Molekularbiologischer Metastasen-

nachweis beim Prostatakarzinom (PCa)

Dr. U. Fiedler

Urologisches Forschungslabor

Klinik und Poliklinik für Urologie

Universitätsklinikum der TU-Dresden

Metastasierung beim PCa

Ansiedlung in:Ansiedlung in:

Lymphknoten 69 %

Knochen 68%

Lunge 48%

Leber 33%

Ausbreitung über:Ausbreitung über:

Lymphbahnen

peripheres Blut

Eble 1993

Diagnose der Metastasierung

Prä-operativ:Prä-operativ: Tumormarkerbestimmung (PSA)

Bildgebende Verfahren (Knochenszintigraphie, PET, CT, MRT, Immunszintigraphie)

Post-operativ:Post-operativ: Histopathologische Begutachtung (Gewebe)

Immunhistochemie (anti-PSA-Antikörper)

Partin-Tabelle zur Beurteilung des Lymphknotenbefalls, PSA >20 ng/ml

Wahrschein-lichkeit %

cT1a cT1b cT1c cT2a cT2b cT2c cT3a0

10

20

30

40

50

60

2-45

67

8-10

Gleason-Score

klinisches Tumorstadium Partin 1997

Partin-Tabelle zur Beurteilung des Lymphknotenbefalls, PSA 10,1-20 ng/ml

cT1a cT1b cT1c cT2a cT2b cT2c cT3a0

10

20

30

40

50

2-45

67

8-10

Wahrschein-lichkeit %

Gleason-Score

klinisches Tumorstadium Partin 1997

Partin-Tabellen zur Beurteilung des Lymphknotenbefalls

Partin 1997

cT1a cT1b cT1c cT2a cT2b cT2c cT3a0

10

20

30

40

50

2-45

67

8-10

Wah

rschein

-lic

hkeit %

Gle

ason

-sc

ore

klinisches Tumorstadium

PSA 10-20 ng/ml PSA >20 ng/ml

cT1a cT1b cT1c cT2a cT2b cT2c cT3a0

10

20

30

40

50

60

2-45

67

8-10

PSA-Serumwerte und pathologische Skelettszintigraphie

Serum-PSA-Wert ng/ml

nossäreMetastasierungnegativ (%)

ossäreMetastasierungpositiv (%)

0,1- 4,0 89 100 0

4,1-10,0 118 100 0

10,1-20,0 99 99 1

20,1-50,0 99 93 7

50,1-100 60 62 38

>100 56 29 71

Oesterling 1993

Sensitivität des Lymphknoten-Stagings

CT 22 %

MRT 26 %

OP+SS 80 %

Beer 1992

Immunszintigraphie 52 %

62 % Lamb 1998

Entwicklung molekularbiologischer Techniken

Nachweis von Tumorzellen im Blut,Knochenmark und Lymphknoten

ZIEL:ZIEL: Verbesserte Diagnostik der Metastasierung bei unterschiedlichen PSA-Werten

Verbesserte Diagnostik des entnommenem LK- Gewebes gegenüber der Histopathologie

Verbesserte Verlaufskontrolle gegenüber der Bestimmung von Serum-PSA

Möglichkeiten des Nachweises von PCa-Zellen

NachweisebenenNachweisebenen

• DNA

• mRNA

• Proteine

Molekularbiologische Marker und Techniken für das PCa

• Cytokeratin

• PSA, PSMA

• Amplifikation von Chr. 7 Deletionen von 13q, 10q,

16q

• Immunzytologie, FACS, Immunomagnetische Separation

• RT-PCR

• FISH, Allelverlust- analysen, GCH

mRNAmRNA

ProteineProteine

DNADNA

Techniken verwendete Marker

Molekularbiologische Verfahren und Marker für das PCa

prostataspezifisch: PSA, PSM, DD3tumorspezifisch: Telomerase, PTI

chrom. Zugewinne: Chromosom 7, 8

Tumorsuppressorgene E-cadherinbeim Metastasierung: KAI-1

PTEN

Allelverluste: 8p, 10q, 16q

Verfahren

RT-PCR

FISH/GCH

LOH’s

differentielle Genexpressionsmuster

Marker

Immunomagnetische Tumorzellanreicherung

Erhöhung der Sensitivitätdes Nachweises durch Anreicherung

Positivselektion(anti-epithelialer-AK)

Negativselektion(panleukozytärer-AK CD45)

Immunzytologische Nachweistechniken

Immunzytologie FACS Immunomagn. Sepa.

FITC

S P

E

Untersuchung von chromosomalen Veränderungen von Tumorzellen im Blut

und Knochenmark (FISH, GCH)

Universitätsklinikum Dresden

bei 85% der Pca-zellen im Knochenmark wurden chromosomale Aneusomien (z. b. tri- oder tetrasomie der Chromosomen 7 und 8 nachgewiesen.

Untersuchungen zu LOH’s im Blut und Plasma

Universitätsklinikum Dresden

Nachweis von spezifischen Transkripten mittels RT-PCR

Isolierung der Mononukleären Blutzellpopulation

Dichtegradientenzentrifugation evtl.

Konzentrierung über magnetic beads

Zellaufschluß

Isolierung der Gesamt-RNA

Umschreibung in cDNA

Transkript-spezifische PCR

Universitätsklinikum Dresden

Probleme der RT-PCR

AAAmRNA

cDNA

PCR

AAAAAA

AAATTT

Kontroll-PCR: GAPDHPrimerauswahlSpezifität

Nachweis spezifischer Transkripte mittels RT-PCR

Isolierung und Aufschluß der

Leukozyten-Fraktion

Aufschluß des Lymphknoten- Gewebes

Isolierung der Gesamt-RNA

Umschreibung in cDNA

Transkript-spezifische PCR

AAAmRNA

cDNA

PCR

AAAAAA

AAATTT

Entwicklung eines Testsystems basierend auf der RT- PCR

Primerauswahl:Primerauswahl: Exonübergreifend (DNA-Verunreinigung)keine Homologien zu anderen Transkripten

Kontroll-PCR‘s:Kontroll-PCR‘s: für RNA-Qualität und -Präparation sowiecDNA-Synthese standardisierte pos. und neg. Kontrollen

Reaktionsprodukte:Reaktionsprodukte: Spezifitätsprüfung durch Sequenzierung, Hybridisierung oder Hybridisierungsproben

Quantifizierung:Quantifizierung: on line in der log. Phase der PCR

Exon Exon

Nachweis disseminierter PCa-Zellen im Blut

PSA/PSMA -RT-PCR

keine eindeutige Korrelation zwischen RT-PCR und Metastasierung

Das Prostata Spezifische Membranantigen (PSM)

extr.

cyt.

Nachweis von PCa-Zellen im Knochenmark

Stadium Patienten Mikrometastasen %

pos. Knochen-

Metastasen

14 14 100

pos. LK-Metastasen 9 7 77

organbegrenzt 31 9 29

organüberschreitend 32 20 63

gesamt 86 50 58

BPH 25 0 0

Wood 1994

Nachweis von PCa-Zellen in regionären Lymphknoten

Universitätsklinikum Dresden

Anzahl PSA-RT pos. PSA-RT neg.

Prostatatumor-

Patienten

54 17 37

pos.

Lymphknoten

16 12 4

neg.

Lymphknoten

38 5 33

Nierentumor-

Patienten

3 0 3

Sensitivität: 75 % Spezifität 87 %

Zusammenfassung

Methoden:Methoden: RT-PCR, Immunzytologie

Marker:Marker: prostata-bzw. tumorzellspezifisch

Korrelationen:Korrelationen: Histopathologie - RT-PCR (LK) Tumorstadium - RT-PCR (Knochenmark)

Probleme:Probleme: spezifische Marker

Mitarbeiter des urologischen Forschungslabors

Prof. Dr. M. P. Wirth

Dr. Ulrike FiedlerWibke EhlersBirgit NoackAscan SchindlerJörg StadeRomy KranzJana ScholzeSilke StrangfeldAstrid Bergmann

Universitätsklinikum Dresden