Arch Otorhinolaryngol (1982) 234:45-51 Archives of Oto-Rhino-Laryngology �9 Springer-Verlag 1982

Mikroflammenphotometrische Natrium-, Kaliumbestimmung zur Reinheitskontrolle von Innenohrfliissigkeiten*

W. Giebel t u n d F. Scheibe 2

1 Universitfits-HNO-Klinik (Direktor: Prof. Dr. D. Plester), Silcherstrage 5, D-7400 Ttibingen, Bundesrepublik Deutschland 2 HNO-Klinik (Direktor: Prof. Dr. H.-J. Gerhardt) des Bereiches Medizin (Charit6) der Humboldt-Universit fit, Schumannstral3e 20-21, DDR-1040 Berlin, Deutsche Demokratische Republik

Microflame-photometric Estimation of Sodium and Potassium for Testing the Purity of Inner Ear Fluids

Summary. A simple micromodification of simultaneous flame-photometric estimation of sodium and potassium concentration in sample volumes of 0.1 ~1 is described for testing the purity of inner ear fluids, especially of perilymph. The precision of the method is about 10% (calibration standards, Table 2) and depends mainly on the precision of measuring the small sample volumes. The method has been used for examining cerebrospinal fluid, perilymph, and endolymph samples of guinea pigs. The increased perilym- phatic potassium (Fig. la) and endolymphatic sodium values suggest a more or less substantial contamination of the tested samples and unterline the necessity of checking the purity of inner ear fluid samples which are used in biochemical analysis.

Key words: Microflame photometry - Sodium - Potassium - Purity testing - Perilymph - Endolymph - Cerebrospinal fluid - Guinea pig

Zusammenfassung. Ffir die Reinheitskontrolle von Innenohrfltissigkeiten, insbesondere der Perilymphe, wird eine einfache Mikromodifikation der simultanen flammenphotometrischen Natrium- und Kaliumbestimmung in Probenvolumina von 0,1 gl beschrieben. Die Genauigkeit der Methode betrfigt fund 10% (Eichstandards, Tabelle 2) und hfingt im wesentlichen von der Genauigkeit der Probendosierung ab. Die Methode wurde zur Kontrolle von Liquor-, Perilymph- und Endolymphproben des Meerschweinchens angewendet. Die erh6hten perilymphatischen Kalium- (Abb. la) und endolymphatischen Natriumwerte weisen auf eine mehr oder weniger starke

* Mit Unterst•tzung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (Gi 59/4) und der Breuninger Stiftung GmbH, Stuttgart

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Verunreinigung der untersuchten Proben hin und unterstreichen die Notwendigkeit einer solchen Reinheitskontrolle bei der biochemischen Analyse der Innenohrfltissigkeiten.

Sehliisselwiirter: Mikroflammenphotometrie - Natrium - Kalium - ReinheitskontroUe - Perilymphe - Endolymphe - Liquor cerebrospinalis - Meerschweinchen

Das Hauptproblem bei der biochemischen Analyse von Innenohrflfissigkeiten stellen heute weniger die geringen Probenmengen dar, da es ffir viele Substanzen inzwischen ausreichend empfindliche Mikromethoden gibt (Lowry und Passoneau 1972; Neuhoff 1973; Thalmann 1976), sondern vielmehr die bei der Entnahme auftretenden Verunreinigungen mit Blut/Plasma, Liquor cere- brospinalis (CSF), Intrazetlularfltissigkeit und Endolymphe (EL) bzw. Peri- lymphe (PL), durch die das analytische Ergebnis wesentlich verffilscht sein kann (Scheibe et al. 1977). Die Daten, die in der Literatur ffir dieselben Bestandteile angegeben sind, unterscheiden sich teilweise erheblich und machen eine Reinheitskontrolle der Proben notwendig. Voraussetzung daffir sind geeignete Kontrollparameter, die in minimalen Probenmengen einfach zu bestimmen sind.

Verunreinigungen mit Blut lassen sich fiber den Gehalt an Erythrozyten oder Hfimoglobin ermitteln (Schindler und Schnieder 1966; Scheibe et al. 1972; Kleinschmidt und Vick 1976, Silverstein 1976 u. a.). Eine st/irkere CSF-Bei- mengung in der PL zeigt sich an einer erniedrigten Proteinkonzentration (Scheibe et al. 1975; Kleinschmidt und Vick 1976). Eine Verunreinigung der PL mit Intrazellularflfissigkeit und/oder EL ist an einer erh6hten Kaliumkonzen- tration zu erkennen (Schnieder 1964; Schindler und Schnieder 1966). PL-Bei- mengungen in der EL ffihren zu erh6hten Natriumwerten (Johnstone et al. 1963; Bosher und Warren 1968).

Natrium (NA) und Kalium (K) wurden in den Innenohrflfissigkeiten hauptsfichlich flammenphotometrisch, -spektrophotometrisch oder mit ionen- sensitiven Mikroelektroden betimmt. Literaturfibersichten der analytischen Daten finden sich bei Makimoto und Silverstein (1974); Rauch und Rauch (1974); Silverstein (1976); Silverstein und Takeda (1977); Peterson et al. (1978) und Arnold und Vosteen (1979).

Moderne Flammenphotometer erm6glichen die simultane Bestimmung yon Na und K in 0,5-1 ]xl Probenvolumen (Silverstein und Schuknecht 1966; Silverstein und Griffin 1970; Silverstein 1976). In der vorliegenden Arbeit wird eine Mikromodifikation zur Reinheitskontrolle von Innenohrflfissigkeiten beschrieben, bei der unter Verwendung t/iglicher Na-, K-Eichkurven ein Probenvolumen yon --- 0,1 ~tl ausreichend ist. Die Anwendung dieser Methode weist auf die Notwendigkeit einer solchen Kontrolle bei analytischen Unter- suchungen der Innenohrfltissigkeiten bin.

Mikroflammenphotometrische Natrium-, Kalium-Bestimmung von Innenohrfliassigkeiten 47

Tabelle 1. Lineare Regression der Bestimmung der Verdiinnungsreihen von zwei Natrium-, Kaliumstandardl6sungen (140/5 und 5/140 mmol/1)

Konzentrationsbereich Steigung Abzissenabschnitt Regressionskoeffizient (mmol/1) (S) (I) (R)

Natrium 140-14 1,01 -0,46 0,9998 Kalium 5,0-0,5 0,97 0,18 0,9998 Natrium 5,0-0,5 0,97 0,20 0,9998 Kalium 140-14 1,10 -1,04 0,9998

Material und Methoden

Die Na-, K-Bestimmung wurde mit einem Digital-Flammenphotometer IL 343 (Instrumentation Laboratory Inc., Lexington, Mass., USA) durchgefiihrt, dessen Na-Mel3bereiche um den Faktor 10 herabgesetzt waren. Die Messung beider Elektrolyte erfolgte simultan durch direktes Ansaugen der mit einem internen Lithium(Li)-Standard (15 mmol/1) manuell verdtinnten Originalproben. Die Konzentrationsanzeige wurde dreistellig (Kommaverschiebung) abgelesen.

Die Verringerung des erforderlichen Probenvolumens lieg sich durch kleineres Megvolumen und niedrigere Konzentration im Megansatz erreichen. Durch Verfinderung der notwendigen Li-Emission wurde die fibliche Ansaugrate von 40 s/ml (1,5 ml/min) auf 120 s/ml (ca. 0,5 ml/min) verringert. Das erforderliche Megvolumen verkleinerte sich damit auf 100 ~1. Die lineare Regression abnehmender Konzentrationen im Mel~ansatz wurde mit einer Verdtinnungsreihe (0,5 - 0,2 - 0,1 - 0,05 ~tl Probe/100 Ixl Li-L6sung) der Na-, K-Standardl6sungen yon 140/5 mrnol/1 und 5/140 mmol/1 ermittelt (Tabelle 1). Fiir die weiteren Bestimmungen wurden 0,1 ~tl Probe/100 ~1 Li-L6sung in verschliegbaren Plastikgeffigen (Eppendorf, Hamburg bzw. Sarstedt, Niimbrecht, BRD) eingesetzt. Die Mel3genauigkeit unter diesen Bedingungen wurde durch Bestimmung aliquoter Teile (100 ~tl) einer entsprechend verdtinnten Standardl6sung ermittelt. Der Variationskoeffizient (VK) der Methode (einschlieglich Probendosierung) wurde fiir beide Standardl6sungen bestimmt (Tabelle 2). Die Dosierung der Proben erfolgte mit 0,5 tal Pr~izisionsspritzen (Graduierung 0,005 ~tl, Scientific Glas Engineering Ply Ltd., North Melbourne, Australia). Bei allen Manipulationen, vor allem beim Offnen und Schliel3en der Probengef~ige vor dem Durchmischen, wurde jegliche Bertihrung der Spritzenspitze und der GeffiNnnenseite (Deckel) mit den Fingern sorgffiltig vermieden.

Versuchstiere waren 150-300 g schwere ohrgesunde Meerschweinchen in ,~thylurethan-Nar- kose. Die Probengewinnung am lebenden Tier erfolgte in der bisher tiblichen Weise (Scheibe et al. 1981). P1 der Scala tympani und EL des Ductus cochlearis wurden aul3erdem durch eine ebenfalls bereits beschriebene Gefrierpr~iparation gewonnen (Giebel 1974; Giebel und Keppeler 1977).

Ergebnisse

Bei direktem Ansaugen der manuell verdfinnten Proben und einer herabge- setzten Ansaugrate (100-120 s/ml) reicht ein Megvolumen von 100 ~1 ffir ein sicheres Ablesen der Konzentrationsanzeige aus. Die Regressionsdaten der Bestimmung der Na- und K-Verdfinnungsreihen (Tabelle 1) zeigen, dab Linearitfit bis zu 10fach erh6hter Verdfinnung besteht (r = 0,9998). Das entspricht 0,05 ~tl Probe/100 ~tl Li-Standard. Aus den Daten geht andererseits hervor, dab die Geraden nicht genau durch den Nullpunkt verlaufen (I 4= 0) und auch deren Steigungen etwas von 1 abweichen. Dies ist auch bei den tfiglich erstellten Eichgeraden meistens der Fall.

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Tabel]e 2. Variationskoeffizienten der Bestimmung (0,1 gl Probe/100 ~tl Li-Standard) yon Natrium-, Kaliumstandard- 16sungen (in Klammern ist die Anzahl der durchgeffihrten Bestimmungen angegeben)

NatriurrdKalium Natrium Kalium

140/5 retool/1 8,3% (20) 10,1% (20) 5/140mmol/1 11,2% (24) 9,9% (31)

0,6-

0,5.

0,4.

0,3"

0 ,2 ,

0,1.

CI o

0 ,4 -

. /"

/

~fi

" " Kalium

" " ~ + s ( n )

: CSF ............ 3,6 1,2 ( 4 8 )

PL t . . . . . 6,6 3,9 ( 4 0 )

" " P L t ( G ) - - 9,7 6,5 ( 3 1 )

I \ i .. / '~.

: /

x,~ / /

�9 ,~ , mmol/I 5 10 15 20 25 30

/ /~ ""

o,3- i ~, : :" i : Na t r i um

i - i I : ] + s ( n )

i ~ CSF ............ 142 10 ( 4 8 )

: : ~ PL t . . . . . . 1 3 5 11 ( 4 0 ) o,2- : | ; : P L t ( G ) - - 8 8 3 4 ( 3 1 )

: I i ::, / : \ - 0,I- ! " " : I : \ ;

I " ~(.. 0,05-

/ ...... i , ~ m m o l / l . . . . . / / ' ( b I0 ' ' 5o 100 ' 150

Abb. la end b. H~ufigkeitsverteilung der Kalium- (a) und Natriumwerte (b) von Liquor cerebrospinalis (CSF) und Perilymphe der Scala tympani, die intravital (PLt) und durch Gefrierprfiparatiou [PLt (G)] gewormen wurde. Angegeben sind augerdem arithmetrischer Mittelwert (~) + Standardabweichung (s) und Anzahl der untersuchten Proben (n) in Klam- mern

Mikroflammenphotometrische Natrium-, Kalium-Bestimmung von Innenohrflfissigkeiten 49

Die Genauigkeit der Messung ist bei Verwendung von 0,1 ~tl Probevolumen fiir die Bestimmung yon Na und K rund 0,4 bzw. 2% (Variationskoeffizient bei 140 retool/1 Na land 5 mmol/l K). Die Genauigkeit der gesamten Bestimmung, in die zus~tzlich die Dosierung und Verdtinnung der Proben eingehen, betrfigt bei den Konzentrationen beider Standardl6sungen rund 10% (Tabelle 2).

Eine Anwendung dieser Methode zur Reinheitskontrolle von CSF und PL der Scala tympani, die intravital bzw. durch Gefrierprfiparation gewonnen wurde, zeigt die in Abb. 1 dargestellten H~iufigkeitsverteilungen. Eine nahezu symmetrische Verteilung mit annfihernder lSlbereinstimmung der arithmetischen Mittelwerte und der hfiufigsten Werte besteht nur bei den Elektrolytwerten des CSF und den Na-Werten der intravital gewonnenen PL. Die tibrigen PL-Daten sind unsymmetrisch verteilt. Daraus resultiert eine wesentliche Diskrepanz zwischen Mittelwert und h~iufigstem Wert. Bei Reinheitskontrollen durch Gefrierpr/iparation gewonnener EL zeigten sich bei den meisten Proben erh6hte Na-Werte.

Diskussion

Wie aus den Ergebnissen hervorgeht, lassen sich Na und K auch bei Verringerung des iiblichen Probenvolumens von 1 auf 0,1 ~d unter den angegebenen Bedingungen mit ausreichender Genauigkeit bestimmen. Ein Vergleich zwischen den Variationskoeffizienten der Messung (0,4-2%) und der gesamten Bestimmung (rund 10%, Tabelle 2) zeigt, daf3 die Genauigkeit der Methode im wesentlichen von der Genauigkeit der Dosierung der geringen Probenvolumina abhfingt. Da die Regressions- und Eichgeraden meistens nicht genau durch den Nullpunkt verlaufen und etwas von 1 abweichen (Tabelle 1), sind Eichstandards zur Kontrolle der Richtigkeit der Methode erforderlich. Im Bedarfsfall, z. B. bei Untersuchungen der EL, k6nnen Proben- und Mel3vo- lumen noch weiter verkleinert werden, um for Reinheitskontrollen aufwendi- gere Bestimmungsmethoden (Bosher und Warren 1968; Peterson et al. 1978; Orsulakova und D'Hease-Reinhold 1979) zu umgehen.

Die hohen K-Werte (Abb. la) bei der iiblichen intravitalen PL-Entnahme durch die Membran des runden Fensters sprechen f/Jr die Verunreinigung der Proben durch zellulfires Material (Intrazellularflfissigkeit). Bei der Gefrierprfi- paration der PL ist der Anteil der verunreinigten Proben wesentlich h6her, wie aus der Anzahl der teilweise sehr hohen K-Werte hervorgeht. Die m6gliche Ursache der niedrigen perilymphatischen Na-Werte bei Gefrierprfiparation (Abb. lb) wurde an anderer Stelle diskutiert (Rauch 1964; Krauss 1981; Giebel 1981). Die hohen endolymphatischen Na-Werte zeigen, dab auch bei Gefrier- preparation die Gewinnung reiner EL-Proben schwierig ist. Die genannten Anwendungsbeispiele unterstreichen die Notwendigkeit einer solchen Rein- heitskontrolle bei der biochemischen Analyse der Innenohrflfissigkeiten.

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Eingegangen am 8. September 1981/Angenommen am 4. Oktober 1981