
QuikChange® Primer Design Program Agilent Technologies Sales & Services GmbH & Co.KG, Waldbronn
sterilen Sicherheitswerkbank Klasse II (Kojair Biowizard)
Kojair Tech Oy, Vilppula, Finnland
Software Adobe Photoshop CS 3 Adobe Systems GmbH, München Software Analyst 1.4.2 Applied Biosystems, Toronto, Kanada Software GelCapture Intas Science Imaging Instruments GmbH,
Göttingen Software GraphPad Prism Version 4.01 GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA Software HUSAR (Heidelberg Unix Sequence Analysis Resources)
HUSAR Bioinformatics Lab, Abteilung Molekulare Biophysik, DKFZ/Steinbeis-Transferzentrum Genominformation, Heidelberg
Software LightCycler® Version 3.5 Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Software Quantity One® 1-D Analysis Software Bio-Rad Laboratories GmbH, München Spektrophotometer SmartSpec™ Plus Bio-Rad Laboratories GmbH, München Szintillationszähler Tri-Carb® 2800 TR Liquid Scintillation Analyser
PerkinElmer LAS GmbH, Rodgau-Jügesheim
Tankblotkammer Mini Trans-Blot® Electrophoretic Transfer Cell
Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Thermocycler MyCycler™ Bio-Rad Laboratories GmbH, München Triple-Quadrupol-Massenspektrometer API 4000™ LC-MS/MS System
Applied Biosystems, Toronto, Kanada
Zentrifuge Eppendorf Centrifuge 5810R Eppendorf AG, Hamburg Zentrifuge Hermle Z400 Hermle Labortechnik GmbH, Wehingen Zentrifuge IEC Micromax Microcentrifuge Thermo Electron Corporation, Pittsburgh, USA
Material und Methoden 43
Serologische Pipetten Sarstedt AG & Co., Nümbrecht Skalpell (Cutfix®, Sterile Einmalskalpelle) B. Braun Melsungen AG, Melsungen Spritze mit Luer-Ansatz: BD DiscarditTM II (20 ml) Becton Dickinson GmbH, Heidelberg Spritze: Injekt®-F solo 1ml Luer B. Braun Melsungen AG, Melsungen Sterilfilter Filtropur S 0,2 PAT / BT50 0,2 Sarstedt AG & Co., Nümbrecht Szintillationsgefäße Pony Vial™ 6 ml PerkinElmer LAS GmbH, Rodgau-Jügesheim ThinCert™ Zellkultureinsatz für 12 well Platten Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen Zellkulturflaschen (25/75 cm2) Sarstedt AG & Co., Nümbrecht Zellschaber, 25 cm Länge Sarstedt AG & Co., Nümbrecht Zentrifugenröhre (15/50 ml) Sarstedt AG & Co., Nümbrecht
5.2. Zellkultivierung
Alle Arbeiten mit Zellkulturen erfolgten unter keimfreien Bedingungen an einer sterilen
Sicherheitswerkbank Klasse II (Kojair Biowizard, Kojair Tech Oy). Zellkulturmedien
sowie Zusätze wurden von den Firmen Invitrogen GmbH und InvivoGen bezogen und vor
ihrer Verwendung im Wasserbad bei 37 °C erwärmt. Als Grundlage für die verschiedenen
Kulturmedien wurde Minimal Essential Medium (MEM, Invitrogen GmbH) verwendet,
welchem 10 % hitzeinaktiviertes (30 Minuten, 56 °C) fetales Kälberserum sowie
100 Einheiten/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin zur Vermeidung bakterieller
Kontaminationen zugesetzt wurde. Zusätzlich wurde diesem Basismedium je nach zu
kultivierender Zelllinie eines oder mehrere unterschiedliche Selektionsantibiotika
zugesetzt. Eine Übersicht über die Zusammensetzung der in dieser Arbeit verwendeten
Medien bietet Tabelle 1.
Eine Kultur der Zelllinien erfolgte in Kulturflaschen mit 25 cm2 oder 75 cm2 (Sarstedt AG
& Co.) bei 5 % CO2 und 37 °C durch zweimal wöchentliches Passagieren. Für diese
Subkultivierung wurden die adhärent und konfluent gewachsenen Zellen zunächst mit
sterilem magnesium- und calciumfreiem PBS-Puffer (D-PBS, -CaCl2, -MgCl2; Invitrogen
GmbH) gewaschen. Dies diente der Verhinderung einer Komplexbildung und Inaktivierung
des Enzyms Trypsin, welches für das Ablösen der Zellen verwendet wurde. Hierfür wurden
die Zellen mit einer Trypsinlösung (0,05 % Trypsin, 0,02 % EDTA in PBS; Invitrogen
GmbH) bei 37 °C inkubiert. Nach vollständigem Ablösen wurde das drei- bis fünffache
Volumen an Kulturmedium zugegeben, welches eine Inaktivierung des Trypsins sowie die
Adsorption des zelltoxischen EDTA bewirkte. Die so erhaltene Zellsuspension wurde
anschließend in eine 15 ml-Zentrifugenröhre (Sarstedt AG & Co.) überführt und bei
500 rpm drei Minuten lang in einem Ausschwingrotor (221.08.V01, Hermle Z400
Zentrifuge) zentrifugiert. Nach Absaugen des Überstandes wurde das Zellpellet vorsichtig
44 Material und Methoden
in Kulturmedium resuspendiert und im Verhältnis 1:10 – 1:20 je nach Zellart und Größe
der verwendeten Kulturflasche expandiert. Für nachfolgende Versuche wurde die Zellzahl
mittels einer Neubauer-Zählkammer (Paul Marienfeld GmbH & Co.KG) ermittelt und die
gewünschte Zellzahl ausgesät.
Von allen im Rahmen dieser Dissertation verwendeten und etablierten Zelllinien wurden
für spätere Anwendungen gefrorene Zellproben („Dauerkulturen“) mit jeweils 2-4 x 106
Zellen hergestellt. Das für eine Konzentration von 4-8 x 106 Zellen/ml benötigte Volumen
an Zellsuspension wurde nochmals in einer 15 ml-Zentrifugenröhre für drei Minuten bei
500 rpm zentrifugiert und mit Kulturmedium auf die gewählte Konzentration verdünnt. Zur
Vermeidung von Zellschädigungen wurde die Zellsuspension mit dem gleichen Volumen
an Einfriermedium durch Auf- und Abpipettieren gemischt und je 1,8 ml in
Einfrierröhrchen (Fisher Scientific GmbH) gefüllt. Die Einfrierröhrchen wurden in einem
Cryo-Einfriergerät (A. Hartenstein Gesellschaft für Labor- und Medizintechnik mbH) bei
-80 °C eingefroren und nach 24 Stunden dauerhaft bei -196 °C in flüssigem Stickstoff
gelagert. Bei Bedarf konnten die Zellen wieder in Kultur genommen werden, indem die
eingefrorenen Zellsuspensionen im Wasserbad bei 37 °C angetaut und zu 10 ml kaltem
Kulturmedium zugetropft wurden. Es folgte eine dreiminütige Zentrifugation bei 500 rpm.
Nach Absaugen des Mediums wurde das Zellpellet in 7 ml warmem Kulturmedium
resuspendiert und in eine Kulturflasche (25 cm2 Kulturfläche) ausgesät.
Material und Methoden 45
Tabelle 1: Zusammensetzung der Kulturmedien
Bezeichnung der Zelllinie Zusammensetzung des Mediums
HEK293-VK G418
HEK293-OATP1B1
HEK293-OATP2B1
Basismedium + 800 µg/ml Geneticin
HEK293-VK Hygro
HEK293-OATP1B3
Basismedium + 250 µg/ml Hygromycin B
MDCKII-VK G418
MDCKII-OATP1B1
Basismedium + 800 µg/ml Geneticin
MDCKII-OATP1B1-UGT1A1 Basismedium + 800 µg/ml Geneticin +
500 µg/ml Zeocin
MDCKII-OATP1B1-MRP2 Basismedium + 800 µg/ml Geneticin +
250 µg/ml Hygromycin B
MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1 Basismedium + 800 µg/ml Geneticin +
7 µg/ml Blasticidin S + 500 µg/ml Zeocin
MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2 Basismedium + 800 µg/ml Geneticin +
7 µg/ml Blasticidin S + 250 µg/ml
Hygromycin B
MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-MRP2 Basismedium + 800 µg/ml Geneticin +
500 µg/ml Zeocin + 250 µg/ml
Hygromycin B
MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1-
MRP2
Basismedium + 800 µg/ml Geneticin +
7 µg/ml Blasticidin S + 500 µg/ml Zeocin +
250 µg/ml Hygromycin B
Einfriermedium: 4 ml Kulturmedium, 4 ml hitzeinaktiviertes fetales Kälberserum
(Invitrogen GmbH), 2 ml DMSO (Carl Roth GmbH + Co. KG)
5.2.1. HEK293-Zellen (Human Embryonic Kidney Cells)
Die HEK293-Zelllinie wurde Anfang der 1970er Jahre von Graham und Kollegen etabliert
und 1977 erstmals beschrieben. Zu ihrer Generierung wurden humane embryonale
Nierenzellen (Human Embryonic Kidney Cells) mit gescherten DNA-Fragmenten des
46 Material und Methoden
humanen Adenovirus 5 transformiert [225]. Es handelt sich bei den HEK293-Zellen um
hypotriploide Epithelzellen, welche adhärent wachsen und einen einschichtigen Zellrasen
ausbilden. Allerdings fehlt diesen Zellen die Fähigkeit polarisiert zu wachsen, weshalb sie
sich nur für Aufnahmestudien, nicht aber für transzelluläre Transportversuche eignen.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden die folgenden, bereits am Lehrstuhl für Klinische
Pharmakologie und Klinische Toxikologie vorhandenen, stabil transfizierten HEK293-
Zelllinien für Aufnahmeversuche mit dem Zytostatikum Etoposid verwendet:
HEK293-VK G418
HEK293-VK Hygro
HEK293-OATP1B1
HEK293-OATP1B3
HEK293-OATP2B1
5.2.2. MDCKII-Zellen (Madin Darby Canine Kidney II Cells)
Die Madin Darby Canine Kidney- (MDCK) Zelllinie wurde 1958 von S.H. Madin und N.B.
Darby aus der Niere eines gesunden, ausgewachsenen weiblichen Cockerspaniels etabliert
und 1966 erstmals von Gaush et al. publiziert [226, 227]. Es existieren zwei Stämme dieser
Nierenepithelzelllinie (Stamm I und II), welche beide aus Zellen des distalen Tubulus oder
des Sammelrohrs des Nephrons stammen sollen [226, 228-230]. Der bedeutendste
Unterschied zwischen beiden Stämmen ist ihre elektrische Resistenz. Auf Filtern ausgesät
sind beide Stämme der Nierenepithelzelllinie in der Lage als Einzellenschicht (Monolayer)
zu wachsen und dabei eine basolaterale und eine apikale Membran auszubilden. Sie
wachsen somit also ähnlich polarisiert wie Epithelzellen in vivo [186, 226]. Dies hat den
Vorteil, dass sie sich nach Transfektion und folgender Überexpression von rekombinanten
Transporterproteinen ideal für transzellulär gerichtete Transportstudien eignen.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden folgende bereits am Lehrstuhl für Klinische
Pharmakologie und Klinische Toxikologie vorhandenen, stabil transfizierten MDCKII-
Zelllinien verwendet:
MDCKII-VK G418
MDCKII-OATP1B1
MDCKII-OATP1B1-MRP2
Material und Methoden 47
Weiterhin wurden aus den bereits vorhandenen MDCKII-Zelllinien folgende neue
Zelllinien etabliert und für transzelluläre Transportstudien eingesetzt:
MDCKII-OATP1B1-UGT1A1
MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1
MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2
MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-MRP2
MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1-MRP2
5.3. Klonierung der cDNAs kodierend für UGT1A1 und CYP3A4
5.3.1. UGT1A1
Zur Herstellung des UGT1A1-Expressionsplasmids pcDNA3.1/Zeo(-)-UGT1A1 wurde die
UGT1A1-Referenzsequenz (NM_000463.2) aus humaner Leber-cDNA mittels der
Oligonukleotide oUGT1A1-5`.for und oUGT1A1-RT.rev amplifiziert. Hierfür wurde
zunächst aus Leber-RNA (Human Total RNA Master Panel II, Clontech Laboratories, Inc.)
mittels reverser Transkription die entsprechende sscDNA synthetisiert und diese als
Template für die Amplifikation des UGT1A1-Fragmentes verwendet. Die so amplifizierte
Sequenz wurde mittels des TOPO TA Cloning Kits (Invitrogen GmbH) nach
Herstellerangaben in den Amplifikationsvektor pCR2.1-TOPO (Invitrogen GmbH) kloniert
und anschließend mittels Hitzeschocks in kompetente E.coli-Zellen (One Shot® TOP10
Chemically Competent E.coli, Invitrogen GmbH) transformiert. Zur Unterscheidung von
rekombinanten und nicht rekombinanten Klonen wurde auf LB-amp Agar Platten (LB-Agar
mit 10 % Ampicillin, Carl Roth GmbH + Co. KG) vor der Ausplattierung der
transformierten E.coli-Zellen immer X-Gal-Lösung (5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-
galactosid) ausplattiert. Das Prinzip dieses α-Komplementationstests beruht darauf, dass
das Amplifikationsplasmid ein lacZ-Gen besitzt, in welchem sich die Klonierungsstelle des
Plasmids befindet. Dieses Gen kodiert für das N-terminale α-Fragment der ß-Galactosidase,
welches zwar alleine keine ß-Galactosidase-Aktivität aufweist, aber zusammen mit dem
inaktiven C-terminalen ω-Fragment der kompetenten E.coli-Zellen wieder eine Aktivität
erhält, was als α-Komplementation bezeichnet wird [231-235]. Bakterienkolonien, welche
ein Plasmid ohne Insert aufnehmen, weisen eine intakte ß-Galactosidase auf und können so
48 Material und Methoden
aus dem 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactosid das Indoxyl abspalten, welches zum
blauen unlöslichen Farbstoff 5,5`-Dibrom-4,4`-dichlor-indigo oxidiert. Diese
Bakterienkolonien weisen dann entsprechend eine Blaufärbung auf. Bakterienkolonien
hingegen, deren lacZ-Gen durch die Insertion eines DNA-Fragmentes zerstört wurde,
zeigen keine ß-Galactosidase-Aktivität und erscheinen dadurch weiß. Weiße Kolonien
wurden abgeimpft und zur Isolierung von Plasmid-DNA in Übernachtkulturen [5 ml LB-
Medium (Carl Roth GmbH + Co. KG) versetzt mit 5 µl Ampicillin (50 µg/µl)] vermehrt.
Zur Überprüfung der Klonierung wurde die erhaltene Plasmid-DNA mit der
Restriktionsendonuklease EcoRI hydrolytisch gespalten und mögliche positive Klone
zusätzlich sequenziert (AGOWA GmbH). Die verifizierte DNA-Sequenz wurde
anschließend in den Expressionsvektor pcDNA3.1/Zeo(-) (Invitrogen GmbH) umkloniert.
Hierfür wurde die DNA-Sequenz aus dem Vektor mittels der Restriktionsendonukleasen
EcoRV und BamHI entfernt und in den mit den gleichen Enzymen linearisierten
Expressionsvektor pcDNA3.1/Zeo(-) mithilfe des T4 DNA Ligase Kits (New England
Biolabs GmbH) bei 16 °C über Nacht ligiert. Die Transformation des ligierten
pcDNA3.1/Zeo(-)-UGT1A1 Plasmids erfolgte in transformationskompetente E.coli-
Bakterienstämme (XL10-Gold Ultracompetent cells, Agilent Technologies Sales &
Services GmbH & Co.KG) mittels Hitzeschocks nach Anleitung des Herstellers. Die
Selektion erfolgte auf LB-amp Agar Platten (LB-Agar mit 10 % Ampicillin, Carl Roth
GmbH + Co. KG). Mögliche positive Klone wurden zur Isolierung von Plasmid-DNA in
Übernachtkulturen vermehrt und die Klonierung mittels sequenzspezifischer hydrolytischer
Spaltung durch die Restriktionsendonukleasen EcoRV und BamHI überprüft.
Rekombinante Klone wurden zur Bestätigung der Nukleotidsequenz der Plasmid-DNA
sequenziert (AGOWA GmbH). Drei kodierende Basenpaaraustausche wurden mittels
Mutagenese mit den Oligonukleotiden oUGT1A1-T399C, oUGT1A1-C1064T und
oUGT1A1-G1161A wie unter Punkt 5.3.8 beschrieben korrigiert und mittels
sequenzspezifischer hydrolytischer Spaltung nochmals auf die Insertion des Fragmentes
geprüft. Nach Bestätigung der Richtigkeit der DNA-Sequenz durch Sequenzierung
(AGOWA GmbH) wurden Lagerungskulturen hergestellt [600 µl an Übernachtkultur des
Klons, dessen Insert mit der Referenzsequenz übereinstimmt, gemischt mit 400 µl Glycerol
(Carl Roth GmbH + Co. KG)] und bei -80 °C dauerhaft gelagert.
Material und Methoden 49
5.3.2. CYP3A4
Die Herstellung des CYP3A4-Expressionsplasmids pVITRO1-blasti-mcs-CYP3A4 mit der
Referenzsequenz NM_017460.3 erfolgte analog zur Klonierung der UGT1A1-cDNA. Zur
Klonierung der Referenzsequenz aus humaner Leber-cDNA wurden die Oligonukleotide
oCYP3A4-5`.for und oCYP3A4-RT.rev, in welche für eine spätere Umklonierung BglII-
Schnittstellen eingebracht waren, verwendet. Die Klonierung des PCR-Produktes erfolgte
zunächst wieder in den Amplifikationsvektor pCR2.1-TOPO (Invitrogen GmbH) und nach
Bestätigung der Richtigkeit der Klonierung mittels hydrolytischer Spaltung mit der
Restriktionsendonuklease BglII und Sequenzierung, wurde eine Umklonierung in den
Expressionsvektor pVITRO-blasti-mcs (InvivoGen) durchgeführt. Hierfür wurde das
DNA-Fragment durch hydrolytische Spaltung mit der Restriktionsendonuklease BglII aus
dem Amplifikationsvektor entfernt und mit dem ebenfalls mit dem Enzym BglII
linearisierten Expressionsvektor pVITRO-blasti-mcs mittels des T4 DNA Ligase Kits (New
England Biolabs GmbH) bei 16 °C über Nacht ligiert. Die Selektion erfolgte auf Blasticidin
S-haltigen Agarplatten (E.coli FastMedia™ Blas Agar, InvivoGen). Übernachtkulturen zur
Gewinnung von Plasmid-DNA wurden mit Blasticidin S-haltigem Medium (E.coli
FastMedia™ Blas TB, InvivoGen) angelegt. Hiernach wurde die Klonierung wiederum
mittels hydrolytischer Spaltung mit der Restriktionsendonuklease BglII und Sequenzierung
(AGOWA GmbH) überprüft. Fünf kodierende Basenpaaraustausche wurden mittels
Mutagenese mit den Oligonukleotiden oCYP3A4-a209g, oCYP3A4-a560t, oCYP3A4-
a1435g, oCYP3A4-g1510a und oCYP3A4-t1584g korrigiert und mittels
sequenzspezifischer hydrolytischer Spaltung nochmals auf Insertion des Fragmentes
geprüft. Die Richtigkeit wurde mittels Sequenzierung überprüft und Lagerungskulturen
angelegt.
5.3.3. Analytische Plasmidpräparation
Die analytische Präparation von Plasmid-DNA erfolgte mittels einer modifizierten
Methode nach Holmes und Quigley [236]. Dabei handelt es sich um eine sehr schnelle und
einfache Methode, um ausreichende Mengen an Plasmid-DNA für sequenzspezifische
Restriktionsanalysen zu erhalten. Hierfür wurde von Übernachtkulturen 1,5 ml Suspension
in 1,5 ml Reagiergefäßen für fünf Minuten bei 5 000 rpm in einer Mikrozentrifuge
50 Material und Methoden
pelletiert (IEC Micromax Microzentrifuge, Thermo Electron Corporation). Nach Abnahme
des Überstandes wurde das Bakterienpellet in STETL-Puffer resuspendiert und die
Bakteriensuspensionen für 35 Sekunden im Wasserbad gekocht. Es folgte ein 10-minütiger
Zentrifugationsschritt bei 13 000 rpm. Das unlösliche Koagulat aus genomischer DNA und
Zelldebris wurde im Anschluss mittels eines autoklavierten Zahnstochers entfernt. Zur
Präzipitation der im Überstand gelösten Plasmid-DNA wurde das gleiche Volumen
Isopropanol zugegeben und nach gründlichem Mischen für 30 Minuten bei 4 °C und
13 000 rpm pelletiert (Eppendorf Centrifuge 5810R, Eppendorf Vertrieb Deutschland). Der
Überstand wurde nachfolgend verworfen und das DNA-Präzipitat an der Luft getrocknet.
Anschließend wurde das DNA-Präzipitat mit deionisiertem Wasser aufgenommen, welches
mit 24 Einheiten RNAse T (Ribonuklease T, Applichem GmbH) versetzt wurde.
STET-Puffer: 50 mM Tris (pH = 8), 50 mM EDTA, 8 % (w/v) Saccharose, 5 % (v/v)
Triton X-100 (alles Carl Roth GmbH + Co. KG)
STETL-Puffer: 1 ml STET-Puffer, 10 µl Lysozym [50 mg/ml (20 000 Einheiten/mg, Carl
Roth GmbH + Co. KG)]
5.3.4. Präparative Plasmidpräparation
Da die analytische Plasmidpräparation zwar sehr schnell und einfach durchzuführen ist, der
Reinheitsgrad der erhaltenen Plasmid-DNA allerdings nicht so hoch ist, wurde zur
Isolierung von reinerer Plasmid-DNA das PureYield™ Plasmid Miniprep System (Promega
GmbH) eingesetzt. Die so erhaltene Plasmid-DNA wurde nachfolgend beispielsweise für
stabile Transfektionen eingesetzt. Die analytische Plasmidpräparation wurde laut
Herstellerangaben durchgeführt [237].
5.3.5. Konzentrations- und Reinheitsbestimmung
Die Konzentrationsbestimmung von DNA- und RNA-Lösungen erfolgte über die
photometrische Messung der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm
(OD260). Die Konzentration der Nukleinsäurelösung kann dann aus der gemessenen
optischen Dichte bei 260 nm, dem Verdünnungsfaktor der Lösung und einem für RNA
Material und Methoden 51
bzw. DNA spezifischen Multiplikationsfaktor errechnet werden. Eine optische Dichte von
1 entspricht beispielsweise einer Konzentration von 50 µg/ml an doppelsträngiger DNA
[235]. Für eine Beurteilung der Reinheit der Nukleinsäurelösungen wurde eine weitere
Messung der optischen Dichte bei 280 nm (OD280) durchgeführt, was dem
Absorptionsmaximum von Proteinen entspricht. Über den Quotienten beider optischen
Dichten OD260/OD280 lässt sich nun eine Aussage über die Reinheit der Lösung treffen.
Eine weitgehend proteinfreie Lösung weist einen Wert zwischen 1,8 und 2 auf. Lösungen
mit niedrigeren Quotienten deuten auf eine Verunreinigung durch Proteine hin [235, 238,
239].
5.3.6. Analyse von DNA mittels Agarosegelelektrophorese
Die Auftrennung von DNA-Fragmenten, beispielsweise nach erfolgter Restriktionsanalyse
von Plasmiden, wurde mittels Agarosegelelektrophorese durchgeführt. Hierfür wurden
Flachbettgele mit Agarosekonzentrationen zwischen 0,8 und 2 % in 1 x TAE-Puffer
verwendet, welche eine Auftrennung von DNA-Fragmenten mit einer Länge von 0,1 bis
hin zu 15 kb (Kilobasen) ermöglichen [235]. Beim Anlegen eines elektrischen Feldes an
das Agarosegel migrieren die aufgrund der Phosphatgruppen negativ geladenen DNA-
Fragmente durch die Gelmatrix zur positiv geladenen Anode, wobei kleinere DNA-
Fragmente schneller durch die Matrix gelangen und so eine Auftrennung nach der
Molekülgröße erfolgt. Um den aufgetrennten DNA-Fragmenten später eine Größe
zuordnen zu können, wurde auf einer Spur zusätzlich ein DNA-Größenstandard (2-Log
DNA Ladder, New England Biolabs GmbH) aufgetragen. Durch Zugabe der Farbstoffe
Bromphenolblau, Xylencyanol und Orange G (alle drei Farbstoffe von Carl Roth GmbH +
Co. KG) zum Probenauftragepuffer konnte die elektrophoretische Auftrennung beobachtet
werden. Zur Anfärbung der DNA-Banden wurde der fluoreszierende Farbstoff
Ethidiumbromid (Carl Roth GmbH + Co. KG) in einer 0,05 %igen Lösung verwendet,
welcher unspezifisch zwischen die Basen der DNA interkaliert und UV-Licht zwischen
302-366 nm absorbiert und die aufgenommene Energie bei ca. 590 nm emittiert [235, 240,
241]. Hierdurch erscheint die DNA rötlich-orange. Eine Visualisierung und Digitalisierung
der Ergebnisse erfolgte unter Verwendung eines Geldokumentationsimagers mit
Aufnahmesoftware (Gel Jet Imager, Software Gel Capture, Intas Science Imaging
Instruments GmbH).
52 Material und Methoden
50 x TAE-Puffer (1l): 242 g Tris Base, 57,1 ml Eisessig, 100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0)
(alles Carl Roth GmbH + Co. KG)
Probenauftragepuffer: 50 % (w/v) Glycerol, 0,05 % (w/v) Bromphenolblau, 0,05 % (w/v)
Xylencyanol, 0,05 % (w/v) Orange G (alles Carl Roth GmbH + Co. KG)
5.3.7. Aufreinigung von DNA-Lösungen mittels Gelelution und Ultrafiltration
Die spezifische Amplifikation der UGT1A1- und CYP3A4-DNA-Fragmente wurde mittels
Agarosegelelektrophorese überprüft. Wurde im Agarosegel dabei nur eine für das jeweilige
DNA-Fragment spezifische Bande sichtbar, so wurde aus dem übrigen PCR-Ansatz das
DNA-Fragment mittels Ultrafiltration gereinigt. Für die Ultrafiltration wurden Microcon
Centrifugal Filter Devices YM-100 (Millipore GmbH) nach den Herstellerangaben
eingesetzt. Konnten im Agarosegel neben der spezifischen Bande weitere unspezifische
Banden detektiert werden, so wurde der komplette PCR-Ansatz mittels
Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und die spezifische Produkt-Bande aus dem Gel
mithilfe eines Skalpells herausgeschnitten. Es folgte eine Extraktion des entsprechenden
DNA-Fragmentes aus dem Gelstück mittels des PureLink™ Quick Gel Extraction Kits
(Invitrogen GmbH) oder des QIAquick® Gel Extraction Kits (QIAGEN GmbH) laut
Herstellerangaben [242, 243].
5.3.8. Mutagenese
Wie unter den Punkten 5.3.1 und 5.3.2 erwähnt, wurden die durch Klonierung erhaltenen
Expressionsplasmide pcDNA3.1/Zeo(-)-UGT1A1 und pVITRO1-blasti-mcs-CYP3A4
mittels Sequenzierung (AGOWA GmbH) und anschließendem Sequenzvergleich mit den
entsprechenden Referenzsequenzen auf ihre Richtigkeit überprüft. Dies erfolgte mit dem
Programm Heidelberg UNIX Sequences Analysis Resource (HUSAR, [244]), basierend auf
dem Wisconsin Genetics Computer Group Program Package [245]. Dabei fanden sich
nach Klonierung in der UGT1A1-Sequenz drei kodierende Basenpaaraustausche, welche
mittels gerichteter Mutagenese mit dem Stratagene QuikChange® Multi Site-Directed
Mutagenesis Kit (Agilent Technologies Sales & Services GmbH & Co.KG) korrigiert
Material und Methoden 53
werden konnten. In der CYP3A4-Sequenz wurden nach der Klonierung fünf kodierende
Basenpaaraustausche nachgewiesen. Diese wurden unter Verwendung des QuikChange®
Lightning Multi Site-Directed Mutagensis Kits (Agilent Technologies Sales & Services
GmbH & Co.KG) korrigiert. Beiden Kitsystemen liegt die Durchführung einer PCR mit
Mutageneseprimern zugrunde, welche eine Punktmutation enthalten, die zur Umkehrung
der Sequenzen in die entsprechenden Referenzsequenzen führten. Die Mutageneseprimer
wurden mithilfe des QuikChange® Primer Design Programms (Agilent Technologies Sales
& Services GmbH & Co.KG) konzipiert. Die Sequenzen der Mutageneseprimer sind in
einer Tabelle unter Punkt 5.1.7 aufgeführt. In der durchgeführten Mutagenese-PCR
entstehen überwiegend einzelsträngige DNA-Plasmide, welche die gewünschte Mutation
enthalten. Als weitere Produkte entstehen doppelsträngige DNA-Plasmide, wobei ein
Strang die gewünschte Mutation trägt. In einem nächsten Schritt wurden die als Matrizen
eingesetzten DNA-Plasmide mittels methylierungssensitiver Restriktionsendonuklease-
spaltung abgebaut. Das dabei eingesetzte Enzym DpnI-Restriktionsendonuklease erkennt
spezifisch methylierte und hemimethylierte DNA und baut diese ab. Hierbei macht man
sich also zunutze, dass Plasmid-DNA aus fast allen E.coli-Arten methyliert ist, wohingegen
die PCR-generierten DNA-Fragmente unmethyliert vorliegen [235, 246, 247]. Im
Anschluss wurde die als Einzelstrang vorliegende durch Mutagenese generierte Plasmid-
DNA wieder in ultrakompetente E.coli-Bakterien (XL10-Gold ultrakompetente Zellen)
transformiert, in denen der komplementäre Strang zu der transformierten einzelsträngigen
Plasmid-DNA synthetisiert wird [248, 249]. Zur Kontrolle der Insertion wurde nach der
analytischen Plasmidpräparation eine sequenzspezifische hydrolytische Spaltung mithilfe
der Restriktionsendonukleasen EcoRV und BamHI (UGT1A1) oder BglII (CYP3A4)
durchgeführt. Der Erfolg der Mutagenese wurde mittels Sequenzierung (AGOWA GmbH)
und anschließendem Alignment untersucht.
5.4. Etablierung von UGT1A1 stabil exprimierenden Zelllinien
Die Etablierung von UGT1A1 stabil exprimierenden Zelllinien erfolgte unter Verwendung
des Effectene® Transfection Reagent Kits (QIAGEN GmbH) nach Herstellerangaben. Es
handelt sich dabei um eine nicht liposomale Transfektionsmethode. Am Tag vor der
Transfektion wurden 1 x 106 Zellen in Zellkulturschalen (9,4 cm, CELLSTAR®, Greiner
Bio-One GmbH) mit 10 ml Kulturmedium ausgesät und über Nacht unter normalen
54 Material und Methoden
Wachstumsbedingungen (37 °C, 5 % CO2) bis zu einer 40 – 80 %igen Konfluenz kultiviert.
Anschließend wurden 2 µg der zu transfizierenden Plasmid-DNA pcDNA3.1/Zeo(-)-
UGT1A1 mit dem Puffer des Kitsystems (EC-Buffer), welcher die optimalen
Salzbedingungen für eine effiziente DNA-Kondensation liefert, auf ein Volumen von
300 µl gemischt. Daraufhin wurden 16 µl Enhancer-Lösung, welche in einem
Inkubationsschritt von fünf Minuten zur Kondensation der Plasmid-DNA führte, zur
Mischung pipettiert. Es folgte die Zugabe des Effectene Reagenz, welches aus Mizellen
besteht, und eine Inkubation von zehn Minuten bei Raumtemperatur (15-25 °C). Hierbei
wird die kondensierte DNA mittels der Mizellen mit kationischen Lipiden umhüllt und es
bildet sich ein DNA-Lipid-Transfektionskomplex. Dieser Transfektionskomplex wurde
anschließend in einer sterilen 15 ml-Zentrifugenröhre mit 3 ml vorgewärmtem
Kulturmedium gemischt und tropfenweise auf die Zellkulturschale gegeben, in der zuvor
das Kulturmedium durch 7 ml frisches vorgewärmtes Kulturmedium ersetzt wurde [250].
Die transfizierten Zellen wurden über Nacht unter normalen Kulturbedingungen kultiviert.
Am darauffolgenden Tag wurden die Zellen im Verhältnis 1:10 und 1:20 in Zeocin™-
haltigem Selektionsmedium passagiert. Die Zellen blieben so lange in Kultur, bis sich
einzelne makroskopisch sichtbare Kolonien bildeten.
Zur Selektion von stabil transfizierten Zellen wurde eine unter dem Handelnamen Zeocin™
geführte Formulierung des Phleomycin D1, ein als Kupferchelat vorliegendes Glykopeptid-
Antibiotikum aus einer Streptomyces verticillus Mutante, eingesetzt. Es gehört zur Familie
der strukturell verwandten Bleomycin/Phleomycin-Antibiotika. In der verwendeten
Zeocin™-Lösung sind Cu2+-Ionen an mehrere Stickstoffatome des Phleomycin D1
komplexiert. Als Kupferchelat vorliegend ist das Antibiotikum inaktiv. Dringt es in die
Zelle ein, wird das Cu2+ zu Cu1+ reduziert und durch Sulfhydryl-Verbindungen der Zelle
abgelöst. Das Entfernen des Kupfers führt zur Aktivierung des Antibiotikums, was zu
dessen Bindung an die DNA und damit zu DNA-Strangbrüchen führt [251-253]. Der zur
Transfektion verwendete Expressionsvektor pcDNA3.1/Zeo(-) enthält neben dem
Ampicillinresistenzgen zusätzlich ein Zeocin-Resistenzgen, kodierend für das Sh ble-
Protein, welches zur Inaktivierung des Zeocins führt und somit eine Selektion von
erfolgreich transfizierten von untransfizierten Zellen ermöglicht [254, 255]. Dem
Kulturmedium wurde dazu 500 µg/ml Zeocin™ zugesetzt. Sobald sich einzelne
makroskopisch sichtbare Zellklone gebildet hatten, wurden diese einzeln mithilfe von
autoklavierten Filterpapierstückchen (Schleicher & Schuell BioScience GmbH), welche mit
Trypsinlösung getränkt waren, in je eine Kavität einer Platte mit 24 Kavitäten (Becton
Material und Methoden 55
Dickinson GmbH), in welche zuvor Selektionsmedium gegeben wurde, überführt.
Erreichten diese Klone in den Kavitäten eine Konfluenz, wurden sie in Kulturflaschen
weiter passagiert. Zur Selektion des Zellklons mit der höchsten UGT1A1 mRNA-
Expression und UGT1A1 Proteinexpression wurden quantitative Real time-PCR- und
Immunblotanalysen durchgeführt. Folgende Zelllinien wurden durch stabile Transfektion
von bereits am Lehrstuhl für Klinische Pharmakologie und Klinische Toxikologie
vorhandenen einzeltransfizierten (MDCKII-OATP1B1) und doppelttransfizierten
(MDCKII-OATP1B1-MRP2) Zelllinien mit dem Expressionsplasmid pcDNA3.1/Zeo(-)-
UGT1A1 im Rahmen dieser Doktorarbeit etabliert:
MDCKII-OATP1B1-UGT1A1
MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-MRP2
5.5. Etablierung von CYP3A4 stabil exprimierenden Zelllinien
Die Etablierung von stabil CYP3A4-exprimierenden Zelllinien erfolgte unter Verwendung
des Expressionsplasmids pVITRO1-blasti-mcs-CYP3A4 und wurde wie bereits für
UGT1A1 beschrieben durchgeführt.
Zur Selektion von transfizierten Zellen wurde hier das aus Streptomyces
griseochromogenes isolierte Nucleosid-Antibiotikum Blasticidin S verwendet. Dieses
Antibiotikum inhibiert in Pro- und Eukaryonten die Proteinbiosynthese durch Inhibition der
Bildung von Peptidbindungen, was zum Absterben dieser Zellen führt. Eine Blasticidin S-
Resistenz der Zellen, die erfolgreich mit dem Expressionsvektor transfiziert wurden, wurde
durch das Blasticidin S-Resistenzgen bsr aus Bacillus cereus vermittelt. Dieses kodiert für
eine Blasticidin S-Deaminase, welche Blasticidin S zu einem inaktiven
Deaminohydroxyderivat überführt [256-258].
Zur Selektion des Klons mit der höchsten CYP3A4 mRNA-Expression und
Proteinexpression wurden wieder quantitative Real time-PCR- und Immunblotanalysen
durchgeführt. Folgende Zelllinien wurden durch stabile Transfektion von doppelt-
(MDCKII-OATP1B1-UGT1A1, MDCKII-OATP1B1-MRP2) und tripeltransfizierten
(MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-MRP2) Zelllinien im Rahmen dieser Doktorarbeit
etabliert:
MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1
MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2
56 Material und Methoden
MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1-MRP2
Um die neu etablierten als auch die bereits am Lehrstuhl für Klinische Pharmakologie und
Klinische Toxikologie vorhandenen und als Kontrollzelllinien in den Versuchen
verwendeten Zelllinien in ihren Expressionsniveaus vergleichen zu können, wurden
weiterhin vergleichende Real time-PCR- und semiquantitative Immunblotanalysen
durchgeführt.
5.6. Bestimmung der mikrosomalen Enzymaktivität
5.6.1. Bestimmung der NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase-Aktivität
Bei der NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase handelt es sich um ein Enzym, welches
am glatten endoplasmatischen Retikulum lokalisiert ist und als Elektronendonor für
mehrere Oxygenasen wie beispielsweise alle mikrosomalen Cytochrom-P450-
Monooxygenasen fungiert [259]. Da eine Aktivität dieses Enzyms grundlegend für eine
Aktivität des Cytochrom-P450-3A4-Enzyms in den damit transfizierten Zelllinien ist, wurde
die Aktivität der NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase in den für die stabile
Transfektion zur Verfügung stehenden Ausgangszelllinien (MDCKII-OATP1B1, MDCKII-
OATP1B1-MRP2, MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-MRP2) sowie in der
Vektorkontrollzelllinie (MDCKII-VK) untersucht [260-262]. Der Nachweis einer
Enzymaktivität erfolgte über die photometrisch messbare Reduktion von Cytochrom c bei
einer Wellenlänge von 550 nm. Ursprünglich wurde die NADPH-Cytochrom-P450-
Oxidoreduktase nämlich als eine NADPH-spezifische Cytochrom-c-Reduktase beschrieben
[263]. Erst spätere Studien belegten, dass die NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase
nicht das physiologische Enzym für die Reduktion von Cytochrom c in den Mitochondrien
darstellt [264]. Zum Nachweis der Enzymaktivität wurden Gesamthomogenate der bereits
erwähnten Zelllinien in PBS-Puffer (D-PBS, -CaCl2 -MgCl2, steril; Invitrogen GmbH)
versetzt mit Proteaseinhibitoren (Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablets,
Roche Diagnostics GmbH) hergestellt und die Proteinkonzentration mittels des BCA-
Proteinassays (Punkt 5.8.2) ermittelt. Ein Volumen des Gesamthomogenates, welches
150 µg Protein entsprach, wurde für drei Minuten in Gegenwart eines
Material und Methoden 57
Natriumphosphatpuffers (300 mM, pH 7,7), einer KCN- (1 mM) und einer Cytochrom c-
Lösung (40 µM) bei 25 °C im Wasserbad äquilibriert (jeweils
Endkonzentrationen/Reaktionsansatz). Die KCN-Lösung wurde dem Reaktionsansatz
zugegeben, um die Cytochrom-c-Oxidase zu hemmen, welche physiologisch die
Reoxidation von Cytochrom c katalysiert [265, 266]. Durch Zugabe einer NADPH-Lösung
(100 µM, Endkonzentration) wurde die Reaktion gestartet und die Reduktion von
Cytochrom c wurde bei einer Wellenlänge von 550 nm mithilfe des Bio-Rad SmartSpec™
Plus Spektrophotometers (Bio-Rad Laboratories) für drei Minuten aufgenommen [266-
268]. Zur Berechnung der Enzymaktivität in pmol reduziertes
Cytochrom c*mg Protein-1*min-1 wurde der Extinktionskoeffizient (ε550nm) von
21 mM-1cm-1 [267, 269] herangezogen. Um den alleinigen Umsatz von Cytochrom c durch
die NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase abschätzen zu können, wurden die Versuche
mit und ohne Zugabe von Gesamthomogenat durchgeführt und die Hintergrundabsorption
von der Absorption in Reaktionsansätzen mit Homogenat abgezogen.
5.6.2. Bestimmung der Cytochrom-P450-3A4-Aktivität
Die Aktivität der Cytochrom-P450-3A4-Monooxygenase wurde über die Umsetzung des
Modellsubstrates Midazolam bestimmt [270-273]. Bei Midazolam handelt es sich um ein
kurzwirksames 1,4-Benzodiazepin, welches im klinischen Alltag zur präoperativen
Sedierung, zur Einleitung und zur Aufrechterhaltung einer Anästhesie sowie zur Sedierung
von Patienten in der Intensivmedizin eingesetzt wird. Es unterliegt einem stark
ausgeprägten First-pass Metabolismus und wird dabei v.a. zu dem Hauptmetaboliten
1`-Hydroxymidazolam oxidiert. Als weitere Metaboliten treten das 4-Hydroxymidazolam
und der sekundäre Metabolit 1`,4-Dihydroxymidazolam auf. Der Hauptabbauweg zum
1`-Hydroxymidazolam ist bereits gut untersucht und gilt als Modellreaktion zur
Bestimmung der CYP3A-Aktivität [270, 271]. Die CYP3A4-Aktivitätsbestimmung wurde
analog zur Bestimmung der Cytochrom-P450-Enzymaktivität mittels des Substrates
Verapamil durchgeführt [274]. Hierfür wurden Gesamthomogenate aller im Rahmen dieser
Doktorarbeit verwendeten MDCKII-Zelllinien in Proteinlagerungspuffer hergestellt und
deren Proteinkonzentration mittels BCA-Proteinassays (Punkt 5.8.2) bestimmt. Ein
Volumen der Homogenate, welches 100 µg Protein entsprach, wurde mit einem
Kaliumdihydrogenphosphatpuffer (50 mM, pH 7,4), einer Magnesiumchlorid-Lösung
58 Material und Methoden
(30 mM) und 3 µM oder 250 µM Midazolam für zwei Minuten bei 37 °C äquilibriert
(jeweils Endkonzentrationen/Reaktionsansatz). Durch Zugabe einer NADPH-Lösung
(4,8 mM, Endkonzentration) zu einem Gesamtvolumen von 250 µl wurde die Reaktion
gestartet. Nach einer Inkubation der Reaktionsansätze von fünf Minuten bei 37 °C wurde
die Umsetzung durch Zugabe von 500 µl eiskalten Acetonitrils (Merck KGaA) gestoppt
und die Proben bei –80 °C eingefroren. Die Menge an gebildetem 1`-Hydroxymidazolam
wurde mittels LC-MS/MS bestimmt und die Aktivität der Cytochrom-P450-3A4-
Monooxygenase wurde ausgedrückt als gebildetes 1`-Hydroxymidazolam in
pmol*mg Protein-1*min-1.
Proteinlagerungspuffer: 100 mM Tris-HCl (Carl Roth GmbH + Co. KG), 1 Complete
Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablette (Roche Diagnostics GmbH), 1 µg/ml Pepstatin
(Roche Diagnostics GmbH); pH: 7,4
5.6.3. Quantifizierung von 1`-Hydroxymidazolam mittels LC-MS/MS
Die Bestimmung der Konzentration an 1`-Hydroxymidazolam in den Zelllysaten erfolgte
mittels der Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS, liquid
chromatography-, tandem mass spectrometry). Hierfür wurden zu 50 µl an Probenvolumen
50 µl einer Lösung des internen Standards (1`-Hydroxymidazolam-d4, 50 ng/ml) gegeben
und beide Lösungen gemischt. Nach einem Zentrifugationsschritt (zwei Minuten bei
15000 rpm, Eppendorf Centrifuge 5810R, Eppendorf AG) wurden 50 µl des Überstandes
abgenommen und mit 50 µl der mobilen Phase [12 mM Ammoniumacetat:Acetonitril, 1+1
(v/v)] gemischt. Hiervon wurde ein Volumen von 20 µl in die Anlage injiziert.
Kalibrierproben und Qualitätskontrollen unter Verwendung der gleichen Matrix wurden auf
gleiche Weise hergestellt.
Die Anlage bestand aus einem API 4000™ Triple-Quadrupol-Massenspektrometer
(Applied Biosystems) ausgestattet mit einem Agilent 1100 HPLC System (Agilent
Technologies Deutschland GmbH). Die LC-MS/MS-Analyse wurde unter Verwendung der
Elektronenspray-Ionisation (ESI) im positiven Ionenmodus durchgeführt. Die
Chromatographie erfolgte isokratisch mit einem Fließmittel, bestehend aus einer Mischung
von 12 mM Ammoniumacetat:Acetonitril im Verhältnis 1+1 (v/v), und einer
Fließgeschwindigkeit von 0,6 ml pro Minute. Die chromatographische Auftrennung
Material und Methoden 59
erfolgte mittels einer ZORBAX Eclipse XDB C18 Säule (150 mm x 4,6 mm, Partikelgröße
5 µm, Agilent Technologies Deutschland GmbH) mit einer entsprechenden Vorsäule AQ
C18 (4 mm x 3 mm, Phenomenex Ltd). Ein 2-Position-10-Port Multifunctional Valve der
Firma VICI Valco Instruments Co. Inc. wurde hinter der Trennsäule angebracht, um Salze
aus den Proben herauszutrennen. Eine Detektion fand für Stoffe statt, welche nach 4,5 bis
6,5 Minuten von der Säule kamen. Der vorherige Durchfluss und der Durchfluss bis eine
halbe Minute danach wurden verworfen. Die Massenübergänge und Kollisionsenergien
lagen bei m/z 342,1-324,3 und 31 eV für 1`-Hydroxymidazolam und bei m/z 346,0-328,1
und 31 eV für 1`-Hydroxymidazolam-d4. Der validierte Kalibrationsbereich betrug
0,1-100 ng/ml und die untere Bestimmungsgrenze (LLOQ, lower limit of quantification)
lag bei 0,1 ng/ml. Zur Bestimmung des Verhältnisses von Peak zu Fläche von
1`-Hydroxymidazolam zu dem des internen Standards wurde die Analyst 1.4.2 Software
(Applied Biosystems) herangezogen. Die lineare Regression wurde mit 1/x gewichtet und
die Korrelationskoeffizienten lagen bei mindestens 0,999. Die intraday-
Variationskoeffizienten für die Konzentrationen 0,1/ 0,25/ 50 und 100 ng/ml bewegten sich
zwischen 2,0 und 6,1 % und die intraday-Richtigkeit der Messung variierte zwischen 3,9
und 15,7. Die interassay-Variabilität wurde anhand von Vergleichsanalysen von fünf
Kalibrationskurven (1-100 ng/ml), welche an unterschiedlichen Tagen hergestellt wurden,
untersucht. Die Variationskoeffizienten lagen hierbei zwischen 4,2 und 13,2 % und die
Richtigkeit der Messung lag zwischen -1,9 und 3,1.
5.7. Methoden der RNA-Analytik
5.7.1. Isolierung von Gesamt-RNA
Für vergleichende Expressionsanalysen wurde Gesamt-RNA aus allen in der vorliegenden
Doktorarbeit verwendeten MDCKII-Zelllinien isoliert. Hierfür wurden von jeder Zelllinie
zunächst 1-2 x 106 Zellen in Zellkulturschalen (9,4 cm, CELLSTAR®, Greiner Bio-One
GmbH) ausgesät und unter normalen Wachstumsbedingungen kultiviert. Am Folgetag
wurden die ausgesäten Zellen mit Natriumbutyrat-haltigem Kulturmedium (10 mM)
induziert. Natriumbutyrat führt über die Inhibition der Histondeacetylase zu einer
vermehrten Proteinexpression [153]. Nach einer 24-stündigen Inkubation wurde mit der
60 Material und Methoden
Isolierung der Gesamt-RNA aus den Zelllinien mithilfe des RNeasy Mini Kits (QIAGEN
GmbH) nach Herstellerangaben begonnen. Für die Isolierung wurde zunächst das
Kulturmedium abgenommen und der Zellrasen mit PBS-Puffer (D-PBS, -CaCl2 -MgCl2,
steril; Invitrogen GmbH) gewaschen, um alle Mediumbestandteile, welche im Verlauf der
Isolation zu einer Störung führen können, zu entfernen. Anschließend wurde der im Kit
enthaltene RLT-Puffer, welcher mit ß-Mercaptoethanol versetzt wurde und
Guanidinisothiocyanat enthält, zugegeben. Bei Guanidinisothiocyanat handelt es sich um
ein chaotropes Salz, welches die dreidimensionale Struktur von Proteinen zerstört und sie
somit inaktiviert. Hierdurch können beispielsweise auch RNasen inaktiviert werden [235,
239, 275, 276]. In diesem denaturierenden Puffer wurden die Zellen mithilfe eines
Zellschabers (Sarstedt AG & Co.) von der Zellkulturschale gelöst und in eine 15 ml-
Zentrifugenröhre überführt. Es folgte das Homogenisieren des Lysates durch zehnmaliges
Auf- und Abziehen des Lysates durch eine 20-Gauge-Kanüle (0,9 mm Durchmesser,
Sterican, B. Braun Melsungen AG). Durch Zugabe des gleichen Volumens von 70 %igem
Ethanol wurden die Nukleinsäuren gefällt. Anschließend wurde dieses Gemisch auf die
Affinitätssäulen des Kitsystems aufgetragen und für 15 Sekunden bei 8 000 g zentrifugiert
(IEC Micromax Microzentrifuge, Thermo Electron Corporation). Nachdem die
Zellsuspension vollständig aufgetragen war, konnte die RNA mittels der Affinitätssäulen
unter mehreren Waschschritten gereinigt werden. Die Elution der RNA von der Säule
erfolgte mit 32 µl RNase-freiem Wasser [277]. Die Konzentrations- und
Reinheitsbestimmung der RNA-Lösung wurde wie unter Punkt 5.3.5 über die Messung der
optischen Dichte bei 260 nm mithilfe eines Spektrophotometers (SmartSpec™ Plus, Bio-
Rad Laboratories GmbH) durchgeführt.
5.7.2. Synthese von sscDNA
Die Synthese von sscDNA wurde mithilfe des iScript™ cDNA Synthesis Kits (Bio-Rad
Laboratories) nach Herstellerangaben durchgeführt. Bei dem Enzym, welches die cDNA-
Synthese (complementary DNA) katalysierte, handelte es sich um eine Reverse
Transkriptase aus dem Moloney murine strain of leukemia virus (MMLV-RT). Um eine
Degradation des RNA-Templates zu verhindern, liegt die Reverse Transkriptase im
Kitsystem zusammen mit einem RNase-Inhibitor vor. Als Oligonukleotide waren im
Kitsystem sowohl Oligo(dt)-Primer, welche sich spezifisch an den Poly(A)-Schwanz der
Material und Methoden 61
mRNA anlagern als auch random Hexamer-Oligonukleotide enthalten. Diese bestehen aus
sechs zufällig zusammengesetzten Nukleotiden, welche statistisch gesehen an jeder Stelle
der RNA hybridisieren können [239]. Drei Schritte waren im Thermocycler (MyCyler™,
Bio-Rad Laboratories GmbH bzw. Labcycler Compact, SensoQuest Biomedizinische
Elektronik GmbH) zur Synthese der cDNA notwendig: Zunächst wurde der
Reaktionsansatz, bestehend aus Gesamt-RNA in Wasser, 5x-iScript-Reaktionsmix (darin
enthalten sind die Oligonukleotide) und iScript-Reverse Transkriptase für 10 Minuten bei
25 °C inkubiert, um das Anlagern der Primer zu gewährleisten. Es folgte ein 30-minütiger
Inkubationsschritt bei 42 °C, bei dem die cDNA synthetisiert wurde und in einem letzten
Schritt wurde die Reverse Transkriptase für fünf Minuten bei 85 °C inaktiviert [278].
5.7.3. Quantitative Real-time PCR
Bei der quantitativen Real-time PCR handelt es sich um eine Polymerasekettenreaktion
(PCR, polymerase chain reaction), welche in Echtzeit verfolgt werden kann und welche
zur quantitativen Expressionsanalyse von Genen eingesetzt wird. Im Rahmen dieser Arbeit
wurden die mRNA-Expressionen von SLCO1B1, CYP3A4, UGT1A1 und ABCC2 in allen
verwendeten MDCKII-Zelllinien untersucht. Als Template wurde die im vorherigen Schritt
generierte cDNA der jeweiligen Zelllinie eingesetzt. Die Sequenzen der verwendeten
Oligonukleotide sind der Tabelle unter Punkt 5.1.7 zu entnehmen. Die Durchführung der
quantitativen Real-time PCR erfolgte mit dem LightCycler® FastStart DNA MasterPLUS
SYBR Green I Kit (Roche Diagnostics GmbH) in einem Real time-Kapillar-Cycler
(LightCycler® 2.0 System, Roche Diagnostics GmbH) gemäß Herstellerangaben. Durch
Einsatz des in doppelsträngige DNA interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffes SYBR Green I
kann die Menge der in jedem Zyklus synthetisierten DNA mithilfe des LightCycler® 2.0
Systems mitverfolgt werden [279]. Die maximale Anregung des Fluoreszenzfarbstoffes
erfolgt unter blauem Licht einer Wellenlänge von 497 nm und die maximale Emissionsrate
des entstehenden DNA-Fluoreszenzfarbstoff-Komplexes liegt bei einer Wellenlänge von
521 nm [280]. Im ungebundenen Zustand hingegen strahlt der Farbstoff kaum eine
Fluoreszenz ab. Da der Fluoreszenzfarbstoff also nur an doppelsträngige DNA bindet, ist
ein Fluoreszenzanstieg proportional zur synthetisierten Menge an doppelsträngiger DNA.
Zur Quantifizierung wurde der CT-Wert (cycle threshold) herangezogen. Dieser beschreibt
den Zyklus, bei dem sich das Fluoreszenzsignal erstmals signifikant vom Hintergrund
62 Material und Methoden
abhebt. Weiterhin wurden als Kalibrierproben Plasmid-DNAs mit einem Real-time PCR-
Fragment der Gene UGT1A1 und CYP3A4 über einen Konzentrationsbereich von 1 ng/µl
bis 1 pg/µl mitgeführt. Trägt man die ermittelten CT-Werte der einzelnen Kalibrierproben
gegen den Logarithmus der in den Kalibierproben eingesetzten Menge an DNA auf, so
ergibt sich eine Standardkurve, mit der man über die CT-Werte der Proben auf deren
Template-Menge schließen kann [235, 281, 282]. Die Zusammensetzung der PCR-
Reaktionsansätze als auch die Einstellungen für die PCR-Zyklen sind den Tabellen 2 und 3
zu entnehmen. Da der Fluoreszenzfarbstoff an jede doppelsträngige DNA bindet und somit
auch unspezifische Produkte wie beispielsweise Primerdimere detektiert, wurde im
Anschluss an die quantitative Real-time PCR noch eine Schmelzkurvenanalyse der
amplifizierten DNA-Fragmente durchgeführt [235]. Hierbei wurde die Temperatur um
0,1 °C/s von 60 °C auf 95 °C kontinuierlich erhöht und dadurch die entstandenen DNA-
Fragmente aufgeschmolzen. Der in der doppelsträngigen DNA gebundene
Fluoreszenzfarbstoff wurde beim Schmelzvorgang freigesetzt, was zu einer messbaren
Abnahme des Fluoreszenzsignals führte. Da Primerdimere bei niedrigeren Temperaturen
schmelzen als spezifische PCR-Produkte, konnte somit über die resultierenden
Schmelzkurven die Spezifität der PCR kontrolliert werden. Als Negativkontrollen wurden
in allen quantitativen Real-time PCR-Analysen Ansätze ohne Template (NTCs, no template
controls) mitgeführt. Als endogene Expressionskontrolle wurde in jeder cDNA neben den
zu untersuchenden Genen auch das Haushaltsgen ß-Aktin detektiert, da dieses relativ
konstant und vergleichbar in allen untersuchten Zelllinien exprimiert wird. Alle Werte der
quantitativen Analyse wurden als prozentuale Expression relativ zum Haushaltsgen ß-Aktin
angegeben.
Tabelle 2: Reaktionsansatz für die qRT-PCR
Lösung Volumen/Konzentration
5x Mastermix 2 µl
Forward Primer 1 µl (10 mM)
reverse Primer 1 µl (10 mM)
Template 1 µl
Wasser 5 µl
Material und Methoden 63
Tabelle 3: Temperaturbedingungen für die qRT-PCR
PCR-Schritte Zyklen Temperatur Zeit
Vorinkubation 1 95 °C 10 min
Real-time PCR 45 95 °C 10 s
64 °C 10 s
72 °C 30 s
Schmelzkurvenanalyse 1 95 °C 10 s
60 °C 10 s
60 °C – 95 °C 0,1 °C/s Temperaturzunahme
Abkühlung 1 40 °C 60 s
5.8. Methoden der Proteinanalytik
5.8.1. Zellaufarbeitung
Zur Herstellung von Proteinhomogenaten wurden von allen in der vorliegenden Arbeit
verwendeten MDCKII-Zelllinien zunächst 2-3 x 106 Zellen pro Zellkulturschale (9,4 cm,
CELLSTAR®, Greiner Bio-One GmbH) ausgesät. Am darauffolgenden Tag wurde die
Expression in den Zellen mit Natriumbutyrat-haltigem Kulturmedium (10 mM) induziert
und die Zellen für 24 Stunden unter normalen Kulturbedingungen weiter kultiviert. Nach
dieser Inkubationszeit wurde das Kulturmedium entfernt und der Zellrasen mit PBS-Puffer
(D-PBS, -CaCl2 -MgCl2, steril; Invitrogen GmbH) gewaschen. Nach weiterer Zugabe von
PBS-Puffer und einer fünfminütigen Inkubation bei 37 °C konnte der konfluente Zellrasen
mittels eines Zellschabers (Sarstedt AG & Co.) gelöst und in eine 15 ml-Zentrifugenröhre
überführt werden. Danach wurde die Zellsuspension für 10 Minuten bei 4 °C und 400 g
zentrifugiert (Eppendorf Centrifuge 5810R, Eppendorf AG). Das entstandene Zellpellet
wurde in 100 µl Lysepuffer resuspendiert. Eine Lagerung der Homogenate erfolgte bei
-20 °C.
Lysepuffer: 7 ml 0,2 %ige Sodiumdodecylsulfatlösung, 1 Complete Mini Protease
Inhibitor Cocktail Tablette (Roche Diagnostics GmbH)
64 Material und Methoden
5.8.2. Quantifizierung des Gesamtproteingehaltes
Zur Bestimmung der Gesamtproteinmenge wurde das BCA™ Protein Assay Kit (Fisher
Scientific GmbH) verwendet. Grundlage dieser Bestimmung ist eine erstmals von Smith et
al. 1985 beschriebene Methode [283]. Sie stellt eine Kombination der Biuret-Reaktion zur
Bestimmung von Proteinen mit Bicinchoninsäure dar und nutzt dabei aus, dass Cu2+-Ionen
im alkalischen Milieu mit Proteinen über deren Peptidbindungen ein Chelat bilden. In
dieser Reaktion werden die Cu2+-Ionen zu Cu1+-Ionen reduziert. Das reduzierte Cu1+
reagiert anschließend mit zwei Molekülen Bicinchoninsäure zu einem farbigen Komplex.
Das Absorptionsmaximum dieses purpurfarbenen Komplexes liegt bei 562 nm und die
Extinktion des Komplexes verhält sich über einen breiten Proteinkonzentrationsbereich fast
linear (20-2000 µg/ml, [284]).
Zur Bestimmung der Proteinwerte wurden zu 25 µl jeder Probe 500 µl einer frisch
hergestellten Bicinchoninsäure-Kupfersulfatlösung [Mischen der Lösungen A (BCA/0,1 M
NaOH) und B (4 % Cu2SO4) des BCA™ Protein Assay Kits im Verhältnis 50:1] gegeben
und diese für 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Alle Proben zur Verwendung in
Immunboltanalysen wurden vor ihrer Vermessung im Verhältnis 1:10 und 1:25 verdünnt.
Danach wurden die Proben in Acryl-Küvetten (Sarstedt AG & Co.) überführt und ihre
Extinktion bei 526 nm mit einem Spektrophotometer (SmartSpec™ Plus, Bio-Rad
Laboratories GmbH) gemessen. Auf gleiche Weise wurden Kalibrierproben aus
Rinderserumalbumin (BCA™ Protein Assay Kit, Fisher Scientific GmbH) in einem
Konzentrationsbereich von 100 µg/ml bis 750 µg/ml angesetzt und vermessen. Dies diente
der Erstellung einer Kalibriergeraden, auf deren Basis mittels linearer Regressionsanalyse
der Proteingehalt der Proben ermittelt werden konnte.
5.8.3. Vorbehandlung der Proben für die SDS-Polyacrylamid-gelelektrophorese
Zur Herstellung der Proben für die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese wurde ein
Volumen an Zellhomogenat, welches 7,5 µg an Protein entsprach, mit einem
proteindenaturierenden Puffer (4x Auftragepuffer) erhitzt. Dieser Auftragepuffer enthielt
das reduzierende Agens Dithiothreitol (DTT), welches zur Reduktion der
Disulfidbindungen der Proteine zu freien Thiolgruppen führte. Durch das Erhitzen der
Proben für fünf Minuten bei 95 °C im Heizblock (Thermoleader, UniEquip GmbH) wurde
Material und Methoden 65
außerdem die Tertiär- und Quartärstruktur der Proteine denaturiert. Eine
Hitzedenaturierung wurde mit Proben, in denen MRP2 nachgewiesen werden sollte, nicht
durchgeführt [147], um eine Degradation dieses Proteins bei höheren Temperaturen zu
verhindern. Des Weiteren erhielten die Proteine durch das Anlagern von SDS
(Natriumdodecylsulfat, 1,4 g SDS pro g Protein), welches im Lyse- und Auftragepuffer
enthalten war, eine negative Gesamtladung, welche proportional zu ihrer Molekülgröße
war [235]. Um später die Expressionen in den verschiedenen Zelllinien miteinander
vergleichen zu können, wurde für die Proben der verschiedenen Zelllinien immer die
gleiche Proteinkonzentration gewählt (7,5 µg/30 µl). Auf ein Gesamtvolumen von 30 µl
wurde mit deionisiertem Wasser aufgefüllt. Weiterhin wurden verschiedene Mengen (1 /
2,5 / 5 / 7,5 / 10 / 12,5 µg) der OATP1B1-UGT1A1-MRP2 tripeltransfizierten Zelllinie
sowie der OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1-MRP2 quadrupeltransfizierten Zelllinie in den
jeweiligen Projekten als Kalibrierproben aufgetragen. Dies diente nach densitometrischer
Auswertung zur Berechnung einer Regressionsgeraden, über welche man später die
Expression in den Kontrollzelllinien in Bezug zur jeweiligen Expression in der tripel- bzw.
quadrupeltransfizierten Zelllinie setzen konnte.
4x Auftragepuffer: Mischung aus Lämmli-Puffer und 2 M DTT (Carl Roth GmbH + Co.
KG) im Verhältnis 5:1
Lämmli-Puffer: 0,313 M Tris-HCl (pH 6,85), 20 % (w/v) SDS, 50 % (v/v) Glycerol,
0,05 % (w/v) Bromphenolblau (alles Carl Roth GmbH + Co. KG)
5.8.4. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die Auftrennung der Proteine nach ihrem Molekulargewicht erfolgte mittels
denaturierender, diskontinuierlicher SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese nach Lämmli
[285, 286]. Dabei macht man sich zunutze, dass die Proteine aufgrund ihrer negativen
Gesamtladung, welche sie durch die Probenvorbereitung erhielten, beim Anlegen einer
Spannung im Polyacrylamidgel zur Anode migrieren, wobei Proteine mit einem geringeren
Molekulargewicht das Gel schneller durchlaufen können als Proteine mit einem höheren.
Es wurden Polyacrylamidgele in einer Dicke von 1 mm in einer vertikalen
Elektrophoresekammer (Mini-PROTEAN 3 Cell, Bio-Rad Laboratories GmbH) verwendet,
welche mit Laufpuffer befüllt war. Zur Detektion von OATP1B1, CYP3A4 und UGT1A1
66 Material und Methoden
wurden diskontinuierliche Polyacrylamidgele mit einem 10 %igen Trenngel und nach
dessen Auspolymerisierung ein 4 %iges Sammelgel gegossen. Der Nachweis von MRP2
erfolgte an Polyacrylamidgelen mit einem 7,5 %igen Trenngel und einem 4 %igen
Sammelgel [147]. Bei allen Gelen wurden im Sammelgel durch das Einsetzen eines
Kammes 15 Taschen zum Auftragen der Proben freigelassen. Die genaue
Zusammensetzung der Gele ist Tabelle 4 zu entnehmen. In jede Probentasche wurden 20 µl
der vorbereiteten Probenlösungen (entsprechend 5 µg an Protein pro Probe und 1 / 2,5 / 5 /
7,5 / 10 / 12,5 µg Protein in den jeweiligen Kalibrierproben) sowie in eine Tasche 7 oder
10 µl eines Proteinstandards (Protein Ladder 10-250 kDa, New England BioLabs GmbH
bzw. BenchMark™ Pre-Stained Protein Ladder, Invitrogen GmbH) pipettiert. Die
Auftrennung der Proteine erfolgte bei einer angelegten konstanten Spannung von 120 V für
das Sammelgel und 160 V für das Trenngel. Nach der SDS-PAGE wurde das Sammelgel
vom Trenngel separiert.
Tabelle 4: Zusammensetzung der Gele für die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (Volumenangaben für ein Gel)
Chemikalien Sammelgel (4 %) Trenngel (10 %) Trenngel (7,5 %)
30 % Acrylamid/Bis
Lösung 37,5:1 325 µl 1,65 ml 1,25 ml
1,5 M Tris-Base pH 8,8 1,25 ml 1,25 ml
0,5 M Tris-HCl pH 6,8 625 µl
10 % (w/v) Sodium-
dodecylsulfat (SDS) 25 µl 50 µl 50 µl
10 % (w/v) Ammonium-
peroxodisulfatlösung
(APS)
12,5 µl 25 µl 25 µl
Tetramethylethylendiamin
(TEMED) 1,25 µl 2,5 µl 2,5 µl
H2O 1,53 ml 2,05 ml 2,42 ml
Laufpuffer: 25 mM Tris-Base, 200 mM Glycin, 3,5 mM SDS (alles Carl Roth GmbH +
Co. KG)
Material und Methoden 67
5.8.5. Immunblotanalyse
Anschließend wurden die im SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennten und negativ geladenen
Proteine mittels des Nassblotverfahrens [287, 288] elektrophoretisch auf eine
Nitrocellulosemembran übertragen. Der Proteintransfer erfolgte in einer Tankblotkammer
(Mini Trans-Blot® Electrophoretic Transfer Cell, Bio-Rad Laboratories GmbH), welche
mit Transferpuffer (Towbin-Puffer) gefüllt war, unter Anlegen einer Spannung von 100 V
für 1,5 Stunden und Kühlung. Nach dem Transfer wurden die Membranen zur Kontrolle
der Transfereffizienz mit einer Ponceau S-Lösung, welche Proteine unspezifisch anfärbt,
inkubiert [289]. Danach wurden die Membranen mit Waschpuffer PBST (phosphate-
buffered saline tween) entfärbt und zur Absättigung von unspezifischen Bindungsstellen für
eine Stunde bei Raumtemperatur in Blockpuffer gegeben. Die Inkubation mit einer Lösung
des Primärantikörpers (Primärantikörper verdünnt in Blockpuffer) erfolgte über Nacht bei
4 °C. Nach Entfernen von überschüssigem, nicht-gebundenem Primärantikörper durch
mehrere Waschschritte mit Waschpuffer, wurden die Membranen mit einem
Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörper, welcher gegen die Spezies, in
welcher der Primärantikörper generiert wurde, gerichtet ist, für eine Stunde bei
Raumtemperatur inkubiert. Dies wurde durchgeführt, da der Primärantikörper selbst nicht
detektiert werden kann und da es durch das Binden mehrerer Sekundärantikörper an einem
Primärantikörper zu einer Amplifikation des Detektionssignals kommt. Es folgten erneut
Waschschritte mit dem Waschpuffer PBST (phosphate-buffered saline tween). Alle
Waschschritte und Inkubationen der Membranen mit Antikörperlösungen erfolgten auf
Schüttlern. Die genauen Angaben zu den Verdünnungen der Antikörperlösungen sowie den
Bedingungen für die Inkubation mit den Antikörperlösungen finden sich in Tabelle 5. Vor
seiner Verwendung wurde das polyklonale Antiserum pESL1 mittels spezifischer
Proteinsäulen der Firma Peptide Specialty Laboratories GmbH aufgereinigt.
Die Detektion erfolgte mittels Chemilumineszenz. Hierfür wurden die Membranen für fünf
Minuten mit den Amersham™ ECL™ Western Blotting Detection Reagents (GE
Healthcare UK Ltd) inkubiert. Durch die Umsetzung des Substrates Luminol durch die an
den Sekundärantikörpern konjugierte Meerrettichperoxidase lässt sich eine
Chemilumineszenz nachweisen. Eine verstärkte Chemilumineszenz (enhanced
chemiluminescence, EC) wird in Anwesenheit von chemischen Enhancern, wie
beispielsweise Phenolen, erreicht. Dabei liegt die maximale Lichtemission bei einer
Wellenlänge von 425 nm und wurde mit einer maximal 10-minütigen Exposition mittels
68 Material und Methoden
einer CCD-Kamera (Molecular Imager ChemiDoc XRS System, Bio-Rad Laboratories
GmbH) digital visualisiert [290, 291].
Transferpuffer: 25 mM Tris-Base, 192 mM Glycin, 20 % (v/v) Methanol (alles Carl Roth
GmbH + Co. KG)
Ponceau S-Lösung: 0,5 % (v/v) Ponceau S in 3 % (v/v) Trichloressigsäure (beides Carl
Roth GmbH + Co. KG)
Waschpuffer PBST: 0,1 % (v/v) Tween 20 (Carl Roth GmbH + Co. KG) in 1 x D-PBS
(Dulbecco`s PBS Pulver für 50 l, Invitrogen GmbH)
Blockpuffer: 5 % oder 0,5 % (w/v) Magermilchpulver (Merck KGaA) in PBST
Material und Methoden 69
Tabelle 5: Antikörperverdünnungen und Inkubationsbedingungen für Immunblotanalysen
Antigen Antikörper Bezeichnung (Hersteller)
Verdünnung in Blockpuffer
Inkubations-bedingungen
OATP1B1 Primärantikörper Sekundärantikörper
pESL1 Fr.2 (Klinische Pharmakologie, Erlangen) Ziege anti-Kaninchen IgG-HRP (GE Healthcare)
1:500 in 5 % Blockpuffer 1:10 000 in 5 % Block-puffer
über Nacht, 4 °C 1 h, RT
CYP3A4 Primärantikörper Sekundärantikörper
Anti-humaner CYP3A4 Antikörper (Abnova) Ziege anti-Maus IgG-HRP (Jackson Immuno Research)
1:1 000 in 0,5 % Block-puffer 1:4 000 in 5 % Block-puffer
über Nacht, 4 °C 1 h, RT
UGT1A1 Primärantikörper Sekundärantikörper
Anti-UGT1A1-Antikörper (Abcam) Ziege anti-Kaninchen IgG-HRP (GE Healthcare)
1:400 in 0,5 % Blockpuffer 1:10 000 in 5 % Block-puffer
über Nacht, 4 °C 1 h, RT
MRP2 Primärantikörper Sekundärantikörper
EAG5 (Prof. Dr. D. Keppler, Heidelberg) Ziege anti-Kaninchen IgG-HRP (GE Healthcare)
1:5 000 in 5 % Blockpuffer 1:10 000 in 5 % Block-puffer
über Nacht, 4 °C 1 h, RT
ß-Aktin Primärantikörper Sekundärantikörper
Anti-ß-Aktin Antikörper (Sigma-Aldrich) Ziege anti-Maus IgG-HRP (Jackson Immuno Research)
1:10 000 in 5 % Block-puffer 1:4 000 in 5 % Blockpuffer
über Nacht, 4 °C 1 h, RT
70 Material und Methoden
5.8.6. Entfernen von Antikörpern
Um auf einer Nitrocellulosemembran ein weiteres Protein (beispielsweise ß-Aktin)
nachweisen zu können, mussten zunächst die Primär- und Sekundärantikörper der
vorausgegangenen Nachweisreaktion entfernt werden. Hierfür wurden die Membranen für
20 Minuten bei 37 °C mit einem kommerziell erhältlichen Puffer (Restore™ Western Blot
Stripping Buffer, Fisher Scientific GmbH) inkubiert. Dies führte zum Ablösen der
gebundenen Antikörper, sodass nach einem Waschschritt die Membran mit einer neuen
Primärantikörperlösung inkubiert werden konnte.
5.8.7. Densitometrische Auswertung
Die densitometrische Auswertung der detektierten Proteinbanden wurde mithilfe des
Programms Quantity One® 1-D Analysis Software (Bio-Rad Laboratories GmbH)
durchgeführt. Dabei wurde jeder Bande ein Wert für ihre mittlere Farbdichte (Average
Density) zugeordnet. Eine Hintergrundfärbung der Immunblots konnte von den
Signalwerten der einzelnen Proteinbanden abgezogen werden (Ausnahme: Immunblot-
analysen mit Detektion von UGT1A1 mit Kalibrierproben der tripeltransfizierten Zelllinie).
Mittels der als Kalibrierproben aufgetragenen, unterschiedlichen Mengen an
Proteinhomogenat der OATP1B1-UGT1A1-MRP2 tripeltransfizierten bzw. der OATP1B1-
CYP3A4-UGT1A1-MRP2 quadrupeltransfizierten Zelllinie erfolgte eine semiquantitative
Auswertung der Blots. Die ermittelten Signalwerte dieser Proben wurden gegen die
entsprechenden Mengen an Homogenat aufgetragen und eine Regressionsgerade berechnet.
Die Durchführung der linearen Regressionsanalyse erfolgte mithilfe der GraphPad Prism
4.01 Software (GraphPad Software, Inc.). Über die ermittelten Signalwerte der
Kontrollzelllinien konnte nun die prozentuale Expression eines Proteins im Vergleich zu
der tripel- bzw. quadrupeltransfizierten Zelllinie berechnet werden.
Material und Methoden 71
5.9. Transportversuche
Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit fanden zwei unterschiedliche Arten von
Transportversuchen Anwendung: Aufnahmeversuche, in denen stabil transfizierte
HEK293-Zellen zum Einsatz kamen und transzelluläre Transportassays, bei denen stabil
transfizierte MDCKII-Zelllinien Verwendung fanden.
5.9.1. Aufnahmeversuche
In diesen Transportversuchen an stabil transfizierten HEK293-Zellen (HEK293-VK G418,
HEK293-VK Hygro, HEK293-OATP1B1, HEK293-OATP1B3, HEK293-OATP2B1)
wurde untersucht, ob das Zytostatikum Etoposid ein Substrat für einen hepatischen OATP-
Transporter darstellt. Hierfür wurden die Transporter-transfizierten Zelllinien und ihre
zugehörigen Vektorkontrollzelllinien mit tritiummarkiertem Etoposid inkubiert. Zeigte sich
eine signifikant höhere Aufnahme der Substanz in die Transporter-transfizierten Zelllinien
im Vergleich zu den Vektorkontrollzelllinien, war nachgewiesen, dass es sich um ein
Substrat des entsprechenden Transporters handelt. Die Durchführung der
Aufnahmeversuche erfolgte nach bereits publizierten Protokollen [292-294].
5.9.1.1. Aussaat und Induktion der Zellen
Die Aussaat der HEK293-Zellen erfolgte in Zellkulturplatten mit 12 Kavitäten
(CELLSTAR® 12 Well Zellkultur Multiwell Platte, Greiner Bio-One GmbH), welche zuvor
mit Poly-D-Lysin (0,1 mg/ml, sterilfiltriert, Sigma-Aldrich Chemie GmbH) beschichtet
wurden, um ein besseres Anhaften der Zellen an der Zellkulturplatte zu gewährleisten. Die
initiale Zellzahl pro Zelllinie und Kavität betrug 7 x 105 Zellen in 800 µl Kulturmedium.
Nach der Aussaat folgte eine Kultivierung der Zellen über Nacht unter normalen
Bedingungen. Am nachfolgenden Tag wurden die Zellen mit Natriumbutyrat-haltigem
Kulturmedium (10 mM) induziert, um wie bereits unter Punkt 5.7.1 beschrieben, die
Proteinexpression der Zellen zu erhöhen. Nach weiteren 24 Stunden unter normalen
Kulturbedingungen wurden die Aufnahmeversuche durchgeführt.
72 Material und Methoden
5.9.1.2. Versuchsdurchführung
Um zunächst die Inkubationszeit zu bestimmen, in der die Transportaktivität noch linear
ansteigt, wurden Aufnahmeversuche mit zwei Substratkonzentrationen (1 µM und 10 µM)
und vier Inkubationszeitpunkten gewählt (1, 5, 10 und 30 Minuten). Die Zellen wurden vor
Zugabe des Substrates mit vorgewärmtem Transportpuffer (37 °C) gewaschen, um das
Kulturmedium vollständig zu entfernen. Danach wurden die ebenfalls vorgewärmten
Donorlösungen (Mischung aus tritiummarkiertem und unmarkiertem Substrat) auf die
Zellen gegeben und die Zellkulturplatten entsprechend der gewählten
Inkubationszeitpunkte bei 37 °C in den Inkubator zurückgestellt. Im Anschluss wurde die
Donorlösung entfernt und die Zellrasen mit kaltem Transportpuffer gewaschen. Um die in
die Zellen aufgenommene Substratmenge bestimmen zu können, war nach dem Versuch
eine Lyse der Zellen notwendig. Hierfür wurde eine 0,2 %ige Natriumdodecylsulfatlösung
(SDS) auf die Zellen gegeben und diese durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren lysiert.
Zur Bestimmung der intrazellulär aufgenommenen Menge an Radioaktivität wurden
Aliquots jedes Zelllysates mit Szintillationsflüssigkeit (Ultima Gold XR, PerkinElmer LAS
GmbH) in Szintillationsgefäße (Pony Vial™ 6 ml, PerkinElmer LAS GmbH) überführt und
in einem Tri-Carb® 2800 TR Liquid Scintillation Analyser (PerkinElmer LAS GmbH) über
drei Minuten vermessen. Die Angabe der Menge an Radioaktivität erfolgte in
Zählereignissen pro Minute (cpm, counts per minute). Um einen Einfluss von
Variabilitäten in der Aussaat der Zellen und in der Proteinexpression aufgrund
unterschiedlichen Wachstumsverhaltens der verwendeten Zelllinien auf die
Transportergebnisse zu minimieren, wurden alle Transportwerte auf die zugehörigen
Gesamtproteinmengen pro Zelllysat bezogen. Die Angabe der Transportaktivität erfolgte
dann in pmol*mg Protein-1*min-1. Die Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration pro
Zelllysat erfolgte mittels des BCA™ Protein Assay Kits (Fisher Scientific GmbH) wie
unter Punkt 5.8.2 beschrieben.
Um die Michaelis-Menten-Konstante (Km) sowie die maximale Transportgeschwindigkeit
(Vmax) der OATP1B1-vermittelten Etoposid-Aufnahme ermitteln zu können, wurden
weiterhin Aufnahmeversuche mit 12 unterschiedlichen Substratkonzentrationen (0,1 / 0,5 /
1 / 2,5 / 5 / 7,5 / 10 / 12,5 / 20 / 30 / 50 und 100 µM) und einer Inkubationsdauer von fünf
Minuten durchgeführt. Diese Inkubationsdauer wurde gewählt, weil die Aufnahme zu
diesem Zeitpunkt noch linear ist. Die Angabe der maximalen Transportgeschwindigkeit
Material und Methoden 73
Vmax erfolgte in pmol*mg Protein-1*min-1 und die der Michaelis-Menten-Konstante (Km)
in µM.
Transportpuffer: 142 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM K2HPO4, 1,2 mM MgSO4,
1,5 mM CaCl2, 5 mM Glucose und 12,5 mM HEPES, pH = 7,3; sterilfiltriert (alles Carl
Roth GmbH + Co. KG)
5.9.2. Transzelluläre Transportversuche
Mittels dieser Transportversuche an stabil transfizierten MDCKII-Zelllinien sollte
untersucht werden, ob eine Substanz nicht nur ein Substrat des Aufnahmetransporters
OATP1B1 ist, sondern ob diese Substanz auch innerhalb der untersuchten Zellsysteme
einer Phase-I- bzw. Phase-II-Metabolisierung unterliegt und ob sie oder deren Metaboliten
Substrate für den Effluxtransporter MRP2 darstellen. Hierfür wurden MDCKII-Zellen auf
Filtereinsätzen ausgesät, was ihnen ein polarisiertes Wachstum ermöglicht [186, 226]. Dies
bedeutet, dass die Zellen sowohl eine basolaterale Membran, in welche die
Aufnahmetransporter eingelagert werden, als auch eine apikale Membran, in welcher die
Effluxtransporter lokalisiert sind, ausbilden. Die beiden durch diese Differenzierung
entstehenden Kompartimente sind durch Tight Junctions voneinander getrennt.
Exprimieren diese Zelllinien zudem metabolisierende Enzyme, so kann bei Zugabe eines
Substrates zur basolateralen Seite der Zelle nicht nur der gerichtete Transport des
Substrates durch die Zelle in das apikale Kompartiment gemessen werden, sondern auch
dessen Metabolisierung und ein möglicher Auswärtstransport von gebildeten Metaboliten
[293].
Hierfür wurden in einem ersten Ansatz die Arzneistoffe Ezetimib und Etoposid und
folgende MDCKII-Zelllinien verwendet: MDCKII-VK, MDCKII-OATP1B1, MDCKII-
OATP1B1-UGT1A1, MDCKII-OATP1B1-MRP2 und MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-
MRP2. Abbildung 8 veranschaulicht exemplarisch einen Versuchsansatz.
74 Material und Methoden
Abbildung 8: Durchführung der transzellulären Transportversuche. Der Arzneistoff (Substrat) wurde dem Zellsystem basolateral zugegeben und die Menge an Arzneistoff (Substrat) bzw. Phase-II-Metabolit im intrazellulären und apikalen Kompartiment wurde nach der gewünschten Inkubationszeit ermittelt. Schematisch dargestellt sind auf Filtereinsätzen polarisiert-gewachsene OATP1B1-UGT1A1-MRP2 tripeltransfizierte Zellen, welche nach basolateraler Zugabe eines Substrates dieses OATP1B1-vermittelt aufnehmen, mittels UGT1A1 metabolisieren und den Phase-II-Metaboliten (und in einem geringeren Ausmaß auch das unveränderte Substrat) MRP2-vermittelt in das apikale Kompartiment transportieren. Entsprechend ausgesät und im transzellulären Transportversuch behandelt, wurden auch die mitgeführten Kontrollzelllinien (MDCKII-VK, MDCKII-OATP1B1, MDCKII-OATP1B1-UGT1A1 und MDCKII-OATP1B1-MRP2). Dadurch, dass diesen eine oder mehrere Komponenten der tripeltransfizierten Zelllinie fehlten, konnten Rückschlüsse auf den Einfluss der einzelnen Proteine auf den transzellulären Transport gezogen werden.
In einem zweiten Ansatz fanden der Arzneistoff Bosentan und folgende MDCKII-
Zelllinien Verwendung: MDCKII-VK, MDCKII-OATP1B1, MDCKII-OATP1B1-MRP2,
MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1, MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2, MDCKII-
OATP1B1-UGT1A1-MRP2 und MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1-MRP2.
Abbildung 9 stellt eine schematische Darstellung dieser Versuche dar.
Material und Methoden 75
Abbildung 9: Durchführung der transzellulären Transportversuche. Der Arzneistoff (Substrat) wurde dem Zellsystem basolateral zugegeben und die Menge an Arzneistoff (Substrat), Phase-I-Metabolit und Phase-II-Metabolit im intrazellulären und apikalen Kompartiment wurde nach der gewünschten Inkubationszeit ermittelt. Schematisch dargestellt sind auf Filtereinsätzen polarisiert-gewachsene OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1-MRP2 quadrupeltransfizierte Zellen, welche nach basolateraler Zugabe eines Substrates, dieses OATP1B1-vermittelt aufnehmen, mittels CYP3A4 und UGT1A1 metabolisieren und die Phase-II-Metaboliten (und in einem geringeren Ausmaß auch das unveränderte Substrat) MRP2-vermittelt in das apikale Kompartiment transportieren. Entsprechend ausgesät und im transzellulären Transportversuch behandelt, wurden auch die mitgeführten Kontrollzelllinien (MDCKII-VK, MDCKII-OATP1B1, MDCKII-OATP1B1-MRP2, MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1, MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2, MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-MRP2). Dadurch, dass diesen eine oder mehrere Komponenten der quadrupeltransfizierten Zelllinie fehlten, konnten Rückschlüsse auf den Einfluss der einzelnen Proteine auf den transzellulären Transport gezogen werden.
Die Durchführung der transzellulären Transportversuche erfolgte nach bereits publizierten
Protokollen [187, 293, 295].
5.9.2.1. Aussaat und Induktion der Zellen
Für die Durchführung der transzellulären Transportversuche wurden Zellkulturplatten mit
12 Kavitäten (CELLSTAR® 12 Well Zellkultur Multiwell Platte, Greiner Bio-One GmbH)
verwendet, in welche vor der Aussaat Transwell-Membraneinsätze (ThinCert™,
76 Material und Methoden
Durchmesser 14 mm, Porengröße 0,4 µm, Greiner Bio-One GmbH) eingebracht wurden.
Durch das Einsetzen dieser Membraneinsätze entstehen in den Kavitäten zwei
Kompartimente. In das untere basolaterale Kompartiment wurden 800 µl Kulturmedium
pipettiert und in das obere apikale Kompartiment wurden die Zellen in einer initialen
Zellzahl von 4 x 105 Zellen in 800 µl Kulturmedium ausgesät. Es folgte eine Kultivierung
der Zellen für insgesamt drei Tage unter normalen Bedingungen. 24 Stunden vor
Durchführung der transzellulären Versuche wurden die Zellen wieder mit Natriumbutyrat-
haltigem Kulturmedium (10 mM) induziert.
5.9.2.2. Versuchsdurchführung
Analog zu den Aufnahmeversuchen wurde zu Beginn des Versuches das Kulturmedium aus
den Zellkulturplatten entfernt und die Zellen wurden mit vorgewärmtem Transportpuffer
gewaschen. Danach wurde in das apikale Kompartiment 800 µl warmer Transportpuffer
vorgelegt und in das basolaterale Kompartiment 800 µl Donorlösung pipettiert. Die
Donorlösungen von Ezetimib und Etoposid bestanden aus tritiummarkiertem und
unmarkiertem Substrat in Transportpuffer. Für transzelluläre Transportversuche mit
Ezetimib wurde eine Konzentration von 1 µM und für Versuche mit Etoposid wurde eine
Konzentration von 10 µM verwendet. Es folgte eine Inkubation der Zellen für 10, 30 und
60 Minuten (Ezetimib) bzw. für 60 und 120 Minuten (Etoposid) bei 37 °C im Inkubator.
Nach diesen Zeitpunkten wurden aus den apikalen Kompartimenten 500 µl an
Transportpuffer entnommen und zur Bestimmung der akkumulierten Radioaktivität mittels
Flüssigkeitsszintillationszählung verwendet. Im Anschluss wurden die Zellen mit kaltem
Transportpuffer gewaschen. Um den Gesamtproteingehalt und die intrazellulär
akkumulierte Radioaktivität ermitteln zu können, wurden die Membranen mithilfe eines
Skalpells (Cutfix®, Sterile Einmalskalpelle, B. Braun Melsungen AG) aus den
Filtereinsätzen herausgetrennt und die anhaftenden Zellen mittels 0,2 %iger
Natriumdodecylsulfatlösung (SDS) lysiert. Die Lysate wurden anteilig zur Bestimmung des
Gesamtproteingehaltes mittels BCA-Assays und der Akkumulation von Radioaktivität im
intrazellulären Kompartiment verwendet.
Transzelluläre Transportversuche, bei denen transportiertes Ezetimib und gebildetes
Ezetimib-Glucuronid mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie
(LC-MS/MS, liquid chromatography-, tandem mass spectrometry) bestimmt wurden,
Material und Methoden 77
wurden analog zu den beschriebenen Versuchen, allerdings mit unmarkiertem Substrat
durchgeführt.
Bei den transzellulären Transportversuchen mit [14C]Bosentan wurde aufgrund der
geringen spezifischen Aktivität der Substanz bei den Donorlösungen auf einen Zusatz von
unmarkiertem Substrat verzichtet. Bosentan wurde in den Versuchen in einer
Konzentration von 20 µM eingesetzt. Die Durchführung der Versuche mit Bosentan
erfolgte analog den bereits beschriebenen Versuchen mit Ezetimib und Etoposid mit
Ausnahme der Probenentnahme vom apikalen Kompartiment. Hier wurden nach 60 und
120 Minuten dem apikalen Kompartiment jeweils Aliquots von 100 µl für die
Flüssigkeitsszintillationszählung entnommen und die Zellkulturplatten wieder zurück in
den Inkubator gestellt. Nach 180 Minuten gesamter Inkubationszeit wurden nochmals
100 µl Transportpuffer vom apikalen Kompartiment entnommen und entsprechend
vermessen. Die Lyse der Zellen und die Bestimmung der Gesamtproteinmenge und der
intrazellulären Akkumulation von Radioaktivität erfolgten analog zu den bereits
beschrieben Versuchen.
Zur Bestimmung von Bosentan bzw. von gebildeten Metaboliten im intrazellulären bzw.
apikalen Kompartiment mittels HPLC gekoppelt mit Radiodetektor bzw. mittels LC-MS
wurden weitere transzelluläre Transportversuche mit radioaktiv markiertem Bosentan
analog zu den beschriebenen Versuchen durchgeführt. Allerdings wurde hier nur eine
Inkubationszeit von 180 Minuten untersucht.
Die Transportwerte aus allen Versuchen wurden auf die entsprechende Menge an
Gesamtprotein normalisiert und in pmol*mg Protein-1 oder nmol*mg Protein-1 angegeben.
Als Positivkontrolle wurde neben den zu testenden Substraten vektorielle
Transportversuche mit dem prototypischen Substrat [3H]Sulfobromophthalein in einer
Konzentration von 0,05 µM und einer Inkubationszeit von 30 Minuten an MDCKII-VK
Zellen im Vergleich zu MDCKII-OATP1B1 Zellen durchgeführt. Da Sulfobromophthalein
bereits als sehr gutes Substrat von OATP1B1 beschrieben ist, diente dies der Kontrolle der
Versuchsbedingungen als auch der Funktionalität der Zelllinie. Als weitere Kontrolle
wurden alle verwendeten Zelllinien parallel zu den transzellulären Transportversuchen mit
den zu testenden Substraten mit der Substanz [3H]Inulin (50 µM) über eine entsprechende
Zeitdauer inkubiert. Bei Inulin handelt es sich um ein Polysaccharid, welches nicht
transzellulär transportiert wird, sondern nur parazellulär Zellmonolayer passieren kann
[296]. Bei einem dichten Zellmonolayer sollte also möglichst wenig Inulin im apikalen
Kompartiment nachzuweisen sein. Über die Berechnung des Verhältnisses von gemessener
78 Material und Methoden
Radioaktivität im apikalen Kompartiment zur eingesetzten Menge an radioaktivem Inulin
kann also eine Aussage über die Dichtigkeit der Zellmonolayer getroffen werden [187].
5.9.2.3. Flüssigkeitsszintillationszählung
Die Konzentration an radioaktivem Substrat in den Proben wurde über ihren radioaktiven
Zerfall bestimmt. Bei Tritium handelt es sich um ein instabiles, radioaktives Isotop des
Wasserstoffatoms, welches mit einer Halbwertszeit von 12,3 Jahren unter ß--Zerfall zu dem
Heliumisotop 3He zerfällt [297]. Bei diesem Zerfall werden ein Elektron und ein
Antineutrino emittiert. 14C ist ein instabiles Radioisotop des Kohlenstoffatoms und zerfällt
ebenfalls unter ß--Zerfall mit einer Halbwertszeit von 5730 ± 40 Jahren [298]. Dadurch
entstehen das Stickstoffisotop 14N sowie ein Elektron und ein Antineutrino [297]. Da dieser
Zerfall aber nicht direkt gemessen werden kann, bedient man sich der Methode der
Flüssigkeitsszintillationszählung (LSC, liquid scintillation counting), welche Licht misst,
das von fluoreszierenden Substanzen (Szintillatoren) abgestrahlt wird, nachdem sie durch
radioaktive Strahlung angeregt wurden [299]. Für die Messung wurden Zelllysat oder
Transportpuffer in Szintillationsgefäße (Pony Vial™ 6 ml, PerkinElmer LAS GmbH)
überführt und mit Szintillationsflüssigkeit (Ultima Gold XR, PerkinElmer LAS GmbH),
welche eine Mischung aus organischem Lösungsmittel mit Szintillationslösung darstellt,
versetzt. Bei Kollision eines durch den ß--Zerfall entstehenden Elektrons in der
Probenmischung mit einem Lösungsmittelmolekül wird die Energie des Elektrons auf das
Lösungsmittelmolekül übertragen, das diese Energie in Lichtimpulse umwandelt. Das
emittierte Licht kann nun vom Szintillator in der Szintillationsflüssigkeit absorbiert und mit
einer längeren Wellenlänge abgestrahlt werden. Dieses entstehende Licht trifft dann auf die
Photokathode des Photomultipliers und wird dort zu einem elektrischen Impuls umgesetzt.
Dabei ist die vom Elektron übertragene Energie proportional zur Fluoreszenzintesität [299],
welche vom Photomultiplier erfasst wird und somit zur Stärke des elektrischen Signals. Die
Dauer der Vermessung pro Probe im Flüssigkeitsszintillationsspektrometer (Tri-Carb®
2800 TR Liquid Scintillation Analyser, PerkinElmer LAS GmbH) betrug drei Minuten. Die
dabei erhaltenen Werte stellen Zählereignisse pro Minute dar (cpm, counts per minute).
Durch das Vermessen der Donorlösung und mittels der Konzentration der Donorlösung
konnten die erhaltenen Werte in Stoffmengen umgerechnet werden. Die Angabe der
Transportaktivität erfolgte in pmol*mg Protein-1, nmol*mg Protein-1 oder
pmol*mg Protein-1*min-1.
Material und Methoden 79
5.9.2.4. Quantifizierung von Ezetimib und Ezetimib-Glucuronid mittels LC-MS/MS
Die Bestimmung von Ezetimib bzw. Ezetimib-Glucuronid im Zelllysat und Transportpuffer
erfolgte nach einer von Oswald et al. [300] bereits publizierten Methode mit leichten
Modifikationen mittels der Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie
(LC-MS/MS, liquid chromatography-, tandem mass spectrometry). Hierfür wurden
zunächst je 150 µl Zelllysat oder Transportpuffer mit deionisiertem Wasser verdünnt und
4-Hydroxychalcon in Acetonitril als interner Standard zugegeben. Es folgte eine Extraktion
des Analyten mithilfe von tert-Butylmethylether. Danach wurde ein Zentrifugationsschritt
(fünf Minuten bei 4000 rpm, Eppendorf Centrifuge 5810R, Eppendorf AG) durchgeführt
und die organische Phase von der wässrigen abgehoben. Die organische Phase, in welche
der Analyt übergegangen war, wurde im Anschluss mit Stickstoff verdampft und der übrig
gebliebene Analyt mit einem Milliliter Eluent [Acetonitril: Wasser, 60:40 (v/v) mit 0,2 %
Essigsäure] aufgenommen. Hiervon wurden 5 µl in die Anlage injiziert. Zur Bestimmung
der Gesamt-Ezetimibkonzentration (freies Ezetimib und konjugiertes Ezetimib) in einer
Probe wurden die Proben in einem zweiten Ansatz für 60 Minuten bei 50 °C mit einer
ß-Glucuronidaselösung (Sigma-Aldrich Chemie GmbH) inkubiert. Dieses Enzym spaltet
das an Ezetimib gebundene Glucuronid wieder ab, sodass nach dieser Doppelbestimmung
über die Differenz des freien Ezetimibs vom gesamten Ezetimib auf das gebildete
Ezetimib-Glucuronid geschlossen werden konnte. Nach dieser Inkubation wurde wieder
interner Standard hinzupipettiert und wie bereits beschrieben vorgegangen.
Für die Bestimmung des Analyts wurde ein API 4000™ Triple-Quadrupol-
Massenspektrometer (Applied Biosystems) ausgestattet mit einem Agilent 1100 HPLC
System (Agilent Technologies Deutschland GmbH) verwendet. Die LC-MS/MS-Analyse
wurde unter Verwendung der Elektronenspray-Ionisation (ESI) im negativen Ionenmodus
durchgeführt. Die Chromatographie erfolgte isokratisch mit einem Fließmittel bestehend
aus einer Mischung von Acetonitril:Wasser im Verhältnis 60:40 (v/v) mit 0,2 % Essigsäure
und einer Fließgeschwindigkeit von 0,4 ml pro Minute. Die chromatographische
Auftrennung erfolgte mittels einer Nucleosil 100-5 C18 AB Säule (125 mm x 2 mm,
Partikelgröße 5 µm, Macherey Nagel) mit einer entsprechenden Vorsäule (8 mm x 3 mm,
Partikelgröße 5 µm, Macherey Nagel). Das Massenspektrometer arbeitete im eingestellten
multiple reaction monitoring- (MRM) Modus. Stickstoff wurde sowohl als Kollisions- und
Schutzgas als auch als Ionenquellengas verwendet. Die Temperatur des Heizelementes
betrug 500 °C und die Ionensprayspannung -4500 V. Die Massenübergänge und
80 Material und Methoden
Kollisionsenergien lagen bei m/z 408,2-271,1 und -22 eV für Ezetimib und bei m/z
223,0-117,0 und -22 eV für 4-Hydroxychalcon. Der validierte Kalibrationsbereich wurde
mit 1-1000 ng/ml festgelegt und die untere Bestimmungsgrenze (LLOQ, lower limit of
quantification) lag bei 1 ng/ml. Zur Bestimmung des Verhältnisses von Peak zu Fläche von
Ezetimib zu dem des internen Standards (4-Hydroxychalcon) wurde die Analyst 1.4.2
Software (Applied Biosystems) herangezogen. Die intraday-Variationskoeffizienten
bewegten sich zwischen 1,5 und 5,9 % für Ezetimib und zwischen 4,1 und 8,5 % für
inkubiertes Ezetimib. Die intraday-Richtigkeit der Messung variierte zwischen -8,5 und
-0,9 für Ezetimib und zwischen 0,5 und 2,5 für inkubiertes Ezetimib. Die interassay-
Variabilität und Matrixeffekte wurden anhand von Vergleichsanalysen von vier
Kalibrationskurven (1-100 ng/ml), welche an unterschiedlichen Tagen hergestellt wurden,
untersucht. Die Variationskoeffizienten lagen hierbei zwischen 2,3 und 10,5 % und die
Richtigkeit der Messung zwischen 3,7 und 2,0.
5.9.2.5. Bestimmung von Bosentan, dessen Phase-I-Metaboliten und Bosentan-Glucuronid mittels HPLC gekoppelt mit Radiodetektor und LC-MS
Sowohl die HPLC- als auch die LC-MS-Methode wurde vom Kooperationspartner
Actelion Pharmaceuticals Ltd etabliert und zur Vermessung der Proben aus transzellulären
Transportversuchen mit [14C]Bosentan angewandt. Im Folgenden werden daher beide
Methoden nur kurz beschrieben.
5.9.2.5.1. HPLC-Methode
Die HPLC-Anlage bestand aus zwei LC-10AD VP HPLC-Pumpen, ausgestattet mit einem
Membranentgaser, einer SCL-10AD VP Steuereinheit, einem SPD-10AV VP UV-Detektor
und einem Autosampler des Modells SIL-HTc (Shimadzu Schweiz GmbH). Die
chromatographische Auftrennung wurde mittels einer Phenomenex Luna C18 Säule
(250 mm x 4,6 mm, Partikelgröße 5 µm, Phenomenex Ltd) bei einer Temperatur von 45 °C
und einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min durchgeführt. Die mobilen Phasen bestanden
aus 50 mM Ammoniumformat (Phase A, pH: 4, eingestellt mit Ameisensäure) oder
Material und Methoden 81
Acetonitril (Phase B). Zur Auftrennung von Bosentan und seiner Metaboliten wurde eine
Gradientenmethode nach folgendem Schema durchgeführt:
Tabelle 6: Gradientenschema
Zeit (Min) 0 10 55 60 63 64 70
Phase B (%) 10 25 73 95 95 10 Stopp
Aufgrund der geringen Mengen an Gesamtradioaktivität in den Proben wurden nach der
chromatographischen Auftrennung in Abständen von 0,28 Minuten Fraktionen mithilfe
eines Agilent Technologies 1200 fraction collectors (Agilent Technologies Deutschland
GmbH) in Deepwell LumaPlates™-96 Platten (PerkinElmer) gesammelt. Anschließend
erfolgte eine Verdampfung der Fraktionen (EZ-2 Evaporator, GeneVac Ltd) und eine off-
line Analyse der Fraktionen mittels eines TopCount-NXT™ microplate luminescence
counters (PerkinElmer). Die Datenauswertung wurde mithilfe der RadioStar Software
(Version 4.6) durchgeführt. Unter den aufgeführten chromatographischen Bedingungen
betrug die Retentionszeit von Bosentan 41,0 Minuten. Die Variabilität in der Retentionszeit
in den verschiedenen Chromatogrammen ging nicht über eine Minute bei einer
Gesamtlaufzeit von 70 Minuten hinaus.
5.9.2.5.2. LC-MS-Methode
Die Strukturaufklärung von möglichen neuen Bosentanmetaboliten wurde mittels eines
LTQ Orbitrap Velo Pro Massenspektrometers (Thermo Finnigan AG), welches an einer
LC-20ADXR HPLC Pumpe (Shimadzu Schweiz GmbH) gekoppelt war, durchgeführt. Die
LC-MS-Analyse erfolgte unter Verwendung der Elektronenspray-Ionisation (ESI) im
positiven Ionenmodus und den folgenden Einstellungen: ESI-Spannung: 3,0 kV,
Kapillartemperatur: 300 °C, Temperatur der Quelle: 200 °C, Schutzgas: 40 psi, Hilfsgas:
5 psi, Kapillarspannung: 13 V, S-lens RF Level 45 %, Massenbereich: 190-1000,
Massenauflösung: 30000. Die chromatographische Methode entsprach der der HPLC-
Methode im vorherigen Abschnitt mit einer Fließratensplittung von 1:5. Die
Datenauswertung erfolgte mithilfe der Xcalibur 2.0.7 Software (Thermo Electron Schweiz
AG).
82 Material und Methoden
5.10. Statistische Analyse
Quantitative Real-time PCR-Analysen und Immunblotanalysen zur Bestimmung der
mRNA- und Proteinexpression wurden in beiden Projekten jeweils in Triplikaten
durchgeführt. Die Bestimmung der Cytochrom-P450-3A4-Enzymaktivität erfolgte an zwei
verschiedenen Tagen mit jeweils zwei Proben pro Midazolamkonzentration und Zelllinie
und die Aktivität der NADPH-Reduktase wurde an zwei verschiedenen Tagen mit
insgesamt vier Proben pro Zelllinie erhoben. Die intrazelluläre und apikale Akkumulation
von Ezetimib-Glucuronid mit nicht markiertem Ezetimib als Substrat wurde ermittelt durch
Subtraktion der Menge an freiem Ezetimib von der Menge an gesamten Ezetimib (freies
Ezetimib und Ezetimib-Glucuronid), welche in einer Probe bestimmt wurden. Jede
Konzentration und jeder Zeitpunkt in transzellulären Transportexperimenten wurde an
mindestens zwei verschiedenen Tagen mit mindestens drei Proben pro Zelllinie und Tag
(Mindestzahl an Einzelwerten = sechs) getestet. Eine Ausnahme davon bildeten die
transzellulären Transportversuche mit Ezetimib mit den Inkubationszeiten 10 und 60
Minuten (Mindestanzahl an Einzelwerten = drei). Mit den Daten aus den
Aufnahmeversuchen an HEK293-Zellen mit Etoposid als Substrat wurde eine nicht-lineare
Kurvenanpassung nach Michaelis-Menten durchgeführt. Jede Konzentration in diesen
Aufnahmeversuchen wurde mit mindestens drei Werten pro Zelllinie an zwei
verschiedenen Tagen untersucht. Alle Daten wurden mithilfe der Software GraphPad
Prism 4.01 (GraphPad Software, Inc.) statistisch ausgewertet. Alle Ergebnisse wurden als
Mittelwerte ± Standardfehler (S.E.M.) angegeben. Der statistische Vergleich von Werten
mehrerer Zelllinien wurde mithilfe des ANOVA-Tests mit nachfolgendem Tukey-Kramer
multiple comparison test durchgeführt. Paarweise Vergleiche wurden im ungepaarten
t-Test untersucht. Ein p-Wert ≤ 0,05 galt als statistisch signifikant.
Ergebnisse 83
6. Ergebnisse
6.1. Identifizierung von Ezetimib, Etoposid und deren Metaboliten als Substrate von MRP2 mittels einer OATP1B1-UGT1A1-MRP2 tripeltransfizierten MDCKII-Zelllinie
6.1.1. Etablierung und Charakterisierung einer MDCKII-Zelllinie, welche stabil den Aufnahmetransporter OATP1B1, das Phase-II-Enzym UGT1A1 und die Exportpumpe MRP2 exprimiert
Bislang war es mittels stabil transfizierter MDCKII-Zelllinien, welche einen oder mehrere
Aufnahmetransporter und einen Effluxtransporter exprimieren, nur möglich den gerichteten
Transport eines Arzneistoffs ohne Berücksichtigung seiner Metabolisierung zu
untersuchen. Da jedoch gerade Phase-II-Metaboliten gute Substrate für Effluxtransporter
wie MRP2 darstellen, sollte dieser enzymatische Schritt nicht außer Acht gelassen werden.
Dazu kommt, dass Arzneistoffmetaboliten häufig nicht kommerziell zu erwerben sind, und
es sich somit schwierig gestaltet, diese als Substrate des Effluxtransporters MRP2
identifizieren zu können. Zelllinien hingegen, welche neben Transportproteinen zusätzlich
metabolisierende Enzyme exprimieren, besitzen hier den Vorteil, dass sie die
entsprechenden Arzneistoffmetaboliten selbst bilden und dass mit ihnen das funktionelle
Zusammenspiel aus Transport und Metabolismus untersucht werden kann. Um zunächst die
Frage zu klären, ob es möglich ist, solche Zelllinien zu etablieren und mit diesen
funktionelle Daten zu generieren, wurde die am Lehrstuhl für Klinische Pharmakologie und
Klinische Toxikologie bereits vorhandene MDCKII-OATP1B1-MRP2 doppelttransfizierte
Zelllinie um das Phase-II-Enzym UDP-Glucuronosyltransferase 1A1 (UGT1A1) erweitert.
Zur Abschätzung des Einflusses der einzelnen Proteine auf den Metabolismus und
transzellulären Transport eines Arzneistoffs und dessen möglicher Metaboliten wurde
zusätzlich eine OATP1B1-UGT1A1 doppelttransfizierte MDCKII-Zelllinie etabliert und in
den Versuchen mitgeführt. Unter diesem Gesichtspunkt wurden des Weiteren die bereits
am Lehrstuhl für Klinische Pharmakologie und Klinische Toxikologie vorhandene
MDCKII-VK Zelllinie, die OATP1B1 einzeltransfizierte MDCKII-Zelllinie und die
OATP1B1-MRP2 doppelttransfizierte MDCKII-Zelllinie als Kontrollzelllinien in allen
Versuchen verwendet.
84 Ergebnisse
Mittels vergleichender quantitativer Real-time PCR-Analyse wurde zunächst die mRNA-
Expression aller transfizierten cDNAs in der tripeltransfizierten Zelllinie als auch in den
Kontrollzelllinien untersucht (Abbildung 10).
Abbildung 10: Quantitative Real-time PCR-Analyse zur Bestimmung der SLCO1B1 (kodierend für OATP1B1), der UGT1A1 (kodierend für UGT1A1) und der ABCC2 (kodierend für MRP2) mRNA-Expression in der neu etablierten tripeltransfizierten Zelllinie (OATP1B1-UGT1A1-MRP2) sowie in den Kontrollzelllinien (MDCKII-VK, MDCKII-OATP1B1, MDCKII-OATP1B1-UGT1A1, MDCKII-OATP1B1-MRP2). Nur mit einer spezifischen cDNA transfizierte Zelllinien zeigten eine entsprechende mRNA-Expression. Die SLCO1B1 (linker Graph) und ABCC2 mRNA-Expression (rechter Graph) variierte nicht signifikant zwischen den exprimierenden Zelllinien, wohingegen es einen signifikanten Unterschied in der mRNA-Expression von UGT1A1 (mittlerer Graph) zwischen der doppelttransfizierten (OATP1B1-UGT1A1) und der tripeltransfizierten Zelllinie gab. Die qRT-PCR wurde in Triplikaten durchgeführt. Alle Daten sind als Mittelwerte ± Standardfehler (S.E.M.) angegeben. Ein statistischer Vergleich erfolgte stets zwischen transfizierten Zelllinien und wurde mithilfe des ANOVA-Tests mit nachfolgendem Tukey-Kramer multiple comparison test durchgeführt. Paarweise Vergleiche wurden im ungepaarten t-Test untersucht. Ein p-Wert ≤ 0,05 galt als statistisch signifikant. (** p < 0,01 vs. MDCKII-OATP1B1-UGT1A1)
Hierbei war nur bei Zelllinien, welche mit einer spezifischen cDNA transfiziert wurden,
eine Detektion der entsprechenden mRNA zu sehen. Kontrollzelllinien, welche nicht
transfiziert waren, zeigten hingegen keine Expression. Des Weiteren konnte hinsichtlich
der SLCO1B1 (linker Graph, Abbildung 10) und der ABCC2 (rechter Graph, Abbildung 10)
mRNA-Expression keine signifikanten Unterschiede zwischen den transfizierten Zelllinien
festgestellt werden. Lediglich die UGT1A1 mRNA-Expression (mittlerer Graph, Abbildung
10) zwischen beiden transfizierten Zelllinien war signifikant unterschiedlich (** p < 0,01,
ungepaarter t-Test).
Um zu untersuchen, ob sich die Daten zur mRNA-Expression auch mit der tatsächlichen
Proteinexpression in den verwendeten Zelllinien decken, wurden zusätzlich
semiquantitative Immunblotanalysen durchgeführt. Hierfür wurde von jeder Zelllinie 5 µg
an Zellhomogenat und zusätzlich von der tripeltransfizierten Zelllinie Kalibrierproben,
Ergebnisse 85
bestehend aus steigenden Mengen an Zellhomogenat dieser Zelllinie (1 / 2,5 / 5 / 7,5 / 10 /
12,5 µg) auf SDS-Polyacrylamidgele aufgetragen und auf Nitrocellulosemembranen
geblottet. Es folgte der spezifische Nachweis der untersuchten Proteine (OATP1B1,
UGT1A1, MRP2) mittels Antikörperdetektion (Abbildung 11).
Abbildung 11: Semiquantitative Immunblotanalyse mit Detektion von OATP1B1 (A), UGT1A1 (B) und MRP2 (C) in der tripeltransfizierten MDCKII-Zelllinie (OATP1B1-UGT1A1-MRP2) sowie in den entsprechenden Kontrollzelllinien. Das OATP1B1-Protein zeigt zwei Banden, welche der glykosylierten Form mit einem Molekulargewicht von 84 kDa und der unglykosylierten Form mit einem Molekulargewicht von 58 kDa entsprechen [22]. Hinsichtlich UGT1A1 und MRP2 wurde jeweils eine spezifische Bande mit einem Molekulargewicht von ca. 60 kDa für UGT1A1 und 190 kDa für MRP2 detektiert [171, 301]. Als Positivkontrolle wurden Kalibrierproben der tripeltransfizierten Zelllinie in aufsteigenden Konzentrationen (1 / 2,5 / 5 / 7,5 / 10 / 12,5 µg) aufgetragen. Die Immunblotanalysen wurden für jedes Protein in Triplikaten durchgeführt.
86 Ergebnisse
Im Anschluss wurden die oben gezeigten Immunblots mittels des Programms Quantity
One® 1-D Analysis Software (Bio-Rad Laboratories GmbH) densitometrisch ausgewertet
und die erhaltenen Werte für die mittlere Farbdichte (Average Density) der Kalibrierproben
zur Berechnung einer linearen Regressionsgeraden herangezogen. Mittels dieser und den
ermittelten Signalstärken der Banden der einzelnen Proben war es möglich, die Expression
eines Proteins in den Kontrollzelllinien auf die jeweilige Expression des Proteins in der
tripeltransfizierten Zelllinie zu berechnen. Einen Überblick über die quantitativen
Expressionen der untersuchten Proteine in den Kontrollzelllinien im Vergleich zur
tripeltransfizierten Zelllinie bietet Abbildung 12.
Abbildung 12: Prozentuale Expression von OATP1B1 (linker Graph), UGT1A1 (mittlerer Graph) und MRP2 (rechter Graph) in den Kontrollzelllinien im Vergleich zur Expression dieser Proteine in der tripeltransfizierten Zelllinie in den Kalibrierproben (densitometrische Auswertung der in Abbildung 11 dargestellten Immunblots). Die OATP1B1 und MRP2 Proteinexpression in den exprimierenden Kontrollzelllinien lag zwischen 67,9 und 110,8 % bezogen auf eine entsprechende Expression in der tripeltransfizierten Zelllinie, wohingegen UGT1A1 in der OATP1B1-UGT1A1 doppelttransfizierten MDCKII-Zelllinie sehr viel schwächer im Vergleich zur tripeltransfizierten Zelllinie (29,1 %) exprimiert war.
Wie man Abbildung 12 entnehmen kann, variierte die Proteinexpression von OATP1B1
und MRP2 (linker und rechter Graph der Abbildung) nicht stark zwischen den
verschiedenen transfizierten Zelllinien (67,9 – 110,8 %ige Proteinexpression bezogen auf
die tripeltransfizierte Zelllinie), was in guter Übereinstimmung mit den entsprechenden
mRNA-Expressionsdaten ist. Hinsichtlich der UGT1A1 Proteinexpression (mittlerer
Graph, Abbildung 12) in den beiden transfizierten Zelllinien zeigte sich wie auch bei der
mRNA-Expression eine sehr viel stärkere Expression in der tripeltransfizierten Zelllinie im
Ergebnisse 87
Vergleich zur OATP1B1-UGT1A1 doppelttransfizierten Zelllinie (29,1 % Expression in
der doppelttransfizierten Zelllinie im Vergleich zur tripeltransfizierten Zelllinie).
6.1.2. Untersuchung zum Metabolismus und transzellulären Transport von Ezetimib
Nachdem die in diesem Projekt verwendeten MDCKII-Zelllinien hinsichtlich ihrer mRNA-
und Proteinexpression charakterisiert waren, wurde die Funktionalität der etablierten
Zelllinien untersucht. Dazu dienten transzelluläre Transportversuche mit Ezetimib, ein
Arzneistoff, welcher zur Cholesterolsenkung eingesetzt wird [202]. Nach oraler Einnahme
gelangt der Arzneistoff durch Resorption im Darm über das Pfortaderblut in die Leber und
wird dort zu einem phenolischen Glucuronid konjugiert. Dieser Phase-II-Metabolit
unterliegt einem starken enterohepatischen Kreislauf und macht ca. 80-90 % der
Gesamtkonzentration im Plasma aus [200]. Es konnte bereits gezeigt werden, dass sowohl
Ezetimib als auch sein Phase-II-Metabolit mit dem hepatischen Aufnahmetransporter
OATP1B1 interagieren [57]. Auch die Metabolisierung von Ezetimib zu dem phenolischen
Glucuronid ist bereits gut untersucht, wobei die meisten Studien davon ausgehen, dass
Ezetimib über UGT1A1 zum Glucuronid konjugiert wird [203, 204]. Des Weiteren gab es
Hinweise auf eine Beteiligung von MRP2 an der hepatischen Elimination von Ezetimib-
Glucuronid [205-207]. Allerdings konnte Ezetimib-Glucuronid bislang noch nicht an einem
geeigneten in vitro-Modell direkt als Substrat von MRP2 identifiziert werden.
Um dies zu untersuchen, wurden zunächst transzelluläre Transportversuche mit
tritiummarkiertem Ezetimib in einer Konzentration von 1 µM und den Inkubationszeiten
10, 30 und 60 Minuten durchgeführt. Hierfür wurde die Donorlösung in das basolaterale
Kompartiment vorgelegt und nach den gewünschten Zeitpunkten sowohl im intrazellulären
als auch im apikalen Kompartiment die Konzentration an Radioaktivität mittels
Flüssigkeitsszintillationszählung ermittelt. Die Ergebnisse aus diesen Versuchen sind
Abbildung 13 zu entnehmen. Überraschenderweise war die intrazelluläre Akkumulation an
Radioaktivität, welche der Gesamtmenge an transportiertem Ezetimib und gebildetem
Glucuronid (nachfolgend bezeichnet als Äquivalente) entspricht, in der OATP1B1
einzeltransfizierten Zelllinie in dieser Versuchsanordnung nicht signifikant unterschiedlich
zur Vektorkontrollzelllinie (Abbildung 13, obere Graphen). Zusätzlich wies die OATP1B1-
UGT1A1-MRP2 tripeltransfizierte Zelllinie im Vergleich zu allen Kontrollzelllinien eine
signifikant geringere Akkumulation von Radioaktivität auf, welche über die Zeit hinweg
88 Ergebnisse
zudem abnahm (Abbildung 13, obere Graphen). Dies scheint offensichtlich dadurch
bedingt zu sein, dass bei den Kontrollzelllinien sehr viel weniger Ezetimibäquivalente in
das apikale Kompartiment gelangen, als es bei der tripeltransfizierten Zelllinie der Fall ist.
So waren signifikant größere Mengen an Ezetimibäquivalenten im apikalen Kompartiment
der tripeltransfizierten Zelllinie im Vergleich zu den Kontrollzelllinien detektierbar
(Abbildung 13, untere Graphen). Signifikant größere Mengen an Ezetimibäquivalenten
waren auch im apikalen Kompartiment der OATP1B1-UGT1A1 doppelttransfizierten
Zelllinie im Vergleich zu den restlichen Kontrollzelllinien nach 30 und 60 Minuten
nachweisbar (p < 0,001, Abbildung 13, untere Graphen). Dennoch blieb auch nach 60
Minuten ein signifikanter Unterschied hinsichtlich einer apikalen Akkumulation von
Ezetimibäquivalenten zwischen dieser Zelllinie und der tripeltransfizierten Zelllinie
bestehen (p < 0,05, Abbildung 13, rechter unterer Graph).
Nach Normalisierung der apikalen Daten auf die UGT1A1 Proteinexpression in beiden
transfizierten Zelllinien wies die tripeltransfizierte Zelllinie keine signifikant höheren
Werte mehr im Vergleich zur doppelttransfizierten Zelllinie auf.
Ergebnisse 89
Abbildung 13: Intrazelluläre Akkumulation (obere Graphen) und Translokation (untere Graphen) von Ezetimibäquivalenten (Ezetimib und Ezetimib-Glucuronid) 10 (linke Graphen), 30 (mittlere Graphen) und 60 (rechte Graphen) Minuten nach basolateraler Zugabe von 1 µM [3H]Ezetimib zu Monolayern der OATP1B1-UGT1A1-MRP2 tripeltransfizierten Zelllinie und der Kontrollzelllinien (MDCKII-VK, MDCKII-OATP1B1, MDCKII-OATP1B1-UGT1A1, MDCKII-OATP1B1-MRP2). Transzelluläre Transportversuche mit den Inkubationszeiten 10 und 60 Minuten wurden einmal mit drei Werten pro Zelllinie und transzelluläre Transportversuche mit der Inkubationszeit 30 Minuten wurden an drei unabhängigen Tagen mit jeweils drei Werten pro Zelllinie durchgeführt. Alle Werte wurden als Mittelwerte ± Standardfehler (S.E.M.) angegeben. (** p < 0,01, *** p < 0,001 vs. MDCKII-VK, # p < 0,05, ## p < 0,01, ### p < 0,001 vs. MDCKII-OATP1B1, § p < 0,05, §§ p < 0,01, §§§ p < 0,001 vs. MDCKII-OATP1B1-UGT1A1, + p < 0,05, ++ p < 0,01, +++ p < 0.001 vs. MDCKII-OATP1B1-MRP2) Da die OATP1B1 einzeltransfizierte MDCKII-Zelllinie im Vergleich zur Kontrollzelllinie
(VK) keine signifikante Aufnahme von Ezetimib zeigte, wurden analog zu den
transzellulären Transportversuchen mit Ezetimib Versuche mit dem Modellsubstrat
Sulfobromophthalein (BSP) durchgeführt. Dies diente dem Nachweis der Funktionalität der
einzeltransfizierten Zelllinie und sollte ausschließen, dass diese Zelllinie keine Aktivität
zeigt. Hierbei wies die einzeltransfizierte Zelllinie eine signifikant höhere Aufnahme des
Substrates im Vergleich zur Vektorkontrollzelllinie auf (0,05 µM BSP, 30 Minuten,
p < 0,01, ungepaarter t-Test, Abbildung 14).
90 Ergebnisse
Abbildung 14: Aufnahme des Modellsubstrates Sulfobromophthalein (BSP, 0,05 µM) in MDCKII-OATP1B1 im Vergleich zu MDCKII-VK Zellen nach 30 Minuten. Die Daten aus zwei unabhängigen Versuchen mit insgesamt vier Werten pro Zelllinie gingen in die Auswertung ein. Die Daten sind als Mittelwerte ± Standardfehler (S.E.M.) angegeben. Ein statistischer Unterschied wurde mittels eines ungepaarten t-Tests untersucht. Ein p-Wert ≤ 0,05 galt als statistisch signifikant. (** p < 0,01)
Zusammengefasst ergab sich aus den Transportversuchen mit tritiummarkiertem Ezetimib,
dass eine UGT1A1-Expression einen entscheidenden Einfluss auf die Translokation von
Ezetimibäquivalenten in das apikale Kompartiment hat und dass zusätzlich exprimiertes
MRP2 in der Lage ist diese Translokation zu unterstützen. Des Weiteren ließ sich aus
diesen Versuchen schließen, dass ein Großteil der im apikalen Kompartiment von
UGT1A1-exprimierenden Zelllinien gemessenen Radioaktivität auf gebildetes Ezetimib-
Glucuronid zurückzuführen ist, da Zelllinien ohne die Expression dieses Enzyms eine sehr
viel geringere Akkumulation von Radioaktivität im apikalen Kompartiment aufwiesen.
Um nachweisen zu können, ob die UGT1A1 transfizierten Zelllinien tatsächlich Ezetimib-
Glucuronid bilden und ob dieses überwiegend MRP2-vermittelt in das apikale
Kompartiment transportiert wird, wurden analog zu den Versuchen mit tritiummarkiertem
Ezetimib Versuche mit unmarkiertem Ezetimib durchgeführt und die Konzentrationen an
Ezetimib und Ezetimib-Glucuronid mittels einer LC-MS/MS-Methode ermittelt. Die
verwendete Substratkonzentration lag wieder bei 1 µM und als Inkubationszeiten wurden
30 und 60 Minuten gewählt. Die Ergebnisse dieser Versuche sind den Abbildungen 15
(Ezetimib) und 16 (Ezetimib-Glucuronid) zu entnehmen. Die Menge an intrazellulär
nachgewiesenem Ezetimib in den verschiedenen Zelllinien (Abbildung 15, untere Graphen)
stimmte gut mit den entsprechenden Werten aus den transzellulären Transportversuchen
mit tritiummarkierten Ezetimib überein. Dies ließ darauf schließen, dass die intrazellulär
gemessene Radioaktivität bei transzellulären Transportstudien mit [3H]Ezetimib
überwiegend auf freies Ezetimib und nicht auf Ezetimib-Glucuronid zurückzuführen war.
Eine Ausnahme bildete die OATP1B1-UGT1A1 doppelttransfizierte Zelllinie, welche nach
Ergebnisse 91
60 Minuten einen signifikanten Rückgang in der Menge an freiem Ezetimib im
intrazellulären Kompartiment zeigte (Abbildung 15, rechter unterer Graph). Eine
signifikant geringere intrazelluläre Akkumulation von Ezetimib wies auch die
tripeltransfizierte Zelllinie im Vergleich zu den übrigen Kontrollzelllinien nach beiden
Inkubationszeitpunkten auf, was ebenfalls sehr gut mit den Daten aus den transzellulären
Transportversuchen mit tritiummarkiertem Ezetimib übereinstimmte (p < 0,001, Abbildung
15, untere Graphen). Bei beiden Zelllinien waren die geringeren Mengen an freiem
Ezetimib wahrscheinlich Folge der Glucuronidierung von Ezetimib mittels UGT1A1.
Weiterhin kann aus Abbildung 15 (obere Graphen) entnommen werden, dass insgesamt nur
geringe Mengen an freiem Ezetimib im apikalen Kompartiment der einzelnen Zelllinien
detektiert werden konnten. Die tripeltransfizierte Zelllinie wies dabei über die Zeit hinweg
signifikant weniger freies Ezetimib auf als die Kontrollzelllinien (Abbildung 15, obere
Graphen, p < 0,001).
92 Ergebnisse
Abbildung 15: Translokation (obere Graphen) und intrazelluläre Akkumulation (untere Graphen) von Ezetimib 30 Minuten (linke Seite) und 60 Minuten (rechte Seite) nach Zugabe von 1 µM Ezetimib in das basolaterale Kompartiment von Monolayern der tripeltransfizierten Zelllinie und der Kontrollzelllinien (MDCKII-VK, MDCKII-OATP1B1, MDCKII-OATP1B1-UGT1A1, MDCKII-OATP1B1-MRP2). Transzelluläre Transportversuche mit der Inkubationszeit 60 Minuten wurden ein- bis zweimal mit drei Werten pro Zelllinie und transzelluläre Transportversuche mit der Inkubationszeit 30 Minuten wurden an zwei bis vier unabhängigen Tagen mit jeweils drei Werten pro Zelllinie durchgeführt. Alle Werte wurden als Mittelwerte ± Standardfehler (S.E.M.) angegeben. (** p < 0,01, *** p < 0,001 vs. MDCKII-VK, # p < 0,05, ### p < 0,001 vs. MDCKII-OATP1B1, §§§ p < 0,001 vs. MDCKII-OATP1B1-UGT1A1, +++ p < 0,001 vs. MDCKII-OATP1B1-MRP2)
Wie aus den Ergebnissen der Versuche mit tritiummarkiertem Ezetimib bereits geschlossen
wurde, ließ sich im apikalen Kompartiment der tripeltransfizierten Zelllinie über die Zeit
hinweg signifikant mehr Ezetimib-Glucuronid als in den Kontrollzelllinien nachweisen,
wahrscheinlich aufgrund einer hohen Affinität des Glucuronids zum Effluxtransporter
MRP2 (Abbildung 16, p < 0,001). Auch die OATP1B1-UGT1A1 doppelttransfizierte
Zelllinie wies größere Mengen an Ezetimib-Glucuronid im apikalen Kompartiment auf.
Diese Akkumulation war jedoch im Vergleich zu den übrigen Kontrollzelllinien statistisch
nicht signifikant (Abbildung 16).
Ergebnisse 93
Abbildung 16: Translokation von Ezetimib-Glucuronid in das apikale Kompartiment von Monolayern der tripeltransfizierten Zelllinie sowie der Kontrollzelllinien (MDCKII-VK, MDCKII-OATP1B1, MDCKII-OATP1B1-UGT1A1, MDCKII-OATP1B1-MRP2) 30 Minuten (linker Graph) und 60 Minuten (rechter Graph) nach Zugabe von 1 µM Ezetimib in das basolaterale Kompartiment der Zelllinien. Transzelluläre Transportversuche mit der Inkubationszeit 60 Minuten wurden ein- bis zweimal mit drei Werten pro Zelllinie und transzelluläre Transportversuche mit der Inkubationszeit 30 Minuten wurden an zwei bis vier unabhängigen Tagen mit jeweils drei Werten pro Zelllinie durchgeführt. In die Auswertung der Daten für die Inkubationszeit 60 Minuten flossen für die OATP1B1-MRP2 doppelttransfizierte Zelllinie nur zwei Werte ein, da es sich bei dem dritten Wert um einen Ausreißerwert handelte. Alle Werte wurden als Mittelwerte ± Standardfehler (S.E.M.) angegeben. (*** p < 0,001 vs. MDCKII-VK, ### p < 0,001 vs. MDCKII-OATP1B1, §§§ p < 0,001 vs. MDCKII-OATP1B1-UGT1A1, +++ p < 0,001 vs. MDCKII-OATP1B1-MRP2)
Darüber, ob die OATP1B1-UGT1A1 doppelttransfizierte Zelllinie im Vergleich zur
Tripeltransfektante entsprechend mehr Ezetimib-Glucuronid intrazellulär akkumulierte,
ließ sich keine Aussage treffen, da die intrazelluläre Konzentration an Ezetimib-Glucuronid
mittels der angewandten Methode nicht zuverlässig bestimmt werden konnte.
Nach Normalisierung der im apikalen Kompartiment ermittelten Konzentrationen an
Ezetimib-Glucuronid auf die geringere Expression von UGT1A1 in der OATP1B1-
UGT1A1 doppelttransfizierten Zelllinie im Vergleich zur tripeltransfizierten Zelllinie
(29,1 %), ergab sich nach wie vor ein signifikanter Unterschied in der Translokation von
Ezetimib-Glucuronid zwischen beiden Zelllinien (Abbildung 17, * p < 0,05, *** p < 0,001,
ungepaarter t-Test).
94 Ergebnisse
Abbildung 17: Translokation von Ezetimib-Glucuronid in das apikale Kompartiment von Monolayern der OATP1B1-UGT1A1 doppelttransfizierten und der tripeltransfizierten Zelllinie 30 Minuten (linker Graph) und 60 Minuten (rechter Graph) nach basolateraler Zugabe von 1 µM Ezetimib. Die erhaltenen Werte wurden auf die prozentuale Expression von UGT1A1 im Vergleich zur tripeltransfizierten Zelllinie normalisiert. In die Auswertung der Versuche mit einer Inkubationszeit von 30 Minuten flossen sechs Einzelwerte für die OAT1B1-UGT1A1 doppelttransfizierte und 12 Einzelwerte für die tripeltransfizierte Zelllinie ein. Bei Versuchen mit der Inkubationszeit 60 Minuten waren es drei Einzelwerte für die doppelt- und sechs Einzelwerte für die tripeltransfizierte Zelllinie. Alle Werte wurden als Mittelwerte ± Standardfehler (S.E.M.) angegeben. Ein statistischer Vergleich zwischen beiden Zelllinien wurde mithilfe eines ungepaarten t-Tests durchgeführt. Ein p-Wert ≤ 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. (* p < 0,05, *** p < 0,001 vs. MDCKII-OATP1B1-UGT1A1)
6.1.3. Identifizierung von Etoposid als Substrat von OATP1B1
Bislang wurde noch nicht gezeigt, dass Etoposid ein Substrat eines hepatischen OATP-
Transporters ist. Deshalb wurde zunächst die Aufnahme von tritiummarkierten Etoposid in
stabil exprimierenden HEK293-Zellen (HEK-OATP1B1, -OATP1B3, -OATP2B1) getestet,
bevor Etoposid in transzellulären Transportversuchen eingesetzt wurde. Um den Zeitpunkt
zu ermitteln, in dem die Aufnahme in die transfizierten HEK293-Zelllinien noch linear
ansteigt, wurden zunächst zeitabhängige Aufnahmeversuche (Inkubationszeiten: 1, 5, 10
und 30 Minuten) mit zwei verschiedenen Etoposidkonzentrationen (1 und 10 µM)
durchgeführt (n = 3 pro Zelllinie, Zeitpunkt und Konzentration). Dabei war der Anstieg der
Aufnahmekurve für alle verwendeten Zelllinien bei einer fünfminütigen Inkubation noch
linear. Nachfolgend wurden die bereits generierten Daten zu dieser Inkubationszeit durch
zwei weitere fünfminütige Aufnahmeversuche mit den beiden Substratkonzentrationen 1
und 10 µM komplettiert. Die Ergebnisse aus diesen Versuchen sind Abbildung 18 zu
entnehmen. Sowohl die OATP1B1 als auch die OATP2B1 stabil exprimierenden HEK293-
Zellen zeigten im Vergleich zur Kontrollzelllinie für beide Konzentrationen eine
Ergebnisse 95
signifikante Aufnahme (Aufnahmeratio OATP1B1 vs. VK: 1 µM: 1,9-fach p < 0,0001;
10 µM: 1,6-fach, p = 0,0001; Aufnahmeratio OATP2B1 vs. VK 1 µM: 1,5-fach, p < 0,01;
10 µM: 1,7-fach, p < 0,0001, ungepaarter t-Test, Abbildung 18). HEK293-Zellen, welche
den Aufnahmetransporter OATP1B3 exprimierten, wiesen nur bei einer
Substratkonzentration von 1 µM zwar eine signifikante, doch mäßige Aufnahme im
Vergleich zur Kontrollzelllinie auf (Aufnahmeratio OATP1B3 vs. VK: 1 µM: 1,3-fach,
p < 0,05, ungepaarter t-Test, Abbildung 18).
Abbildung 18: Aufnahme von [3H]Etoposid in HEK293-Zellen, welche die hepatischen Aufnahmetransporter OATP1B1 (Tr, links), OATP1B3 (Tr, Mitte) und OATP2B1 (Tr, rechts) stabil exprimieren im Vergleich zu den entsprechenden Kontrollzelllinien (VK). Die Substratkonzentrationen betrugen 1 und 10 µM und die Inkubationszeit lag bei fünf Minuten. In die Graphik wurden die Ergebnisse aus mindestens drei unabhängigen Versuchen eingebracht (9-18 Einzelwerte pro Zelllinie). Alle Werte wurden als Mittelwerte ± Standardfehler (S.E.M.) angegeben. Ein statistischer Vergleich zwischen zwei Zelllinien wurde mithilfe eines ungepaarten t-Tests durchgeführt. Ein p-Wert ≤ 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 vs. HEK293-VK)
Im Anschluss wurde eine konzentrationsabhängige Aufnahmekinetik für Etoposid in
OATP1B1-exprimierende HEK293-Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen bei einer
Inkubationszeit von fünf Minuten durchgeführt. Folgende Substratkonzentrationen wurden
hierfür gewählt: 0,1 / 0,5 / 1 / 2,5 / 5 / 7,5 / 10 / 12,5 / 20 / 30 / 50 und 100 µM. Jede
Konzentration wurde mindestens in zwei unabhängigen Versuchen getestet. Die
konzentrationsabhängige Aufnahme für Etoposid in die HEK293-OATP1B1 sowie in die
HEK293-VK G418 Zellen und der Nettotransport (Differenz zwischen der Aufnahme in
96 Ergebnisse
die OATP1B1-exprimierenden Zellen und der in die Kontrollzellen) sind Abbildung 19 zu
entnehmen. Die Aufnahme in die HEK293-OATP1B1 Zellen war über den kompletten
Konzentrationsbereich signifikant höher als in die Kontrollzellen (p < 0,05 für 100 µM und
p ≤ 0,0001 für die restlichen Konzentrationen, ungepaarter t-Test, Abbildung 19). Die
Michaelis-Menten-Konstante (Km) konnte mit 42,2 ± 11,6 µM und die maximale
Transportgeschwindigkeit (Vmax) mit 25,8 ± 3,5 pmol*mg Protein-1*min-1 bestimmt
werden.
Abbildung 19: Konzentrationsabhängige Aufnahme von Etoposid in OATP1B1-exprimierende HEK293-Zellen (graue Kurve) im Vergleich zu den entsprechenden Kontrollzellen (VK, schwarze Kurve). Der Nettotransport (rote Kurve) wurde berechnet durch Subtraktion der Aufnahme in die Kontrollzellen von der in die OATP1B1 transfizierten Zellen. Folgende Substratkonzentrationen wurden zur Bestimmung der Aufnahmekinetik gewählt: 0,1 / 0,5 / 1 / 2,5 / 5 / 7,5 / 10 / 12,5 / 20 / 30 / 50 / 100 µM. Die Inkubationszeit betrug fünf Minuten. Jede Substratkonzentration wurde mindestens in zwei unabhängigen Experimenten getestet (Anzahl der Einzelwerte pro Konzentration und Zelllinie: 6-18). Alle Werte wurde als Mittelwerte ± Standardfehler (S.E.M.) angegeben. Ein statistischer Vergleich zwischen beiden Zelllinien wurde mithilfe eines ungepaarten t-Tests durchgeführt. Ein p-Wert ≤ 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Bei allen getesteten Konzentrationen war die Aufnahme in die OATP1B1-exprimierenden Zelllinien signifikant höher als in die Kontrollzellen (p < 0,05 für 100 µM und p ≤ 0,0001 für die restlichen Konzentrationen).
6.1.4. Untersuchungen zum Metabolismus und transzellulären Transport von Etoposid
Da über die Aufnahmeversuche an HEK293-Zellen Etoposid als Substrat für OATP1B1
identifiziert werden konnte, war es im Folgenden möglich, transzelluläre
Transportversuche mit diesem Substrat an transfizierten MDCKII-Zellen durchzuführen.
Hierfür wurde [3H]Etoposid in einer Konzentration von 10 µM in das basolaterale
Kompartiment von Monolayern der tripeltransfizierten Zelllinie als auch der
Kontrollzelllinien (MDCKII-VK, MDCKII-OATP1B1, MDCKII-OATP1B1-UGT1A1,
Ergebnisse 97
MDCKII-OATP1B1-MRP2) gegeben und sowohl nach 60 als auch nach 120 Minuten die
Akkumulation von Radioaktivität im apikalen Kompartiment sowie die intrazelluläre
Akkumulation ermittelt. Transzelluläre Transportversuche für beide Inkubationszeiten
wurden in Triplikaten mit je drei Werten pro Zelllinie durchgeführt (neun Einzelwerte pro
Zelllinie und Inkubationszeit). Die Ergebnisse aus diesen Versuchen sind in Abbildung 20
zusammengefasst. Obwohl Etoposid in den Aufnahmeversuchen an HEK293-Zellen als
Substrat für OATP1B1 identifiziert werden konnte, zeigte sich in den transzellulären
Transportversuchen keine signifikante Aufnahme in OATP1B1-exprimierende Zelllinien
im Vergleich zur Kontrollzelllinie (Abbildung 20, obere Graphen). Dies könnte durch einen
Auswärtstransport von Etoposid über endogen exprimierte Effluxtransporter der MDCKII-
Zellen bedingt gewesen sein [302].
Im Gegensatz dazu akkumulierten signifikant mehr Etoposidäquivalente (Etoposid und
mögliche gebildete Metaboliten) im apikalen Kompartiment der OATP1B1-MRP2
doppelttransfizierten Zelllinie und der tripeltransfizierten Zelllinie im Vergleich zur
Vektorkontrollzelllinie (VK) nach 60 Minuten und im Vergleich zur Vektorkontrollzelllinie
und zur OATP1B1 einzeltransfizierten Zelllinie nach 120 Minuten (Abbildung 20, untere
Graphen). Dies deutet darauf hin, dass sowohl Etoposid als auch möglicherweise ein
gebildetes Glucuronid ein Substrat für MRP2 darstellen.
98 Ergebnisse
Abbildung 20: Intrazelluläre Akkumulation (obere Graphen) und transzellulärer Transport (untere Graphen) von Etoposidäquivalenten (Etoposid und mögliche Metaboliten) in das apikale Kompartiment von Monolayern der tripeltransfizierten Zelllinie sowie der Kontrollzelllinien (MDCKII-VK, MDCKII-OATP1B1, MDCKII-OATP1B1-UGT1A1, MDCKII-OATP1B1-MRP2) 60 Minuten (linke Seite) bzw. 120 Minuten (rechte Seite) nach Zugabe von 10 µM [3H]Etoposid in das basolaterale Kompartiment der Zelllinien. Die Versuche mit beiden Inkubationszeiten wurden in Triplikaten mit je drei Einzelwerten pro Zelllinie durchgeführt (insgesamt neun Einzelwerte pro Zelllinie und Inkubationszeit). Alle Werte wurden als Mittelwerte ± Standardfehler (S.E.M.) angegeben. (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 vs. MDCKII-VK, # p < 0,05, ## p < 0,01, ### p < 0,001 vs. MDCKII-OATP1B1)
Ob lediglich Etoposid oder auch ein gebildetes Glucuronid ein Substrat für den
Effluxtransporter MRP2 darstellt, soll zukünftig analog zu den vorgestellten Versuchen mit
Ezetimib durch weitere transzelluläre Transportversuche mit unmarkiertem Etoposid und
der getrennten Messung von freiem Etoposid und Etoposid-Glucuronid durch eine
entsprechende LC-MS/MS-Methode untersucht werden.
Ergebnisse 99
6.2. Identifizierung von Bosentan und dessen Metaboliten als Substrate von MRP2 mittels einer OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1-MRP2 quadrupeltransfizierten MDCKII-Zelllinie
6.2.1. Etablierung und Charakterisierung einer MDCKII-Zelllinie, welche stabil den Aufnahmetransporter OATP1B1, das Phase-I-Enzym CYP3A4, das Phase-II-Enzym UGT1A1 und die Exportpumpe MRP2 exprimiert
Um alle vier möglichen Phasen der hepatischen Elimination eines Arzneistoffs in vitro an
einem intakten Zellsystem untersuchen zu können, wurde die zuvor etablierte
tripeltransfizierte Zelllinie um ein Phase-I-Enzym, dem Cytochrom-P450-Enzym 3A4,
erweitert. Auf diese Weise war es möglich das Zusammenspiel aus gerichtetem Transport
und beiden Phasen der Biotransformation zu untersuchen. Analog zu dem bereits
vorgestellten Projekt mit der tripeltransfizierten Zelllinie wurden mit der neu etablierten
quadrupeltransfizierten Zelllinie transzelluläre Transportversuche mit einem radioaktiv
markierten Substrat durchgeführt. Hierzu diente der Arzneistoff Bosentan, welcher bereits
als Substrat für den Aufnahmetransporter OATP1B1 und das Phase-I-Enzym CYP3A4
beschrieben wurde [218-220]. Die direkte Glucuronidierung von Bosentan und dessen
Phase-I-Metaboliten in humanen Hepatozyten konnte bereits in einem Kongressbeitrag
gezeigt werden. Allerdings sind sowohl die umsetzende UGT-Isoform als auch der/die für
den Auswärtstransport von Bosentan-Metaboliten und/oder Bosentan verantwortliche/n
Transporter/n bislang noch nicht identifiziert [221, 223, 224, 303, 304]. Dieser
Fragestellung sollte mithilfe der neu etablierten quadrupeltransfizierten Zelllinie
nachgegangen werden. Zur Abschätzung des Einflusses der einzelnen Proteine auf den
Metabolismus und transzellulären Transport von Bosentan und dessen möglicher
Metaboliten wurden auch hier analog zu dem bereits vorgestellten Projekt zusätzlich
Kontrollzelllinien (MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1, MDCKII-OATP1B1-
CYP3A4-MRP2) etabliert und in den Versuchen mitgeführt. Unter diesem Gesichtspunkt
wurden des Weiteren die bereits am Lehrstuhl für Klinische Pharmakologie und Klinische
Toxikologie vorhandene MDCKII-VK Zelllinie, die OATP1B1 einzeltransfizierte
MDCKII-Zelllinie und die OATP1B1-MRP2 doppelttransfizierte MDCKII-Zelllinie sowie
die bereits beschriebene OATP1B1-UGT1A1-MRP2 tripeltransfizierte Zelllinie als
Kontrollzelllinien in allen Versuchen verwendet. Mittels vergleichender quantitativer
100 Ergebnisse
Real-time PCR-Analyse wurde zunächst die mRNA-Expression aller transfizierten cDNAs
in der quadrupeltransfizierten Zelllinie als auch in den Kontrollzelllinien untersucht
(Abbildung 21).
Abbildung 21: Quantitative Real-time PCR-Analyse zur Bestimmung der SLCO1B1 (kodierend für OATP1B1), der CYP3A4 (kodierend für CYP3A4), der UGT1A1 (kodierend für UGT1A1) und der ABCC2 (kodierend für MRP2) mRNA-Expression in der quadrupeltransfizierten Zelllinie sowie in den Kontrollzelllinien (MDCKII-VK, MDCKII-OATP1B1, MDCKII-OATP1B1-MRP2, MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1, MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2, MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-MRP2). Nur mit der spezifischen cDNA transfizierte Zelllinien zeigten eine entsprechende Expression. Die SLCO1B1 (linker oberer Graph) mRNA-Expression variierte nur zwischen der OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1 tripeltransfizierten Kontrollzelllinie und den übrigen Zelllinien signifikant. Die übrigen untersuchten Zelllinien zeigten keine signifikanten Unterschiede in ihrer SLCO1B1 mRNA-Expression. Bezüglich CYP3A4 ergab sich in der OATP1B1-CYP3A4-MRP2 tripeltransfizierten Zelllinie eine signifikant schwächere mRNA-Expression im Vergleich zu den beiden anderen mit dieser cDNA transfizierten Zelllinien (rechter oberer Graph). Die OATP1B1-UGT1A1-MRP1 tripeltransfizierte Zelllinie zeigte im Vergleich zur OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1 tripeltransfizierten Zelllinie eine signifikant stärkere UGT1A1 mRNA-Expression (linker unterer Graph), wohingegen die ABCC2 mRNA-Expression (rechter unterer Graph) nicht signifikant zwischen den exprimierenden Zelllinien variierte. Die qRT-PCR wurde in Triplikaten durchgeführt. Alle Daten sind als Mittelwerte ± Standardfehler (S.E.M.) angegeben. (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 vs. MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1, ## p < 0,01, ### p < 0,001 vs. MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2)
Ergebnisse 101
Wie bei dem bereits vorgestellten Projekt war auch bei diesen quantitativen Real-time
PCR-Analysen nur bei Zelllinien, welche mit einer spezifischen cDNA transfiziert wurden,
eine entsprechende mRNA-Expression zu detektieren. Kontrollzelllinien, welche nicht
transfiziert waren, zeigten keine entsprechende Expression. Hinsichtlich der SLCO1B1
mRNA-Expression (linker oberer Graph, Abbildung 21) ergaben sich nur zwischen der
OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1 tripeltransfizierten Zelllinie und den restlichen Zelllinien
signifikante Unterschiede. Die übrigen mit dieser cDNA transfizierten Zelllinien wiesen
keine signifikanten Unterschiede in ihrer SLCO1B1 mRNA-Expression auf. Somit zeigen
diese Daten eine gute Übereinstimmung mit denen des bereits vorgestellten Projektes. Die
CYP3A4 mRNA-Expression (rechter oberer Graph, Abbildung 21) in der OATP1B1-
CYP3A4-MRP2 tripeltransfizierten Zelllinie war im Vergleich zu den beiden anderen mit
dieser cDNA transfizierten Zelllinien signifikant schwächer sowie die mRNA-Expression
von UGT1A1 in der MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1 Zelllinie im Vergleich zur
MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-MRP2 Zelllinie (linker unterer Graph, Abbildung 21).
Bezüglich der ABCC2 mRNA-Expression (rechter unterer Graph, Abbildung 21) konnten
keine signifikanten Unterschiede zwischen transfizierten Zelllinien detektiert werden, was
sich mit den Daten aus dem bereits vorgestellten Projekt deckt.
Um zu untersuchen, ob die Daten zur mRNA-Expression auch mit der tatsächlichen
Proteinexpression in den verwendeten Zelllinien übereinstimmen, wurden analog zu dem
bereits vorgestellten Projekt semiquantitative Immunblotanalysen durchgeführt. Als
Kalibrierproben dienten in diesem Fall aufsteigende Mengen an Zellhomogenat der
quadrupeltransfizierten Zelllinie (1 / 2,5 / 5 / 7,5 / 10 µg). Neben diesen wurden wieder von
jeder Zelllinie 5 µg Zellhomogenat auf diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgele
aufgetragen und auf Nitrocellulosemembranen geblottet. Danach folgte der spezifische
Nachweis der untersuchten Proteine (OATP1B1, CYP3A4, UGT1A1, MRP2) mittels
Antikörperdetektion (Abbildung 22).
102 Ergebnisse
Abbildung 22: Semiquantitative Immunblotanalysen mit Detektion von OATP1B1 (A), CYP3A4 (B), UGT1A1 (C) und MRP2 (D) in der quadrupeltransfizierten MDCKII-Zelllinie sowie in den Kontrollzelllinien. Für den Nachweis wurden pro Zelllinie 5 µg an Zellhomogenat verwendet. Das OATP1B1-Protein zeigt zwei Banden, welche der glykosylierten Form mit einem Molekulargewicht von 84 kDa und der unglykosylierten Form mit einem Molekulargewicht von 58 kDa entsprechen. Hinsichtlich CYP3A4, UGT1A1 und MRP2 wurde jeweils eine spezifische Bande detektiert mit einem Molekulargewicht von ca. 55 kDa für CYP3A4, ca. 60 kDa für UGT1A1 und 190 kDa für MRP2. Als Positivkontrolle und für semiquantitative Auswertungen wurden Kalibrierproben der quadrupeltransfizierten Zelllinie in aufsteigenden Konzentrationen (1 / 2,5 / 5 / 7,5 / 10 µg) aufgetragen. Die Immunblotanalysen wurden für jedes Protein in Triplikaten durchgeführt.
Im Anschluss wurden die einzelnen Immunblots mittels des Programms Quantity One®
1-D Analysis Software (Bio-Rad Laboratories GmbH) densitometrisch ausgewertet und die
erhaltenen Werte für die mittlere Farbdichte (Average Density) der Kalibrierproben zur
Berechnung einer linearen Regressionsgeraden herangezogen. Diese wurde wie im bereits
Ergebnisse 103
vorgestellten Projekt wieder dazu verwendet, um die ermittelten Signalstärken der Banden
der einzelnen Proben auf eine prozentuale Expression eines Proteins in den
Kontrollzelllinien auf die jeweilige Expression des Proteins in der quadrupeltransfizierten
Zelllinie umzurechnen. Einen Überblick über die verschiedenen Expressionen der
untersuchten Proteine in den Kontrollzelllinien im Vergleich zur quadrupeltransfizierten
Zelllinie bietet Abbildung 23.
Abbildung 23: Prozentuale Expression von OATP1B1 (linker oberer Graph), CYP3A4 (rechter oberer Graph), UGT1A1 (linker unterer Graph) und MRP2 (rechter unterer Graph) in den Kontrollzelllinien im Vergleich zur Expression dieser Proteine in der quadrupeltransfizierten Zelllinie in den Kalibrierproben. Zur Generierung dieser Daten wurden Immunblotanalysen mit der Detektion der unterschiedlichen Proteine jeweils in Triplikaten durchgeführt und diese densitometrisch ausgewertet. Die Variabilität in der prozentualen Expression der einzelnen Proteine in den Kontrollzelllinien im Vergleich zur quadrupeltransfizierten Zelllinie war nicht höher als ± 60 %, mit Ausnahme der OATP1B1-Expression in der MDCKII-OATP1B1, der CYP3A4-Expression in der MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2 und der UGT1A1-Expression in der MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-MRP2 Zelllinie. Alle Daten sind als Mittelwerte ± Standardfehler (S.E.M.) angegeben. (# p < 0,05, ## p < 0,01 vs. MDCKII-OATP1B1, ++ p < 0,01 vs. MDCKII-OATP1B1-MRP2, §§§ p < 0,001 vs. MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1, ††† p < 0,001 vs. MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2, $$ p < 0,01, $$$ p < 0,001 vs. MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-MRP2)
104 Ergebnisse
Wie man der Abbildung 23 entnehmen kann, variierte die prozentuale Expression der
einzelnen Proteine in den Kontrollzelllinien im Vergleich zur quadrupeltransfizierten
Zelllinie um ± 60 %. Ausnahmen davon bildeten die Expression von OATP1B1 in der
MDCKII-OATP1B1 Zelllinie, die CYP3A4-Expression in der MDCKII-OATP1B1-
CYP3A4-MRP2 Zelllinie sowie die Expression von UGT1A1 in der MDCKII-OATP1B1-
UGT1A1-MRP2 Zelllinie. Insgesamt zeigten die Daten zur Protein- und mRNA-
Expression eine gute Übereinstimmung, mit Ausnahme der Expression von OATP1B1 in
der einzeltransfizierten Zelllinie sowie der Expression von MRP2 in der
doppelttransfizierten Zelllinie.
6.2.2. Untersuchungen zur Bestimmung der mikrosomalen Enzymaktivität
6.2.2.1. Bestimmung der NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase-Aktivität
Da eine NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase-Aktivität für die Aktivität des
Cytochrom-P450-3A4-Enzyms in den damit transfizierten Zelllinien notwendig ist, wurde
diese in den für die stabile Transfektion zur Verfügung stehenden Ausgangszelllinien
(MDCKII-OATP1B1, MDCKII-OATP1B1-MRP2, MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-MRP2)
sowie in der Vektorkontrollzelllinie (MDCKII-VK) untersucht. Der Nachweis einer
Enzymaktivität erfolgte über die photometrisch messbare Reduktion von Cytochrom c bei
einer Wellenlänge von 550 nm in Gesamthomogenaten der erwähnten Zelllinien. Die
Ergebnisse zu diesen Untersuchungen sind in Abbildung 24 zusammengefasst.
Ergebnisse 105
Abbildung 24: Nettoaktivität der NADPH-Cytochrom-P450-Oxidoreduktase in den zur weiteren stabilen Transfektion eingesetzten Zelllinien (MDCKII-OATP1B1, MDCKII-OATP1B1-MRP2, MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-MRP2) sowie in der Vektorkontrollzelllinie (VK). Bestimmt wurde die Aktivität der Oxidoreduktase über die photometrische Vermessung von reduziertem Cytochrom c. Die dargestellten Ergebnisse stammten aus zwei unabhängigen Versuchen mit insgesamt vier Einzelwerten pro Zelllinie. Zwischen den untersuchten Zelllinien ergab sich kein signifikanter Unterschied in der Oxidoreduktase-Aktivität. Alle Daten sind als Mittelwerte ± Standardfehler (S.E.M.) angegeben. Ein statistischer Vergleich zwischen exprimierenden Zelllinien erfolgte mithilfe des ANOVA-Tests mit nachfolgendem Tukey-Kramer multiple comparison test. Ein p-Wert ≤ 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
Wie Abbildung 24 zeigt, lag die Oxidoreduktase-Aktivität für alle untersuchten Zelllinien
zwischen 11074 und 14532 pmol*mg Protein-1*min-1 und variierte nicht signifikant.
6.2.2.2. Bestimmung der Cytochrom-P450-3A4-Aktivität
Um vor der Durchführung von transzellulären Transportversuchen an den neu etablierten
Zelllinien nachzuweisen, dass die CYP3A4-exprimierenden Zelllinien auch eine
entsprechende Aktivität dieses Enzyms aufweisen, wurde diese zuvor in einem Assay
bestimmt. Dazu wurde die Umsetzung von Midazolam zum 1`-Hydroxymidazolam in
Gesamthomogenaten aller in diesem Projekt verwendeten Zelllinien (MDCKII-VK,
MDCKII-OATP1B1, MDCKII-OATP1B1-MRP2, MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-
UGT1A1, MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2, MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-MRP2,
MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1-MRP2) untersucht. Dieser Hauptabbauweg des
Midazolams gilt als Modellreaktion zur Bestimmung der CYP3A-Aktivität [270]. Die
Ergebnisse zu diesen Versuchen sind Abbildung 25 zu entnehmen.
106 Ergebnisse
Abbildung 25: Bestimmung der Cytochrom-P450-3A4-Aktivität in der quadrupeltransfizierten Zelllinie sowie in den Kontrollzelllinien (MDCKII-VK, MDCKII-OATP1B1, MDCKII-OATP1B1-MRP2, MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1, MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2, MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-MRP2). Hierfür wurden Gesamthomogenate aller Zelllinien für fünf Minuten bei 37 °C mit 3 µM (linker Graph) oder 250 µM (rechter Graph) Midazolam inkubiert und danach die Konzentration an gebildetem 1`-Hydroxymidazolam mittels LC-MS/MS bestimmt. Nur Zelllinien, welche CYP3A4 exprimieren, zeigten eine Umsetzung des Midazolams zum entsprechenden 1`-Hydroxymetaboliten bei beiden getesteten Konzentrationen. Die MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2 Zelllinie zeigte bei beiden Konzentrationen eine signifikant geringere Umsetzung als die beiden anderen CYP3A4-exprimierenden Zelllinien. Bei einer Substratkonzentration von 3 µM war zudem der Unterschied in der 1`-Hydroxymidazolam Bildung zwischen der MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1 Zelllinie und der quadrupeltransfizierten Zelllinie signifikant. Die dargestellten Ergebnisse stammten aus zwei unabhängigen Versuchen mit insgesamt vier Einzelwerten pro Zelllinie und Konzentration. Alle Daten sind als Mittelwerte ± Standardfehler (S.E.M.) angegeben. (* p < 0,05, *** p < 0,001 vs. MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1, ## p < 0,01, ### p < 0,001 vs. MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2)
Die Umsetzung von Midazolam zum 1`-Hydroxymidazolam wurde durch eine
fünfminütige Inkubation von Gesamthomogenaten der bereits erwähnten Zelllinien mit 3
bzw. 250 µM Midazolam bei 37 °C bestimmt. Wie in Abbildung 25 erkennbar, war nur in
den CYP3A4-exprimierenden Zelllinien eine 1`-Hydroxymidazolam Bildung detektierbar.
Zudem ergaben die Untersuchungen zur CYP3A4-Aktivität, dass die MDCKII-OATP1B1-
CYP3A4-MRP2 Zelllinie bei beiden getesteten Konzentrationen eine signifikant geringere
Umsetzung des Midazolams im Vergleich zu den beiden anderen CYP3A4-exprimierenden
Zelllinien aufweist. Des Weiteren konnten signifikante Unterschiede in der Bildung des
1`-Hydroxymetaboliten auch zwischen der MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1
Zelllinie und der quadrupeltransfizierten Zelllinie bei einer Substratkonzentration von
3 µM detektiert werden.
Da die MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2 Zelllinie allerdings im Vergleich zu den
beiden anderen CYP3A4-exprimierenden Zelllinien eine signifikant niedrigere CYP3A4-
Ergebnisse 107
Expression aufwies, wurden die Daten zur CYP3A4-Aktivität auf die Expression dieses
Enzyms in den einzelnen Zelllinien normalisiert. Abbildung 26 zeigt die Ergebnisse zu
diesen Berechnungen.
Abbildung 26: Cytochrom-P450-3A4-Aktivität in CYP3A4-exprimierenden Zelllinien nach Normalisierung auf die Expression des Enzyms in den einzelnen Zelllinien. Nach Normalisierung auf die CYP3A4-Expression wies die MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2 Zelllinie bei beiden im Aktivitätsassay getesteten Midazolamkonzentrationen (3 µM, linke Graphik und 250 µM, rechte Graphik) die stärkste Umsetzung zum 1`-Hydroxymidazolam auf. Die dargestellten Ergebnisse stammten aus zwei unabhängigen Versuchen mit insgesamt vier Einzelwerten pro Zelllinie und Konzentration. Alle Daten sind als Mittelwerte ± Standardfehler (S.E.M.) angegeben. (* p < 0,05 vs. MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2)
Wie Abbildung 26 zeigt, wies die MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2 Zelllinie nach
Normalisierung auf die Cytochrom-P450-3A4 Expression die stärkste Umsetzung von
Midazolam zum 1`-Hydroxymidazolam auf.
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die quadrupeltransfizierte Zelllinie sowie die
neu generierten Kontrollzelllinien erfolgreich etabliert und charakterisiert werden konnten.
6.2.3. Untersuchungen zum Metabolismus und transzellulärem Transport von Bosentan
Bei Bosentan handelt es sich um einen dualen Endothelinrezeptor-Antagonisten, welcher
eine hohe Affinität zu beiden Endothelinrezeptoren aufweist und als erste orale Medikation
zur Behandlung der pulmonalen arteriellen Hypertonie zugelassen wurde [216-219, 305,
306]. Nach Aufnahme in die Leber wird Bosentan CYP3A4- und CYP2C9-vermittelt zu
108 Ergebnisse
einem Phenol-Metaboliten (Ro 47-8634), einem Hydroxy-Metaboliten (Ro 48-5033) und
dem sekundären Hydroxyphenol-Metaboliten (Ro 64-1056) umgesetzt [217-220]. Die
Elimination von Bosentan-Metaboliten und möglicherweise von Bosentan selbst erfolgt zu
90 % über die Galle [221, 222]. Sowohl Bosentan als auch der Hydroxy-Metabolit sind
Substrate des hepatischen Aufnahmetransporters OATP1B1 [218]. Eine Glucuronidierung
von Bosentan und seiner Phase-I-Metaboliten konnte in humanen Hepatozyten gezeigt
werden, allerdings wurde die UGT-Isoform, welche die Glucuronidierung vermittelt, noch
nicht identifiziert [224]. Bislang konnte auch noch nicht abschließend geklärt werden, über
welche/n Transporter die Bosentan-Metaboliten und/oder der Arzneistoff selbst in die Galle
transportiert werden [220, 221, 223, 303, 304].
Um dies zu untersuchen, wurden analog zu dem bereits vorgestellten Projekt transzelluläre
Transportversuche mit [14C]Bosentan in einer Konzentration von 20 µM durchgeführt.
Hierfür wurde die Donorlösung mit Bosentan in das basolaterale Kompartiment von
Monolayern der quadrupeltransfizierten Zelllinie sowie der Kontrollzelllinien (MDCKII-
VK, MDCKII-OATP1B1, MDCKII-OATP1B1-MRP2, MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-
UGT1A1, MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2, MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-MRP2)
gegeben und diese für 180 Minuten bei 37 °C inkubiert. Nach 60 und nach 120 Minuten
wurden dem apikalen Kompartiment aller Monolayer Aliquots von 100 µl entnommen, um
darin die Menge an Radioaktivität zu bestimmen. Nach 180 Minuten wurden nochmals
Aliquots von 100 µl entnommen und die apikal sowie intrazellulär akkumulierte Menge an
Radioaktivität ermittelt. Die Ergebnisse zu diesen Untersuchungen sind in den
Abbildungen 27 und 28 zusammengefasst. Die intrazelluläre Akkumulation von
Bosentanäquivalenten (Bosentan und mögliche Metaboliten) war in MRP2-exprimierenden
Zelllinien signifikant niedriger im Vergleich zu Zelllinien ohne diesen Transporter
(Abbildung 27, p < 0,001). Die tripeltransfizierte Kontrollzelllinie MDCKII-OATP1B1-
CYP3A4-UGT1A1 wies zudem eine signifikant höhere intrazelluläre Menge an
Bosentanäquivalenten im Vergleich zu den beiden anderen Kontrollzelllinien ohne MRP2-
Expression (MDCKII-VK, MDCKII-OATP1B1) auf (Abbildung 27, p < 0,001).
Ergebnisse 109
Abbildung 27: Intrazelluläre Akkumulation von Bosentanäquivalenten (Bosentan und mögliche, gebildete Metaboliten) in Monolayern der quadrupeltransfizierten Zelllinie sowie der Kontrollzelllinien (MDCKII-VK, MDCKII-OATP1B1, MDCKII-OATP1B1-MRP2, MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1, MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2, MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-MRP2) 180 Minuten nach basolateraler Zugabe von 20 µM [14C]Bosentan. Zelllinien, welche MRP2 exprimieren, akkumulierten intrazellulär signifikant weniger Bosentanäquivalente im Vergleich zu Zelllinien ohne diesen Transporter. Die OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1 tripeltransfizierte Zelllinie wies die höchste Akkumulation von Bosentanäquivalenten im intrazellulären Kompartiment auf. Diese war auch im Vergleich zu den beiden anderen Zelllinien ohne MRP2-Expression (MDCKII-VK, MDCKII-OATP1B1) signifikant höher. Die hier zusammengefassten Ergebnisse stammten aus zwei unabhängigen Versuchen mit je drei Einzelwerten pro Zelllinie. Alle Daten sind als Mittelwerte ± Standardfehler (S.E.M.) angegeben. (*** p < 0,001 vs. MDCKII-VK, ### p < 0,001 vs. MDCKII-OATP1B1, §§§ p < 0,001 vs. MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1)
Entsprechend der niedrigeren intrazellulären Mengen an Bosentanäquivalenten, zeigten
Zelllinien mit MRP2-Expression im Vergleich zu Zelllinien ohne diesen Transporter eine
signifikant höhere Akkumulation von Bosentanäquivalenten im apikalen Kompartiment
nach allen getesteten Inkubationszeiten (Abbildung 28, p < 0,001). Nach 60 Minuten
zeigten zudem die tripeltransfizierten Kontrollzelllinien MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-
MRP2 und MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-MRP2 signifikant höhere Mengen an
Bosentanäquivalenten im apikalen Kompartiment im Vergleich zur OATP1B1-MRP2
doppelttransfizierte Zelllinie (Abbildung 28, oberer Graph, p < 0,05). Dieser Unterschied
blieb zwischen der doppelttransfizierten Zelllinie und der MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-
MRP2 Zelllinie über die komplette Inkubationszeit signifikant (Abbildung 28, p < 0,05).
110 Ergebnisse
Abbildung 28: Akkumulation von Bosentanäquivalenten im apikalen Kompartiment von Monolayern der quadrupeltransfizierten Zelllinie sowie der Kontrollzelllinien (MDCKII-VK, MDCKII-OATP1B1, MDCKII-OATP1B1-MRP2, MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1, MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2, MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-MRP2) 60 Minuten (oberer Graph), 120 Minuten (mittlerer Graph) und 180 Minuten (unterer Graph) nach basolateraler Zugabe von 20 µM [14C]Bosentan. Zelllinien mit Expression von MRP2 wiesen eine signifikant höhere Akkumulation von Bosentanäquivalenten im Vergleich zu Zelllinien ohne Expression des Transporters auf. Signifikante Unterschiede in der Menge an Bosentanäquivalenten im apikalen Kompartiment ergaben sich auch zwischen der OATP1B1-MRP2 doppelttransfizierten Zelllinie und den tripeltransfizierten Zelllinien MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2 und MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-MRP2 nach 60 Minuten. Diese Unterschiede blieben zwischen der doppelttransfizierten Zelllinie und der MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2 Zelllinie über die gesamte Inkubationszeit signifikant. Die hier zusammengefassten Ergebnisse stammten aus zwei unabhängigen Versuchen mit je drei Einzelwerten pro Zelllinie und Inkubationsdauer. Alle Daten sind als Mittelwerte ± Standardfehler (S.E.M.) angegeben. (*** p < 0,001 vs. MDCKII-VK, ### p < 0,001 vs. MDCKII-OATP1B1, + p < 0,05, +++ p < 0,001 vs. MDCKII-OATP1B1-MRP2, §§§ p < 0,001 vs. MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1)
Ergebnisse 111
Die Ergebnisse aus diesen Versuchen deuteten darauf hin, dass Bosentan selbst ein Substrat
von MRP2 ist, da auch die doppelttransfizierte Zelllinie MDCKII-OATP1B1-MRP2 eine
signifikante Translokation von Bosentanäquivalenten im Vergleich zu Zelllinien ohne
Expression von MRP2 aufwies. Inwieweit das zutraf bzw. inwieweit auch Bosentan-
Metaboliten mittels MRP2 in das apikale Kompartiment der entsprechenden Zelllinien
transportiert wurden, sollte in einer Kooperation mit Actelion (Actelion Pharmaceuticals
Ltd, Allschwil, Schweiz) geklärt werden.
Hierfür wurden zwei weitere transzelluläre Transportversuche mit 20 µM [14C]Bosentan
und einer Inkubationszeit von 180 Minuten ohne apikale Entnahme von Aliquots nach 60
und 120 Minuten durchgeführt. Die intrazelluläre und apikale Akkumulation von
Bosentanäquivalenten wurden wieder in Aliquots mittels Flüssigkeitsszintillationszählung
zur Abgleichung dieser Daten mit denen der beiden vorherigen Versuche bestimmt.
Nachdem die Messung eine gute Übereinstimmung der Versuche bestätigte, wurden die
Proben zum Kooperationspartner versandt. Dort erfolgte eine Untersuchung der Proben
mittels HPLC gekoppelt mit Radiodetektor und LC-MS. Qualitative Messungen mittels
HPLC gekoppelt mit Radiodetektor zweier Proben pro Zelllinie ergaben, dass vor allem
Bosentan im apikalen Kompartiment der Zelllinien akkumuliert wird. Somit bestätigten
diese Messungen die Vermutung, dass Bosentan selbst ein Substrat des Effluxtransporters
MRP2 in vitro ist. Entsprechende Vermessungen der intrazellulären Proben (insgesamt drei
Proben pro Zelllinie) zeigten ebenfalls eine überwiegende Akkumulation von Bosentan in
diesem Kompartiment. In CYP3A4-exprimierenden Zelllinien wurden zusätzlich kleine
Mengen der beiden Phase-I-Metaboliten Ro 48-5033 (Hydroxy-Metabolit) und Ro 47-8634
(Phenol-Metabolit) nachgewiesen. Strukturelle Untersuchungen mittels LC-MS zur
Identifizierung neuer Metaboliten (Phase-II-Konjugate) ergaben, dass in den intrazellulären
Kompartimenten von UGT1A1-exprimierenden Zelllinien und in den apikalen
Kompartimenten der UGT1A1-MRP2-exprimierenden Zelllinien zusätzlich kleine Mengen
an Bosentan-Glucuronid zu detektieren waren. Glucuronide der Phase-I-Metaboliten
hingegen konnten im Rahmen dieser Arbeit nicht nachgewiesen werden. Die Ergebnisse
der qualitativen Messungen der intrazellulären Proben sind in Tabelle 7 zusammengefasst.
112 Ergebnisse
Tabelle 7: Qualitative Messungen von Bosentan und seiner Metaboliten in intrazellulären Kompartimenten
Identifizierte Verbindungen
Zelllinien
VK
OA
TP1B
1
OA
TP1B
1-M
RP2
OA
TP1B
1-C
YP3
A4-
UG
T1A
1
OA
TP1B
1-C
YP3
A4-
MR
P2
OA
TP1B
1-U
GT1
A1-
MR
P2
OA
TP1B
1-C
YP3
A4-
UG
T1A
1-M
RP2
Bosentan
+ + + + + + +
Ro 48-5033
- - - + + - +
Ro 47-8634
- - - + + - +
Ro 64-1056
n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
Bosentan-Glucuronid
- - - + - + +
n.d.: nicht detektierbar
Diskussion 113
7. Diskussion
Ziel dieser Arbeit war es, mehrfachtransfizierte Zellsysteme mit der parallelen, stabilen
Expression eines Aufnahmetransporters (OATP1B1), von metabolisierenden Enzymen
(CYP3A4 und/oder UGT1A1) und eines Effluxtransporters (MRP2) zu etablieren und
funktionell zu charakterisieren. Mithilfe dieser Zellsysteme war es möglich, das
Zusammenspiel von Aufnahme, Metabolismus und Export von Arzneistoffen in vitro
untersuchen zu können.
7.1. Identifizierung von Ezetimib, Etoposid und deren Metaboliten als Substrate von MRP2 mittels einer OATP1B1-UGT1A1-MRP2 tripeltransfizierten MDCKII-Zelllinie
Anhand von klinischen Studien an gesunden Probanden konnte gezeigt werden, dass die
Transportproteine OATP1B1 und MRP2 sowie das Phase-II-Enzym UGT1A1 wichtige
Determinanten für die Pharmakokinetik von Ezetimib darstellen [57, 205]. Nun konnte im
Rahmen der vorliegenden Arbeit mittels eines neu etablierten Zellmodells mit der
parallelen, stabilen Expression des Aufnahmetransporters OATP1B1, des Phase-II-Enzyms
UGT1A1 und des Effluxtransporters MRP2, Ezetimib-Glucuronid, nicht aber die
Ursprungssubstanz Ezetimib als ein gutes Substrat für den Effluxtransporter MRP2
identifiziert werden. In vitro-Studien an OATP1B1, OATP1B3 und OATP2B1
transfizierten Zelllinien zeigten, dass sowohl Ezetimib als auch sein phenolisches
Glucuronid Inhibitoren der OATP-vermittelten Aufnahme des Modellsubstrates
Sulfobromophthalein darstellen. Dabei stellte sich Ezetimib als ein 30- bis 100-fach
weniger potenter Inhibitor heraus als sein Phase-II-Metabolit. Eine Aufnahme in
OATP1B1-exprimierende Zellen konnte zudem nur für das Glucuronid, nicht aber für die
Ursprungssubstanz Ezetimib gezeigt werden [57]. Diese Daten stimmen mit den
Ergebnissen aus den Versuchen, welche im Rahmen der vorliegenden Arbeit gewonnen
wurden, überein. So konnte auch anhand der transzellulären Transportversuche an stabil
transfizierten MDCKII-Zelllinien kein signifikanter Unterschied in der intrazellulären
Akkumulation von Ezetimib zwischen den MDCKII-OATP1B1 einzeltransfizierten Zellen
und den MDCKII-Vektorkontrollzellen festgestellt werden. Es lässt sich also festhalten,
dass in vitro-Untersuchungen zur Aufklärung von klinischen Befunden eine entscheidende
114 Diskussion
Rolle spielen, da die Daten aus der bereits erwähnten klinischen Studie den Schluss nahe
legten, dass auch Ezetimib ein Substrat für den hepatischen Aufnahmetransporter
OATP1B1 darstellen könnte.
Die intrazelluläre Akkumulation von Ezetimibäquivalenten zeigte eine gute
Übereinstimmung mit der detektierten Menge an freiem Ezetimib in den intrazellulären
Kompartimenten der Zelllinien, was darauf hindeutet, dass vor allem freies Ezetimib
intrazellulär akkumuliert wurde. Zudem war die intrazelluläre Akkumulation von Ezetimib
in der MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-MRP2 tripeltransfizierten Zelllinie im Vergleich zu
den restlichen Zelllinien signifikant niedriger. Dieser Befund lässt auf eine effektive
Glucuronidierung von Ezetimib mittels UGT1A1 und einer hohen Affinität des gebildeten
Glucuronids zum MRP2-Transporter schließen. Eine Ausnahme bildete die OATP1B1-
UGT1A1 doppelttransfizierte Zelllinie, welche nach einer Inkubationszeit von 60 Minuten
einen Rückgang in der intrazellulären Akkumulation von freiem Ezetimib, nicht aber von
Ezetimibäquivalenten aufwies. Ob dies auf eine mögliche Akkumulation von Ezetimib-
Glucuronid zurückzuführen war, konnte nicht nachgewiesen werden, da die Menge an
Ezetimib-Glucuronid in den intrazellulären Kompartimenten mittels der angewandten
Methode nicht bestimmt werden konnte.
Insgesamt konnte im apikalen Kompartiment aller Zelllinien nur wenig freies Ezetimib
detektiert werden, was darauf hindeutet, dass Ezetimib selbst, wenn überhaupt, nur ein
schlechtes Substrat von MRP2 darstellt. Dabei wies die MDCKII-OATP1B1-UGT1A1-
MRP2 Tripeltransfektante signifikant geringere Mengen im Vergleich zu den übrigen
Zelllinien auf, was wiederum auf eine effektive Phase-II-Metabolisierung von Ezetimib
und einem nachfolgenden Transport des gebildeten Glucuronids in das apikale
Kompartiment dieser Zelllinie zurückzuführen ist. Sowohl bei der OATP1B1-UGT1A1
doppelttransfizierten Zelllinie als auch bei der OATP1B1-UGT1A1-MRP2
tripeltransfizierten Zelllinie konnte im apikalen Kompartiment Ezetimib-Glucuronid
detektiert werden. Allerdings war die Translokation von gebildetem Ezetimib-Glucuronid
in das apikale Kompartiment der tripeltransfizierten Zelllinie im Vergleich zur
doppelttransfizierten Zelllinie signifikant stärker ausgeprägt. Nach Normalisierung der
Menge an Ezetimib-Glucuronid im apikalen Kompartiment beider Zelllinien auf ihre
unterschiedliche Expression des Phase-II-Enzyms UGT1A1, blieb ein signifikanter
Unterschied in der Translokation des Glucuronids zwischen beiden Zelllinien bestehen.
Aufgrund dieser Ergebnisse konnte also geschlussfolgert werden, dass nicht die signifikant
höhere UGT1A1-Expression in der tripeltransfizierten Zelllinie für die stärkere
Diskussion 115
Translokation des Glucuronids in das apikale Kompartiment dieser Zelllinie verantwortlich
war, sondern die Überexpression des humanen MRP2-Transporters. Die vorhandene, aber
im Vergleich zur tripeltransfizierten Zelllinie geringere Translokation des Glucuronids in
das apikale Kompartiment der OATP1B1-UGT1A1 doppelttransfizierten Zelllinie lässt
sich durch die endogene Expression des Mrp2-Transporters in den MDCKII-Zellen
erklären [302, 307]. Es lässt sich also abschließend festhalten, dass nur das koordinierte
Zusammenspiel des Phase-II-Enzyms UGT1A1 und des Effluxtransporters MRP2 eine
effektive Elimination von Ezetimib vermitteln kann.
Eine Studie an acht gesunden, männlichen Probanden, welchen eine einmalige Dosis von
20 mg [14C]Ezetimib verabreicht wurde, zeigte, dass 78 % der verabreichten Menge mit
den Fäzes ausgeschieden werden [308]. Trotz des ausgeprägten Phase-II-Metabolismus
wurde aber vor allem freies Ezetimib (69 % der verabreichten Menge) in den Fäzes
wiedergefunden, weshalb davon ausgegangen wird, dass das in die Galle sekretierte
Ezetimib-Glucuronid im Darm wieder in das freie Ezetimib hydrolysiert und dann
ausgeschieden wird oder dass Ezetimib insgesamt nur schlecht resorbiert wird [308, 309].
Da der Arzneistoff in wässrigen Lösungen, welche zu Injektionen eingesetzt werden,
nämlich praktisch unlöslich ist, kann die absolute Bioverfügbarkeit des Arzneistoffs nicht
bestimmt werden [200]. Daher lässt sich auch kaum eine Aussage über die orale
Bioverfügbarkeit des Arzneistoffs treffen, da die absolute Bioverfügbarkeit als
Vergleichsgröße fehlt. Bezüglich der Glucuronidierung von Ezetimib konnte im Rahmen
der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass diese auch von dem Phase-II-Enzym UDP-
Glucuronosyltransferase 1A1 katalysiert wird. Dieses Ergebnis bestätigt Untersuchungen
von Ghosal et al., welche anhand von humanen, rekombinanten UGT-Mikrosomen die
Enzyme UGT1A1, UGT1A3 und UGT2B15 als die für die phenolische Glucuronidierung
von Ezetimib verantwortlichen Enzyme identifizieren konnten [203]. Im Gegensatz dazu
ließen Untersuchungen einer anderen Arbeitsgruppe an einem Mausmodell den Schluss
nahe, dass die Glucuronidierung von Ezetimib möglicherweise nicht überwiegend mittels
UGT1A1, sondern vielmehr mittels UGT2B-Enzymen katalysiert wird [310]. In vitro-
Studien von Oswald et al. ebenfalls an humanen, rekombinanten UGT-Mikrosomen zeigten
hingegen eine Beteiligung von UGT1A1 und UGT1A3 an der Glucuronidierung von
Ezetimib, nicht aber von UGT2B7 oder UGT2B15 [204]. Die Ergebnisse aus den
transzellulären Transportversuchen an UGT1A1-exprimierenden Zelllinien der
vorliegenden Arbeit bestätigen eine Beteiligung von UGT1A1 an der Glucuronidierung
von Ezetimib.
116 Diskussion
Zwei in vitro-Studien zur Inhibition des MRP2-vermittelten 17ß-Estradiol-Glucuronid
Transportes an MRP2-exprimierenden Membranvesikeln zeigten, dass Ezetimib-
Glucuronid diesen Transport inhibieren kann [205, 207]. Weiterhin legten zwei in vivo-
Studien an Ratten- bzw. Maus-Knockout-Tieren den Schluss nahe, dass Ezetimib-
Glucuronid ein Substrat des Effluxtransporters MRP2 sein könnte. Ein Rattenmodell,
welches keine Mrp2-Expression aufwies, zeigte nach 14-tägiger oraler Gabe von 5 mg/kg
Ezetimib einen 8,4-fach höheren Ezetimib-Glucuronid Plasmaspiegel im Vergleich zu
Wildtyp Ratten [206]. In der zweiten Studie wiesen Mrp2-defiziente Mäuse nach
duodenaler Applikation von Ezetimib eine signifikante Akkumulation von Ezetimib-
Glucuronid in der Leber und signifikant reduzierte Mengen an Ezetimib-Glucuronid in der
Galle im Vergleich zu Wildtyp Tieren auf [207]. Die beiden Studien an Tiermodellen
deuteten also bereits auf eine Beteiligung des Effluxtransporters MRP2 an der biliären
Sekretion von Ezetimib-Glucuronid hin. Mithilfe des im Rahmen dieser Arbeit generierten
tripeltransfizierten Zellmodells konnten diese Hinweise experimentell bestätigt werden.
Zwar konnte sowohl im apikalen Kompartiment der OATP1B1-UGT1A1
doppelttransfizierten MDCKII-Zelllinie als auch der OATP1B1-UGT1A1-MRP2
tripeltransfizierte MDCKII-Zelllinie nach basolateraler Zugabe von Ezetimib der Phase-II-
Metabolit Ezetimib-Glucuronid detektiert werden, allerdings wies die tripeltransfizierte
Zelllinie eine signifikant stärkere Akkumulation von Ezetimib-Glucuronid im apikalen
Kompartiment im Vergleich zu allen Kontrollzelllinien auf. Es scheint folglich ein
koordiniertes Zusammenspiel des Phase-II-Enzyms UGT1A1 und des Effluxtransporters
MRP2 für eine effektive Elimination von Ezetimib-Glucuronid aus der Zelle entscheidend
zu sein. Die Ergebnisse aus den Studien von de Waart et al. deuten zudem darauf hin, dass
auch andere Effluxtransporter in der Maus wie die Transporter Bcrp (rodent Breast cancer
resistance protein) und Mrp3 (rodent Multidrug resistance protein 3) einen Einfluss auf die
Konzentration von Ezetimib-Glucuronid im Darm, im Pfortaderblut und/oder in der Galle
haben können [207]. Um zu zeigen, dass auch deren humane Orthologe in der Lage sind
Ezetimib-Glucuronid zu transportieren, sind weitere Studien nötig.
Anhand von in vitro-Studien an humanen, rekombinanten UGT-Mikrosomen und von in
vitro-Studien an MRP2-überexprimierenden Zelllinien konnte bereits eine Beteiligung des
Phase-II-Enzyms UGT1A1 und des Effluxtransporters MRP2 an der Elimination von
Etoposid gezeigt werden. Die Elimination von Etoposid-Glucuroniden erfolgt sowohl über
den Urin als auch über die Fäzes [311]. Hierfür ist die Aufnahme von Etoposid in die Leber
Diskussion 117
und eine biliäre Sekretion der Glucuronide in die Galle notwendig. Beide
Transportvorgänge konnten bislang nicht ausreichend aufgeklärt werden. Im Rahmen der
vorliegenden Arbeit ist es anhand von Aufnahmeversuchen an HEK293-Zelllinien, welche
die drei hepatischen OATP-Aufnahmetransporter überexprimieren, gelungen, Etoposid als
Substrat für die Transporter OATP1B1 und OATP2B1 zu identifizieren. Für den dritten
hepatischen Aufnahmetransporter OATP1B3 dürfte Etoposid, wenn, nur ein sehr schlechtes
Substrat darstellen. Über die Durchführung mehrerer Aufnahmeversuche an HEK293-
OATP1B1 Zellen mit unterschiedlichen Substratkonzentrationen konnte eine Michaelis-
Menten-Konstante (Km-Wert) von 42,2 µM und eine maximale Transportgeschwindigkeit
(Vmax) von 25,8 pmol*mg Protein-1*min-1 ermittelt werden. Die klinische Relevanz dieses
Ergebnisses sowie ein möglicher Einfluss von Polymorphismen im SLCO1B1-Gen, welche
beispielsweise einen entscheidenden Einfluss auf die Pharmakokinetik von HMG-CoA-
Reduktaseinhibitoren ausüben [53], auf die Pharmakokinetik von Etoposid muss in Zukunft
noch geklärt werden. Neben einer intravenösen Applikation ist für Etoposid auch eine orale
Arzneiform verfügbar, sodass nach oraler Einnahme eine entsprechend hohe Menge des
Arzneistoffs über das Pfortaderblut an die Hepatozyten und somit an die hepatischen
OATPs herantransportiert wird. Im Gegensatz zu den Aufnahmeversuchen an HEK293-
Zellen konnte in den transzellulären Transportversuchen an MDCKII-Monolayern keine
signifikante intrazelluläre Akkumulation von Etoposid in MDCKII-OATP1B1-Zellen im
Vergleich zu den Vektorkontrollzellen festgestellt werden. Ein Grund für dieses Phänomen
könnte ein Transport von Etoposid zurück in das basolaterale Kompartiment durch endogen
in den MDCKII-Zellen exprimierte Transporter wie beispielsweise Mrp3 sein [133, 213].
In vivo und in vitro unterliegt Etoposid einem ausgeprägten Phase-II-Metabolismus. In
vitro werden dabei ein phenolisches und zwei alkoholische Glucuronide gebildet, wobei die
prädominante Form das Phenolische darstellt [312]. Zwei in vitro-Studien an 9 bzw. 12
humanen, rekombinanten UGT-Isoformen zeigten sehr deutlich, dass das Phase-II-Enzym
UGT1A1 die Glucuronidierung von Etoposid katalysiert [210, 312]. Die Glucuronidierung
von Etoposid mittels UGT1A1 verläuft zudem sehr spezifisch, sodass Etoposid als hoch
selektives Modellsubstrat für in vitro-Untersuchungen an UGT1A1 vorgeschlagen wurde
[312]. Die Daten aus den transzellulären Transportversuchen mit der basolateralen Zugabe
von [3H]Etoposid zu den Monolayern der OATP1B1-UGT1A1-MRP2 tripeltransfizierten
Zelllinie und den Kontrollzelllinien legen den Schluss nahe, dass Etoposid und
möglicherweise ebenso ein intrazellulär gebildetes Glucuronid Substrate des
Effluxtransporters MRP2 sind. Die Akkumulation von Etoposidäquivalenten (Etoposid und
118 Diskussion
mögliche Glucuronide) nach 120 Minuten im apikalen Kompartiment von Monolayern der
tripeltransfizierten Zelllinie war im Vergleich zur Vektorkontrollzelllinie um 115 % höher.
Interessanterweise führte allerdings auch die alleinige Expression der beiden Transporter
ohne das Phase-II-Enzym UGT1A1 in den MDCKII-OATP1B1-MRP2 Zellen zu einer
vergleichbaren Akkumulation von Etoposidäquivalenten im apikalen Kompartiment im
Vergleich zur Vektorkontrollzelllinie (+ 137 %). Eine mögliche Erklärung hierfür könnte
sein, dass Etoposid und das gebildete Glucuronid ein kompetitives Verhalten am MRP2-
Transporter aufweisen, was zu den ähnlichen Transportraten der MDCKII-OATP1B1-
MRP2 doppelttransfizierten Zelllinie und der tripeltransfizierten Zelllinie führen würde.
Zudem könnte ein möglicherweise gebildetes Glucuronid ebenfalls ein Substrat für einen
endogen an der basolateralen Membran der MDCKII-Zellen exprimierten Effluxtransporter
(z.B. Mrp3) darstellen, sodass ein intrazellulär gebildetes Glucuronid über diesen
Mechanismus auch in das basolaterale Kompartiment transportiert werden könnte [133,
213]. Zur Klärung dieser Fragen müssten in weiterführenden Studien die Mengen an
Etoposid und Etoposid-Glucuronid im basolateralen und apikalen Kompartiment der
verschiedenen Zelllinien sowie die intrazellulären Konzentrationen beider Verbindungen
bestimmt werden. Hierfür könnten analog zu den Versuchen mit Ezetimib transzelluläre
Transportversuche mit nicht radioaktiv markierten Etoposid durchgeführt werden und die
Konzentrationen an Etoposid und Phase-II-Metabolit mittels einer LC-MS/MS-Methode
bestimmt werden. Die Ergebnisse aus den transzellulären Transportversuchen mit
tritiummarkierten Etoposid, welche im Rahmen der vorliegenden Arbeit generiert wurden,
bestätigen die Daten aus in vitro-Versuchen an MRP2-überexprimierenden Zelllinien sowie
MRP2-exprimierenden Membranvesikeln. Diese deuteten bereits auf eine Beteiligung von
MRP2 am Transport von Etoposid hin [153, 211, 212]. Zwar wird der Effluxtransporter
MRP2 vor allem als Transporter für Glutathion- und Glucuronid-Konjugate beschrieben,
allerdings konnte bereits eine MRP2-vermittelte Resistenz gegenüber den
Chemotherapeutika Vincristin, Vinblastin und Etoposid in Abhängigkeit von Glutathion
gezeigt werden [153, 162, 313]. Des Weiteren ist für die beiden Effluxtransporter MRP1
und MRP4 bereits ein Cotransport von Arzneistoffen bzw. endogenen Stoffen mit
Glutathion beschrieben worden, was auf einen weiteren übergreifenden
Transportmechanismus der MRP-Transporterfamilie hinweist [163-166]. Daher ist der
Transport von unkonjugiertem Etoposid im Rahmen dieser Arbeit am wahrscheinlichsten
auf einen Cotransport mit Glutathion zurückzuführen [314].
Diskussion 119
Zudem weist eine Studie von Lagas et al. an Transporter-Knockout-Mäusen darauf hin,
dass in der Maus die Transporter Mrp2, Mrp3 und P-Glykoprotein an der Verteilung von
Etoposid und Etoposid-Glucuronid beteiligt sind [214]. Ob auch die humanen Orthologe an
der Verteilung und Elimination beider Verbindungen beteiligt sind, muss in
weiterführenden Studien untersucht werden.
7.2. Identifizierung von Bosentan und dessen Metaboliten als Substrate von MRP2 mittels einer OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1-MRP2 quadrupeltransfizierten MDCKII-Zelllinie
Anhand von in vitro-Studien konnte bereits gezeigt werden, dass Bosentan und sein aktiver
Phase-I-Metabolit Ro 48-5033 [(4-(2-hydroxy-1,1-dimethyl-ethyl)-N-[6-(2-hydroxy-
ethoxy)-5-(2-methoxy-phenoxy)-[2,2`]bipyrimidinyl-4-yl]-benzensulfonamid)] Substrate
der hepatischen Aufnahmetransporter OATP1B1 und OATP1B3 sind [218]. Des Weiteren
ist für Bosentan bereits bekannt, dass dieser Arzneistoff mittels der Cytochrom-P450-
Enzyme 3A4 und 2C9 zu drei Phase-I-Metaboliten biotransformiert wird [217-220]. Die
Elimination von Bosentan-Metaboliten und möglicherweise von Bosentan selbst erfolgt zu
mehr als 90 % über die Galle, sodass weniger als 3 % einer oral verabreichten Dosis im
Urin wiederzufinden sind [215, 221, 222]. Eine Glucuronidierung von Bosentan und dessen
Phase-I-Metaboliten in humanen Hepatozyten konnte bereits in einem Kongressbeitrag
gezeigt werden, offen blieb allerdings bislang die Frage nach der umsetzenden UGT-
Isoform als auch nach der Beteiligung eines Transporters an der biliären Elimination von
Bosentan und dessen Metaboliten [221, 223, 224, 303, 304].
Aufgrund von Interaktionen zwischen Bosentan und anderen gleichzeitig verabreichten
Arzneistoffen wie beispielsweise Ciclosporin A, Rifampicin oder Sildenafil, welche nicht
durch eine Veränderung der Funktionalität der metabolisierenden Cytochrom-P450-Enzyme
erklärt werden konnten, untersuchten Treiber et al., ob die hepatische Aufnahme von
Bosentan transportervermittelt stattfindet und ob an Transportern Interaktionen mit den
genannten Arzneistoffen auftreten. Anhand von Aufnahmeversuchen mit [14C]Bosentan
und dem radioaktiv markiertem Phase-I-Metaboliten Ro 48-5033 an OATP1B1-
exprimierenden CHO-Zellen (Chinese Hamster Ovary), konnten Treiber et al. beide
Verbindungen als Substrate des hepatischen Aufnahmetransporters OATP1B1 mit
Km-Werten von 44 µM (für Bosentan) und 60 µM (für Ro 48-5033) identifizieren.
120 Diskussion
Weiterhin konnten die Arzneistoffe Ciclosporin A, Rifampicin und Sildenafil als
Inhibitoren für die OATP1B1-vermittelte Aufnahme von Bosentan identifiziert werden
[218]. Interessanterweise konnte in der vorliegenden Arbeit keine signifikant stärkere
intrazelluläre Akkumulation von [14C]Bosentan in Transportversuchen an den MDCKII-
OATP1B1 einzeltransfizierten Zellen im Vergleich zu den Vektorkontrollzellen gezeigt
werden. Eine mögliche Ursache hierfür könnten die unterschiedlichen
Versuchsbedingungen sein. Während bei den Aufnahmeversuchen an CHO-Zellen
Inkubationszeiten von drei bis maximal fünf Minuten gewählt wurden, wurden die
Monolayer bei der vorliegenden Arbeit für insgesamt 180 Minuten inkubiert.
Möglicherweise kann zu diesem Zeitpunkt keine signifikante Aufnahme mehr in
OATP1B1-exprimierende Zellen im Vergleich zu untransfizierten Zellen gezeigt werden,
da andere Prozesse als OATP1B1-vermittelte bei längeren Inkubationen an Bedeutung
zunehmen.
Bosentan wird nach der Aufnahme in den Hepatozyten mittels der Cytochrom-P450-Enzyme
3A4 und 2C9 zu einem Phenol-Metaboliten (Ro 47-8634), einem aktiven Hydroxy-
Metaboliten (Ro 48-5033) und einem sekundären Hydroxyphenol-Metaboliten (Ro 64-
1056) biotransformiert [217-220]. Die Daten aus der Kooperation mit der Firma Actelion
Pharmaceuticals Ltd zeigen, dass in den Zelllinien, welche das Phase-I-Enzym CYP3A4
exprimieren, auch im geringen Umfang die Phase-I-Metaboliten Ro 48-5033 und Ro 47-
8634 intrazellulär nachweisbar sind. Den Hauptanteil der intrazellulär akkumulierten
Radioaktivität macht allerdings in allen Zelllinien der Arzneistoff Bosentan selbst aus. Eine
Erklärung hierfür wäre, dass Bosentan für das Cytochrom-P450-Enzym 3A4 ein sehr viel
schlechteres Substrat darstellt als das Modellsubstrat Midazolam, unter dessen
Verwendung die Funktionalität des Enzyms in den exprimierenden Zelllinien untersucht
wurde. In einem Kongressbeitrag von Shen et al. wurden die Km-Werte für die
Metabolisierung von Bosentan zu den beiden Phase-I-Metaboliten Ro 48-5033 und Ro 47-
8634 in humanen Lebermikrosomen mit 65 µM (Ro 48-5033) und 73 µM (Ro 47-8634)
publiziert [224]. Im Gegensatz dazu liegt der Km-Wert für die Metabolisierung von
Midazolam zum 1`-Hydroxymidazolam für humane Lebermikrosomen bei 3,9 µM und für
rekombinantes CYP3A4 sogar nur bei 0,8 µM [315]. Zu überprüfen wäre in
weiterführenden Experimenten, ob veränderte Versuchsbedingungen, wie eine Erhöhung
der Substratkonzentration oder eine Verlängerung der Inkubationszeit, zu einer verstärkten
Metabolisierung von Bosentan führen würde.
Diskussion 121
Eine direkte Glucuronidierung von Bosentan und dessen Phase-I-Metaboliten in humanen
Hepatozyten wurde bereits in einem Kongressbeitrag gezeigt [224]. Allerdings wurden die
gebildeten Glucuronide strukturell nicht genau beschrieben und eine umfassende
Publikation der Daten existiert nicht [224]. Die umsetzende UGT-Isoform wurde noch
nicht identifiziert. Es ist weiterhin zu erwähnen, dass entsprechende Phase-II-Metaboliten
während der Entwicklungphase des Arzneistoffs im Menschen bislang nicht nachgewiesen
werden konnten. Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit sollten dazu dienen,
mögliche Phase-II-Konjugate von Bosentan und dessen Phase-I-Metaboliten, deren
Bildung UGT1A1-vermittelt stattfindet, zu identifizieren. UGT1A1 ist die innerhalb der
UGT1-Familie in der Leber am stärksten exprimierte Isoform und für die Glucuronidierung
einer großen Anzahl von endogenen Verbindungen sowie Xenobiotika verantwortlich [67,
82]. Insofern erscheint auch eine entsprechende Verstoffwechslung von Bosentan über
dieses Enzym denkbar. Tatsächlich konnte ein entsprechender Phase-II-Metabolit in den
intrazellulären Kompartimenten der UGT1A1-exprimierenden MDCKII-Zelllinien im
Rahmen der Kooperation mit der Firma Actelion Pharmaceuticals Ltd und somit ein neuer
Stoffwechselweg nachgewiesen werden. Dabei handelte es sich um Bosentan-Glucuronid.
Glucuronid-Konjugate der Phase-I-Metaboliten konnten allerdings nicht detektiert werden,
möglicherweise aufgrund der geringen Bildung von Phase-I-Metaboliten in den
untersuchten Zellsystemen. Abbildung 29 liefert eine Übersicht aller bisher identifizierten
Stoffwechselwege von Bosentan.
Abbildung 29: Übersicht über alle bisher identifizierten Stoffwechselwege von Bosentan (inklusive des in dieser Arbeit erstmals charakterisierten Abbauweges von Bosentan mittels direkter Glucuronidierung durch UGT1A1).
122 Diskussion
Verschiedene Studien untersuchten bereits die biliäre Sekretion von Bosentan. Bislang
konnte allerdings der Mechanismus, über welchen Bosentan und seine Metaboliten in die
Galle gelangen, nicht identifiziert werden. In vitro-Untersuchungen an primären humanen
Hepatozyten ließen eine Inhibition des BSEP-vermittelten Transportes von Taurocholat bei
gleichzeitiger Inkubation mit Bosentan und eine Verminderung der biliären Sekretion von
Bosentan bei gleichzeitiger Inkubation mit Erythromycin, einem Inhibitor von
P-Glykoprotein, erkennen [223]. Auch Fattinger et al. konnten einen inhibitorischen Effekt
von Bosentan auf den Transport von Taurocholat an Bsep-exprimierenden Sf9-Zellvesikeln
zeigen [303]. Dennoch konnte Bosentan für keinen der beiden Effluxtransporter als
Substrat identifiziert werden [223]. Eine Studie an MDR1- (P-Glykoprotein) Knockout-
Mäusen schloss zudem einen P-Glykoprotein-vermittelten Transport von Bosentan aus
[221]. Ob der MRP2-vermittelte Transport durch Bosentan beeinflusst wird oder ob
Bosentan und eventuell dessen Metaboliten mittels MRP2 transportiert werden, konnte
bislang ebenfalls nicht ausreichend geklärt werden. In vitro-Studien an primären humanen
Hepatozyten zeigten, dass die biliäre Elimination von DPDPE ([2-D-Penicillamin, 5-D-
penicillamin]enkephalin) bei gleichzeitiger Inkubation mit Bosentan nur in den
Hepatozyten eines von drei Spendern verringert war [223]. Zudem ergaben Inkubationen
von primären humanen Hepatozyten mit Bosentan und Probenecid, einem Inhibitor für
MRP2, eine verminderte Aufnahme und eine verstärkte Elimination von Bosentan [223].
Eine Studie hingegen, welche an normalen und Mrp2-defizienten TR¯-Ratten durchgeführt
wurde, führte bei Gabe von Bosentan bei normalen Ratten zu einem Mrp2-vermittelten
choleretischen Effekt, welcher bei TR¯-Ratten auf ein nicht signifikantes Niveau abfiel
[304]. Insgesamt gesehen sind also die Daten zur Beteiligung eines Effluxtransporters an
der biliären Elimination von Bosentan nicht eindeutig. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit
konnte anhand von transzellulären Transportversuchen mit [14C]Bosentan gezeigt werden,
dass alle Zelllinien mit einer MRP2-Expression signifikant weniger Radioaktivität
intrazellulär akkumulieren, als Zelllinien ohne diesen Transporter. Die größte intrazelluläre
Akkumulation von Radioaktivität wies dabei die OATP1B1-CYP3A4-UGT1A1
tripeltransfizierte MDCKII-Zelllinie auf, was jedoch auf geringere Proteinwerte dieser
Zelllinie in den durchgeführten Experimenten zurückzuführen sein dürfte. Der niedrigen
intrazellulär gemessenen Radioaktivität zur Folge zeigten Zelllinien mit MRP2-Expression
eine signifikant höhere Akkumulation von Bosentanäquivalenten (Bosentan und mögliche
Metaboliten) im apikalen Kompartiment, sodass man schlussfolgern kann, dass die
Bosentanäquivalente MRP2-vermittelt in das apikale Kompartiment transportiert wurden.
Diskussion 123
Signifikante Unterschiede in der Translokation von Bosentanäquivalenten konnten
zwischen der OATP1B1-MRP2 doppelttransfizierten MDCKII-Zelllinie und den beiden
Tripeltransfektanten MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2 und MDCKII-OATP1B1-
UGT1A1-MRP2 nach 60 Minuten detektiert werden. Dieser Unterschied blieb zwischen
der Doppeltransfektante und der OATP1B1-CYP3A4-MRP2 tripeltransfizierten MDCKII-
Zelllinie über die betrachtete Zeit hinweg signifikant. Eine mögliche Erklärung hierfür ist,
dass neben Bosentan in den OATP1B1-CYP3A4-MRP2 und OATP1B1-UGT1A1-MRP2
tripeltransfizierten und auch in der quadrupeltransfizierten MDCKII-Zelllinie auch
mögliche gebildete Metaboliten mittels MRP2 in das apikale Kompartiment transportiert
werden. Die Daten aus der Kooperation mit Actelion lassen allerdings darauf schließen,
dass vor allem Bosentan MRP2-vermittelt in das apikale Kompartiment transportiert wird,
wohingegen das gebildete Bosentan-Glucuronid in apikalen Proben der UGT1A1-MRP2-
exprimierenden Zelllinien nur in geringem Umfang nachweisbar war. Dies könnte daran
liegen, dass für eine effektive Translokation von Bosentan-Metaboliten die intrazelluläre
Biotransformation von Bosentan nur unzureichend vonstattenging. Eine weitere Erklärung
für die signifikanten Unterschiede zwischen der doppelttransfizierten Zelllinie und den
beiden Tripeltransfektanten mit MRP2-Expression wäre, dass die doppelttransfizierte
Zelllinie die geringste MRP2-Expression aufwies und daher eine geringere
Transportaktivität zeigte. Allerdings unterschied sich die doppelttransfizierte Zelllinie in
ihrer MRP2-Expression nicht signifikant von der MDCKII-OATP1B1-CYP3A4-MRP2
tripeltransfizierten MDCKII-Zelllinie, welche die höchste Translokation von
Bosentanäquivalenten aufwies. Es lässt sich dennoch festhalten, dass es im Rahmen der
vorliegenden Arbeit erstmals gelungen ist, Bosentan in vitro als Substrat des
Effluxtransporters MRP2 zu identifizieren. Der Transport von Bosentan mittels MRP2 ist
wie für Etoposid bereits diskutiert (siehe Punkt 7.1) am wahrscheinlichsten wiederum auf
einen Cotransport des Substrates mit Glutathion zurückzuführen [163-166, 314]. Für diese
Erklärung sprechen auch die Ergebnisse einer Studie mit normalen und Mrp2-defizienten
TR¯ Ratten. Bei Ratten mit normaler Mrp2-Funktion führte Bosentan zu einem
ausgeprägten choleretischen Effekt, welcher in Mrp2-defizienten Ratten nur ein nicht
signifikantes Niveau erreichte. Diese Befunde führten zu dem Schluss, dass Bosentan über
Mrp2-vermittelte Mechanismen die Gallenbildung modulieren kann. Des Weiteren erhöhte
die Gabe von Bosentan bei normalen Ratten die Konzentration von Glutathion und dessen
Transport in die Galle [304], was ebenfalls für einen Cotransport von Bosentan mit
Glutathion über MRP2 sprechen würde.
124 Diskussion
Weiterhin konnte ein Phase-II-Metabolit des Arzneistoffs (Bosentan-Glucuronid) in den
intrazellulären Kompartimenten der UGT1A1-exprimierenden MDCKII-Zelllinien als auch
in den apikalen Kompartimenten der UGT1A1-MRP2-exprimierenden Zelllinien mittels
einer LC-MS-Methode strukturell identifiziert werden. Eine entsprechende
Glucuronidierung von Phase-I-Metaboliten konnte allerdings im Rahmen dieser Arbeit
nicht nachgewiesen werden. Ob durch veränderte Versuchsbedingungen Phase-I- und evtl.
auch Phase-II-Metaboliten in einem verstärkten Umfang gebildet werden, oder ob eine
Konjugation von Phase-I-Metaboliten von Bosentan vor allem durch eine andere UGT-
Isoform vermittelt wird, soll in weiterführenden Studien untersucht werden. Anhand dieser
soll auch der Frage nachgegangen werden, ob bei einer verstärkten Bildung von Bosentan-
Metaboliten diese auch in einem stärkeren Maße MRP2-vermittelt aus der Zelle
heraustransportiert werden oder ob eventuell auch andere Effluxtransporter an der
Elimination von Bosentan-Metaboliten beteiligt sind.
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die im Rahmen der vorliegenden Arbeit
etablierten Zelllinien mit der parallelen Expression von Aufnahme- und Effluxtransportern
sowie von metabolisierenden Enzymen neben anderen in vitro-Modellen, Tiermodellen und
klinischen Studien zu einem besseren Verständnis der hepatischen Verteilung und
Elimination von häufig eingesetzten Arzneistoffen beitragen können.
Literaturverzeichnis 125
Literaturverzeichnis 1. Mutschler, E., G. Geisslinger, H.K. Kroemer, und M. Schäfer-Korting, Mutschler
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Veröffentlichungen 157
Veröffentlichungen Originalarbeiten
Fahrmayr, C., J. König, D. Auge, M. Mieth, and M.F. Fromm, Identification of drugs and
drug metabolites as substrates of MRP2 using triple-transfected MDCK-OATP1B1-
UGT1A1-MRP2 cells. Br J Pharmacol, 2012. 165(6): p. 1836-47.
Impactfaktor 2010: 4,925
Mandery, K., H. Sticht, K. Bujok, I. Schmidt, C. Fahrmayr, B. Balk, M.F. Fromm, and H.
Glaeser, Functional and structural relevance of conserved positively charged lysine
residues in organic anion transporting polypeptide 1B3. Mol Pharmacol, 2011. 80(3): p.
400-6.
Impactfaktor 2010: 4,725
Übersichtsarbeit
Fahrmayr, C., M.F. Fromm, and J. König, Hepatic OATP and OCT uptake transporters:
their role for drug-drug interactions and pharmacogenetic aspects. Drug Metab Rev, 2010.
42(3 SI): p. 380-401.
Impactfaktor 2010: 6,263
Kongressbeiträge
Fahrmayr, C., J. König, and M.F. Fromm, Generation of an OATP1B1-UGT1A1-MRP2
triple-transfected MDCK cell line: Identification of Ezetimibe glucuronide as substrate of
MRP2. Basic Clin Pharmacol Toxicol, 2011. 109 SI (Suppl. 1): p. 62
10th EACPT Congress, Budapest
Fahrmayr, C., J. König, and M.F. Fromm, Identification of ezetimibe glucuronide as
substrate of MRP2 using an OATP1B1-UGT1A1-MRP2 triple-transfected MDCKII cell
line. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 2011. 383 (Suppl. 1): p. 79
77. Jahrestagung der DGPT, Frankfurt
158 Veröffentlichungen
Fahrmayr, C., J. König, M.F. Fromm, and H. Glaeser, The role of lysine residue 361 for
OATP1B3-mediated BSP and pravastatin transport. 2010.
8th EACPT Summer School 2010, Dresden
Fahrmayr, C., M.F. Fromm, and J. König, The influence of frequent genetic variations on
the transport activity of OATP1B1. Br J Clin Pharmacol, 2009. 68: p. 30.
11. Jahreskongress für Klinische Pharmakologie 2009, Heidelberg
Fahrmayr, C., J. König, M.F. Fromm, and H. Glaeser, The role of lysine 361 and lysine
399 for the transport activity of OATP1B3. Basic Clin Pharmacol Toxicol, 2009. 104(6): p.
522.
10. Jahreskongress für Klinische Pharmakologie 2008, Berlin
Vorträge
The role of lysine 361 and lysine 399 for the transport activity of OATP1B3.
10. Jahreskongress für Klinische Pharmakologie 2008, Berlin
Stipendien
Reisestipendium zur 8th EACPT Summer School 2010 nach Dresden für den Beitrag: The
role of lysine residue 361 for OATP1B3-mediated BSP and pravastatin transport.
Koautoren: J. König, M. F. Fromm und H. Glaeser
Reisestipendium zum 10th EACPT Congress nach Budapest für den Beitrag: Generation of
an OATP1B1-UGT1A1-MRP2 triple-transfected MDCK cell line: Identification of
Ezetimibe glucuronide as substrate of MRP2.
Koautoren: J.König und M.F. Fromm
Danksagung 159
Danksagung
Im Folgenden möchte ich mich bei all jenen ganz herzlich bedanken, ohne deren
Unterstützung und Hilfe diese Arbeit wahrscheinlich nicht zustande gekommen wäre.
Besonders danken möchte ich Herrn Professor Dr. med. Martin F. Fromm für die
Übertragung des interessanten Promotionsthemas, die exzellente Betreuung und die
Begutachtung meiner Arbeit. Ich möchte mich auch für sein Interesse am Fortschritt meiner
Arbeit sowie für die Möglichkeit bedanken an zahlreichen, interessanten nationalen und
internationalen Kongressen teilnehmen zu können.
Mein großer Dank gilt weiterhin meinem Betreuer Herrn PD Dr. rer. nat. Jörg König für
seine Diskussionsbereitschaft, seine zahlreichen Anregungen, seiner konstruktiven Kritik
und Zuversicht.
Ich danke Frau Professor Dr. Kristina Leuner für die Begutachtung meiner Arbeit und
Herrn Professor Dr. Geoffrey Lee und Herrn Professor Dr. Markus Heinrich für die
Abnahme der mündlichen Prüfung.
Mein Dank gilt außerdem Herrn Dr. Alexander Treiber der Abteilung Preclinical
Pharmacokinetics and Metabolism des Kooperationspartners Actelion Pharmaceuticals Ltd
für die Kooperation im Quadrupeltransfektanten-Projekt, der Unterstützung bei der
Erstellung des Manuskriptes sowie für seine Diskussionsfreude und dem freundlichen E-
Mail-Verkehr. Für das Vermessen meiner Proben bedanke ich mich ganz besonders auch
bei allen beteiligten Mitarbeitern des Kooperationspartners.
Auch möchte ich Herrn Professor Dr. Dietrich Keppler von der Abteilung für
Tumorbiochemie am DKFZ Heidelberg für die Bereitstellung des Antikörpers EAG5 sowie
der Zelllinien MDCKII-VK G418, MDCKII-OATP1B1 G418 und MDCKII-OATP1B1-
MRP2 danken.
Herzlich danken möchte ich Herrn PD Dr. rer. nat. Hartmut Gläser für seine stete
Diskussionsfreude, seinem Engagement und seiner geduldigen Unterstützung bei allen
160 Danksagung
theoretischen und praktischen Anliegen und für die hervorragende Einarbeitung in die
Methoden der Molekularbiologie und Proteinchemie während meines pharmazeutischen
Praktikums. Ebenso geht mein Dank an Dr. med. Fabian Müller für seine
Diskussionsfreude und seinem Interesse an meiner Arbeit.
Bei allen derzeitigen und ehemaligen Kollegen und Kolleginnen des Instituts für
Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie bedanke ich mich für die
gute Zusammenarbeit und das herzliche Arbeitsklima.
Mein besonderer Dank geht dabei an Frau Claudia Hoffmann, Frau Katrin Singer und Frau
Ingrid Schmidt für ihre Unterstützung bei meiner Laborarbeit.
Für die Durchführung der Analytik bedanke ich mich herzlich bei Frau Dr. rer. nat. Maren
Mieth, Herrn Daniel Auge und Frau Evi Hoier.
Ebenso möchte ich mich bei meinen ehemaligen und derzeitigen Mitdoktorandinnen und
Mitdoktoranden Frau Dr. rer. nat. Kathrin Mandery, Herrn Dr. rer. nat. Jürgen Kindla,
Herrn Apotheker Joachim Strobel, Frau Dipl. hum. biol. Sabine Klatt, Frau Dipl. biol. Anja
Kittel und Frau Dipl. biol. Kristina Münch für ihre Unterstützung und die schöne
gemeinsame Zeit bedanken. Ich wünsche ihnen alles Gute und viel Erfolg für ihre weitere
Arbeit!
Der DOKTOR ROBERT PFLEGER-STIFTUNG Bamberg und der Deutschen
Forschungsgemeinschaft (Fr 1298/5-1) danke ich für die Finanzierung dieser Arbeit.
Nicht zuletzt sei meiner Familie und Achim für ihre liebevolle Unterstützung gerade auch
in schwierigen Situationen und ihrem stetem Glauben an mich ganz herzlich gedankt. Mein
Studium und diese Arbeit ist zum großen Teil euer Verdienst!
