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Molekularbiologische Aspekte beim
Prostatakarzinom (PCa) - Grundlagen der
Entstehung sowie Möglichkeiten der
Diagnostik und Therapie
Dr. U. FiedlerUrologisches ForschungslaborKlinik und Poliklinik für UrologieDirektor Prof. Dr. M. WirthTU-Dresden
Histologie des Prostatakarzinoms
Regulation des Prostatawachstums
Androgene
Wachstumsfaktoren
stromal-epitheliale Interaktion
Genexpression in der Prostata
ZK
Testosteron (T)
T
Dihydrotesto-steron (DHT)
HRE5-Re-duktase
DHT
EGF, KGF
AR
Epithelzelle
RE Gen
Promotor
TGF-
++ --
Veränderungen der Prostata
Unkontrolliertes Wachstum von Prostata-zellen meist erst ab dem 50. Lebensjahr
Benigne Hyperplasie (BPH)
Prostatakarzinom (PCa)
Inzidenz des PCa
häufigste Tumorerkrankung beim Mannin der westlichen Welt
ca. 250.000 Neuerkrankungen p.a.
steigende Inzidenz mit dem Alter
insignifikantes PCa bei ca. 20-30%aller Männer über 50
PCa - Tumorstadien
Stadium 5-Jahres- Überlebensrate
lokal begrenzt 99,1% (T1/T2)
lokal fortgeschritten 93,6 % (T3/T4)
metastasierend 30,7% (N1, M1)
Molekulare Ursachen der Entstehung eines PCa
familiäre/hereditäre Ursachen
chromosomale Veränderungen(Deletionen, Translokationen, Mutationen)
Methylierung
Differentielle Genexpression
Grundlagen
Familiäres Prostatakarzinom
unter 65 Jahren: 5-10% familiär bedingt
unter 65 Jahren, mind. 4 Betroffene proFamilie: 25-30 % familiäre Ursache
prostate cancer susceptibility loci
1q 24-25 (HPC-1)
1p 36 (PCa, Hirntumoren)
Grundlagen
Chromosomale Verluste beim PCa (CGH, LOH) Grundlagen
16q E-Cadherin5q --Catenin13q RB, BRCA210q PTEN
0
10
20
30
40
50
60
8p 16q 5q 13q 10q 7q
% V
erlu
st
Chromosomale Region
Gluthathion S-Transferase (GST-1)
Androgenrezeptor (AR)
Methylierung beim PCa Grundlagen
Inaktivierung von Genen durch Methylierung vonCpG-reichen Sequenzen im Promotor
GST-1/ARCpG
5‘ regulatorische Sequenz Zielgen
Tumorsuppressorgene
p53
Retinoblastom-Gen
BRCA2
KAI1
Onkogene und Tumorsup-pressorgene beim PCa
Onkogene
ras
c-myc
c-erb-2
bcl-2
Grundlagen
Differtielle Genexpression
Methode: DD-PCR (Differential Display PCR)
Amplifizerung von cDNA-Fragmenten des Tumor- und tumorfreien Gewebes
Tumorfrei TumorTAAA
mRNA
cDNA
PCR
GAAACAAA
CAAAGTTT
Grundlagen
Chromosom 13q13
Lokalisierung zwischen den Tumor-suppressorgenen BRCA2 und Rb-1
Kernlokalisierungssignal
Ähnlichkeit zu Transkriptionsfaktoren
epithelspezifische Expression
Isolierung des putativen Tumorsuppressorgens C13
Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden
Grundlagen
Untersuchungen zumVerlust der Heterozygotie
Methode: Untersuchung von Allelverlusten mit Mikrosatellitenmarkern bei Tumor- und tumorfreiem Gewebe
PCR
ACACAC
Grundlagen
ACACACAC
Allel 1
Allel 2
Tumortumorfrei
5 Mikrosatellitenmarker im Bereich 13q13
LOH oder AI: 61 % (13 von 21 Patienten)
Unterstützung der Hypothese, daß C13 ein Tumorsuppressorgenist
Chromosom 13
13RB1
C 13BRCA2
C13-LOH-Analysen Grundlagen
Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden
Weitere Gene involviert in die Prostatakarzinogenese
Telomerase
angiogene Wachstumsfaktoren
Gene der Apoptose
CD 44
Grundlagen
Faktoren der Metastasierung
Zell-Adhäsionsmoleküle
E- Cadherin- Catenin
Metalloproteinasen und Inhibitoren
MMPTIMP
Angiogene Faktoren
VEGF und Rezeptoren
Grundlagen
Chromosom 1p22
verminderte Expression im PCa-Gewebe
epithelspezifisch
extrazelluläres Signalprotein, matrixgebunden
Modulator der Zelladhäsion und Zellinteraktion
Isolierung des putativen Tumorsuppressorgens Cyr 61
Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden
Grundlagen
Diagnostik beim PCa
Primärdiagnostik:Digitale rektale UntersuchungSerum-PSA Bestimmungtransrektaler UltraschallHistologie der Biopsien
Metastasierung: SkelettszinthigraphieCT Thorax und Abdomen(PET)
Diagnostik
Verbesserte Diagnostik
Verbesserung der Primärdiagnostik bei Serum-PSA 4-10 ng/ml
Verbesserung von Staging und Prognose
sensitiver molekularer Nachweis von PCa-Zellen in
Blut, Biopsien, regionären Lymphknoten
Diagnostik
Nachweis von PCa-Zellen mittels RT-PCR
Diagnostik
Bestimmung der Mengean PCa-Zellen (Staging)
Feststellung der Ex-pression spez. Tumor-marker (Prognose)
Isolierung der Gesamt-RNA
Umschreibung in cDNA
Transkript-spezifische PCR
Aufschluß des Gewebes
Qualitative und quantitative Bestimmung von Transkripten
Prostata spezifisches Antigen (PSA)
Prostata spezifischesMembranantigen (PSM)
Humanes Kallikrein (hK2)
ProstataspezifischeTranskripte
Tumorspezifische Transkripte
Telomerase
c-src
Survivin
Epidermaler Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR)
Somatostatin-Rezeptor Typ 1
Diagnostik
Prostataspezifische mRNA‘s
PSM (Prostata SpezifischesMembranantigen)
PSA (Prostata Spezifisches Antigen)
Serinprotease
Lokalisation: Serum
Größe: 34 kDa
Transkripte: PSA mRNA
Folathydrolase
Lokalisation: Plasmamembran
Größe: 94 kDa
Transkripte: PSM mRNA PSM’ mRNA PSM’’ mRNA
Diagnostik
Qualitativer Nachweis von PSM-Transkripten in Lymphknoten
Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1-3, 5-7: Lymphknoten RNA
8: pos. Kontrolle (LNCaP RNA)
9: neg. Kontrolle
10: 123 bp DNA-Standard
Quantitativer Nachweisvon PSA-Transkripten
Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden
4518 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
WasserStandard 10 pgStandard 1 pgStandard 100 fgStandard 10 fg
0.10
1.0
pos. PCa-ZellenPatient 1 LKPatient 2 LK
Anzahl der Zyklen
Flu
ore
szen
z
Diagnostik
Nachweis von PSA-Transkripten in regionären Lymphknoten
n RT-PCR- RT-PCR-PSA + PSM
PCa 54 12 51 32
RCC 3 0 3 2
kein Ca 2 0 0 0
PCa/N+ 17 12 16 15
PCa/N- 37 0 35 37
RT-PCR-PSM‘
Diagnostik
Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden
Therapie des PCa
Operation - radikale Prostatektomie
Hormontherapie
Strahlentherapie
Therapie
Molekulare Grundlagen der Hormonresistenz
Androgenrezeptor
Steroidrezeptoren
EGF-Rezeptor
MDR-1 (Multi-Drug Resistenz-Gen)
Therapie
Molekulare Therapie-ansätze für das PCa
Inhibitoren von Wachstumsfaktoren
Anti-Angiogene Faktoren
Gentherapie
Therapie
Signalkaskade desEGF-Rezeptors
EGF
Kinase
Kinase
EGF
ShcGRB2
RasSOS
MEK
MAPK
Mitogenese
Ziel-Genc-fosc-jun
c-src
PLCy
Raf
EGF-Rezeptor
c-myc
Therapie
Immun-Gentherapie
Suizidgentherapie
Inhibierung von Onkogenen
Expression von Tumorsupressorgenen
Gentherapeutische Ansätze beim PCa
Therapie
Antigen expr. APC’s
APC AdenoviralerGentransfer(PSA, PSM)
nach Ficazzola and Taneja, 1998
Immun-Gentherapie mit Antigen Präsentierenden Zellen (APC)
+ GM-CSF, IL-4
Klinische Studien (NIH approved) I
Strategie Verabreichung Autor Vektor/Ther. Gen
Immuntherapie Tumorvaccine Gansbacher Retrovirus: IL-2ex vivo Tumorvaccine Simons Retrovirus: GM-CSF
Tumorvaccine Paulson Liposome: IL-2
Immuntherapie systemisch Chen Vaccine: PSAin vivo systemisch Kufe Vaccine: PSA
systemisch Sanda Vaccine: PSA
intratumoral Simons Adenovirus: PSAintratumoral Belldegrun Liposome: IL-2
nach Ficazzola and Taneja, 1998
5’-Fluorcytosin (5-FC)
5’-Fluorouracil (5-FU)
Ganciclovir- P
Ganciclovir
Ganciclovir- P-P-P
CDCDHSV-tkHSV-tk
zelluläre Enzymezelluläre Enzyme
Suizidgene: Cytosin-Desaminase (CD)
Herpex-Simplex-Thymidin-Kinase (HSV-tk)
Induzierung des Zelltodes Therapie
Herman et al., 1999
Induzierung des Zelltodes durch HSV tk/GCV
CMV Prom. HSV tk
adenoviraler Vektor
intraprostatische Injektion
i. v. GCV
klin. Phase I: 18 Patienten nach Radiotherapie lokales Rezidiv, keine Metastasierung 4 ADV-Konzentrationen
Ergebnis: PCR Nachweis des Vektors im Urin keine Wachstum des ADV in Blut- oder Urinproben 4 Patienten Grad 1-2 Toxizität 1 Patient Grad 3-4 Toxizität 3 Patienten mind. 50 % PSA-Abfall (6-52 Wochen)
Therapie
DNA mRNA
Antisense-Oligonukleotid
X
Protein
Ribosom
Aminosäuren
Translation
Therapie mit Antisense-Oligonukleotiden Therapie
Antisense-Behandlung von PCa-Zellen
Verringerung der
Viabilität von
DU 145-Zellen
nach Antisense-
Telomerase-
Behandlung
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Zeit (Tage)
Via
bili
tät
5 µM AtRT
10 µM AtRT
15 µM AtRT
Kontrolle
15 µM NS
Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden
Expression von
Tumorsuppressorgenen
CMV Promotor p53
p 53
Logothetis et al., AUA 1999
klin. Phase I/II: intraprostatische neoadjuvante Therapie17 Patienten mit lokal fortgeschrittenem PCa3 Injektionen (14 Tage Abstand)
Ergebnis: keine Grad 3 und 4 toxischen Effekte 3/14 Patienten: 25% Reduzierung der Tumorgröße
p53-Expression adenoviraler Vektor
Klinische Studien (NIH approved) II
nach Ficazzola and Taneja, 1998
Strategie Verabreichung Autor Vektor/Ther. Gen
Suizidgen intratumoral Kadmon Adenovirus: HSV-tkintratumoral Scardino Adenovirus: HSV-tk intratumoral Hall Adenovirus: HSV-tk
Tumorsuppressor intratumoral Belldegrun Adenovirus: p53intratumoral Logethetis Adenovirus: p53
Anti-Oncogen intratumoral Steiner Retrovirus: Myc-antisense
Das urologische Forschungslabor
Prof. Dr. M. P. Wirth
Dr. Ulrike FiedlerSusanne FüsselUta SchmidtWibke EhlersDr. Andres MelchiorBirgit NoackAscan SchindlerJörg StadeRomy KranzJana HerrmannSilke Tomasetti